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JP2002527051A - デルタ６脂肪酸デサチュラーゼ - Google Patents

デルタ６脂肪酸デサチュラーゼ

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Publication number
JP2002527051A
JP2002527051A JP2000575530A JP2000575530A JP2002527051A JP 2002527051 A JP2002527051 A JP 2002527051A JP 2000575530 A JP2000575530 A JP 2000575530A JP 2000575530 A JP2000575530 A JP 2000575530A JP 2002527051 A JP2002527051 A JP 2002527051A
Authority
JP
Japan
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cyb5rp
protein
seq
delta
amino acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
JP2000575530A
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English (en)
Inventor
ペトルーヒン，コンスタンテイン
キヤスキー，シー・トーマス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck and Co Inc
Original Assignee
Merck and Co Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck and Co Inc filed Critical Merck and Co Inc
Publication of JP2002527051A publication Critical patent/JP2002527051A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
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Abstract

(57)【要約】 遺伝子CYB5RP（デルタ6脂肪酸デサチュラーゼ）をコードする新規ヒトDNA配列を提供する。ゲノムCYB5RP DNAおよび該CYB5RPタンパク質をコードするcDNAを提供する。該新規DNA配列にコードされるCYB5RPタンパク質も提供する。組換え系内でCYB5RPタンパク質を発現させる方法を提供する。CYB5RPタンパク質のアクチベーターおよびインヒビターを同定するCYB5RP法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、必須脂肪酸の合成に関与する酵素であるデルタ6脂肪酸デサチュラ
ーゼ（desaturase）をコードする新規ヒトDNA配列に関する。
【０００２】 （発明の背景） 必須脂肪酸（EFA）は、哺乳類が産生できない多不飽和脂肪酸であるが、多数
の重要な生化学的過程に必要であり、したがって食物として供給されなければな
らない。食物に含まれる最も重要なEFAはリノール酸およびα-リノレン酸（ALA
）である。これらの2つのEFAは、それらを種々の他のEFAに変換する多数の生合
成反応を受ける。図1は、EFAの2群 [n-6 EFA（リノール酸誘導体）およびn-3 EF
A（ALA誘導体）が関与する生合成反応を示す。EFAは、リノール酸およびALAから
、追加的な二重結合の挿入と共役した2個の水素の除去（不飽和化）、および2個
の炭素の付加による脂肪酸鎖の伸長（鎖伸長）を含む一連の交互の反応により形
成される。不飽和化および伸長を触媒する酵素はEFAの両群に関して同じである
と考えられている。
【０００３】 より重要な不飽和脂肪酸としては、膜の構造および機能の維持、コレステロー
ルの合成および輸送の調節、および皮膚からの水分喪失の予防に関与するデルタ
6不飽和脂肪酸が挙げられる。デルタ6不飽和脂肪酸はまた、プロスタグランジン
およびロイコトリエンを含むエイコサノイドの前駆体として働く（Horrobin, 19
92, Prog. Lipid Res. 31:163-194）。デルタ6不飽和脂肪酸の6位の二重結合は
、デルタ6デサチュラーゼとして公知の酵素のクラスにより導入される。
【０００４】 リノール酸およびALA誘導体の欠乏は、皮膚病、糖尿病合併症、炎症性および
自己免疫障害、心臓血管障害、ウイルス感染症の合併症、および網膜機能不全に
関連づけられている。例えば、酵素デルタ6デサチュラーゼの作用によりリノー
ル酸から産生されるγ-リノレン酸（GLA）の欠乏は、老化、ストレス、糖尿病、
湿疹およびいくつかの感染症において見出されるこの酵素の活性の減少から、あ
るいは炎症または癌において見出される酸化または急速な細胞分裂によるGLAの
異化の増加から生じうる。臨床治験は、食事によるGLAの補給が、GLA欠乏に関連
した多数の状態（例えば、アトピー性湿疹、乳房痛、糖尿病性神経障害、ウイル
ス感染症およびいくつかの形態の癌）の治療に有効でありうることを示している
（Horrobin, 1990, Rev. Contemp. Pharmacother. 1:1-45）。
【０００５】 デルタ6デサチュラーゼは脂肪酸デサチュラーゼの一例である。脂肪酸デサチ
ュラーゼは、脂肪酸の炭素鎖内に二重結合を導入する酵素である。それらは、必
須脂肪酸を含む多不飽和脂肪酸の生合成において極めて重要な役割を果たす。脂
肪酸デサチュラーゼは、可溶性および膜結合形態として存在し、それらの機能発
現のためには電子供与体（例えば、シトクロムb5）を必要とする。
【０００６】 デルタ6デサチュラーゼは、図1に示すとおりリノール酸およびALA群EFAの生合
成における律速段階を触媒する。リノール酸経路の最終産物には、エイコサノイ
ド（プロスタグランジンおよびロイコトリエン）が含まれる。ALA経路の最終産
物は、脊椎動物の網膜内の膜の重要成分であるドコサヘキサエン酸（DHA）であ
る。DHAは、網膜に高度に特異的であり、杆体外節（ROS）内の脂肪酸の50％以上
に相当する。DHAは、網膜の正常な構造および機能の維持において重要であるら
しい（Andersonら, 1992, Neurobiology of Essential Fatty Acids, Bazanら編
, Plenum Press, New York, p.285-294）。グリーンランドエスキモー人におい
て、アザラシ肉および魚類からのDHAおよびその前駆体エイコサペンタエン酸の
食物内消耗の増加が黄斑変性の頻度の増加と関連づけられている（Rosenberg, 1
987, Arct. Med. Res. 46:64-70）。
【０００７】 ある種のデルタ6デサチュラーゼは植物からクローニングされている。例えば
、デルタ6デサチュラーゼはルリチシャからクローニングされている（Sayanova
ら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4211-4216）。このデルタ6デサチュ
ラーゼは、そのシトクロムb5電子供与体が、別個のタンパク質として合成される
のではなく該酵素のN末端伸長として存在する点で、特異である。ルリチシャデ
ルタ6デサチュラーゼは機能的であること、すなわち、それをコードするクロー
ン化遺伝子をタバコに導入することによりトランスジェニックタバコの葉内で高
レベルのGLAおよびオクタデカテトラエン酸（OTA）の合成がもたらされることが
示されている。GLAおよびOTAは、それぞれリノール酸およびALAに対するデルタ6
デサチュラーゼの作用による産物である。
【０００８】 そのヒドロパシープロフィールに基づけば、ルリチシャデルタ6デサチュラー
ゼは膜結合型タンパク質であるらしい。該ルリチシャ酵素のアミノ酸配列および
多種多様な生物からの膜結合型デサチュラーゼのアミノ酸配列を検討することに
より、保存された相互間隔を有するヒスチジン残基（HX(3または4)H、HX(2また
は3)HH、およびHX(2または3)HH）を含有する保存された短いモチーフの3個の領
域が明らかとなった（Shanklinら, Biochemistry, 1994, 33:12787-12794）。
【０００９】 ヒマワリ胚からDNA配列が単離されており、該DNA配列は、その配列から判断す
ると、N末端に融合したシトクロムb5様部分を有するデルタ6デサチュラーゼをコ
ードしているらしい（Sperlingら, 1995, Eur. J. Biochem. 232:798-805）。
【００１０】 （発明の概要） 本発明は、デルタ6脂肪酸デサチュラーゼ（シトクロムb5関連タンパク質（CYB
5RP））をコードする新規ヒトDNA配列に関する。本発明は、ゲノムCYB5RP DNA、
および該CYB5RPタンパク質をコードするcDNAを含む。該ゲノムCYB5RP DNAは、他
の核酸を実質的に含有せず、配列番号1に示すヌクレオチド配列を有する。CYB5R
Pタンパク質をコードするcDNAは、他の核酸を実質的に含有せず、配列番号2に示
すヌクレオチド配列を有する。また、該新規DNA配列にコードされるCYB5RPタン
パク質も提供する。該CYB5RPタンパク質は、他のタンパク質を実質的に含有せず
、配列番号3に示すアミノ酸配列を有する。組換え系内でCYB5RPタンパク質を発
現させる方法を提供する。また、CYB5RPをコードするDNAを使用する又はCYB5RP
タンパク質を使用するデルタ6不飽和脂肪酸の製造方法を提供する。
【００１１】 （図面の簡単な記載） 図1は、必須脂肪酸の合成のリノール酸（n-3）およびα-リノレン酸（n-6）経
路に関与する酵素変換を示す。
【００１２】 図2A〜Gは、CYB5RP遺伝子のゲノムDNA配列（配列番号1）を示す。下線を付し
た大文字のヌクレオチドはエキソンを表す。エキソン1内の544位の開始ATGコド
ンおよびエキソン12内の18,103位の終結コドンTGAは、太字で示されている。ポ
リA尾部の約20塩基対上流に位置する推定ポリアデニル化シグナルATTAAAは、太
字のイタリック体で示されている（エキソン12内の18,373位）。エキソン1の上
流のDNA配列は、353位のTATAボックス（下線を付した太字）の存在により示され
るとおり、CYB5RP遺伝子の推定プロモーター領域を表す。
【００１３】 図3A〜Cは、CYB5RPのcDNA配列（配列番号2）およびアミノ酸配列（配列番号3
）を示す。アミノ酸1〜102を含む領域はシトクロムb5ドメインを表す。アミノ酸
182〜186を含む領域はHIS BOX（ボックス）1を表す。アミノ酸219〜223を含む領
域はHIS BOX2を表す。アミノ酸383〜387を含む領域はHIS BOX3を表す。
【００１４】 図4は、マウスCYB5RPのcDNA配列の一部（配列番号4）およびアミノ酸配列の一
部（配列番号5）を示す。
【００１５】 図5Aは、CYB5RPのKyte-Doolittleヒドロパシープロットを示す。図5Bは、その
ヒドロパシープロットに基づく、提案されているCYB5RPの膜位相幾何学を示す。
この膜位相幾何学は、他の膜結合型脂肪酸デサチュラーゼに関して提案されてい
るもの（Shanklinら, Biochemistry, 1994, 33:12787-12794）に類似している。
図5Bに示すアミノ酸は配列番号3の一部である。
【００１６】 図6は、Wisconsin GCGパッケージからのProfilescanプログラムの出力を示す
。上側のアミノ酸配列はCYB5RPに由来する（配列番号3の31〜78位）。下側のア
ミノ酸配列は、シトクロムb5プロフィールの1〜48位（配列番号6）である。該出
力は、CYB5RPが、シトクロムb5タンパク質ファミリーのヘム結合ドメインに典型
的なプロフィールを含有することを示している。重要なのは、同一性の領域が非
変異HPGGモチーフを含み、その中のヒスチジンが鉄のヘム軸方向（アキシアル）
リガンドに相当することである。
【００１７】 図7AおよびBは、完全長CYB5RPアミノ酸配列を照会として使用するGenBankデー
タベースのBlastP検索の結果を示す。図7Aは、最高の相同性を有するヒット（ヒ
マワリからの仮想タンパク質）を示す。該ヒマワリタンパク質とCYB5RPとは、3
個のHisボックス（枠で囲まれている）を共有し、該Hisボックス間の間隔は保存
されている。また、シトクロムb5タンパク質ファミリーのヘム結合ドメインに典
型的なHPGGモチーフも枠で囲まれている。どちらのタンパク質においても、第3
Hisボックスの第1ヒスチジンがグルタミンで置換されている（これは、デルタ6
特異性を有するデサチュラーゼの典型的特徴である）。示されている上側のアミ
ノ酸配列はCYB5RP由来であり、配列番号3の一部である。示されている下側のア
ミノ酸配列は、該ヒマワリ由来仮想タンパク質のアミノ酸配列の一部である（Sp
erlingら, 1995, Eur. J. Biochem. 232:798-805）。348〜432位として示されて
いる配列は配列番号7である。22〜74位として示されている配列は配列番号8であ
る。152〜227位として示されている配列は配列番号9である。図7Bは、2番目に高
い相同性を有するヒット [ルリチシャ（Borago oficinalis）由来のデルタ6デサ
チュラーゼ]を示す（Sayanovaら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4211-
4216）。また、該ルリチシャ（Borago）タンパク質とCYB5RPとは、保存された間
隔を有する3個のHisボックスおよびHPGGモチーフを共有する。どちらのタンパク
質においても、第3 Hisボックスの第1ヒスチジンがグルタミンで置換されている
（これは、デルタ6特異性を有するデサチュラーゼの典型的特徴である）。示さ
れている上側のアミノ酸配列はCYB5RP由来であり、配列番号3の一部である。示
されている下側のアミノ酸配列は、該ルリチシャ（Borago）デルタ6デサチュラ
ーゼのアミノ酸配列の一部である。338〜424位として示されている配列は配列番
号10である。12〜64位として示されている配列は配列番号11である。153〜220位
として示されている配列は配列番号12である。
【００１８】 図8は、CYB5RPタンパク質を照会として使用するGenBankデータベースのBlastP
検索の追加的な結果を示す。図8は、BlastPプログラムにより行った該CYB5RPタ
ンパク質とシネコシスティス種（Synechocystis sp．）（pcc6803株）由来のデ
ルタ6デサチュラーゼとのアミノ酸アライメントを示す。シネコシスティス（Syn
echocystis）デルタ6デサチュラーゼおよびCYB5RPは3個のHisボックスを共有し
、そのうちの2個が図8に示されている（枠で囲まれている）。どちらのタンパク
質においても、第3 Hisボックスの第1ヒスチジンがグルタミンで置換されている
（これは、デルタ6特異性を有するデサチュラーゼの典型的特徴である）。示さ
れているCYB5RP配列は配列番号3の一部である。示されているシネコシスティス
（Synechocystis）配列は配列番号13である。
【００１９】 図9Aは、21サイクルのRT-PCR増幅により測定された9個のヒト組織におけるCYB
5RP遺伝子の発現パターンを示す。ヒト網膜、腎臓、膵臓、胎盤および脳におい
て発現が検出されている。図9Bは、25サイクルの増幅により行った同様の実験の
結果を示す。調べたすべてのヒト組織においてCYB5RP遺伝子の発現が認められる
。
【００２０】 （発明の詳細な記載） 本発明の目的においては、「他のタンパク質を実質的に含有しない」は、他の
タンパク質から少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは99％、より一
層好ましくは99.9％フリーである（すなわち、かかる割合分は他のタンパク質を
含有しない）ことを意味する。したがって、他のタンパク質を実質的に含有しな
いCYB5RPタンパク質調製物は、その全タンパク質に対する割合として、10％以下
、好ましくは5％以下、より好ましくは1％以下、より一層好ましくは0.1％以下
の非CYB5RPタンパク質を含有するであろう。ある与えられたCYB5RPタンパク質調
製物が他のタンパク質を実質的に含有しないか否かは、適当な検出方法（例えば
、銀染色または免疫ブロット法）と組合せた例えばドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）などのタンパク質の純度を評価する通
常の技術により判定することができる。
【００２１】 「他の核酸を実質的に含有しない」は、他の核酸から少なくとも90％、好まし
くは95％、より好ましくは99％、より一層好ましくは99.9％フリーであることを
意味する。したがって、他の核酸を実質的に含有しないCYB5RP DNA調製物は、そ
の全核酸に対する割合として、10％以下、好ましくは5％以下、より好ましくは1
％以下、より一層好ましくは0.1％以下の非CYB5RP核酸を含有するであろう。あ
る与えられたCYB5RP DNA調製物が他の核酸を実質的に含有しないか否かは、適当
な染色方法（例えば、臭化エチジウム染色）と組合せた例えばアガロースゲル電
気泳動などの核酸の純度を評価する通常の技術により、または配列決定により判
定することができる。
【００２２】 「CYB5RPと実質的に同じ生物活性」は、CYB5RPがリノール酸の6位に二重結合
を導入しうる条件下でリノール酸の6位に二重結合を導入しうることを意味する
。
【００２３】 「同類アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ
酸残基により置換されることを意味する。そのような同類置換の具体例としては
、疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）間での置換
、ある極性残基を同じ電荷の別の極性残基で置換すること（例えば、リシンから
アルギニンへの、アスパラギン酸からグルタミン酸への置換）が挙げられる。
【００２４】 本発明は、シトクロムb5関連タンパク質（CYB5RP）、ヒトデルタ6脂肪酸デサ
チュラーゼをコードする遺伝子の同定およびクローニングに関する。該遺伝子は
、ベスト黄斑萎縮症に関連した遺伝子を含有することが示されているヒト染色体
11q12の領域からのPACクローン759J12、756B3、519O13および466A11上に存在す
る（Cooperら, 1997, Genomics 41:185-192; Stohrら, 1997, Genome Res. 8:48
-56; Graffら, 1997, Hum. Genet. 101:263-279）。CYB5RP遺伝子の周辺の制限
断片長さ多型（RFLP）（例えば、配列番号1におけるもの）を同定することによ
り、CYB5RP遺伝子の染色体位置とベスト黄斑萎縮症に関連する遺伝子の位置との
この連関を診断に用いることができる。そのようなRFLPは、ベスト黄斑萎縮症遺
伝子と関連しており、したがってそれを用いて、ベスト黄斑萎縮症遺伝子の疾患
原因形態を保持する個体を同定することができる。
【００２５】 ヒト染色体11q12由来のPACクローンからの配列スキャニングデータにおけるES
Tヒットとして、CY5BRPを同定した。また、CYB5RPの完全長cDNAをヒト網膜cDNA
ライブラリーから回収した。CYB5RPのゲノム領域は既に配列決定されており、CY
B5RPのエキソン／イントロン構造が既に決定されている。CYB5RP遺伝子は12個の
エキソンを有する。真核性転写に必要なコンセンサス要素を検出することにより
、CYB5RPのプロモーター領域を5'UTRの上流で同定した。CYB5RPの発現パターン
を、9個のヒト組織におけるRT-PCR分析により決定した。CYB5RP遺伝子は、主と
して、ヒト網膜、腎臓、膵臓および胎盤において発現される。また、より低いレ
ベルの発現が、脳、心臓、肺、肝臓および骨格筋において検出される。バイオイ
ンフォマティクス分析は、植物および細菌脂肪酸デサチュラーゼの一群に対する
有意な相同性を示した。これらの脂肪酸デサチュラーゼ内に存在する典型的なア
ミノ酸モチーフのすべては、CYB5RP内にも存在する。Kyte-Doolittleアルゴリズ
ム分析は、CYB5RPの脂肪酸デサチュラーゼに典型的な膜貫通構造を予想する（図
5を参照されたい）。CYB5RPは、それがシトクロムb5領域をそのN末端に含有する
点で特異である。多数の脂肪酸デサチュラーゼはシトクロムb5を電子供与体とし
て利用するが、それらのポリペプチド鎖の一部としてこのシトクロムを含んでい
るものはほとんどない。
【００２６】 CYB5RPが脂肪酸デサチュラーゼであることは、以下の証拠により示される。 （1）CYB5RPは、植物および微生物脂肪酸デサチュラーゼに対する有意な相同
性を有する。 （2）他の脂肪酸デサチュラーゼと同様に、CYB5RPは、3個の保存されたヒスチ
ジンボックスを有し、それらのボックス間は適切な間隔で隔てられている。 （3）CYB5RPの推定膜位相幾何学は、公知脂肪酸デサチュラーゼのものに類似
している。
【００２７】 CYB5RPがデルタ6脂肪酸デサチュラーゼであることは、以下の証拠により示さ
れる。 （1）CYB5RPは、N末端に融合したシトクロムb5様部分を含有する。N末端に融
合したシトクロムb5様部分を含有する僅か2種の脂肪酸デサチュラーゼが、デル
タ6デサチュラーゼであることが公知であるか又はその疑いがある。 （2）6位に二重結合を導入することが公知であるか又はその疑いのある僅か2
種の植物デサチュラーゼが、第1位にHではなくQを有する非典型的なHisボックス
3（QI/LEHH）を有する。CYB5RPは、同じ非典型的なHisボックス3を有する。 （3）6位に二重結合を導入することが公知である唯一の細菌デサチュラーゼは
、第1位にHではなくQを有する非典型的なHisボックス3（QVTHH）を有する。CYB5
RPは、同じ非典型的なHisボックス3を有する。
【００２８】 CYB5RPは、脂質代謝障害を治療するための並びにプロスタグランジンおよびロ
イコトリエンの生合成のモジュレーションを要する状態（喘息、痛みなど）を治
療するための薬物の開発の標的である。また、CYB5RPは、皮膚病、糖尿病合併症
、生殖障害（乳房痛および月経前症候群を含む）、炎症性および自己免疫障害、
心臓血管障害、ウイルス感染症の合併症、ならびに種々の形態の網膜変性（加齢
関連黄斑変性を含む）の治療に使用する薬物の開発の標的でもある。
【００２９】 CYB5RPは、ルリチシャ（Borago oficinalis）由来のデルタ6デサチュラーゼと
相同である（図7Bを参照されたい）。高等植物由来のデサチュラーゼとは異なり
、CYB5RPおよびこのルリチシャ（Borago）デルタ6デサチュラーゼは共に、それ
らのN末端に融合したシトクロムb5様ドメインを含有する点で特異である（Sayan
ovaら, 1997, Proc. Natl. Acad. USA 94:4211-4216; 以下、これは「Sayanova
」と記す）。ルリチシャ（Borago）デサチュラーゼは、トランスジェニックタバ
コ内で発現されており、該トランスジェニックタバコの葉において高レベルのデ
ルタ6不飽和脂肪酸（高レベルのγ-リノレン酸（GLA）を含む）を与えた（Sayan
ova）。GLAの医学的重要性を考えると、ルリチシャ（Borago）デルタ6デサチュ
ラーゼを発現するトランスジェニック植物はGLA源として貴重であると、Sayanov
aは提案している。同様に、トランスジェニック植物内で発現されるCYB5RPは貴
重なGLA源を提供すると予想される。
【００３０】 本発明は、他の核酸を実質的に含有しないCYB5RPをコードするDNAを提供する
。本発明はまた、CYB5RPをコードする組換えDNA分子を提供する。本発明は、図2
に配列番号1として示すヌクレオチド配列を含む、他の核酸を実質的に含有しな
いDNA分子を提供する。配列番号1の分析は、このゲノム配列が、12個のエキソン
を有する遺伝子を定めることを示した。これらのエキソンは一括して、445アミ
ノ酸のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを有する。選択的
スプライシングを受けるエキソン8が用いられると、アミノ酸317〜328を欠く433
アミノ酸のCYB5RPタンパク質が産生される。したがって、本発明は、他の核酸を
実質的に含有しない、2個の形態のCYB5RPタンパク質をコードする2個のcDNA分子
を含む。該第1 cDNAは、図3に示されており、配列番号2のヌクレオチド配列を有
する。該第2 cDNAは、それが1,019〜1,054位のヌクレオチドを含有しないこと以
外は該第1 cDNAと同一である。
【００３１】 本発明は、配列番号2のコード領域を含む、他の核酸を実質的に含有しないDNA
分子を含む。したがって、本発明は、配列番号2の71〜1,405位を含む配列を有す
る、他の核酸を実質的に含有しないDNA分子を含む。本発明はまた、配列番号2の
71〜1,405位を含む配列を有する（ただし、1,019〜1,054位が欠失している）、
他の核酸を実質的に含有しないDNA分子を含む。また、配列番号2の71〜1,405位
を含むヌクレオチド配列を有する組換えDNA分子、および配列番号2の71〜1,405
位を含む（ただし、1,019〜1,054位が欠失している）ヌクレオチド配列を有する
組換えDNA分子も、本発明に含まれる。
【００３２】 CYB5RPをコードする本発明の新規DNA配列は、全体的または部分的に、他のDNA
配列（すなわち、CYB5RPが天然では結合していないDNA配列）に結合して、CYB5R
Pをコードする「組換えDNA分子」を形成していてもよい。そのような他の配列に
は、転写または翻訳を制御するDNA配列、例えば、翻訳開始配列、RNAポリメラー
ゼIIのプロモーター、転写または翻訳終結配列、エンハンサー配列、微生物内で
の複製を制御する配列、抗生物質耐性を付与する配列、またはポリペプチド「タ
グ」（例えば、ポリヒスチジン領域またはmycエピトープ）をコードする配列が
含まれうる。本発明の新規DNA配列は、ベクター（例えば、プラスミド、コスミ
ド、ウイルスベクター、P1人工染色体または酵母人工染色体）内に挿入すること
ができる。
【００３３】 本発明には、ストリンジェントな条件下で配列番号1または2の少なくとも1つ
にハイブリダイズするDNA配列が含まれる。例えば、高いストリンジェンシーの
条件を用いる方法は、以下のとおりであるが、それらに限定されるものではない
。DNAを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、6X SSC、5Xデン
ハルト液および100μg/ml変性サケ精子DNAを含むバッファー中、65℃で2時間〜
一晩行なう。100μg/ml変性サケ精子DNAおよび5〜20 X 106cpmの32P標識プロー
ブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、フィルターを65℃で12〜48
時間ハイブリダイズさせる。2X SSC、0.1％ SDSを含有する溶液中、37℃で1時間
、フィルターの洗浄を行なう。この後、0.1X SSC、0.1％ SDS中、50℃で45分間
の洗浄を行ない、ついでオートラジオグラフィーに付す。
【００３４】 高いストリンジェンシーの条件を用いる他の方法は、5XSSC、5Xデンハルト液
、50％ホルムアミド中、42℃で12〜48時間行なうハイブリダイゼーション、また
は0.2X SSPE、0.2％ SDS中、65℃で30〜60分間行なう洗浄工程を含むであろう。
【００３５】 高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを行なうための前記方法で
挙げた試薬は当技術分野でよく知られている。これらの試薬の組成の詳細は、例
えば、Sambrook, FritschおよびManiatis, 1989, Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている
。前記のもの以外の使用しうる他の高いストリンジェンシー条件は当技術分野で
よく知られている。
【００３６】 遺伝暗号の縮重性のため、2種のアミノ酸を除く全てのアミノ酸に関しては、2
以上のコドンが特定のアミノ酸をコードする。このため、配列番号2のヌクレオ
チド配列とは有意に異なるが配列番号3に示すのと同じCYB5RPタンパク質を尚も
コードする合成DNAヌクレオチド配列を有するCYB5RPタンパク質コード化合成DNA
の構築が可能となる。そのような合成DNAは本発明の範囲内にあると意図される
。また、配列番号3のアミノ酸317〜328を欠くCYB5RPタンパク質をコードする合
成DNAも、本発明の範囲内にある。
【００３７】 本発明のもう1つの態様は、CYB5RPタンパク質をコードするDNA配列を含有およ
び／または発現するように操作された宿主細胞を含む。CYB5RPタンパク質を産生
させるために、そのような組換え宿主細胞を適当な条件下で培養することができ
る。組換え宿主細胞内でCYB5RPタンパク質を発現させるために、CYB5RPタンパク
質をコードするDNAを含有する発現ベクターを使用することができる。組換え宿
主細胞は、原核性または真核性であることが可能であり、それらには、大腸菌（
E. coli）などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげ
っ歯類由来の細胞系を含む（これらに限定されるものではない）哺乳類細胞、タ
バコなどの植物細胞およびショウジョウバエ（Drosophila）およびカイコに由来
する細胞系を含む（これらに限定されるものではない）昆虫細胞が含まれるが、
これらに限定されるものではない。CYB5RPタンパク質の組換え発現に適した、哺
乳類種に由来する商業的に入手可能な細胞系には、L細胞L-M(TK-)（ATCC CCL 1.
3）、L細胞L-M（ATCC CCL 1.2）、293（ATCC CRL 1573）、Raji（ATCC CCL 86）
、CV-1（ATCC CCL 70）、COS-1（ATCC CRL 1650）、COS-7（ATCC CRL 1651）、C
HO-K1（ATCC CCL 61）、3T3（ATCC CCL 92）、NIH/3T3（ATCC CRL 1658）、HeLa
（ATCC CCL 2）、C127I（ATCC CRL 1616）、BS-C-1（ATCC CCL 26）およびMRC-5
（ATCC CCL 171）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】 哺乳類細胞内で組換えCYB5RPを発現させるためには、種々の哺乳類発現ベクタ
ーを使用することができる。商業的に入手可能な適当な哺乳類発現ベクターには
、pMC1neo（Stratagene）、pSG5（Stratagene）、pcDNAIおよびpcDNAIamp、pcDN
A3、pcDNA3.1、pCR3.1（Invitrogen）、EBO-pSV2-neo（ATCC 37593）、pBPV-1(8
-2)（ATCC 37110）、pdBPV-MMTneo(342-12）（ATCC 37224）、pRSVgpt（ATCC 37
199）、pRSVneo（ATCC 37198）およびpSV2-dhfr（ATCC 37146）が含まれるが、
これらに限定されるものではない。組換え細胞内での発現後、CYB5RPを、通常の
技術により、他のタンパク質を実質的に含有しないレベルにまで精製することが
できる。CYB5RPを発現させるために使用しうるベクターの説明は、例えば、Goed
del編, 1990, Meth. Enzymol. vol. 185またはPerbal, 1988, A Practical Guid
e to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc.に記載されている。
【００３９】 本発明は、他のタンパク質を実質的に含有しないCYB5RPタンパク質を含む。完
全長CYB5RPタンパク質のアミノ酸配列を、図3に配列番号3として示す。したがっ
て、本発明は、配列番号3のアミノ酸配列を有し他のタンパク質を実質的に含有
しないCYB5RPタンパク質を含む。また、選択的スプライシングを受けたCYB5RP m
RNAから産生されるCYB5RPタンパク質であって、アミノ酸317〜328を欠くアミノ
酸配列3を有するタンパク質も、本発明に含まれる。
【００４０】 多数のタンパク質の場合と同様、CYB5RPのアミノ酸の多数を修飾し、それでも
なお、元のタンパク質と実質的に同じ生物活性を保有させることが可能である。
したがって、本発明は、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するがCYB5RPと実
質的に同じ生物活性を依然として保有する修飾CYB5RPタンパク質を含む。単一の
アミノ酸の置換は通常はタンパク質の生物活性を改変しないことが、一般に認め
られている（例えば、Molecular Biology of the Gene, Watsonら, 1987, 第4版
, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., p.226; およびCunningham ＆
Wells, 1989, Science 244:1081-1085を参照されたい）。したがって、本発明
は、配列番号3において1つのアミノ酸置換が施されておりCYB5RPと実質的に同じ
生物活性を依然として保有するポリペプチドを含む。本発明はまた、配列番号3
において2以上のアミノ酸置換が施されておりCYB5RPと実質的に同じ生物活性を
依然として保有するポリペプチドを含む。特に、本発明は、前記置換が同類置換
である実施形態を含む。特に、本発明は、前記置換がCYB5RPHisボックス内に存
在しない実施形態を含む。特に、本発明は、CYB5RPのそれらの位置に存在するア
ミノ酸と、Sperlingら, 1995, Eur. J. Biochem. 232:798-805の図1に示されて
いるヒマワリタンパク質の対応位置に存在するアミノ酸とが、これらの2つのタ
ンパク質をBLASTP分析により整列（アライメント）させた場合に同じである位置
には、前記置換が存在しない実施形態を含む。特に、本発明は、CYB5RPのそれら
の位置に存在するアミノ酸と、CCCTCTACCCCTGTCCCATCAGGC（配列番号15）の対応
位置に存在するアミノ酸とが同じである位置には、前記置換が存在しない実施形
態を含む。
【００４１】 当業者は、配列番号2に基づく他の多数のプライマー対が適当であると認識す
るであろう。
【００４２】 AmpliTaq、AmpliTaq GoldまたはVentポリメラーゼを含む（これらに限定され
るものではない）種々の耐熱性酵素でPCR反応を行なうことができる。AmpliTaq
の場合には、10mM Tris-Cl, pH8.3、2.0mM MgCl2、200μMの各dNTP、50mM KCl、
0.2μMの各プライマー、10ngのDNA鋳型、0.05単位/μlのAmpliTaq中で反応を行
なうことができる。該反応を95℃で3分間加熱し、ついで95℃で20秒間、62℃で2
0秒間、72℃で3分間のサイクリングパラメーターを用いる35サイクルに付す。こ
れらの条件に加えて、適当な種々のPCRプロトコールがPCR Primer, A Laborator
y Manual, C.W. DieffenbachおよびG.S. Dveksler編, 1995, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press、またはPCR Protocols: A Guide to Methods and Applicat
ions, Michaelら編, 1990, Academic Pressに記載されている。
【００４３】 CYB5RPをコードするクローンが単離されうる適当なcDNAライブラリーは、ラム
ダgt10またはラムダgt11ベクター（カタログ番号HL1143aおよびHL1132b, Clonte
ch, Palo Alto, CA）内のヒト網膜5'伸長cDNAライブラリーであろう。そのよう
なライブラリーの一次クローンをプールに細分することができ（各プールは約20
,000個のクローンを含有する）、各プールを別々に増幅することができる。
【００４４】 この方法により、445アミノ酸のオープンリーディングフレーム（配列番号3）
または433アミノ酸のオープンリーディングフレーム（アミノ酸317〜328位を欠
く配列番号3）をコードするcDNA断片を得ることができる。このcDNA断片を、適
当なクローニングベクターまたは発現ベクター内にクローニングすることができ
る。例えば、該断片を、哺乳類発現ベクターpcDNA3.1（Invitrogen, San Diego,
CA）内にクローニングすることができる。ついでCYB5RPまたはその一部をコー
ドする発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入し、該宿主細胞を適当な条件下で
増殖させることにより、CYB5RPタンパク質を産生させることができる。ついで当
技術分野でよく知られた方法により、CYB5RPタンパク質を単離することができる
。
【００４５】 前記PCR法に代わる方法としては、オリゴヌクレオチドプローブでcDNAライブ
ラリーをスクリーニングするための当技術分野でよく知られた方法を用いCYB5RP
に特異的なオリゴヌクレオチドをプローブとして使用して、CYB5RPをコードする
cDNAクローンをcDNAライブラリーから単離することができる。そのような方法は
、例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (
編), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U
.K., Vol. I, IIに記載されている。CYB5RPに特異的でcDNAライブラリーのスク
リーニングに使用されうるオリゴヌクレオチドは、配列番号2に示すCYB5RPのcDN
A配列に基づき容易に設計することができ、当技術分野でよく知られた方法によ
り合成することができる。
【００４６】 CYB5RP遺伝子を含有するゲノムクローンは、商業的に入手可能なヒトPACまた
はBACライブラリー（例えば、Research Genetics, Huntsville, ALから入手可能
なもの）から得ることができる。CYB5RP遺伝子を含有するPACクローン（例えば
、PACクローン759J12、756B3、519O13および466A11）は、Research Genetics, H
untsville, AL（個々のPACクローンのカタログ番号はRPCI.Cである）から商業的
に入手可能である。あるいは、本明細書に開示するCYB5RP配列に基づくプローブ
を使用して、CYB5RP含有ゲノムクローンが単離されうるゲノムライブラリー（特
に、P1人工染色体ベクター中のもの）を調製することができる。そのようなライ
ブラリーの調製方法は当技術分野で公知である（Ioannouら, 1994, Nature Gene
t. 6:84-89）。
【００４７】 本発明はまた、サンプル中のCYB5RP RNAのレベルを測定するために使用しうる
配列番号2に基づくオリゴヌクレオチドプローブを提供する。特に、本発明は、
配列番号2の少なくとも18個の連続したヌクレオチドを含むDNAオリゴヌクレオチ
ドを含む。本発明はまた、対応するRNAオリゴヌクレオチドを提供する。該DNAま
たはRNAオリゴヌクレオチドプローブを、キットとして一括することができる。
【００４８】 前記の有用性に加えて、本発明は、種々の細胞型内でのCYB5RPタンパク質の組
換え発現を可能にする。特に、植物細胞内でCYB5RPを組換え的に発現させるのが
好都合である。植物細胞内でのそのような発現は、高レベルの重要なEFA（例え
ば、GLAおよびOTA）を組換え植物細胞内で製造するための製造方法を提供する。
ルリチシャの場合のデルタ6脂肪酸デサチュラーゼのそのような組換え発現の一
例は、Sayanovaら, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4211-4216（Sayanov
a）に記載されている。ルリチシャデルタ6デサチュラーゼの組換え発現は、それ
が発現されるタバコ植物の葉内での高レベルのGLAおよびOTAの産生をもたらす。
Sayanovaに記載の方法は、タバコ内でのCYB5RPの発現に容易に応用することがで
き、したがって、大量の重要なEFAを製造するための追加的な有用な製造方法を
もたらす。タバコ以外の他の植物種において遺伝子を組換え発現させる公知方法
を用いて、それらの他の種においてCYB5RPを発現させることができる。
【００４９】 本発明はまた、CYB5RPタンパク質の生物学的活性を測定するアッセイの開発を
可能にする。組換え的発現されたCYB5RPタンパク質を使用するそのようなアッセ
イは、特に興味深い。
【００５０】 CYB5RPタンパク質の活性のアクチベーターまたはインヒビターである化合物を
同定するために化合物のライブラリーまたは他の化合物源をスクリーニングする
ために、CYB5RPタンパク質活性に関するアッセイを用いることができる。同定さ
れたそのような化合物は、CYB5RP活性が異常である状態（例えば、皮膚病、糖尿
病合併症、炎症性および自己免疫障害、心臓血管障害、ウイルス感染症の合併症
、ならびに網膜機能不全、例えば黄斑変性）に罹患した患者におけるCYB5RP活性
をモジュレーションするために使用しうる医薬の開発のための「リード体」とし
て有用である。
【００５１】 そのようなアッセイは、 （a）CYB5RPタンパク質を宿主細胞内で組換え的に発現させ、 （b）該組換え発現CYB5RPタンパク質の生物学的活性を、CYB5RPタンパク質の
アクチベーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在
下で測定することを含むことが可能であり、 該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下の該組換え発現CYB5RPタン
パク質の生物学的活性の変化が、該物質がCYB5RPタンパク質のアクチベーターま
たはインヒビターであることを示す。
【００５２】 特定の実施形態においては、該組換え発現CYB5RPタンパク質の生物学的活性は
、リノール酸またはα-リノール酸の6位に二重結合を導入する能力である。
【００５３】 いくつかの実施形態においては、工程（a）と工程（b）との間に追加的な工程
を加えるのが好都合かもしれない。そのような追加的な工程は、該宿主細胞を細
胞溶解し、その内容物を分画して該組換え発現CYB5RPを部分的に精製し、それに
より、該物質および該アッセイで使用するいずれかの基質に該組換え発現CYB5RP
がさらされるのを容易にすることを含む。
【００５４】 本発明は、本明細書に記載の方法により同定されたアクチベーターおよびイン
ヒビター、ならびにそのようなアクチベーターおよびインヒビターを含んでなる
医薬組成物を含む。一般には、該アクチベーターおよびインヒビターを、使用前
に医薬上許容される担体と一緒にして、医薬組成物を得る。アクチベーターまた
はインヒビターと担体とを含有する医薬組成物の製剤化のそのような担体および
方法の具体例は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに記載されている。有
効な投与に適した医薬上許容される組成物を形成させるためには、そのような組
成物は、該アクチベーターまたはインヒビターの有効量を含有するであろう。
【００５５】 治療用または予防用組成物は、CYB5RP活性が異常である状態を治療または予防
するのに十分な量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性別、年
齢などの種々の因子によって様々となりうる。他の因子には、投与様式が含まれ
る。熟練した医師であれば、適当な量を決定することが可能である。
【００５６】 組成物は、単独で適当な投与量で使用することができる。あるいは、他の物質
の同時投与または連続的投与が望ましいことがある。
【００５７】 該組成物は、通常の投与用ビヒクル中の多種多様な治療用剤形で投与すること
ができる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれは時限放出（time
d release）および徐放製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チ
ンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤などの経口剤形として又は注射により
投与することができる。同様に、それらを、静脈内（ボーラスおよび注入の両方
）、腹腔内、皮下、局所（閉塞（occlusion）の存在下または不存在下）または
筋肉内形態として投与することも可能であり、それらはすべて、薬学分野の当業
者によく知られた形態を用いることが可能である。
【００５８】 組成物を単回1日量で投与したり、あるいは合計1日量を2、3または4分割量で
毎日投与するのが有利かもしれない。さらに、組成物は、適当な鼻腔内ビヒクル
の局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者によく知られた経皮皮膚パッチ
の形態を使用して経皮経路により投与することができる。もちろん、経皮デリバ
リーシステムの形態で投与されるためには、該投与量の投与は、該投与計画の全
体にわたり、断続的なものではなく連続的なものとなるであろう。
【００５９】 該組成物を使用する投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および
医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓血管機
能；および使用するその個々の組成物を含む種々の因子に応じて選択される。通
常の技量を有する医師または獣医は、該状態の進行の予防、阻止または停止に必
要な組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うことな
く効力を与える範囲内の組成物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対
する該組成物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは
、組成物の分布、平衡および排泄に関する考慮を含む。
【００６０】 本発明はまた、CYB5RPタンパク質に対する抗体を含む。そのような抗体は、ポ
リクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。本発明の抗体は、当技
術分野でよく知られた方法により、全CYB5RPタンパク質に対して、または適当な
担体（例えば、血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）と共
役した該タンパク質の適当な抗原断片に対して産生させる。タンパク質の適当な
抗原断片を同定する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Hopp ＆ Woods,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824-3828; およびJameson ＆ Wolf, 1
988, CABIOS (Computer Applications in the Biosciences) 4:181-186を参照さ
れたい。
【００６１】 ポリクローナル抗体の産生のためには、CYB5RPタンパク質または抗原断片（適
当な担体と共役させたもの）を、適当な非ヒト宿主動物（例えば、ウサギ、ヒツ
ジ、ヤギ、ラット、マウス）に定期的に注射する。該動物から定期的に採血し、
得られた血清を、注射された抗原に対する抗体の存在に関して試験する。該注射
は、筋肉内、腹腔内、皮下などに行なうことができ、アジュバントと共に行なう
ことができる。
【００６２】 モノクローナル抗体の産生のためには、CYB5RPタンパク質または抗原断片（適
当な担体と共役させたもの）を、ポリクローナル抗体の産生に関して前記したの
と同様の適当な非ヒト宿主動物に注射する。モノクローナル抗体の場合には、該
動物は一般にはマウスである。ついで該動物の脾臓細胞を不死化させる。これは
、しばしば、Kohler ＆ Milstein, 1975, Nature 256:495-497に記載のとおり、
骨髄腫細胞との融合により行なう。モノクローナル抗体の産生の更に詳しい説明
については、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow ＆ Lane編, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, 1988を参照されたい。
【００６３】 CYB5RPポリペプチドを標的器官（例えば、網膜の色素上皮または網膜の他の部
分）の細胞内に導入するために、遺伝子治療を用いることができる。CYB5RPポリ
ペプチドをコードするヌクレオチドを、受容細胞への感染により該ヌクレオチド
の導入を媒介するウイルスベクター内に連結させることができる。適当なウイル
スベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘル
ペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびポリオウイルスに基づくベクターが含
まれる。あるいは、リガンド-ヌクレオチドコンジュゲート、リポフェクション
、膜融合または直接マイクロインジェクションを用いて、受容体媒介標的化導入
（receptor-mediated targeted transfer）を含む非ウイルス技術により、CYB5R
Pポリペプチドをコードするヌクレオチドを遺伝子治療のために細胞内に導入す
ることができる。これらの方法およびそれらの変法は、エクスビボ（ex vivo）
およびインビボ遺伝子治療に適している。CYB5RPポリペプチドでの遺伝子治療は
、CYB5RP活性を上昇させることが有益である疾患の治療に特に有用であろう。
【００６４】 本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものでは
ない。実際のところ、本明細書に記載のものの他に本発明の種々の修飾が、以上
の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は、添付の請求の範
囲の範囲内に含まれると意図される。
【００６５】 本明細書中には種々の刊行物が引用されているが、それらの開示の全体を参照
により本明細書に組み入れることとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 必須脂肪酸の合成のリノール酸（n-3）およびα-リノレン酸（n-6）経路に関
与する酵素変換を示す。
【図２Ａ】 CYB5RP遺伝子のゲノムDNA配列（配列番号1）を示す。
【図２Ｂ】 CYB5RP遺伝子のゲノムDNA配列（配列番号1）を示す。
【図２Ｃ】 CYB5RP遺伝子のゲノムDNA配列（配列番号1）を示す。
【図２Ｄ】 CYB5RP遺伝子のゲノムDNA配列（配列番号1）を示す。
【図２Ｅ】 CYB5RP遺伝子のゲノムDNA配列（配列番号1）を示す。
【図２Ｆ】 CYB5RP遺伝子のゲノムDNA配列（配列番号1）を示す。
【図２Ｇ】 CYB5RP遺伝子のゲノムDNA配列（配列番号1）を示す。
【図３Ａ】 CYB5RPのcDNA配列（配列番号2）およびアミノ酸配列（配列番号3）を示す。
【図３Ｂ】 CYB5RPのcDNA配列（配列番号2）およびアミノ酸配列（配列番号3）を示す。
【図３Ｃ】 CYB5RPのcDNA配列（配列番号2）およびアミノ酸配列（配列番号3）を示す。
【図４】 マウスCYB5RPのcDNA配列の一部（配列番号4）およびアミノ酸配列の一部（配
列番号5）を示す。
【図５Ａ】 CYB5RPのKyte-Doolittleヒドロパシープロットを示す。
【図５Ｂ】 CYB5RPのKyte-Doolittleヒドロパシープロットに基づく、提案されたCYB5RPの
膜位相幾何学を示す。
【図６】 Wisconsin GCGパッケージからのProfilescanプログラムの出力を示す。
【図７Ａ】 完全長CYB5RPアミノ酸配列を照会として使用するGenBankデータベースのBlast
P検索の結果による、最高の相同性を有するヒット（ヒマワリからの仮想タンパ
ク質）を示す。
【図７Ｂ】 完全長CYB5RPアミノ酸配列を照会として使用するGenBankデータベースのBlast
P検索の結果による、2番目に高い相同性を有するヒット[ルリチシャ（Borago of
icinalis）由来のデルタ6デサチュラーゼ]を示す（Sayanovaら，1997，Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 94:4211-4216）。
【図８】 CYB5RPタンパク質を照会として使用するGenBankデータベースのBlastP検索の
追加的な結果を示す。
【図９Ａ】 21サイクルのRT-PCR増幅により測定された9個のヒト組織におけるCYB5RP遺伝
子の発現パターンを示す。
【図９Ｂ】 25サイクルの増幅により行ったヒト組織におけるCYB5RP遺伝子の発現パターン
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 31/12 ４Ｃ０８４ 31/12 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/88 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/88 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/68 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 33/50 Ｐ // Ａ６１Ｋ 38/55 Ｙ 39/395 45/00 48/00 Ｇ０１Ｎ 33/68 45/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 48/00 5/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/64 (72)発明者 キヤスキー，シー・トーマス アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 4B024 AA01 AA11 BA07 CA04 DA02 EA04 GA11 HA12 HA15 4B050 CC01 CC04 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ13 QQ20 QQ79 QQ95 QR59 QR80 QS24 QS28 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA27 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA07 AA17 BA01 BA05 BA08 BA10 BA22 CA18 CA53 CA56 DA39 DC32 DC50 MA22 MA23 MA35 MA37 MA41 MA43 MA52 MA56 MA58 MA59 MA63 MA66 MA67 NA14 ZA332 ZA362 ZA892 ZB112 ZB132 ZB152 ZB332 ZC202 ZC542 4C085 AA14 BB15 BB16 BB22 BB31 CC04 CC05 CC13 CC22 CC23 CC29 DD22 DD23 DD86 DD88 EE01 EE06 FF24 GG03 GG04 GG06 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA22 EA23 EA29 EA50 FA71

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号3のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
    る組換えDNA分子。
  2. 【請求項２】 配列番号1、 配列番号2、 1,019〜1,054位を欠く配列番号2、 配列番号2の71〜1,405位、および 1,019〜1,054位を欠く配列番号2の71〜1,405位よりなる群から選ばれるヌクレオ
    チド配列を含んでなる組換えDNA分子。
  3. 【請求項３】 請求項2に記載のDNA分子にストリンジェントな条件下でハイ
    ブリダイズするDNA分子。
  4. 【請求項４】 請求項1に記載のDNAを含んでなる発現ベクター。
  5. 【請求項５】 請求項1に記載のDNAを含んでなる組換え宿主細胞。
  6. 【請求項６】 配列番号3および317〜328位を欠く配列番号3よりなる群から
    選ばれるアミノ酸配列を有する、他のタンパク質を実質的に含有しないCYB5RPタ
    ンパク質。
  7. 【請求項７】 単一のアミノ酸置換を含有する、請求項6に記載のCYB5RPタ
    ンパク質。
  8. 【請求項８】 該置換が同類置換である、請求項7に記載のCYB5RPタンパク
    質。
  9. 【請求項９】 該タンパク質がアミノ酸置換を含有し、 CYB5RPとヒマワリ由来のデルタ6デサチュラーゼとをBLASTP分析により整列させ
    た場合に、CYB5RP内のそれらの位置に存在するアミノ酸がヒマワリ由来のデルタ
    6デサチュラーゼ内の対応位置にも存在するような位置には、該置換が存在しな
    いか、またはCYB5RPとシネコシスティス（Synechocystis）由来のデルタ6デサチ
    ュラーゼとをBLASTP分析により整列させた場合に、CYB5RP内のそれらの位置に存
    在するアミノ酸がシネコシスティス（Synechocystis）由来のデルタ6デサチュラ
    ーゼ内の対応位置にも存在するような位置には、該置換が存在しないか、または
    CYB5RPとルリチシャ由来のデルタ6デサチュラーゼとをBLASTP分析により整列さ
    せた場合に、CYB5RP内のそれらの位置に存在するアミノ酸がルリチシャ由来のデ
    ルタ6デサチュラーゼ内の対応位置にも存在するような位置には、該置換が存在
    しない、請求項6に記載のCYB5RPタンパク質。
  10. 【請求項１０】 請求項6に記載のCYB5RPタンパク質に特異的に結合する抗
    体。
  11. 【請求項１１】 請求項2に記載の配列の少なくとも1つの少なくとも18個の
    連続したヌクレオチドを含んでなるDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドプローブ。
  12. 【請求項１２】 ある物質がCYB5RPタンパク質のアクチベーターまたはイン
    ヒビターであるか否かを判定するための方法であって、 （a）請求項6に記載のCYB5RPタンパク質を宿主細胞内で組換え的に発現させ、 （b）該組換え発現CYB5RPタンパク質の生物学的活性を、CYB5RPタンパク質の
    アクチベーターまたはインヒビターであると疑われる物質の存在下および不存在
    下で測定することを含んでなり、 該物質の不存在下と比較した場合の該物質の存在下の該組換え発現CYB5RPタン
    パク質の生物学的活性の変化が、該物質がCYB5RPタンパク質のアクチベーターま
    たはインヒビターであることを示すことを特徴とする方法。
  13. 【請求項１３】 CYB5RPタンパク質の生物学的活性が、リノール酸の6位に
    二重結合を導入する能力である、請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 CYB5RPのアクチベーターまたはインヒビターを含んでなる
    医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項14に記載の医薬組成物の有効量を患者に投与するこ
    とを含んでなる、黄斑変性の治療方法。
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