JP2002527072A - アグロバクテリウム・ラジオバクターによって産生されるヘテロ多糖類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１種のアグロバクテリウム・ラジオバクターI-2001（又はDSM 12095）菌株、その組換え体又はその突然変異体と、前記菌株、その組換え体又はその突然変異体によって同化されることができる炭素源とを含む培地中での発酵によって得ることができることを特徴とする、ヘテロ多糖類（ＨＰ）に関する。本発明はまた、前記ヘテロ多糖類の製造方法並びに増粘及び／又はゲル化剤としてのその使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、少なくとも１種のアグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobact
erium radiobacter）I-2001（又はDSM 12095）菌株、それらの組換え体又はそれ
らの突然変異体と、前記菌株、それらの組換え体又はそれらの突然変異体によっ
て同化されることができる炭素源とを含む培地中での発酵によって得ることがで
きることを特徴とする、ヘテロ多糖類（ＨＰ）に関する。

【０００２】 多くの産業分野において、ゲルを形成することができる改善されたレオロジー
特性並びに広い温度及びｐＨ範囲にわたって高い安定性を有する化合物であって
、それらが添加される媒体との適合性が高いものについて、絶え間なく研究され
ている。 細菌発酵によって得られる化合物の場合、この化合物が良好な生産性を有する
こともまた重要である。

【０００３】 様々な分野においてゲルを用いることを必要とする用途があるので、ゲルは特
に魅力的な系であり、従ってゲル化できるということは非常に有利なことである
。 例えば、農業食品産業は広範なゲル化製品（クリーム、ヨーグルト、各種ゼリ
ー、アイスクリーム等）を提供し、製薬産業は活性成分の担体又は増粘剤として
ゲルを用いる。 全く別の分野において、塗料は、静置時にゲルの特性を持っていれば滴り落ち
ることはなく、他方で塗料刷毛で容易に塗り広げられる（レオ流体化プロフィー
ル）。 また、水性ゲルはクロマトグラフィー担体として又はコンタクトレンズの製造
用にも用いられる。

【０００４】 キサンタンガムのような細菌を起源とするヘテロ多糖類はすでに報告されてお
り、レオロジー特性が優れているために極端な温度及びｐＨ条件下において用い
られている。しかしながら、これらのヘテロ多糖類は溶液状での用途において好
適ではあるが、常にゲルをもたらすわけではない。 媒体のゲル化は、媒体の成分の架橋の後に３次元網目構造が形成されるときに
起こることが知られている。

【０００５】 従来、このゲル化は、媒体に追加のカチオン、特にアルカリ金属若しくはアル
カリ土類金属タイプ（例えばカルシウム及び／若しくはマグネシウム）のカチオ
ンを添加することによって、ｐＨを酸性若しくは塩基性ｐＨに転換させることに
よって、別の化合物、特に別の多糖類（例えばキサンタンとカロブとの組合せ）
を添加することによって、又は温度を変えることによって、もたらされている。

【０００６】 どんな用途が検討されるとしても、前記のゲル化条件は、 ・追加のカチオン又は補助添加剤（これはゲルを得るために導入しなければなら
ない）と組成物中に存在するその他の成分との間の相互作用のせいで最終ゲルの
安定性及び適合性を損なうことがあり、 ・高い温度及び／又はｐＨ変化のせいで組成物中に存在するヘテロ多糖類及び／
又はその他の成分を変質させることがある。

【０００７】 本発明の範疇において、用語「ゲル」とは、液体中に分散されるヘテロ多糖類
鎖が少なくとも部分的に会合することの結果として生じる擬似固体（固体に近い
挙動）を意味する。外力振動数範囲ωにおいて、擬似固体ゲルは一般的に、それ
らの固体成分に関しては弾性率Ｇ’（ω）（貯蔵弾性率とも称される）によって
、それらの液体又は粘性成分に関しては粘性弾性率Ｇ”（ω）（損失弾性率とも
称される）によって、特徴付けられる。

【０００８】 機械的値Ｇ’（ω）及びＧ”（ω）は、歪み調節式流動計を用いて振動態様で
操作して測定することができる。非限定的な指標として、例えばRheo-Fluid Spe
ctrometer（登録商標）流動計を挙げることができる。 Ｇ’及びＧ”はまた、応力調節式流動計について振動態様で操作して測定する
こともできる。非限定的な指標として、例えばCARRIMED（登録商標）流動計を挙
げることができる。

【０００９】 この測定の原理は、最初に機械的外力に対するゲルの応答が歪みの関数として
直線的である可逆的な機械的歪みの範囲を決定し、次にこの決定された直線範囲
に含まれる所定の値の機械的歪みをこのゲルに加えることから成る。流動計が振
動数ωの掃引を行う。

【００１０】 歪みと位相が一致するゲルの応力応答は、弾性率Ｇ’（ω）を与える。Ｇ’（
ω）は、弾性の形でゲルによって蓄えられるエネルギーに相当し、回復すること
ができる。 歪みと９０°の角度で位相がずれたゲルの応力応答は、粘性弾性率Ｇ”（ω）
を与える。Ｇ”（ω）は、粘性流によって消散するエネルギーに相当し、回復す
ることができない。

【００１１】 ゲルは、掃引される外力振動数（ω）の範囲全体でＧ’／Ｇ”比が１０以上で
あり、即ちゲルの弾性が高いままであり、且つＧ”（ω）値が１０Ｐａ以上であ
る場合に、強い真のゲルであると言われる。

【００１２】 本発明の目的は正に、非常に良好なレオロジー特性｛特に増粘及び擬塑性（レ
オ流体化）特性の点で｝を有し且つ媒体に追加のカチオンを添加する必要なくｐ
Ｈを転換させる必要もなく４０℃以下の温度において真のゲルを作る能力を有す
るヘテロ多糖類を提供することにある。

【００１３】 本発明の目的はまた、低濃度において非常に良好なレオロジー特性を有するヘ
テロ多糖類を提供することにもある。

【００１４】 従って、本発明は、少なくとも１種のアグロバクテリウム・ラジオバクターI-
2001（又はDSM 12095）菌株、それらの組換え体又はそれらの突然変異体と、前
記菌株、それらの組換え体又はそれらの突然変異体によって同化されることがで
きる炭素源とを含む培地中での発酵によって得ることができることを特徴とする
、ヘテロ多糖類（ＨＰ）に関する。

【００１５】 アグロバクテリウム・ラジオバクター菌株は、ブダペスト条約に従って１９９
８年４月３日にCollection Nationale de Culture des Microorganismes（ＣＮ
ＣＭ）に寄託されており、I-2001の番号の下で公に入手できる。これはまた、１
９９８年４月２１日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellcultur
en GmbH（ＤＳＭＺ）にも寄託されており、DSM 12095の番号の下で公に入手でき
る。

【００１６】 アグロバクテリウム・ラジオバクターI-2001（又はDSM 12095）の純粋培養は
、２５℃〜３０℃の範囲、より特定的には２５℃〜２８℃の範囲の温度に保温さ
れたペトリ皿中で約２４時間実施することができる。

【００１７】 アグロバクテリウム・ラジオバクターI-2001（又はDSM 12095）によって同化
されることができる炭素及び窒素源は、グルコース、フルクトース、ガラクトー
ス、トレハロース、マンノース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、マ
ルトトリロース、マルトース、ラクトース、ラクツロース、メチル−β−ガラク
トピラノシド、メチル−α−ガラクトピラノシド、セロビオース、ゲンチオビオ
ース、メチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド
、エスクリン、リボース、アラビノース、キシロース、パラチノース、ラムノー
ス、フコース、メレジトース、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（−）アラビトール、
キシリトール、ズルシトール、タガトース、グリセロール、ミオイノシトール、
マンニトール、マルチトール、ツラノース、ソルビトール、アドニトール、リキ
ソース、エリトリトール、Ｄ（−）タルタレート、Ｄ（＋）マレート、Ｌ（−）
マレート、ｃｉｓ−アコニテート、ｔｒａｎｓ−アコニテート、２−ケト−Ｄ−
グルコネート、Ｎ−アセチルグルコサミン、キネート（キナ酸エステル）、ベタ
イン、スクシネート、フマレート、グリセレート及びグルコサミンから選択する
ことができる。

【００１８】 菌株のための可能な維持媒体の中では、Difco MYアガー（寒天）（参照番号07
12-01-8）タイプの維持媒体が特に有利であると考えられる。このDifco MYアガ
ー（寒天）培地は、次の組成を有する： ・バクト酵母抽出物 ３ｇ ・モルト（麦芽）抽出物 ３ｇ ・バクトペプトン ５ｇ ・バクトデキストロース １０ｇ ・バクトアガー ２０ｇ。

【００１９】 菌株を保存するためには、少なくとも１回の予備培養工程を先に行うのが好ま
しい。用語「予備培養工程」とは、多糖類を産生することなく細菌菌株を成長さ
せ増殖させることから成る工程を意味するものとする。

【００２０】 一般的にヘテロ多糖類（ＨＰ）は、グルコース及び／又はその誘導体のモチー
フ（部分構造、単位）、ガラクトース及び／又はその誘導体のモチーフ、グルク
ロン酸及び／又はその塩のモチーフ、酢酸及び／又はその塩のモチーフ、並びに
ピルビン酸及び／又はその塩のモチーフを含むということを示すことができてい
る。

【００２１】 ヘテロ多糖類の成分モチーフは、基準としてのグルコースを１として ・ガラクトース及び／又はその誘導体０．２〜５、 ・グルクロン酸及び／又はその塩０．１〜３、 ・酢酸及び／又はその塩０〜５、 ・ピルビン酸及び／又はその塩０．０１〜２ のモル割合で存在するのが一般的である。

【００２２】 より特定的には、前記モチーフは、基準としてのグルコースを１として ・ガラクトース及び／又はその誘導体０．５〜４、好ましくは０．８〜２、 ・グルクロン酸及び／又はその塩０．２〜２、好ましくは０．４〜１、 ・酢酸及び／又はその塩０〜４、好ましくは０〜３、 ・ピルビン酸及び／又はその塩０．０１〜２ のモル割合で存在させる。

【００２３】 前記のグルクロン酸、酢酸及びピルビン酸は塩の形にあることができる。塩と
しては、ナトリウム、カリウム、カルシウム又はアンモニウム塩を挙げることが
できる。

【００２４】 上に特定した原料組成を決定することを可能にしたヘテロ多糖類（ＨＰ）の分
析方法の原理は、このヘテロ多糖類（ＨＰ）の加水分解後の成分要素（単糖類及
び酸）の測定並びに内部又は外部キャリブレーションを用いたクロマトグラフィ
ー分析である。

【００２５】 単糖類分析は、次の態様で実施した。ヘテロ多糖類（ＨＰ）１００ｍｇを密封
管中で１Ｍトリフルオル酢酸５ミリリットルを用いて１０５℃において３〜６時
間加水分解する。

【００２６】 この操作に続いて、蒸発乾固させ、乾燥残渣を内部標準としてソルビトール１
５ｍｇを含有させたピリジン５ミリリットル中に取り出す。次いでピリジン溶液
１ミリリットルに対してヘキサメチルジシラザン０．９ミリリットルを用いてシ
リル化を行う。このシリル化は、トリフルオル酢酸０．１ミリリットルによって
触媒される。

【００２７】 次いで０．１４μのフィルム厚さを有するメチルシリコーン相を装填した長さ
２５ｍ、直径０．２５ｍｍのガラス毛細管カラムを用いてＦＩＤ（水素炎イオン
化検出）ガス相クロマトグラフィーによって単糖類分析を実施する。用いたガス
媒体は、２ミリリットル／分の流量の水素である。

【００２８】 ピルビン酸分析は、１Ｎ塩酸５ミリリットルを用いてヘテロ多糖類（ＨＰ）５
０ｍｇを１０５℃において１時間加水分解し、次いでケトグルタル酸（内部標準
となる）２ｍｇを添加し、蒸留水で２５ミリリットルに調節することによって得
られた原溶液を用いて実施される。この操作に続いて、２，４−ジニトロフェニ
ルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との反応を次のようにして行う。 ・前記溶液１ミリリットルに、２Ｎ塩酸中に７ｍｇ／ミリリットルのＤＮＰＨ溶
液１ミリリットルを添加する。 ・反応時間を５分間とする。次いで ・アセトン２ミリリットル及び水−アセトニトリル混合物６ミリリットルを添加
する。

【００２９】 次いで、直径５μのＣ−１８グラフト化シリカを装填した長さ２５０ｍｍ、直
径４．６ｍｍのカラムを用いて高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
って分析を実施する。用いた溶離剤は、０．２モル／リットルホスホン酸とアセ
トニトリルとの容量比５０／５０の混合物である。流量は２ミリリットル／分と
する。 ピルビン酸の検出は、３７５ｎｍの紫外線光を用いて実施する。

【００３０】 酢酸の分析は、次のようにして行う。最初に、２Ｎ塩酸５ミリリットルを用い
てヘテロ多糖類（ＨＰ）１００ｍｇを１０５℃において１時間加水分解し、次い
で内部標準として５ｍｇ／ミリリットルのプロピオン酸の溶液５ミリリットルを
添加し、この混合物に脱イオン水１５ミリリットルを添加する。分析は、長さ２
５０ｃｍ、直径４．６ｍｍの５μＣ−１８グラフト化シリカカラムを用いてＨＰ
ＬＣによって実施する。溶離剤は０．０２モル／リットルホスホン酸水溶液であ
り、流量は１．２ミリリットル／分とする。検出は屈折率測定式のものである。

【００３１】 グルクロン酸は、「Food Chemical Codex」第４版、第７６８頁に記載された
方法に従って、ガム質物を温塩酸で処理して脱カルボキシルさせることによって
放出されるＣＯ₂によって分析する。

【００３２】 分子量は、直列のTSK PW 4000カラム及びTSK PW 6000カラム（長さ３０ｃｍ、
直径７ｍｍのカラム）を用いて屈折率測定式検出方式の排除クロマトグラフィー
によって測定する。溶離剤は０．１モル／リットル硝酸ナトリウム溶液である。
ヘテロ多糖類は溶離剤中に約０．０１５重量％である。５×１０³〜１．６×１
０⁶ｇ／モルの範囲（１０⁷ｇ／モルまで外挿される）の分子量の単分散多糖類で
あるプルランを用いてキャリブレーションを実施する。

【００３３】 クロマトグラムから導かれる質量分布曲線から、重量平均分子量（Ｍｗ）が得
られる。この重量平均分子量（Ｍｗ）は、一般的に１×１０⁵〜８×１０⁶ｇ／モ
ルの範囲、好ましくは約８×１０⁵〜５×１０⁶ｇ／モルの範囲である。この重量
平均分子量は、より特定的には約３×１０⁶ｇ／モルである。

【００３４】 前述のように、ＨＰは、溶液状、特に蒸留水又は都市水中で、非常に良好なレ
オロジー特性を有する。 かくして、例えば１Ｈｚの振動数において２３℃の蒸留水中の１重量／重量％
のＨＰ溶液は、０．１〜２００Ｐａの範囲のＧ’値及び０．１〜２０Ｐａの範囲
のＧ”値をもたらすことがわかった。 ＨＰは、Ｇ’及びＧ”値が有利にはＧ’について２０〜２００Ｐａの範囲、Ｇ
”について０．５〜１５Ｐａの範囲の時に、強いゲル又は真のゲルをもたらす。
さらにより一層有利には、Ｇ’値は２０〜１５０Ｐａの範囲であり、Ｇ”値は０
．５〜１０Ｐａの範囲である。特に好ましい具体例に従えば、Ｇ’値は約１００
Ｐａであり、Ｇ”値は約５Ｐａである（蒸留水中）。

【００３５】 ＨＰは水性媒体に粘性を付与し、これは流れレオロジーによって評価される。
流れ粘度のレオロジー測定は、応力調節式流動計又は剪断調節式速度流動計｛例
えばそれぞれRHEOMAT（登録商標）又はCARRIMED（登録商標）タイプの粘度計を
用いるもの｝を用いて実施される。

【００３６】 両方の場合において、装置はＨＰと水との混合物を不可逆的に歪ませたときの
この混合物の流動時の応力を測定する。この応力から流れ粘度が計算される。 かくして、この装置は、所定の剪断速度における粘性レベルを定量化すること
ができる。 流れ粘度はBROOKFIELD粘度計を用いてもっと簡単に評価することができる。

【００３７】 ＨＰ流れ粘度のこれらのレオロジー測定はさらに、ＨＰ溶液及び／又はそれを
含む配合物の流れ閾値を評価することも可能にする。この閾値は、媒体の構造を
破壊してそれを流動させるために提供されなければならない力を表わす。

【００３８】 流れレオロジーはまた、調節剪断が増大するときのＨＰ溶液及び／又はそれを
含む配合物の流動し易さ（擬塑性又はレオ流体化挙動）を定量化することもでき
る。

【００３９】 例えば、２３℃においての１％（重量／重量）ＮａＣｌ含有蒸留水中のＨＰの
１％（重量／重量）溶液は、０．１ｓ^-1の剪断速度において１００〜５０００Ｐ
ａ・ｓの範囲、より特定的には２００〜２０００Ｐａ・ｓの範囲の流れ粘度値を
もたらすということがわかった。 同様の条件下で、１０ｓ^-1の剪断速度においては、０．５〜３００Ｐａ・ｓの
範囲、より特定的には５〜１５０Ｐａ・ｓの範囲の流れ粘度値がもたらされる。

【００４０】 これらの流れレオロジーデータは、配合物が素練りされる時や、移し替えられ
る時、オーバーランする時等のこの配合物の挙動を象徴する。

【００４１】 ＨＰを媒体に組み込むことによって得られるゲルは治癒性ゲルであり、即ち剪
断後、強剪断後でさえ、“破壊された”ゲルは再形成して初期特性を回復する能
力（当初の強さを維持する能力）を有する。

【００４２】 ＨＰから得られるゲルの治癒力は圧縮測定によって評価され、この圧縮測定は
例えば直径１２．７ｍｍの円筒状測定体から成るETIA T2テキスチャライザーに
ついて、侵入速度０．０５ｍｍ／ｓ、押込み深さ１５ｍｍで実施される。ピスト
ンをゲル中に同じ場所において数回、異なる時間間隔で押込み、圧縮力を記録す
る。ゲルの弾性を象徴する初期スロープ（ｍＮ／ｍｍで表わされる）を測定する
。

【００４３】 例えば、蒸留水中にＨＰ１％（重量／重量）でゲルを調製する。このゲルを次
いで２４時間貯蔵した後に、室温（約２５℃）において又は約６℃の冷却時にお
いて圧縮測定を実施する。 圧縮測定は、０分、５分、１５分及び２４時間の異なる時間間隔で、各測定の
間で５分間待機して、実施する。

【００４４】 どの測定時間（ｔ＝０分、５分、１５分及び２４時間）でも、スロープは一定
のままであり、約４５±１ｍＮ／ｍｍである。 このことは、ゲルの弾性が安定であり、同じゲル強度を維持しながら、ゲルが
全時間を通じて連続的に数回治癒する能力を有するということを意味する。

【００４５】 本発明はまた、前記のヘテロ多糖類（ＨＰ）の製造方法にも関する。 この製造方法は、まず最初に、アグロバクテリウム・ラジオバクターI-2001（
又はDSM 12095）菌株、その組換え体又はその突然変異体によって同化されるこ
とができる少なくとも１種の炭素源を含む培地の発酵から成る。

【００４６】 発酵培地には、前記の同化されることができる炭素源に加えて、少なくとも１
種の有機又は無機窒素源及び随意としての１種以上の無機塩を含有させることが
できる。 この培地にアグロバクテリウム・ラジオバクターI-2001（又はDSM 12095）菌
株を通常の態様で接種する。

【００４７】 発酵培地の一構成成分である有機炭素源としては、前記の糖類に加えて、澱粉
（加水分解されたものが有利である）、澱粉水解物のような糖類、これら糖類の
混合物及びこれら糖類の内の少なくとも１種を含む混合物を挙げることができる
。 より特定的には、グルコース、スクロース、澱粉（有利には加水分解されたも
の）、澱粉水解物、ラクトース、これらの糖類の混合物及びこれら糖類の内の少
なくとも１種を含む混合物を挙げることができる。グルコース及びスクロースが
さらにより一層好ましい糖類である。

【００４８】 発酵培地中の炭素源濃度は、１〜１００ｇ／リットルの範囲にすることができ
、１５〜６０ｇ／リットルの範囲にするのが好ましい。

【００４９】 有機窒素源としては、カゼイン及びカゼイン塩、魚水解物、小麦、トウモロコ
シ又は大豆粉、酵母抽出物（パン酵母、ビール酵母、乳汁酵母等）、コーンステ
ィープリカー（ＣＳＬ）、尿素並びにジャガイモ蛋白質を挙げることができる。 無機窒素源としては、硝酸アンモニウム又はナトリウム、及び燐酸又は硫酸ア
ンモニウムを挙げることができる。 また、有機窒素源と無機窒素源との混合物を用いて発酵を行うこともできる。

【００５０】 発酵培地中の窒素含有源（有機、無機又はこれら２種の混合物）濃度は、１〜
８０ｇ／リットルの範囲にすることができ、３〜５０ｇ／リットルの範囲にする
のが好ましい。

【００５１】 発酵培地にはまた、痕跡量の元素、例えば痕跡量の鉄及び／又はカルシウム及
び／又はマンガン及び／又はマグネシウム塩並びにビタミン及びヌクレオチドが
含有されていてもよい。

【００５２】 発酵は、１〜４バールの範囲の圧力、２５℃〜３５℃の範囲、好ましくは２５
℃〜３０℃の範囲の温度で、有気条件下で実施することができる。

【００５３】 発酵培地のｐＨは、５〜９の範囲であることができ、６〜８の範囲にするのが
好ましい。このｐＨは、その場合に応じて水酸化ナトリウム、水酸化カリウム若
しくはアンモニア水のような塩基によって、又は硫酸、燐酸、塩酸若しくは硝酸
のような酸によって、調節することができる。

【００５４】 発酵タンク又は容器中に入れられた発酵培地は、撹拌するのが有利なことがあ
る。この撹拌は、例えば相互振盪機、回転式振盪機、撹拌スピンドル又は泡カラ
ムを用いて実施することができる。発酵時間は通常は３０時間以上であり、一般
的には４０〜１００時間の範囲である。

【００５５】 発酵収率は、用いた炭素源に対する産生されるヘテロ多糖類の重量として一般
的に４０重量％以上、より特定的には５５〜７５重量％、特に特定的には６０〜
７５重量％である。

【００５６】 発酵後に、ヘテロ多糖類（ＨＰ）を次の工程に従って発酵マスト（発酵液）か
ら分離することができる： （i） 発酵終了時におけるマストを８０℃〜１２０℃の範囲の熱処理に１０〜
６０分間付す； （ii） 少なくとも部分的に水混和性の有機液体を用いてヘテロ多糖類（ＨＰ）
を沈殿させる； （iii） 前記有機液体から前記ヘテロ多糖類（ＨＰ）を分離する。

【００５７】 工程（i）において、ヘテロ多糖類（ＨＰ）を含有する発酵マストを有利には
８０℃〜１２０℃の範囲の温度に１０〜６０分間、好ましくは１５〜４５分間加
熱する。

【００５８】 前記の熱処理に付されるマストは、６〜８の範囲のｐＨを有するのが有利であ
る。 しかしながら、このｐＨは必要ならば場合に応じて塩基又は酸によって調節す
ることができる。 これらは、発酵培地のｐＨを調節するために用いられる前記の塩基及び酸から
選択することができる。

【００５９】 本発明の好ましい具体例に従えば、工程（i）から誘導されたマストを熱処理
の温度と同じ温度に保つ。

【００６０】 工程（ii）において、工程（i）において得られたマストからヘテロ多糖類（
ＨＰ）を、有利には、少なくとも部分的に水混和性であり且つヘテロ多糖類（Ｈ
Ｐ）が不溶性又は事実上不溶性である有機液体を用いた沈殿によって、回収する
。

【００６１】 本発明に従って好適な液体の例としては、アセトン並びに１〜６個の炭素原子
を有するアルコール、例えばエタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブ
タノール、ｔ−ブタノール又はそれらの混合物を挙げることができる。 より特定的には、ＨＰの沈殿はイソプロパノールを用いて実施される。

【００６２】 用いる有機液体の容量は、処理されるべきマストの容量の少なくとも２倍にす
るのが一般的である。

【００６３】 有機液体によるヘテロ多糖類（ＨＰ）の沈殿はまた、ナトリウム、カリウム又
はカルシウムの硫酸塩、塩化物又は燐酸塩のような塩の存在下で実施することも
できる。

【００６４】 特定的な具体例に従えば、沈殿は、４０〜６０℃の範囲の温度において行うこ
とができる。

【００６５】 沈殿したヘテロ多糖類（ＨＰ）は、次いで工程（iii）において有機液体から
分離することができる。 分離方法自体は臨界的ではなく、例えば濾過、遠心分離又は絞り取り（essora
ge）のような通常の既知の分離方法から無差別に選択することができる。

【００６６】 得られるファイバーは、例えばアセトン又はエタノール、プロパノール若しく
はイソプロパノールのようなアルコールを用いて随意に脱水することができる。 この脱水操作を実施するのに必要なアルコールの重量は、処理されるべきファ
イバーの重量の１〜１０倍であるのが一般的である。

【００６７】 脱水されたファイバーは、さらに濾過、遠心分離又は絞り取り操作に付すこと
ができる。 適宜に前記ファイバーを乾燥させ、粉砕し且つ／又は篩分けして、ヘテロ多糖
類（ＨＰ）のパウダーを得ることができる。

【００６８】 より一層純粋なパウダーを得ることが意図されるならば、発酵マスト又は前記
の方法に従って得られたパウダーから再形成された水溶液のいずれかを１種以上
の酵素を用いて処理することができる。 この目的に適した酵素の例としては、プロテアーゼ、ムタナーゼ、リポプロテ
アーゼ、セルラーゼ及びキチナーゼを挙げることができる。

【００６９】 酵素を用いた精製と組み合わせて又はこれの代わりに、様々な濾過、遠心分離
若しくは透析のような物理的精製方法又は様々なクロマトグラフィー技術を行う
ことができる。

【００７０】 発酵マスト又は前記のヘテロ多糖類（ＨＰ）の再形成溶液（随意に精製処理さ
れたもの）は、濃縮することができる。 濃縮は、ある場合、特にそれによって輸送コストが減少する場合に、有利であ
ることがある。さらに、濃縮された溶液はヘテロ多糖類（ＨＰ）パウダーよりも
迅速に用いることができる。 濃縮は、当業者に周知のすべての技術によって、特に蒸発、限外濾過又はダイ
アフィルトレーションによって、実施することができる。

【００７１】 本発明において、ヘテロ多糖類（ＨＰ）は、ファイバー又はパウダータイプの
固体の形で存在するのが有利である。

【００７２】 前述のように、ＨＰは非常に良好なレオロジー特性を有し、特に真のゲルを形
成する能力を有する。発酵条件に応じて、特に培地中の成分及びそれらの濃度並
びに本方法の工程（ii）における沈殿条件（より特定的には沈殿を塩の存在下で
行うかどうか）に応じて、ＨＰは増粘剤として、ゲル化剤として又はそれらの両
方として用いることができるという利点を有する。

【００７３】 かくして、本発明は、増粘剤及び／又はゲル化剤としての前記のヘテロ多糖類
（ＨＰ）又は前記の方法によって得られるヘテロ多糖類（ＨＰ）の使用にも関す
る。

【００７４】 ＨＰは、例えば石油、農薬、食品、化粧品、紙及び織物産業並びに塗料、コン
タクトレンズ、接着剤、インク及び家庭用又は工業用洗剤中の増粘剤及び／又は
ゲル化剤として用いることができる。

【００７５】 化粧品組成物中に用いることができる本発明のヘテロ多糖類（ＨＰ）の量は、
増粘及び／又はゲル化されるべき水性媒体に依存する。この量は、増粘又はゲル
化される水性媒体の重量の約０．０１〜５％を占めることができ、約０．１〜０
．３％を占めるのが好ましい。

【００７６】 用語「化粧品組成物」又は「化粧品配合物」とは、化粧品綱領（Directive Co
smetique）と称される１９７６年７月２７日付けヨーロッパ綱領Ｎｏ．７６／７
６８／ＥＥＣの付録１｛「化粧製品のカテゴリーによる例示的リスト」（Illust
rative list by category of cosmetic products）｝に記載されているもののよ
うなすべての化粧品製品又は製剤を意味するものする。

【００７７】 化粧品組成物は、毛髪及び／又は皮膚用の多数のタイプの製品中に配合するこ
とができ、例えばムース、ジェル（特にスタイリング用ジェル）、コンディショ
ナー、ヘアースタイリング用配合物、毛髪の櫛通りをよくするための配合物、リ
ンス用配合物、ハンド及びボディーローション、皮膚の潤いを調節する製品、ク
レンジング乳液、メーキャップ除去用組成物、太陽及び紫外線に対する保護のた
めのクリーム又はローション、ケアクリーム、抗アクネ製剤、局所麻酔、マスカ
ラ、口唇又はその他の粘膜に適用することが企図される製品、スティック、並び
に同じタイプのその他の組成物中に配合することができる。

【００７８】 これらの化粧品組成物には、組成物中に約０．５〜９９．５％の範囲、一般的
には約５〜９０％の範囲の濃度で存在するビヒクル又は数種のビヒクルの混合物
が利用される。

【００７９】 好適なビヒクルの選択は、用いる成分の性状及び組成物の用途に依存し、配合
された製品が適用された表面にとどまるべきもの（例えばスプレー、ムース、ト
ニックローション又はジェル）であるか、使用後に濯がれるべきもの（例えばシ
ャンプー、コンディショナー、リンス用ローション）であるかにも依存する。

【００８０】 化粧品組成物中に存在させる水性ビヒクルにはまた、Ｃ₁〜Ｃ₆アルコール、特
にメタノール、エタノール及びイソプロパノールを含有させることもできる。こ
れらにはまた、この組成物中に用いられる様々な成分を水性媒体中に可溶化又は
分散させることができる別の溶剤を含有させることもできる。

【００８１】 かくして、前記ビヒクルにはまた、非常に様々なその他の溶剤、例えばアセト
ン、炭化水素、ハロ炭化水素、リナロール、揮発性シリコーン及びエステルを含
有させることもできる。水性ビヒクル中に用いることができる様々な溶剤は、互
いに混和性であっても非混和性であってもよい。

【００８２】 化粧品組成物がスプレー、トニックローション、ジェル又はムースの形にある
場合、好ましいビヒクルは、水に加えて、エタノール、揮発性シリコーン誘導体
及びそれらの混合物を含むものである。

【００８３】 エアゾールスプレー及びムース用の配合物には、均一なムース又は微細スプレ
ーの形の製品を生じさせることができる噴射剤を含有させることもできる。例と
して、トリクロルフルオルメタン、ジクロルジフルオルメタン、ジフルオルエタ
ン、ジメチルエーテル、プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンを挙げることがで
きる。

【００８４】 前記水性ビヒクルは、多くの形を取ることができ、特に油中水エマルション、
水中油エマルション及びマルチエマルションを含めてエマルションの形を取るこ
とができ、その所望の粘度は２００００００ｍＰａ・ｓまでの範囲であることが
できる。

【００８５】 化粧品組成物には、水性ビヒクルに加えて、用いられる様々な化合物（特に皮
膚軟化又は潤い付与特性のために用いられる化合物）を分散させ、乳化させ、可
溶化させ及び安定化させるために用いられるある種の界面活性剤を含有させるこ
とができる。これらは、アニオン性、ノニオン性、カチオン性、双極性イオン性
又は両性タイプのものであることができ、例として、次のものを挙げることがで
きる。

【００８６】 アニオン性界面活性剤としては、アルキルエステルスルホネート、アルキルサ
ルフェート、アルキルアミドサルフェート、飽和又は不飽和脂肪酸の塩のような
ものを挙げることができる。これは３％〜５０％の範囲の量であることができ、
５％〜２０％の範囲の量であるのが好ましい。

【００８７】 ノニオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレン化アルキルフェノール
、グルコサミド、グルカミド、Ｎ−アルキルアミンから誘導されたグリセロール
アミド、ポリオキシアルキレン化Ｃ₈〜Ｃ₂₂脂肪族アルコール、プロピレンオキ
シドとプロピレングリコールとの縮合から得られた疎水性物質とエチレンオキシ
ドとの縮合から得られた生成物、アミンオキシド、アルキルポリグリコシド及び
そのポリオキシアルキレン化誘導体、Ｃ₈〜Ｃ₂₀脂肪酸のアミド、エトキシル化
脂肪酸、エトキシル化アミン、エトキシル化アミド、エトキシル化アミドアミン
のようなものを挙げることができ、これは０．１％〜３０％の範囲の量であるこ
とができ、２％〜１０％の範囲の量であるのが好ましい。

【００８８】 両性又は双極性イオン性界面活性剤としては、ベタイン、スルホベタイン、ア
ミドアルキルベタイン及びアミドアルキルスルホベタインのようなベタインタイ
プのもの、アルキルサルテイン（sultaine）、脂肪酸と蛋白水解物との縮合生成
物、ココアンフォアセテート及びココアンフォジアセテート、アルキルアンフォ
プロピオネート又はアルキルアンフォジプロピオネート、アルキルポリアミンの
両性誘導体のようなものを挙げることができ、これらは０．１％〜３０％の範囲
の量であることができ、１〜１０％の範囲の量であるのが好ましい。

【００８９】 また、コンディショナーを存在させることもでき、その量は０．０５％〜５％
の範囲であることができ、０．１％〜１％の範囲であるのが好ましい。これらの
中では、ポリクウォータニウム（polyquaternium）−２、ポリクウォータニウム
−７及びポリクウォータニウム−１０のようなポリクウォータニウムの名称でよ
く知られている合成によるもの、ココジモニウム（cocodimonium）ヒドロキシエ
チルセルロース、グアールヒドロキシプロピルトリモニウム（trimonium）クロ
リド若しくはヒドロキシプロピルグアールヒドロキシプロピルトリモニウムクロ
リドのような多糖類のカチオン性誘導体、アモジメチコン（amodimethicone）、
シクロメチコン（cyclomethicone）のような不揮発性シリコーン誘導体、又はオ
イル、樹脂若しくはガムのような水不溶性且つ不揮発性のオルガノポリシロキサ
ン、例えばジフェニルジメチコンガムを挙げることができる。

【００９０】 化粧品配合物にはまた、付着作用をもたらすために用いることができるフィル
ム形成特性を有するポリマーを含有させることもできる。これらのポリマーは、
０．０１〜１０％の範囲の濃度で存在させるのが一般的であり、０．５〜５％の
範囲の濃度で存在させるのが好ましい。これらは、ポリビニルピロリドン、ポリ
ビニルピロリドンとメタクリル酸メチルとのコポリマー、ポリビニルピロリドン
と酢酸ビニルとのコポリマー、ポリエチレングリコールテレフタレート／ポリエ
チレングリコールコポリマー及びスルホン化テレフタル酸コポリエステルポリマ
ーのタイプのものであるのが好ましい。

【００９１】 化粧品配合物にはまた、保護作用を発揮するポリマー系誘導体を約０．０１〜
１０重量％、好ましくは約０．１〜５重量％の量で含有させることもでき、この
誘導体は、例えばセルロース誘導体、ポリアルキレン主鎖上にポリビニルエステ
ルをグラフトさせたもの、ポリビニルアルコール、スルホン化テレフタル酸コポ
リエステルポリマー、エトキシル化モノアミン又はポリアミン、及びエトキシル
化アミンポリマーのようなものである。

【００９２】 また、可塑剤を用いることによって化粧品組成物の性能を向上させることもで
き、この可塑剤の量は、配合物の０．１〜２０％の範囲であることができ、１〜
１５％の範囲であるのが好ましい。これらの可塑剤の中では、アジペート、フタ
レート、イソフタレート、アゼレート、ステアレート、シリコーンコポリオール
、グリコール、ヒマシ油、又はそれらの混合物を挙げることができる。

【００９３】 また、カルシウム及びマグネシウム硬度を調節するために、約０．１〜７重量
％の量で、金属イオン封鎖剤、より特定的にはクエン酸イオンのようなカルシウ
ムを封鎖するもの、又はポリマー系分散剤、例えばポリカルボン酸の水溶性塩、
分子量約１０００〜５００００のポリエチレングリコールを、これらの組成物に
有利に添加することもできる。

【００９４】 また、化粧品組成物中には湿潤剤、例えばグリセロール、ソルビトール、尿素
、コラーゲン、ゼラチン、及び皮膚軟化剤（一般的にアルキルモノグリセリド、
アルキルジグリセリド、トリグリセリド、例えば植物及び野菜から抽出された油
若しくは動物を起源とする油又はそれらの水素化誘導体、鉱油又はパラフィン油
、ジオール、脂肪酸エステル又はシリコーン類から選択される）を添加すること
もできる。

【００９５】 これらの化合物には、炭酸カルシウムのような無機粒子又はパウダー、二酸化
チタン、シリカ、アルミニウム塩、カオリン、タルク、クレー及びそれらの誘導
体のようなパウダーの形又はコロイドの形の無機酸化物を組み合わせて添加する
ことができる。 一般的に、これらの成分に１種以上の芳香剤、染料及び／又は不透明化剤（例
えば顔料）が添加される。

【００９６】 太陽光線及び紫外線による攻撃から皮膚及び／又は毛髪を保護するために、こ
れらの配合物にサンスクリーンを添加することができ、このサンスクリーンは、
紫外線を強く吸収する化合物又は酸化亜鉛、二酸化チタン若しくは酸化セリウム
のような無機粒子のいずれかである。

【００９７】 保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類、安息香酸ナトリウム又は
化粧品組成物中に慣用的に用いられている細菌若しくはカビの増殖を防止する任
意の化学薬剤のような保存剤を、これらの組成物中に０．０１〜３重量％の量で
導入するのが一般的である。 時には、水の活性を変性する薬剤及び浸透圧を大きく増大させる薬剤、例えば
炭水化物又は塩を用いることができる。

【００９８】 化粧品配合物にはまた、別の粘度調整及び／又はゲル化用ポリマー、例えば架
橋したポリアクリレート、発酵によって得られるヒドロコロイド、例えばキサン
タンガム及びRehozan、ヒドロキシプロピルセルロース又はカルボキシメチルセ
ルロースのようなセルロース誘導体、グアール類及びそれらの誘導体等を単独で
又は組み合わせて含有させることもできる。

【００９９】 本発明は、より特定的には、飲食物配合物中に増粘剤及び／又はゲル化剤とし
てヘテロ多糖類を使用することに関する。 ヘテロ多糖類（ＨＰ）が添加される飲食物配合物は、慣用の液体単純若しくは
マルチエマルション、ガスと液体との複合エマルション（オーバーランシステム
）、液体と固体との懸濁液、又はこれらの可能性を組み合わせた任意のその他の
系である。 これらの配合物において、液体は水又は少なくとも一部水を含む液体であるの
が有利である。

【０１００】 飲食物配合物は、そのタイプの応じて慣用の飲食物調製方法を実施することに
よって得られる。かくして、ＨＰ（有利にはファイバー又はパウダータイプの固
体の形にあるもの）をその配合物に必要なその他の成分と混合する。必要ならば
全体的な混合物をホモジネートすることができる。

【０１０１】 配合物を調製する温度自体は臨界的ではない。ＨＰを含む配合物は、その使用
についての特性を何ら損なうことなく滅菌することができる。ＨＰの別の利点は
、前もって成分を加熱する必要なく飲食物配合物を調製することができるという
ことである。

【０１０２】 ＨＰは、飲食物配合物の多様性（ｐＨ、イオン強度、組成）に関係なく適合性
のままであり、その特性を実質的に維持する。

【０１０３】 本発明の主題であるヘテロ多糖類（ＨＰ）に関連した有利なレオロジー特性、
及び広いｐＨ範囲内で４０℃以下の温度において真のゲルを作ることができる能
力はまた、ＨＰが単独で又は別の添加剤と組み合わせて用いられた配合物に対し
て、前記添加剤のみを含む配合物のものに近いテキスチャーを付与することも可
能にする。

【０１０４】 飲食物配合物のテキスチャーを特徴付けるための測定可能なパラメーターは、
レオロジー的性状のものであり、本質的に弾性率（Ｇ’）及び粘性弾性率（Ｇ”
）並びに所定剪断速度における流れ粘度を測定することから成る。Ｇ’及びＧ”
並びに前記粘度は、上で定義したものである。

【０１０５】 これらのレオロジー特徴付けの目的は、配合物を互いに比較するためにそれら
の粘弾性及び／又は擬塑性挙動を示すことである。

【０１０６】 ＨＰ（有利にはファイバー又はパウダータイプの固体の形にあるもの）は、そ
れを含む配合物にレオ流体化プロフィールを付与する能力を有する。 ＨＰはまた、機械的応力を加えた後に治癒することができる真のゲルを作る能
力も有する。

【０１０７】 配合物について測定されたＧ’及びＧ”弾性率並びに前記粘度は、蒸留水中で
のＨＰについて測定されたものとは異なることがあるということに留意すべきで
ある。

【０１０８】 例えばフラン（カスタードプリン）のような乳製品系のゲル化されたデザート
では、有利なことに、通常のゲル化剤（特にゼラチン）を少なくとも部分的にＨ
Ｐに置き換えることができる。

【０１０９】 ヴィネグレットソース（フレンチドレッシング）のような塩気と酸味がある媒
体中では、含有される水性媒体にＨＰを少量添加することによって構造付与する
ことができる。

【０１１０】 砂糖菓子の分野、特にHARIBO（登録商標）タイプのゲル化されたボンボン（キ
ャンデー）においては、有利なことに、例えばゼラチンのようなゲル化剤を少な
くとも部分的にＨＰに置き換えることができる。

【０１１１】 イオン強度が高い媒体、特に豚肉製品においては、テキスチャーを強化するた
め、特に例えばソーセージの弾性のある外観を強化するために、カラゲーナンに
ＨＰを添加することができる。

【０１１２】 シャンティイークリーム、トッピング又はアイスクリームのようなオーバーラ
ンが予定される配合物においては、ＨＰを増粘及び／又はゲル化剤として用いる
ことができる。

【０１１３】 同様に、マヨネーズ、野菜ムース又は蛋白質を含むムース、例えば肉若しくは
魚ムース、又はメレンゲのようなアルブミンを含むムースのような配合物中にも
ＨＰを用いることができる。 ＨＰはまた、増粘及び／又はゲル化剤として、ヨーグルトの組成の一部になる
こともできる。

【０１１４】 前記の飲食物用途においては、ＨＰを含有する組成物又は配合物の重量に対し
てヘテロ多糖類（ＨＰ）を０．０１〜５重量％の範囲の量で用いるのが一般的で
あり、０．０５〜２重量％の範囲の量で用いるのが好ましい。組成物又は配合物
の重量に対してヘテロ多糖類（ＨＰ）を０．１〜１重量％の範囲の量で用いるの
がさらにより一層好ましい。

【０１１５】 ヘテロ多糖類（ＨＰ）はそれが導入された食品の味を変えないということに注
目すべきである。

【０１１６】 最後に、本発明は、前記のヘテロ多糖類（ＨＰ）を含む飲食物組成物又は配合
物に関する。

【０１１７】 以下、実施例によって本発明をさらに例示するが、これら実施例は本発明の範
囲を限定するものではない。

【０１１８】例１ この例は、アグロバクテリウム・ラジオバクターI-2001（又はDSM 12095）の
純粋培養及びこの菌株の保存条件を記載する。

【０１１９】アグロバクテリウム・ラジオバクターI-2001（又はDSM 12095）の純粋培養： アグロバクテリウム・ラジオバクターI-2001（又はDSM 12095）菌株を維持す
るための培地は、Difco MYアガー（参照番号0712-01-8）とする。この培地のす
でに準備のできた組成は、次の通りである。 ・バクト酵母抽出物 ３ｇ ・モルト抽出物 ３ｇ ・バクトペプトン ５ｇ ・バクトデキストロース １０ｇ ・バクトアガー ２０ｇ。

【０１２０】 この培地２１ｇを蒸留水１リットル中に希釈する。溶解後に、この培地をオー
トクレーブ中で１２１℃において１５分間滅菌する。次いでこの培地をペトリ皿
中に分配する。 ２５℃〜３０℃の範囲、好ましくは２５〜２８℃の範囲に保温したペトリ皿上
で最低２４時間培養を実施する。

【０１２１】予備培養−保存： この菌株を次いで液体窒素凍結（ＬＮＦ）法によって−１９６℃において凍結
したチューブの形で保存する。 液体窒素凍結（ＬＮＦ）のために、次の組成を有するＰＹＧ１０培地上で予備
培養を実施する。 ・モルト抽出物 ３ｇ ^*1 ・酵母抽出物 ３ｇ ^*1 ・大豆ペプトン ５ｇ ^*1 ・グルコース １０ｇ ^*2 ・ミネラルウォーター ｑｓ１リットル ^*3 ＊１ Oxoidから入手。 ＊２ Prolaboから入手。 ＊３ 全体が１リットルになるのに足りる量。以下同じ。

【０１２２】 この培地を調製するために、すべての成分をミネラルウォーター中に分散させ
る。１０％Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨを６．５に調節する。この培地をオートクレーブ中で
１２０℃において２０分間滅菌する。 回転式振盪装置を２２０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍで用いて２８℃において２４時
間インキュベートした後に、この培養物に純粋な無菌グリセロールを１０容量％
添加する。次いでこの培養物を、１ミリリットル〜１０ミリリットルの範囲、好
ましくは２ミリリットル〜４ミリリットルの範囲の容量の極低温管中に分配する
。 これらの管を液体窒素中で保存する。

【０１２３】例２ この例は、有機窒素源を用いたものと無機窒素源を用いたものとの２つの発酵
法に従うヘテロ多糖類の調製及び生産を記載する。 この例には、２つの「予備培養」工程が伴う。これらの工程は、培地１００ミ
リリットルに相当する５００ミリリットル三角フラスコ中で行う。 細菌菌株が多糖類を産生する工程に相当する産生工程は、２０リットル発酵槽
（１５リットル利用可能）中で行う。 回転式振盪機の撹拌条件は、速度２２０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍとする。

【０１２４】予備培養工程１： 予備培養工程１は、次の組成を有するＰＹＧ１０培地を用いて実施する。 ・モルト抽出物 ３ｇ ^*1 ・酵母抽出物 ３ｇ ^*1 ・大豆ペプトン ５ｇ ^*1 ・グルコース １０ｇ ^*2 ・蒸留水 ｑｓ１リットル ＊１ Oxoidから入手。 ＊２ Prolaboから入手。

【０１２５】 全体が１リットルになるのに足りる量の蒸留水中にすべての成分を分散させる
。滅菌の前に１０％Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨを６．５に調節する。この培地をオートクレ
ーブ中で１２０℃において２０分間滅菌する。 滅菌後で極低温管を用いた接種（ｑｓｐ）の前に、ｐＨは７．３３である。 それぞれの三角フラスコに充分な量のＬＮＦを植え付ける。

【０１２６】 回転式振盪機を用いて（２２０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ）２８℃において２４時
間のインキュベーションの後に、培地は次の特徴を有していた。 ・ｐＨ＝６．８２ ・粘度＝１００ｍＰａ・ｓ ・２８℃において７２時間後のMYアガー（Difco培地、参照番号0712-01-8）上で
読み取った個体数＝１．８×１０⁹ｃｆｕ／ミリリットル。 ２４時間のインキュベーションの後に、予備培養物１を用いて予備培養物２に
対する植え付けを行う。

【０１２７】予備培養工程２： 次の組成の培地を用いて予備培養工程２を実施する。 ・酵母抽出物 ４ｇ ^*1 ・ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．８ｇ ^*2 ・ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０１ｇ ^*2 ・ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ Ｍｎ²⁺５ｐｐｍ^*2 ・Ｋ₂ＨＰＯ₄ ４ｇ ^*2 又はＮａＨＰＯ₄ ３ｇ ^*2 ・グルコース １０ｇ ^*2 ・脱イオン水 ｑｓ１リットル ^*2。 ＊１ Oxoidから入手。 ＊２ Prolaboから入手。

【０１２８】 蒸留水中で１００ｇ／リットルのグルコースの溶液を調製し、次いで中性ｐＨ
で１２１℃において１５分間滅菌する。 残りの成分を全体が９００ミリリットルになるのに足りる量の脱イオン水中に
分散させ、次いでｐＨを６．８に調節し、その後に１２１℃において１５分間滅
菌する。 滅菌後に、グルコース溶液１０ミリリットルを各三角フラスコに添加する。 滅菌後で接種の前に、ｐＨは６．８８である。 各三角フラスコに充分な量の予備培養物１を接種する。

【０１２９】 回転式振盪機を用いて（２２０ｒｐｍ、振幅５０ｍｍ）２８℃において２４時
間のインキュベーションの後に、培地は次の特徴を有していた。 ・ｐＨ＝６．８２ ・粘度＝５０〜１００ｍＰａ・ｓ ・２８℃において７２時間後のMYアガー（Difco培地、参照番号0712-01-8）上で
読み取った個体数＝１．６×１０⁹ｃｆｕ／ミリリットル。 ２４時間のインキュベーションの後に、予備培養物２を用いて産生工程におい
て２つの発酵培地（発酵槽１及び２）に対して植え付けを行う。

【０１３０】産生工程： 最終工程は、ヘテロ多糖類（ＨＰ）産生工程である。 発酵槽１の培地は、次の組成を有する。 ・グルコース ２０ｇ ^* ・ＣＳＬ ６ｇ ^* ・ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．８ｇ ^* ・ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ Ｍｎ²⁺５ｐｐｍ^* ・Ｋ₂ＨＰＯ₄ １ｇ ^* ・消泡剤 ０．２ミリリットル ・脱イオン水 ｑｓ１リットル ＊ Prolaboから入手。

【０１３１】 グルコース→充分なｇ数のグルコースを３リットルになるのに足りる量の脱イオ
ン水中に溶解させる。１０％Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨを５に低下させる。この溶液をマリ
オットフラスコ中でオートクレーブ中で１２０℃において３０分間滅菌する。 窒素＋塩→充分なｇ数のコーンスティープリカー（ＣＳＬ）、Ｋ₂ＨＰＯ₄１５ｇ
、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ１２ｇ、１０ｇ／リットルＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ溶液２３ミリ
リットル及び消泡剤３ミリリットルを、７リットルになるのに足りる量の脱イオ
ン水中に溶解させる。１０％Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨを６．５に調節する。この混合物を
その場で１２０℃において３０分間滅菌する。 １Ｎ水酸化ナトリウム→ＮａＯＨチップ４０ｇを１リットルになるのに足りる量
の蒸留水中に溶解させる。この溶液をマリオットフラスコ中でオートクレーブ中
で１２０℃において３０分間滅菌する。

【０１３２】 すべての成分が２８℃になったときに、これらを発酵槽中で混合する。次いで
発酵槽に充分な量の予備培養物２を接種する。 発酵槽１中の発酵条件は次の通りである。 撹拌→０〜２０時間の間は２００ｒｐｍ、次いで発酵終了時まで４００ｒｐｍ。
通気→０〜１８時間の間は４００リットル／ｈ、次いで２４時間〜発酵終了時ま
では８２５リットル／ｈ。 温度は２８℃に調節する。 ｐＨは１Ｎ−ＮａＯＨで６．８に調節する。 圧力は大気圧とする。

【０１３３】 発酵槽２の培地は、次の組成を有する。 ・ＮａＮＯ₃ １．２ｇ ^* ・ＮＨ₄ＮＯ₃ ０．２５ｇ ^* ・ＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ ０．３ｇ ^* ・ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．８ｇ ^* ・ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ Ｍｎ²⁺５ｐｐｍ^* ・ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０１ｇ ^* ・Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １ｇ ^* ・グルコース ４５ｇ ^* ・消泡剤 ０．２ミリリットル ・脱イオン水 ｑｓ１リットル ＊ Prolaboから入手。

【０１３４】 グルコース→充分なｇ数のグルコースを３リットルになるのに足りる量の脱イオ
ン水中に溶解させる。１０％Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨを５に調節する。この溶液をマリオ
ットフラスコ中でオートクレーブ中で１２０℃において３０分間滅菌する。 窒素＋塩→ＮａＮＯ₃１８ｇ、ＮＨ₄ＮＯ₃３．７５ｇ、ＣａＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ４．
５ｇ、１０ｇ／リットルＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ溶液２３ミリリットル、ＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ１２ｇ、２ｇ／リットルＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ溶液７５ミリリットル、Ｎ
ａ₂ＨＰＯ₄４．５ｇ及び消泡剤３ミリリットルを、７リットルになるのに足りる
量の脱イオン水中に溶解させる。１０％Ｈ₂ＳＯ₄でこの溶液のｐＨを６に調節す
る。この混合物をその場で１２０℃において３０分間滅菌する。 １Ｎ水酸化ナトリウム→ＮａＯＨチップ４０ｇを１リットルになるのに足りる量
の蒸留水中に溶解させる。この溶液をマリオットフラスコ中でオートクレーブ中
で１２０℃において３０分間滅菌する。

【０１３５】 すべての成分が２８℃になったときに、これらを発酵槽中で混合する。次いで
発酵槽に充分な量の予備培養物２を接種する。 発酵槽２中の発酵条件は次の通りである。 撹拌→０〜２０時間の間は２００ｒｐｍ、次いで発酵終了時まで４００ｒｐｍ。
通気→０〜２４時間の間は４００リットル／ｈ、次いで２４時間〜発酵終了時ま
では８２５リットル／ｈ。 温度は２８℃に調節する。 ｐＨは１Ｎ−ＮａＯＨで６．８に調節する。 圧力は大気圧とする。

【０１３６】発酵結果： 研究した培地に応じて、発酵時間は６５〜９０時間の範囲とし、イソプロパノ
ールによって沈殿させることができる固形分は１５〜２６ｇ／ｋｇの範囲であり
、用いた炭素源に対する重量収率は３３〜６０％の範囲である。

【０１３７】抽出及び精製： 発酵終了時のマストを純粋なイソプロパノール１０％（重量／重量）で安定化
させる。次いでこれを中性ｐＨ（ここではｐＨ＝７）で１１０℃において２５分
間熱処理する。熱処理の間にｐＨは変化しない。 熱処理が終わったら、マストを熱抽出する（温度＞８０℃）。 沈殿条件は、次の通りである。 ・イソプロパノール＝５３％（重量／重量） ・Ｎａ₂ＳＯ₄＝０．２％（重量／重量） ・固形分＝０．４％（重量／重量）。 沈殿後に、ファイバーを細断し、次いで洗浄し、力価７８％のイソプロパノー
ルで脱水する。 次いでこのファイバーを通気インキュベーター中で８０〜８５℃において、水
含有率約１０重量％の生成物が得られるまで乾燥させる。 次いでこのファイバーを粉砕して篩分けする。

【０１３８】例３ この例の主題は、トッピング用飲食物配合物中における例２において得られた
ＨＰの使用にある。 以下の例において、流れ粘度（ｍＰａ・ｓ）はBROOKFIELD RVT 20-2粘度計を
用いて室温において測定した。 弾性率値（Ｐａ）は、CARRIMED CSL 100応力調節式流動計を用いて得た。これ
らは振動数０．０１〜１０Ｈｚの振動システムにおいて測定した。

【０１３９】 オーバーランの度合い（％）の測定は、次のようにして実施した： ・重さがわかっている容量Ｖのビーカー中にムースを導入する。このビーカーを
３回強くたたき、ムースを水平にする。 ・ビーカーを計量して含有されているムースの質量（Ｍ）を測定する。 ・オーバーランの度合い＝［Ｍ（ｇ）／Ｖ（ｍｌ）］×１００。

【０１４０】 次の２つの配合物を調製する。 ・配合物３．１＝本発明に従うヘテロ多糖類（ＨＰ）を含む。 ・配合物３．２＝カゼイン酸ナトリウム及びアルギン酸ナトリウムを含む。 これら配合物の組成を表Ｉに与える。

【表１】 ｑｓ１００＝全体が１００になるのに足りる量

【０１４１】水性相： 解凝集パドルを備えたビーカー中で、必要量の水を計量し、上の表に記載した
パウダーの混合物を激しく撹拌（５００ｒｐｍ）しながら分散させる。 パウダーの導入後に５分間撹拌を続ける。

【０１４２】油性相： ビーカー中で、脂肪物質及び乳化剤を水浴中で７０℃に加熱する。 次いでこの油性相を１０００ｒｐｍで撹拌しながら前記水性相に添加する。 油性相の導入後に５分間撹拌を続ける。この操作の間、蒸発する分の水を補填
する。 次いでこの全体としての混合物をUltra-Turraxを用いて２０００ｒｐｍで２分
間ホモジネートする。 この混合物を１０℃より低い温度に冷却し、次いでオーバーランを実施する。
これはKENWOOD CHEFタイプの実験室用ミキサーを用いて５℃付近の温度において
最大速度３分で行う。 結果を表IIに与える。

【０１４３】

【表２】

【０１４４】 これらの結果は、本発明に従うＨＰを用いた配合物３．１が比較用の配合物３
．２のものより低い粘度を有し、そのためにオーバーランしやすいということを
示す。 さらに、配合物３．１（本発明に従う）は最初により多くゲル化し（高振動数
においてＧ’がより高い）、改善されたオーバーラン度合いを有する。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年６月２７日（２００１．６．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項４

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項７

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１３

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】 本発明の範疇において、用語「ゲル」とは、液体中に分散されるヘテロ多糖類
鎖が少なくとも部分的に会合することの結果として生じる擬似固体（固体に近い
挙動）を意味する。応力振動数範囲ωにおいて、擬似固体ゲルは一般的に、それ
らの固体成分に関しては弾性率Ｇ’（ω）（貯蔵弾性率とも称される）によって
、それらの液体又は粘性成分に関しては粘性弾性率Ｇ”（ω）（損失弾性率とも
称される）によって、特徴付けられる。

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】 この測定の原理は、最初に機械的応力に対するゲルの応答が歪みの関数として
直線的である可逆的な機械的歪みの範囲を決定し、次にこの決定された直線範囲
に含まれる所定の値の機械的歪みをこのゲルに加えることから成る。流動計が振
動数ωの掃引を行う。

【手続補正８】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】 ゲルは、掃引される応力振動数（ω）の範囲全体でＧ’／Ｇ”比が１０以上で
あり、即ちゲルの弾性が高いままであり、且つＧ”（ω）値が１０Ｐａ以上であ
る場合に、強い真のゲルであると言われる。

【手続補正９】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１２５】 全体が１リットルになるのに足りる量の蒸留水中にすべての成分を分散させる
。滅菌の前に１０％Ｈ₂ＳＯ₄でｐＨを６．５に調節する。この培地をオートクレ
ーブ中で１２０℃において２０分間滅菌する。 滅菌後で極低温管を用いた接種（充分な量）の前に、ｐＨは７．３３である。 それぞれの三角フラスコに充分な量の凍結菌株（ＬＮＦ法で調製して極低温管
中に入れておいたもの）を植え付ける。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０９Ｄ 11/00 Ｃ０９Ｄ 11/00 ４Ｊ０３９ 105/00 105/00 ４Ｊ０４０ Ｃ０９Ｊ 11/08 Ｃ０９Ｊ 11/08 105/00 105/00 Ｃ０９Ｋ 3/00 １０３ Ｃ０９Ｋ 3/00 １０３Ｇ １０３Ｌ //(Ｃ１２Ｐ 19/04 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ソフィ ヴァズラン フランス国 エフ92210 サンクルー、レ ズィダンス ボソレユ、25 (72)発明者 ポール シェヴァレルオ フランス国 エフ79500 メレ、リュ エ ルワ リシャール (72)発明者 ジャンリュック シモン フランス国 エフ79500 メレ、ルート ド リモージュ、４ Ｆターム(参考） 4B018 MD33 4B064 AF11 BA16 BA17 BA18 CA02 CC06 CE10 DA10 DA11 DA16 4C083 AA03 AC10 AD21 CC02 CC11 CC31 DD08 DD41 FF01 4C090 AA04 AA08 BA61 BB12 BB13 BB22 BB65 BC19 BD06 DA08 DA26 DA27 4J038 BA122 NA24 4J039 AB01 BE23 4J040 BA122 KA25

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１種のアグロバクテリウム・ラジオバクターI-20
   01（又はDSM 12095）菌株、それらの組換え体又はそれらの突然変異体と、前記
   菌株、それらの組換え体又はそれらの突然変異体によって同化されることができ
   る炭素源とを含む培地中での発酵によって得ることができることを特徴とする、
   ヘテロ多糖類（ＨＰ）。
2. 【請求項２】 グルコース及び／又はその誘導体のモチーフ、ガラクトース
   及び／又はその誘導体のモチーフ、グルクロン酸及び／又はその塩のモチーフ、
   酢酸及び／又はその塩のモチーフ、並びにピルビン酸及び／又はその塩のモチー
   フを含むことを特徴とする、請求項１記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
3. 【請求項３】 前記モチーフを、グルコースを１として ・ガラクトース及び／又はその誘導体０．２〜５、 ・グルクロン酸及び／又はその塩０．１〜３、 ・酢酸及び／又はその塩０〜５、 ・ピルビン酸及び／又はその塩０．０１〜２ のモル割合で含むことを特徴とする、請求項２記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
4. 【請求項４】 前記モチーフを、グルコースを１として ・ガラクトース及び／又はその誘導体０．５〜４、好ましくは０．８〜２、 ・グルクロン酸及び／又はその塩０．２〜２、好ましくは０．４〜１、 ・酢酸及び／又はその塩０〜４、好ましくは０〜３、 ・ピルビン酸及び／又はその塩０．０１〜２ のモル割合で含むことを特徴とする、請求項３記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
5. 【請求項５】 前記のグルクロン酸、酢酸及びピルビン酸が塩の形にあるこ
   とを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
6. 【請求項６】 前記の酸がナトリウム、カリウム、カルシウム又はアンモニ
   ウム塩の形にあることを特徴とする、請求項５記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
7. 【請求項７】 １×１０⁵〜８×１０⁶ｇ／モルの範囲、好ましくは約８×１
   ０⁵〜５×１０⁶ｇ／モルの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有することを特徴と
   する、請求項１〜６のいずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
8. 【請求項８】 約３×１０⁶ｇ／モルの重量平均分子量（Ｍｗ）を有するこ
   とを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
9. 【請求項９】 １Ｈｚの振動数において２３℃の蒸留水中の前記ヘテロ多糖
   類（ＨＰ）の１％（重量／重量）溶液が０．１〜２００Ｐａの範囲のＧ’値及び
   ０．１〜２０Ｐａの範囲のＧ”値をもたらすことを特徴とする、請求項１〜８の
   いずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
10. 【請求項１０】 １Ｈｚの振動数において２３℃の蒸留水中の前記ヘテロ多
    糖類（ＨＰ）の１％（重量／重量）溶液が２０〜２００Ｐａの範囲のＧ’値及び
    ０．５〜１５Ｐａの範囲のＧ”値をもたらすことを特徴とする、請求項１〜９の
    いずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
11. 【請求項１１】 前記Ｇ’値が２０〜１５０Ｐａの範囲であり且つ前記Ｇ”
    値が０．５〜１０Ｐａの範囲であることを特徴とする、請求項１０記載のヘテロ
    多糖類（ＨＰ）。
12. 【請求項１２】 前記Ｇ’値が約１００Ｐａであり且つ前記Ｇ”値が約５Ｐ
    ａであることを特徴とする、請求項１０又は１１記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
13. 【請求項１３】 ２３℃においての１％（重量／重量）ＮａＣｌ含有蒸留水
    中の前記ＨＰの１％（重量／重量）溶液が０．１ｓ^-1の剪断速度において１００
    〜５０００Ｐａ・ｓの範囲、より特定的には２００〜２０００Ｐａ・ｓの範囲の
    流れ粘度値をもたらすことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載のヘ
    テロ多糖類（ＨＰ）。
14. 【請求項１４】 ２３℃においての１％（重量／重量）ＮａＣｌ含有蒸留水
    中の前記ＨＰの１％（重量／重量）溶液が１０ｓ^-1の剪断速度において０．５〜
    ３００Ｐａ・ｓの範囲、より特定的には５〜１５０Ｐａ・ｓの範囲の流れ粘度値
    をもたらすことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載のヘテロ多糖類
    （ＨＰ）。
15. 【請求項１５】 ファイバー又はパウダータイプの固体の形にあることを特
    徴とする、請求項１〜１４のいずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
16. 【請求項１６】 請求項１〜１５のいずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）
    の製造方法であって、ヘテロ多糖類を発酵マストから次の工程： （i） 発酵終了時におけるマストを８０℃〜１２０℃の範囲の熱処理に１０〜
    ６０分間付す工程； （ii） 水混和性有機液体を用いてヘテロ多糖類（ＨＰ）を沈殿させる工程； （iii） 前記有機液体から前記ヘテロ多糖類（ＨＰ）を分離する工程： に従って分離することを特徴とする、前記方法。
17. 【請求項１７】 前記の工程（i）において熱処理に付されるマストが６〜
    ８の範囲のｐＨを有することを特徴とする、請求項１６記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記の工程（i）から誘導されたマストを熱処理の温度と
    同じ温度に保つことを特徴とする、請求項１６又は１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記の有機液体によってヘテロ多糖類（ＨＰ）を沈殿させ
    る工程（ii）をナトリウム、カリウム又はカルシウムの硫酸塩、塩化物又は燐酸
    塩のような塩の存在下で実施することを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれ
    かに記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記沈殿工程（ii）を４０〜６０℃の範囲の温度において
    行うことを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記工程（iii）の終わりに得られるファイバーを脱水す
    ることを特徴とする、請求項１６〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記ファイバーを乾燥させ、粉砕し且つ／又は篩分けして
    、ヘテロ多糖類（ＨＰ）のパウダーを得ることを特徴とする、請求項２１記載の
    方法。
23. 【請求項２３】 増粘剤及び／又はゲル化剤として用いるための、請求項１
    〜１５のいずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
24. 【請求項２４】 石油、農薬、食品、化粧品、紙及び織物産業並びに塗料、
    コンタクトレンズ、接着剤、インク及び家庭用又は工業用洗剤中の増粘剤及び／
    又はゲル化剤として用いるための、請求項１〜１５のいずれかに記載のヘテロ多
    糖類（ＨＰ）。
25. 【請求項２５】 飲食物配合物中に０．０１〜５重量％の範囲、好ましくは
    ０．０５〜２重量％の範囲の量で増粘剤及び／又はゲル化剤として用いるための
    、請求項１〜１５のいずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）。
26. 【請求項２６】 石油、農薬、食品、化粧品、紙、織物、塗料、コンタクト
    レンズ、接着剤、インク及び家庭用又は工業用洗剤分野に用いるための請求項１
    〜１５のいずれかに記載のヘテロ多糖類（ＨＰ）を含む組成物又は配合物。