JP2002526037A - N-acetylglycosaminyltransferase gene - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼＶ核酸、該核酸によってコードされるタンパク質ならびに該核酸およびタンパク質の使用。 (57) [Summary] N-acetylglycosaminyltransferase V nucleic acids, proteins encoded by the nucleic acids and uses of the nucleic acids and proteins.
Description
【０００１】 発明の分野 本発明は、新規なＮ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼＶ核酸、該
核酸によってコードされるタンパク質、ならびに該核酸およびタンパク質の使用
に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to novel N-acetylglycosaminyltransferase V nucleic acids, proteins encoded by the nucleic acids, and uses of the nucleic acids and proteins.
【０００２】 発明の背景 タンパク質グリコシル化は、ゴルジ装置において見出される一連の酵素によっ
て媒介される。該経路における酵素の多くは、胚形成、リンパ球活性化の間およ
び癌進行において調節を受ける。細胞表面における炭水化物および分泌または非
分泌（例えば、レポーター）タンパク質の構造的多様性は、それらの機能および
関連する細胞生物学に影響を及ぼす。Ｎ結合オリゴ糖類の−ＧｌｃＮＡｃβ１−
６Ｍａｎα１−６Ｍａｎβ−分枝の生合成を遮断する体細胞突然変異および薬物
は、また、器官コロニー形成、イン・ビトロでの侵入を阻害し、イン・ビボでの
充実性腫瘍成長を制限する。BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Protein glycosylation is mediated by a series of enzymes found in the Golgi apparatus. Many of the enzymes in the pathway are regulated during embryogenesis, lymphocyte activation and in cancer progression. The structural diversity of carbohydrates and secreted or non-secreted (eg, reporter) proteins at the cell surface affects their function and associated cell biology. N-linked oligosaccharide -GlcNAcβ1-
Somatic mutations and drugs that block the biosynthesis of the 6Manα1-6Manβ-branch also inhibit organ colonization, in vitro invasion, and limit solid tumor growth in vivo.
【０００３】 ＧｌｃＮＡｃ−分枝炭水化物構造の合成は、Ｎ−アセチルグリコサミニルトラ
ンスフェラーゼに依存し、その１つがＮ−アセチルグリコサミニルトランスフェ
ラーゼＶ（ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ）である。ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶは、いくつかの細
胞表面および分泌糖タンパク質において見出される分枝複合型Ｎ結合オリゴ糖類
のための生合成経路において１−６ＧｌｃＮＡｃのトリマンノシル・コアへの付
加を触媒する（Schachter, H. (1986) Biochem. Cell. Biol. 64: 163-181）。
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶの１−６ＧｌｃＮＡｃ産物は、細胞−細胞および細胞−基質
相互作用に影響を及ぼす末端ポリラクトサミン配列の付加経路における好ましい
アンテナおよび速度制限基質である（van den Eijnden, D.H.ら、(1988) 263: 1
2461-12465; Yousefi, S.ら、(1991 J. Biol. Chem. 266: 1772-1783;およびHef
fernan, Mら、(1993) J. Biol. Chem. 268: 1242-1251）。[0003] The synthesis of GlcNAc-branched carbohydrate structures relies on N-acetylglycosaminyltransferases, one of which is N-acetylglycosaminyltransferase V (GlcNAc-TV). GlcNAc-TV catalyzes the addition of 1-6GlcNAc to the trimannosyl core in a biosynthetic pathway for branched complex N-linked oligosaccharides found on several cell surfaces and secreted glycoproteins (Schachter, H (1986) Biochem. Cell. Biol. 64: 163-181).
The 1-6GlcNAc product of GlcNAc-TV is a preferred antenna and rate limiting substrate in the addition pathway of terminal polylactosamine sequences that influence cell-cell and cell-substrate interactions (van den Eijnden, DH et al., (1988) ) 263: 1
2461-12465; Yousefi, S. et al. (1991 J. Biol. Chem. 266: 1772-1783; and Hef.
fernan, M et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 1242-1251).
【０００４】 ラット（Shoreibah, M.ら、(1993), 268: 15381-15385）およびヒト（Saito,
H.ら、(1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 198: 318-327 233: 18-26）Ｇ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ配列は、７４１アミノ酸ＩＩ型糖タンパク質を予測する。ヒト
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ遺伝子は、１７個のエキソンを有するヒト染色体２ｑ２１上
に位置し、１５５Ｋｂに及ぶ（Saitoら、(1995) Eur. J. Biochem. 233: 18-26
）。ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ遺伝子の推定プロモーター領域は、ＡＰ１およびＰＥＡ
３／ｅｔｓ結合部位を有し、ｒａｓシグナル化経路に応答する（Buckhaults P J
Biol Chem (1997) 272: 19575-19581）。[0004] Rats (Shoreibah, M. et al. (1993), 268: 15381-15385) and humans (Saito,
H. et al., (1994) Biochem. Biophys. Res. Commun. 198: 318-327 233: 18-26) G
The lcNAc-TV sequence predicts a 741 amino acid type II glycoprotein. The human GlcNAc-TV gene is located on human chromosome 2q21 with 17 exons and spans 155 Kb (Saito et al., (1995) Eur. J. Biochem. 233: 18-26).
). The putative promoter region of the GlcNAc-TV gene is AP1 and PEA.
3 / ets has a binding site and responds to the ras signaling pathway (Buckhaults PJ
Biol Chem (1997) 272: 19575-19581).
【０００５】 ポリオーマウイルス、ｖ−ｓｒｃ、Ｈ−ｒａｓまたはｖ−ｆｐｓによるげっ歯
類繊維芽細胞のオンコジーン形質転換は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ発現の増加を導き
（Yamashita, K.ら、(1985) J. Biol. Chem. 260: 3963-3969; Pierce, Mおよび
Arango, J. (1986) J. Biol. Chem. 261: 10772-10777; Dennis, Jら、(1987) S
cience 236:; 582-585, 1987）、胸部、結腸および皮膚のヒト癌腫において、Ｇ
ｌｃＮＡｃＴＶによって生じた構造は、腫瘍の病理学的段階と相関する（Fernan
des, B.ら、(1991) 51: 718-723）。ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶメッセージは、また、
腫瘍細胞における選択的スプライシングの頻度の増加を受けやすく、幅広く発生
する「腫瘍−関連抗原」として同定されたＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ遺伝子のイントロ
ン配列によってコードされるペプチドを生じる。試験したヒト黒色腫腫瘍の５０
％が該抗原を発現したが、正常な組織において存在しない（Guilloux, Y.ら、(1
996) J. Exp. Med. 183: 1173-1183）。遺伝性肝臓癌のラットモデルにおいて、
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ転写レベルは、原発性腫瘍およびリンパ腺転移において増加
する（Miyoshiら、(1993) Cancer Res. 53: 3899-3902, 1993）。さらに、上皮
細胞におけるＧｌｃＮＡｃ−ＴＶの局所的発現は、形態的形質転換および腫瘍形
成をもたらすが（Demetriou, M.ら、(1995) J. Cell Biol. 130: 383）、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ活性の喪失について選択された腫瘍細胞突然変異体は、イン・ビボ
で悪性の可能性の減少を示す（Lu, Y.ら、(1994) Clin. Exp. Metastasis 12: 4
7-54）。[0005] Oncogene transformation of rodent fibroblasts with the polyomavirus, v-src, H-ras or v-fps, leads to increased GlcNAc-TV expression (Yamashita, K. et al., (1985) J Biol. Chem. 260: 3963-3969; Pierce, M and
Arango, J. (1986) J. Biol. Chem. 261: 10772-10777; Dennis, J et al., (1987) S.
cience 236 :; 582-585, 1987), in human carcinomas of the breast, colon and skin, G
The structure generated by lcNAcTV correlates with the pathological stage of the tumor (Fernan
des, B. et al. (1991) 51: 718-723). The GlcNAc-TV message also
It is susceptible to an increased frequency of alternative splicing in tumor cells, resulting in a peptide encoded by the intron sequence of the GlcNAc-TV gene identified as a widely occurring "tumor-associated antigen". 50 of human melanoma tumors tested
% Expressed the antigen but were absent in normal tissues (Guilloux, Y. et al., (1
996) J. Exp. Med. 183: 1173-1183). In a rat model of hereditary liver cancer,
GlcNAc-TV transcript levels are increased in primary tumors and lymph gland metastases (Miyoshi et al., (1993) Cancer Res. 53: 3899-3902, 1993). Furthermore, local expression of GlcNAc-TV in epithelial cells leads to morphological transformation and tumorigenesis (Demetriou, M. et al. (1995) J. Cell Biol. 130: 383), but GlcNAc-TV.
Tumor cell mutants selected for loss of NAc-TV activity show reduced potential for malignancy in vivo (Lu, Y. et al. (1994) Clin. Exp. Metastasis 12: 4).
7-54).
【０００６】 発明の概要 本発明者らは、新規なＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ核酸分子を同定した。核酸は、本明
細書において、「ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ」または「ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ核
酸分子」および「ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ」または「ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ核
酸分子」と称される。核酸分子によってコードされるタンパク質は、本明細書に
おいて、「ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ」または「ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク
質」および「ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ」または「ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパ
ク質」と称される。SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have identified a novel GlcNAc-TV nucleic acid molecule. Nucleic acids are referred to herein as "glcNAc-TV-b" or "GlcNAc-TV-b nucleic acid molecules" and "glcNAc-TV-c" or "GlcNAc-TV-c nucleic acid molecules". The protein encoded by the nucleic acid molecule is referred to herein as "GlcNAc-TV-b" or "GlcNAc-TV-b protein" and "GlcNAc-TV-c" or "GlcNAc-TV-c protein". You.
【０００７】 広く定められた本発明は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＰＮ
Ａを包含する本発明のタンパク質をコードしている単離核酸分子ならびにそのア
ンチセンス類似体、および生物学的、診断的、予防的、臨床的または治療的に有
用なその変異またはフラグメント、およびそれを含んでなる組成物を意図する。[0007] The broadly defined invention provides for mRNA, DNA, cDNA, genomic DNA, PN
An isolated nucleic acid molecule encoding a protein of the invention including A and antisense analogs thereof, and biologically, diagnostically, prophylactically, clinically or therapeutically useful mutations or fragments thereof, and A composition comprising
【０００８】 特に、本発明は、少なくとも１８個のヌクレオチドを含み、配列番号１の相補
的な核酸配列またはその縮重形態にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
する配列を含む単離ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ核酸
分子を意図する。さらに、本発明の該態様の具体例は、生物学的、診断的、予防
的、臨床的または治療的に有用なその変異およびそれを含んでなる組成物を提供
する。In particular, the present invention relates to an isolated GlcNAc-TV- comprising at least 18 nucleotides and comprising a sequence that hybridizes under stringent conditions to a complementary nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a degenerate form thereof. b or GlcNAc-TV-c nucleic acid molecules are contemplated. Further, embodiments of this aspect of the invention provide for biologically, diagnostically, prophylactically, clinically or therapeutically useful variants thereof and compositions comprising the same.
【０００９】 本発明は、また、本発明の核酸分子によってコードされる単離ＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質、その末端切断型、類似体、
対立遺伝子または種変異、または本発明のタンパク質の相同体、またはその末端
切断型を意図する。（末端切断型、類似体、対立遺伝子または種変異、および相
同体は、集合的に本明細書において「ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質」
または「ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質」と称する）。The present invention also provides an isolated GlcNAc- encoded by a nucleic acid molecule of the present invention.
TV-b or GlcNAc-TV-c protein, truncated forms, analogs thereof,
Allelic or species variations, or homologs of the proteins of the invention, or truncated forms thereof, are contemplated. (Truncated forms, analogs, allelic or species variants, and homologs are collectively referred to herein as "GlcNAc-TV-b-related proteins".
Or "GlcNAc-TV-c related protein").
【００１０】 本発明の核酸分子は、非翻訳核酸配列またはプロモーター領域に作動可能に連
結された遺伝子の発現を特異的に促進する調節配列の同定を可能にする。かかる
プロモーター配列の同定および使用は、遺伝子移入または遺伝子療法のような、
限定的な環境（例えば、ＣＮＳ環境）において異種遺伝子発現を特に必要としう
る場合に特に望ましい。したがって、本発明は、プロモーター配列のような本発
明の核酸分子の調節配列、好ましくは、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｃの調節配列をコードしている核酸を意図する。[0010] The nucleic acid molecules of the present invention allow for the identification of regulatory sequences that specifically promote the expression of untranslated nucleic acid sequences or genes operably linked to a promoter region. The identification and use of such a promoter sequence can be used to control gene transfer, such as gene transfer or gene therapy.
It is particularly desirable where heterologous gene expression may be specifically required in a restricted environment (eg, the CNS environment). Accordingly, the present invention relates to a regulatory sequence for a nucleic acid molecule of the invention, such as a promoter sequence, preferably glcNAc-TV-b or glcN.
A nucleic acid encoding a regulatory sequence of Ac-TV-c is contemplated.
【００１１】 成熟ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質をコー
ドする核酸分子は、成熟ポリペプチドのコーディング配列（配列番号５または９
）のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列および付加的なコーディング配列
（例えば、リーダーまたは分泌配列、プロタンパク質配列）；成熟ポリペプチド
のコーディング配列（および任意の付加的なコーディング配列）および非コーデ
ィング配列、例えば、イントロンまたは成熟ポリペプチドのコーディング配列の
５’および／または３’の非コーディング配列（例えば、配列番号３）を包含し
うる。[0011] The nucleic acid molecule encoding the mature GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c protein comprises the coding sequence of the mature polypeptide (SEQ ID NO: 5 or 9).
) Only; the coding sequence of the mature polypeptide and additional coding sequences (eg, leader or secretory sequence, proprotein sequence); the coding sequence of the mature polypeptide (and any additional coding sequences) and non-coding sequences, eg, , An intron or a non-coding sequence 5 'and / or 3' of the coding sequence of the mature polypeptide (eg, SEQ ID NO: 3).
【００１２】 したがって、「タンパク質をコードしている核酸分子」なる語は、タンパク質
のコーディング配列のみを含む核酸分子ならびに付加的なコーディングおよび／
または非コーディング配列を含む核酸分子を包含する。Thus, the term “nucleic acid molecule encoding a protein” refers to a nucleic acid molecule comprising only the coding sequence of the protein, as well as additional coding and / or
Or nucleic acid molecules containing non-coding sequences.
【００１３】 本発明の核酸は、適当な発現ベクター中に挿入してもよく、該ベクターは、挿
入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有していて
もよい。したがって、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクター（ここに、適
当な１以上の転写および翻訳エレメントが核酸分子に連結している）を構築して
もよい。[0013] The nucleic acids of the invention may be inserted into a suitable expression vector, which may contain the necessary elements for the transcription and translation of the inserted coding sequence. Accordingly, a recombinant expression vector comprising a nucleic acid molecule of the invention, wherein one or more suitable transcription and translation elements are linked to the nucleic acid molecule, may be constructed.
【００１４】 本発明の調節配列ならびに本発明の調節配列が異種タンパク質（すなわち、宿
主細胞において天然に発現されないタンパク質）および転写終止シグナルに作動
可能に連結されているキメラ遺伝子構築物を含むベクターは、本発明の範囲内に
あるとされる。A vector comprising a regulatory sequence of the present invention and a chimeric gene construct in which the regulatory sequence of the present invention is operably linked to a heterologous protein (ie, a protein that is not naturally expressed in a host cell) and a transcription termination signal is provided by the present invention. It is considered to be within the scope of the invention.
【００１５】 宿主細胞を形質転換して、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質、またはＧｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質または異種タンパク質を発現するために、組換
え発現ベクターを使用することができる。したがって、本発明は、さらに、本発
明の組換え分子を含有する宿主細胞を提供する。本発明は、また、その生殖細胞
および体細胞が本発明の核酸分子、特に、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｃの類似体あるいはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｃの末端切断型をコードする核酸分子を含む組換え分子を含有するヒト
以外のトランスジェニック哺乳動物も意図する。[0015] The host cell is transformed into a GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc.
-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein, or Glc
To express a NAc-TV-c related protein or a heterologous protein, a recombinant expression vector can be used. Accordingly, the present invention further provides a host cell containing the recombinant molecule of the present invention. The present invention also provides that the germ cell and somatic cell are the nucleic acid molecules of the present invention, in particular, GlcNAc-TV-b or Glc.
Analogs of NAc-TV-c or GlcNAc-TV-b or GlcNAc
Transgenic non-human mammals containing a recombinant molecule comprising a nucleic acid molecule encoding a truncated form of TV-c are also contemplated.
【００１６】 本発明のタンパク質は、天然細胞供給源由来の単離物として得てもよいが、そ
れらは、好ましくは、組換え手法によって生産される。１の態様において、本発
明は、本発明の精製および単離核酸分子を利用するＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタン
パク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタン
パク質、またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の製法を提供する。１の
具体例において： （ａ）ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タン
パク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連
タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を有する本発明の組換え発現ベク
ターを宿主細胞中に移入し； （ｂ）形質転換した宿主細胞を非形質転換宿主細胞から選択し； （ｃ）選択した形質転換宿主細胞をＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、Ｇｌ
ｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質または
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の発現を可能にする条件下で培養し；次
いで （ｄ）ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タン
パク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連
タンパク質を単離する ことを特徴とするＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ
関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ
−ｃ関連タンパク質の製法が提供される。Although the proteins of the present invention may be obtained as isolates from natural cell sources, they are preferably produced by recombinant techniques. In one embodiment, the present invention relates to a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein, or a GlcNAc-TV-c-related protein utilizing a purified and isolated nucleic acid molecule of the present invention. A method for producing a protein is provided. In one embodiment: (a) a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a nucleotide sequence encoding a GlcNAc-TV-c-related protein of the invention (B) selecting a transformed host cell from non-transformed host cells; and (c) selecting the transformed host cell for GlcNAc-TV-b protein, Gl.
cultured under conditions that allow expression of the cNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein; and (d) GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b protein characterized by isolating a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein.
Related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV
Methods for making -c related proteins are provided.
【００１７】 本発明は、さらに、幅広く、本発明の方法を用いて得られる組換えＧｌｃＮＡ
ｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡ
ｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質を意図す
る。The invention further broadly relates to recombinant GlcNAs obtained using the method of the invention.
c-TV-b protein, GlcNAc-TV-b related protein, GlcNA
A c-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c related protein is contemplated.
【００１８】 本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タ
ンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関
連タンパク質を、タンパク質のような他の分子と結合させて、融合タンパク質ま
たはキメラタンパク質を調製してもよい。これは、例えば、Ｎ末端またはＣ末端
融合タンパク質の合成によって達成されうる。A GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein of the present invention is bound to another molecule such as a protein and fused. A protein or chimeric protein may be prepared. This can be achieved, for example, by synthesis of an N-terminal or C-terminal fusion protein.
【００１９】 本発明は、さらに、本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡ
ｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質のエピトープに対して特異性を有する抗体を意
図する。抗体は、検出可能な物質で標識し、生物学的試料、組織および細胞中で
本発明のタンパク質を検出するために使用してもよい。The present invention further provides a GlcNAc-TV-b protein of the present invention, GlcNA.
c-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or Glc
Antibodies having specificity for an epitope of a NAc-TV-c related protein are contemplated. Antibodies may be labeled with a detectable substance and used to detect the proteins of the invention in biological samples, tissues and cells.
【００２０】 本発明は、また、本発明の核酸分子または本発明のタンパク質に独特のヌクレ
オチドプローブの構築を可能にする。したがって、本発明は、また、本発明のタ
ンパク質をコードしている配列またはその一部を含むプローブに関する。プロー
ブは、例えば、検出可能な物質で標識してもよく、本発明のタンパク質の１以上
の特性を展示するタンパク質をコードしている核酸分子を包含する本発明の核酸
分子をヌクレオチド配列の混合物から選択するために使用してもよい。The present invention also allows for the construction of nucleotide probes unique to the nucleic acid molecules or proteins of the invention. Therefore, the present invention also relates to a probe comprising a sequence encoding the protein of the present invention or a part thereof. The probe may be labeled, for example, with a detectable substance, and the nucleic acid molecule of the present invention, including nucleic acid molecules encoding a protein exhibiting one or more properties of the protein of the present invention, from a mixture of nucleotide sequences. May be used to select.
【００２１】 本発明の１の態様によると、本発明の核酸分子およびタンパク質の存在を決定
することによって、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−
ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
Ｖ−ｃ関連タンパク質によって媒介される病状を診断およびモニターするための
方法および生産物が提供される。According to one aspect of the present invention, by determining the presence of the nucleic acid molecules and proteins of the present invention, GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-
b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-T
Methods and products are provided for diagnosing and monitoring conditions mediated by Vc-related proteins.
【００２２】 またさらに、本発明は、本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の生物学的活性を変調する能力について試
験化合物を評価する方法を提供する。例えば、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク
質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク
質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の触媒活性を阻害または増加す
る物質が評価されうる。「変調する」なる語は、本発明のタンパク質の生物学的
活性における変化または改変をいう。変調は、活性の増加または減少、特徴の変
化、あるいはタンパク質の生物学的、機能的または免疫学的特性におけるいずれ
か他の変化であってもよい。Still further, the present invention provides the GlcNAc-TV-b protein of the present invention, Glc
NAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or G
Methods are provided for evaluating test compounds for their ability to modulate the biological activity of an lcNAc-TV-c related protein. For example, substances that inhibit or increase the catalytic activity of GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein can be evaluated. The term "modulate" refers to a change or an alteration in the biological activity of a protein of the invention. Modulation may be an increase or decrease in activity, a change in characteristics, or any other change in the biological, functional or immunological properties of the protein.
【００２３】 本発明のタンパク質の生物学的活性を変調する化合物は、また、組織および細
胞において、化合物の存在下および不在下で、本発明の核酸分子またはタンパク
質の発現のパターンおよびレベルを比較することによる本発明の方法を用いて同
定されうる。Compounds that modulate the biological activity of a protein of the invention also compare the pattern and level of expression of a nucleic acid molecule or protein of the invention in tissues and cells in the presence and absence of the compound. Identified using the method of the present invention.
【００２４】 また、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ調節配列（例え
ば、プロモーター配列、エンハンサー配列、負のモジュレーター配列）に結合す
る化合物または物質（例えば、タンパク質）を同定する方法が意図される。Also contemplated are methods of identifying compounds or substances (eg, proteins) that bind to glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c regulatory sequences (eg, promoter sequences, enhancer sequences, negative modulator sequences). You.
【００２５】 本発明の方法を用いて同定された物質および化合物は、本発明のＧｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の生物学的
活性を変調するために使用してもよく、それらは、限定するものではないが、癌
のような増殖性疾患、ウイルス、細菌および寄生虫感染を包含するタンパク質に
よって媒介される病状の治療において、造血前駆細胞成長を刺激するか、または
化学療法もしくは放射線治療に対する保護を与えるために使用してもよい。した
がって、本発明の核酸分子およびタンパク質ならびに物質および化合物を、１以
上のこれらの病状に罹患している個体に投与するための組成物に処方してもよい
。したがって、本発明は、また、本発明の１以上の核酸分子またはタンパク質、
あるいは本発明の方法を用いて同定される物質または化合物、および医薬上許容
される担体、賦形剤または希釈剤を含んでなる組成物に関する。これらの病状の
治療または予防を必要とする患者に本発明の組成物を投与することを特徴とする
、これらの病状を治療または予防するための方法もまた、提供される。The substances and compounds identified using the method of the present invention are GlcNAc of the present invention.
-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc
May be used to modulate the biological activity of a TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein, including, but not limited to, proliferative diseases such as cancer, viruses, bacteria. And in the treatment of conditions mediated by proteins, including parasitic infections, may be used to stimulate hematopoietic progenitor cell growth or to provide protection against chemotherapy or radiation therapy. Thus, the nucleic acid molecules and proteins and substances and compounds of the present invention may be formulated into compositions for administration to an individual suffering from one or more of these conditions. Accordingly, the present invention also provides one or more nucleic acid molecules or proteins of the invention,
Alternatively, it relates to a composition comprising a substance or compound identified using the method of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent. Also provided are methods for treating or preventing these conditions, comprising administering a composition of the present invention to a patient in need of treatment or prevention of these conditions.
【００２６】 本発明は、脳に向けられた遺伝子に基づく治療の提供に必要な手段を提供する
。これらの治療物質は、適当なベクター中に置かれるか、またはより直接的な方
法で標的細胞中へデリバリーされるｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｃの調節配列を含む本発明の核酸の全てまたは一部を含むポリヌクレオ
チドの形態をとってもよい。The present invention provides the means necessary to provide gene-based therapy directed at the brain. These therapeutic agents can be placed in a suitable vector or delivered to the target cell in a more direct manner into glcNAc-TV-b or glcNAc.
It may take the form of a polynucleotide comprising all or part of a nucleic acid of the invention comprising a regulatory sequence of -TV-c.
【００２７】 新規なＧｌｃＮＡｃ ＴＶタンパク質およびそれをコードしている核酸を提供
することにより、本発明はさらに、オリゴ糖類、例えば、２以上の糖類の製法を
提供する。特定の具体例において、本発明は、活性化ＧｌｃＮＡｃおよびアクセ
プターを含む反応混合物を本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の存在下で接触させることを特徴とするオ
リゴ糖類の製法に関する。By providing novel GlcNAc TV proteins and nucleic acids encoding the same, the present invention further provides methods for producing oligosaccharides, eg, two or more saccharides. In certain embodiments, the present invention provides a reaction mixture comprising an activated GlcNAc and an acceptor, comprising a GlcNAc-TV-b protein of the invention, GlcNAc.
NAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or G
The present invention relates to a method for producing an oligosaccharide, which comprises contacting in the presence of an lcNAc-TV-c-related protein.
【００２８】 本発明のさらなる態様によると、本発明のタンパク質または核酸を科学的研究
、ＤＮＡの合成およびベクターの製造に関連するイン・ビトロでの目的で利用す
る方法が提供される。 本発明のこれらおよび他の態様、特徴および利益は、以下の図面および詳細な
説明から、当業者に明らかであろう。According to a further aspect of the present invention there is provided a method of utilizing a protein or nucleic acid of the present invention for in vitro purposes related to scientific research, DNA synthesis and vector production. These and other aspects, features, and advantages of the present invention will be apparent to one skilled in the art from the following figures and detailed description.
【００２９】 発明の詳細な記載 本発明によると、当該分野内の通常の分子生物学、微生物学および組換えＤＮ
Ａ技術を用いてもよい。かかる技術は、文献において十分に説明されている。例
えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, N.Y.）；DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes IおよびII
(D.N. Glover編、1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編、1984); N
ucleic Acid Hybridization B.D. Hames & S.J. Higgins編、(1985); Transcrip
tion and Translation B.D. Hames & S.J. Higgins編(1984); Animal Cell Cult
ure R.I. Freshney編、(1986); Immobilized Cells and enzymes IRL Press, (1
986);およびB. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)を参
照のこと。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION According to the present invention, conventional molecular biology, microbiology and recombinant DN within the art
A technology may be used. Such techniques are explained fully in the literature. For example, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, NY); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II
(DN Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ Gait ed., 1984); N
ucleic Acid Hybridization BD Hames & SJ Higgins eds., (1985); Transcrip
tion and Translation BD Hames & SJ Higgins (1984); Animal Cell Cult
ure RI Freshney ed., (1986); Immobilized Cells and enzymes IRL Press, (1
986); and B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
【００３０】 本発明の核酸分子 上記のように、本発明は、単離ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂおよびＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｃ核酸分子を提供する。ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂおよびＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
Ｖ−ｃ核酸分子は、その３’末端において異なる。[0030] As described above, the present invention relates to isolated GlcNAc-TV-b and GlcNAc-
A TV-c nucleic acid molecule is provided. GlcNAc-TV-b and GlcNAc-T
Vc nucleic acid molecules differ at their 3 'end.
【００３１】 「単離」なる語は、その自然環境から取り除かれた、精製された、または分離
された、あるいは組換えＤＮＡ技術によって生産される場合、細胞質性物質また
は培養培地、または化学反応物、または化学合成される場合、他の化学物質から
実質的に遊離した核酸（またはタンパク質）をいう。好ましくは、単離核酸分子
は、天然で結合されている他の成分から少なくとも６０％遊離、より好ましくは
、少なくとも７５％遊離、最も好ましくは、少なくとも９０％遊離している。「
核酸」なる語は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含する修
飾または非修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、または混合ポリマーを包含することを意味し、
１本鎖、２本鎖または３本鎖のいずれかであることができる。例えば、核酸配列
は、１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域、または１本鎖、２本
鎖および３本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖または２本鎖ＲＮＡ、１本鎖
、またはより典型的には、２本鎖、または３本鎖であってもよいＲＮＡ、ＲＮＡ
またはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む領域の混合であってもよ
い。かかる領域における鎖は、同じ分子または異なる分子由来であってもよい。
ＤＮＡまたはＲＮＡは、１以上の修飾した塩基を含有していてもよい。例えば、
ＤＮＡまたはＲＮＡは、安定性または他の理由のために修飾された骨格を有して
いてもよい。核酸配列は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレ
オチドを包含する。「核酸分子」なる語は、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡにおいて
、１次および２次構造のみをいい、いずれかの特定の３次形態に限定しない。The term “isolated” refers to a cytoplasmic substance or culture medium, or a chemical reactant, that has been removed from its natural environment, purified or isolated, or produced by recombinant DNA technology. Or, when chemically synthesized, refers to nucleic acids (or proteins) substantially free of other chemicals. Preferably, the isolated nucleic acid molecule is at least 60% free, more preferably at least 75%, most preferably at least 90% free from other components with which it is naturally associated. "
The term "nucleic acid" is meant to include modified or unmodified DNA, RNA, or mixed polymers, including mRNA, DNA, cDNA and genomic DNA,
It can be either single-stranded, double-stranded or triple-stranded. For example, the nucleic acid sequence may be single-stranded or double-stranded DNA, DNA that is a single-stranded and double-stranded region, or a mixture of single-stranded, double-stranded and triple-stranded regions, single-stranded or double-stranded. RNA, RNA, which may be single-stranded, or more typically double-stranded, or triple-stranded
Alternatively, it may be a mixture of DNA, or a region containing both RNA and DNA. The chains in such regions may be from the same or different molecules.
DNA or RNA may contain one or more modified bases. For example,
DNA or RNA may have backbones modified for stability or other reasons. Nucleic acid sequences include oligonucleotides, nucleotides or polynucleotides. The term “nucleic acid molecule” particularly refers to only primary and secondary structures in DNA or RNA, and is not limited to any particular tertiary form.
【００３２】 本発明の具体例において： （ｉ）配列番号２、４、６、１０または１２のアミノ酸配列に対し、実質的な
配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％の
実質的な配列同一性を有するタンパク質をコードしている核酸配列； （ｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列； （ｉｉｉ）遺伝コードの縮重のため、コドン配列において（ｉ）または（ｉｉ
）の核酸のいずれかと異なる核酸配列； （ｉｖ）少なくとも１８個のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな条件下
で、配列番号１、３、５、９または１１の核酸配列またはその縮重形態にハイブ
リダイズできる核酸配列；In an embodiment of the invention: (i) a substantial sequence identity, preferably at least 70%, more preferably at least 75%, to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10 or 12 (Ii) a nucleic acid sequence complementary to (i); (iii) a (i) or (ii) in the codon sequence due to the degeneracy of the genetic code.
(Iv) comprising at least 18 nucleotides and hybridizing under stringent conditions to the nucleic acid sequence of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9 or 11 or a degenerate form thereof. Possible nucleic acid sequence;
【００３３】 （ｖ）配列番号２、４、６、１０または１２のアミノ酸配列を含むタンパク質
の末端切断型、類似体、対立遺伝子または種変異をコードしている核酸配列；ま
たは （ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメント、または対立遺伝
子もしくは種変異 を含む単離核酸が意図される。(V) a nucleic acid sequence encoding a truncated form, analog, allele or species variation of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10 or 12; or (vi) (i ), (Ii) or (iii) fragments, or isolated nucleic acids containing allelic or species variations.
【００３４】 特定の具体例において、単離核酸は： （ｉ）配列番号１、３、５、９または１１のヌクレオチド配列に対して実質的
な配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％
の配列同一性を有する核酸配列； （ｉｉ）（ｉ）に相補的、好ましくは、配列番号１、３、５、９または１１の
全長核酸配列に相補的な核酸配列； （ｉｉｉ）遺伝コードの縮重のため、コドン配列において（ｉ）ないし（ｉｉ
）の核酸のいずれかと異なる核酸配列；または （ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメント、または対立遺伝
子もしくは種変異 を含む。In certain embodiments, the isolated nucleic acid is: (i) substantial sequence identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9, or 11, preferably at least 70%, more preferably At least 75%
(Ii) a nucleic acid sequence complementary to (i), preferably complementary to the full-length nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9 or 11; (iii) the genetic code Due to degeneracy, (i) to (ii) in the codon sequence
Or (iv) a fragment of (i), (ii) or (iii), or an allele or species mutation.
【００３５】 「相補的」なる語は、許容する塩および温度条件下での塩基対合による核酸分
子の天然の結合をいう。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、相補的配列「Ｔ−Ｃ−
Ａ」に結合する。２つの１本鎖分子間の相補性は、核酸のいくつかのみが結合す
る「部分的」であってもよく、または全体の相補性が１本鎖分子間に存在する完
全であってもよい。The term “complementary” refers to the natural association of nucleic acid molecules by base pairing under acceptable salt and temperature conditions. For example, the sequence "AGT" is replaced by the complementary sequence "TC-
A ". The complementarity between two single-stranded molecules may be "partial," in which only some of the nucleic acids bind, or the entire complementarity may exist between the single-stranded molecules. .
【００３６】 好ましい具体例において、単離核酸は、配列番号２、４、６、１０または１２
のアミノ酸配列によってコードされる核酸配列を含むか、または配列番号１、３
、５、９または１１のヌクレオチド配列（ここに、ＴはＵであることもできる ）を含む。In a preferred embodiment, the isolated nucleic acid is SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10 or 12
Comprising the nucleic acid sequence encoded by the amino acid sequence of
, 5, 9 or 11 nucleotides, wherein T can also be U.
【００３７】 「配列類似性」または「配列同一性」なる語は、配列を比較することによって
決定される２以上のアミノ酸または核酸配列間の関係をいい、該関係は、一般に
、「相同性」として知られている。また、当該分野において同一性とは、場合に
より、かかる一連の配列間の対合によって決定される場合、アミノ酸または核酸
配列間の配列関連の度合いを意味する。同一性および類似性の両方とも、容易に
計算することができる（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編、Oxf
ord University Press New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genom
e Projects, Smith, D.W.編、Academic Press, New York, 1993; Computer Anal
ysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編、Human
a Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von H
einje, G., Academic Press, New York, 1987;およびSequence Analysis Primer
, Gribskov, MおよびDevereux, J.編、M. Stockton Press, New York, 1991）。
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列間の同一性および類似性を測定するた
めのいくつかの現存する方法があるが、どちらの用語も当業者によく知られてい
る（Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Pre
ss, New York, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.およびDevereux
, J.編、M. Stockton Press, New York, 1991; およびCarillo, H.,およびLipma
n, D. SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988）。同一性を決定するための好
ましい方法は、試験配列間の最も大きい対合を得るように設計される。同一性を
決定するための方法は、コンピュータープログラムにおいて体系化されている。
２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープ
ログラム方法は、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Deve
reux, J.ら、Nucleic Acids Research 12(1): 387, 1984）、ＢＬＡＳＴＰ、Ｂ
ＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Atschul, S.F.ら、J. Molec. Biol. 215:403, 19
90）を包含する。同一性または類似性は、また、Dayhoffら；Methods in Enzymo
logy 91: 524-545 (1983)のアラインメントアルゴリズムを用いて決定してもよ
い。The term “sequence similarity” or “sequence identity” refers to a relationship between two or more amino acid or nucleic acid sequences determined by comparing the sequences, which relationship is generally referred to as “homology”. Also known as In the art, identity also means the degree of sequence relatedness between amino acid or nucleic acid sequences, as the case may be, as determined by pairing between such sequences. Both identity and similarity can be readily calculated (Computational Molecular Biology, Lesk, ed., Oxf.
ord University Press New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genom
e Projects, Smith, DW, Academic Press, New York, 1993; Computer Anal
ysis of Sequence Data, Part I, Griffin, AM and Griffin, HG, Human
a Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von H
einje, G., Academic Press, New York, 1987; and Sequence Analysis Primer
, Gribskov, M and Devereux, J. Ed., M. Stockton Press, New York, 1991).
There are several existing methods for measuring the identity and similarity between two amino acid sequences or two nucleic acid sequences, both terms being well known to those skilled in the art (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Pre
ss, New York, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M., and Devereux
, J. Ed., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipma.
n, D. SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988). Preferred methods for determining identity are designed to obtain the largest match between test sequences. Methods for determining identity are codified in computer programs.
Preferred computer programming methods for determining identity and similarity between two sequences include, but are not limited to, the GCG program package (Deve
reux, J. et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387, 1984), BLASTP, B
LASTN and FASTA (Atschul, SF et al., J. Molec. Biol. 215: 403, 19
90). Identity or similarity can also be determined by Dayhoff et al .; Methods in Enzymo.
logy 91: 524-545 (1983).
【００３８】 好ましくは、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、５、９または１１に対し
、本明細書に引用される好ましいコンピュータープログラムを用いて実質的な配
列同一性、例えば、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％の核酸
同一性；まだより好ましくは少なくとも８０％の核酸同一性；最も好ましくは少
なくとも９０〜９５％の配列同一性を有する。Preferably, the nucleic acid molecule of the invention has substantial sequence identity to SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9 or 11 using the preferred computer programs cited herein, eg at least 70%, more preferably at least 75% nucleic acid identity; still more preferably at least 80% nucleic acid identity; most preferably at least 90-95% sequence identity.
【００３９】 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質
をコードし、かつ、遺伝コードの縮重のため、配列番号１、３、５、９または１
１の核酸配列と異なる配列を有する単離核酸分子もまた、本発明の範囲内である
。かかる核酸分子は、遺伝コードの縮重のため、配列が配列番号１、３、５、９
または１１の配列と異なるが、同等のタンパク質をコードする。一例として、ｇ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ内のＤＮＡ配列多形は、ア
ミノ酸配列に影響を及ぼさないサイレント突然変異を生じうる。天然の対立遺伝
子変異のため、１以上のヌクレオチドの変異が集団内の個体間に存在しうる。か
かる核酸変異のいずれかおよび全ては、本発明の範囲内である。また、ＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｂタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質のアミノ酸
配列において変化をもたらすＤＮＡ配列多形が起こりうる。これらのアミノ酸多
形もまた、本発明の範囲内である。さらに、種変異、すなわち、異なる種間で天
然に生じるヌクレオチド配列における変異は、本発明の範囲内である。GlcNAc-TV-b protein or GlcNAc-TV-c protein and, due to the degeneracy of the genetic code, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9 or 1
An isolated nucleic acid molecule having a sequence that differs from one nucleic acid sequence is also within the scope of the invention. Such nucleic acid molecules have the sequence of SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9 due to the degeneracy of the genetic code.
Or encodes a protein different from, but equivalent to, the sequence of 11. As an example, g
DNA sequence polymorphisms in lcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c can result in silent mutations that do not affect the amino acid sequence. Due to natural allelic variations, one or more nucleotide variations may exist between individuals in a population. Any and all such nucleic acid variations are within the scope of the present invention. GlcN
DNA sequence polymorphisms can occur that result in changes in the amino acid sequence of the Ac-TV-b or GlcNAc-TV-c proteins. These amino acid polymorphisms are also within the scope of the present invention. In addition, species variations, ie, variations in the nucleotide sequence that occur naturally between different species, are within the scope of the invention.
【００４０】 本発明の別の態様は、選択的条件下、例えば、高ストリンジェントな条件下で
、本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタ
ンパク質をコードする配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸分子を提供する
。好ましくは、該配列は、配列番号２、４、６、１０または１２のアミノ酸配列
をコードし、少なくとも１８個のヌクレオチドを含む。ハイブリダイゼーション
の選択性は、ランダムであるよりもむしろ、ある特定の度合いの特異性によって
起こる。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条
件は、当業者によく知られており、Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6において見出すことができる。
低または高ストリンジェンシーのいずれかを含む多くの同等条件は、配列の長さ
および性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基構成）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基
構成）、環境（溶液中または固体基質上に固定される）、塩および他の成分の濃
度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよび／またはポリエチレングリ
コール）および反応温度（プローブの融点の約５℃以下から融点の約２０℃〜２
５℃以下の範囲内）のような因子に依存する。上記の条件と同等であるが、異な
る低または高ストリンジェンシーのいずれかの条件を生じるために、１以上の因
子を変化させてもよい。例えば、約４５℃で６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸
ナトリウム（ＳＳＣ）または０．５％ＳＤＳ、次いで、５０℃で２．０ｘＳＳＣ
の洗浄を用いてもよい。ストリンジェンシーは、洗浄工程において用いられる条
件に基づいて選択されうる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃で約０
．２ｘＳＳＣの高ストリンジェンシーから選択できる。さらに、洗浄工程におけ
る温度は、約６５℃での高ストリンジェンシー条件であることができる。Another aspect of the present invention relates to a nucleic acid comprising a sequence encoding a GlcNAc-TV-b protein or a GlcNAc-TV-c protein of the invention under selective conditions, eg, under high stringency conditions. A hybridizing nucleic acid molecule is provided. Preferably, the sequence encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10 or 12, and comprises at least 18 nucleotides. Hybridization selectivity occurs with a certain degree of specificity, rather than being random. Suitable stringency conditions that promote DNA hybridization are well known to those skilled in the art, and are described in Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6.
Many equivalent conditions, including either low or high stringency, include sequence length and nature (DNA, RNA, base composition), target properties (DNA, RNA, base composition), environment (solution or solid substrate). ), The concentration of salts and other components (eg, formamide, dextran sulfate and / or polyethylene glycol) and the reaction temperature (below about 5 ° C below the melting point of the probe to about 20 ° C
5 ° C. or less). One or more factors may be varied to produce conditions that are equivalent to those described above, but either different low or high stringency. For example, at about 45 ° C., 6.0 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) or 0.5% SDS, then at 50 ° C., 2.0 × SSC
May be used. Stringency can be selected based on the conditions used in the washing step. For example, the salt concentration in the washing step is about 0 at 50 ° C.
. You can choose from the high stringency of 2xSSC. Further, the temperature in the washing step can be high stringency conditions at about 65 ° C.
【００４１】 本発明が本明細書に記載のように、タンパク質の末端切断型、対立遺伝子およ
び種変異、および類似体を包含するＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をコードする核酸分子を包含することは、
評価されるであろう。特に、本発明の核酸分子のフラグメントは、少なくとも約
１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１８、最も好まし
くは少なくとも２０個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも５０〜２００
個のヌクレオチドの長さであり、２ｋｂ未満であることが意図される。さらに、
本発明のｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生じる本
発明の核酸分子の変異形態が本発明に包含されることが評価されるであろう。The GlcNAc-TV-b protein, which includes truncated forms, allelic and species variants, and analogs of the protein, as described herein, Glc
NAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or G
Including a nucleic acid molecule encoding an lcNAc-TV-c related protein comprises:
Will be appreciated. In particular, a fragment of a nucleic acid molecule of the invention has at least about 10, preferably at least 15, more preferably at least 18, most preferably at least 20 nucleotides, more typically at least 50 to 200 nucleotides.
Nucleotides in length and is intended to be less than 2 kb. further,
It will be appreciated that mutant forms of the nucleic acid molecules of the invention resulting from alternative splicing of mRNA corresponding to the cDNA of the invention are encompassed by the present invention.
【００４２】 ＤＮＡを含む本発明の単離核酸分子は、配列番号１、３、５、９または１１の
核酸配列の全てまたは一部に基づく標識した核酸プローブを調製することによっ
て単離できる。標識した核酸プローブは、適当なＤＮＡライブラリー（例えば、
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー）をスクリーンするために使用される
。例えば、ｃＤＮＡライブラリーは、標準的技術を用いて標識したプローブでラ
イブラリーをスクリーニングすることによって、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパ
ク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパ
ク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をコードしているｃＤＮＡを
単離するために使用できる。別法では、ゲノムＤＮＡライブラリーを同様にスク
リーンして、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺伝子を包
含するゲノムクローンを単離することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングによって単離された核酸は、標準的技術によって配
列決定することができる。An isolated nucleic acid molecule of the present invention, including DNA, can be isolated by preparing a labeled nucleic acid probe based on all or a portion of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9, or 11. The labeled nucleic acid probe can be used in a suitable DNA library (eg,
cDNA or genomic DNA libraries). For example, a cDNA library can be screened with labeled probes using standard techniques to produce a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV protein. -C can be used to isolate cDNA encoding related proteins. Alternatively, genomic DNA libraries can be similarly screened to isolate genomic clones containing the glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c gene. Nucleic acids isolated by screening a cDNA or genomic DNA library can be sequenced by standard techniques.
【００４３】 また、ＤＮＡである本発明の単離核酸分子は、本発明の核酸を選択的に増幅す
ることによって単離できる。「増幅する」または「増幅」なる語は、核酸配列の
付加的なコピーの生産をいい、一般に、当該分野でよく知られたポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて行われる（Dieffenbach, C.W.およびG.S. Dveksl
er (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Pla
inview. N.Y.）。特に、ＰＣＲにおいて使用するための配列番号１、３、５、７
、８、９または１１のヌクレオチド配列由来の合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーを設計することが可能である。これらのオリゴヌクレオチドプライマーおよび
標準的ＰＣＲ増幅技術を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから核酸を増幅す
ることができる。そのように増幅された核酸を適当なベクター中にクローン化で
き、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。ｃＤＮＡは、種々の技術
により、例えば、Chirgwinら, Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979)のグアニジ
ニウム−チオシアネート抽出法を用いることによって、全細胞性ｍＲＮＡを単離
することによって、ｍＲＮＡから調製してもよい。次いで、逆転写酵素（例えば
、Gibco/BRL, Bethesda, MDから入手可能なMoloney MLV 逆転写酵素またはSeika
gaku America, Inc., St. Petersburg, FLから入手可能なAMV逆転写酵素）を用
いて、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成する。The isolated nucleic acid molecule of the present invention, which is DNA, can be isolated by selectively amplifying the nucleic acid of the present invention. The term "amplify" or "amplification" refers to the production of additional copies of a nucleic acid sequence and is generally performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique well known in the art (Dieffenbach, CW and GS Dveksl
er (1995) PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Pla
inview. NY). In particular, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 for use in PCR
, 8, 9 or 11 nucleotide sequences can be designed. Nucleic acids can be amplified from cDNA or genomic DNA using these oligonucleotide primers and standard PCR amplification techniques. The nucleic acid so amplified can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis. cDNA is prepared from mRNA by various techniques, for example, by isolating total cellular mRNA by using the guanidinium-thiocyanate extraction method of Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299 (1979). Is also good. Then reverse transcriptase (eg Moloney MLV reverse transcriptase or Seika available from Gibco / BRL, Bethesda, MD)
cDNA is synthesized from mRNA using gaku America, Inc., AMV reverse transcriptase available from St. Petersburg, FL).
【００４４】 ＲＮＡである本発明の単離核酸分子は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質ま
たはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をコードしているｃＤＮＡを、ｃＤ
ＮＡの転写が可能な適当なベクター中でクローン化して、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−
ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−
ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をコードするＲＮＡ
分子を生産することによって単離できる。例えば、ｃＤＮＡをベクター中のバク
テリオファージプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）の下流にクローン化
でき、Ｔ７ポリメラーゼを用いてｃＤＮＡをイン・ビトロで転写でき、通常の技
術により、得られたＲＮＡを単離できる。[0044] The isolated nucleic acid molecule of the invention, which is RNA, comprises a GlcNAc-TV-b protein,
A GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a cDNA encoding a GlcNAc-TV-c-related protein can be obtained by converting
Cloning in an appropriate vector capable of transcription of NA, GlcNAc-TV-
b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-
RNA encoding c protein or GlcNAc-TV-c related protein
It can be isolated by producing the molecule. For example, cDNA can be cloned downstream of a bacteriophage promoter (eg, T7 promoter) in a vector, cDNA can be transcribed in vitro using T7 polymerase, and the resulting RNA can be isolated by conventional techniques. .
【００４５】 本発明の核酸分子は、標準的技術を用いて化学的に合成してもよい。ポリデオ
キシヌクレオチドを化学的に合成する方法は既知であり、限定するものではない
が、ペプチド合成のように市販のＤＮＡシンセサイザーにおいて完全に自動化さ
れた固相合成を包含する（例えば、Itakuraら、米国特許第４，５９８，０４９
号；Caruthersら、米国特許第４，４５８，０６６号；およびItakura米国特許第
４，４０１，７９６号および４，３７３，０７１号を参照）。[0045] The nucleic acid molecules of the invention may be chemically synthesized using standard techniques. Methods for chemically synthesizing polydeoxynucleotides are known and include, but are not limited to, fully automated solid phase synthesis on commercially available DNA synthesizers, such as peptide synthesis (eg, Itakura et al., US Patent No. 4,598,049
Caruthers et al., U.S. Patent No. 4,458,066; and Itakura U.S. Patent Nos. 4,401,796 and 4,373,071).
【００４６】 特定の核酸分子がｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃであ
るか、あるいはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関
連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−
ｃ関連タンパク質をコードするかどうかの決定は、標準的技術により、適当な宿
主細胞中でそのｃＤＮＡを発現し、本明細書に記載の方法で発現タンパク質を試
験することによって達成できる。ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｃ ｃＤＮＡあるいはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をコードしているｃＤＮＡは、ジデオキシヌクレ
オチド・チェーン・ターミネーションまたはマキシム−ギルバート化学的配列決
定のような標準的技術によって配列決定でき、核酸配列およびコード化タンパク
質の予測アミノ酸配列を決定することができる。The particular nucleic acid molecule is glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c, or a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-
Determination of whether it encodes a c-related protein can be accomplished by expressing the cDNA in a suitable host cell by standard techniques and testing the expressed protein in the manner described herein. GlcNAc-TV-b or GlcNAc-
TV-c cDNA or GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc
-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcN
The cDNA encoding the Ac-TV-c related protein can be sequenced by standard techniques such as dideoxynucleotide chain termination or Maxim-Gilbert chemical sequencing, and the nucleic acid sequence and predicted amino acid sequence of the encoded protein. Can be determined.
【００４７】 本発明の核酸分子の開始コドンおよび非翻訳配列は、その目的で設計されたコ
ンピューターソフトウェア、例えば、ＰＣ／Ｇｅｎｅ（InteliGenetics Inc., C
alif.）を用いて決定してもよい。本発明の核酸分子の、および／またはＧｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をコ
ードしているイントロン−エクソン構造および転写調節配列は、本発明の核酸分
子を用いてゲノムＤＮＡクローンライブラリーをプローブすることによって同定
してもよい。調節エレメントは、標準的技術を用いて同定できる。エレメントの
機能は、これらのエレメントを用いて、該エレメントに作動可能に連結されたｌ
ａｃＺ遺伝子のようなレポーター遺伝子を発現させることによって確認できる。
これらの構築物は、通常の手法を用いて培養細胞中に、またはヒト以外のトラン
スジェニック動物モデル中に導入してもよい。ＤＮＡにおいて調節エレメントを
同定することのほかに、かかる構築物は、当該分野で既知の技術を用いて、該エ
レメントと相互作用する核タンパク質を同定するために用いてもよい。The initiation codon and the untranslated sequence of the nucleic acid molecule of the present invention can be obtained by computer software designed for that purpose, for example, PC / Gene (InteliGenetics Inc., C
alif.). The nucleic acid molecule of the invention and / or Glc
NAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b related protein, Glc
Intron-exon structures and transcriptional regulatory sequences encoding a NAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c related protein were identified by probing a genomic DNA clone library using the nucleic acid molecules of the invention. Is also good. Regulatory elements can be identified using standard techniques. The function of the elements is to use these elements to operably link them.
It can be confirmed by expressing a reporter gene such as the acZ gene.
These constructs may be introduced into cultured cells using conventional techniques, or into non-human transgenic animal models. In addition to identifying regulatory elements in DNA, such constructs may be used to identify nuclear proteins that interact with the element using techniques known in the art.
【００４８】 本発明の１の態様によると、プロモーター配列のようなＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−
ｂ調節配列を含む核酸が提供される。特に： （ｉ）配列番号７または８の配列に対し、少なくとも７５％の配列同一性を有
する核酸配列； （ｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列； （ｉｉｉ）遺伝コードの縮重のため、コドン配列において（ｉ）または（ｉｉ
）の核酸のいずれかと異なる核酸配列；According to one aspect of the present invention, GlcNAc-TV-
b A nucleic acid comprising a regulatory sequence is provided. In particular: (i) a nucleic acid sequence having at least 75% sequence identity to the sequence of SEQ ID NO: 7 or 8, (ii) a nucleic acid sequence complementary to (i); (iii) due to the degeneracy of the genetic code , In the codon sequence (i) or (ii)
A) a nucleic acid sequence different from any of the nucleic acids;
【００４９】 （ｉｖ）少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチドを
含み、かつ、ストリンジェントな条件下で、配列番号７または８の核酸配列また
はその縮重形態にハイブリダイズできる核酸配列； （ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメント、あるいは対立遺伝
子または種変異 を含む単離核酸分子が意図される。(Iv) a nucleic acid sequence comprising at least 10, most preferably at least 18 nucleotides and capable of hybridizing under stringent conditions to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8 or a degenerate form thereof; v) Fragments of (i), (ii) or (iii), or isolated nucleic acid molecules containing allelic or species variations are contemplated.
【００５０】 好ましい具体例において、単離核酸は、配列番号７または８の核酸配列（ここ
に、ＴはＵであることもできる）を含む。 本発明は、適当なベクター中に含有されるｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ遺伝子また
はｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺伝子（例えば、配列番号７または８）の調節配列を
含む本発明の核酸の全てまたは一部を含む核酸分子を意図する。該ベクターは、
異種核酸配列を含有していてもよい。「異種核酸」なる語は、細胞中にまたは細
胞の染色体部位に天然に位置しない核酸をいう。好ましくは、異種核酸は細胞に
対して外来の核酸を包含する。In a preferred embodiment, the isolated nucleic acid comprises the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 7 or 8, wherein T can be U. The present invention includes all or a part of the nucleic acid of the present invention containing the regulatory sequence of glcNAc-TV-b gene or glcNAc-TV-c gene (for example, SEQ ID NO: 7 or 8) contained in a suitable vector. A nucleic acid molecule is intended. The vector is
It may contain a heterologous nucleic acid sequence. The term "heterologous nucleic acid" refers to a nucleic acid that is not naturally located in the cell or at a chromosomal site in the cell. Preferably, heterologous nucleic acids include nucleic acids foreign to the cell.
【００５１】 本発明の別の態様によると、本明細書に記載の方法を用いて単離された核酸は
、突然変異体ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ対立遺伝子
である。例えば、該突然変異対立遺伝子は、癌の徴候に寄与する遺伝子型を有す
ることが知られているかまたはそのように考えられる個体から単離してもよい。
突然変異対立遺伝子および突然変異対立遺伝子産物は、本明細書に記載の治療お
よび診断方法において使用してもよい。例えば、突然変異ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−
ｂ遺伝子のｃＤＮＡは、本明細書に記載のようにＰＣＲを用いて単離してもよく
、突然変異対立遺伝子のＤＮＡ配列は、突然変異遺伝子産物の機能の喪失または
改変の原因である突然変異を突きとめるために、正常な対立遺伝子と比較しても
よい。また、突然変異対立遺伝子を有する疑いのある、またはそのことが知られ
ている個体由来のＤＮＡを用いて、ゲノムライブラリーを構築でき、あるいは突
然変異対立遺伝子を発現することが知られているかまたはその疑いのある組織由
来のＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築できる。次いで、正常なｇｌ
ｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ遺伝子またはそのいずれかの適当なフラグメントをコードし
ている核酸を標識し、プローブとして用いて、かかるライブラリー中の対応する
突然変異対立遺伝子を同定してもよい。突然変異配列を含有するクローンを精製
し、配列分析に付すことができる。さらに、突然変異ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ対
立遺伝子を発現することが知られているかまたはその疑いのある個体の組織から
単離されたＲＮＡ由来のｃＤＮＡを用いて、発現ライブラリーを構築することが
できる。推定の突然変異組織由来の遺伝子産物が発現し、例えば、本明細書に記
載のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タン
パク質に特異的な抗体を用いて、スクリーンしてもよい。抗体を用いて同定され
たライブラリークローンを精製し、配列分析に付すことができる。According to another aspect of the present invention, the nucleic acid isolated using the methods described herein is a mutant glcNAc-TV-b or a glcNAc-TV-c allele. For example, the mutant allele may be isolated from an individual known or thought to have a genotype that contributes to the manifestation of cancer.
Mutant alleles and mutant allele products may be used in the therapeutic and diagnostic methods described herein. For example, the mutant glcNAc-TV-
The cDNA of the b gene may be isolated using PCR as described herein, and the DNA sequence of the mutated allele may contain the mutation responsible for the loss or alteration of function of the mutated gene product. To locate, one may compare to the normal allele. In addition, genomic libraries can be constructed using DNA from individuals suspected of, or known to have, a mutant allele, or are known to express a mutant allele or A cDNA library can be constructed using RNA from the suspected tissue. Then the normal gl
The nucleic acid encoding the cNAc-TV-b gene or any suitable fragment thereof may be labeled and used as a probe to identify the corresponding mutant allele in such a library. Clones containing the mutated sequence can be purified and subjected to sequence analysis. In addition, expression libraries can be constructed using cDNA from RNA isolated from tissues of individuals known or suspected of expressing the mutant glcNAc-TV-b allele. . Gene products from the putative mutant tissue are expressed and may be screened, for example, using an antibody specific for a GlcNAc-TV-b protein or a GlcNAc-TV-b-related protein described herein. The library clones identified using the antibodies can be purified and subjected to sequence analysis.
【００５２】 アンチセンス分子およびリボザイムは、本発明の範囲内であることが意図され
る。「アンチセンス」なる語は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に相補的なヌク
レオチド配列を含有するいずれかの構成をいう。リボザイムは、ＲＮＡの特異的
切断を触媒するために用いることのできる酵素的ＲＮＡ分子である。アンチセン
ス分子およびリボザイムは、核酸分子の合成のための当該分野で既知のいずれか
の方法によって調製してもよい。これらは、固相ホスホルアミダイト化学合成の
ようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術を包含する。別法では、ＲＮ
Ａ分子は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タ
ンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関
連タンパク質をコードしているＤＮＡ配列のイン・ビトロおよびイン・ビボでの
転写によって生成されうる。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６のような適
当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する多種多様なベクター中に組み込ま
れていてもよい。別法では、アンチセンスＲＮＡを構成的にまたは誘導可能に合
成するこれらのｃＤＮＡ構築物を細胞系統、細胞または組織中に導入することが
できる。ＲＮＡ分子は、細胞内安定性および半減期を増加させるために修飾して
もよい。可能な修飾は、限定するものではないが、分子の５’および／または３
’末端での隣接配列の付加または分子の骨格内のホスホジエステル結合よりもむ
しろホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用を包含する。該概念は、
ＰＮＡの生産に固有であり、イノシン、キューオシンおよびワイブトシンのよう
な非翻訳塩基ならびに内在性エンドヌクレアーゼによって容易に認識されないよ
うなアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル、メチル
、チオおよび同様の修飾形態の包含により、これらの分子の全てに及ぶことがで
きる。[0052] Antisense molecules and ribozymes are intended to be within the scope of the present invention. The term "antisense" refers to any composition containing a nucleotide sequence that is complementary to a specific DNA or RNA sequence. Ribozymes are enzymatic RNA molecules that can be used to catalyze the specific cleavage of RNA. Antisense molecules and ribozymes may be prepared by any method known in the art for the synthesis of nucleic acid molecules. These include techniques for chemically synthesizing oligonucleotides, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, RN
The A molecule is a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a DNA sequence encoding a GlcNAc-TV-c-related protein, in vitro and in vivo. It can be produced by transcription. Such a DNA sequence may be incorporated into a wide variety of vectors having a suitable RNA polymerase promoter, such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA constructs that synthesize antisense RNA constitutively or inducibly can be introduced into cell lines, cells or tissues. RNA molecules may be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, 5 ′ and / or 3 ′ of the molecule.
'Including the addition of flanking sequences at the termini or the use of phosphorothioates or 2'O-methyl rather than phosphodiester bonds within the backbone of the molecule. The concept is
Acetyl, methyl, thio and similar modifications of adenine, cytidine, guanine, thymine and uridine that are unique to the production of PNA and are not readily recognized by untranslated bases such as inosine, cuosine and wibutosin and endogenous endonucleases The inclusion of forms can span all of these molecules.
【００５３】 本発明のタンパク質 本発明のタンパク質は、脊髄を除く中枢神経系において優勢に発現される。タ
ンパク質は、また、子宮頸癌、肺癌、結腸癌、黒色腫のような種々の腫瘍におい
て発現し、それらは、胸部および子宮由来の腫瘍において特に見出された。Proteins of the Invention The proteins of the invention are predominantly expressed in the central nervous system except for the spinal cord. The protein is also expressed in various tumors such as cervical, lung, colon, melanoma and they have been found especially in tumors of breast and uterus origin.
【００５４】 本発明の単離ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号
２、４または６の配列を含む。本発明の単離ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質
のアミノ酸配列は、配列番号２、１０または１２の配列を含む。配列番号２、４
、６、１０または１２のアミノ酸配列を含むタンパク質に加え、本発明のタンパ
ク質は、本明細書に記載のように、その末端切断型、類似体、対立遺伝子および
種変異、ならびにＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃの相同
体およびその末端切断型（すなわち、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質ま
たはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質）を包含する。The amino acid sequence of the isolated GlcNAc-TV-b protein of the present invention comprises the sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6. The amino acid sequence of the isolated GlcNAc-TV-c protein of the present invention comprises the sequence of SEQ ID NO: 2, 10 or 12. SEQ ID NOs: 2, 4
, 6, 10 or 12 amino acid sequences, as well as truncated forms, analogs, alleles and species variants, and GlcNAc-TV-b, as described herein. Or a homolog of GlcNAc-TV-c and its truncated form (ie, a GlcNAc-TV-b-related protein or a GlcNAc-TV-c-related protein).
【００５５】 末端切断タンパク質は、トリペプチドから７０量体ポリペプチドまでのサイズ
範囲にある３〜７０個のアミノ酸残基、好ましくは１２〜２０アミノ酸を含んで
いてもよい。本発明の１の態様において、配列番号２、４、６、１０または１２
の少なくとも５個の連続的なアミノ酸のアミノ酸配列を有するＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
Ｖ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質のフラグメントが提供され、こ
こに、フラグメント中に存在する５個以上、６個以上、７個以上または８個以上
の連続的なアミノ酸のアミノ酸配列は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｃ以外のタンパク質に存在しない。本発明の１の具体例において、
該フラグメントは、配列番号２、４、６、１０または１２の配列のような特定の
配列由来の少なくとも１２〜２０個の隣接するアミノ酸のアミノ酸残基の範囲で
ある。該フラグメントは、免疫原性であってもよく、好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ以外のタンパク質に対して免疫反応性
である抗体に対し、免疫反応性ではない。The truncated protein may comprise from 3 to 70 amino acid residues, preferably from 12 to 20 amino acids, ranging in size from tripeptides to 70-mer polypeptides. In one embodiment of the present invention, SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10 or 12
GlcNAc-T having an amino acid sequence of at least 5 consecutive amino acids of
A fragment of a Vb or GlcNAc-TV-c protein is provided, wherein the amino acid sequence of 5 or more, 6 or more, 7 or more or 8 or more contiguous amino acids present in the fragment is GlcNAc -TV-b or GlcN
Not present in proteins other than Ac-TV-c. In one embodiment of the present invention,
The fragment ranges from at least 12 to 20 contiguous amino acid residues from a particular sequence, such as the sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10, or 12. The fragment may be immunogenic, preferably GlcNAc
Not immunoreactive with an antibody that is immunoreactive with a protein other than -TV-b or GlcNAc-TV-c.
【００５６】 末端切断タンパク質は、アミノ基（−ＮＨ２）、疎水性基（例えば、カルボベ
ンゾキシル、ダンシルまたはＴ−ブチルオキシカルボニル）、アセチル基、９−
フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＰＭＯＣ）基、または限定するものではな
いが、脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコールもしくは炭水化物を包含す
る巨大分子をアミノ末端に有していてもよい。末端切断タンパク質は、カルボキ
シル基、アミド基、Ｔ−ブチルオキシカルボニル基、または限定するものではな
いが、脂質−脂肪酸複合体、ポリエチレングリコールもしくは炭水化物を包含す
る巨大分子をカルボキシ末端に有していてもよい。The truncated proteins may be amino groups (—NH 2 ), hydrophobic groups (eg, carbobenzoxyl, dansyl or T-butyloxycarbonyl), acetyl groups, 9-
The fluorenylmethoxy-carbonyl (PMOC) group, or macromolecules, including but not limited to lipid-fatty acid conjugates, polyethylene glycol or carbohydrates, may have amino termini. The truncated protein may have a macromolecule at the carboxy terminus including, but not limited to, a carboxyl group, an amide group, a T-butyloxycarbonyl group, or a lipid-fatty acid complex, polyethylene glycol or carbohydrate. Good.
【００５７】 本発明のタンパク質は、また、本明細書に記載のように、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ
−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃの類似体および／またはその末端切断型を包
含し、それは、限定するものではないが、１以上のアミノ酸置換、挿入および／
または欠失を含有するＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃを
包含しうる。アミノ酸置換は、保存的または非保存的性質であってもよい。保存
的アミノ酸置換は、同様の電荷、サイズおよび／または疎水性のアミノ酸でのＧ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃアミノ酸配列の１以上のア
ミノ酸の置換を含む。保存的置換のみが起こる場合、得られる類似体は、好まし
くは、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃと機能的に同等で
ある。非保存的置換は、異なる電荷、サイズ、および／または疎水性を有する１
以上のアミノ酸でのＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃアミ
ノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換を含む。The protein of the present invention may also comprise a GlcNAc-TV, as described herein.
-B or analogs of GlcNAc-TV-c and / or truncated forms thereof, including, but not limited to, one or more amino acid substitutions, insertions and / or
Or GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c containing the deletion. Amino acid substitutions may be of a conservative or non-conservative nature. Conservative amino acid substitutions can result in G at similar charge, size and / or hydrophobic amino acids.
Includes one or more amino acid substitutions in the lcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c amino acid sequence. If only conservative substitutions occur, the resulting analog is preferably functionally equivalent to GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c. Non-conservative substitutions will result in 1 having different charges, sizes, and / or hydrophobicities.
Includes the replacement of one or more amino acids of the GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c amino acid sequence with the above amino acids.
【００５８】 １以上のアミノ酸挿入をＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質またはＧｌｃＮＡ
ｃ−ＴＶ−ｃタンパク質中に導入してもよい。アミノ酸挿入は、単一アミノ酸残
基または２〜５アミノ酸長の範囲の連続したアミノ酸よりなってもよい。 欠失は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃアミノ酸配列
からの１以上のアミノ酸または別個（discrete）の部分の除去よりなってもよい
。欠失されるアミノ酸は、隣接していてもよく、またはしていなくてもよい。欠
失突然変異を有するより短い限定の長さの得られる類似体は、約１０アミノ酸、
好ましくは１００アミノ酸である。[0058] The one or more amino acid insertions may be replaced by a GlcNAc-TV-b protein or GlcNAc.
It may be introduced into the c-TV-c protein. Amino acid insertions may consist of single amino acid residues or contiguous amino acids ranging in length from 2 to 5 amino acids. Deletions may consist of the removal of one or more amino acids or discrete portions from the GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c amino acid sequence. The amino acids deleted may be contiguous or non-contiguous. The resulting analog of shorter defined length with the deletion mutation is approximately 10 amino acids,
Preferably it is 100 amino acids.
【００５９】 タンパク質レベルでのＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ
の対立遺伝子変異は、唯一の、または多くて、２、３個のアミノ酸置換によって
、互いに異なる。ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ
−ｃタンパク質の種変異は、生物の異なる種の間で天然に起こる変異である。GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c at the protein level
Allelic variations differ from one another by one or at most a few amino acid substitutions. GlcNAc-TV-b protein or GlcNAc-TV
A species variation of the -c protein is a variation that occurs naturally between different species of an organism.
【００６０】 本発明のタンパク質は、また、本明細書に記載のように、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ
−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃの相同体および／またはその末端切断型を包
含する。かかるＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ相同体は
、そのアミノ酸配列が、選択的ハイブリダイゼーション条件下（本明細書におい
て、選択的で特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の考察を参照
）でＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク
質を得るために使用されるプローブとハイブリダイズする他の種由来のＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ領域のアミノ酸配列よりなるタン
パク質を包含する。これらの相同体は、一般に、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたは
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質に特有の同一領域を有するであろう。配列番
号２、４、６、１０または１２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一
性、より好ましくは少なくとも７５％の同一性、最も好ましくは８０〜９０％の
同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質が本発明のタンパク質の相同体で
あることが予想される。アミノ酸配列相同性または同一性の割合は、本明細書に
記載の方法、好ましくは、本明細書に記載のコンピュータープログラムを用いて
計算される。The protein of the present invention may also comprise a GlcNAc-TV, as described herein.
-B or a homolog of GlcNAc-TV-c and / or truncated forms thereof. Such GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c homologs have amino acid sequences whose GlcNAc under selective hybridization conditions (see discussion of selective and particularly stringent hybridization conditions herein). -GlcN from other species that hybridizes with the probe used to obtain the TV-b or GlcNAc-TV-c protein
Includes proteins consisting of the amino acid sequence of the Ac-TV-b or GlcNAc-TV-c region. These homologs will generally have the same region unique to the GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c protein. Comprises an amino acid sequence having at least 70% identity, more preferably at least 75% identity, and most preferably 80-90% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 10 or 12. It is expected that the protein is a homolog of the protein of the invention. The percentage of amino acid sequence homology or identity is calculated using the methods described herein, preferably using the computer programs described herein.
【００６１】 本発明は、また、本発明のタンパク質のイソ型も意図する。イソ型は、本発明
のタンパク質と同じ数および種類のアミノ酸を含有するが、イソ型は、異なる分
子構造を有する。本発明によって意図されるイソ型は、好ましくは、本明細書に
記載のような本発明のタンパク質と同じ特性を有する。The present invention also contemplates isoforms of the proteins of the present invention. Isoforms contain the same number and types of amino acids as the proteins of the invention, but isoforms have different molecular structures. The isoforms contemplated by the present invention preferably have the same properties as the proteins of the present invention as described herein.
【００６２】 本発明は、また、融合タンパク質またはキメラタンパク質を生産するために、
選択されたタンパク質、またはマーカータンパク質（下記参照）、または他のグ
リコシルトランスフェラーゼと結合したＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、Ｇ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質また
はＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質を包含する。The present invention also provides a method for producing a fusion protein or a chimeric protein,
A selected protein, or a marker protein (see below), or a GlcNAc-TV-b protein linked to another glycosyltransferase, G
Includes lcNAc-TV-b related proteins, GlcNAc-TV-c proteins or GlcNAc-TV-c related proteins.
【００６３】 本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タ
ンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関
連タンパク質は、組換えＤＮＡ法を用いて調製してもよい。したがって、本発明
のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質をコードする配列を有する本発明の核酸は、既知の方法において、タンパク
質の良好な発現を確実にする適当な発現ベクター中に取り込まれてもよい。可能
な発現ベクターは、ベクターが使用される宿主細胞に適合性である限り、限定す
るものではないが、コスミド、プラスミド、または修飾したウイルス（例えば、
複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を包含す
る。The GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein of the present invention may be prepared using a recombinant DNA method. Thus, a nucleic acid of the invention having a sequence encoding a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein of the invention can be prepared by known methods. Alternatively, it may be incorporated into a suitable expression vector which ensures good expression of the protein. Possible expression vectors include, but are not limited to, cosmids, plasmids, or modified viruses, such as, but not limited to, those compatible with the host cell in which the vector is used.
Replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses).
【００６４】 したがって、本発明は、本発明の核酸分子、ならびに挿入したタンパク質配列
の転写および翻訳に必要な調節配列を含有する本発明の組換え発現ベクターを意
図する。適当な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫遺伝子
を包含する種々の供給源由来であってもよい（例えば、Goeddel, Gene Expressi
on Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA
(1990)に記載の調節配列を参照）。適当な調節配列の選択は、下記の考察のよう
に、選択される宿主細胞に依存し、通常の当業者によって容易に達成されうる。
必要な調節配列は、天然のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質および／またはそ
のフランキング領域によって供給されうる。Thus, the present invention contemplates a recombinant expression vector of the present invention containing a nucleic acid molecule of the present invention and regulatory sequences necessary for the transcription and translation of the inserted protein sequence. Suitable regulatory sequences may be from a variety of sources, including bacterial, fungal, viral, mammalian or insect genes (eg, Goeddel, Gene Expressi).
on Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA
(1990)). Selection of the appropriate regulatory sequence depends on the host cell chosen, as discussed below, and can be readily accomplished by one of ordinary skill in the art.
The necessary regulatory sequences may be provided by the native GlcNAc-TV-c protein and / or its flanking regions.
【００６５】 本発明は、さらに、発現ベクター中にアンチセンス方向にクローン化された本
発明の核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は
ＤＮＡ分子の転写によって、配列番号１、３、５、７、８、９または１１の核酸
配列に対してアンチセンスなＲＮＡ分子の発現が可能な方法で、調節配列に連結
される。種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指示す
るアンチセンス核酸に連結された調節配列、例えば、ウイルスプロモーターおよ
び／またはエンハンサーを選択でき、あるいはアンチセンスＲＮＡの組織または
細胞型特異的発現を指示する調節配列を選択できる。The present invention further provides a recombinant expression vector comprising a nucleic acid molecule of the present invention cloned in an antisense orientation into an expression vector. That is, the DNA molecule is linked to the regulatory sequence in such a way that the transcription of the DNA molecule allows expression of an RNA molecule that is antisense to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 8, 9 or 11. You. Regulatory sequences linked to the antisense nucleic acid, which direct continuous expression of the antisense RNA molecule in various cell types, such as viral promoters and / or enhancers, can be selected, or tissue or cell type specific for the antisense RNA. Regulatory sequences that direct expression can be selected.
【００６６】 本発明の組換え発現ベクターは、また、本発明の組換え分子で形質転換または
トランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含有して
いてもよい。マーカー遺伝子の例は、ある特定の薬剤に対する耐性を与えるＧ４
１８、ｄｈｆｒ、ｎｐｔ、ａｌｓ、ｐａｔおよびハイグロマイシン、β−ガラク
トシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタル・ルシ
フェラーゼ、ｔｒｐＢ、ｈｉｓＤ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ア
デニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、または免疫グロブリンもしくはその
一部、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分、好ましくはＩｇＧのようなタンパク
質をコードしている遺伝子である。アントシアニン、ベータ−グルクロニダーゼ
およびその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのよ
うな可視マーカーを用いて、形質転換体を同定でき、また、特定のベクター系に
起因する一過性または安定なタンパク質発現の量を定量できる（Rhoeds, C.ら、
(1995) Mol. Biol. 55: 121-131）。マーカーは、目的の核酸とは別のベクター
に導入できる。[0066] The recombinant expression vectors of the present invention may also contain a marker gene that facilitates selection of host cells transformed or transfected with the recombinant molecules of the present invention. An example of a marker gene is G4, which confers resistance to certain drugs.
18, dhfr, npt, als, pat and hygromycin, β-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, firefly luciferase, trpB, hisD, herpes simplex virus thymidine kinase, adenine phosphoribosyltransferase, or immunoglobulin or a part thereof For example, a gene encoding a protein such as the Fc portion of an immunoglobulin, preferably IgG. Transformants can be identified using visible markers such as anthocyanins, beta-glucuronidase and its substrate GUS, and luciferase and its substrate luciferin, as well as transient or stable protein expression due to the particular vector system. Quantitation (Rhoeds, C. et al.,
(1995) Mol. Biol. 55: 121-131). The marker can be introduced into a different vector from the nucleic acid of interest.
【００６７】 組換え発現ベクターは、また、組換えタンパク質の発現増加；組換えタンパク
質の安定性増加；およびアフィニティー精製においてリガンドとして作用するこ
とによる標的組換えタンパク質の精製における補助を提供する融合部分をコード
する遺伝子を含有していてもよい。例えば、融合タンパク質の精製後に融合部分
から組換えタンパク質を分離できるようにするために、タンパク質分解性切断部
位を標的組換えタンパク質に付加してもよい。典型的な融合発現ベクターは、グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質ま
たはプロテインＡを各々、組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Amrad Corp.,
Melbourne, Australia）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA）お
よびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, NJ）を包含する。The recombinant expression vector also includes a fusion moiety that provides increased expression of the recombinant protein; increased stability of the recombinant protein; and aid in the purification of the target recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification. It may contain an encoding gene. For example, a proteolytic cleavage site may be added to the target recombinant protein to allow separation of the recombinant protein from the fusion moiety after purification of the fusion protein. A typical fusion expression vector is pGEX (Amrad Corp., which fuses glutathione S-transferase (GST), maltose E binding protein or protein A, respectively, with the recombinant protein.
Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ).
【００６８】 形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を生産するために、ベクター
を宿主細胞中に導入してもよい。「トランスフェクトされた」および「トランス
フェクション」なる語は、多くの標準的な技術の１つによって、核酸（例えば、
ベクター）を細胞中へ導入することを包含する。トランスフェクトされた核酸が
表現型変化をもたらす場合、細胞は、核酸によって「形質転換」されている。原
核生物細胞は、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウムに媒介さ
れる形質転換によって、核酸でトランスフェクトまたは形質転換することができ
る。核酸は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキスト
ランによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポ
レーションまたはマイクロインジェクションのような通常の技術によって、哺乳
動物細胞中に導入することができる。宿主細胞を形質転換およびトランスフェク
トするための適当な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)）および他
の研究室用テキストブックにおいて見出すことができる。A vector may be introduced into a host cell to produce a transformed or transfected host cell. The terms "transfected" and "transfection" refer to nucleic acids (eg,
Vector) into a cell. A cell has been "transformed" by a nucleic acid when the transfected nucleic acid results in a phenotypic change. Prokaryotic cells can be transfected or transformed with the nucleic acid, for example, by electroporation or calcium chloride-mediated transformation. Nucleic acids can be introduced into mammalian cells by conventional techniques such as calcium phosphate or calcium chloride co-precipitation, transfection mediated by DEAE-dextran, lipofectin, electroporation or microinjection. Suitable methods for transforming and transfecting host cells are described in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) and other laboratory textbooks.
【００６９】 また、プラスミド中に含有させ、発現させることができるＤＮＡのより大きい
フラグメントをデリバリーするために、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いてもよ
い。６〜１０ＭのＨＡＣを構築し、治療目的で、通常のデリバリー法（リポソー
ム、ポリカチオン性アミノポリマー、またはビヒクル）によってデリバリーする
。[0069] Human artificial chromosomes (HACs) may also be used to deliver larger fragments of DNA that can be contained and expressed in a plasmid. A 6-10 M HAC is constructed and delivered for therapeutic purposes by conventional delivery methods (liposomes, polycationic amino polymers, or vehicles).
【００７０】 適当な宿主細胞は、多種多様な原核生物および真核生物宿主細胞を包含する。
例えば、本発明のタンパク質は、イー・コリ（E.coli）のような細菌細胞、昆虫
細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞、または哺乳動物細胞において発
現させてもよい。他の適当な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technolog
y: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991)におい
て見出すことができる。[0070] Suitable host cells include a wide variety of prokaryotic and eukaryotic host cells.
For example, the proteins of the invention may be expressed in bacterial cells such as E. coli, insect cells (using baculovirus), yeast cells, or mammalian cells. Other suitable host cells include Goeddel, Gene Expression Technolog
y: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).
【００７１】 また、挿入した核酸配列の発現を変調し、または所望の様式でタンパク質を修
飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）し、処理（例えば、切断）する宿主
細胞を選択してもよい。タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾に特異的
かつ特徴的なメカニズムを有する宿主系または細胞系統が選択されうる。例えば
、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ａ４３１、ＨｅＬＡ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３
、３Ｔ３およびＷ１３８を包含する真核生物宿主細胞を使用してもよい。タンパ
ク質の長期間の高収量の安定な発現のために、遺伝子産物を安定に発現する細胞
系統および宿主系を操作してもよい。[0071] One may also select host cells that modulate the expression of the inserted nucleic acid sequence or modify (eg, glycosylate or phosphorylate) and treat (eg, cleave) the protein in the desired manner. Host systems or cell lines that have specific and characteristic mechanisms for post-translational processing and modification of the protein can be selected. For example, CHO, VERO, BHK, A431, HeLA, COS, MDCK, 293
Eukaryotic host cells, including 3T3 and W138, may be used. Cell lines and host systems that stably express the gene product may be engineered for long-term, high-yield, stable expression of the protein.
【００７２】 宿主細胞および特に、本明細書に記載の方法を用いて生産される細胞系統は、
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク
質の活性を変調する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用でありうる。The host cells and, in particular, the cell lines produced using the methods described herein include:
GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein,
It may be particularly useful for screening and evaluating compounds that modulate the activity of a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein.
【００７３】 本発明のタンパク質は、また、限定するものではないが、マウス、ラット、ウ
サギ、モルモット、ミクロピッグ（micro-pig）、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ヒト以
外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー）を包含するヒト以外のト
ランスジェニック動物において発現されうる（Hammerら、(Nature 315:680-683,
1985), Palmiterら、(Science 222:809-814, 1983), Brinsterら(Proc Natl. A
cad. Sci USA 82: 44384442, 1985), PalmiterおよびBrinster (Cell 41: 343-3
45, 1985)および米国特許第４，７３６，８６６号参照）。当該分野で既知の手
法を用いて、トランスジェニック動物の創始者系統を生産するために、ＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をコー
ドしている本発明の核酸分子を動物中に導入してもよい。かかる手法は、前核マ
イクロインジェクション、生殖系統中へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入、胚
性幹細胞における遺伝子ターゲティング、胚のエレクトロポレーションおよび精
子媒介性遺伝子移入を包含する。The proteins of the present invention also include, but are not limited to, mice, rats, rabbits, guinea pigs, micro-pigs, goats, sheep, pigs, non-human primates (eg, baboons, (Hammer et al., (Nature 315: 680-683, Nature).
1985), Palmiter et al., (Science 222: 809-814, 1983), Brinster et al. (Proc Natl. A
cad.Sci USA 82: 44384442, 1985), Palmiter and Brinster (Cell 41: 343-3).
45, 1985) and U.S. Pat. No. 4,736,866). Using techniques known in the art to produce a founder strain of transgenic animals, GlcN
Ac-TV-b protein, GlcNAc-TV-b related protein, GlcN
A nucleic acid molecule of the invention encoding an Ac-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c related protein may be introduced into an animal. Such techniques include pronuclear microinjection, retrovirus-mediated gene transfer into the germ line, gene targeting in embryonic stem cells, embryo electroporation and sperm-mediated gene transfer.
【００７４】 本発明は、全てのそれらの細胞においてＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺伝子を有するトランスジェニック動物、および全てではない
が、いくつかのそれらの細胞においてトランスジーンを有する動物を意図する。
トランスジーンは、単一トランスジーンとして、またはコンカテマー中で導入し
てもよい。トランスジーンを特定の細胞型に選択的に導入し、該細胞型において
活性化させてもよい（例えば、Laskoら、1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
6236参照）。トランスジーンは、遺伝子ターゲティングによって、内在性遺伝
子の染色体部位中に組み込んでもよい。トランスジーンを特定の細胞型に選択的
に導入し、該細胞型において内在性遺伝子を不活性化してもよい（Guら、Scienc
e 265: 103-106参照）。The present invention relates to GlcNAc-TV-b or Glc in all those cells.
Transgenic animals having the NAc-TV-c gene, and animals that have the transgene in some, but not all, of their cells are contemplated.
The transgene may be introduced as a single transgene or in a concatemer. The transgene may be selectively introduced into and activated in a particular cell type (see, eg, Lasko et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
6236). The transgene may be integrated into the chromosomal site of the endogenous gene by gene targeting. The transgene may be selectively introduced into a particular cell type to inactivate an endogenous gene in that cell type (Gu et al., Scienc
e 265: 103-106).
【００７５】 組換えＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タン
パク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連
タンパク質のトランスジェニック動物における発現は、標準的な技術を用いてア
ッセイしてもよい。最初のスクリーニングをサザンブロット分析またはＰＣＲ法
によって行って、トランスジーンが組み込まれたかどうかを分析してもよい。ト
ランスジェニック動物の組織におけるｍＲＮＡ発現のレベルは、また、組織試料
のノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＲＴ−
ＰＣＲを包含する技術を用いてアッセイされうる。組織は、また、本発明のＧｌ
ｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質に対す
る抗体を用いて、免疫細胞化学的に評価してもよい。The expression of the recombinant GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein in transgenic animals is assayed using standard techniques. May be. An initial screen may be performed by Southern blot analysis or PCR to analyze whether the transgene has been incorporated. The level of mRNA expression in the tissues of the transgenic animals can also be determined by Northern blot analysis of tissue samples, in situ hybridization and RT-
It can be assayed using techniques including PCR. The tissue is also a Gl of the present invention.
Immunocytochemical evaluation may be performed using an antibody against the cNAc-TV-b protein or the GlcNAc-TV-c protein.
【００７６】 本発明のタンパク質は、また、固相合成（Merrifield, 1964, J. Am. Chem. A
ssoc. 85: 2149-2154）または均質溶液中の合成（Houbenweyl, 1987, Methods o
f Organic Chemistry, ed. E. Wansch, Vol. 15 IおよびII, Thieme, Stuttgart
）のようなタンパク質の化学においてよく知られた技術を用いる化学合成によっ
て調製してもよい。タンパク質合成は、手動の手順を用いてまたは自動操作によ
って行ってもよい。自動合成は、例えば、Applied Biosystems 431A ペプチドシ
ンセサイザー（Perkin Elmer）を用いて行ってもよい。本発明のタンパク質の種
々のフラグメントを別々に化学的に合成し、化学的方法で結合させて、全長分子
を製造してもよい。The protein of the present invention can also be synthesized by solid phase synthesis (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. A
ssoc. 85: 2149-2154) or synthesis in homogeneous solution (Houbenweyl, 1987, Methods o).
f Organic Chemistry, ed.E. Wansch, Vol. 15 I and II, Thieme, Stuttgart
) May be prepared by chemical synthesis using well known techniques in protein chemistry. Protein synthesis may be performed using manual procedures or by automation. Automated synthesis may be performed, for example, using an Applied Biosystems 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer). Various fragments of the proteins of the invention may be chemically synthesized separately and linked in a chemical manner to produce the full-length molecule.
【００７７】 タンパク質のような他の分子（例えば、マーカーまたは他のグリコシルトラン
スフェラーゼ）と結合した本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質を含むＮ末端またはＣ末端融合タンパク質
あるいはキメラタンパク質は、組換え技術により、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタン
パク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタン
パク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質のＮ末端またはＣ末端およ
び所望の生物学的機能を有する選択されたタンパク質またはマーカータンパク質
の配列を融合することによって調製してもよい。得られた融合タンパク質は、選
択されたタンパク質または本明細書に記載のようなマーカータンパク質に融合し
たＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質を含有する。融合タンパク質を調製するために使用されうるタンパク質の例
は、免疫グロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロ
テインＡ、赤血球凝集素（ＨＡ）および末端切断型ｍｙｃを包含する。GlcNAc-TV-b protein of the invention, Glc conjugated to another molecule such as a protein (eg, a marker or other glycosyltransferase)
NAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or G
An N-terminal or C-terminal fusion protein or a chimeric protein containing an lcNAc-TV-c-related protein can be obtained by recombinant techniques using a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-protein. It may be prepared by fusing the N-terminus or C-terminus of a TV-c-related protein with the sequence of a selected protein or marker protein having the desired biological function. The resulting fusion protein can be a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV protein fused to a selected protein or a marker protein as described herein. -Contains c-related proteins. Examples of proteins that can be used to prepare fusion proteins include immunoglobulins, glutathione-S-transferase (GST), protein A, hemagglutinin (HA) and truncated myc.
【００７８】 抗体 本発明のタンパク質またはその一部を用いて、タンパク質に特異的な抗体を調
製することができる。タンパク質の非保存領域における別個のエピトープに結合
する抗体を調製できる。タンパク質の非保存領域は、他のタンパク質に対する実
質的な配列相同性を有さないものである。また、よく特徴付けられたドメインの
ような保存領域由来の領域を用いて、本発明のタンパク質の保存領域に対する抗
体を調製できる。Antibodies The protein of the present invention or a part thereof can be used to prepare an antibody specific to the protein. Antibodies can be prepared that bind to distinct epitopes on non-conserved regions of the protein. Non-conserved regions of a protein are those that have no substantial sequence homology to other proteins. In addition, antibodies to conserved regions of the proteins of the invention can be prepared using regions from conserved regions, such as well-characterized domains.
【００７９】 本発明の具体例において、本発明のタンパク質に対する抗体を誘導するために
使用されるオリゴペプチド、ペプチドまたはフラグメントは、少なくとも５個の
アミノ酸、より好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列
を有する。オリゴペプチドなどは、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一
であることができ、それらは、小型天然分子の全アミノ酸配列を含有していても
よい。また、本発明のタンパク質に対して特異性を有する抗体は、本明細書に記
載のような細菌中に融合タンパク質を発現することによって生産された融合タン
パク質から生じてもよい。In an embodiment of the present invention, the oligopeptide, peptide or fragment used to elicit antibodies against the protein of the present invention comprises at least 5 amino acids, more preferably at least 10 amino acids Has an array. Oligopeptides and the like can be identical to a portion of the amino acid sequence of a native protein, and they can contain the entire amino acid sequence of a small native molecule. Also, antibodies having specificity for a protein of the present invention may be generated from a fusion protein produced by expressing the fusion protein in bacteria as described herein.
【００８０】 本発明は、無傷モノクローナルまたはポリクローナル抗体、および免疫学的に
活性なフラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２フラグメント）、抗体
Ｈ鎖、抗体Ｌ鎖、遺伝学的に操作した単一鎖Ｆｖ分子（Ladnerら、米国特許第４
，９４６，７７８号）またはキメラ抗体、例えば、ネズミ抗体の結合特異性を含
有するが、残りの部分はヒト起源である抗体を用いることができる。モノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体、フラグメントおよびキメラなどを包含する抗体
は、当業者に既知の方法を用いて調製してもよい。The present invention relates to intact monoclonal or polyclonal antibodies, and immunologically active fragments (eg, Fab or (Fab) 2 fragments), antibody heavy chains, antibody light chains, genetically engineered single chains. Fv molecules (Ladner et al., US Pat.
, 946,778) or chimeric antibodies, eg, antibodies that contain the binding specificity of a murine antibody, but the remainder of which is of human origin. Antibodies, including monoclonal and polyclonal antibodies, fragments and chimeras, etc., may be prepared using methods known to those skilled in the art.
【００８１】 本発明の核酸分子、タンパク質および抗体の応用 核酸分子、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連
タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ
関連タンパク質、および本発明の抗体は、癌を包含する本発明の核酸またはタン
パク質の変調を必要とする病状の予後および診断的評価、およびかかる病状の素
因のある対象の同定において使用してもよい（下記参照）。本発明の核酸分子お
よびタンパク質を検出する方法は、タンパク質および核酸を検出および位置決定
することによって、癌（例えば、胸部および子宮癌のような充実性腫瘍）を包含
する核酸またはタンパク質の変調を必要とする病状をモニターするために使用で
きる。また、本明細書に記載の方法を用いて本発明のタンパク質の発達的な発現
を研究することができ、よって、タンパク質の役割にさらなる洞察を提供するこ
とは、当業者に明らかであろう。また、本発明の応用は、本発明のタンパク質の
生物学的活性を変調する化合物の同定方法を包含する（下記参照）。化合物、抗
体などは、癌（例えば、胸部および子宮癌のような充実性腫瘍）を包含する本発
明のタンパク質の変調を必要とする病状の治療に使用してもよい（下記参照）。Applications of the Nucleic Acid Molecules, Proteins and Antibodies of the Present Invention Nucleic acid molecules, GlcNAc-TV-b proteins, GlcNAc-TV-b related proteins, GlcNAc-TV-c proteins or GlcNAc-TV-c
Related proteins, and antibodies of the invention, may be used in the prognosis and diagnostic evaluation of conditions requiring modulation of the nucleic acids or proteins of the invention, including cancer, and in identifying subjects predisposed to such conditions. (See below). The methods of detecting nucleic acid molecules and proteins of the invention require modulation of nucleic acids or proteins, including cancers (eg, solid tumors such as breast and uterine cancer), by detecting and locating the proteins and nucleic acids. It can be used to monitor for medical conditions. It will also be apparent to one of skill in the art that the methods described herein can be used to study the developmental expression of a protein of the invention, and thus provide further insight into the role of the protein. Also, applications of the present invention include methods for identifying compounds that modulate the biological activity of the proteins of the present invention (see below). The compounds, antibodies, etc. may be used in the treatment of conditions requiring modulation of the proteins of the invention, including cancers (eg, solid tumors such as breast and uterine cancer) (see below).
【００８２】 診断方法 種々の方法を癌（例えば、充実性腫瘍、胸部および子宮癌）を包含する本発明
のタンパク質の変調を必要とする病状の診断および予後的評価、およびかかる病
状の素因のある対象の同定に用いることができる。かかる方法は、例えば、本発
明の核酸分子、およびそのフラグメント、およびペプチドフラグメントを包含す
る本発明のタンパク質に対して向けられた抗体を利用してもよい。特に、核酸お
よび抗体は、例えば：（１）ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ
−ｃ突然変異の存在の検出、または病気ではない状態と比較してＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ ｍＲＮＡの過剰発現または低発現のい
ずれかの検出、またはある特定の病状またはかかる病状に対する罹患性と相関し
うるｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ転写産物の選択的ス
プライス形態の質的または定量的検出；および（２）病気ではない状態と比較し
て本発明のタンパク質の過剰または低い相対量のいずれかの検出、あるいは病態
または病態への進行と相関する本発明の修飾された（例えば、全長以下）タンパ
ク質の存在の検出に用いてもよい。Diagnostic Methods A variety of methods can be used to diagnose and prognosticate conditions requiring modulation of the proteins of the present invention, including cancers (eg, solid tumors, breast and uterine cancers), and to predispose to such conditions. Can be used to identify subjects. Such methods may utilize, for example, antibodies directed against the proteins of the invention, including the nucleic acid molecules of the invention, and fragments thereof, and peptide fragments. In particular, nucleic acids and antibodies may be, for example: (1) glcNAc-TV-b or glcNAc-TV
Detection of the presence of the -c mutation, or GlcNAc-
A glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c transcript that may correlate with either over- or under-expression of TV-b or GlcNAc-TV-c mRNA, or correlate with a particular condition or susceptibility to such condition Qualitative or quantitative detection of an alternative splice form of E. coli; and (2) detecting either an excess or low relative amount of a protein of the invention compared to a non-disease state, or correlating with a disease state or progression to a disease state May be used to detect the presence of a modified (eg, less than full length) protein of the invention.
【００８３】 本明細書に記載の方法は、少なくとも１個の特異的核酸または本明細書に記載
の抗体を含み、例えば、臨床的背景において、患者をスクリーンおよび診断する
ために、ならびに疾患を発症する素因を示す個体をスクリーンおよび同定するた
めに通常使用されうる予めパッケージされた診断キットを利用することによって
行ってもよい。The methods described herein include at least one specific nucleic acid or antibody described herein, eg, to screen and diagnose a patient in a clinical setting and to develop a disease This may be done by utilizing a pre-packaged diagnostic kit that can be commonly used to screen and identify individuals who are predisposed to the predisposition.
【００８４】 核酸に基づく検出技術およびペプチド検出技術を下記する。本発明の方法を用
いて分析されうる試料は、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−
ｃを発現することあるいは本発明のタンパク質を含有することが知られたている
か、またはその疑いのあるものを包含する。該方法は、限定するものではないが
、細胞、細胞培養においてインキュベートされた細胞のライゼート、細胞から単
離された染色体（例えば、中期染色体のスプレッド）、ゲノムＤＮＡ（溶液中ま
たは例えば、サザン分析のために、固体支持体に結合している）、ＲＮＡ（溶液
中または例えば、ノーザン分析のために、固体支持体に結合している）、ｃＤＮ
Ａ溶液中または固体支持体に結合している）、細胞または組織由来の抽出物、血
清、尿、血液およびＣＳＦのような生物学的流体を包含する生物学的試料におい
て行ってもよい。試料は、患者または培養体由来であってもよい。The detection techniques based on nucleic acids and peptides are described below. A sample that can be analyzed using the method of the invention is glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-b.
c that are known or suspected of expressing c or containing the protein of the present invention. The methods include, but are not limited to, lysates of cells, lysates of cells incubated in cell culture, chromosomes isolated from cells (eg, metaphase chromosome spreads), genomic DNA (in solution or, for example, Southern analysis). RNA (in solution or attached to a solid support, eg, for Northern analysis), cDN
A solution or attached to a solid support), extracts from cells or tissues, serum, urine, blood and biological fluids including biological fluids such as CSF. The sample may be from a patient or a culture.
【００８５】 本発明の核酸分子の検出方法 本発明のタンパク質をコードしている核酸分子は、改変された発現を検出する
ために、サザンまたはノーザン分析、ドットブロット、または他の膜に基づく技
術において；ＰＣＲ技術において；あるいは患者生検由来の流体または組織を用
いるディップスティック、ピン、ＥＬＩＳＡアッセイまたはミクロアレイにおい
て用いてもよい。かかる質的または定量的方法は、当該分野でよく知られており
、いくつかの方法を下記する。Methods of Detecting Nucleic Acid Molecules of the Invention Nucleic acid molecules encoding the proteins of the invention can be used in Southern or Northern analysis, dot blot, or other membrane-based techniques to detect altered expression. May be used in PCR techniques; or in dipsticks, pins, ELISA assays or microarrays using fluids or tissues from patient biopsies. Such qualitative or quantitative methods are well known in the art, and some methods are described below.
【００８６】 本発明の核酸分子により、当業者は、生物学的物質中の本発明の核酸配列の検
出において使用するためのヌクレオチドプローブを構築できる。適当なプローブ
は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ核酸分子の領域（配
列番号１、３、５、７、８、９または１１）由来の少なくとも５個の連続したア
ミノ酸をコードしている核酸配列に基づく核酸分子を包含し、好ましくは、それ
らは１５〜３０ヌクレオチドよりなる。ヌクレオチドプローブは、適切なシグナ
ルを提供し、かつ、３２Ｐ、３Ｈ、１４Ｃなどのような十分な半減期を有する放
射能標識のような検出可能な物質で標識してもよい。使用されうる他の検出可能
な物質は、特異的標識抗体によって認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識抗
原に特異的な抗体、およびルミネセンス化合物を包含する。適当な標識は、検出
されるべきヌクレオチドに対するプローブのハイブリダイゼーションおよび結合
の割合、およびハイブリダイゼーション可能なヌクレオチドの量を顧慮すること
によって選択されうる。標識したプローブは、一般にSambrookら、1989, Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.)に記載のように、ニトロセルロー
スフィルターまたはナイロン膜のような固体支持体上で核酸にハイブリダイズし
うる。核酸プローブは、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ
遺伝子を好ましくは、ヒト細胞中で検出するために使用してもよい。ヌクレオチ
ドプローブは、また、例えば、癌の診断または予後、癌の段階、およびこれらの
病状の進行のモニタリング、または治療的処置のモニタリングにおいて有用であ
りうる。プローブは、また、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用であり
うる。配列は、特定の染色体、染色体の特定領域、または人工染色体構築物（例
えば、ＨＡＣ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）細菌Ｐ１
構築物または単一染色体ｃＤＮＡライブラリー（Price, C.M. 1993, Blood Rev.
7: 127-1134およびTrask, B.J. 1991, Trends Genet. 7; 149-154参照））に位
置付けることができる。The nucleic acid molecules of the present invention allow one of skill in the art to construct nucleotide probes for use in detecting the nucleic acid sequences of the present invention in biological materials. Suitable probes encode at least 5 contiguous amino acids from a region of a GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c nucleic acid molecule (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 8, 9, or 11). Nucleic acid molecules based on a given nucleic acid sequence, preferably they consist of 15 to 30 nucleotides. Nucleotide probes may be labeled with a detectable substance, such as a radiolabel, which provides an appropriate signal and has a sufficient half-life, such as 32 P, 3 H, 14 C, and the like. Other detectable substances that can be used include antigens recognized by specific labeled antibodies, fluorescent compounds, enzymes, antibodies specific for the labeled antigen, and luminescent compounds. A suitable label can be selected by taking into account the ratio of hybridization and binding of the probe to the nucleotide to be detected, and the amount of nucleotide capable of hybridizing. Labeled probes are generally described in Sambrook et al., 1989, Molecu.
Nucleic acid can be hybridized to a solid support such as a nitrocellulose filter or a nylon membrane as described in the Lar Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.). The nucleic acid probe can be glcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c.
The gene may preferably be used for detection in human cells. Nucleotide probes can also be useful, for example, in the diagnosis or prognosis of cancer, the stage of cancer, and the progress of these conditions, or the monitoring of therapeutic treatment. Probes may also be useful for mapping native genomic sequences. The sequence may be a specific chromosome, a specific region of a chromosome, or an artificial chromosome construct (eg, HAC, yeast artificial chromosome (YAC), bacterial artificial chromosome (BAC), bacterial P1.
Constructs or single chromosome cDNA libraries (Price, CM 1993, Blood Rev.
7: 127-1134 and Trask, BJ 1991, Trends Genet. 7; 149-154)).
【００８７】 プローブは、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺伝子を
検出するために、ハイブリダイゼーション技術において使用してもよい。技術は
、一般に、核酸中の相補配列に対するプローブの特異的アニーリングに有利な条
件下で、患者または他の細胞供給源由来の試料から得られた核酸（例えば、組換
えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子）を本発明のプローブと接触し、インキュベー
トすることを含む。インキュベーション後、アニールしなかった核酸を除去し、
もしあれば、プローブにハイブリダイズした核酸の存在を検出する。Probes may be used in hybridization techniques to detect glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c genes. The technique generally involves nucleic acids (eg, recombinant DNA molecules, cloned genes) obtained from a sample from a patient or other cell source under conditions that favor specific annealing of the probe to complementary sequences in the nucleic acid. Is contacted with the probe of the present invention and incubated. After the incubation, remove the unannealed nucleic acids,
If present, the presence of the nucleic acid hybridized to the probe is detected.
【００８８】 本発明の核酸分子の検出は、ＰＣＲのような増幅方法を用いる特異的遺伝子配
列の増幅、次いで、当業者に既知の技術を用いる増幅した分子の分析を含んでも
よい。適当なプライマーは、当業者によって慣例的に設計される。Detection of a nucleic acid molecule of the invention may include amplification of a specific gene sequence using an amplification method such as PCR, followed by analysis of the amplified molecule using techniques known to those skilled in the art. Suitable primers are routinely designed by those skilled in the art.
【００８９】 ゲノムＤＮＡは、点突然変異、挿入、欠失および染色体再配列を包含するｇｌ
ｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ構造に関与する異常性を検出
するために、生物学的試料のハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおい
て用いてもよい。例えば、直接配列決定、１本鎖コンホメーション多形分析、ヘ
テロ２本鎖分析、変性勾配ゲル電気泳動、化学的ミスマッチ切断、およびオリゴ
ヌクレオチドハイブリダイゼーションを用いてもよい。The genomic DNA contains gl, including point mutations, insertions, deletions and chromosomal rearrangements.
It may be used in biological sample hybridization or amplification assays to detect abnormalities involving the cNAc-TV-b or glcNAc-TV-c structure. For example, direct sequencing, single-stranded conformation polymorphism analysis, heteroduplex analysis, denaturing gradient gel electrophoresis, chemical mismatch cleavage, and oligonucleotide hybridization may be used.
【００９０】 当業者に知られている遺伝子型分類技術は、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺伝子における突然変異に極めて接近した多形性を分類す
るために用いることができる。多形性は、おそらく突然変異を有しているファミ
リーにおいて個体を同定するために用いてもよい。また、多形性がｇｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺伝子における突然変異との連鎖不均
衡を示す場合、また、おそらく突然変異を有している一般集団における個体につ
いてスクリーンするためにそれを用いることができる。使用されうる多形性は、
制限フラグメント長多形（ＲＦＬＰ）、単一塩基多形、および単純配列反復多形
（ＳＳＬＰ）を包含する。The genotyping techniques known to those skilled in the art include glcNAc-TV-b or g
It can be used to classify polymorphisms that are very close to mutations in the lcNAc-TV-c gene. Polymorphisms may be used to identify individuals in families that probably have the mutation. Also, polymorphism is glcNAc
If it shows linkage disequilibrium with a mutation in the -TV-b or glcNAc-TV-c gene, it can also be used to screen for individuals in the general population that probably have the mutation. Polymorphisms that can be used are:
Includes restriction fragment length polymorphism (RFLP), single nucleotide polymorphism, and simple sequence repeat polymorphism (SSLP).
【００９１】 本発明のプローブは、ＲＦＬＰを直接同定するために使用してもよい。本発明
のプローブまたはプライマーは、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミド、ファージ
またはプラスミドのようなゲノムクローンを単離するために、付加的に使用でき
る。クローン中のＤＮＡは、ハイブリダイゼーションまたは配列決定方法を用い
てＳＳＬＰについてスクリーンできる。[0091] The probes of the present invention may be used to directly identify RFLPs. The probes or primers of the present invention can additionally be used to isolate genomic clones such as YACs, BACs, PACs, cosmids, phages or plasmids. DNA in clones can be screened for SSLP using hybridization or sequencing methods.
【００９２】 本明細書に記載のハイブリダイゼーションおよび増幅技術は、ｇｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ発現の質的および定量的態様をアッセイ
するために用いてもよい。例えば、ＲＮＡをｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂを発現する
ことが知られている細胞型または組織（例えば、脳）から単離し、本明細書に引
用されるハイブリダイゼーション（例えば、標準的なノーザン分析）またはＰＣ
Ｒ技術を用いて試験してもよい。該技術は、正常または異常な選択的スプライシ
ングのためであるかもしれない転写サイズの相違を検出するために用いてもよい
。該技術は、癌のような疾患の徴候を示している個体と比較して、正常個体にお
いて検出される全長および／または選択的スプライス転写産物のレベルの定量的
相違を検出するために用いてもよい。 プライマーおよびプローブは、上記の方法において、その場で、すなわち、生
検または切除物から得られた患者の組織の（固定および／または冷凍された）組
織切片上で直接使用してもよい。[0092] The hybridization and amplification techniques described herein employ glcNAc-
It may be used to assay qualitative and quantitative aspects of TV-b or glcNAc-TV-c expression. For example, RNA may be isolated from a cell type or tissue known to express glcNAc-TV-b (eg, brain) and hybridized as described herein (eg, standard Northern analysis) or PC
It may be tested using the R technique. The technique may be used to detect transcript size differences that may be due to normal or abnormal alternative splicing. The technique may also be used to detect quantitative differences in the levels of full length and / or alternative splice transcripts detected in normal individuals, as compared to individuals showing signs of a disease such as cancer. Good. Primers and probes may be used in the methods described above in situ, ie, directly on (fixed and / or frozen) tissue sections of a patient's tissue obtained from a biopsy or excision.
【００９３】 ミクロアレイ 本発明の核酸分子のいずれか由来のオリゴヌクレオチドは、ミクロアレイの標
的として用いてもよい。「ミクロアレイ」なる語は、基質、例えば、紙、ナイロ
ン、または他の型の膜、フィルター、チップ、ガラススライド、またはいずれか
他の適当な固体支持体上で合成された別個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドのアレイをいう。Microarrays Oligonucleotides from any of the nucleic acid molecules of the present invention may be used as targets for microarrays. The term "microarray" refers to a substrate, for example, a discrete polynucleotide synthesized on a paper, nylon, or other type of membrane, filter, chip, glass slide, or any other suitable solid support or Refers to an array of oligonucleotides.
【００９４】 ミクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターするために（転
写イメージを製造するために）、および遺伝的変異、突然変異および多形を同定
するために使用できる。該情報は、遺伝子機能の決定、疾患の遺伝的基礎の理解
、疾患の診断、ならびに治療物質の活性の発現およびモニタリングに有用である
（Heller, R.ら、(1997) Proc. Natl. Acd, Sci. 94: 2150-55）。Microarrays can be used to monitor the expression levels of large numbers of genes simultaneously (to produce transcript images) and to identify genetic mutations, mutations and polymorphisms. The information is useful for determining gene function, understanding the genetic basis of disease, diagnosing disease, and expressing and monitoring the activity of therapeutics (Heller, R. et al. (1997) Proc. Natl. Acd, Sci. 94: 2150-55).
【００９５】 本発明の具体例において、ミクロアレイは、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９５／１１９
９５（Cheeら）、Lockhart D.ら、1996, Nat. Biotech, 14: 1675-1680およびSc
hena M.ら、1996, Proc. Natl. Acad, Sci. 93: 10614-10619に記載の方法にし
たがって、調製および使用される。[0095] In an embodiment of the invention, the microarray is PCT Application Publication WO 95/119.
95 (Chee et al.), Lockhart D. et al., 1996, Nat. Biotech, 14: 1675-1680 and Sc.
Hena M. et al., 1996, Proc. Natl. Acad, Sci. 93: 10614-10619.
【００９６】 ミクロアレイは、多数の独特の１本鎖核酸配列、通常、固体支持体に固定され
たｃＤＮＡの合成アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはフラグメントよりなる
。オリゴヌクレオチドは、約６〜６０ヌクレオチド長、好ましくは、１５〜３０
ヌクレオチド長、最も好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチド長であることがで
きる。いくつかのミクロアレイの場合、約７〜１０ヌクレオチド長のオリゴヌク
レオチドを用いることが好ましい。ミクロアレイは、既知の５’または３’配列
を含むオリゴヌクレオチド、全長配列を含む連続したオリゴヌクレオチド、また
は配列長の特定の領域から選択された独特のオリゴヌクレオチドを含有すること
ができる。ミクロアレイにおいて使用されるポリヌクレオチドは、配列の少なく
ともフラグメントが既知であるか、または特定の細胞型、あるいは発達的または
病的状態に共通の１以上の同定されていないｃＤＮＡに特異的である目的の遺伝
子に特異的なオリゴヌクレオチドであることができる。[0096] Microarrays consist of a number of unique single-stranded nucleic acid sequences, usually synthetic antisense oligonucleotides or fragments of cDNA immobilized on a solid support. The oligonucleotide is about 6-60 nucleotides in length, preferably 15-30
It can be nucleotides in length, most preferably about 20-25 nucleotides in length. For some microarrays, it is preferred to use oligonucleotides of about 7-10 nucleotides in length. Microarrays can contain oligonucleotides containing known 5 'or 3' sequences, contiguous oligonucleotides containing full length sequences, or unique oligonucleotides selected from particular regions of sequence length. Polynucleotides used in microarrays are those whose at least a fragment of the sequence is known or specific for one or more unidentified cDNAs common to a particular cell type or developmental or pathological condition May be an oligonucleotide specific to the gene.
【００９７】 ミクロアレイのために既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを生産するため
に、ヌクレオチド配列の５’またはより好ましくは、３’末端で開始するコンピ
ューターアルゴリズムを用いて、目的の遺伝子を試験する。アルゴリズムは、遺
伝子に独特であり、ハイブリダイゼーションに適当な範囲内のＧＣ含量を有し、
かつ、ハイブリダイゼーションを干渉できる予測される二次構造を欠く所定の長
さのオリゴマーを同定する。いくつかの場合、ミクロアレイ上でオリゴヌクレオ
チド対を用いることが適当である。「対」なる語は、配列の中心に配置できる単
一ヌクレオチドを除いて、同一であろう。対における二番目のオリゴヌクレオチ
ドは対照として作用する。オリゴヌクレオチド対の数は、２００万〜１００万の
範囲であってもよい。オリゴマーは、光管理された化学的工程を用いて、基質上
の指示された領域で合成される。To produce an oligonucleotide against a known sequence for a microarray, the gene of interest is tested using a computer algorithm starting at the 5 ′ or more preferably at the 3 ′ end of the nucleotide sequence. The algorithm is unique to the gene and has a GC content in the appropriate range for hybridization,
In addition, oligomers of a given length are identified that lack predicted secondary structures that can interfere with hybridization. In some cases, it is appropriate to use oligonucleotide pairs on a microarray. The term "pair" will be identical except for a single nucleotide that can be placed at the center of the sequence. The second oligonucleotide in the pair serves as a control. The number of oligonucleotide pairs may range from 2 million to 1 million. Oligomers are synthesized at indicated regions on the substrate using light controlled chemical processes.
【００９８】 オリゴマーは、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９５／２５１１１６（Baldeschweilerら）
に記載のように、化学カップリング法およびインクジェット塗布装置を用いて、
基質の表面で合成できる。ドット（またはスロット）に類似の「グリッド（grid
ded）」アレイもまた、真空系、温度的、ＵＶ、機械的または化学的結合法を用
いて、基質の表面にｃＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを配置およ
び結合するために使用できる。アレイは、手作業で、または入手可能な装置（ス
ロットブロットまたはドットブロット装置）、材料（いずれかの適当な固体支持
体）および機械（ロボット機器を包含する）を用いて製造でき、それは、８、２
４、９６、３８４、１５３６または６１４４個のオリゴヌクレオチド、または市
販の機器の効率のよい使用に向いているいずれか他の２００万〜１００万の複数
を含有できる。Oligomers are described in PCT Application Publication WO 95/251116 (Baldeschweiler et al.).
As described in the above, using a chemical coupling method and an inkjet coating device,
Can be synthesized on the surface of the substrate. A grid similar to a dot (or slot)
"ded)" arrays can also be used to place and attach cDNA fragments or oligonucleotides to the surface of a substrate using vacuum, thermal, UV, mechanical or chemical coupling methods. Arrays can be manufactured by hand or using available equipment (slot blot or dot blot equipment), materials (any suitable solid support) and machines (including robotic equipment), including , 2
It can contain 4, 96, 384, 1536 or 6144 oligonucleotides, or any other 2 million to 1 million plurals that are suitable for efficient use of commercially available equipment.
【００９９】 ミクロアレイを用いる試料分析は、生物学的試料由来のＲＮＡまたはＤＮＡを
ハイブリダイゼーションプローブにすることによって行われる。ｍＲＮＡを単離
し、ｃＤＮＡを調製し、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を作るための鋳型とし
て使用する。ａＲＮＡを蛍光ヌクレオチドの存在下で増幅し、標識したハイブリ
ダイゼーションプローブをミクロアレイと一緒にインキュベートし、それにより
、プローブ配列がミクロアレイの相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズす
る。インキュベーション条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補性対合で
、または種々の度合いのより小さい相補性で起こるように選択される。非ハイブ
リダイゼーションプローブの除去後、スキャナーが蛍光のレベルおよびパターン
を決定する。スキャンしたイメージを調べて、ミクロアレイ上の各オリゴヌクレ
オチド配列の相補性の度合いおよび相対量を決定する。生物学的試料は、いずれ
かの体液（例えば、血液、尿、唾液、痰、胃液など）、培養細胞、生検、または
他の組織調製物から得てもよい。検出系は、全ての別個の配列について、ハイブ
リダイゼーションの不在、存在および量を同時に測定するために使用できる。該
データは、試料間の配列、突然変異、変異または多形における大規模な相関研究
に使用できる。Sample analysis using a microarray is performed by using RNA or DNA from a biological sample as a hybridization probe. mRNA is isolated, cDNA is prepared and used as a template to make antisense RNA (aRNA). The aRNA is amplified in the presence of fluorescent nucleotides and the labeled hybridization probes are incubated with the microarray, so that the probe sequences hybridize to the complementary oligonucleotides of the microarray. Incubation conditions are chosen such that hybridization occurs at exact complementarity matches, or with varying degrees of lesser complementarity. After removal of non-hybridization probes, the scanner determines the level and pattern of fluorescence. The scanned images are examined to determine the degree of complementarity and the relative amount of each oligonucleotide sequence on the microarray. Biological samples may be obtained from any bodily fluid (eg, blood, urine, saliva, sputum, gastric juice, etc.), cultured cells, biopsies, or other tissue preparations. The detection system can be used to simultaneously measure the absence, presence and amount of hybridization for all distinct sequences. The data can be used for extensive correlation studies on sequences, mutations, mutations or polymorphisms between samples.
【０１００】 タンパク質の検出方法 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質、または誘導体、例えば、酵素複合体または標識化誘導体と特異的に反応す
る抗体は、種々の生物学的材料中でＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質を検出するために用いてもよい。それらは
、診断または予後的試薬として使用してもよく、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパ
ク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパ
ク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質発現のレベルにおける異常性
、または該タンパク質の構造および／または時間的、組織、細胞性、または亜細
胞性位置における異常性を検出するために用いてもよい。抗体は、また、癌など
のような病状に対する治療化合物の効果を決定するために、可能性のある治療化
合物をイン・ビトロでスクリーンするために用いてもよい。イン・ビトロでのイ
ムノアッセイもまた、特定の治療の効果を評価またはモニターするために用いて
もよい。本発明の抗体は、また、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌ
ｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質を生産するように遺伝子操作された細胞にお
いてＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ発現のレベルを決定
するために、イン・ビトロで用いてもよい。Protein Detection Methods GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein, or derivative, eg, enzyme complex or labeled derivative Antibodies that specifically react with GlcNAc-TV-b protein, Glc in various biological materials.
NAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or G
It may be used to detect lcNAc-TV-c related proteins. They may be used as diagnostic or prognostic reagents, and abnormalities in the level of GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein expression Or may be used to detect abnormalities in the structure and / or temporal, tissue, cellular, or subcellular location of the protein. Antibodies may also be used to screen potential therapeutic compounds in vitro, to determine the effect of the therapeutic compound on a condition, such as cancer. In vitro immunoassays may also be used to assess or monitor the effect of a particular treatment. The antibody of the present invention also comprises a GlcNAc-TV-b protein, GlcN
Ac-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or Gl
It may be used in vitro to determine the level of GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c expression in cells that have been genetically engineered to produce a cNAc-TV-c-related protein.
【０１０１】 抗体は、本発明のタンパク質の抗原性決定基と抗体の間の結合作用に依存する
いずれか既知のイムノアッセイにおいて用いてもよい。かかるアッセイの例は、
ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光
、免疫沈降、ラテックス凝集、赤血球凝集、および組織化学試験である。抗体は
、特定の細胞性事象または病理学的状態におけるその役割を決定するために、な
らびにかかる病理学的状態を診断および治療するために、試料中の本発明のタン
パク質を検出および定量するために使用してもよい。Antibodies may be used in any known immunoassay that relies on the binding action between the antigenic determinant of the protein of the invention and the antibody. Examples of such assays are
Radioimmunoassay, enzyme immunoassay (eg, ELISA), immunofluorescence, immunoprecipitation, latex agglutination, hemagglutination, and histochemical tests. Antibodies can be used to detect and quantify a protein of the invention in a sample to determine its role in a particular cellular event or pathological condition, and to diagnose and treat such pathological conditions. May be used.
【０１０２】 特に、本発明の抗体は、本発明のタンパク質を検出するため、特定の細胞およ
び組織に、および特定の亜細胞性位置に対してそれを位置決定するため、および
発現レベルを定量するために、免疫−組織化学分析において、例えば、細胞性お
よび亜細胞性レベルで使用してもよい。In particular, the antibodies of the invention detect the protein of the invention, to localize it to specific cells and tissues and to specific subcellular locations, and quantify expression levels. For use in immuno-histochemical analysis, for example, at the cellular and subcellular levels.
【０１０３】 光学および電子顕微鏡を用いる抗原の位置決定のために当該分野で既知の細胞
化学的技術を、本発明のタンパク質を検出するために用いてもよい。一般に、本
発明の抗体を検出可能な物質で標識してもよく、タンパク質を検出可能な物質の
存在に基づいて組織および細胞中に位置決定してもよい。ポリペプチドおよび糖
タンパク質を標識する種々の方法が当該分野で知られており、使用してもよい。
検出可能な物質の例は、限定するものではないが、放射性同位元素（例えば、３ Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ロ
ーダミン、ランタニド燐光体）、ラミノールのようなルミネセンス標識；酵素標
識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ）、ビオチン化基
（標識したアビジン、例えば、光学的または熱量測定的方法によって検出できる
蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジンによって検出できる
）、および第２のレポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体の結
合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される予め決定され
たポリペプチドエピトープを包含する。いくつかの具体例において、標識は、立
体障害の可能性を減少させるために、種々の長さのスペーサーアームを介して結
合する。抗体は、また、電子顕微鏡によって容易に明視化する電子に富む物質、
例えば、フェリチンまたはコロイド状金に結合していてもよい。[0103] Cytochemical techniques known in the art for the localization of antigens using light and electron microscopy may be used to detect the proteins of the invention. In general, the antibodies of the present invention may be labeled with a detectable substance, and proteins may be localized in tissues and cells based on the presence of the detectable substance. Various methods for labeling polypeptides and glycoproteins are known in the art and may be used.
Examples of detectable substances include, but are not limited to, radioisotopes (eg, 3 H, 14 C, 35 S, 125 I, 131 I), fluorescent labels (eg, FITC, rhodamine, lanthanide phosphor). , A luminescent label such as laminol; an enzyme label (eg, horseradish peroxidase, β-galactosidase, luciferase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase), a biotinylated group (labeled avidin, eg, detected by optical or calorimetric methods) And a second reporter (eg, a leucine zipper pair sequence, a binding site for a secondary antibody, a metal binding domain, an epitope tag) recognized by a second reporter (eg, a leucine zipper pair sequence, a metal binding domain, an epitope tag). Polypepti It encompasses an epitope. In some embodiments, the label is attached via spacer arms of various lengths to reduce the potential for steric hindrance. Antibodies are also electron-rich substances that are easily visualized by electron microscopy,
For example, it may be bound to ferritin or colloidal gold.
【０１０４】 抗体または試料は、細胞、抗体などを固定することができる担体または固体支
持体上に固定していてもよい。例えば、担体または支持体は、ニトロセルロース
、またはガラス、ポリアクリルアミド、斑レイ岩および磁鉄鉱であってもよい。
支持体材料は、球形（例えば、ビーズ）、円筒形（例えば、試験管またはウェル
の内表面、またはロッドの外表面）または平面（例えば、シート、試験ストリッ
プ）を包含するいずれかの可能な外形を有していてもよい。１次抗原−抗体反応
が、本発明のタンパク質に対して反応性の抗体に対する特異性を有する２次抗体
の導入によって増幅される間接的方法もまた、用いてもよい。例えば、本発明の
タンパク質に対する特異性を有する抗体がウサギＩｇＧ抗体である場合、２次抗
体は、本明細書に記載の検出可能な物質で標識したヤギ抗−ウサギガンマグロブ
リンであってもよい。The antibody or sample may be immobilized on a carrier or solid support on which cells, antibodies and the like can be immobilized. For example, the carrier or support may be nitrocellulose, or glass, polyacrylamide, gabbro and magnetite.
The support material can be any possible contour, including spherical (eg, beads), cylindrical (eg, the inner surface of a test tube or well, or the outer surface of a rod) or flat (eg, a sheet, test strip). May be provided. An indirect method in which the primary antigen-antibody reaction is amplified by the introduction of a secondary antibody having specificity for an antibody reactive to the protein of the invention may also be used. For example, if the antibody having specificity for a protein of the invention is a rabbit IgG antibody, the secondary antibody may be a goat anti-rabbit gamma globulin labeled with a detectable substance described herein.
【０１０５】 放射能標識を検出可能な物質として用いる場合、本発明のタンパク質は、ラジ
オオートグラフィーによって位置決定されうる。ラジオオートグラフィーの結果
は、種々の光学的方法によってラジオオートグラフィー中の粒子の密度を決定す
ることによって、またはグレンをカウントすることによって定量してもよい。When a radioactive label is used as the detectable substance, the proteins of the invention can be located by radioautography. The results of radioautography may be quantified by determining the density of the particles during radioautography by various optical methods or by counting Glen.
【０１０６】 物質／化合物の同定または評価方法 本明細書に記載の方法は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の活性を干渉または増加する物質を包含するＧｌ
ｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、Ｇｌ
ｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の
生物学的活性を変調する物質を同定するために設計される。Methods for Identifying or Evaluating Substances / Compounds The methods described herein are based on the GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc
-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcN
Gl containing agents that interfere with or increase the activity of Ac-TV-c related proteins
cNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, Gl
Designed to identify substances that modulate the biological activity of a cNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c related protein.
【０１０７】 本発明の方法を用いて同定された物質および化合物は、限定するものではない
が、Ｉｇ−末端融合ペプチドを包含する可溶性ペプチドのようなペプチド、Ｄ−
および／またはＬ−配座アミノ酸よりなるライブラリーを包含するランダムペプ
チドライブラリーおよびコンビナトリアル化学誘導性分子ライブラリーのメンバ
ー、ホスホペプチド（ランダムまたは部分的変性に向けられたホスホペプチドラ
イブラリーメンバーを包含する）、抗体［例えば、ポリクローナル、モノクロー
ナル、ヒト化、抗−イディオタイプ、キメラ、１本鎖抗体、フラグメント（例え
ば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２およびＦａｂ発現ライブラリーフラグメント、および
そのエピトープ結合フラグメント）］、および小型有機または無機分子を包含す
る。物質または化合物は、内因性生理学的化合物であってもよく、または天然も
しくは合成化合物であってもよい。Substances and compounds identified using the methods of the invention include, but are not limited to, peptides such as soluble peptides, including Ig-terminal fusion peptides, D-
And / or members of random peptide libraries and combinatorial chemically inducible molecule libraries, including libraries consisting of L-conformation amino acids, phosphopeptides (including phosphopeptide library members directed to random or partial denaturation) ), Antibodies [eg, polyclonal, monoclonal, humanized, anti-idiotype, chimeric, single chain antibodies, fragments (eg, Fab, F (ab) 2 and Fab expression library fragments, and epitope binding fragments thereof)] , And small organic or inorganic molecules. The substance or compound may be an endogenous physiological compound, or may be a natural or synthetic compound.
【０１０８】 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質を変調する物質は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
Ｖ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｃ関連タンパク質と結合するそれらの能力に基づいて同定できる。した
がって、本発明は、また、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡ
ｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質に結合する物質の同定方法も提供する。本発明の方
法を用いて同定された物質は、通常の技術を用いて単離、クローン化および配列
決定してもよい。本発明のタンパク質に結合する物質は、本発明のポリペプチド
の生物学的または免疫学的活性のアゴニストまたはアンタゴニストであってもよ
い。The substance that modulates a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein, or a GlcNAc-TV-c-related protein is a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-T protein.
Vb-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc
-Can be identified based on their ability to bind to TV-c related proteins. Therefore, the present invention also provides a GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-
TV-b related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNA
Also provided is a method for identifying a substance that binds to a c-TV-c-related protein. Substances identified using the methods of the invention may be isolated, cloned and sequenced using conventional techniques. The substance that binds to the protein of the present invention may be an agonist or antagonist of the biological or immunological activity of the polypeptide of the present invention.
【０１０９】 「アゴニスト」なる語は、タンパク質の活性の量を増加するか、または持続時
間を延長する分子をいう。「アンタゴニスト」なる語は、タンパク質の生物学的
または免疫学的活性を減少する分子をいう。アゴニストおよびアンタゴニストは
、タンパク質、核酸、炭水化物、または本発明のポリペプチドに結合するいずれ
か他の分子を包含する。[0109] The term "agonist" refers to a molecule that increases the amount of activity or the duration of a protein. The term "antagonist" refers to a molecule that decreases the biological or immunological activity of a protein. Agonists and antagonists include proteins, nucleic acids, carbohydrates, or any other molecules that bind to a polypeptide of the invention.
【０１１０】 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質に結合できる物質は、結合が可能な条件下で、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタン
パク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタン
パク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ
タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ
タンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質に結合する可能性のあ
る試験物質と反応させ、試験物質に結合したＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質
またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質を除去および／または検出するこ
とによって同定してもよい。物質−タンパク質複合体、遊離の物質、または非複
合体化タンパク質をアッセイしてもよい。物質−タンパク質複合体の形成を可能
にする条件は、物質およびタンパク質の性質および量のような因子を顧慮して選
択されうる。A substance that can bind to a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein, or a GlcNAc-TV-c-related protein is a GlcNAc-TV- b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein by GlcNAc-TV-b
Protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c
A GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein, or a GlcNAc that is reacted with a test substance that may bind to the protein or the GlcNAc-TV-c-related protein. -May be identified by removing and / or detecting TV-c related proteins. A substance-protein complex, free substance, or uncomplexed protein may be assayed. Conditions that allow for the formation of a substance-protein complex can be selected in view of factors such as the nature and quantity of the substance and protein.
【０１１１】 物質−タンパク質複合体、遊離の物質または非複合体化タンパク質は、通常の
単離技術、例えば、塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲルろ過、分別、吸
着、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集、またはその組み合わせによって単
離してもよい。成分のアッセイを容易にするために、本発明のタンパク質または
物質に対する抗体、または標識タンパク質、または標識物質を用いてもよい。抗
体、タンパク質、または物質は、上記のような検出可能な物質で標識してもよい
。The substance-protein complex, free substance or uncomplexed protein can be isolated by conventional isolation techniques such as salting out, chromatography, electrophoresis, gel filtration, fractionation, adsorption, polyacrylamide gel electrophoresis, It may be isolated by aggregation, or a combination thereof. Antibodies to the proteins or substances of the present invention, or labeled proteins, or substances may be used to facilitate the assay of the components. The antibody, protein, or substance may be labeled with a detectable substance as described above.
【０１１２】 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質または本発明の方法で使用される物質は、不溶性であってもよい。例えば、
タンパク質、または物質は、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデ
ックス、セファロース、カルボメチルセルロースポリスチレン、濾紙、イオン交
換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリア
ミン−メチルビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、
エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルクなどのような適当な担体に
結合していてもよい。担体は、例えば、チューブ、試験プレート、ビーズ、ディ
スク、球などの形状であってもよい。不溶化タンパク質または物質は、既知の化
学的または物理的方法、例えば、臭化シアンカップリングを用いて、材料を適当
な不溶性担体と反応させることによって調製してもよい。The GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein or the substance used in the method of the present invention may be insoluble. . For example,
The protein or substance is agarose, cellulose, dextran, Sephadex, Sepharose, carbomethylcellulose polystyrene, filter paper, ion exchange resin, plastic film, plastic tube, glass beads, polyamine-methylvinyl-ether-maleic acid copolymer, amino acid copolymer,
It may be attached to a suitable carrier such as ethylene-maleic acid copolymer, nylon, silk and the like. The carrier may be in the form of, for example, a tube, a test plate, a bead, a disk, a sphere, and the like. Insolubilized proteins or substances may be prepared by reacting the material with a suitable insoluble carrier using known chemical or physical methods, for example, cyanogen bromide coupling.
【０１１３】 本発明は、また、本発明のタンパク質と結合する物質とタンパク質との結合の
アゴニストまたはアンタゴニスト（すなわち、エンハンサーまたはインヒビター
）についてアッセイすることによって、本発明のタンパク質の生物学的活性を変
調するその能力について化合物を評価するための方法を意図する。化合物が本発
明のタンパク質とタンパク質に結合する物質との結合のアゴニストまたはアンタ
ゴニストであるかを評価するための基本的な方法は、試験化合物の存在下、物質
−タンパク質複合体の形成を可能にする条件下で、タンパク質および物質を含有
する反応混合物を調製することである。試験化合物は、最初に、混合物に加える
か、またはタンパク質および物質の添加の後に加えてもよい。試験化合物を含有
しない、またはプラシーボを含有する対照反応混合物もまた調製する。複合体の
形成を検出し、反応混合物中にはない、対照反応混合物中での複合体の形成は、
試験化合物がタンパク質および物質の相互作用を干渉することを示す。反応は、
液体相において行われてもよく、あるいはタンパク質、物質、または試験化合物
は本明細書に記載のように固定されていてもよい。The present invention also modulates the biological activity of a protein of the present invention by assaying for an agonist or antagonist (ie, an enhancer or inhibitor) of the binding of the protein to a substance that binds to the protein of the present invention. A method for evaluating a compound for its ability to A basic method for assessing whether a compound is an agonist or antagonist of the binding of a protein of the invention to a substance that binds to a protein allows for the formation of a substance-protein complex in the presence of the test compound. Under conditions, a reaction mixture containing the protein and the substance is prepared. The test compound may be added first to the mixture or after the addition of the protein and the substance. Control reaction mixtures containing no test compound or containing a placebo are also prepared. Complex formation in the control reaction mixture, which is not in the reaction mixture and detects complex formation,
Figure 4 shows that test compounds interfere with protein and substance interactions. The reaction is
It may be performed in the liquid phase, or the protein, substance, or test compound may be immobilized as described herein.
【０１１４】 本発明の方法を用いてアッセイできるアゴニストおよびアンタゴニスト、すな
わち、インヒビターおよびエンハンサーは、アゴニスト結合部位、拮抗的アンタ
ゴニスト結合部位、非−拮抗的アンタゴニスト結合部位またはアロステリック部
位を包含するタンパク質または物質上の１以上の結合部位に作用しうることが理
解されよう。Agonists and antagonists, ie, inhibitors and enhancers, that can be assayed using the methods of the present invention are proteins or substances that include agonist binding sites, antagonistic antagonist binding sites, non-antagonistic antagonist binding sites or allosteric sites. It will be understood that they can act on one or more of the binding sites.
【０１１５】 本発明は、また、本発明のタンパク質とタンパク質に結合できる物質との相互
作用のアゴニストの効果を阻害するアンタゴニストについてスクリーンすること
を可能にする。したがって、本発明は、本発明のタンパク質の同じ結合部位につ
いて競合する化合物についてアッセイするために用いてもよい。The present invention also makes it possible to screen for antagonists which inhibit the effect of an agonist of the interaction between the protein of the invention and a substance capable of binding the protein. Thus, the invention may be used to assay for compounds that compete for the same binding site on a protein of the invention.
【０１１６】 本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タ
ンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関
連タンパク質を変調する物質は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌ
ｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の活性を干渉または増加するそれらの能力に
基づいて同定できる。したがって、本発明は、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク
質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク
質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の活性を変調するその能力につ
いて化合物を評価する方法であって、（ａ）試験物質の存在下でＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質のアクセプタ
ーおよび糖ドナーを反応させ；（ｂ）アクセプターに移動された糖ドナーの量を
測定し、（ｃ）試験物質の不在下で（ａ）および（ｂ）の工程を行って、該物質
がＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質による糖ドナーのアクセプターへの移動を干渉または増加させるかを決定す
ることを特徴とする方法を提供する。The substance that modulates the GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein of the present invention is GlcNAc-TV-b protein, GlcN.
Ac-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or Gl
Identification can be based on their ability to interfere or increase the activity of cNAc-TV-c related proteins. Accordingly, the present invention is a method of evaluating a compound for its ability to modulate the activity of a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein. (A) In the presence of a test substance, GlcNAc-
TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-
Reacting a TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein acceptor and a sugar donor; (b) measuring the amount of sugar donor transferred to the acceptor; (c) in the absence of the test substance, (a) and By performing the step (b), the substance transfers the sugar donor to the acceptor by the GlcNAc-TV-b protein, the GlcNAc-TV-b-related protein, the GlcNAc-TV-c protein or the GlcNAc-TV-c-related protein. A method is provided for determining whether to interfere or increase.
【０１１７】 本発明の方法において使用するのに適当なアクセプターは、還元末端にリンカ
ー有する合成または天然構造である糖類、オリゴ糖類、多糖類、グリコペプチド
、糖タンパク質、または糖脂質、例えば、アシアロ−アガラクト−フェチュイン
グリコペプチドである。Acceptors suitable for use in the methods of the invention include saccharides, oligosaccharides, polysaccharides, glycopeptides, glycoproteins, or glycolipids, such as asialo-, which are synthetic or natural structures having a linker at the reducing end. Agalacto-fetuin glycopeptide.
【０１１８】 糖ドナーは、ヌクレオチド糖、ドリコールリン酸−糖またはドリコールピロリ
ン酸−オリゴ糖類、例えば、ウリジンジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｕ
ＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）またはその誘導体もしくは類似体であってもよい。Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質は、
天然供給源から得てもよく、または本明細書に記載のような組換え法を用いて生
産してもよい。Sugar donors include nucleotide sugars, dolichol phosphate-sugars or dolichol pyrophosphate-oligosaccharides, such as uridine diphospho-N-acetylglucosamine (U
DP-GlcNAc) or a derivative or analog thereof. Glc
NAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b related protein, Glc
The NAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein is
It may be obtained from natural sources or may be produced using recombinant methods as described herein.
【０１１９】 アクセプターまたは糖ドナーは、本明細書に記載のような検出可能な物質で標
識してもよく、本発明のタンパク質とアクセプターおよび糖ドナーとの相互作用
は、検出可能な変化を生じるであろう。検出可能な変化は、比色、測光、放射分
析、電位差測定的などであってもよい。本発明のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパ
ク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパ
ク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質の活性は、また、ＨＰＬＣに
基づく方法（Koendermanら、FEBS Lett. 222:42, 1987）または疎水性アグリコ
ンに接着した合成オリゴ糖類アクセプターを用いる方法（Palcicら、Glycoconju
gate 5:49, 1988; およびPierceら、Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 679,
1987）を用いて決定してもよい。The acceptor or sugar donor may be labeled with a detectable substance as described herein, and the interaction of a protein of the invention with the acceptor and sugar donor will result in a detectable change. There will be. The detectable change may be colorimetric, photometric, radiometric, potentiometric, and the like. The activity of the GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein of the present invention can also be determined by HPLC-based methods (Koenderman et al., FEBS Lett. 222 : 42, 1987) or using synthetic oligosaccharide acceptors attached to hydrophobic aglycones (Palcic et al., Glycoconju).
gate 5:49, 1988; and Pierce et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 146: 679,
1987).
【０１２０】 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質は、タンパク質が糖ドナーをアクセプターに移動させるのに有効なｐＨおよ
び温度にて、金属コファクター、通常、二価カチオン様マンガンの存在下、アク
セプターおよび糖ドナーと反応させる（ここに、１の成分が標識されており、検
出可能な変化を生じる）。タンパク質に有効なｐＨ範囲内にｐＨを維持するため
に、アクセプターおよび糖ドナーを含有するバッファーを使用することが好まし
い。バッファー、アクセプターおよび糖ドナーは、アッセイ組成物として使用し
てもよい。ＥＤＴＡおよび界面活性剤のような他の化合物をアッセイ組成物に添
加してもよい。The GlcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-TV-c-related protein has a pH and temperature effective for the protein to transfer a sugar donor to an acceptor. Reacts with an acceptor and a sugar donor in the presence of a metal cofactor, usually a divalent cation-like manganese (where one component is labeled and produces a detectable change). It is preferred to use a buffer containing an acceptor and a sugar donor to maintain the pH within the pH range effective for proteins. Buffers, acceptors and sugar donors may be used as the assay composition. Other compounds such as EDTA and detergents may be added to the assay composition.
【０１２１】 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質を変調する化合物を評価するために、本発明の方法を適用するのに適当な試
薬は、適当な容器中にパッケージされた必要な材料を提供する便利なキット中に
パッケージされていてもよい。該キットは、また、本発明の方法の実施に有用な
適当な支持体を包含していてもよい。To evaluate a compound that modulates a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein, the method of the present invention is applied. The appropriate reagents may be packaged in a convenient kit that provides the necessary materials packaged in a suitable container. The kit may also include a suitable support useful in practicing the methods of the present invention.
【０１２２】 組成物および治療 本発明の核酸分子およびタンパク質ならびに本明細書に記載の方法によって同
定された物質または化合物、抗体、および本発明のアンチセンス核酸分子は、Ｇ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、Ｇ
ｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質
の生物学的活性を変調するために使用してもよく、それらは、癌を予防する、腫
瘍転移を阻害または治療する、造血前駆細胞成長を刺激する、対象において化学
療法および放射線療法に対する保護を与える、および／または増殖性障害、微生
物もしくは寄生虫感染または神経学的障害を治療するために使用してもよい。Compositions and Therapies The nucleic acid molecules and proteins of the present invention and the substances or compounds identified by the methods described herein, the antibodies, and the antisense nucleic acid molecules of the present invention comprise G
lcNAc-TV-b protein, GlcNAc-TV-b related protein, G
It may be used to modulate the biological activity of lcNAc-TV-c or GlcNAc-TV-c related proteins, which prevent cancer, inhibit or treat tumor metastasis, hematopoietic progenitor cell growth May be used to provide protection against chemotherapy and radiation therapy in a subject, and / or to treat proliferative disorders, microbial or parasitic infections or neurological disorders.
【０１２３】 本発明の物質、化合物などは、黒色腫、アデノーマ、肉腫および特に患者の充
実性組織の癌種のような種々の形態の腫瘍形成の治療に、特に有用でありうる。
特に、組成物は、子宮頸部癌、腎臓、脳、胃、肺、直腸、胸部、腸、胃、肝臓、
甲状腺、頸部（neck）、頸部（cervix）、唾液腺、胆管、骨盤、縦隔、尿道、気
管支、嚢、食道および結腸の癌、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のＨ
ＩＶ感染患者に付随する癌の形態であるカポジ肉腫を治療するために使用しても
よい。The substances, compounds and the like of the present invention may be particularly useful in the treatment of various forms of tumorigenesis, such as melanoma, adenoma, sarcoma and, in particular, carcinomas of solid tissues in patients.
In particular, the composition comprises cervical cancer, kidney, brain, stomach, lung, rectum, breast, intestine, stomach, liver,
Thyroid, neck, cervix, salivary gland, bile duct, pelvis, mediastinum, urethra, bronchial, sac, esophageal and colon cancer, and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) H
It may be used to treat Kaposi's sarcoma, a form of cancer associated with IV infected patients.
【０１２４】 したがって、タンパク質、物質、抗体および化合物などは、イン・ビボでの投
与に適当な生物学的に適合性の形態で、患者に投与するための医薬組成物に処方
してもよい。「イン・ビボでの投与に適当な生物学的に適合性の形態」なる語に
より、いずれかの毒性効果より治療効果が優る投与されるべき物質の形態を意味
する。物質は、ヒトおよび動物を包含する生きている生物に投与してもよい。治
療上活性量の本発明の医薬組成物の投与は、所望の結果を達成するために必要な
投与量および期間で有効な量として定義される。例えば、治療上活性量の物質は
、個体の病態、年齢、性別および体重、および個体において所望の応答を顕在化
させる抗体の能力のような因子にしたがって変化させてもよい。投与計画は、最
適な治療応答を提供するように調整してもよい。例えば、数回に分けた投与量を
毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性による必要に比例して、投与量を
減少させてもよい。Thus, the proteins, agents, antibodies, compounds and the like may be formulated into pharmaceutical compositions for administration to a patient in a biologically compatible form suitable for in vivo administration. By the term "biologically compatible form suitable for administration in vivo" is meant a form of the substance to be administered that has a therapeutic effect that outweighs any toxic effect. The agent may be administered to living organisms, including humans and animals. The administration of a therapeutically active amount of the pharmaceutical composition of the present invention is defined as an amount that is effective at the dose and for the duration necessary to achieve the desired result. For example, a therapeutically active amount of a substance may vary according to factors such as the condition, age, sex and weight of the individual, and the ability of the antibody to elicit the desired response in the individual. Dosage regimes may be adjusted to provide the optimum therapeutic response. For example, several divided doses may be administered daily or the dose may be proportionally reduced as indicated by the exigencies of the therapeutic situation.
【０１２５】 活性物質は、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮的塗布、また
は直腸投与のような都合のよい方法で投与してもよい。投与経路によって、活性
物質を酵素、酸および化合物を不活性化しうる他の天然条件の作用から化合物を
保護するための材料で被覆させてもよい。The active substance may be administered by any convenient method, such as injection (subcutaneous, intravenous, etc.), oral administration, inhalation, transdermal application, or rectal administration. Depending on the route of administration, the active agent may be coated with a material to protect the compound from the effects of enzymes, acids and other natural conditions which can inactivate the compound.
【０１２６】 本明細書に記載の組成物は、それ自体、対象に投与できる医薬上許容される組
成物の調製のための既知の方法によって調製でき、その結果、有効量の活性物質
が医薬上許容されるビヒクルと共に混合物中に配合される。適当なビヒクルは、
例えば、Remington's Pharmaceutical Science (Remingtn's Pharmaceutical Sc
ience, Mack Publishing Company, Easton, Pa, USA 1985）に記載されている。
これに基づき、組成物は、たとえ排他的でなくても、１以上の医薬上許容される
ビヒクルまたは希釈剤と共に、適当なｐＨで、かつ、生理学的流体と等浸透圧の
緩衝溶液中に含有される物質または化合物の溶液を包含する。The compositions described herein can themselves be prepared by known methods for the preparation of pharmaceutically acceptable compositions that can be administered to a subject, so that an effective amount of the active substance is pharmaceutically acceptable. Formulated in a mixture with an acceptable vehicle. A suitable vehicle is
For example, Remington's Pharmaceutical Science (Remingtn's Pharmaceutical Sc
ience, Mack Publishing Company, Easton, Pa, USA 1985).
On this basis, the composition is contained, if not exclusively, together with one or more pharmaceutically acceptable vehicles or diluents at a suitable pH and in a buffered solution isotonic with the physiological fluid. Solution of the substance or compound to be prepared.
【０１２７】 医薬組成物を調製した後、それらを適当な容器内に入れ、指示された病状の治
療のために標識することができる。本発明の組成物の投与の場合、標識化は、投
与の量、頻度および方法を包含するであろう。After preparing the pharmaceutical compositions, they can be placed in an appropriate container and labeled for treatment of an indicated condition. For administration of the compositions of the present invention, labeling will include the amount, frequency and method of administration.
【０１２８】 組成物、物質、化合物などは、治療物質として単独または他の治療物質もしく
は他の治療形態（例えば、化学療法または放射能療法）と共に指示されてもよい
。それらは、癌および免疫抑制疾患の治療において、マクロファージ、Ｔ細胞お
よびＮＫ細胞の活性化を増加させるために使用できる。例えば、それらは、増殖
抑制剤、抗菌剤、免疫刺激剤または抗炎症剤と組み合わせて使用できる。特に、
それらは、インターロイキン−２、ンターロイキン−１２およびインターフェロ
ン−を包含するＴｈ１サイトカインのような抗ウイルスおよび／または増殖抑制
剤、ならびにＡＺＴおよび３ＴＣのようなヌクレオシド類似体と組み合わせて使
用できる。それらは、他の治療物質または療法と同時に、別々に、または連続的
に投与できる。The compositions, agents, compounds and the like may be indicated as therapeutic agents alone or with other therapeutic agents or other forms of treatment (eg, chemotherapy or radiotherapy). They can be used to increase macrophage, T cell and NK cell activation in the treatment of cancer and immunosuppressive diseases. For example, they can be used in combination with antiproliferative, antibacterial, immunostimulant or anti-inflammatory agents. In particular,
They can be used in combination with antiviral and / or antiproliferative agents such as Th1 cytokines, including interleukin-2, interleukin-12 and interferon-, and nucleoside analogs such as AZT and 3TC. They can be administered simultaneously, separately or sequentially with other therapeutic substances or therapies.
【０１２９】 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質をコードしている核酸分子またはそのいずれかのフラグメント、またはアン
チセンス配列を治療目的で使用してもよい。本発明のタンパク質をコードしてい
る核酸分子に対するアンチセンスは、タンパク質の合成を遮断するための状況に
おいて使用してもよい。特に、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡ
ｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃ
ＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質をコードしている核酸分子に相補的な配列で細
胞を形質転換してもよい。したがって、アンチセンス配列は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
Ｖ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
Ｖ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパク質活性を変調する
ために、または遺伝子機能の調節を達成するために使用してもよい。センスまた
はアンチセンスオリゴマーあるいはより大きなフラグメントは、本発明のタンパ
ク質をコードしている配列のコーディングまたは調節領域の種々の位置から設計
することができる。A nucleic acid molecule encoding a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein, or a fragment thereof, or an antisense sequence May be used for therapeutic purposes. Antisense to a nucleic acid molecule encoding a protein of the invention may be used in the context of blocking protein synthesis. In particular, GlcNAc-TV-b protein, GlcNA
c-TV-b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or Glc
Cells may be transformed with sequences complementary to a nucleic acid molecule encoding a NAc-TV-c related protein. Therefore, the antisense sequence is GlcNAc-T
Vb protein, GlcNAc-TV-b related protein, GlcNAc-T
It may be used to modulate Vc protein or GlcNAc-TV-c related protein activity or to achieve regulation of gene function. Sense or antisense oligomers or larger fragments can be designed from various locations in the coding or regulatory region of the sequence encoding the protein of the invention.
【０１３０】 発現ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニ
アウイルス、または標的器官、組織または細胞へ核酸配列をデリバリーするため
の種々の細菌性プラスミド由来であってもよい。ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたは
ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃのアンチセンス核酸配列を発現するベクターは、当業者
によく知られた技術を用いて構築できる（例えば、Sambrookら（前掲）参照）。[0130] The expression vector may be derived from a retrovirus, adenovirus, herpes or vaccinia virus, or various bacterial plasmids for delivering nucleic acid sequences to a target organ, tissue or cell. Vectors expressing glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c antisense nucleic acid sequences can be constructed using techniques well known to those skilled in the art (see, eg, Sambrook et al., supra).
【０１３１】 ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ関連タンパク質
、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ関連タンパ
ク質をコードしている遺伝子は、本発明のタンパク質をコードする核酸分子また
はそのフラグメントを高レベルで発現する発現ベクターで細胞または組織を形質
転換することによって、作成することができる。かかる構築物は、翻訳不可能な
センスまたはアンチセンス配列を細胞中に導入するために使用してもよい。たと
え、それらがＤＮＡ中に組み込まれなくても、内在性ヌクレアーゼによって全コ
ピーが無能力にされるまで、ベクターはＲＮＡ分子を転写し続けることができる
。一過性発現は、非複製ベクターを用いて、または適当な複製エレメントがベク
ター系の一部である場合に、長期間（例えば、１ヶ月以上）続く。A gene encoding a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-related protein, a GlcNAc-TV-c protein or a GlcNAc-TV-c-related protein is a nucleic acid molecule encoding a protein of the present invention or It can be made by transforming a cell or tissue with an expression vector that expresses the fragment at high levels. Such constructs may be used to introduce non-translatable sense or antisense sequences into cells. Even if they are not integrated into the DNA, the vector can continue to transcribe the RNA molecule until all copies are disabled by the endogenous nuclease. Transient expression may last for an extended period of time (eg, one month or more) using non-replicating vectors, or when the appropriate replication elements are part of the vector system.
【０１３２】 遺伝子発現の修飾は、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ
遺伝子の調節領域、すなわち、プロモーター、エンハンサーおよびイントロンに
対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を設
計することによって達成してもよい。好ましくは、アンチセンス分子は、転写開
始部位由来のオリゴヌクレオチドである（例えば、開始部位から位置−１０〜＋
１０）。阻害は、また、３重らせんに基づく対合技術を用いることによって達成
できる。３重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のた
めに十分に開くことができる２重らせんの能力に対する阻害を引き起こす（Gee
J.E.ら、(1994); Huber, B.E.およびB.I. Carr, Molecular and Immunologic Ap
proaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.）。アンチセンス分子は、
また、リボソームへの転写産物の結合を阻害することによって、ｍＲＮＡの翻訳
を遮断するように設計されてもよい。[0132] Modification of gene expression can be performed using glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c.
It may be achieved by designing antisense molecules, DNA, RNA, or peptide nucleic acids (PNA) for the regulatory regions of the gene, ie, promoters, enhancers and introns. Preferably, the antisense molecule is an oligonucleotide from the transcription start site (eg, positions -10 to + from the start site).
10). Inhibition can also be achieved by using triple helix-based pairing techniques. Triple helix pairing causes inhibition of the ability of the double helix to open sufficiently for binding of polymerases, transcription factors or regulatory molecules (Gee
JE et al., (1994); Huber, BE and BI Carr, Molecular and Immunologic Ap.
proaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). Antisense molecules are
It may also be designed to block translation of mRNA by inhibiting the binding of the transcript to the ribosome.
【０１３３】 リボザイムは、ＲＮＡの特定の切断を触媒するために使用されてもよい。リボ
ザイム作用は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリ
ダイゼーション、次いで、エンドヌクレオチド結合分解性の切断を含む。例えば
、特異的に、有効に、本発明のポリペプチドをコードしている配列のエンドヌク
レオチド結合分解性切断を触媒できるハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子
を操作してもよい。Ribozymes may be used to catalyze the specific cleavage of RNA. Ribozyme action involves sequence-specific hybridization of a ribozyme molecule to a complementary target RNA, followed by endonucleolytic cleavage. For example, one may engineer a hammerhead motif ribozyme molecule that can specifically and effectively catalyze endonucleolytic cleavage of a sequence encoding a polypeptide of the invention.
【０１３４】 いずれかのＲＮＡ標的内の特異的リボソーム切断部位は、最初に、配列：ＧＵ
Ａ、ＧＵＵおよびＧＵＣを包含するリボザイム切断部位について標的分子をスキ
ャンすることによって同定してもよい。標的遺伝子の切断部位の領域に対応する
１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを作動不
能にしうる２次構造特徴について評価してもよい。候補標的の適当性は、リボヌ
クレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼ
ーションの可能性を試験することによって評価してもよい。A specific ribosome cleavage site within either RNA target is first identified by the sequence: GU
A, may be identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites, including GUU and GUC. Short RNA sequences of 15-20 ribonucleotides corresponding to the region of the cleavage site of the target gene may be evaluated for secondary structural features that can render the oligonucleotide inoperable. The suitability of a candidate target may be assessed by testing its potential for hybridization with a complementary oligonucleotide using a ribonuclease protection assay.
【０１３５】 本発明のタンパク質、核酸分子、物質、化合物、抗体、アンチセンス核酸分子
および組成物の活性は、動物実験モデル系において確認してもよい。 本発明は、また、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂタンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−
ｂ関連タンパク質、ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質またはＧｌｃＮＡｃ−Ｔ
Ｖ−ｃ関連タンパク質の機能を研究するための方法を提供する。ｇｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ発現を欠くかまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ
−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ発現を部分的に欠く細胞、組織およびヒト以
外の動物は、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｖまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺伝子にお
ける特異的欠失または挿入突然変異を有する本発明の組換え発現ベクターを用い
て開発されうる。組換え発現ベクターは、相同組換えによって内在性遺伝子を不
活性化または改変し、それにより、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｃ欠損細胞、組織または動物を作成するために使用してもよい。The activity of the proteins, nucleic acid molecules, substances, compounds, antibodies, antisense nucleic acid molecules and compositions of the present invention may be confirmed in animal experimental model systems. The present invention also provides a GlcNAc-TV-b protein, a GlcNAc-TV-b-protein.
b-related protein, GlcNAc-TV-c protein or GlcNAc-T
Methods for studying the function of Vc-related proteins are provided. glcNAc-
Lacking TV-b or glcNAc-TV-c expression or glcNAc-TV
The cells, tissues and non-human animals partially lacking -b or glcNAc-TV-c expression may have a specific deletion or insertion mutation in the glcNAc-TV-v or glcNAc-TV-c gene. It can be developed using a recombinant expression vector. The recombinant expression vector inactivates or modifies the endogenous gene by homologous recombination, whereby glcNAc-TV-b or glcNAc
-May be used to create TV-c deficient cells, tissues or animals.
【０１３６】 欠失突然変異によって、胚性幹細胞のような細胞において、ヌル対立遺伝子を
生じてもよい。組換えｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺
伝子は、また、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃを不活性
化する挿入突然変異を含有するように操作されてもよい。次いで、トランスフェ
クション、エレクトロポレーション、インジェクションなどのような技術によっ
て、、かかる構築物を胚性幹細胞のような細胞中に導入してもよい。次いで、無
傷ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ遺伝子を欠く細胞を、
例えば、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングによって、または本明
細書に記載の方法を用いる本発明のタンパク質の発現についてアッセイすること
によって同定してもよい。次いで、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ
−ＴＶ−ｃを欠損しているヒト以外のトランスジェニック動物を作成するために
、かかる細胞を用いてもよい。突然変異の生殖細胞系伝達は、例えば、８細胞期
胚のような初期の胚を用いて、イン・ビトロで胚性幹細胞を集め、得られた胚盤
胞をレシピエント雌に移入し；得られた集合キメラの生殖細胞系伝達を生じるこ
とによって達成してもよい。かかる突然変異動物は、通常、ｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ
−ｂまたはｇｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ発現に依存する特定の細胞集団、発達パター
ンおよびイン・ビボでのプロセスを定義付けるために用いてもよい。[0136] Deletion mutations may result in null alleles in cells such as embryonic stem cells. The recombinant glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c gene may also be engineered to contain insertional mutations that inactivate glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c. Such a construct may then be introduced into cells, such as embryonic stem cells, by techniques such as transfection, electroporation, injection, and the like. The cells lacking the intact glcNAc-TV-b or glcNAc-TV-c gene are then
For example, they may be identified by Southern blotting, Northern blotting, or by assaying for expression of a protein of the invention using the methods described herein. Then, glcNAc-TV-b or glcNAc
Such cells may be used to create non-human transgenic animals deficient in TV-c. Germline transmission of mutations involves, for example, using early embryos, such as 8-cell stage embryos, collecting embryonic stem cells in vitro and transferring the resulting blastocysts to recipient females; It may be achieved by causing germline transmission of the assembled chimeras. Such a mutant animal is usually a glcNAc-TV
-B or glcNAc-TV-c may be used to define specific cell populations, developmental patterns and processes in vivo that depend on expression.
【０１３７】 本発明のタンパク質は、ポリペプチドを発現している細胞の生存、成長、移動
および／または分化を支持するために使用してもよい。したがって、本発明のポ
リペプチドは、例えば、培養中の細胞を支持するための補給物として使用しても
よい。The proteins of the present invention may be used to support the survival, growth, migration and / or differentiation of cells expressing the polypeptide. Thus, the polypeptides of the present invention may be used, for example, as a supplement to support cells in culture.
【０１３８】 オリゴ糖類の製法 本発明は、活性化ＧｌｃＮＡｃおよびアクセプターを含む反応混合物を本発明
のタンパク質の存在下で接触させることを特徴とするオリゴ糖類の製法に関する
。The present invention relates to a method for producing an oligosaccharide, which comprises contacting a reaction mixture containing activated GlcNAc and an acceptor in the presence of a protein of the present invention.
【０１３９】 オリゴ糖類の製法において使用するためのアクセプターの例は、還元末端にリ
ンカー有する合成または天然構造である糖類、オリゴ糖類、多糖類、グリコペプ
チド、糖タンパク質、または糖脂質、例えば、アシアロ−アガラクト−フェチュ
イングリコペプチドである。活性化ＧｌｃＮＡｃは、ヌクレオチド−糖、ドリコ
ールリン酸−糖またはドリコールピロリン酸−オリゴ糖類の一部であってもよい
。Examples of acceptors for use in the production of oligosaccharides are saccharides, oligosaccharides, polysaccharides, glycopeptides, glycoproteins, or glycolipids that are synthetic or natural structures with a linker at the reducing end, such as asialo- Agalacto-fetuin glycopeptide. The activated GlcNAc may be part of a nucleotide-sugar, dolichol phosphate-sugar or dolichol pyrophosphate-oligosaccharide.
【０１４０】 本発明の具体例において、オリゴ糖類は、哺乳動物に非毒性の担体、特に、脂
質イソプレノイドまたはポリイソプレノイドアルコール上で調製される。適当な
担体の例は、ドリコールリン酸である。オリゴ糖類は、脂質担体からのオリゴ糖
の化学的除去を可能にする不安定な結合を介して担体に接着していてもよい。別
法では、オリゴ糖を脂質担体からタンパク質へ移動させるために、オリゴ糖トラ
ンスフェラーゼを使用してもよい。In an embodiment of the present invention, the oligosaccharide is prepared on a carrier that is non-toxic to mammals, in particular, a lipid isoprenoid or polyisoprenoid alcohol. An example of a suitable carrier is dolichol phosphate. The oligosaccharide may be attached to the carrier via a labile bond that allows for the chemical removal of the oligosaccharide from the lipid carrier. Alternatively, an oligosaccharide transferase may be used to transfer an oligosaccharide from a lipid carrier to a protein.
【０１４１】 以下の非限定的実施例は、本発明の例示である。 実施例１ ヒトＧｌｃＮＡｃ−ＴＶｂの単離 ヒトＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ相同体のｃＤＮＡ配列をＧｅｎｅＢａｎｋ ＥＳＴデ
ータベース（受託番号R87580)を用いる類似性対合によって同定した。該ＥＳＴ
ｃＤＮＡクローン（ｈＧＴＮＶｂと称する）を配列決定し（６２７塩基対）、翻
訳時に、ヒトＧｌｃＮＡｃ−ＴＶアミノ酸配列の３’末端に６７％同一であるこ
とが示された。該情報は、二つの異なる方法；コロニープラークリフトによるヒ
ト脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングおよび５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端
の迅速な増幅）を用いて、ヒトＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ様ｃＤＮＡの全配列について
検索を開始した。The following non-limiting examples are illustrative of the present invention. Example 1 Isolation of Human GlcNAc-TVb The cDNA sequence of the human GlcNAc-TV homolog was identified by similarity pairing using the GeneBank EST database (Accession number R87580). The EST
A cDNA clone (designated hGTNVb) was sequenced (627 base pairs) and shown to be 67% identical to the 3 'end of the human GlcNAc-TV amino acid sequence during translation. The information was initiated using two different methods; screening of the human brain cDNA library by colony plaque lift and 5'RACE (rapid amplification of cDNA ends) to search for the entire sequence of human GlcNAc-TV-like cDNA. .
【０１４２】 ヒト脳５’ＳＴＲＥＴＣＨ ＰＬＵＳｃＤＮＡライブラリー（gt10-CLONTECH
（Cat# HL3002A）を、Ｎｏｔ１およびＢａｍＨ１でのｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ
ＥＳＴ ｃＤＮＡの制限酵素消化によって生じた３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識した２０
３塩基対ｃＤＮＡプローブでスクリーンした（標準的プロトコールを用いる）。
２００万個のファージクローンをスクリーンし、４個の陽性クローンを同定した
。その後の３回のスクリーニングラウンドによってこれらのクローンの各々を均
質に精製し、通常の方法を用いて、ファージＤＮＡをこれらのクローンの各々か
ら単離した。ｃＤＮＡ挿入部をこれらのクローンの各々から単離し、次いで、Ｂ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Stratagene）のＥｃｏＲ１部位中にサブクローン
化し、配列決定した。４つのクローンのうち２つがＥＳＴクローンと同一の配列
を有し、それにより、新しい情報を提供しなかった。他の２つのクローンは、ｈ
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂに類似することが見出された。１つのクローン（１８２
０塩基対）は、付加的な１２９５塩基対の３’非翻訳配列を有するＥＳＴクロー
ンのコーディング領域と配列が同一であり、他のクローンは、ｈＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂと６１％同一であり（アミノ酸比較）、ｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃと称
した。興味深いことに、ｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂおよびｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ
−ｃの３’末端は、非常に異なり、これらのクローンの１つが他方のスプライス
変異であることを示唆する。A human brain 5′STRETCH PLUS cDNA library (gt10-CLONTECH
(Cat # HL3002A) was converted to hGlcNAc-TV-b on Not1 and BamH1.
32 P-dCTP labeled 20 produced by restriction enzyme digestion of EST cDNA.
Screened with a 3 bp cDNA probe (using standard protocol).
Two million phage clones were screened and four positive clones were identified. Each of these clones was purified to homogeneity by three subsequent screening rounds, and phage DNA was isolated from each of these clones using conventional methods. A cDNA insert was isolated from each of these clones and then
euscript vector (Stratagene) was subcloned into the EcoR1 site and sequenced. Two of the four clones had the same sequence as the EST clone, thereby providing no new information. The other two clones are h
It was found to be similar to GlcNAc-TV-b. One clone (182
0 bp) is identical in sequence to the coding region of an EST clone having an additional 1295 bp 3 ′ untranslated sequence, while the other clones have the hGlcNAc-
It is 61% identical to TV-b (amino acid comparison) and was designated as hGlcNAc-TV-c. Interestingly, hGlcNAc-TV-b and hGlcNAc-TV
The 3 'end of -c is very different, suggesting that one of these clones is a splice variant of the other.
【０１４３】 ５’ＲＡＣＥプロトコールを用いて、ｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ ｃＤＮＡ配
列の５’領域を単離した。ＰＦＳＫ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６０原発
性神経外胚葉腫瘍）由来の２μｇのｍＲＮＡと一緒にインキュベートし、８５℃
で１０分間インキュベートし、次いで、氷上で１分間冷却したＰＣＲプライマー
（プライマーTVB#1A−ＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＴＣＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡ
ＣＡＧ)（配列番号１３）（１００ｍＭ最終濃度）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡ合
成を行った。該混合物に、最終濃度まで、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４
）、５０ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、４００μＭ
各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび２００単位のＳｕｐｅｒｓｃ
ｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ（GIBCO-BRL）を加え、４２℃で５０分間インキュベートし
た。７０℃で１５分間それを置くことによって反応を止め、次いで、２単位のＲ
ＮＡｓｅと一緒にインキュベートし、さらに３０分間インキュベートした。Glsa
aMax DNAスピンカートリッジを製造者の指示（GIBCO-BRL）にしたがって用いる
ことにより、生じたｃＤＮＡを精製した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４
）、２５ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＣＴＰおよび１
単位のＴｄＴの最終組成を用いて３７℃で１０分間インキュベートした反応にお
いて、単離ｃＤＮＡをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（
ＴｄＴ）でテーリングし、ホモポリマーｄＣＴＰをｃＤＮＡの３’末端に付加し
た。ＴｄＴは、６５℃で１０分間、熱不活性化した。テーリングしたｃＤＮＡ（
５μｌ）を２つのプライマー（プライマーTVB#1B−ＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧ
ＧＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧ（配列番号１４）および短縮アンカー（Abridged Ancho
r）プライマー−GIBCO-BRLから提供されない配列）を用い、２０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、４００ｍＭプ
ライマーＴＶＢ＃１Ｂ、４００ｍＭ短縮アンカープライマー、２００μＭ各ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメ
ラーゼの最終組成を用いてＰＣＲによって増幅した。該反応物を９４℃に予め平
衡化させたサーマルサイクラーに移した。下記のサイクリングプロトコール：９
４℃で２分間のプレ変性、９４℃で１分間の変性、５８℃で１．５分間のプライ
マーのアニーリング、７２℃で２．５分間のプライマー伸長および７２℃で１０
分間の最終伸長を用いて、ＰＣＲを３５サイクル行った。５’ＲＡＣＥ産物は、
標準的アガロースゲル電気泳動プロトコールを用いて分析した。目に見えるバン
ドは観察されなかったので、StratgeneのＤＮＡゲル抽出キットを用いて１．６
ｋｂマーカーより大きい領域を単離し、標準的手法を用いてＴ／Ａ Ｂｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔベクター中にサブクローン化した。数個のｃＤＮＡフラグメントがＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中にサブクローン化され、配列決定された。１．７
ｋｂ ｃＤＮＡフラグメントを含有する１個のクローンだけがｈＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂに類似していた。該ｃＤＮＡフラグメントの実際のサイズは、１６７６
塩基対であり、全ｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂクローンを含まなかったので、異な
るプライマーで上記と同じプロトコールを用いて、５’ＲＡＣＥの第２ラウンド
を行った。ｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂの５’末端を単離するために、別のプラマ
−ＴＶＢ＃２Ａ（ＧＧＴＣＡＡＧＡＴＡＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＧＡ
ＴＣ）（配列番号１５）をプライマーＴＶＢ＃１Ａの代わりに使用し、ＴＶＢ＃
２Ｂ（ＧＴＧＧＡＴＴＡＴＡＴＣＣＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡ
Ｔ（配列番号１６）をＴＶＢ＃２Ａの代わりに使用した。プライマーの該セット
は、３つのｃＤＮＡフラグメント（３、１．７および１．４ｋｂ）を生じ、Stra
tageneのＤＮＡゲル抽出キットを製造者の指示にしたがって用いてそれを単離し
、標準的手法を用いてＴ／Ａ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中にサブクローン
化した。各ｃＤＮＡフラグメントを配列決定し、それは、１．４ｋｂフラグメン
トのみがｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶに類似し、ｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂの５’末端
を示すことを明らかにした。該フラグメントの実際のサイズは、１４４０塩基対
である。Using the 5 ′ RACE protocol, the 5 ′ region of the hGlcNAc-TV-b cDNA sequence was isolated. Incubate with 2 μg of mRNA from PFSK-1 cells (ATCC CRL-2060 primary neuroectodermal tumor) at 85 ° C.
PCR primers (primer TVB # 1A-CCAGACCTGGTCGGCCCCTGCAGCCA) cooled for 10 minutes on ice and then cooled on ice for 1 minute.
First strand cDNA synthesis was performed using CAG) (SEQ ID NO: 13) (100 mM final concentration). The mixture is added to a final concentration of 20 mM Tris-HCl (pH 8.4).
), 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 400 μM
Each dATP, dCTP, dGTP, dTTP and 200 units Supersc
Rip II RT (GIBCO-BRL) was added and incubated at 42 ° C for 50 minutes. The reaction is stopped by placing it at 70 ° C. for 15 minutes, then 2 units of R
Incubate with Nase and incubate for another 30 minutes. Glsa
The resulting cDNA was purified using an aMax DNA spin cartridge according to the manufacturer's instructions (GIBCO-BRL). 10 mM Tris-HCl (pH 8.4)
), 25 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 200 μM dCTP and 1
In a reaction incubated for 10 minutes at 37 ° C. with a final composition of units of TdT, the isolated cDNA was converted to terminal deoxynucleotidyl transferase (
TdT), and a homopolymer dCTP was added to the 3 ′ end of the cDNA. TdT was heat inactivated at 65 ° C. for 10 minutes. The tailed cDNA (
5 μl) with 2 primers (primer TVB # 1B-GGAGGCAGCCCCCG)
GGAGCTGGGAG (SEQ ID NO: 14) and truncated anchor (Abridged Ancho
r) primer-sequence not provided by GIBCO-BRL) and 20 mM Tris-H
Cl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 400 mM primer TVB # 1B, 400 mM shortened anchor primer, 200 μM each dA
Amplified by PCR using a final composition of TP, dCTP, dGTP, dTTP and 2.5 units of Taq DNA polymerase. The reaction was transferred to a thermal cycler pre-equilibrated to 94 ° C. The following cycling protocol: 9
Pre-denaturation at 4 ° C. for 2 minutes, denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing of primer at 58 ° C. for 1.5 minutes, primer extension at 72 ° C. for 2.5 minutes, and 10 minutes at 72 ° C.
The PCR was run for 35 cycles with a final extension of minutes. The 5'RACE product is
Analyzed using a standard agarose gel electrophoresis protocol. No visible band was observed, so using a Stratgene DNA gel extraction kit 1.6.
The region larger than the kb marker was isolated and T / A Blues was isolated using standard techniques.
Subcloned into the script vector. Several cDNA fragments B
The vector was subcloned into a vector and sequenced. 1.7
Only one clone containing the kb cDNA fragment was hGlcNAc-
It was similar to TV-b. The actual size of the cDNA fragment is 1676
A second round of 5'RACE was performed using the same protocol as above with different primers because they were base pairs and did not contain the entire hGlcNAc-TV-b clone. To isolate the 5 'end of hGlcNAc-TV-b, another primer-TVB # 2A (GGTCAGAATAAATGGCGTTTTTCCACCGA
TC) (SEQ ID NO: 15) was used in place of primer TVB # 1A,
2B (GTGGATTATATCCCATGGCAGAAAAGCTTTATA
T (SEQ ID NO: 16) was used instead of TVB # 2A. The set of primers yielded three cDNA fragments (3, 1.7 and 1.4 kb),
It was isolated using the tagene DNA gel extraction kit according to the manufacturer's instructions and subcloned into the T / A Bluescript vector using standard techniques. Each cDNA fragment was sequenced, revealing that only the 1.4 kb fragment was similar to hGlcNAc-TV, indicating the 5 'end of hGlcNAc-TV-b. The actual size of the fragment is 1440 base pairs.
【０１４４】 ｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂの全ｃＤＮＡ配列は４５４１塩基対であり、まず、
ＨｉｎｄＩＩＩでの制限酵素消化によって１４４０塩基対のｈＧＴＮＶの５’末
端（５’ＲＡＣＥの第２ラウンド由来）から１４３１塩基対バンド（バンドＡと
称する）（Stratageneゲル抽出キット）を単離することによって再構築された。
第２に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩでの制限酵素消化によって、１６７６塩
基対のｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶｂフラグメント（５’ＲＡＣＥの最初のラウンド由
来）からｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂの中間セクション（１６２３塩基対−バンド
Ｂと称する）を単離し、次いで、バンドＡに連結した（標準的手法を用いる）。
最終的に、ｈＧＴＮＶｂの３’末端をＳｍａＩ制限酵素を用いて単離して、１４
８７塩基対バンド（バンドＣと称する）を単離した。次いで、バンドＣをバンド
Ａ＋Ｂに連結して、ｈＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂの全非翻訳および翻訳配列を作成
した。The entire cDNA sequence of hGlcNAc-TV-b is 4541 base pairs.
Re-isolating by isolating a 1431 base pair band (designated Band A) (Stratagene gel extraction kit) from the 1440 base pair hGTNV 5 'end (from the second round of 5' RACE) by restriction enzyme digestion with HindIII. It was constructed.
Second, an intermediate section of hGlcNAc-TV-b (designated 1623 bp-band B) from a 1676 bp hGlcNAc-TVb fragment (from the first round of 5'RACE) by restriction enzyme digestion with HindIII and SmaI. ) Was isolated and then ligated to band A (using standard procedures).
Finally, the 3 'end of hGTNVb was isolated using SmaI restriction enzyme and
An 87 base pair band (designated band C) was isolated. Band C was then ligated to band A + B to create the entire untranslated and translated sequence of hGlcNAc-TV-b.
【０１４５】 実施例２ ＧｌｃＮＡｃＴＶ−ｂの発現 ヒト組織のノーザンブロット分析 ヒト複合組織および腫瘍細胞系統ノーザンブロットをClontechから入手した。
ヒト胸部および子宮癌組織ならびに正常組織由来のｍＲＮＡを含有するノーザン
ブロットをInvitrogenから入手した。全てのノーザンブロットは、２ｇのｍＲＮ
Ａ／レーンを含有した。これらのブロットを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識したｈ
ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ（ヌクレオチド１５０８−１９２１）およびＧｌｃＮＡｃ−
ＴＶ−ｂ（ヌクレオチド１９５９−２４１７）ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた
。Amersham multiprime ＤＮＡ標識キットおよび［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３０
００ｃｉ／モル）を標識に用いた。ノーザンブロットをストリンジェントな条件
下、推奨されるプロトコール（Clontech）にしたがってハイブリダイズし、Ｘ線
フィルムまたはホスホイメージャー（phosphoimager）に曝露した。Example 2 Expression of GlcNAcTV-b Northern Blot Analysis of Human Tissues Human complex tissues and tumor cell line Northern blots were obtained from Clontech.
Northern blots containing mRNA from human breast and uterine cancer tissues and normal tissues were obtained from Invitrogen. All Northern blots had 2 g mRN
A / lane was included. These blots were labeled with [α- 32 P] dCTP-labeled h
GlcNAc-TV (nucleotides 1508-1921) and GlcNAc-
It hybridized with TV-b (nucleotide 1959-2417) cDNA. Amersham multiprime DNA labeling kit and [α- 32 P] dCTP (30
(00 ci / mol) was used for labeling. Northern blots were hybridized under stringent conditions according to the recommended protocol (Clontech) and exposed to X-ray film or a phosphoimager.
【０１４６】 結果 ２つのＧｌｃＮＡｃ−ＴＶの発現パターンを異なるヒト組織で調べた。ストリ
ンジェントな条件下でのＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ ｃＤＮＡプローブのノーザンブロ
ットへのハイブリダイゼーションは、７．４〜９．５ｋｂのサイズにわたる２つ
の転写産物の幅広い発現を示した（図１）。主要な転写産物９．３ｋｂは、ほと
んどの組織ならびにヒト脳の種々の部位で発現された（図２）。９．３ｋｂおよ
び７．４ｋｂの転写産物は、ヒト結腸直腸細胞系統ＳＷ４８０を除き、ヒト腫瘍
細胞系統において検出されなかった（図３）。しかしながら、この場合、７．４
ｋｂ転写産物は優勢な１つであった。同じブロットをＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ
ｃＤＮＡプローブで試験したとき、非常に異なるパターンの組織特異的発現が観
察された。高レベルの４．５ｋｂ転写産物が脳組織において発現し、精巣におい
て低レベルであった（図１）。該転写産物の存在は、他の試験組織において検出
されなかった。ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ転写産物は、脊髄を除き、成人の脳のい
たるところで発現した（図２）。充実性腫瘍由来の４つの細胞系統は、ＧｌｃＮ
Ａｃ−ＴＶｂの発現を示したが、白血病およびリンパ腫において４．５ｋｂ転写
産物は検出されなかった（図３）。高発現のＧｌｃＮＡｃ−ＴＶｂが２つの異な
るヒト腫瘍組織（胸部および子宮）において検出されたが、腫瘍組織に隣接する
正常組織は非常に低レベルのＧｌｃＮＡｃ−ＴＶｂ転写産物を示した。Results The expression patterns of the two GlcNAc-TVs were examined in different human tissues. Hybridization of a GlcNAc-TV cDNA probe to a northern blot under stringent conditions showed extensive expression of the two transcripts ranging in size from 7.4 to 9.5 kb (FIG. 1). The major transcript, 9.3 kb, was expressed in most tissues as well as in various parts of the human brain (FIG. 2). Transcripts of 9.3 kb and 7.4 kb were not detected in human tumor cell lines except for the human colorectal cell line SW480 (FIG. 3). However, in this case, 7.4
The kb transcript was the dominant one. The same blot was used for GlcNAc-TV-b.
When tested with cDNA probes, a very different pattern of tissue-specific expression was observed. High levels of the 4.5 kb transcript were expressed in brain tissue and low in testis (FIG. 1). The presence of the transcript was not detected in other test tissues. GlcNAc-TV-b transcripts were expressed throughout the adult brain, except for the spinal cord (FIG. 2). The four cell lines from solid tumors are GlcN
Although expression of Ac-TVb was shown, no 4.5 kb transcript was detected in leukemias and lymphomas (FIG. 3). Highly expressed GlcNAc-TVb was detected in two different human tumor tissues (chest and uterus), while normal tissues adjacent to the tumor tissues showed very low levels of GlcNAc-TVb transcripts.
【０１４７】 好ましい具体例において本発明の原理を説明および記載したが、かかる原理か
ら逸脱することなく、アレンジおよび細部において本発明を修飾できることは、
当業者に明らかであろう。上記の特許請求の範囲の範囲内でされる全ての修飾が
主張される。Although the principles of the invention have been illustrated and described in preferred embodiments, it should be understood that modifications of the invention in arrangement and detail may be made without departing from such principles.
It will be apparent to those skilled in the art. All modifications made within the scope of the following claims are claimed.
【０１４８】 本明細書において引用された全ての出版物、特許および特許出願は、出典明示
により、あたかも個々の出版物、特許または特許出願が全体として出典明示によ
り本明細書の一部とされることが特別かつ個別に示されたかと同じ範囲まで、全
体として、本明細書の一部とされる。本明細書において、本発明が先の出願によ
って、かかる開示を以前にしたものとすることを承認されないと解釈されるもの
はない。All publications, patents, and patent applications cited herein are incorporated by reference, as though the individual publications, patents, or patent applications were incorporated by reference in their entirety. To the same extent as if otherwise specifically and individually indicated herein as a whole. Nothing herein is to be construed as an admission that the present invention has not been authorized by prior application to make such disclosure earlier.
【配列表】 [Sequence list]
【図１】 異なるヒト組織から単離したｍＲＮＡをサイズ分画し、放射性ヒ
ト部分ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶクローン（ヌクレオチド１５０８−１９２１）および
ヒト部分ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ（ヌクレオチド１９５９−２４１７）でプロー
ブしたノーザンハイブリダイゼーション実験から得られたラジオオートグラフィ
ーの複写物である。FIG. 1. mRNA isolated from different human tissues was size fractionated and probed with a radioactive human partial GlcNAc-TV clone (nucleotides 1508-1921) and a human partial GlcNAc-TV-b (nucleotides 1959-2417). It is a copy of radioautography obtained from a hybridization experiment.
【図２】 異なるヒト脳組織から単離したｍＲＮＡをサイズ分画し、放射性
ヒト部分ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶクローン（ヌクレオチド１５０８−１９２１）およ
びヒト部分ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ（ヌクレオチド１９５９−２４１７）でプロ
ーブしたノーザンハイブリダイゼーション実験から得られたラジオオートグラフ
ィーの複写物である。FIG. 2. mRNA isolated from different human brain tissues was size fractionated and probed with a radioactive human partial GlcNAc-TV clone (nucleotides 1508-1921) and a human partial GlcNAc-TV-b (nucleotides 1959-2417). It is a copy of radioautography obtained from a hybridization experiment.
【図３】 異なるヒト腫瘍細胞系統から単離したｍＲＮＡをサイズ分画し、
放射性ヒト部分ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶクローン（ヌクレオチド１５０８−１９２１
）およびヒト部分ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂ（ヌクレオチド１９５９−２４１７）
でプローブしたノーザンハイブリダイゼーション実験から得られたラジオオート
グラフィーの複写物である。FIG. 3. Size fractionation of mRNA isolated from different human tumor cell lines,
Radioactive human partial GlcNAc-TV clone (nucleotides 1508-1921)
) And the human part GlcNAc-TV-b (nucleotides 1959-2417)
2 is a copy of radioautography obtained from a Northern hybridization experiment probed in FIG.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｂ０６５ Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｃ０８６ 1/19 9/10 ４Ｃ０８７ 1/21 Ｃ１２Ｐ 19/44 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 19/44 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ａ６１Ｋ 35/76 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB20 CA25 CB01 CB03 CB07 CB08 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB02 FB03 FB07 FB15 4B024 AA01 AA11 BA10 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA17 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL05 4B063 QA13 QQ02 QQ42 QQ52 QR55 QS34 4B064 AF41 CA19 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y 4C084 AA17 ZB262 ZC202 4C085 AA13 BB22 DD88 4C086 AA01 AA02 EA16 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 ZB26 4H045 AA10 AA11 BA10 DA75 EA20 EA50 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 48/00 C07K 16/40 4B065 A61P 35/00 C12N 1/15 4C084 C07K 16/40 1/19 4C085 C12N 1/15 1/21 4C086 1/19 9/10 4C087 1/21 C12P 19/44 4H045 5/10 C12Q 1/68 A 9/10 G01N 33/15 Z C12P 19/44 33/50 Z C12Q 1/68 33/53 D G01N 33/15 33/566 33/50 A61K 35/76 33/53 C12N 15/00 ZNAA 33/566 5/00 A // A61K 35/76 A61K 37/02 (81) Designated country EP ( AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, C) , CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM) , AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK , LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZWF terms (reference) 2G045 BB20 CA25 CB01 CB03 CB07 CB08 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB02 FB03 FB07 FB15 4B024 AA01 AA11 BA10 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA17 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL05 4B063 QA13Q52 QA13Q52 QA13Q52QA4Q2 AA87X AA93Y 4C084 AA17 ZB262 ZC202 4C085 AA13 BB22 DD88 4C086 AA01 AA02 EA16 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 ZB26 4H045 AA10 AA11 BA10 DA75 EA20 EA50
Claims (25)
番号１または配列番号１の相補物にハイブリダイズする少なくとも３０ヌクレオ
チドの単離ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ核酸分子。1. An isolated GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c nucleic acid molecule of at least 30 nucleotides that hybridizes under stringent hybridization conditions to SEQ ID NO: 1 or the complement of SEQ ID NO: 1.
に対し、実質的な配列同一性、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少
なくとも７５％の配列同一性を有するタンパク質をコードしている核酸配列； （ｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列； （ｉｉｉ）遺伝コードの縮重のため、コドン配列において（ｉ）または（ｉｉ
）の核酸のいずれかと異なる核酸配列； （ｉｖ）少なくとも１８個のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな条件下
で配列番号１、３、５、９または１１の核酸配列またはその縮重形態にハイブリ
ダイズできる核酸配列； （ｖ）配列番号２、４、６、１０または１２のアミノ酸配列を含むタンパク質
の末端切断型、類似体、対立遺伝子または種変異をコードしている核酸配列；ま
たは （ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメント、または対立遺伝
子もしくは種変異 を含む単離ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ核酸分子。(I) having a substantial sequence identity, preferably at least 70%, more preferably at least 75%, to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10 or 12; (Ii) a nucleic acid sequence complementary to (i); (iii) a (i) or (ii) in the codon sequence due to the degeneracy of the genetic code.
A) a nucleic acid sequence different from any of the nucleic acids of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9 or 11 or capable of hybridizing under stringent conditions to the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9 or 11 or a degenerate form thereof. (V) a nucleic acid sequence encoding a truncated form, analog, allele or species variation of a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10 or 12; or (vi) (i An isolated GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c nucleic acid molecule comprising a), (ii) or (iii) fragments, or allelic or species mutations.
列に対し、実質的な配列同一性、と好ましくは少なくとも７０％、より好ましく
は少なくとも７５％の配列同一性を有する核酸配列； （ｉｉ）（ｉ）に相補的な、好ましくは、配列番号１、３、５、９または１１
の全長核酸配列に相補的な核酸配列； （ｉｉｉ）遺伝コードの縮重のため、コドン配列において（ｉ）ないし（ｉｉ
）の核酸のいずれかと異なる核酸配列； （ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメント、または対立遺伝
子もしくは種変異 を含む単離核酸ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃ核酸分子
。(I) having substantial sequence identity, preferably at least 70%, more preferably at least 75% sequence identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9 or 11; (Ii) complementary to (i), preferably SEQ ID NO: 1, 3, 5, 9, or 11
(Iii) Due to the degeneracy of the genetic code, (i) to (ii) in the codon sequence
A) a nucleic acid sequence different from any of the nucleic acids of (iv), (i), (ii) or (iii), or an isolated nucleic acid GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c nucleic acid comprising an allele or species mutation; molecule.
パク質の抗体に結合するタンパク質をコードする単離核酸分子。4. An isolated nucleic acid molecule encoding a protein that binds to a GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c protein antibody.
ずれか1項記載の単離核酸分子。5. An isolated nucleic acid molecule according to any one of the preceding claims, fused to a nucleic acid encoding a heterologous protein.
単離ＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｂまたはＧｌｃＮＡｃ−ＴＶ−ｃタンパク質。8. An isolated GlcNAc-TV-b or GlcNAc-TV-c protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10 or 12.
くとも７０％のアミノ酸配列同一性を有する単離タンパク質。9. An isolated protein having at least 70% amino acid sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10, or 12.
；次いで （ｄ）タンパク質を単離する ことを特徴とする請求項８記載のタンパク質の製法。10. (a) transferring the vector of claim 6 into a host cell; (b) selecting a transformed host cell from non-transformed host cells; and (c) transforming the selected transformed host cell into a protein. 9. The method for producing a protein according to claim 8, wherein the culture is performed under conditions that allow expression of the protein; and (d) isolating the protein.
。11. A protein prepared according to the method of claim 10.
有する抗体。12. An antibody having specificity for the epitope of the protein according to claim 8.
胞中でタンパク質を検出するために使用される請求項１２記載の抗体。13. The antibody of claim 12, which is labeled with a detectable substance and is used for detecting proteins in biological samples, tissues and cells.
る配列を含むプローブ。14. A probe comprising a sequence encoding the protein according to claim 8 or a part thereof.
項のいずれか１項記載のタンパク質の存在を決定することによって、請求項８記
載のタンパク質によって媒介される病状を診断およびモニターする方法。15. Diagnosing a disease mediated by a protein according to claim 8 by determining the presence of a nucleic acid molecule according to any of the preceding claims or a protein according to any of the preceding claims. And how to monitor.
きる可能性のある少なくとも１個の物質と、該物質とタンパク質の間の結合を可
能にする条件下で反応させ、（ｂ）該物質に結合したタンパク質を除去または検
出し、ここに、結合したタンパク質および物質の検出が、該物質が該タンパク質
と結合することを示すことを特徴とする請求項８記載のタンパク質と結合する物
質を同定する方法。(A) reacting the protein according to claim 8 with at least one substance capable of binding to the protein under conditions that allow binding between the substance and the protein; b) removing or detecting the protein bound to the substance, wherein the detection of the bound protein and the substance indicates that the substance binds to the protein; A method for identifying substances that do.
ク質またはタンパク質の活性化についてアッセイすることによって、タンパク質
と物質の結合が検出される請求項１６記載の方法。17. The method of claim 16, wherein the binding of the protein to the substance is detected by assaying for substance-protein complex, free substance, uncomplexed protein or activation of the protein.
結合する物質および試験化合物を、該物質とタンパク質の間の複合体の形成を可
能にする条件下で提供し、複合体を除去および／または検出することを特徴とす
る、請求項８記載のタンパク質の生物学的活性を変調するその能力について化合
物を評価するための方法。18. A complex according to claim 8 wherein said substance and a test compound which bind to said protein at a known concentration are provided under conditions which allow the formation of a complex between said substance and the protein. 9. A method for assessing a compound for its ability to modulate the biological activity of a protein according to claim 8, characterized by removing and / or detecting.
イブリダイズし、それにより、ハイブリダイゼーション複合体を形成し；次いで （ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出し、ここに、ハイブリダイゼーシ
ョン複合体の存在が、生物学的試料中のタンパク質をコードしている核酸分子の
存在と相関する 工程を特徴とする生物学的試料中で配列番号２、４、６、１０または１２のアミ
ノ酸配列を含むタンパク質をコードしている核酸分子を検出する方法。19. a) hybridizing the nucleic acid molecule of claim 1 to a nucleic acid of a biological sample, thereby forming a hybridization complex; and (b) detecting the hybridization complex; Wherein the presence of the hybridization complex correlates with the presence of the nucleic acid molecule encoding the protein in the biological sample. Or a method for detecting a nucleic acid molecule encoding a protein comprising the amino acid sequence of 12.
応によって生物学的試料の核酸を増幅する請求項１９記載の方法。20. The method according to claim 19, wherein the nucleic acid of the biological sample is amplified by a polymerase chain reaction before the hybridization step.
は請求項１８記載の方法によって同定された物質または化合物を投与することを
特徴とする請求項８記載のタンパク質によって媒介される病状の治療法。21. A protein mediated by the protein according to claim 8, wherein an effective amount of the antibody according to claim 12 or the substance or compound identified by the method according to claim 16 or 18 is administered. How to treat a medical condition.
タンパク質、あるいは上記請求項のいずれか１項記載の方法を用いて同定された
物質または化合物、および医薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含んで
なる組成物。22. A nucleic acid molecule or protein according to one or more of the preceding claims, or a substance or compound identified using a method according to any of the preceding claims, and a pharmaceutically acceptable substance. A composition comprising a carrier, excipient, or diluent.
するための医薬組成物の調製における、１以上の上記請求項のいずれか１項記載
の核酸分子またはタンパク質、あるいは上記請求項のいずれか１項記載の方法を
用いて同定された物質または化合物の使用。23. A nucleic acid molecule or protein according to one or more of the preceding claims, or the above, in the preparation of a pharmaceutical composition for treating a disease mediated by the protein of claim 8. Use of a substance or compound identified using the method according to any one of the above.
リヌクレオチドを特徴とする脳に向けられた遺伝子に基づく治療。24. A gene-directed therapy directed at the brain characterized by a polynucleotide comprising all or part of the regulatory sequence of SEQ ID NO: 7 or 8.
を請求項８または９に記載のタンパク質の存在下で接触させることを特徴とする
オリゴ糖類の製法。25. A method for producing an oligosaccharide, comprising contacting a reaction mixture containing activated GlcNAc and an acceptor in the presence of the protein according to claim 8 or 9.
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