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JP2002525067A - レプチン誘導遺伝子 - Google Patents

レプチン誘導遺伝子

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Publication number
JP2002525067A
JP2002525067A JP2000570353A JP2000570353A JP2002525067A JP 2002525067 A JP2002525067 A JP 2002525067A JP 2000570353 A JP2000570353 A JP 2000570353A JP 2000570353 A JP2000570353 A JP 2000570353A JP 2002525067 A JP2002525067 A JP 2002525067A
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JP
Japan
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seq
lig46
lig56
nucleic acid
protein
Prior art date
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Pending
Application number
JP2000570353A
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English (en)
Inventor
デイビッド ホワイト
ジアンホン ホウ
ルイス エー． タータグリア
Original Assignee
ミレニアム ファーマシューティカルズ インク．
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ミレニアム ファーマシューティカルズ インク． filed Critical ミレニアム ファーマシューティカルズ インク．
Publication of JP2002525067A publication Critical patent/JP2002525067A/ja
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Abstract

(57)【要約】 その発現がレプチンによって誘導される遺伝子６個を開示する（LIG46；LIG56；T細胞特異的GTP結合蛋白質をコードするTgtp；インターフェロン（IFN）誘導型蛋白質をコードするLRG-47；20S脳プロテアソームのサブユニットをコードするRC10-II；およびレチン酸誘導型蛋白質をコードするStra13）。これらの６個のレプチン誘導遺伝子とそれらがコードする蛋白質は、体重を調節するために用いられる治療薬を開発するための標的となる。例えば、レプチン誘導蛋白質の１つまたは複数の発現または活性を変化させる物質は、体重を調節するために用いることができる。そのような物質はレプチン誘導蛋白質６個の１つまたは複数の発現または活性をモニターする細胞アッセイ法、インビトロアッセイ法、またはインビボアッセイ法を用いて同定することができる。おそらく有用な治療物質はまた、レプチン誘導蛋白質の１つに結合する物質を同定するようにデザインされたアッセイ法を用いることによって同定することができる。本発明のレプチン誘導遺伝子およびそれらがコードする蛋白質は、治療的および診断的に有用であると考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 Ob遺伝子産物であるレプチンは、循環血中に存在する体重の重要なモデュレー
ターである。レプチンは、レプチン受容体であるObRの長型に結合してこれを活
性化する（タータグリア（Tartaglia）ら、（1995）Cell 83：1263〜71）。レプ
チンは空腹および他の因子に影響を及ぼすことによって体重を調節すると考えら
れている。レプチン以外の化合物、例えば神経ペプチドY、メラノコルチン、CAR
T、およびオレキシンも同様に、空腹および満腹のような要因、脂肪の貯蔵、な
らびにエネルギーの産出に影響を及ぼすことによって、体重の調節に何らかの役
割を果たすと考えられる。
【０００２】発明の概要 本発明は、その発現がレプチンによって誘導される遺伝子６個の同定に少なく
とも一部基づいている。これらの遺伝子の２つ、LIG46とLIG56は新規遺伝子であ
る。遺伝子４個は既に同定されている。既に同定されている遺伝子は：T細胞特
異的GTP結合蛋白質をコードするTgtp；インターフェロン（IFN）誘導型蛋白質を
コードするLRG-47；20S脳プロテアソームのサブユニットをコードするRC10-II；
およびレチン酸誘導型蛋白質をコードするStra13である。
【０００３】 本発明のレプチン誘導型遺伝子６個およびそれらがコードする蛋白質は、体重
を調節するために用いられる治療物質を開発するための標的となる。例えば、１
つまたは複数のレプチン誘導蛋白質の発現または活性を変化させる物質は、体重
を調節するために用いることができる。そのような物質は、レプチン誘導蛋白質
６個のうち１つまたは複数の発現または活性をモニターする細胞アッセイ法、イ
ンビトロまたはインビボアッセイ法を用いて同定することができる。レプチン誘
導蛋白質の１つに結合する物質を同定するためにデザインされたアッセイ法を用
いることによって、おそらく有用な治療物質も同定することができる。本発明の
レプチン誘導遺伝子およびそれらがコードする蛋白質は、治療的および診断的に
有用となると考えられる。
【０００４】LIG46 下記のマウスLIG46 cDNA（配列番号：１）は、アミノ酸397個の蛋白質（配列
番号：２）をコードする1191ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（配
列番号：１のヌクレオチド3〜1193位；配列番号：３）を有する。この蛋白質は
、アミノ酸約32個の推定シグナル配列（配列番号：２のアミノ酸１位からアミノ
酸約32位）、およびアミノ酸約365個の推定成熟蛋白質（配列番号：２のアミノ
酸約33位〜アミノ酸397位；配列番号：４）を含む。LIG46の細胞外ドメインは、
アミノ酸約33位からアミノ酸約302位に及ぶ。LIG46は推定される膜貫通ドメイン
を１つ有し、これは配列番号：２のアミノ酸約303位（細胞外末端）からアミノ
酸約320位（細胞内末端）に及ぶ。LIG46の細胞質ドメインは、アミノ酸約321位
からアミノ酸約397位に及ぶ。
【０００５】 下記のヒトLIG46 cDNA（配列番号： ）は、アミノ酸397個の蛋白質（配列番
号： ）をコードする1191ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有す
る。この蛋白質はアミノ酸約32個の推定シグナル配列（配列番号： のアミノ酸
１位からアミノ酸約32位）、およびアミノ酸約365個の推定成熟蛋白質（配列番
号： のアミノ酸約33位〜アミノ酸397位；配列番号： ）を含む。
【０００６】 LIG46蛋白質は、多くのガラクトシルトラスフェラーゼと何らかの配列類似性
を有する。ガラクトシルトランスフェラーゼは発達過程に関係している。さらに
、ガラクトシルトランスフェラーゼは、細胞表面受容体上の炭水化物レパートリ
ー（carbohydrate repertoire）を修飾して、受容体活性を活性化、阻害、また
はそうでなければ修飾することによって（例えば、リガンドに対する受容体の親
和性を変化させることによって）細胞間シグナル伝達において何らかの役割を有
する可能性がある。このように、LIG46は、体重の調節に関係する分子、例えば
レプチンによって媒介される細胞間シグナル伝達に影響を及ぼすことによって体
重の調節に何らかの役割を果たす可能性がある。
【０００７】 配列番号：２のLIG46ポリペプチド配列は、アミノ酸30〜33位、79〜82位、89
〜92位、127〜173位、および219〜222位で可能性があるN-グリコシル化部位；ア
ミノ酸54〜56位、202〜204位、221〜223位、323〜325位、および377〜379位で可
能性があるプロテインキナーゼCリン酸化部位；アミノ酸31〜34位、94〜97位、1
85〜188位、221〜224位、234〜237位、および368〜371位で可能性があるカゼイ
ンキナーゼIIリン酸化部位；アミノ酸115〜122位で可能性があるチロシンキナー
ゼリン酸化部位；ならびにアミノ酸３〜６位で可能性があるアミド生成部位を含
む。
【０００８】 一つの局面において、本発明は、LIG46蛋白質またはその生物学的に活性な部
分をコードする単離された核酸分子を提供すると共に、LIG46コード核酸分子を
検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして用いる
のに適した核酸分子を提供する。
【０００９】 本発明は、配列番号：１もしくは配列番号：３に示すヌクレオチド配列と少な
くとも45％（または55％、65％、75％、85％、95％、または98％）同一である核
酸分子、またはその相補体を提供する。
【００１０】 本発明は、配列番号：１もしくは配列番号：３に示すヌクレオチド配列のヌク
レオチド少なくとも300個（325、350、375、400、425、450、500、550、600、65
0、700、800、900、1000、1200、1300、もしくは1400個）の断片を含む核酸分子
、またはその相補体を提供する。
【００１１】 本発明はまた、配列番号：２または配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも
45％（または55％、65％、75％、85％、95％、または98％）同一であるアミノ酸
配列を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を特徴とする
。
【００１２】 好ましい態様では、LIG46核酸分子は、配列番号：1、または配列番号：3に記
載の塩基配列を有する。
【００１３】 また、配列番号：2または配列番号：4のアミノ酸配列を有するポリペプチドの
断片、配列番号：2または配列番号：4の少なくとも15（25、30、50、100、150、
300、又は390）の連続したアミノ酸を有する断片をコードする核酸分子も本発明
の範囲内である。
【００１４】 本発明はストリンジェントな条件下で、配列番号：1または配列番号：3を含む
核酸分子とハイブリダイズする、配列番号：2または配列番号：4のアミノ酸配列
を有するポリペプチドの天然型対立遺伝子変異体をコ−ドする核酸分子を含む。
【００１５】 配列番号：４（成熟マウスLIG46）のアミノ酸配列、または配列番号：２（未
成熟マウスLIG46）のアミノ酸配列と少なくとも約65％、好ましくは75％、85％
、95％、または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたLIG46蛋白質；
およびガラクトシルトランスフェラーゼと相同性を有するLIG46の部分と少なく
とも約85％、95％、または98％同一であるアミノ酸配列を有する単離されたLIG4
6蛋白質（例えば、配列番号：２のアミノ酸192〜353、142〜184、201〜296、289
〜347、140〜183、367〜391、177〜266、299〜343、もしくは140〜184位）また
は神経原性の分泌されるシグナル伝達蛋白質（例えば、配列番号：２のアミノ酸
200〜291、270〜354、144〜183、380〜394、または211〜248位）も同様に本発明
に含まれる。
【００１６】 配列番号：3と少なくとも約65％、好ましくは75％、85％、または95％の同一
性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子にコードされる単離LIG46蛋白質
；およびストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：3と
相補的な塩基配列を有する核酸分子とハイブリダイズする塩基配列を有する核酸
分子にコードされる単離LIG46蛋白質も本発明の範囲内である。
【００１７】 ストリンジェントな条件下で、配列番号：1、または配列番号：3と相補性を有
する核酸分子とハイブリダイズする核酸分子にコードされるポリペプチドで、配
列番号：2または配列番号：4のアミノ酸配列を有するポリペプチドの天然型対立
遺伝子変異体である、ポリペプチドも本発明の範囲内である。
【００１８】 本発明の別の態様において、他のガラクトシルトランスフェラーゼをコードす
る核酸分子に対してLIG46核酸分子（例えば、ヒトLIG46をコードする核酸配列）
を特異的に検出するLIG46核酸分子を提供する。例えば、ある態様において、LIG
46核酸分子は、配列番号：1、配列番号：3、又はそれらに相補的な配列を含む核
酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、無関係のガラクト
シルトランスフェラーゼにはハイブリダイズしない。また別の態様では、LIG46
核酸分子は、少なくとも300（325、350、375、400、425、450、500、550、600、
650、700、800、900、1000、または1200）ヌクレオチド長であり、且つ配列番号
：1、配列番号：3に示す塩基配列もしくはそれらに相補的な配列を有する核酸分
子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００１９】 本発明の別の局面は、本発明のLIG46核酸分子を含む、例えば組換え発現ベク
ター等のベクターを提供する。また別の態様では、本発明はこのようなベクター
を含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、LIG46蛋白質を産生するように、組
換え発現ベクターを含む本発明の宿主細胞を適切な培地で培養することにより、
LIG46蛋白質を生産する方法を提供する。
【００２０】 本発明の別の局面は単離された又は組換えLIG46蛋白質及びポリペプチドを提
供する。好ましいLIG46蛋白質及びポリペプチドは、天然型LIG46が保持する、少
なくとも一つの生物学的活性を保持し（例えば、ガラクトシルトランスフェラー
ゼとしての作用能力）、かつレプチンによって誘導される。
【００２１】 本発明のLIG46蛋白質、又はそれらの生物学的活性部位を非LIG46ポリペプチド
（例えば、非相同アミノ酸配列）と機能的に結合させ、LIG46融合蛋白質を形成
することができる。さらに本発明は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗
体のような、LIG46蛋白質に特異的に結合する抗体を特徴とする。さらに、LIG46
蛋白質又はそれらの生物学的活性部位は、薬学的組成物に組み込むことができ、
該薬学的組成物は薬学的に許容される担体を任意に含む。
【００２２】 別の局面では、本発明は、LIG46活性の指標の検出が可能な薬剤に生物検体を
接触させて生物検体内のLIG46の活性の存在を検出することによる、生物検体内
のLIG46の活性又は発現の存在を検出する方法を提供する。
【００２３】 別の局面では本発明は、細胞におけるLIG46の活性又は発現が改変されるよう
に、LIG46の活性又は発現を調節（抑制または刺激）する薬剤と細胞とを接触さ
せる段階を含む、LIG46の活性を調節する方法を提供する。ひとつの態様では、
薬剤はLIG46蛋白質に特異的に結合する抗体である。別の態様で薬剤は、LIG46遺
伝子の転写、LIG46 mRNAのスプライシング、又はLIG46 mRNAの翻訳を調節するこ
とにより、LIG46の発現を調節する。また別の態様では、薬剤は、LIG46 mRNAま
たはLIG46遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスである塩基配列を有する核酸
分子である。
【００２４】 一つの態様では、本発明の方法を用いて、LIG46モデュレーターである薬剤を
被験者に投与することにより、望ましくないレベルのLIG46蛋白質もしくは核酸
発現または活性を特徴とする疾患を有する被験者を治療する。一つの態様ではLI
G46モデュレーターはLIG46蛋白質である。また別の態様では、LIG46モデュレー
ターはLIG46核酸分子である。別の態様では、LIG46モデュレーターは、ペプチド
、ペプチド模倣体、または他の小分子である。好ましい態様では、疾患は、肥満
症または悪液質である。
【００２５】 肥満を治療する場合、LIG46の発現または活性を減少させる物質（LIG46拮抗剤
）を投与することが望ましい。そのような物質はレプチンと共に投与することが
できる。好ましくは、投与するレプチンの量は、任意の内因性レプチンと共に、
治療する被験者をLIG46拮抗剤の作用に対して感受性にするために十分である。
【００２６】 低体重を治療する場合、LIG46活性の発現を増加させる物質（LIG46アゴニスト
）を投与することが望ましい。
【００２７】 本発明は又、（i）LIG46蛋白質をコードする遺伝子の異常な修飾又は突然変異
、（ii）LIG46蛋白質をコードする遺伝子の誤制御、及び（iii）LIG46蛋白質の
異常な翻訳後修飾の少なくとも一つを特徴とする遺伝子の損傷または突然変異の
有無を同定する診断アッセイ法であって、該遺伝子の野生型がLIG46活性を有す
る蛋白質をコードする、診断アッセイ法を提供する。
【００２８】 別の局面では、本発明はLIG46蛋白質に結合する又はLIG46蛋白質の活性を変化
させる化合物を同定する方法を提供する。一般的には、このような方法は試験化
合物の存在下、又は非存在下でのLIG46蛋白質の生物活性の測定、及びLIG46蛋白
質の活性を変化させるこれらの化合物の同定を伴う。
【００２９】 本発明はまた、化合物の存在下、又は非存在下でのLIG46の発現を測定するこ
とにより、LIG46の発現を調節する化合物を同定する方法を特徴とする。
【００３０】LIG56 下記のマウスLIG56 cDNA（配列番号：５）は、アミノ酸400個の蛋白質（配列
番号：６）をコードする1200ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（配
列番号：５のヌクレオチド１〜1200位；配列番号：７）を有する。
【００３１】 配列番号：６のLIG56ポリペプチド配列は、アミノ酸252〜255位で可能性があ
るN-グリコシル化部位；アミノ酸67〜69、75〜77、203〜205、218〜220、295〜2
97、および299〜301位で可能性があるプロテインキナーゼCリン酸化部位；アミ
ノ酸126〜129、170〜173、203〜206、256〜259、291〜294、341〜344、および34
5〜349位で可能性があるカゼインキナーゼIIリン酸化部位；アミノ酸233〜241位
で可能性があるチロシンキナーゼリン酸化部位；アミノ酸66〜71、85〜90、116
〜121、および308〜313位で可能性があるN-ミリストイル化部位；ならびにアミ
ノ酸63〜70位で可能性があるアミド生成部位を含む。
【００３２】 LIG56は、GTP結合蛋白質であってもよい。LIG56蛋白質の一部は、１つまたは
複数のマウスGTP結合蛋白質（ジェンバンク受入番号：L38444；U15636；M63630
；U19119；およびU53219）と類似である。
【００３３】 LIG56蛋白質は、GTP結合蛋白質様ドメイン（配列番号：６のアミノ酸12〜283
位）およびLRG-47様ドメイン（配列番号：６のアミノ酸24〜177位）を有する。
【００３４】 一つの局面において、本発明は、LIG56蛋白質または生物学的活性なその部分
をコードする単離された核酸分子を提供すると共に、LIG56コード核酸を検出す
るためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして適している核
酸断片を提供する。
【００３５】 本発明は、配列番号：５または配列番号：７に示すヌクレオチド配列と少なく
とも45％（または55％、65％、75％、85％、95％、または98％）同一である核酸
分子、またはその相補体を提供する。
【００３６】 本発明は、配列番号：５、もしくは配列番号：７に示すヌクレオチド配列の少
なくとも100（200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800
、900、1000、1100、または1200）ヌクレオチドの断片を含む核酸分子、または
その相補体を提供する。
【００３７】 本発明はまた、配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも45％（または55％、
65％、75％、85％、95％、または98％）同一であるアミノ酸配列を有する蛋白質
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を特徴とする。
【００３８】 好ましい態様では、LIG56核酸分子は、配列番号：5または配列番号：7に記載
の塩基配列を有する。
【００３９】 また、配列番号：6のアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片、配列番号：6
の少なくとも15（25、30、50、100、150、300、または400）の連続したアミノ酸
を有する断片をコードする核酸分子も本発明の範囲内である。
【００４０】 本発明はストリンジェントな条件下で、配列番号：5または配列番号：7と相補
性を有する配列を有する核酸分子とハイブリダイズする、配列番号：6のアミノ
酸配列を含むポリペプチドの天然型対立遺伝子変異体をコ−ドする核酸分子を含
む。
【００４１】 配列番号：6のアミノ酸配列と、同一性が、少なくとも約65％、好ましくは75
％、85％、95％、または98％であるアミノ酸配列を有する、単離LIG56蛋白質も
本発明の範囲内である。
【００４２】 配列番号：7と少なくとも約65％、好ましくは75％、85％、または95％の同一
性を有する塩基配列を有する核酸分子にコードされる単離LIG56蛋白質；および
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：7の塩基配列
を有する核酸分子とハイブリダイズする塩基配列を有する核酸分子にコードされ
る単離LIG56蛋白質も本発明の範囲内である。
【００４３】 ストリンジェントな条件下で、配列番号：5または配列番号：7を含む核酸分子
とハイブリダイズする核酸分子にコードされるポリペプチドで、配列番号：6の
アミノ酸配列を有するポリペプチドの天然型対立遺伝子変異体である、ポリペプ
チドも本発明の範囲内である。
【００４４】 本発明の別の態様は、GTP結合蛋白質と相同性を有する配列を有する無関係の
核酸分子をコードする核酸分子に対するLIG56核酸分子（例えば、ヒトLIG56）を
特異的に検出するLIG56核酸分子を提供する。例えば、ある態様において、LIG56
核酸分子は、配列番号：5もしくは配列番号：7の塩基配列、又はそれらに相補的
な配列を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。また
別の態様では、LIG56核酸分子は、少なくとも300（325、350、375、400、425、4
50、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、または1200）ヌクレオ
チド長であり、且つ配列番号：5もしくは配列番号：7に示す塩基配列、またはそ
れらに相補的な配列を有する核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズする。別の態様において、本発明は、LIG56核酸のコード鎖に対してアンチ
センスである単離核酸分子を提供する。
【００４５】 本発明の別の局面は、本発明のLIG56核酸分子を含む、例えば組換え発現ベク
ター等のベクターを提供する。また別の態様では、本発明はこのようなベクター
を含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、LIG56蛋白質を産生するように、組
換え発現ベクターを含む本発明の宿主細胞を適切な培地で培養することにより、
LIG56ポリペプチドを生産する方法を提供する。
【００４６】 本発明の別の局面は単離された又は組換えLIG56蛋白質及びポリペプチドを提
供する。好ましいLIG56蛋白質及びポリペプチドは、天然型LIG56が保持する、少
なくとも一つの生物活性を保持し、かつレプチンによって誘導される。
【００４７】 本発明のLIG56蛋白質、又はそれらの生物学的活性部位を非LIG56ポリペプチド
（例えば、非相同アミノ酸配列）に機能的に結合させ、LIG56融合蛋白質を形成
できる。さらに本発明は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のような
、LIG56蛋白質に特異的に結合する抗体を特徴とする。さらに、LIG56蛋白質又は
それらの生物学的活性部位は、薬学的組成物に組み込むことができ、該薬学的組
成物は薬学的に許容される担体を任意に含む。
【００４８】 別の局面では、本発明は、LIG56活性の指標を検出できる薬剤に生物検体を接
触させて生物検体内のLIG56の活性の存在を検出することによる、生物検体内のL
IG56の活性又は発現の存在を検出する方法を提供する。
【００４９】 別の局面では本発明は、細胞におけるLIG56の活性又は発現が改変されるよう
に、LIG56の活性又は発現を調節（抑制または刺激）する薬剤と細胞とを接触さ
せることを含む、LIG56の活性を調節する方法を提供する。ひとつの態様では、
薬剤はLIG56蛋白質に特異的に結合する抗体である。別の態様で薬剤は、LIG56遺
伝子の転写、LIG56 mRNAのスプライシング、又はLIG56 mRNAの翻訳を調節するこ
とにより、LIG56の発現を調節する。また別の態様では、薬剤は、LIG56 mRNAま
たはLIG56遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスである塩基配列を有する核酸
分子である。
【００５０】 一つの態様では、本発明の方法を用いて、LIG56モデュレーターである薬剤を
被験者に投与することにより、望ましくないレベルのLIG56蛋白質もしくは核酸
発現（例えば、体重性疾患）または活性を特徴とする疾患を有する被験者を治療
する。一つの態様ではLIG56のモデュレーターはLIG56蛋白質である。また別の態
様では、LIG56のモデュレーターはLIG56核酸分子である。別の態様では、LIG56
モデュレーターは、ペプチド、ペプチド模倣体、または他の小分子である。好ま
しい態様では、疾患は、肥満症または悪液質である。
【００５１】 本発明は又、（i）LIG56蛋白質をコードする遺伝子の異常な修飾又は突然変異
、（ii）LIG56蛋白質をコードする遺伝子の誤制御、及び（iii）LIG56蛋白質の
異常な翻訳後修飾の少なくとも一つを特徴とする遺伝子の損傷または突然変異の
有無を同定する診断アッセイ法であって、該遺伝子の野生型がLIG56活性を有す
る蛋白質をコードする、診断アッセイ法を提供する。
【００５２】 別の局面では、本発明はLIG56蛋白質に結合する又はLIG56蛋白質の活性を変化
させる化合物を同定する方法を提供する。一般的には、このような方法は試験化
合物の存在下、又は非存在下でのLIG56蛋白質の生物活性の測定、及びLIG56蛋白
質の活性を変化させるこれらの化合物の同定を伴う。
【００５３】 本発明はまた、化合物の存在下、又は非存在下でのLIG56の発現を測定するこ
とにより、LIG56の発現を変化させる化合物を同定する方法を特徴とする。
【００５４】Tgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13 Tgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13は既知の遺伝子である。しかし、これ
らの遺伝子のいずれもこれまでに体重の調節に関係していると思われなかった。
本発明は、これらの遺伝子のそれぞれの発現がレプチンによって誘導されるとい
う発見に一部基づいている。Tgtp、LRG-47、RC10-IIおよびStra13は、レプチン
によって誘導されるため、Tgtp、LRG-47、RC10-IIおよびStra13蛋白質ならびに
それらをコードする核酸分子は、体重障害の治療または予防のための治療的化合
物の開発において有用である。
【００５５】 Tgtp（ジェンバンク受入番号L38444）は、T細胞特異的グアニンヌクレオチド
三リン酸結合蛋白質（カーロウ（Carlow）ら、（1994）J. Immunol. 154：1724
〜34）をコードする。LRG-47（ジェンバンク受入番号U19119）は、LPS、IFN-γ
、およびIFN-α/βによって誘導され、GTPO結合蛋白質と何らかの相同性を有す
る蛋白質をコードする（ソレース（Sorace）ら、（1995）、J. Leukocyte Biol.
58：477〜84）。
【００５６】 LRG-47（ジェンバンク受入番号U19119）は、そのいずれもがIFN-γ誘導型遺伝
子であるIRG-47およびMg21と相同性を有する、LPS、IFN-γ、およびIFN-α/β誘
導型遺伝子である（ソレース（Sorace）ら、（1995）、J. Leukocyte Biol. 58
：477〜484）。LRG-47もまた、Tgtpと相同性を有し、GTP結合蛋白質であっても
よい（ソレース（Sorace）ら、上記）。
【００５７】 RC10-II（ジェンバンク受入番号D21800）は、ラット胚脳の20Sプロテアソーム
のRC10-IIサブユニットをコードする遺伝子である（ニシムラ（Nishimura）ら、
（1993）、FEBS Lett. 336：462〜66）。RC10-IIは、トリプシン活性の発現のた
めに必要なプロテアソームサブユニットであることが示唆されている（ニシムラ
（Nishimura）ら、上記）。
【００５８】 Stra13（ジェンバンク受入番号AF010305）は、塩基性ヘリックスループヘリッ
クス蛋白質をコードするレチン酸誘導型遺伝子である（ブージェラル（Boudjela
l）ら、（1997）Genes Dev. 11：2052〜65）。Stra13は、活性化された転写の抑
制物質として作用する可能性があり、ニューロンの分化において何らかの役割を
果たすと考えられている（ブージェラル（Boudjelal）ら、上記）。
【００５９】 本発明はTgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質に結合してその活性を
調節する化合物を同定する方法を提供する。一般的に、そのような方法は、試験
化合物の存在下または非存在下において、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStr
a13蛋白質の生物活性を測定すること、およびTgtp、LRG-47、RC10-II、もしくは
Stra13蛋白質に結合する、またはその活性を変化させる化合物を同定することを
必要とする。
【００６０】 本発明はまた、化合物の存在下および非存在下においてTgtp、LRG-47、RC10-I
I、またはStra13の発現を測定することによって、Tgtp、LRG-47、RC10-II、また
はStra13の発現を調節する化合物を同定する方法を特徴とする。
【００６１】 したがって、細胞におけるTgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の活性又
は発現が改変されるように、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の活性又
は発現を調節（抑制または刺激）する薬剤と細胞とを接触させることを含む、Tg
tp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の活性を調節する方法を提供する。ひと
つの態様では、薬剤はTgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質に特異的に
結合する抗体である。別の態様で薬剤は、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStr
a13遺伝子の転写、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13 mRNAのスプライシ
ング、又はTgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13 mRNAの翻訳を調節すること
により、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の発現を調節する。また別の
態様では、薬剤は、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13 mRNAまたはTgtp、
LRG-47、RC10-II、もしくはStra13遺伝子のコード鎖に対してアンチセンスであ
る塩基配列を有する核酸分子である。
【００６２】 一つの態様では、本発明の方法を用いて、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはS
tra13モデュレーターである薬剤を被験者に投与することにより、Tgtp、LRG-47
、RC10-II、もしくはStra13蛋白質もしくは核酸発現、または活性によって影響
を受ける疾患を有する被験者を治療する。一つの態様ではTgtp、LRG-47、RC10-I
I、もしくはStra13モデュレーターは、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13
蛋白質である。また別の態様では、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13モ
デュレーターは、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13核酸分子である。別
の態様では、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13モデュレーターは、ペプ
チド、ペプチド模倣体、または他の小分子である。好ましい態様では、疾患は、
肥満症または悪液質である。
【００６３】 本発明は又、（i）Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13蛋白質をコードす
る遺伝子の異常な修飾又は突然変異（部分的または完全な欠失または増幅を含む
）と、（ii）Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13蛋白質をコードする遺伝
子の誤制御と、（iii）Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13蛋白質の異常な
翻訳後修飾との少なくとも一つを特徴とする遺伝子の損傷または突然変異の有無
を同定する診断アッセイ法であって、該遺伝子の野生型が、体重性疾患（body w
eight disorder）によって特徴づけられる疾患のような、Tgtp、LRG-47、RC10-I
I、もしくはStra13活性を有する蛋白質をコードする、診断アッセイ法を提供す
る。
【００６４】 もう一つの局面において、本発明は、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13
活性の有無が生体試料において検出されるように、Tgtp、LRG-47、RC10-II、ま
たはStra13活性の指標物質を検出することができる物質に、該生体試料を接触さ
せることによって、生体試料におけるTgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13の
活性または発現の有無を検出する方法を提供する。
【００６５】 本発明のその他の特徴および利点は以下の詳細な説明および特許請求の範囲か
ら明らかとなると思われる。発明の詳細な説明 本発明は、その発現がレプチンによって誘導される遺伝子６個が同定されたこ
とに一部基づいている。これらの遺伝子のうちの４つ、Tgtp、LRG-47、RC10-II
、およびStra13は既知の遺伝子である。これらの遺伝子のうちの２つ、LIG46お
よびLIG56は新規である。
【００６６】 マウスLIG46蛋白質をコードするヌクレオチド配列を図１に示す（配列番号：
１；配列番号：３はオープンリーディングフレームのみを含む）。LIG46蛋白質
の推定アミノ酸配列も同様に、図１に示す（配列番号：２）。
【００６７】 図１のマウスLIG46 cDNA（配列番号：１）はアミノ酸397個の蛋白質をコード
する。
【００６８】 マウスLIG46は、特定の保存された構造および機能的特徴を有する分子のファ
ミリー（「LIG46ファミリー」）の１つのメンバーである。本発明の蛋白質およ
び核酸分子を指す場合の「ファミリー」という用語は、共通の構造ドメインを有
し、本明細書に定義するような十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性を
有する、２つまたはそれ以上の蛋白質または核酸分子を意味すると解釈される。
そのようなファミリーメンバーは、天然に存在しうる、および同じまたは異なる
種に由来しうる。例えば、ファミリーはマウス起源の第一の蛋白質およびヒト起
源のその蛋白質の相同体と共に、ヒト起源の第二の異なる蛋白質とその蛋白質の
マウス相同体を含みうる。ファミリーメンバーは、共通の機能的特徴を有しても
よい。
【００６９】 マウスLIG56蛋白質をコードするヌクレオチド配列を図４に示す（配列番号：
５；配列番号：７はオープンリーディングフレームのみを含む）。LIG46蛋白質
の推定アミノ酸配列もまた、図４に示す（配列番号：６）。
【００７０】 図４のマウスLIG56 cDNA（配列番号：５）は、アミノ酸400個の蛋白質をコー
ドする。
【００７１】 マウスLIG56は、特定の保存された構造および機能的特徴を有する分子のファ
ミリー（「LIG56ファミリー」）の１つのメンバーである。本発明の蛋白質およ
び核酸分子を指す場合の「ファミリー」という用語は、共通の構造ドメインを有
し、本明細書に定義するような十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性を
有する２つまたはそれ以上の蛋白質または核酸分子を意味すると解釈される。そ
のようなファミリーメンバーは、天然に存在しうる、および同じまたは異なる種
に由来しうる。例えば、ファミリーはマウス起源の第一の蛋白質およびヒト起源
のその蛋白質の相同体と共に、ヒト起源の第二の異なる蛋白質とその蛋白質のマ
ウス相同体を含みうる。ファミリーメンバーは、共通の機能的特徴を有してもよ
い。
【００７２】 Tgtp（ジェンバンク受入番号L38444）は、T細胞特異的グアニンヌクレオチド
三リン酸結合蛋白質をコードする（カーロウ（Carlow）ら、（1994）J. Immunol
. 154：1724〜34）。LRG-47（ジェンバンク受入番号U19119）はLPS、IFN-γ、お
よびIFN-α/βによって誘導され、GTP結合蛋白質と何らかの相同性を有する蛋白
質をコードする（ソレース（Sorace）ら、（1995）J. Leukocyte Biol. 58：477
〜84）。
【００７３】 LRG-47（ジェンバンク受入番号U19119）は、いずれもIFN-γ誘導型遺伝子であ
るIRG-47およびMg21と相同性を有するLPS、IFN-γ、およびIFN-α/β誘導型遺伝
子である（ソレース（Sorace）ら、（1995）J. Leukocyte Biol. 58：477〜484
）。LRG-47はまたTgtpとも相同性を有し、GTP結合蛋白質であってもよい（ソレ
ース（Sorace）ら、上記）。
【００７４】 RC10-II（ジェンバンク受入番号D21800）は、ラット胚脳の20Sプロテアソーム
のRC10-IIサブユニットをコードする遺伝子である（ニシムラ（Nishimura）ら、
（1993）FEBS Lett. 336：462〜66）。RC10-IIは、トリプシン活性の発現に必要
なプロテアソームサブユニットであることが示唆されている（ニシムラ（Nishim
ura）ら、上記）。
【００７５】 Stra13（ジェンバンク受入番号AF010305）は、塩基性ヘリックス-ループ-ヘリ
ックス蛋白質をコードするレチン酸誘導型遺伝子である（ブージェラル（Boudje
lal）ら、（1997）Genes Dev. 11：2052〜65）。Stra13は、活性化された転写の
リプレッサーとして作用する可能性があり、神経の分化において何らかの役割を
有すると考えられている（ブージェラル（Boudjelal）ら、上記）。
【００７６】 本発明の様々な局面を以下の章でさらに詳しく説明する。
【００７７】I. 単離核酸分子 本発明の一つの局面は、LIG46またはLIG56蛋白質、またはそれらの生物学的活
性部分をコードする単離核酸分子、及びLIG46またはLIG56をコードする核酸分子
（例えば、ヒトLIG46またはヒトLIG56）を同定するためのハイブリダイゼーショ
ンのプローブとして使用することが可能な核酸分子、ならびにLIG46またはLIG56
の核酸分子を増幅または変異させるためにPCRプライマーとして使用するための
断片に関する。本明細書で使用されるように、「核酸分子」という用語はDNA分
子（例えばcDNAやゲノムDNA）、RNA分子（例えばmRNA）、及び核酸類似体を用い
て作製されたDNAまたはRNAの類似体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖で
も二本鎖でよいが好ましくは二本鎖DNAである。
【００７８】 この章では、様々なLIG46およびLIG56核酸分子について記述する。当然のこと
ながら、Tgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13の全てまたは一部をコードする
単離された核酸分子は、本発明の方法、例えば体重障害を調節する化合物を同定
する方法において有用である。このように、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStr
a13の全てまたは一部をコードする配列を含む核酸分子（またはTgtp、LRG-47、R
C10-II、またはStra13の調節領域の全てまたは一部を含む核酸分子）は、スクリ
ーニングアッセイ法において用いることができる組換え型細胞を作製するために
用いることができる。さらに、Tgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13をコード
する核酸分子を用いて、Tgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13の１つまたは複
数を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製することができる。そのよう
なトランスジェニックマウスは、体重調節におけるこれらの遺伝子の役割を解明
する上で有用である。このように、この章において記載した方法を用いて、Tgtp
、LRG-47、RC10-II、およびStra13核酸分子と共に、Tgtp、LRG-47、RC10-II、お
よびStra13のヒト相同体を調製して操作することができる。
【００７９】 「単離された」核酸分子は核酸の天然の発生源に存在する別の核酸分子から分
離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸（好ましくは蛋白質をコ
ードする配列）は、核酸が由来する生物のゲノムDNA内で該核酸に自然に隣接す
る配列（例えば核酸の5'及び3'末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々
な態様では、単離されたLIG46核酸分子または単離されたLIG56核酸分子は、核酸
が由来する細胞のゲノムDNA内で核酸分子に自然に隣接する約5kb、4kb、3kb、2k
b、1kb、0.5kb、又は0.1kbより短い塩基配列を含むことができる。さらに、cDNA
分子のような「単離された」核酸分子は、実質的に細胞材料を、あるいは組換え
技術により作製された場合は他の培地材料を、または、化学的に合成された場合
には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００８０】 例えば配列番号：１、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7、またはこれ
らの任意の核酸配列の相補配列を有する核酸分子のような本発明の核酸分子は、
分子生物学の常法および本明細書で提供される配列情報を用いて単離することが
できる。配列番号：１もしくは配列番号：3の核酸配列の全てもしくは一部、ま
たは配列番号：5もしくは配列番号：7の核酸配列の全てもしくは一部を、ハイブ
リダイゼーション用プローブとして使用し、ハイブリダイゼーション及びクロー
ニングの常法（例えば、Sambrookら編集、「分子クローニング；実験マニュアル
（Molecular Cloning; A Laboratory Manual）」、 第二版、Cold Spring Harbo
r Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N
Y、1989に記載のように）を用いて、LIG46およびLIG56核酸分子を単離すること
ができる。
【００８１】 本発明の核酸を、PCR増幅技術の常法に従い、鋳型としてcDNA、mRNA、もしく
はゲノムDNAを、また適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅する
ことができる。増幅した核酸は適切なベクターにクローニングし、DNA配列分析
により解析できる。さらにLIG46またはLIG56の塩基配列に対応するオリゴヌクレ
オチドは、例えば自動DNA合成機を用いるなどして、標準的合成方法により作製
できる。
【００８２】 本発明の単離核酸分子は、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、もしく
は配列番号：7に示す塩基配列の相補配列、またはそれらの一部である核酸分子
を有する。任意の塩基配列に相補的な核酸分子は、任意の塩基配列にハイブリダ
イズできるに十分に任意の核酸配列に相補的で、ハイブリダイズして安定な二本
鎖を形成する分子である。
【００８３】 さらに、本発明の核酸分子は、LIG46またはLIG56をコードする核酸配列の一部
だけを有することもでき、例えば、プローブもしくはプライマーとして利用でき
る断片、またはLIG46もしくはLIG56の生物学的活性部位をコードする断片を有す
ることもできる。マウスLIG46遺伝子およびマウスLIG56遺伝子のクローニングか
ら決定された塩基配列を使用して、例えば、別の組織のような別の細胞のタイプ
でのLIG46相同体もしくはLIG56相同体、ならびに例えばヒトのような他の哺乳動
物からのLIG46相同体およびLIG56相同体の同定、及び／またはクローニングに使
用するために設計されたプローブ及びプライマーを作成できる。該プローブ／プ
ライマーは典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを有する。オリゴ
ヌクレオチドは典型的には、配列番号：１もしくは配列番号：3のセンスもしく
はアンチセンス配列、または配列番号：１もしくは配列番号：3の天然に生じる
変異配列、または配列番号：5もしくは配列番号：7のセンスもしくはアンチセン
ス配列、または配列番号：5もしくは配列番号：7の天然に生じる変異配列の少な
くとも約12個、好ましくは約25個、より好ましくは約50、75、100、125、150、1
75、200、250、300、350または400の連続したヌクレオチドと、ストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズする塩基配列の領域を有する。
【００８４】 LIG46またはLIG56塩基配列に基づくプローブは、同一のまたは関連する蛋白質
（例えば、ヒト相同体）をコードする転写産物またはゲノム配列を検出するため
に使用できる。該プローブは例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または
酵素補因子のような、それに結合する標識基を有する。このようなプローブは、
LIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質を誤発現する細胞、または組織の同定のための
診断試験キットの一部として、例えば被験体からの細胞の検体内のLIG46またはL
IG56コード核酸のレベルを、例えば、LIG46もしくはLIG56のmRNAのレベルを検出
する、またはゲノムLIG46遺伝子もしくはゲノムLIG56遺伝子が突然変異もしくは
欠失を起こしているかどうかを決定するなどして測定することにより使用するこ
とができる。
【００８５】 「LIG46の生物学的活性部位」をコードする核酸断片は、LIG46の生物学的活性
を有するポリペプチドをコードする配列番号：１もしくは配列番号：3の一部を
単離し、LIG46のコードされた部分を発現（例えばインビトロでの組換え発現に
より）し、LIG46のコードされた部分の活性を測定することにより調製できる。
例えば、LIG46の生物学的活性部位をコードする核酸断片は、例えば、配列番号
： のようなガラクトシルトランスフェラーゼ様ドメインを含む。
【００８６】 本発明はさらに、遺伝コードの縮重により、配列番号：1もしくは配列番号：3
の塩基配列とは異なり、従って配列番号：1もしくは配列番号：3に示す塩基配列
によりコードされる蛋白質と同じLIG46蛋白質をコードする核酸分子を有する。
配列番号：1および配列番号：3に示すLIG46塩基配列に加えて、LIG46のアミノ酸
配列内に変化を引き起こすDNA配列の多型が集団内に存在する可能性があること
を当業者は認識すると思われる。このようなLIG46遺伝子における遺伝子多型は
、天然型対立遺伝子変異体により一つの集団内の個々の間に存在する可能性があ
る。本明細書で使用されるように、「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語
は、LIG46蛋白質、好ましくは哺乳動物LIG46蛋白質をコードするオープンリーデ
ィングフレームを有する核酸分子を示す。このような天然型対立遺伝子変異体に
より、典型的にはLIG46遺伝子の塩基配列において1〜5％の変異が生じる。天然
型対立遺伝子変異体の結果であり、またLIG46の機能活性を変化させないLIG46内
のいくつかおよび全てのこのような核酸変異とその結果のアミノ酸多型は本発明
の範囲内であることが意図される。
【００８７】 「LIG56の生物学的活性部位」をコードする核酸断片は、LIG56の生物学的活性
を有するポリペプチドをコードする配列番号：5もしくは配列番号：7の一部を単
離し、LIG56蛋白質のコードされた部分を発現（例えばインビトロでの組換え発
現により）し、LIG56のコードされた部分の活性を測定することにより調製でき
る。例えば、LIG56の生物学的活性部位をコードする核酸断片は、例えば、配列
番号： のようなGTP結合蛋白質様ドメインを含む。
【００８８】 本発明はさらに、遺伝コードの縮重により、配列番号：5もしくは配列番号：7
の塩基配列とは異なり、従って配列番号：5もしくは配列番号：7に示す塩基配列
によりコードされる蛋白質と同じLIG56蛋白質をコードする核酸分子を有する。
配列番号：5および配列番号：7に示すマウスLIG56塩基配列に加えて、LIG56のア
ミノ酸配列内に変化を引き起こすDNA配列の多型が集団内に存在する可能性があ
ることを当業者は認識すると思われる。このようなLIG56遺伝子における遺伝子
多型は、天然型対立遺伝子変異体により一つの集団内の個々の間に存在する可能
性がある。本明細書で使用されるように、「遺伝子」及び「組換え遺伝子」とい
う用語は、LIG56蛋白質、好ましくは哺乳動物LIG56蛋白質をコードするオープン
リーディングフレームを有する核酸分子を示す。このような天然型対立遺伝子変
異体により、典型的にはLIG56遺伝子の塩基配列において1〜5％の変異が生じる
。天然型対立遺伝子変異体の結果であり、またLIG56の機能活性を変化させないL
IG56内のいくつかおよび全てのこのような核酸変異とその結果のアミノ酸多型は
本発明の範囲内であることが意図される。
【００８９】 さらに、他の種（LIG46相同体またはLIG56相同体）由来のLIG46蛋白質もしく
はLIG56蛋白質をコードする核酸分子は、マウス遺伝子の塩基配列とは異なった
塩基配列を有しており、本発明の範囲内であることが意図される。本発明のLIG4
6またはLIG56 cDNAの天然型対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子
は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイゼーシ
ョンの常法を用い、マウスcDNAまたはその一部をハイブリダイゼーション用プロ
ーブとして用いて、本明細書で開示されたLIG46またはLIG56核酸との同一性に基
づき単離することができる。例えば、可溶性LIG46 cDNAは、マウス膜結合型LIG4
6との同一性に基づいて単離することができる。同様に、膜結合型ヒトLIG56のcD
NAは、LIG56との同一性に基づいて単離することができる。
【００９０】 したがって、また別の態様では、本発明の単離核酸分子は少なくとも300（325
、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、また
は1200）ヌクレオチド長であり、配列番号:1もしくは配列番号：3、または配列
番号：5もしくは配列番号：7における塩基配列、好ましくはコード配列を有する
核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。本明細書で用いら
れるように「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、
少なくとも60％（65％、70％、好ましくは75％）互いに同一な塩基配列が典型的
には互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーション条件及び洗
浄条件を示すことを意味する。このようなストリンジェント条件は当業者に公知
であり、「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular B
iology）」, John Wiley & Sons, N. Y. （1989）の6.3.1-6.3.6において見いだ
せる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例
としては、約45℃での6X塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）でのハイ
ブダイゼーション、50〜65℃での、一回または複数回の0.2X SSC及び0.1％SDSで
の洗浄がある。好ましくは配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、もしくは
配列番号：7の配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の
単離された核酸分子は、天然型核酸分子に対応する。本明細書で使用されるよう
に、「天然型」核酸分子とは、自然に発生する塩基配列を有するRNAまたはDNA分
子（例えば天然型蛋白質をコードする）を意味する。
【００９１】 集団において存在する可能性のあるLIG46配列またはLIG56配列の天然型対立遺
伝子変異体に加えて、本明細書に開示された塩基配列へ突然変異により変異を導
入し、それによりコードされたLIG46蛋白質またはLIG56蛋白質のアミノ酸配列を
、LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質の機能に変化を及ぼすことなく、変化させられ
ることを当業者はさらに認識すると思われる。例えば、「非必須」アミノ酸残基
でのアミノ酸の置換につながるヌクレオチドの置換を行うことができる。「非必
須」アミノ酸残基とは、生物活性の変化を伴わず、LIG46またはLIG56から変化さ
せることができる残基で、一方、「必須」アミノ酸残基は生物活性に不可欠であ
る。例えば、 LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質の様々な種間で保存されるアミノ
酸残基は、とりわけ変化に従わないことが予測される。
【００９２】 例えば、本発明の好ましいLIG46蛋白質は、ガラクトシルトランスフェラーゼ
間で保存されたアミノ酸を有する。このような保存されたドメインは突然変異に
従いにくい。しかしながら他のアミノ酸残基は（例えば様々な種のLIG46もしく
はLIG56間で保存されていない、または半保存されたアミノ酸残基）は、活性に
不可欠ではないかもしれず、従って変化に依存しやすい。
【００９３】 したがって、本発明の別の局面は、活性に必須でないアミノ酸残基内の変化を
含むLIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質をコードする核酸分子に関する。このよう
なLIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質は、アミノ酸配列が本明細書に開示されたア
ミノ酸配列とは異なるが、依然として生物活性を保持している。別の態様におい
ては、単離核酸分子は、配列番号：2もしくは配列番号：6のアミノ酸配列と少な
くとも約45％同一な、または65％、75％、85％、95％もしくは98％同一なアミ酸
配列を有する蛋白質をコードする塩基配列を含む。
【００９４】 本明細書に開示された配列とは異なる配列を有するLIG46蛋白質もしくはLIG56
蛋白質をコ−ドする単離核酸分子は、本明細書に開示された塩基配列への一つま
たは複数の塩基の置換、付加、又は欠失を導入することにより作製され、従って
一つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、又は欠失がコードされた蛋白質が作製
される。突然変異は、部位特異的変異誘発やPCR媒介性変異誘発のような常法に
より導入できる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、一つまたは複数の推定非
必須アミノ酸残基でおこる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似
の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するのア
ミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーは
塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアス
パラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン
、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非電極側鎖（例
えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン
、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イ
ソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプト
ファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従ってLIG46もしくはLIG56内の
推定される非必須アミノ酸は好ましくは同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基
と置換される。また、例えば飽和変異誘発などを用いてLIG46もしくはLIG56をコ
−ドする配列の全てまたは一部にランダムに突然変異を導入でき、得られた突然
変異体でLIG46もしくはLIG56の生物活性を選抜し、活性を保持する変異体を特定
することができる。変異誘発後、コードされた蛋白質を組換えて発現させ、蛋白
質の活性を測定できる。
【００９５】 本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、例えば二本鎖cDNA分子のコード
鎖に相補的、あるいは、mRNA配列に相補的などの、蛋白質をコードするセンス核
酸に相補的な分子を含む。アンチセンス核酸はセンス核酸と水素結合する。アン
チセンス核酸は、例えば蛋白質をコードする領域（またはオープンリーディング
フレーム）の全て、または一部のように、LIG46もしくはLIG56の全コード鎖に相
補的または、それらの一部とのみ相補的であることができる。アンチセンス核酸
分子はLIG46もしくはLIG56をコードする塩基配列のコード鎖の非コーディング領
域にアンチセンスであることもできる。非コーディング領域（「5'及び3'非翻訳
領域」）はコーディング領域に隣接するが、アミノ酸へは翻訳されない5'及び3'
配列である。
【００９６】 本明細書で開示されたLIG46もしくはLIG56をコードするコード鎖配列（例えば
配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、および配列番号：7）が得られれば、
本発明のアンチセンス核酸をワトソンとクリックの塩基対の法則にしたがって設
計することができる。アンチセンス核酸分子はLIG46 mRNAもしくはLIG56 mRNAの
全コーディング領域と相補的であることができるが、しかしより好ましくは、LI
G46 mRNAもしくはLIG56 mRNAのコーディング領域または非コーディング領域の一
部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンス
オリゴヌクレオチドは、LIG46 mRNAもしくはLIG56 mRNAの翻訳開始部位の周辺領
域と相補的であることもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは例えば約5
、10、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチドの長さである。本発明
のアンチセンス核酸は当技術分野で周知の方法を用いた化学合成及び酵素連結反
応を用いて構築できる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド）は、自然発生する塩基、または該分子の生物学的安定を促進する
ため、またはアンチセンス及びセンス核酸間に形成された二本鎖の安定を促進す
るために設計された様々な修飾塩基を用いて化学的に合成でき、例えばホスホロ
チオエート誘導体やアクリジン置換塩基を用いることができる。アンチセンス核
酸を作製するために使用できる修飾塩基の例には5-フルオロウラシル、5-ブロモ
ウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン
、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-カル
ボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチル
ウラシル、ジヒドウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペ
ンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニ
ン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシ
ン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メト
キシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカ
ルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニ
ルアデニン、ウラシル-5-オキシ酸酢（v）、ワイブトコシン、シュードウラシル
、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-
チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウ
ラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カ
ルボキシプロピル）ウラシル、（acp3）w、及び2,-6ジアミノプリンが含まれる
。また、核酸がアンチセンスの方向にサブクローニングされた発現ベクターを用
いて、アンチセンス核酸を生物学的に作成することができる（すなわち、次のサ
ブセクションで詳しく述べるように、挿入核酸から転写されたRNAは対象の標的
核酸に対してアンチセンス方向となる。）
【００９７】 本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的に、被験物に投与されるか、または
関心対象の蛋白質をコードする細胞mRNA及び／またはゲノムDNAにハイブリダイ
ズするまたは結合するようにインサイチューで作製され、例えば、転写または翻
訳を阻害するなどして、該蛋白質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは
従来のヌクレオチド相補性により行われ、安定な二本鎖を形成し、または、例え
ばDNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主グルーブ
内での特定の相互作用による。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例に
は、組織部位への直接注入が含まれる。また、アンチセンス核酸分子を修飾し、
選択した細胞を標的とし全身投与できる。例えば、全身投与の場合、例えば細胞
表面レセプターや抗原に結合するペプチドや抗体にアンチセンス核酸分子を結合
させるなどして、選択した細胞表面で発現するレセプターや抗体に特異的に結合
するようにアンチセンス核酸分子を修飾できる。アンチセンス核酸分子は、また
、ここで表記するベクターを用いて細胞に運搬できる。アンチセンス分子の十分
な細胞内濃度を得るために、アンチセンス核酸分子が強力なpol IIまたはpol II
Iプロモーターの制御下に置かれたベクターの構築物が好ましい。
【００９８】 本発明のアンチセンス核酸分子はまたαアノマー核酸分子であることもできる
。αアノマー核酸分子は相補的RNAとの特定の二本鎖ハイブリッドを形成し、そ
こでは通常のβユニットとは逆で、鎖がお互いに平行である（Gaultierら、1987
、Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまた2'-o-メ
チルリボヌクレオチド（井上ら、1987、Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）ま
たは、キメラRNA-DNA類似体（井上ら、1987、FEBS Lett. 215: 327-330）を含む
ことができる。
【００９９】 本発明はまたリボザイムを含む。リボザイムは、mRNAのような、相補的な領域
を有する一本鎖核酸を切断できるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子で
ある。従って、リボザイム（例えばHaselhoffとGerlach、1988、Nature 334: 58
5-591に示されるハンマーヘッドリボザイムなど）を利用して、触媒的にLIG46 m
RNAもしくはLIG56 mRNAの転写産物を切断し、LIG46 mRNAもしくはLIG56 mRNAの
翻訳を阻害することができる。LIG46もしくはLIG56をコードする核酸への特異性
を有するリボザイムを本明細書に開示するLIG46 cDNAもしくはLIG56 cDNAの核酸
配列に基づき設計することができる。例えばLIG46もしくはLIG56をコードするmR
NAにおいて、活性部位の塩基配列が切断される塩基配列と相補的であるテトラヒ
メナ（Tetrahymena）L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる。例えば、C
echら、米国特許第4,987,071号、Cechら、米国特許第5,116,742号を参照のこと
。または、LIG46 mRNAもしくはLIG56 mRNAを用い、RNA分子のプールから特異的
なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを選抜できる。例えばBartelとSzostak
、1993、Science 261: 1411-1418を参照のこと。
【０１００】 本発明はまた三重螺旋構造を形成する核酸分子を含む。例えば、LIG46もしく
はLIG56の調節領域（例えば、LIG46もしくはLIG56のプロモーター及び／または
エンハンサー）に相補的な塩基配列を標的として、標的細胞内のLIG46遺伝子も
しくはLIG56遺伝子の転写を阻害する三重螺旋構造を形成させ、LIG46遺伝子もし
くはLIG56遺伝子の発現を阻害することができる。一般的なものとして、Helene
、1991、Anticancer Drug Des. 6 (6): 569-84; Helene (1992)、Ann. N. Y. Ac
ad Sci. 660:27-36; 及びMaher、1992、Bioassays、 14 (12): 807-15を参照の
こと。
【０１０１】 好ましい態様においては、本発明の核酸分子は塩基部分、糖部分、またはリン
酸バックボーンで修飾でき、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、
あるいは溶解度を改変できる。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸バックボ
ーンを修飾し、ペプチド核酸を作製できる（Hyrupら、1996、Bioorganic & Mdei
cal Chemistry 4 (1): 5-23参照）。ここで使用される「ペプチド核酸」や「PNA
」という用語は、デオキシリボースリン酸バックボーンが擬似ペプチドバックボ
ーンに置換され、わずか4つの元来の核塩基のみが残っている、例えばDNA模倣物
などの、核酸模倣物を意味する。PNAの中性バックボーンは、低いイオン強度条
件下では、特異的なDNA及びRNAのハイブリダイゼーションを可能にすることが示
されている。Hyrupら（1996、上記）; Perry-O' Keefeら、1996、Proc Natl. Ac
ad. Sci. USA 93: 14670-675が示す固相ペプチド合成の常法により、PNAオリゴ
マーを合成できる。
【０１０２】 LIG46もしくはLIG56のPNAを治療及び診断へ応用することができる。例えば、P
NAをアンチセンスまたは抗原剤として用い、例えば転写の促進または翻訳停止ま
たは複製を阻害するなどして、遺伝子発現を配列特異的に修飾できる。LIG46も
しくはLIG56のPNAはまた、例えば、S1ヌクレアーゼ（Hyrup、1996、上記)等の他
の酵素と組み合わせて用いる場合には「人工制限酵素」として、またDNA配列決
定及びハイブリダイゼーションのためのプローブやプライマーとして、（Hyrup
ら、1996、上記; Perry-O' Keefeら、1996、Proc Natl. Acad. Sci. USA 93: 14
670-675）例えばPNS特異的PCRクランピングにより、遺伝子内の単一塩基対の突
然変異を分析することなどに利用できる。
【０１０３】 また別の態様に於いては、親油性または別のヘルパー基をPNAに付着させたり
、または、PNA-DNAのキメラを形成して、あるいは、当技術分野で既知のリポソ
ームや別の薬物運搬方法を用いて、LIG46 PNAもしくはLIG56 PNAを修飾して、例
えば、それらの安定性や細胞への取込みを向上させることができる。例えば、LI
G46またはLIG56のPNA-DNAキメラを作製し、PNAまたはDNAの有利な形質を組み合
わせることができる。このようなキメラを用い、PNA部分が高い結合親和性や特
異性を与える一方で、例えばRNAse HやDNAポリメラーゼ等のDNA制限酵素がDNA部
分に作用することができる。PNA-DNAのキメラは、塩基のスタッキングや、核塩
基間の結合数、方向（Hyrup、1996、上記）に基づき選択された適切な長さのリ
ンカーを用いて結合させることができる。Hyrup、1996、上記やFinnら、1996、N
ucleic Acids Research 24 (17): 3357-63に記載のようにして、PNA-DNAのキメ
ラを合成することができ、例えば、標準的なホスホルアミダイトカップリング化
学や修飾ヌクレオシド類似体、5'-4(-メトキシトリチル）アミノ-5'-デオキシ-
チミジンホスホルアミダイトを用いて固相支持体上に合成することができ、PNA
とDNAの5'末端との間で用いることができる（Magら、1989、Nucelic Acid Res.
17: 5973-88）。PNAモノマーをその後段階的にカップリングさせ、5' PNAセグメ
ント及び3' DNAセグメントを有するキメラ分子を作製できる（Finnら、1996、Nu
cleic Acid Res. 24 (17): 3357-63）。また、5' DNAセグメント及び3'PNAセグ
メントを有するキメラ分子を合成することもできる（Peterserら、1975、Bioorg
anic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124）。
【０１０４】 別の態様においては、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えばインビボで宿
主細胞レセプターを標的にするために）、または細胞膜間の輸送を容易にする薬
剤（例えばLetsinger ら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556;
Lemaitreら、1987、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652; 国際公開公報第
88/09810号参照）、もしくは血液−脳関門（例えば国際公開公報第89/10134号参
照）の輸送を容易にする薬剤等の他の付属基を含む。さらに、オリゴヌクレオチ
ドはハイブリダイゼーション刺激切断剤（例えばKrolら、1988、Bio/Techniques
6: 958-976参照）、または挿入剤（例えばZon、1988、Pharm. Res. 5: 539-549
参照）などで修飾できる。このために、オリゴヌクレオチドは、例えばペプチド
、ハイブリダイゼーション刺激クロスリンカー剤、輸送剤、ハイブリダイゼーシ
ョン刺激切断剤等の別の分子に接合させることも可能である。
【０１０５】II. 単離LIG46蛋白質、単離LIG56蛋白質、抗LIG46抗体、および抗LIG56抗体 本発明の一つの局面においては、単離LIG46蛋白質もしくは単離LIG56蛋白質、
それらの生物学的活性部位、及び抗LIG46抗体もしくは抗LIG56抗体を作製するた
めの免疫原としての使用に適したポリペプチドの断片を含む。一つの態様では、
天然型LIG46蛋白質もしくは天然型LIG56蛋白質は、蛋白質精製の常法により、適
切な精製の計画で細胞または組織源から単離できる。また別の態様では、LIG46
蛋白質もしくはLIG56蛋白質は、組換えDNA技術で製造することができる。組換え
発現の代わりに、LIG46もしくはLIG56蛋白質またはポリペプチドは、ペプチド合
成の常法により化学合成することができる。
【０１０６】 この章では、LIG46およびLIG56ポリペプチド、抗体、およびその用途について
述べる。しかし、Tgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13ポリペプチドならびに
抗体（およびその断片または変異体）は、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra1
3の全てまたは一部を含む融合蛋白質と同様に本方法において有用である。この
ように、この章において、LIG46およびLIG56ポリペプチドならびにその変異体の
生産および使用に関して記述した方法は、Tgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra1
3にも適用される。Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13に対する抗体は本発明
の方法において有用である。例えば、そのような抗体は、Tgtp、LRG-47、RC10-I
I、またはStra13の発現または活性を調節する物質を同定するようにデザインさ
れたスクリーニングアッセイ法において、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra1
3の発現を測定するために用いることができる。下記に示す抗LIG46および抗LIG5
6抗体を調製して特徴を調べるための記載の方法は、Tgtp、LRG-47、RC10-II、ま
たはStra13に対する抗体にも適用することができる。
【０１０７】 「単離された」または「精製された」蛋白質、またはそれらの生物学的活性部
位は、実質的に細胞材料または関心対象の蛋白質（例えば、LIG46またはLIG56）
に由来する細胞もしくは組織材料に汚染された蛋白質を含まず、または化学合成
された場合には、化学的前駆体もしくは別の化学物質を実質的に含まない。「実
質的に細胞材料を含まない」という用語は、蛋白質が、単離または組換えにより
作製された細胞の細胞構成物質から分離された調製品を含む。従って、細胞材料
を実質的に含まないLIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質には、非LIG46蛋白質もし
くは非LIG56蛋白質（本明細書ではまた「汚染蛋白質」とも称される）を約30％
、20％、10％、または5％未満有するLIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質の調製品
が含まれる。LIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質、またはそれらの生物学的活性部
位が組換えにより製造される場合、好ましくは培地を実質的に含まず、すなわち
培地は、蛋白質調製品の体積の約20％、10％、または5％未満である。LIG46蛋白
質もしくはLIG56蛋白質を化学合成する場合、好ましくは、化学的前駆体や別の
化学物質を含まず、すなわち、蛋白質の合成に関係した化学的前駆体や別の化学
物質から分離される。従って、このようなLIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質の調
製品は、約30％、20％、10％、5％（乾燥重量に基づく）未満の化学的前駆体ま
たは非LIG46化学物質もしくは非LIG56化学物質を含む。
【０１０８】 LIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質の生物学的活性部位には、LIG46蛋白質もし
くはLIG56蛋白質のアミノ酸配列と十分に同一な配列、またはLIG46蛋白質もしく
はLIG56蛋白質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するペプチドが含ま
れ、それらは、全長LIG46蛋白質もしくは全長LIG56蛋白質より少数のアミノ酸を
含み、かつLIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質の少なくとも一つの活性を示す。典
型的には生物学的活性部位は、LIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質の少なくとも一
つの活性を有するドメインまたはモチーフを有する。LIG46蛋白質もしくはLIG56
蛋白質の生物学的活性部位は、例えば、10、25、50、100またはそれ以上の長さ
のアミノ酸を有するポリペプチドである。好ましい生物学的活性ポリペプチドに
は、一つまたは複数の同定されたLIG46もしくはLIG56構造ドメインが含まれる。
【０１０９】 さらに、別の生物学的活性部位には、蛋白質の別の領域が欠失しているものが
あり、これらは組換え技術により調製することができ、天然型LIG46蛋白質もし
くは天然型LIG56蛋白質の一つまたは複数の機能活性を評価することができる。
【０１１０】 好ましいLIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質は、本明細書に開示されたアミノ酸
配列を有するか、またはこれらと実質的に同一である。他の好ましい蛋白質は、
天然型対立遺伝子変異体または変異誘発により、アミノ酸配列は異なっているも
のの、本明細書に開示された配列と実質的に同一であり、かつ蛋白質の機能活性
を保持している。
【０１１１】 したがって、有用なLIG46蛋白質は、配列番号：2（または、配列番号：4）に
記載のアミノ酸配列と少なくとも約45％、好ましくは55％、65％、75％、85％、
95％または99％同一なアミノ酸配列を含み、配列番号：2（または、配列番号：4
）のLIG46蛋白質の機能活性を保持している蛋白質である。その他の場合では、L
IG46蛋白質はガラクトシルトランスフェラーゼと相同性を有するLIG46の部分と5
5％、65％、75％、85％、95％、または98％同一であるアミノ酸配列を有する蛋
白質（例えば、配列番号：２のアミノ酸192〜353、142〜184、201〜296、289〜3
47、140〜183、367〜391、177〜266、299〜343、または140〜184位）、または神
経原性分泌シグナル伝達蛋白質（例えば、配列番号：２のアミノ酸200〜291、27
0〜354、144〜183、380〜394、または211〜248位）である。好ましい態様におい
て、LIG46蛋白質は配列番号：２（または配列番号：４）のLIG46蛋白質の機能的
活性を保持している。
【０１１２】 有用なLIG56蛋白質は配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも約45％、好ま
しくは55％、65％、75％、85％、95％、または99％同一であるアミノ酸配列を含
み、配列番号：６のLIG46蛋白質の機能的活性を保持している蛋白質である。
【０１１３】 二つのアミノ酸配列または核酸配列の同一性割合を決定するために、配列は最
適な比較を目的として整列化される（例えば、二番目のアミノ酸または核酸配列
との最適な整列のために、第一のアミノ酸または核酸配列にギャップが導入でき
る）。その後、対応するアミノ酸の位置、または塩基の位置でのアミノ酸残基ま
たは塩基を比較する。最初の配列のある位置が二番目の配列内の対応する位置と
同じアミノ酸残基または塩基で占められている場合、この位置での分子は同一と
なる。二つの配列間での同一性パーセントは同一な位置の数を配列で割った関数
である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数x100）。
【０１１４】 二つの配列間の相同性パーセントは数学的アルゴリズムを用いて決定できる。
二つの配列の比較に使用する数学的アルゴリズムの、好ましく且つ非限定的な例
として、KarlinとAltschul（1990、Proc Nat'lAcad Sci. USA 87: 2264-2268)の
アルゴリズムで、KarlinとAltschul（1993、Proc Nat'lAcad Sci. USA 90: 5873
-5877)によって改変されたものがあげられる。このようなアルゴリズムは、Alts
chulら（1990、J. Mol. Biol. 215: 403-410）のNBLAST及びXBLASTプログラムに
取り入れられた。BLAST塩基検索をスコアー＝100、単語数＝12でNBLASTのプログ
ラムで行い、本発明のLIG46核酸分子もしくはLIG56核酸分子と相同な塩基配列を
得ることができる。BLAST蛋白質検索は、スコアー＝50、単語数＝3でXBLASTプロ
グラムを用いて行われ、本発明のLIG46蛋白質分子もしくはLIG56蛋白質分子と相
同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップのある配列を得る
ために、Altschulら（1997、Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402）に記載のよう
に、ギャップBLASTを用いることができる。BLAST及びギャップBLASTプログラム
を使用する場合は、それぞれのプログラムの不履行パラメーター（例えばXBLAST
及びNBLAST）使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照。配列の比較に使
用する数学的アルゴリズムの、好ましく且つ非限定的な別の例としては、Myers
とMiller、CABIOS(1989)のアルゴリズムがある。このようなアルゴリズムはGCG
配列アライメントソフトウエアのパッケージの一部であるALIGNプログラム（バ
ージョン2.0）へ取り込まれる。アミノ酸配列の比較のためにALIGNプログラムを
使用する場合は、PAM120ウェイト残基表、12のギャップ長ペナルティー、及び4
ギャップ長ペナルティーを使用できる。
【０１１５】 二つの配列間の同一性パーセントは、ギャップありかまたはなしで先述の方法
に類似の方法で決定できる。同一性パーセントを計算する場合、正確な一致のみ
を数える。
【０１１６】 本発明はLIG46もしくはLIG56のキメラまたは融合蛋白質も提供する。本明細書
において使用されるLIG46もしくはLIG56の「キメラ蛋白質」または「融合蛋白質
」は、非LIG46ポリペプチドまたは非LIG56ポリペプチドと機能的に結合したLIG4
6ポリペプチドまたはLIG56ポリペプチドを有する。「LIG46ポリペプチドまたはL
IG56ポリペプチド」とは、LIG46もしくはLIG56に対応するアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを意味し、一方、「非LIG46ポリペプチドもしくは非LIG56ポリペプ
チド」とは、LIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質と実質的に同一でない蛋白質に対
応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、LIG46蛋白質またはLIG56蛋
白質とは異なる蛋白質、及び同一または異なる生物由来の蛋白質に対応するアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。LIG46融合蛋白質もしくはLIG56融合
蛋白質間では、LIG46ポリペプチドもしくはLIG56ポリペプチドは、LIG46蛋白質
もしくはLIG56蛋白質の全てまたは一部に対応し、好ましくは少なくとも、LIG46
蛋白質もしくはLIG56蛋白質の生物学的活性部位の一つに対応する。融合蛋白質
間では、「機能的に結合する」という用語は、LIG46ポリペプチドもしくはLIG56
ポリペプチドと、非LIG46ポリペプチドもしくは非LIG56ポリペプチドがインフレ
ームで互いに融合していることを意味する。非LIG46ポリペプチドまたは非LIG56
ポリペプチドは、LIG46ポリペプチドまたはLIG56ポリペプチドのN末端またはC末
端と融合することができる。
【０１１７】 有用な融合蛋白質の一つとしては、GST配列のC末端と、LIG46配列またはLIG56
配列が融合しているGST-LIG46融合蛋白質またはGST-LIG56融合蛋白質がある。こ
のような融合蛋白質は組換えLIG46または組換えLIG56の精製を容易にする。
【０１１８】 もう一つの態様において、融合蛋白質はそのN-末端に異種シグナル配列を含む
LIG46蛋白質である。例えば、本来のLIG46シグナル配列（すなわち、配列番号：
２のアミノ酸約１〜32位）を除去して、別の蛋白質からのシグナル配列に置換す
ることができる。特定の宿主細胞（例えば、哺乳類の宿主細胞）では、異種シグ
ナル配列を用いることによって、LIG46の発現および／または分泌を増加させる
ことができる。例えば、バキュロウイルス外皮蛋白質のgp67分泌配列を異種シグ
ナル配列として用いることができる（「分子生物学の現行プロトコール（Curren
t Protocols in Molecular Biology）」、アウスユベール（Ausubel）ら編、ジ
ョン・ウィリー＆サンズ、1992）。真核細胞異種シグナル配列の他の例には、メ
リチンおよびヒト胎盤アルカリフォスファターゼの分泌配列が含まれる（ストラ
タジーン社；ラホヤ、カリフォルニア州）。さらにもう一つの例において、有用
な原核細胞異種シグナル配列には、phoA分泌シグナル（「分子クローニング（Mo
lecular Cloning）」、サムブルック（Sambrook）ら、第二版、コールドスプリ
ングハーバー研究所出版、1989）およびプロテインA分泌シグナル（ファルマシ
アバイオテック社；ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）が含まれる。
【０１１９】 また別の態様では、融合蛋白質は、LIG46もしくはLIG56の全てまたは一部が、
イムノグロブリン蛋白質ファミリーのメンバーに由来する配列と融合しているLI
G46またはLIG56-イムノグロブリン融合蛋白質である。本発明のLIG46-イムノグ
ロブリン融合蛋白質を薬学的組成物中に取り入れ、被験者に投与し、細胞表面で
のLIG56リガンドとLIG56蛋白質との相互作用を阻害し、それによりインビボでの
LIG56を介するシグナル伝達を阻害することができる。LIG56-イムノグロブリン
融合蛋白質は、LIG56の同種リガンドの生体利用性に作用するように使用するこ
とができる。さらに、本発明のLIG56-イムノグロブリン融合蛋白質を免疫原とし
て使用し、被験者体内でLIG56抗体を生産し、LIG56のリガンドを精製し、スクリ
ーニング解析においてLIG56とLIG56リガンドとの相互作用を阻害する分子を同定
することができる。LIG46融合蛋白質は類似の方法で用いることができる。
【０１２０】 好ましくは、LIG46もしくはLIG56のキメラ又は融合蛋白質は組換えDNAの常法
により製造できる。例えば、異なったポリペプチド配列をコードするDNA断片を
、例えば、結合用の平滑末端または付着末端を用い、制限酵素消化により適切な
末端を設け、適切に付着末端を埋め、アルカリホスファターゼ処理で望ましくな
い結合を避け、酵素連結を行うなど従来の方法に従ってインフレームで連結でき
る。また別の態様では自動DNA合成機などの従来の方法で、融合遺伝子を合成で
きる。また、アニーリングして再増幅された二つの連続した遺伝子断片間で相補
的オーバーハングを産出するアンカープライマーを用いて遺伝子断片を増幅し、
キメラ遺伝子配列を作製できる（例えば「分子生物学の最新プロトコール（Curr
ent Protocols in Molecular Biology）」、Ausubelら編、John WileyとSons：1
992参照）。さらに、すでに融合部分（例えばGSTポリペプチド）をコードする多
くの発現ベクターを購入できる。LIG46コード核酸またはLIG56コード核酸はこの
ような発現ベクターにクローニングされ、融合部分はLIG46蛋白質またはLIG56蛋
白質とインフレームで結合する。
【０１２１】 本発明はまた、LIG46もしくはLIG56のアゴニスト（模倣物）、またはLIG46も
しくはLIG56のアンタゴニストのいずれかとして機能するLIG46もしくはLIG56蛋
白質の変異体にも関する。例えばLIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質の点突然変異
または短縮等の変異誘発により、LIG46またはLIG56蛋白質の変異体を作製するこ
とができる。LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質のアゴニストは、天然型LIG46蛋白
質もしくは天然型LIG56蛋白質の形態と実質的に同じ生物学的活性、またはそれ
らのサブセットを維持することができる。LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質のアン
タゴニストは、例えば、LIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質を含む細胞シグナル伝
達経路の下流または上流メンバーへの競合的結合等により、LIG46蛋白質もしく
はLIG56蛋白質の天然型の一つまたは複数の活性を阻害することができる。従っ
て、限定的な機能の変異体と共に処理することによって特異的な生物学的作用を
誘起できる。該蛋白質の天然型の生物活性のサブセットを有する変異体によって
被験者を治療することにより、LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質の天然型での治療
と比較して、被験者への副作用を軽減できる。LIG46またはLIG56のアゴニスト（
模倣物）またはLIG46またはLIG56のアンタゴニストとして機能するLIG46蛋白質
またはLIG56蛋白質の変異体を、例えばLIG46もしくはLIG56蛋白質のアゴニスト
またはアンタゴニストの活性においてLIG46もしくはLIG56蛋白質のトランケーシ
ョン変異体等の、変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする
ことにより同定することができる。一つの態様において、LIG46変異体またはLIG
56の変異体の種々のライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発
により生産され、様々な遺伝子ライブラリーでコードされる。様々なLIG46また
はLIG56の変異体ライブラリーは、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺
伝子配列へ酵素を用いて結合し、可能性のあるLIG46配列もしくはLIG56配列の縮
重セットを個々のポリペプチドとして、またはLIG46配列もしくはLIG56配列の集
合を含む、より大きな融合蛋白質の集合体（例えばファージディスプレイのため
）として発現可能な様式で生産できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性
のあるLIG46もしくはLIG56変異体のライブラリーを作製するために用いることの
できる様々な方法がある。自動DNA合成機で縮重遺伝子配列を化学合成し、合成
遺伝子を適切な発現ベクターに結合させる。遺伝子の縮重セットを用いて、可能
性のあるLIG46配列またはLIG56配列の所望のセットをコードする全ての配列を、
一つの混合物として提供することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法
は当技術分野では公知である（例えば、Narang、1983、Tetrahedron 39:3、Itak
uraら、1984、Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakuraら、1984、Scicence 198:
1056; Ikeら、1983、nucleic Acid Res. 11: 477参照）。
【０１２２】 さらには、LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質をコードする配列の断片のライブラ
リーを用いて、様々なLIG46断片またはLIG56断片の集団を作製し、LIG46またはL
IG56蛋白質の変異体をスクリーニングし、その後選抜することができる。一つの
態様では、LIG46もしくはLIG56コード配列の二本鎖PCR断片を、一分子につきニ
ックが約一回だけ生じる条件下でヌクレアーゼ処理し、二本鎖DNAを変性させ、D
NAを復元し、異なったニック産物からのセンス／アンチセンス対を含む二本鎖DN
Aを形成し、S1ヌクレアーゼ処理で、復元した二本鎖から一本鎖の部分を削除し
、得られた断片を発現ベクターに結合して、コード配列断片のライブラリーを作
製できる。この方法によって、LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質のN末端及び様々
な大きさの内部断片をコードする発現ライブラリーを作製することができる。
【０１２３】 点突然変異またはトランケーションで作製されたコンビナトリアルライブラリ
ーの遺伝子産物をスクリーニングし、また、選択された形質を有する遺伝子産物
をcDNAライブラリーからスクリーニングする幾つかの方法が当技術分野では周知
である。このような方法は、LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質のコンビナトリアル
変異誘発で産出された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応する。
最も広く使われている、高処理量分析が容易な、大きな遺伝子ライブラリーのス
クリーニング方法には、典型的に、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラ
リーのクローニング、得られたライブラリーベクターの適切な細胞のトランスフ
ォーメーションと、望ましい活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子
をコードするベクターの単離を容易にする条件下でのコンビナトリアル遺伝子の
発現とが含まれる。ライブラリー内の機能的変異体の頻度を増加させる方法であ
る、リカーシブアンサンブル変異誘発（Recursive ensemble mutagenesis: REM
）を、スクリーニング解析と共に用いて、LIG46変異体もしくはLIG56変異体を同
定することができる（ArkinとYourvan、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
7877-7815; Delgraveら、1993、Protein Engineering 6(3): 327-331）。
【０１２４】 単離LIG46蛋白質もしくは単離LIG56蛋白質、またはその一部もしくは断片を免
疫原として用い、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体作成の常法で、
LIG46またはLIG56に結合する抗体を作製することができる。また、全長LIG46蛋
白質または全長LIG56蛋白質を用い、代替的には本発明により、LIG46もしくはLI
G56の抗原ペプチドの断片を作成し、免疫原として使用することができる。LIG46
もしくはLIG56の抗原ペプチドは、配列番号：2に記載のアミノ酸配列の少なくと
も８個（好ましくは、10、15、20又は30個）のアミノ酸残基を含み、かつLIG46
またはLIG56のエピトープを含有し、該ペプチドに対して生産された抗体がLIG46
またはLIG56と特異的な免疫複合体を形成する。
【０１２５】 抗原ペプチドに含まれる好ましいエピトープは、例えば親水性領域等の、該蛋
白質の表面に位置するLIG46もしくはLIG56の領域である。親水性領域および抗原
領域は、当技術分野において既知の標準的なツールを用いて同定した。
【０１２６】 LIG46またはLIG56の免疫原を利用し、典型的に、適当な被験者（例えばウサギ
、ヤギ、マウスや他の哺乳動物）を免疫原で免疫化して抗体を作製できる。適切
な免疫原の調製品としては、例えば、発現されたLIG46組換え蛋白質もしくはLIG
56組換え蛋白質、または化学合成LIG46ポリペプチドもしくは化学合成LIG56ポリ
ペプチドを含む。調製品はさらに、例えばフロイントの完全または不完全アジュ
バント等のアジュバント、または類似の免疫促進剤を含む。適切な被験者の免疫
原LIG46調製品または免疫原LIG56調製品による免疫化は、抗LIG46ポリクローナ
ル抗体または抗LIG56ポリクローナル抗体反応を促進する。
【０１２７】 したがって、本発明の別の局面は抗LIG46抗体または抗LIG56抗体に関する。「
抗体」という用語は本明細書では、イムノグロブリン分子や、イムノグロブリン
分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、LIG46またはLIG56のような抗原に特異
的に結合する抗原結合部位をもつ分子を指す。LIG46またはLIG56に特異的に結合
する分子はLIG46またはLIG56に結合する分子ではあるが、例えば、元来LIG46ま
たはLIG56を有する生物検体等の検体内のような試料中の別の分子とは実質的に
結合しない分子である。イムノグロブリン分子の免疫学的に活性な部分には、ペ
プシンなどの酵素で抗体を処理することにより生産できるF(ab)及びF(ab')2断片
が含まれる。本発明によりLIG46またはLIG56に結合するポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体が提供される。本明細書で使用される「モノクローナル抗
体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、LIG46またはLIG56の特
定のエピトープと免疫作用できる抗原結合部位を一種のみ有する抗体分子の集団
を示す。従ってモノクローナル抗体組成物は典型的には、モノクローナル抗体が
免疫反応する特定のLIG46蛋白質またはLIG56蛋白質への単一結合親和性を示す。
【０１２８】 抗LIG46ポリクローナル抗体または抗LIG56ポリクローナル抗体は、上記のよう
に適切な被験者をLIG46免疫原またはLIG56免疫原で免疫化することにより調製す
ることができる。免疫化された被験者体内の抗LIG46抗体または抗LIG56抗体の力
価は、例えば、固定化LIG46またはLIG56を用いて固相酵素免疫検定法（ELISA）
等の常法に従い、経時的に測定できる。必要であれば、LIG46またはLIG56に対す
る抗体分子を哺乳動物（例えば血液）から単離し、例えば蛋白質Aクロマトグラ
フィーのような周知の方法でさらに精製し、IgG分画を得ることができる。免疫
後の適切な時、例えば、抗LIG46抗体または抗LIG56抗体の力価の最大時に、抗体
産生細胞を被験者から得て、常法、例えば最初にKohlerとMilstein（1975、Natu
re 256: 495-497）に示されたハイブリドーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法（
Kozborら、1983、Immunol Today 4: 72）、EBV-ハイブリドーマ法（Coleら、198
5、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc., pp. 77-
96）またはトリオーマ法を用いて、モノクローナル抗体を調製できる。様々な抗
体、モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製する方法は周知である（一般的な
ものとして「免疫学の最新プロトコール（Current Protocols in Immunology）
」、1994、Coliganら編、John WileyとSons、Inc.、New York、NY参照）。手短
には、不死の細胞系（典型的にはミエローマ）を、先述のように、LIG46免疫原
またはLIG56免疫原で免疫化した哺乳動物からのリンパ細胞（典型的には脾臓細
胞）と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清を選抜し、LIG46また
はLIG56に結合するハイブリドーマ産生モノクローナル抗体を同定する。
【０１２９】 抗LIG46モノクローナル抗体または抗LIG56モノクローナル抗体を生産する目的
のために、リンパ細胞と不死化細胞株を融合させる多くの周知の方法のいずれか
を用いることができる（例えば、「免疫学の最新プロトコール（Current Protoc
ols in Immunology）」、上記、Galfreら、1977、Nature 266: 55052；R. H. Ke
nnith、Monoclonal Antobodies: A new Dimension In Biological Analyses, Pl
enum Publishing Corp.、New York、New York、1980；及びLerner 1981、Yale J
. Biol. Med., 54: 387-402）。さらには、一般的な当業者は有効な多くのこの
ような方法の変法があることに気付くと思われる。典型的には、不死化細胞株（
例えばミエローマ細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えばヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含有する培地（「HAT培地」
）に感受性のミエローマ細胞株等の、不死化したマウス細胞株と本発明の免疫原
性調製物で免疫化したマウスからのリンパ球を融合させることにより、例えばマ
ウスハイブリドーマを作成できる。例えば、p3-NS1/1-Ag4-1、p3-x63-Ag8.653ま
たはSp2/O-Ag14ミエローマ細胞系のような、多くのミエローマ細胞系のいずれの
細胞系も、常法に従い融合相手として利用できる。これらのミエローマ細胞系は
ATCCより入手可能である。特に、HAT感受性マウスミエローマ細胞を、ポリエチ
レングリコール（「PEG」）を用いてマウス脾臓細胞に融合させる。そして該融
合で得られたハイブリドーマ細胞をHAT培地で選抜し、HAT培地により非融合及び
非生産的に融合したミエローマ細胞が死滅する（非融合脾臓細胞は、形質転換さ
れていないので、数日後に死滅する）。本発明のモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞は、例えばELISAの常法で、LIG46またはLIG56に結合する抗
体について培地上清をスクリーニングすることによって検出される。
【０１３０】 モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代わりに、抗LIG46モノク
ローナル抗体または抗LIG56モノクローナル抗体を同定し、LIG46またはLIG56を
用いて組換えコンビナトリアルイムノグロブリンライブラリー（例えば、抗体フ
ァージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることにより単離し、そ
れによりLIG46またはLIG56に結合するイムノグロブリンライブラリーのメンバー
を単離することができる。ファージディスプレイライブラリーの作製及びスクリ
ーニングのキットは市販されている（例えばPharmacia Recombinant Phage Anti
body System、カタログ番号27-9400-01、及びStratagene SurfZAP(商標) Phage
Display Kit、カタログ番号240612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリー
の生産及びスクリーニングにおける使用が特に可能な方法及び試薬の例は、例え
ば、米国特許第5,223,409号; 国際公開公報第92/18612号；国際公開公報第91/17
271号；国際公開公報第92/20791号；国際公開公報第92/15679号；国際公開公報
第93/01288号； 国際公開公報第92/01047号； 国際公開公報第92/09690号；国際
公開公報第90/02809号； Fuchsら、1991、Bio/Technology 9: 1370-1372; Hayら
、1992、Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huseら、1989、Science 246: 12
75-1281; Griffithsら、1993、EMBO J 12: 725-734に見出すことができる。
【０１３１】 さらに、ヒト及び非ヒトの部分を含み、組換えDNA技術の常法により作成する
ことができる、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体のような、組換え抗LIG46
抗体または抗LIG56抗体は、本発明の範囲内である。このようなキメラ及びヒト
化モノクローナル抗体は、例えば、国際公開公報第87/02671号; 欧州特許出願第
184,187号; 欧州特許出願第171,496号; 欧州特許出願第173,494号; 国際公開公
報第86/01533号; 米国特許第4,816,567号; 欧州特許出願第125,023号; Betterら
、1988、Science 240: 1041-1043; Liuら、1987、Poc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4: 3439-3443; Liuら、1987、J. Immunol. 139: 3521-3526; Sunら、1987、Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimuraら、1987、Canc. Res. 47: 99
9-1005; Woodら、1985、Nature 314: 446-449; 及びShawら、1988、J. Natl. Ca
ncer Inst. 80: 1553-1559; Morrison、1985、Science 229: 1202-1207 Oiら、1
986、Bio/Techniques 4: 214; 米国特許第5,225,539号; Jonesら、1986、Nature
321: 552-525; Verhoeyanら、1988、Science 239: 1354; 及びBeidlerら、1988
、J. Immunol. 141: 4053-4060に記載の方法を用いて、当技術分野で周知の組換
えDNA技術により産出できる。
【０１３２】 抗LIG46またはLIG56抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニ
ティクロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によって、LIG46
またはLIG56を単離することができる。抗LIG46またはLIG56抗体によって、細胞
からの天然のLIG46またはLIG56、および宿主細胞において発現された組換え型LI
G46またはLIG56の精製が容易となりうる。その上、LIG46またはLIG56蛋白質の量
および発現パターンを評価するために、抗LIG46またはLIG56抗体を用いて、LIG4
6またはLIG56蛋白質を検出することができる（例えば、細胞溶解物または細胞上
清中で）。抗LIG46またはLIG56抗体は、例えば所与の治療レジメの効果を決定す
るために、臨床試験技法の一部として組織中の蛋白質レベルをモニターするため
に診断的に用いることができる。検出は検出可能な物質に抗体をカップリングさ
せることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵
素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射性物質が含ま
れる。適した酵素の例には、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ
フォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ
が含まれる；適した補欠分子団の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよび
アビジン／ビオチンが含まれる；適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、
フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロト
リアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリスリンが含
まれる；発光物質の例にはルミノールが含まれる；生体発光物質の例には、ルシ
フェラーゼ、ルシフェリン、およびアエコリンが含まれる；ならびに適した放射
性物質の例には、125I、131I、35S、または3Hが含まれる。
【０１３３】 ヒト完全抗体は、患者を治療的処置をするために特に望ましい。このような抗
体は、内因性の免疫グロブリンの重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を発現する能力はない
が、ヒトの重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を発現できるように形質転換したマウスを用
いて産生され得る。このトランスジェニックマウスを、選択された抗原を用いて
通常の様式で免疫化する。その抗原に対して誘導されるモノクローナル抗体は、
従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウ
スが有しているヒト免疫グロブリン導入遺伝子はB細胞の分化の際に再配列し、
したがってクラススイッチの転換や体細胞突然変異が起こる。したがって、この
ような技術を用いると、治療上有用なIgG、IgAおよびIgE抗体を産生することが
可能である。ヒト抗体を産生するこの技術の概論についてはLonbergおよびHusza
r(1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65〜93)を参照されたい。ヒト抗体やヒトモノ
クローナル抗体を産生するための技術、およびそのような抗体を産生するための
プロトコールについての詳細な説明は、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,6
33,425号、米国特許第5,569,825号、米国特許5,661,016号、および米国特許第5,
545,806号を参照するとよい。Abgenix, Inc. (Freemont, CA)およびGenpharm, I
nc.（Palo Alto, CA）によって、選択された抗原に対して誘導されるヒト抗体を
提供してもらうことが可能である。
【０１３４】III．組換え発現ベクター及び宿主細胞 本発明の別の局面はベクターに関連し、好ましくは、LIG46もしくはLIG56（ま
たはそれらの一部）をコードする核酸を含む発現ベクターである。
【０１３５】 下記の技術はまた、組換え型蛋白質またはトランスジェニック動物を作製する
ために用いられるTgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13を発現するために用い
られる宿主細胞およびベクターに適用することができる。このように、この章で
はLIG46およびLIG56について述べているが、記述した方法は、Tgtp、LRG-47、RC
10-II、およびStra13に適用することができる。
【０１３６】 本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、それが結合されている別の
核酸を輸送する能力のある核酸分子を意味する。ベクターの一タイプが「プラス
ミド」であり、それに別のDNAセグメントを連結できるような環状の二本鎖DNAル
ープを意味する。もう一つのタイプのベクターにはウイルス性のベクターがあり
、これでは別のDNAセグメントがそのウイルスのゲノムに結合できる。ある種の
ベクターは宿主細胞で自律複製ができ、その細胞にそれらベクターが導入される
（例えば、細菌性の複製起点を備えた細菌性ベクター及びエピソーム性哺乳類ベ
クターである）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳類ベクター）は宿
主細胞に導入されると哺乳動物のゲノムに組み込まれ、それによって宿主のゲノ
ムとともに複製される。さらにある種のベクター、即ち発現ベクターは、それら
が機能的に結合した遺伝子の発現を促す能力がある。一般に組換えDNA法で用い
られる発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態であることが多い。しか
しながら本発明は、等価の機能を有する発現ベクターの他の形態、例えばウイル
ス性ベクター（例えば複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関
連ウイルス）のような発現ベクターを含むことを意図している。
【０１３７】 本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において核酸を発現させるために適
した形態の本発明の核酸を含んでおり、つまり組換え発現ベクターが、発現のた
めに利用される宿主細胞に基づいて選択され、発現されるべき核酸配列に機能的
に結合している一個またそれ以上の調節配列を含んでいることを意味している。
組換え発現ベクターにおいて「機能的に結合する」とは、対象の核酸配列が調節
配列に、核酸配列の発現が可能になるような様式（例えば、インビトロでの転写
／翻訳系における様式、またはベクターが宿主細胞に導入された場合にその宿主
細胞における様式）で結合していることを意味すると解釈される。「調節配列」
という用語には、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節要素（例えば、
ポリアデニル化シグナル）が含まれると解釈される。このような調節配列は、例
えばGoeddelの「遺伝子の発現技術（Gene Expression Technology）」：Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990)に記載さ
れている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞において核酸配列の構成的発
現を誘導する配列や、ある種の宿主細胞においてのみ核酸の発現を誘導する配列
（例えば組織特異的な調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換
される宿主細胞の選択、望ましい蛋白質の発現レベルなどの因子に応じて異なる
ことが当業者によって認識されると思われる。本発明の発現ベクターが宿主細胞
に導入されることによって、本明細書に記載されたような核酸にコードされる、
融合蛋白質またはペプチドを含む蛋白質またはペプチドが産生できる（例えば、
LIG46またはLIG56蛋白質、LIG46またはLIG56蛋白質の突然変異体、融合蛋白質な
ど）。
【０１３８】 本発明の組換え発現ベクターは、例えば大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バ
キュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞などの原
核細胞または真核細胞において、LIG46またはLIG56を発現できるように設計すれ
ばよい。好ましい宿主細胞についてもさらに、Goeddelの「遺伝子の発現技術（G
ene Expression Technology）」：Methods in Enzymology 185, Academic Press
, San Diego, California (1990)に記載されている。また、組換え発現ベクター
はインビトロで転写及び翻訳が可能であり、例えばT7プロモーター調節配列及び
T7ポリメラーゼを用いて行う。
【０１３９】 原核細胞における蛋白質の発現は、融合蛋白質または非融合蛋白質のいずれか
を発現させる構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを含むベクターを用い
て大腸菌で行うことが最も多い。融合ベクターは、それにコードされる蛋白質に
、通常はその組換え蛋白質のアミノ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このよ
うな融合ベクターは典型的には次の三つの目的を達成する：1）組換え蛋白質の
発現を増加させる、2）組換え蛋白質の溶解性を高める、及び3）アフィニティー
精製法でリガンドとして作用させることによって組換え蛋白質の精製を促進させ
る。しばしば、融合発現ベクターでは、蛋白質溶解切断部位が融合部分と組換え
蛋白質との連結部に導入して、融合蛋白質を精製すべく融合部分の配列から組換
え蛋白質を分離することができる。このような酵素、またそれらと同じ性質の認
識配列には、Xa因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。代表的な融
合発現ベクターとしては、pGEX（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson (
1988) Gene 67: 31〜40）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, MA）及びpRI
T5（Pharmacia, Piscataway, NJ）が挙げられ、それらは標的組換え蛋白質にグ
ルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）、マルトースE結合蛋白質、または蛋白
質Aがそれぞれ結合している。
【０１４０】 適した誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrc（Amannら、 (1988) G
ene 69: 301〜315）及びpET 11d（Studierら、「遺伝子の発現技術（Gene Expre
ssion Technology）」：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Die
go, California (1990) 60〜89）が挙げられる。pTrcベクターからの標的遺伝子
の発現は、ハイブリッドtrp-lac融合プロモーターから宿主のRNAポリメラーゼ転
写に依存する。pET 11dベクターからの標的遺伝子の発現は、同時に発現したウ
イルス性RNAポリメラーゼ（T7 gnl）によって仲介されたT7 gn10-lac融合プロモ
ーターからの転写に依存する。このウイルス性ポリメラーゼは、宿主の菌株BL21
（DE3）またはHMS174（DE3）によって、lacUV5プロモーターの転写調節下でT7 g
nl遺伝子を有する内因性λプロファージから供給される。
【０１４１】 大腸菌において組換え蛋白質発現を最大にするための戦略の一つは、組換え蛋
白質を蛋白質分解によって開裂させる修復能力を持つ蛋白質を宿主細菌中に発現
させることである（Gottwsman, 「遺伝子の発現技術（Gene Expression Technol
ogy）」：Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Californi
a (1990) 119〜128）。別の戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個々のコドン
が大腸菌で優先的に用いられるようなアミノ酸のコドンとなるように、発現ベク
ターに挿入される核酸の核酸配列を変化させることである（Wadaら、(1992) Nuc
leic Acids Res. 20: 2111〜2118）。本発明の核酸配列に対するこのような変更
は、標準的なDNA合成法によって行うことができる。
【０１４２】 別の態様では、LIG46発現ベクターまたはLIG56発現ベクターは、酵母の発現ベ
クターである。酵母S.セレビシエ（S. Cerivisae）で発現するためのベクターの
例には、pYepSec1（Baldariら、 (1987) EMBO J. 6: 229〜234）、pMFa（Kurjan
およびHerskowitz, (1982) Cell 30: 933〜943）、pJRY88（Schultzら、 (1987)
Gene 54:113〜123）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）、及
びpicZ（InVitrogen Corp, San diego, CA）が挙げられる。
【０１４３】 また、LIG46またはLIG56は、バキュロウイルスの発現ベクターを用いて昆虫細
胞中に発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）において蛋
白質を発現させるのに有用なバキュロウイルスベクターには、pAc系列（Smithら
、(1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156〜2165）及びpVL系列（LucklowおよびSummer
s (1989) Virology 170: 31〜39）が含まれる。
【０１４４】 さらに別の態様においては、本発明の核酸は哺乳動物の発現ベクターを用いて
哺乳動物細胞において発現する。哺乳動物の発現ベクターの例には、pCDM8（See
d (1987) Nature 329: 840）、及びpMT2PC（Kaufmanら、(1987) EMBO J. 6: 187
〜195）が含まれる。哺乳動物の細胞において使用する場合、発現ベクターの調
節機能はウイルスの調節要素によって提供されることがよくある。例えば、共通
して用いられるプロモーターとしては、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイト
メガロウイルス及びシミアンウイルス40に由来する。原核細胞および真核細胞の
両方に対して好適な他の発現系は、Sambrookら (同上文献）の第16章及び17章を
参照されたい。
【０１４５】 別の態様において、哺乳動物の組換え発現ベクターに、特定の細胞型で優先的
に核酸を発現させる能力がある（例えば、組織特異的調節要素がその核酸を発現
させるために用いられる）。組織特異的調節要素は当技術分野では既知である。
適当な組織特異的プロモーターに関する非限定的な例には、アルブミンプロモー
ター（肝臓特異的、Pinkertら(1987) Genes Dev. 1: 268〜277）、リンパ特異的
プロモーター（CalameおよびEaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235〜275）、特
定するならばT細胞受容体のプロモーター（WinotoおよびBaltimore (1989) EMBO
J. 8: 729〜733）及び免疫グロブリン（Banerjiら、(1983) Cell 33: 729〜740
、QueenおよびBaltimore (1983) Cell 33: 741〜748）、神経細胞特異的プロモ
ーター（例えばニューロフィラメントプロモーター、ByrneおよびRuddle (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473〜5477）、膵臓特異的プロモーター（Ed
lundら、 (1985) Science 230: 912〜916）、及び乳腺特異的プロモーター（例
えば、ミルクホエー（乳清）プロモーター、米国特許第4,873,316号及び欧州特
許出願第264,166号）が挙げられる。発達時に調節されるプロモーターも含まれ
、例えばマウスのホックス（hox）プロモーター（KesselおよびGruss (1990) Sc
ience 249: 374〜379）及びαフェトプロテインプロモーター（CampesおよびTil
ghman (1989) Genes Dev. 3: 537〜546）も含まれる。
【０１４６】 本発明はさらに、アンチセンス配向でその発現ベクターにクローニングされた
本発明のDNA分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ちこのDNA分子は、LI
G46 mRNAまたはLIG56 mRNAにアンチセンスであるRNA分子が発現（DNA分子の転写
によって）できるような様式で調節配列に機能的に結合している。アンチセンス
配向でクローニングされた核酸に機能的に結合された調節配列を使用することが
可能であり、それはさまざまな細胞型でアンチセンスRNA分子の構成的発現を誘
導する。例えばウイルスのプロモーターやエンハンサー、もしくは調節配列を選
択することが可能で、それはアンチセンスRNAの組織特異性、または細胞型特異
性の構成的発現を誘導する。このアンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミ
ド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態にすることができ、そこではアン
チセンスな核酸は非常に効率的な調節領域の制御を受けて産生され、その活性は
ベクターが導入された細胞タイプによって決定することができる。アンチセンス
遺伝子を用いた遺伝子発現の調節に関する考察については、Weintraubら、(Revi
ews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986）参照のこと。
【０１４７】 本発明のもう一つの局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入される宿主細
胞に関連する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で
は互換的に用いられる。このような用語は、特定の対象とした細胞だけでなく、
そのような細胞の子孫や潜在的な子孫にも関連している。突然変異や環境の影響
のいずれかに起因して後代にある種の変化が起きる可能性があるため、実際には
このような子孫は親細胞と同一でないかもしれないが、それでも本明細書で用い
たような用語の範囲に含められる。
【０１４８】 宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。例えばLIG46蛋白質
またはLIG56蛋白質は、大腸菌などの細菌性細胞、昆虫細胞、酵母、または哺乳
動物細胞（例えばチャイニーズハムスターの卵巣細胞（CHO）またはCOS細胞）に
おいて発現させることができる。この他にも適当な宿主細胞が当業者に周知であ
る。
【０１４９】 ベクターDNAは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法によって原
核細胞あるいは真核細胞に導入することができる。本明細書で用いられる「形質
転換」及び「トランスフェクション」という用語は、外来の核酸（例えば、DNA
）を宿主細胞に導入するための技術的に認められたさまざまな方法を指すと解釈
され、それにはリン酸カルシウムもしくは塩酸カルシウムとの共沈降法、DEAE-
デキストラン-仲介性トランスフェクション法、リポフェクション法、またはエ
レクトロポレーション法が含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
ションする適切な方法は、Sambrookら(同上文献)、及び他の実験マニュアルにて
見出すことができる。
【０１５０】 哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションでは、用いた発現ベクターとト
ランスフェクション法によって、わずかな細胞の分画のみが外因性DNAをそれら
のゲノムに組みこむことできることが知られている。これらの組み込みを同定し
選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする
遺伝子を対象の遺伝子とともに宿主細胞に導入することが一般的である。好まし
い選択マーカーには、例えばG418、ハイグロマイシン及びメトトレキセートのよ
うな薬物に対する抵抗性を付与するものが含まれる。選択マーカーをコードする
核酸は、LIG46もしくはLIG56をコードするベクターと同一のベクターで宿主細胞
に導入してもよいし、または別個のベクターで導入してもよい。導入された核酸
を用いて安定的にトランスフェクションした細胞は、薬物選択法によって同定す
ることができる（例えば、選択マーカー遺伝子を導入した細胞は生存し、これに
対して他の細胞は死んでしまう）。
【０１５１】 本発明の宿主細胞は、例えば培養物中に含まれる原核宿主細胞または真核宿主
細胞であるが、それはLIG46蛋白質またはLIG56蛋白質を産生（即ち、発現）する
ことができる。したがって本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてLIG46蛋
白質またはLIG56蛋白質を産生する方法も提供する。一態様においてこの方法は
、本発明の宿主細胞（それにLIG46またはLIG56をコードする組換え発現ベクター
が導入されている）を、LIG46蛋白質またはLIG56蛋白質が産生されるような適当
な培地中で培養する段階を含む。別の態様では、この方法はさらに、LIG46また
はLIG56を、培地または宿主細胞から単離する段階を含む。
【０１５２】 本発明の宿主細胞はまた、関心対象の蛋白質を過剰発現する非ヒトトランスジ
ェニック動物を作製するためにも用いることができる。例えば一態様において、
本発明の宿主細胞は受精卵母細胞または胚幹細胞であり、LIG46、LIG56、Tgtp、
LRG-47、RC10-II、またはStra13の高レベルの発現を誘導する核酸分子を導入す
ることができる。次にこのような宿主細胞を用いることによって、LIG46配列、L
IG56配列、Tgtp配列、LRG-47配列、RC10-II配列、もしくはStra13配列がゲノム
中に導入されている非ヒトトランスジェニック動物、または内因性のLIG46配列
、LIG56配列、Tgtp配列、LRG-47配列、RC10-II配列、もしくはStra13配列が変化
している相同的組換え動物を作製することができる。このような動物はLIG46、L
IG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の機能、および／または活性を
研究するために用いることができ、かつLIG46活性もしくはLIG56活性のモデュレ
ーターを同定したり、および／または評価したりするために用いることもできる
。本明細書で用いられる「トランスジェニック動物」とは非ヒト動物であり、好
ましくは哺乳類、さらに好ましくはラットやマウスのようなげっ歯類であって、
その動物の一つまたは複数の細胞が導入遺伝子を含むものである。トランスジェ
ニック動物の他の例としては、非ヒトの霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニ
ワトリ、両性類などが含まれる。導入遺伝子とは、細胞のゲノム中に組み込まれ
、トランスジェニック動物を生育させ、かつ成熟した動物のゲノムに残ることに
よって、トランスジェニック動物の一つまたは複数の細胞型もしくは組織でコー
ドされる遺伝子産物を発現させるような外因性DNAである。本明細書で用いられ
る「相同的組換え動物」とは、非ヒトの動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ま
しくはマウスであって、内因性のLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、また
はStra13遺伝子が、内因性の遺伝子と、その動物の細胞、例えばその動物の胚細
胞にその動物が発生する前に導入された外因性のDNA分子との間で相同的組換え
を行うことで改変されている動物である。
【０１５３】 本発明のトランスジェニック動物は、所望の蛋白質をコードする核酸分子を受
精した卵母細胞の雄の前核に導入することによって、例えばマイクロインジェク
ション法、レトロウイルスの感染、及びその卵母細胞を偽妊娠させた雌の仮親動
物において成長させることによって作製することができる。cDNA配列は、非ヒト
動物のゲノムに導入遺伝子として組み込むことができる。または、LIG46、LIG56
、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13遺伝子におけるヒト相同体は、LIG46
、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13 cDNAへのハイブリダイジェー
ションを基にして、および導入遺伝子を用いて単離することができる。イントロ
ン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子における発現の効率を
高めるために含まれ得る。組織特異的調節配列は、蛋白質が特定の細胞で発現す
るように導入遺伝子に機能的に結合されている。胚の操作やマイクロインジェク
ションによって、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を発生させ
るための方法は、当技術分野では慣例的であり、例えば米国特許第4,736,866号
及び第4,870,009号、米国特許第4,873,191号並びにHogan「マウスの胚操作（Man
ipulating the Mouse Embryo）」(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor N. Y., 1986)に記載されている。類似の方法が他のトランジェ
ニック動物を作製するために用いられる。トランスジェニック発端動物は、ゲノ
ム中の導入遺伝子の存在、および/または動物における組織または細胞中のmRNA
発現に基づいて同定される。トランスジェニック発端動物は、その後、導入遺伝
子を有する別の動物と繁殖させるために使用することができる。また、LIG46、L
IG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13をコードする導入遺伝子を有する
トランジェニック動物は、他の導入遺伝子を有する他のトランジェニック動物と
さらにかけあわせてもよい。
【０１５４】 相同的組換え動物を作製するために、少なくとも一部分のLIG46、LIG56、Tgtp
、LRG-47、RC10-II、またはStra13遺伝子を含み、それに欠失、付加または置換
が導入されたことで遺伝子が例えば機能的に破壊するなどの変化を有するベクタ
ーを調製する。好ましい態様においてはこのベクターは、相同的組換えを行って
内因性遺伝子が機能的に破壊している（即ち、もはや機能的蛋白質をコードしな
い。「ノックアウト」ベクターとも言われる）ように設計されている。またこの
ベクターは、相同的組換えを行って内因性遺伝子が変異したり他の様式で改変さ
れているが、機能的蛋白質はコードするように設計することができる（例えば、
上流側の調節領域を改変することによって内因性蛋白質の発現を変化させること
ができる）。相同的組換えベクターでは、ベクターによって輸送される外因性遺
伝子と、胚幹細胞中の内因性遺伝子との間で相同的組換えが起こりうるように、
遺伝子の変化部分は、その5'末端及び3'末端が遺伝子の付加的な核酸と隣接して
いる。この隣接している付加的な核酸は、内因性遺伝子と相同的組換えを成功さ
せるのに十分な長さである。典型的には数キロベースの隣接するDNA（5'末端及
び3'末端の両方で隣接する）がベクターに含まれる（例えば、相同的組換えベク
ターについて記載したThomasおよびCapecchi (1987) Cell 51: 503参照）。この
ベクターは胚幹細胞系に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）
、そしてその導入された遺伝子が内因性遺伝子と相同的組換えを行った細胞が選
択される（例えば、Liら(1992) Cell 69: 915参照）。続いてその選択された細
胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入することによって、凝集キメラを形
成することができる（例えば、Bradley「奇形癌と胚性幹細胞（Teratocarsinoma
s and Embryonic Stem Cells）」: A Practical Approsch, Robertson, ed. (IR
L, Oxford, 1987) pp.113〜152参照）。次にキメラの胚を適当な偽妊娠させた雌
性仮親動物に移植することができ、その胚は出産日に至る。生殖細胞に相同的組
換えDNAを有している子孫は、導入遺伝子を生殖系で伝達させることによって全
ての細胞に相同的組換えDNAを含む動物を繁殖させるために利用できる。相同的
組換えベクターと相同的組換え動物を構築する方法は、[Bradley (1991) Curren
t Opunion in Bio/Technology 2: 823〜829]及び国際公開公報第90/11354号、第
91/01140号、第92/0968号、及び第93/04169号にさらに説明されている。
【０１５５】 別の態様においては、導入遺伝子の調節された発現が可能になるよう選択され
た系を備えたトランジェニック非ヒト動物を作製できる。このような系の一例は
、バクテリオファージP1のcre／loxP組換え酵素系である。このcre／loxP組換え
酵素系についての説明は、例えば[Laksoら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89：6232〜6236]参照のこと。組換え酵素系の別の例では、サッカロマイセス・
セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のFLP組換え酵素系がある（O'Gorman
ら、 (1991) Science 251:1351〜1355）。cre／loxP組換え酵素系が導入遺伝子
の発現を調節するために用いられる場合、Cre組換え酵素と選択された蛋白質の
両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。このような動物は、「二
重」トランジェニック動物を構築、例えば一方は選択された蛋白質をコードする
導入遺伝子を有し、もう一方は組換え酵素をコードする導入遺伝子を有するよう
な二種類のトランジェニック動物を掛け合わせることによって提供することがで
きる。
【０１５６】 本明細書で記載した非ヒトトランジェニック動物のクローンは、Wilmutら(199
7) Nature 385:810〜813並びに国際公開公報第97/07668号及び第97/07669号に説
明されている方法に従って作製することもできる。簡単に説明すると、トランジ
ェニック動物から例えば体細胞などの細胞を取り出し、増殖周期を脱してG0期に
入るように誘導することができる。続いてその静止細胞を、例えば電気パルスを
使用して同種の動物から得られる核を除去した卵母細胞に融合し、そこから静止
細胞を単離することができる。次にこの再構築した卵母細胞を培養して桑実胞ま
たは胚盤胞に成長させ、それを偽妊娠した雌性仮親動物に移植する。この雌の仮
親動物が生んだ子供は、例えば体細胞などの細胞が単一である動物のクローンと
なる。
【０１５７】IV．薬学的組成物 本発明のLIG46およびLIG56核酸分子、LIG46およびLIG56蛋白質、ならびに抗LI
G46抗体および抗LIG56抗体（本明細書では「活性化合物」とも言われる）は、LI
G46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の発現、または活性にお
ける様々なモデュレーターとなりうるような投与するにふさわしい薬学的組成物
に組み入れることができる。
【０１５８】 治療的組成物は、通常、核酸分子、蛋白質、または抗体と、薬学的に許容され
る担体とを含んでいる。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」とい
う用語には、任意の溶媒および全ての溶媒、分散媒体、被膜剤、抗菌剤及び抗真
菌剤、等張化剤及び吸収遅延化剤など、薬学的投与で相互作用を及ぼさないもの
が含まれる。薬学的活性物質に対するこのような媒体や添加剤の使用は当技術分
野では周知である。任意のよく用いられる媒体または添加剤が、活性化合物と不
適合でない限り、組成物において使用することができる。補助的な活性化合物も
その組成物に組み入れることが可能である。
【０１５９】 本発明の薬学的組成物は、投与する予定の経路と適合するよう処方される。投
与経路の例には、非経口投与、例えば静脈内投与、皮内投与、皮下投与や、経口
投与（例えば吸入）、経皮投与（局所）、粘膜経由投与、及び直腸内投与が挙げ
られる。非経口投与、経皮投与、または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液
には、次の成分を含んでいてもよい：注射のための水などの滅菌性の希釈剤、食
塩水、固定化オイル、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコ
ールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールやメチルパラベンのような抗酸化
剤；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩ま
たはリン酸塩のような緩衝剤；塩化ナトリウムやブドウ糖のような等張性を調整
する添加剤。pHは酸または塩基、例えば塩酸や水酸化ナトリウムを用いて調節す
ればよい。非経口投与用の製剤は、ガラス製かプラスチック製のアンプル、使い
捨ての注射器、または多数回分の用量が入った容器に封入することができる。
【０１６０】 注射可能な用途に適した薬学的組成物には、滅菌した注入可能な溶液または分
散剤を即時調製するための滅菌性の水性溶液（水溶性の場合）または分散剤と滅
菌性の粉末とが含まれる。静脈内投与のための適当な担体として、生理食塩水、
静菌性の水、クレモホール（Cremophor）EL（登録商標）（BASF; Parsippany, N
J）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が挙げられる。いずれの場合でも組成物
は滅菌されるべきであり、かつ容易に注射可能な出口を出て広がる液体であるべ
きである。製造や保存の条件下では安定であることが必要で、細菌や真菌のよう
な微生物からの汚染作用から保護されなくてはならない。担体は溶媒または分散
剤であり、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレ
ングリコール、及び液状のポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適当な
混合液が含まれる。適切な流動性は、例えばレシチンのような被膜剤を使用する
ことによって、分散剤の場合には必要とされる粒子の大きさを保守することによ
って、また表面活性剤を使用することによって維持できる。微生物の作用の抑制
は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロ
ザールなどのような種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって達成することができる。
多くの場合、例えば糖、マンニトールのようなポリアルコール類、ソルビトール
、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に含ませることが好ましいと考えられ
る。注射可能な組成物の持続的な吸収のためには、例えばアルブミンモノステア
リン塩とゼラチンのような吸収を遅らせる添加剤を組成物に含有させることによ
って達成できる。
【０１６１】 注入可能な滅菌溶液は、活性化合物（例えば、LIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白
質、または抗LIG46抗体もしくは抗LIG56抗体）を適当な溶媒中で必要な量だけ、
上記に列挙した成分の一つまたはそれらの成分を組み合わせたものと一緒に組み
入れ、必要に応じて、その後、濾過滅菌して調製できる。一般に分散剤は、活性
化合物を、ベースの分散媒と上記に列挙した成分のなかから必要とされる成分と
を含む滅菌性の溶剤に組入れて調製する。滅菌性の注入可能な溶液を調製するた
めに滅菌性の粉末を使用する場合、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥で
あり、これによって得られた活性成分と予め濾過滅菌した溶液に由来する望まし
い添加成分を混合する。
【０１６２】 経口投与用の組成物は一般に、不活性な希釈剤または食用に適した担体が含ま
れる。それらはゼラチンカプセルに封入してもよいし、圧縮して錠剤にしてもよ
い。経口での治療薬投与の目的で活性化合物は賦形剤とともに調合してもよく、
錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の剤形にすればよい。経口組成物はまた、
口腔洗浄剤として用いる場合には液状の担体を使用して調製すればよく、その際
、液状担体中に含まれる化合物が経口的に供給され、すすがれ、および吐き出さ
れるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性である結合剤および／またはアジ
ュバント剤をその組成物の一部として含めることもできる。錠剤、丸剤、カプセ
ル剤、トローチ剤などの薬剤は、以下の成分のいずれか、またはそれと同様の性
質を有する化合物を含むことができる：微結晶のセルロース、トラガカントガム
もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンや乳糖などの賦形剤；アルギン酸、プ
リモゲル(Primogel)、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグ
ネシウムもしくはステローテス(Sterotes)などの潤滑剤；コロイド二酸化珪素な
どの潤化剤；ショ糖やサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル
酸メチル、もしくはオレンジ香料などの着香料である。吸入によって投与する場
合、その化合物は適当な発射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器
、もしくはディスペンサーから、または噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で
供給される。
【０１６３】 また全身投与は、経粘膜または経皮膚手段によっても行うことができる。経粘
膜または経皮膚投与方法では、透過させるべき障壁に対して適した浸透剤を製剤
に用いる。このような浸透剤は一般に当技術分野では公知であり、例えば経粘膜
投与のための洗浄剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与
は、鼻腔用スプレーや坐薬を利用して行うことができる。経皮投与では、活性化
合物は一般的に当技術分野で知られているような軟膏、膏薬、ゲル、またはクリ
ームに製剤化される。
【０１６４】 またこの化合物は、直腸に送達するための坐薬（例えば、ココアバター及び他
のグリセライドのような従来よりある坐薬の基剤とともに）または滞留浣腸の形
態として調製してもよい。
【０１６５】 一つの態様において、活性化合物は、該化合物が体内から急速に消失するのを
防ぐ担体とともに調製され、それは例えば、移植片やマイクロカプセル化した送
達系などの放出を制御する製剤である。生分解性であり、生体適合性である、例
えばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド類、ポリグリコール酸、コ
ラーゲン、ポリオルトエステル類、及びポリラクチン酸のようなポリマーを用い
ることができる。このような製剤の調製方法は当業者には明らかであると思われ
る。またこれらの材料は、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.
から商業的に入手してもよい。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノク
ローナル抗体を感染させた細胞を標的とするリポソームを含む）も薬学的に許容
される担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第4,522,811
号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製できる。
【０１６６】 投与を容易にし、かつ一用量を均一にするために、用量単位形態で経口または
非経口組成物を製剤化することが特に都合がよい。本明細書で用いられる用量単
位形態とは、治療を受ける被験者にとって単一用量として適した物理的に別々の
単位を意味し、そのそれぞれの単位は、必要とされる薬学的担体と関連して望ま
しい治療効果を生み出すように計算された予め決められた量の活性化合物を含ん
でいる。本発明の用量単位形態についての特定化は、活性化合物の特有の特徴及
び達成される特定の治療効果、並びに個体の治療のためにこのような活性化合物
を複合化するという当技術分野における固有の制限に指示され、それらに直接的
に依存する。
【０１６７】 本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いること
ができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注入、局所投与（米国特許第5,
328,470号）によって、または定位への注入（例えば、Chenら(1994) Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 91: 3054〜3057参照）によって患者に供給することができる
。この遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中にその遺伝子
治療ベクターを含有させてもよいし、あるいはその遺伝子輸送のための溶剤が埋
め込まれた徐放性基質を構成してもよい。また、完全な遺伝子輸送ベクターが例
えばレトロウイルスベクターのような組換え細胞からそのまま産生できる場合、
薬学的製剤はその遺伝子輸送系を産生する1個または複数の細胞を含んでいれば
よい。
【０１６８】 この薬学的組成物は、投与説明書とともに、容器、パッケージ、またはディス
ペンサー中に含まれ得る。
【０１６９】V．本発明の使用及び方法 本明細書に記載されたLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13
の核酸分子、蛋白質、蛋白質相同体、ならびに抗体は以下の方法の一つまたは複
数の方法で用いることができる。即ち、a）スクリーニング解析、b）検出アッセ
イ法（例えば、染色体マッピング、組織タイピング、法医生物学）、c）治療方
法（例えば、治療用または予測用）である。本発明の単離核酸分子は、LIG46、L
IG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質を発現させるため（例えば
、遺伝子治療の適用における宿主細胞、またはトランスジェニック動物中の組換
え発現ベクターを介して）、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはS
tra13 mRNA（例えば、生物試料に含まれる）、またはLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-
47、RC10-II、もしくはStra13遺伝子における遺伝的障害を検出するため、かつL
IG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の活性または発現を調節
するために用いることができる。さらにLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II
、またはStra13蛋白質は、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStr
a13蛋白質の不十分な産生、または過剰な発現によって、または野生型蛋白質に
比べて望ましくないレベルの活性を有するLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-I
I、もしくはStra13蛋白質型が産生されることによって特徴づけられる疾患を治
療するために用いられ、ならびにLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もし
くはStra13の活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングする
ためにも用いられる。さらに、本発明の抗LIG46抗体、抗LIG56抗体、抗Tgtp抗体
、抗LRG-47抗体、抗RC10-II抗体、または抗Stra13抗体は、LIG46、LIG56、Tgtp
、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質を検出して単離するため、ならびにLIG
46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13の活性を調節するために用い
ることができる。
【０１７０】 本発明はさらに、上記のスクリーニング解析によって同定された新規の薬物、
及び本明細書に記載されたような治療の目的でそれらを使用する方法にも関連す
る。
【０１７１】 A．スクリーニング解析 本発明は、モデュレーター、即ち、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、
もしくはStra13蛋白質に結合したり、および／または例えばLIG46、LIG56、Tgtp
、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の発現または活性に対する刺激作用または
阻害作用を有する候補もしくは試験化合物または薬物（例えば、ペプチド、ペプ
チド模倣体、小分子、または他の薬物）を同定するための方法（本明細書では「
スクリーニング解析」とも称する）を提供する。
【０１７２】 本発明は、LIG46蛋白質もしくはポリペプチドの膜結合型またはその生物学的
活性部分に結合する、またはその活性を調節する候補物質もしくは試験化合物を
スクリーニングするためのアッセイ法を提供する。その他の態様はLIG46の可溶
性型を使用することを含む。
【０１７３】 本発明の試験化合物は、当技術分野で既知の組合せライブラリー法で非常に多
くの方法のうちのいずれかを用いて得ることができる。そのライブラリーには、
生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行な（spatially addressabl
e parallel）固相ライブラリーまたは液相ライブラリー、デコンボレーションを
必要とする合成ライブラリー法、「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）
」ライブラリー法、及びアフィニティークロマトグラフィー選別法を利用する合
成ライブラリー法が含まれる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライ
ブラリーに限定されるが、これに対して他の4つのアプローチはペプチド、非ペ
プチドオリゴマーまたは小分子の化合物ライブラリーに適用可能である（Lam (1
997) Anticancer Drug Des. 12: 145）。
【０１７４】 分子ライブラリーを合成するための方法の例は、当技術分野で周知であり、例
えばDeWittら(1993) Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erbら、(1994)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422、Zuckermannら、(1994). J. Med. Che
m. 37: 2678、Choら、 (1993) Science 261: 1303、Carrellら、(1994) Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carellら、 (1994) Angew. Chem. Int. Ed. E
ngl. 33: 2061、及びGallopら、(1994) J. Med. Chem. 37: 1233に見出される。
【０１７５】 化合物のライブラリーは溶液で存在していてもよいし（例えば、Houghten (19
92) Bio/Techniques 13: 412〜421）、またはビーズ上（Lam (1991) Nature 354
: 82〜84）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555〜556）、細菌（米国特許
第5,223,409号）、胞子（特許第5,571,698号、第5,403,484号、及び第5,223,409
号）、プラスミド（Cullら(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865〜1869
）、もしくはファージ（ScottおよびSmith (1990) Science 249: 386〜390、Dev
lin (1990) Science 249: 404〜406、Cwirlaら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
87: 6378〜6382、及びFelici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301〜310）に存在し
ていてもよい。
【０１７６】 本発明は、可溶性のLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13を
用いるアッセイ法を含む。そのようなアッセイ法は、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-
47、RC10-II、もしくはStra13蛋白質またはその生物学的に活性な部分を試験化
合物と接触させること、および試験化合物の、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC
10-II、もしくはStra13蛋白質またはその生物学的に活性な部分との結合能を決
定することを含む。試験化合物のLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、また
はStra13蛋白質との結合は、上記のアプローチを用いて直接または間接的に決定
することができる。好ましい態様において、アッセイ法は、試験化合物とLIG46
、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質との相互作用能を決定す
る段階が、既知化合物と比較して試験化合物がLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC
10-II、もしくはStra13、またはその生物学的に活性な部分に選択的に結合する
か否かを決定することを含む、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしく
はStra13蛋白質またはその生物学的に活性な部分を、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-
47、RC10-II、またはStra13に結合する既知の化合物に接触させてアッセイ混合
物を形成する段階、該アッセイ混合物を試験化合物に接触させる段階、および該
試験化合物がLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質と相
互作用するか否かを決定する段階を含む。
【０１７７】 別の態様において、アッセイ法は、LIG46蛋白質もしくはLIG56蛋白質、または
それらの生物学的活性部位と試験化合物を接触させる段階、およびLIG46、LIG56
、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13蛋白質またはそれらの生物学的活性
部位の活性を調節する（例えば、刺激または阻害する）試験化合物の能力を測定
する段階を含む細胞ベースのアッセイ法である。LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、
RC10-II、またはStra13の活性を調節する試験化合物の能力を測定するには、例
えば、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13に結合するLIG46、
LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質の能力を測定することによ
って行うことができる。他の態様では、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II
、またはStra13の活性を調節する試験化合物の能力の検出は、LIG46、LIG56、Tg
tp、LRG-47、RC10-II、またはStra13標的分子の活性を変化させる薬物の能力を
検出することによって達成することができる。例えば、適当な基質上の標的分子
の触媒／酵素活性を測定すればよい。
【０１７８】 さらに別の態様では、無細胞アッセイ法には、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、
RC10-II、もしくはStra13蛋白質、またはそれらの生物学的活性部位を、LIG46、
LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13と結合してアッセイ混合物を形
成する既知の化合物と接触させる段階、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触
させる段階、及びLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質
と相互作用する試験化合物の能力を検出する段階を含むアッセイ法であって、LI
G46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質と相互作用する試験
化合物の能力を検出する前記段階には、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II
、またはStra13標的分子に優先的に結合したりその活性を優先的に調節したりす
るLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質の能力を検出す
る方法が含まれる。
【０１７９】 LIG46のような膜結合蛋白質に関して、一つの態様においてアッセイ法は、LIG
46蛋白質の膜結合型またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞
を試験化合物に接触させて、該試験化合物がLIG46蛋白質に結合するか否かを決
定する、細胞に基づくアッセイ法である。例えば、細胞は酵母細胞または哺乳類
起源の細胞となりうる。試験化合物がLIG46蛋白質に結合するか否かを決定する
ことは、例えば、試験化合物と、LIG46蛋白質またはその生物学的に活性な部分
との結合を、複合体において標識した化合物を検出することによって決定するこ
とができるように、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリング
させることによって行うことができる。例えば、試験化合物は125I、35S、14C、
または3Hによって直接的または間接的に標識することができ、放射性同位元素は
電波放出数の直接計数またはシンチレーション計数によって検出される。または
試験化合物は、例えばホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ、またはルシフェラーゼによって酵素的に標識することができ、酵素
標識は適当な基質の産物への変換を測定することによって検出される。好ましい
態様において、アッセイ法は、試験化合物がLIG46蛋白質と相互作用するか否か
を決定する段階が、既知の化合物と比較して、試験化合物がLIG46またはその生
物学的活性部分に選択的に結合するか否かを決定する段階を含む、LIG46蛋白質
の膜結合型またはその生物学的活性部分を細胞表面上に発現する細胞を、LIG46
に結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成する段階、該アッセ
イ混合物を試験化合物と接触させる段階、および該試験化合物がLIG46蛋白質と
相互作用するか否かを決定する段階を含む。
【０１８０】 もう一つの態様において、アッセイ法は、LIG46蛋白質の膜結合型またはその
生物学的活性部分を細胞表面上に発現する細胞を、試験化合物に接触させる段階
、および試験化合物がLIG46蛋白質またはその生物学的活性部分の活性を調節す
る（例えば、刺激または阻害）か否かを決定する段階を含む、細胞に基づくアッ
セイ法である。試験化合物がLIG46またはその生物学的活性部分の活性を調節す
るか否かを決定する段階は、例えば、LIG46蛋白質がLIG46標的分子と結合または
相互作用するか否かを決定することによって行うことができる。本明細書におい
て用いるように、「標的分子」とは、LIG46蛋白質が自然に結合または相互作用
する分子であり、例えばLIG46蛋白質を発現する細胞の表面上の分子、第二の細
胞の表面上の分子、細胞外環境にある分子、細胞膜または細胞質分子の内部表面
に結合した分子である。LIG46標的分子は、本発明の非LIG46分子またはLIG46蛋
白質もしくはポリペプチドとなりうる。一つの態様において、LIG46標的分子は
細胞膜を通じて細胞内へと至る細胞外シグナル（例えば、化合物と膜結合型LIG4
6分子の結合によって生成されたシグナル）の伝達を促進するシグナル伝達経路
の成分である。標的は例えば、触媒活性を有する第二の細胞間蛋白質またはLIG4
6と下流のシグナル伝達分子との会合を促進する蛋白質でありうる。
【０１８１】 膜結合型LIG46蛋白質がLIG46標的分子と結合または相互作用するか否かを決定
することは、直接結合の決定に関する上記の方法の一つによって行うことができ
る。好ましい態様において、LIG46蛋白質がLIG46標的分子に結合または相互作用
するか否かを決定することは、標的分子の活性を決定することによって行うこと
ができる。例えば、標的分子の活性は、触媒／酵素活性を検出することによって
、または細胞応答を検出することによって決定することができる。
【０１８２】 本発明の無細胞アッセイ法は、可溶型LIG46と膜結合型LIG46のどちらに使用し
ても感受性が高い。膜結合型LIG46を含む無細胞アッセイ法の場合には、膜結合
型LIG46が溶液中に維持されるように可溶化薬剤を使用することが望ましいと考
えられる。このような可溶化薬剤の例には、以下の非イオン性界面活性剤が含ま
れる：例えば、n-オクチルグルコシド、n-ドデシルグルコシド、n-ドデシルマル
トシド、オクタノイル-N-メチルグルカミド、デカノイル-N-メチルグルカミド、
トリトン（登録商標）X-100、トリトン（登録商標）X-144、テジット（登録商標
）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）n、3-［（3-クロラミド
プロピル）ジメチルアミニオ］-1-プロパンスルホン酸（CHAPS）、3-［（3-クロ
ラミドプロピル）ジメチルアミニオ］-2-ハイドロキシ-1-プロパンスルホン酸（
CHAPSO）、またはN-ドデシル＝N，N-ジメチル-3-アミニオ-1-プロパンスルホン
酸。
【０１８３】 本発明の上記のアッセイ法の一つ以上の態様では、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-
47、RC10-II、もしくはStra13か、または対応する標的分子のいずれかを固定す
ることによって、アッセイの自動化に適用できるという点はもちろんのこと、そ
れらの蛋白質の一方または両方ともが複合していない形態から複合した形態を分
離するのが容易であるという点において望ましい。試験化合物と、LIG46、LIG56
、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13との結合、または候補化合物の存在
下もしくは非存在下における、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしく
はStra13と標的分子との相互作用は、反応物を含むのに適した任意の容器中で達
成され得る。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管
、及び微量遠心分離管が挙げられる。一つの態様において、一つまたは両方の蛋
白質を基質に結合させるドメインを追加する融合蛋白質が提供される。例えば、
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ／融合蛋白質またはグルタチオン-S-トラン
スフェラーゼ／標的融合蛋白質を、グルタチオンセファロースビーズ（Shigma C
hemical; St. Louis, MO）またはグルタチオンを誘導させたマイクロタイタープ
レートに吸着させ、続いてそれを試験化合物と結合させたり、または試験化合物
と非吸着標的蛋白質またはLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStr
a13蛋白質のいずれかと結合させ、次にその混合物が複合体を形成できるような
伝導性条件（例えば、塩類及びpHについては生理学的条件で）下でインキュベー
トするとよい。インキュベートに続いてそのビーズまたはマイクロタイタープレ
ートのウェルを洗浄して非結合成分を除去し、ビーズの場合には基質を固定化し
て、例えば上記に記載されたように直接的または非直接的のいずれかで複合体を
測定した。また、この複合体は基質と無関係にすることができ、LIG46、LIG56、
Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13の結合、または活性のレベルを標準的
な方法を用いて測定した。
【０１８４】 基質上に蛋白質を固定化する他の手法も本発明のスクリーニング解析として用
いることができる。例えば、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはS
tra13、または対応する標的分子のいずれかは、ビオチン及びストレプトアビジ
ンの組合せを用いて固定化することができる。ビオチン化されたLIG46、LIG56、
Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13、または対応する標的分子は、当技術
分野で周知の方法（例えば、ビオチン化キット Pierce Chemicals; Rockford,
IL）を用いてビオチン-NHS（N-ハイドロキシ-サクシンイミド）から調製でき、
そしてストレプトアビジンをコーティングした96穴プレート（Pierce Chemical
）のウェルに固定化することができる。または、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、
RC10-II、もしくはStra13、または対応する標的分子と反応するが、LIG46、LIG5
6、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13蛋白質がその標的分子に結合するのを
妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され、非結合標的分子また
はLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13を抗体複合体によっ
てウェル中で捕捉することもできる。GST-固定化複合体について上記の方法とは
別に、このような複合体を検出するための方法には、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-
47、RC10-II、もしくはStra13、または対応する標的分子と関連した酵素活性の
検出に依存している酵素結合解析、ならびにLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10
-II、もしくはStra13、または対応する標的分子と反応する抗体を用いた複合体
の免疫検出法が含まれる。
【０１８５】 別の態様においては、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、またはStra13
の発現におけるモデュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、細胞中におけ
るLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13 mRNA、または蛋白質
の発現を検出する細胞ベースのアッセイ法において同定される。候補化合物が存
在する場合のLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13 mRNA、ま
たは蛋白質の発現レベルは、候補化合物が存在しない場合のLIG46、LIG56、Tgtp
、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13 mRNAまたは蛋白質の発現レベルと比較され
る。次にこの比較結果に基づいて、候補化合物をLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、
RC10-II、またはStra13の発現におけるモデュレーターとして同定することがで
きる。例えば、LIG46 mRNAまたは蛋白質の発現が、候補化合物が存在下において
非存在下よりも多い（統計学的に有意に多い）場合、その候補化合物がLIG46 mR
NAまたは蛋白質発現の刺激物質として同定される。または、LIG46 mRNAまたは蛋
白質の発現が、候補化合物の存在下において非存在下よりも少ない（統計学的に
有意に少ない）場合、その候補化合物がLIG46 mRNAまたは蛋白質発現の阻害物質
として同定される。細胞内でのLIG46 mRNAまたは蛋白質の発現レベルは、LIG46
mRNAまたは蛋白質を検出するための本明細書に記載された方法によって検出する
ことができる。
【０１８６】 もう一つの態様において、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-IIまたはStra1
3活性のモデュレーターは、細胞を候補化合物に接触させて、細胞におけるLIG46
、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-IIまたはStra13 mRNAまたは蛋白質の活性を測定
する、細胞に基づくアッセイ法において同定される。候補化合物の存在下でのLI
G46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-IIまたはStra13 mRNAまたは蛋白質の活性レベ
ルを、候補化合物の非存在下におけるLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-IIま
たはStra13 mRNAまたは蛋白質の活性レベルと比較する。次に、この比較に基づ
いて、候補化合物をLIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-IIまたはStra13活性の
モデュレーターとして同定することができる。
【０１８７】 例えば、LIG46の活性が、候補化合物の存在下において非存在下より大きい（
統計学的に有意に大きい）場合、候補化合物はLIG46 mRNAまたは蛋白質発現の刺
激物質として同定される。または、LIG46の活性が候補化合物の存在下において
非存在下より小さい（統計学的に有意に小さい）場合、候補化合物はLIG46活性
の阻害剤として同定される。
【０１８８】 本発明のさらに別の局面において、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、
またはStra13蛋白質は、ツーハイブリッドアッセイ法またはスリーハイブリッド
アッセイ法（例えば、米国特許第5,283,317号、Zervosら(1993) Cell 72:223〜2
32、Maduraら(1993) J. Biol. Chem. 268: 12046〜12054、Bartelら(1993) Bio/
Techniques 14: 920〜924、Iwabuchiら(1993) Oncogene 8: 1693〜1696、及び国
際公開公報第94/10300号参照）において「ベイト（bait）蛋白質」として用いる
ことができ、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、もしくはStra13と結合し
たり、またはそれらと相互作用する他の蛋白質を同定することができ、および活
性を調節することができる。
【０１８９】 ツーハイブリッドシステムは、分離できるDNA結合ドメインと活性化ドメイン
からなる、最も多い転写因子の調節性質（module nature）に基づいている。簡
単に言うとこのアッセイ法は、2種の異なるDNA構築物を使用する。一つの構築物
では例えば、Stra13のような関心対象の蛋白質のコード遺伝子が、既知の転写因
子（例えば、GAL-4）のDNA結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方
の構築物では、未同定の蛋白質（「プレイ(prey)」または「試料」）をコードし
ており、DNA配列のライブラリーに由来するDNA配列が、既知の転写因子の活性化
ドメインをコードしている遺伝子に融合される。「ベイト（beit）」蛋白質及び
「プレイ」蛋白質が生体内で相互作用して複合体を形成する場合、転写因子のDN
A結合ドメインと活性化ドメインはきわめて近接するようになる。このような近
接は、転写因子に応答する転写調節部位に機能的に結合するリポーター遺伝子（
例えば、LacZ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現を検出することが
でき、機能的な転写因子を含む細胞コロニーが単離でき、かつStra13と相互作用
する蛋白質をコードするクローン遺伝子を得るために用いることができる。
【０１９０】 本発明はさらに、前記のスクリーニング解析によって同定された新規の薬物、
及び本明細書に記載したような治療のためのその使用方法に関する。
【０１９１】B.検出アッセイ法 本明細書において同定したLIG46 cDNA配列およびLIG56 cDNA配列の一部または
断片（および対応する完全な遺伝子配列）を、ポリヌクレオチド試薬として多く
の方法で使用することができる。例えばこれらの配列を用いて：(i)それらの各
遺伝子を染色体上にマッピングし、それにより遺伝性疾患に関連した遺伝子領域
を特定する；(ii)微小生体試料から個体を同定する（組織タイピング）；ならび
に(iii)生体試料の法医学的鑑定を補助することができる。これらの用途につい
ては、以下のサブセクションにおいて説明する。
【０１９２】1. 染色体地図の作製 遺伝子の配列（または配列の一部）が単離されると、この配列を用いて染色体
上の遺伝子の位置をマッピングすることができる。従って、本明細書で説明され
たLIG46核酸分子もしくはLIG56核酸分子、またはそれらの断片を用いて、染色体
上のLIG46遺伝子またはLIG56遺伝子の位置をマッピングすることができる。染色
体に対するLIG46配列またはLIG56配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関
連した遺伝子と関連付ける際の重要な第一工程である。
【０１９３】 簡単に述べると、LIG46遺伝子またはLIG56遺伝子は、LIG46配列またはLIG56配
列からPCRプライマー（好ましくは長さ15〜25bp）を調製することによって、染
色体にマッピングすることができる。LIG46配列またはLIG56配列のコンピュータ
解析を用いて、ゲノムDNAにおいて１個以上のエクソンに及ぶことのないプライ
マーを迅速に選択することができ、その結果増幅過程を複雑にする。次にこれら
のプライマーを、ヒト個体のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリ
ーニングに使用することができる。LIG46配列またはLIG56配列に相当するヒト遺
伝子を含むそれらのハイブリッドのみが、増幅断片を生じる。
【０１９４】 体細胞ハイブリッドは、様々な哺乳動物由来の体細胞（例えばヒト細胞および
マウス細胞）の融合により調製される。ヒト細胞およびマウス細胞のハイブリッ
ドが増殖および分裂すると、これらは次第に無秩序な順番でヒト染色体を失って
いくが、マウス染色体は維持し続ける。特定の酵素を欠いているためにマウス細
胞は増殖できないがヒト細胞は増殖できるような培地を使用することによって、
必要とされる酵素をコードしている遺伝子を含む１種のヒト染色体が維持される
と考えられる。様々な培地を使用することによって、ハイブリッド細胞株のパネ
ルを確立することができる。パネル中の各細胞株は、 単一のヒト染色体または
少数のヒト染色体のいずれか、およびマウス染色体の完全なセットを含み、特定
のヒト染色体に個々の遺伝子をマッピングすることが容易になる(D'Eustachioら
、Science, 220:919〜924(1983))。ヒト染色体の断片のみを含む体細胞ハイブリ
ッドは、転座および欠失を伴うヒト染色体を使用して作製することもできる。
【０１９５】 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割付け
る迅速な方法である。１回の熱サイクルで、１日に３種以上の配列を割付けるこ
とができる。オリゴヌクレオチドプライマーをデザインするためにLIG46配列ま
たはLIG56配列を使用し、特異的染色体由来の断片のパネルにより仮位置確認(su
blocalization)を行うことができる。LIG46配列またはLIG56配列をその染色体に
マッピングするために同様に使用される他のマッピング戦略は、インサイチュー
ハイブリダイゼーション（Fanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6223〜27(1
990))、標識したフロー分取された(flow-sorted)染色体による予備スクリーニン
グ、および染色体に特異的なcDNAライブラリーへのハイブリダイゼーションによ
る予備スクリーニングを含む。
【０１９６】 さらに中期染色体塗沫標本(spread)に、DNA配列の蛍光インサイチューハイブ
リダイゼーション(FISH)を、１工程で正確な染色体位置を提供するために使用す
ることができる。染色体塗沫標本は、紡錘体を破壊する、例えばコルセミドのよ
うな化学物質により分裂が中期で停止された細胞を使用して作製することができ
る。これらの染色体は、短時間トリプシン処理し、その後ギムザ染色することが
できる。各染色体に明暗のバンドパターンが出現し、その結果これらの染色体を
個別に同定することができる。FISH技法は500または600塩基のような短いDNA配
列で使用することができる。しかし、1,000塩基より大きいクローンは、簡単な
検出に十分なシグナル強度を持つ独自の染色体位置に結合している可能性がより
高い。妥当な時間で良好な結果を得るには、好ましくは1,000塩基、より好まし
くは2,000塩基で十分であると考えられる。この技法を検証するためには、Verma
らの著書「ヒト染色体：基本技術マニュアル(Human Chromosomes：A Manual of
Basic Techniques)」(ペルガモン出版社、ニューヨーク、1988年)を参照のこと
。
【０１９７】 染色体マッピングのための試薬を個別に使用し、１個の染色体または染色体上
の一部位に印をつけるか、もしくは、試薬のパネルを用いて複数部位および／ま
たは複数の染色体に印をつけることができる。実際に遺伝子の非コード領域に対
応する物質がマッピングを目的とする場合に好ましい。コード配列は、遺伝子フ
ァミリーにおいて恐らく保存されており、その結果染色体マッピングの間に交差
ハイブリダイゼーションする機会が増大する。
【０１９８】 配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的位置
を遺伝子地図データにより関連づけることができる（このようなデータは、例え
ばV. McKusickの著書、「ヒトのメンデル遺伝（Mendelian Inheritance in Man
）」、（オンライン上のジョンポプキンス大学のWelch Medical Libraryから入
手可）を参照。その後同一染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患の間の関
係を、連鎖解析により同定することができ（物理的に隣接する遺伝子は結びつい
て遺伝する）、これについてはEgelandらの論文（Nature, 325:783〜787(1987)
）に記されている。
【０１９９】 さらにLIG46遺伝子またはLIG56遺伝子に関連した疾患に罹患した個体および罹
患していない個体との間のDNA配列の差異を決定することができる。変異が罹患
した個体の一部または全部において認められるが罹患していない個体では全く認
められない場合には、この変異が恐らくその特定疾患の起因物質であると考えら
れる。罹患した個体および罹患していない個体の比較は一般に、最初に染色体の
構造的変動、例えば染色体塗沫標本から認めることが可能な、もしくは、そのDN
A配列を基にしたPCRによって検出可能な欠失または転座などを探すことに関連し
ている。最終的には、いくつかの個体に由来する遺伝子の完全な配列決定が行わ
れ、変異の存在を確認し、かつ多型から変異を識別することができる。
【０２００】2. 組織タイピング 本発明のLIG46配列またはLIG56配列を用いて、微小生体試料から個体を同定す
ることもできる。例えば米軍では、兵士の識別に制限断片長多型(RFLP)の使用を
考慮している。この技術では、個体のゲノムDNAを、１種以上の制限酵素で消化
し、サザンブロット法においてプローブとし、識別のための独自のバンドを得る
。この方法は、紛失、交換、または盗難の可能性があり明確な識別を行うことが
困難である現行法の「ドッグタッグ」のような欠点がない。本発明の配列は、RF
LPの追加DNAマーカーとして有用である（米国特許第5,272,057号に開示されてい
る）。
【０２０１】 さらに、本発明の配列を用いて、個体ゲノムの選択された部分の実際の塩基毎
のDNA配列を決定する代替技術を提供することができる。従って、本明細書に記
したLIG46配列またはLIG56配列を用いて、この配列の5'および3'末端から２種の
PCRプライマーを調製することができる。その後これらのプライマーを用いて、
個体DNAを増幅し、引き続きそれを配列決定することができる。
【０２０２】 各個体は対立遺伝子の相違に起因するようなDNA配列の独自のセットを有する
ので、前述の方法で作成された個体に由来する対応するDNA配列のパネルは、独
自の個体の識別を提供することができる。本発明の配列を用し、個体および組織
から、このような識別配列を得ることができる。本発明のLIG46配列またはLIG56
配列は、ヒトゲノムの一部を独自に示している。対立遺伝子の変動は、これらの
配列のコード領域にはある程度生じ、非コード領域により多く生じる。ヒト個体
間の対立遺伝子の変動は、500塩基当たりおよそ１個の頻度で生じると推定され
る。本明細書に記した各配列は、識別を目的として、個体由来のDNAを比較する
ための標準としてかなり使用される。非コード領域により多くの多型が生じるの
で、個体の識別に必要な配列は非常に少ない。配列番号：１の非コード配列は、
各々が100塩基の増殖された非コード配列を生じるおそらく10〜1,000個のプライ
マーのパネルにより、明確な個体の同定を容易に提供することができる。配列番
号：3のような推定コード配列が使用される場合、明確な個体識別にとってより
適切な数のプライマーは、500〜2,000であると考えられる。
【０２０３】 本明細書に記したLIG46配列またはLIG56配列由来の試薬のパネルを用いて個体
に関する独自の識別用データベースを作成する場合、個体由来の組織を同定する
ために、これらの同じ物質を後に使用することができる。独自の識別用データベ
ースを使用し、生死にかかわらず個体の明確な識別を、極めて少量の組織試料に
より行うことができる。
【０２０４】3. 法医生物学における部分的LIG46配列または部分的LIG56配列の使用 DNAベースの識別法は、法医生物学においても使用することができる。法医生
物学とは、例えば犯罪加害者の明確な識別の手段として、犯罪現場で見つかった
生物学的証拠の遺伝子タイピングを使用する科学的分野である。このような識別
をするために、PCR法が用いられ、例えば犯罪現場で見つかった毛髪もしくは皮
膚などの組織、または血液、唾液もしくは精液などの体液のような非常に小さい
生体試料から得られたDNAが増幅される。その後増幅された配列は、標準と比較
され、それにより生体試料の起源の識別が可能になる。
【０２０５】 本発明の配列を用いて、ヒトゲノムの特定の座を標的化したポリヌクレオチド
試薬、例えばPCRプライマーなどを提供することができ、これは、例えば別の「
識別マーカー」（すなわち、特定の個体に特有の別のDNA配列）を提供すること
によって、DNAベースの法医学的識別の信頼性を増すことができる。前述のよう
に、実際の塩基配列情報を、制限酵素が作出した断片によって形成されたパター
ンに対する正確な代用物として識別に用いることができる。配列番号：１の非コ
ード領域を標的化した配列は、より多数の多型が非コード領域に生じるので、こ
のような使用に特に適しており、この方法を用いることで個体識別がより簡便と
なる。ポリヌクレオチド物質の例は、LIG46配列もしくはLIG56配列、またはそれ
らの一部を含み、例えば少なくとも20〜30塩基長を有する配列番号：１の非コー
ド領域に由来する断片を含む。
【０２０６】 さらに本明細書に記載したLIG46配列またはLIG56配列を使用して、例えば脳組
織のような特定の組織を識別するためのインサイチューハイブリダイゼーション
法などにおいて使用することができるようなポリヌクレオチド試薬、例えば標識
または非標識のプローブなどを提供することができる。これは、法医病理学者が
出自が明らかでない組織を提示した場合に非常に有用である。このようなLIG46
プローブまたはLIG56プローブのパネルを用いて、種別および／または臓器型別
に組織を同定することができる。
【０２０７】 同様の方法で、これらの物質、例えばLIG46もしくはLIG56プライマー、または
プローブなどを、組織培養物の夾雑物に関するスクリーニングに使用することが
できる（すなわち培養物中の異なる細胞種の混在のスクリーニング）。
【０２０８】 本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これらは限定するもの
と解釈されるべきではない。本出願全体にわたって引用されている全ての参考文
献、特許および公開されている特許出願の内容は参照として本明細書に組み入れ
られている。
【０２０９】 実施例 実施例１：レプチンにより誘導される遺伝子の同定 本発明のレプチンにより誘導される遺伝子は、レプチン処理されたOB-RL発現
マウス・神経細胞の発現パターンを、OB-RLを発現しないこと以外は同一の、処
理された細胞の発現パターンと比較することにより同定された。
【０２１０】 Ob受容体発現神経細胞の調製 長鎖型のマウスOB受容体（ObR-L）（Bauman et al.(1996) Proc.Nat'l.Acad.S
ci.USA 93:8374-78）を発現するアデノウイルス・ベクターを、標準的な技術に
より調製した。このベクターを保持する高力価ウイルス・ストックを調製し、GT
1-7マウス・神経細胞へ感染させるために使用した。感染細胞を標準的な増殖培
地中で48時間インキュベートし、次いで標識されたレプチンの結合を測定するこ
とによりObR-L発現について試験した（(1995) Cell 83:1263-71）。このアッセ
イ法により、感染細胞がObR-Lを発現することが証明された。
【０２１１】 サブトラクティッド・ライブラリーの調製 前記のObR-L発現マウス・神経細胞を、無血清培地中で増殖させることにより4
時間飢餓状態にした。飢餓細胞の試料を、200ng/mlのマウス・レプチンの存在下
で3時間インキュベートすることにより刺激した。飢餓細胞の第二の試料を、偽
刺激した。両細胞試料から全RNAを単離し、SMART PCR（商標）cDNA合成キット（
Clontech,Inc.；Palo Alto,CA）を使用してcDNAを作出するために使用した。前
記のようにして作出された（非処理細胞及びレプチン処理細胞から採取された全
RNAから生成した）2つのcDNAプールを、クロンテックPCR−セレクトcDNAサブト
ラクション・キット（Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit）（Clontech
,Inc.）を使用して、サブトラクティッド・ライブラリーを作出するために使用
した。
【０２１２】 サブトラクティッド・ライブラリーのスクリーニング及び陽性クローンの分析 サブトラクティッド・ライブラリー内のクローンを、T/Aベクター・プラスミ
ドT-Adv（Advantage PCR Cloning Kit；Clontech,Inc.）中にクローニングした
。プラスミド特異的隣接プライマーを、ライブラリーからcDNA挿入配列をPCR増
幅するために使用した。次いで、PCR産物を、ナイロン膜上にマイクロアレイを
作出するために使用した。マイクロアレイをサブトラクティッド・ライブラリー
由来の標識されたcDNAで検索した。マイクロアレイ上で同定された陽性クローン
を配列決定し、陽性クローンのディファレンシャルな発現を、最初の処理試料及
び非処理試料（最初の細胞試料から生成したサブトラクション前のcDNA）に対す
る実際のノーザン分析により確認した。さらに、ノーザンブロッティングにより
、脳及び末梢組織における分布について、これらのクローンのサブセットを分析
した。
【０２１３】 新規な遺伝子を表すと考えられる2つの陽性クローンを、全長クローンを同定
するため、マウス脳ライブラリー全体を検索するために使用した。その結果、LI
G46及びLIG56が同定された。
【０２１４】 前記のようにして同定されたレプチンにより誘導される遺伝子のうちの6個、L
IG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、及びSrta13について、以下にさらに詳細
に記載する。
【０２１５】 実施例2：マウス及びヒトのLIG46のcDNA及び蛋白質の特徴決定 前記のようにして単離されたLIG46 cDNA（配列番号：1）は、397アミノ酸の蛋
白質（配列番号：2）をコードする、1191ヌクレオチドのオープン・リーディン
グ・フレーム（配列番号：1のヌクレオチド＿〜＿；配列番号：3）を有する。こ
の蛋白質は、約32アミノ酸の推定シグナル配列（配列番号：2の1位アミノ酸から
約32位アミノ酸）及び約365アミノ酸の推定成熟蛋白質（配列番号：2の約33位ア
ミノ酸から397位アミノ酸；配列番号：4）を含む。LIG46の細胞外ドメインは、
約33位アミノ酸から約302位アミノ酸までに相当する。LIG46蛋白質は、配列番号
：2の約303位アミノ酸（細胞外側末端）から約320位アミノ酸（細胞内側末端）
までに相当する一つの推定膜貫通ドメインを保有している。LIG46の細胞質ドメ
インは、約321位アミノ酸から約397位アミノ酸に相当する。
【０２１６】 LIG46蛋白質は、多数のガラクトシルトランスフェラーゼと、ある程度の配列
類似性を有している。ガラクトシルトランスフェラーゼは、発生の過程に関与し
ていることが示されている。さらに、ガラクトシルトランスフェラーゼは、細胞
表面受容体の炭水化物レパートリーを修飾し、受容体の活性を活性化、阻害、又
は他の様式で（例えば、リガンドとの受容体の親和性を改変することにより）修
飾することにより、細胞間シグナル伝達において役割を果たしている可能性があ
る。従って、LIG46は、体重制御に関与している分子、例えばレプチンにより媒
介される細胞間シグナル伝達に影響を及ぼすことにより、体重制御において役割
を果たしている可能性がある。
【０２１７】 配列番号：2のLIG46ポリペプチド配列は、アミノ酸30〜33、79〜82、89〜92、
127〜173、及び219〜222位に潜在的N-グリコシル化部位を含み、アミノ酸54〜56
、202〜204、221〜223、323〜325、及び377〜379位に潜在的プロテインキナーゼ
Cリン酸化部位を含み、アミノ酸31〜34、94〜97、185〜188、221〜224、234〜23
7、及び368〜371位に潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位を含み、アミノ酸1
15〜122位に潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位を含み、アミノ酸3〜6位に潜
在的アミド生成部位を含む。
【０２１８】 LIG46の一部は、いくつかのガラクトシルトランスフェラーゼと類似している
。図2は、LIG46のアミノ酸配列の一部と、ハツカネズミ（Mus musculus）UDP-Ga
l:βGlcNAcβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ-I（受入番号AF029790；配列
番号：＿）、ハツカネズミIPP-Gal:βGlcNAcβ1,3-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ-III（受入番号AF029792）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanog
aster）神経分泌シグナル伝達蛋白質（受入番号U41449；配列番号：＿）、及び
ヒトUDP-ガラクトース:2-アセトアミド-2-デオキシ-D-グルコース3β−ガラクト
シルトランスフェラーゼ（受入番号Y15014；配列番号：＿）を含む多数のガラク
トシルトランスフェラーゼの一部との一連のアラインメントを示す。多数派配列
（majority sequence）は、実線の上に図示されている。保存された残基は影付
きになっている。これらの残基は、LIG46の機能的変異体において保存されてい
る可能性が比較的高い。
【０２１９】 図3は、LIG46のハイドロパシー・プロットである。相対疎水性が点線の上に示
されており、相対親水性が点線の下に示されている。
【０２２０】 図7は、全長ヒトLIG46クローンのcDNA配列を示す。図8は、ヒトLIG46の推定ア
ミノ酸配列を示す。図7に図示されたヒトLIG46 cDNA（配列番号：＿）は、397ア
ミノ酸の蛋白質（配列番号：＿）をコードする1191ヌクレオチドのオープン・リ
ーディング・フレームを有する。この蛋白質は、約32アミノ酸の推定シグナル配
列（配列番号：＿の1位アミノ酸から約32位アミノ酸）及び約365アミノ酸の推定
成熟蛋白質（配列番号：＿の約33位アミノ酸から397位アミノ酸；配列番号：＿
）を含む。図9は、ヒトLIG46（上の配列）及びマウスLIG46（下の配列）のcDNA
配列のアラインメントを示す。図10は、ヒトLIG46（上の配列）及びマウスLIG46
（下の配列）の推定アミノ酸配列のアラインメントを示す。
【０２２１】 LIG46のゲノム・マッピング LIG46は、ヒト第2染色体のホワイトヘッド・インスティチュート（Whitehead
Institute）フレームワーク・マーカーD2S290の17.9 cR3000テロメア（telomeri
c）（LODスコア＝15.5）及びホワイトヘッド・フレームワーク・マーカーWI-613
0の23.5 cR3000セントロメア（centromeric）（LODスコア＝13.6）にマッピング
された。この領域は、アルストレーム症候群（Macari et al.(1998) Human Gene
t.103:658-61）に関する最小区間の内側又はわずかに外側の細胞学的位置2p12-1
3に相当する。アルストレーム症候群とは、小児期の肥満、網膜色素変性、神経
難聴、非インスリン依存性糖尿病、慢性腎症、及び高脂血症により特徴づけられ
る常染色体劣性障害である。その他の症状には、心筋症、黒色表皮症、甲状腺機
能低下症、成長ホルモン欠損、進行性禿頭症、高尿酸血症、女性化乳房、及び受
精能の減少が含まれる（Russell-Eggitt et al.(1998) Ophthalmology 105:1274
-80）。
【０２２２】 簡単に説明すると、LIG46遺伝子は、ジーンブリッジ4ラディエーション・ハイ
ブリッド・パネル（Genebridge 4 Radiation Hybrid Panel）を使用してマッピ
ングされた。LIG46の3'非翻訳領域内の一対のプライマー（フォワード−CCATGTT
GGGGTCTCACATTAGAG、配列番号：＿；及びリバース−GGTAAGTCAGACCAATATCCTGCC
、配列番号：＿）を、ジーンブリッジ4パネルからDNAを増幅するため使用した。
PCR産物を2％アガロースゲルにて泳動し、SYBRゴールドで染色し、スキャンした
。連鎖解析を、マップ・マネージャーQT623ソフトウェア・パッケージを使用し
て実施した。
【０２２３】 LIG46核酸分子は、アルストレーム症候群の診断において使用されうる。さら
に、LIG46の変異は、アルストレーム症候群を引き起こす可能性がある。もしそ
うであれば、LIG46のポリペプチド及び核酸分子、並びにLIG46に対する抗体及び
LIG46の発現又は活性のモデュレーターが、アルストレーム症候群及び／又はア
ルストレーム症候群の様々な症状を治療するために使用されうる。
【０２２４】 実施例3：LIG46 mRNAの分布 マウス組織におけるLIG46の発現を、ノーザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンを使用して分析した。全組織ブロットの分析により、LIG46が最も高レベル
で発現しているのは心臓及び肝臓であり、次が肺及び腎臓、次が脳、次が脾臓、
精巣、及び骨格筋であることが明らかとなった。マウス脳におけるLIG46発現の
分析により、LIG46が、少なくとも視床下部（弓状核、腹／内側視床下部、及び
視交叉上核を含む）、海馬、皮質、及び線条において発現していることが明らか
となった。
【０２２５】 実施例4：LIG46の分泌 LIG46蛋白質は、分泌型蛋白質であるキイロショウジョウバエbrainiac（Goode
et al.,(1996) Development 122:3863-79）と相同である（図2）。前述のよう
に、LIG46は、アミノ末端に推定シグナル配列を有する。従って、LIG46蛋白質が
分泌型であるか否かを決定するため、以前に記載された方法と類似の方法を使用
して、全長LIG46（アミノ酸1〜397）をアルカリホスファターゼと融合させた(LI
G46のカルボキシ末端での融合；Cheng and Flanagan (1994) Cell 79:157-168；
Tartaglia et al.(1995) Cell 83:1263-71)。この構築物を、ヒト293T細胞へ一
過性トランスフェクトした。
【０２２６】 トランスフェクションから48時間後、グレート・エスケープ（Great EscAPe）
アルカリホスファターゼ検出キット（Clontech,Inc.）を使用して、増殖培地を
アルカリホスファターゼ活性についてアッセイした（White et al.,(1997) Proc
.Natl.Acad.Sci USA 94:10657-10662）。トランスフェクトされた細胞からの増
殖培地においては、偽トランスフェクトされた細胞と比較して、アルカリホスフ
ァターゼ活性の大きな増加が観察され、このことから、LIG46蛋白質が分泌型で
あること、及びLIG46のシグナル配列が機能性であることが示された。
【０２２７】 実施例5：LIG46発現はインビボでレプチンにより誘導される C57BL6 ob/obマウスに、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（偽注射）又は100μg
のレプチン（R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN）が補添されたPBS（レプチン注
射）のいずれか100μlを（腹腔内（IP））注射した。1時間又は3時間の処理の後
、CO２窒息により動物を安楽死させ、脳を採取し、切片化し、LIG46のコード領
域に対する386塩基対の放射性標識されたアンチセンス・プローブを使用したイ
ンサイチュー・ハイブリダイゼーションにより、視床下部を分析した。偽注射動
物及びレプチン注射動物由来の視床下部切片の比較分析は、LIG46転写物が、レ
プチンにより弓状核及び腹内側視床下部において誘導されることを示している。
【０２２８】 実施例6：肥満（ob/ob）雄マウスの摂食に対するLIG46アンチセンス・オリゴ
デオキシヌクレオチドの作用 この研究のため、ホスホチオエート（phosphothioate）保護されたアンチセン
ス・オリゴデオキシヌクレオチド及びその各対照配列（センス）を合成した。ア
ンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチドは、39位のLIG46開始コドンmRNAを標
的とする。 雄肥満ob/ob C57BL/6J（45g）マウスを、マクロロン（macrolon）ケージ（22&p
lusmn;2℃；6pm消灯の12：12h明／暗周期）に個別に収容した。水道水及びマウ
ス飼料を自由に摂取させた。この実験の1週間前に、第3脳室（脳室内）を照準と
した長期的ガイドカニューレをマウスに定位移植した。
【０２２９】 レプチンにより誘導される食事摂取の減少に対するLIG46アンチセンス処理の
効果を、5日目に研究した。従って、1日目及び3日目に、18μgのLIG46アンチセ
ンス・オリゴデオキシリボヌクレオチド、18μgのセンス（対照）オリゴデオキ
シリボヌクレオチド、又は2μlのRNAse非含有水で、マウスを脳室内処理した。
脳室内注射は3pmに実施した。対照及びオリゴデオキシリボヌクレオチドによる
前処理に続き、5日目の5pmに、1mg/kgのレプチン又はリン酸緩衝生理食塩水（媒
体）の腹腔内注射を実施し、レプチン又は媒体の適用からそれぞれ4時間後に食
事の摂取を測定した。この研究の結果を図6に示す。レプチンにより誘導される
食事摂取の減少は、LIG46センス・ヌクレオチド又はPBS対照の存在下よりもLIG4
6アンチセンス・オリゴヌクレオチドの存在下の方がはるかに大きかった。
【０２３０】 実施例7：痩せ雄マウスの摂食に対するLIG46アンチセンス・オリゴデオキシヌ クレオチドの作用 この研究のため、ホスホチオエート保護されたアンチセンス・オリゴデオキシ
ヌクレオチド及びその各対照配列（センス）を合成した。アンチセンス・オリゴ
デオキシヌクレオチドは、39位のLIG46開始コドンmRNAを標的とする。 痩せ雄C57BL/6J（24g）マウスをマクロロンケージ（22±2℃；6pm消灯の1
2：12h明／暗周期）に個別に収容した。水道水及びマウス飼料を自由に摂取させ
た。この実験の1週間前に、第三脳室（脳室内）を照準とした長期的ガイドカニ
ューレをマウスに定位移植した。
【０２３１】 レプチンにより誘導される食事摂取の減少に対するLIG46アンチセンス処理の
作用を、5日目に研究した。従って、1日目及び3日目に、18μgのLIG46アンチセ
ンス・オリゴデオキシリボヌクレオチド、18μgのセンス（対照）オリゴデオキ
シリボヌクレオチド、又は2μlのRNAse非含有水で、マウスを脳室内処理した。
脳室内注射は3pmに実施した。対照及びオリゴデオキシリボヌクレオチドによる
前処理に続き、5日目の5pmに、1mg/kgのレプチン又はリン酸緩衝生理食塩水（媒
体）の腹腔内注射を実施し、レプチン又は媒体の適用からそれぞれ4時間後に食
事の摂取を測定した。この研究の結果を図11に示す。LIG46アンチセンスにより
誘導される食事摂取の減少は、PBS対照の存在下よりもレプチンの存在下の方が
はるかに大きかった。従って、LIG46蛋白質発現を減少させることにより、痩せ
マウスにおいて食事摂取を減少させることができる。さらに、レプチンを投与し
た場合、この食事摂取の減少は増加し、このことから、レプチンがLIG46アンタ
ゴニストの作用に対する痩せマウスの感受性を高めうることが証明された。
【０２３２】 実施例8：LIG56のcDNA及び蛋白質の特徴決定 前記のようにして単離された全長LIG56 cDNA（配列番号：5）は、図4に示され
ている。このcDNAは、400アミノ酸の蛋白質（配列番号：6）をコードする1200ヌ
クレオチドのオープン・リーディング・フレーム（配列番号：5のヌクレオチド1
〜1200位；配列番号：7）を有する。
【０２３３】 配列番号：6のLIG56ポリペプチド配列は、アミノ酸252〜255位に潜在的N-グリ
コシル化部位を含み、アミノ酸67〜69、75〜77、203〜205、218〜220、295〜297
、及び299〜301位に潜在的プロテインキナーゼCリン酸化部位を含み、アミノ酸1
26〜129、170〜173、203〜206、256〜259、291〜294、341〜344、及び345〜349
位に潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位を含み、アミノ酸233〜241位に潜在
的チロシンキナーゼリン酸化部位を含み、アミノ酸66〜71、85〜90、116〜121、
及び308〜313位に潜在的N-ミリストイル化部位を含み、アミノ酸63〜70位に潜在
的アミド生成部位を含む。
【０２３４】 LIG56は、GTP結合蛋白質である可能性がある。LIG56蛋白質の一部は、一つ又
は複数のマウスGTP結合蛋白質（ジェンバンク受入番号：L38444；U15636；M6363
0；U19119；及びU53219）と類似している。
【０２３５】 LIG56蛋白質は、GTP結合蛋白質様ドメイン（配列番号：6のアミノ酸12から283
位）及びLRG-47様ドメイン（配列番号：6のアミノ酸24〜177位）を保有している
。
【０２３６】 図5は、LIG56のハイドロパシー・プロットである。相対的疎水性が点線の上に
示されており、相対的親水性が点線の下に示されている。
【０２３７】 実施例9：LIG56 mRNAの分布 マウス組織におけるLIG56の発現を、ノーザンブロット・ハイブリダイゼーシ
ョンを使用して分析した。全組織ブロットの分析により、LIG56が最も高レベル
に発現しているのは心臓であり、次が肝臓であり、次が腎臓、次が肺、次が骨格
筋、次が脾臓であることが明らかとなった。マウス脳におけるLIG56発現の分析
により、LIG56が少なくとも海馬（少なくとも歯状回を含む）において発現して
いることが明らかとなった。
【０２３８】 実施例10：クローン50（Tgtp）の特徴決定及びmRNA分布 前記のマイクロアレイにおいて同定されたクローン50の配列分析により、この
クローンが、T細胞特異的グアニンヌクレオチド三リン酸結合蛋白質であるマウ
スTgtp（ジェンバンク受入番号L38444）（Carlow et al.(1994) J.Immunol.154:
1724-34）をコードすることが明らかとなった。
【０２３９】 マウス組織におけるクローン50の発現を、ノーザンブロット・ハイブリダイゼ
ーションを使用して分析した。全組織ブロットの分析により、クローン50が最も
高レベルに発現しているのは心臓であり、次が腎臓、次が肺及び骨格筋、次が肝
臓であることが明らかとなった。マウス脳におけるクローン50発現の分析により
、クローン50が少なくとも脈絡叢において発現していることが明らかとなった。
【０２４０】 実施例11：クローン44（LRG-47）の特徴決定及びmRNA分布 前記のマイクロアレイにおいて同定されたクローン44の配列分析により、この
クローンが、LPS、IFN-γ、及びIFN-α/βにより誘導される、GTP結合蛋白質と
のある程度の相同性を有する蛋白質であるマウスLRG-47（ジェンバンク受入番号
U19119）（Sorace et al.(1995) J.Leukocyte Biol.58:477-84）をコードするこ
とが明らかとなった。
【０２４１】 マウス組織におけるクローンLRG-47 mRNAの発現を、ノーザンブロット・ハイ
ブリダイゼーションを使用して分析した。全組織ブロットの分析により、LRG-47
が最も高レベルに発現しているのは心臓であり、次が腎臓、次が肝臓、次が骨格
筋、次が肺、次が脾臓であることが明らかとなった。マウス脳におけるLRG-47 m
RNA発現の分析により、LRG-47が、少なくとも皮質、海馬、脈絡叢、内側手綱核
、及び視床下部（少なくとも弓状核及び室傍核を含む）において発現しているこ
とが明らかとなった。
【０２４２】 実施例12：LRG-47はインビボでレプチンにより誘導される C57BL6 ob/obマウスに、PBS又は100μgのレプチン（R&D Systems Inc.）が補
添されたPBSのいずれか100μlを（IP）注射した。60分後、CO２窒息により動物
を安楽死させ、脳を採取し、切片化し、LRG-47転写物の5'非翻訳領域内の配列に
対する762塩基対の放射性標識されたアンチセンス・プローブを使用したインサ
イチュー・ハイブリダイゼーションにより、視床下部を分析した。偽注射動物及
びレプチン注射動物由来の視床下部切片の比較分析は、LRG-47転写物が、レプチ
ンにより弓状核において誘導されることを示しており、このことから、LRG-47転
写物がインビボでレプチンにより誘導される遺伝子であることが証明された。
【０２４３】 実施例13：クローン10（RC10-11）の特徴決定及びmRNA分布 前記のマイクロアレイにおいて同定されたクローン10の配列分析により、この
クローンが、ラット胎児脳の20SプロテアソームのサブユニットであるマウスRC1
0 II（ジェンバンク受入番号D21800）（Nishimura et al.(1993) FEBS Lett.336
:462-66）をコードすることが明らかとなった。RC10-IIは、トリプシン活性の発
現にとって必要なプロテアソームのサブユニットであることが示唆されている（
Nishimura et al.、前記）。
【０２４４】 マウス組織におけるクローン10 mRNAの発現を、ノーザンブロット・ハイブリ
ダイゼーションを使用して分析した。全組織ブロットの分析により、クローン10
が最も高レベルに発現しているのは心臓、肝臓、骨格筋、及び腎臓であり、次が
脳、肺、及び精巣であることが明らかとなった。マウス脳におけるクローン10 m
RNA発現の分析により、クローン10が、少なくとも皮質、海馬、手綱核、視床、
及び視床下部（弓状核及び腹内側視床下部を含む）において発現していることが
明らかとなった。
【０２４５】 実施例14：クローン67（Stra13）の特徴決定及びmRNA分布 前記のマイクロアレイにおいて同定されたクローン67の配列分析により、この
クローンが、レチン酸により誘導されうるヘリックス-ループ-ヘリックス・蛋白
質であるStra13（ジェンバンク受入番号AF010305）（Boudjelal et al.(1997) G
enes Dev.11:2052-65）をコードすることが明らかとなった。Stra13は、活性化
された転写のリプレッサーとして機能する可能性があり、ニューロン分化に役割
を果たしていると考えられている（Boudjelal et al.、前記）。
【０２４６】 マウス組織におけるクローン67 mRNAの発現を、ノーザンブロット・ハイブリ
ダイゼーションを使用して分析した。全組織ブロットの分析により、クローン10
が最も高レベルに発現しているのは肝臓であり、次が心臓、次が骨格筋、次が脳
、次が腎臓であることが明らかとなった。マウス脳におけるクローン67 mRNA発
現の分析により、クローン67が、少なくとも皮質、海馬（CA1、CA2、及び歯状回
）、外側視床、視床下部（弓状核）において発現していることが明らかとなった
。
【０２４７】 実施例15：Stra13はインビボでレプチンにより誘導される C57BL6 ob/obマウスに、PBS又は100μgのレプチン（R&D Systems Inc.）が補
添されたPBSのいずれか100μlをIP注射した。60分後、CO２窒息により動物を安
楽死させ、脳を採取し、切片化し、LRG-47転写物の5'非翻訳領域内の配列に対す
る328塩基対の放射性標識されたアンチセンス・プローブを使用したインサイチ
ュー・ハイブリダイゼーションにより、視床下部を分析した。偽注射動物及びレ
プチン注射動物由来の視床下部切片の比較分析は、Stra13転写物がレプチンによ
り弓状核において誘導されることを示しており、このことから、Stra13転写物が
インビボでレプチンにより誘導される遺伝子であるという主張が支持された。
【０２４８】 実施例16：LIG46活性に関するアッセイ法 LIG46はガラクトシルトランスフェラーゼであると考えられるため、グリコシ
ルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼ・ファミリーのメ
ンバーの活性を測定するために使用されるアッセイ法（例えば、Hennet et al.(
1998) J.Biol Chem 1998 273:58-65;Current Protocols in Molecular Biology
(1993) Ausbel et al.編,Wiley Interscience (New York)；及びWandall et al.
(1997) J.Biol Chem 272(38):23503-14を参照のこと）を使用して、LIG46活性の
モデュレーターを同定することが可能であると考えられる。当然、LIG46により
使用されるドナー基質及びアクセプター基質は、以前の文献に記載されたものと
は異なるかもしれない。当業者であれば、グリコシルトランスフェラーゼおよび
ガラクトシルトランスフェラーゼ・ファミリーの他のメンバーについて使用され
たアッセイ法を、LIG46に関する使用に適合させることが可能である。
【０２４９】等価物 当業者は、通常の実験から、本明細書に記された本発明の具体的な態様の多く
の等価物を認めるか、もしくは確かめることができると思われる。このような等
価物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 マウスLIG46のcDNA配列（配列番号：１）および推定アミノ酸配
列（配列番号：２）を示す。
【図２】 LIG46のアミノ酸配列と、以下を含む、多くのガラクトシルトラ
ンスフェラーゼの一部との一連のアラインメントを示す：（上から下に）ハツカ
ネズミ（Mus musculus）UDP-Gal：βGlcNAcβ1,3-ガラクトシルトランスフェラ
ーゼ-I（受入番号AF029790；配列番号： ）；ハツカネズミIPP-Gal；βGlcNAc
β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ-III（受入番号AF029792）；ドロソフィ
ラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）神経原性分泌シグナル伝達蛋
白質（「ブレイニアック（Brainiac）」；受入番号U41449；配列番号： ）；お
よびヒト（Homo sapiens）UDP-ガラクトース：2-アセタミド-2-デオキシ-D-グル
コース3β-ガラクトシルトランスフェラーゼ（受入番号Y15014；配列番号： ）
。実線の上のアミノ酸配列は主配列である。
【図３】 LIG46のハイドロパシープロットである。推定される膜貫通ドメ
イン（TM）の位置、細胞質ドメイン（IN）、および細胞外ドメイン（OUT）の位
置は、システインの位置として示す（cys；プロットのすぐ下の垂直の棒）。相
対的な疎水性は、破線の上に示し、相対的な親水性は破線の下に示す。
【図４】 マウスLIG56のcDNA配列（配列番号：５）および推定アミノ酸配
列（配列番号：６）を示す。
【図５】 LIG56のハイドロパシープロットである、相対的疎水性を破線の
上に示し、相対的親水性を破線の下に示す。
【図６】 レプチンの存在下および非存在下における雄性肥満（ob/ob）マ
ウスの食物摂取に及ぼすLIG46のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド
の作用を示すグラフである。
【図７】 ヒトLIG46のcDNA配列を示す。
【図８】 ヒトLIG46の推定アミノ酸配列を示す。
【図９】 ヒトLIG46（上の配列）とマウスLIG46（下の配列）のcDNA配列と
のアラインメントを示す。
【図１０】 ヒトLIG46（上の配列）とマウスLIG46（下の配列）の推定アミ
ノ酸配列とのアラインメントを示す。
【図１１】 レプチンの存在下および非存在下における雄性の痩せたマウス
の食物摂取に及ぼすLIG46のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの作
用を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 3/04 Ｃ１２Ｎ 9/10 ４Ｃ０８５ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｎ 5/10 1/68 Ａ ４Ｈ０４５ 9/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/566 (Ｃ１２Ｑ 1/02 //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０９／１９５，８９６ (32)優先日 平成10年11月19日(1998．11．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／２９２，２２８ (32)優先日 平成11年４月15日(1999．4．15) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 タータグリア ルイス エー． アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ウ ォータータウン クーリッジ ヒル ロー ド 104 アパートメント ６ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 CB01 CB17 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB05 4B024 AA11 BA10 BA63 BA80 CA04 DA02 EA04 FA17 GA11 HA11 HA12 4B050 CC03 DD07 LL03 4B063 QA01 QA20 QQ08 QQ43 QQ44 QR08 QR32 QR42 QR56 QR66 QS25 QS34 QX02 4B065 AA91X AA91Y AB01 BA02 CA24 CA29 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 AA17 BA44 CA17 NA14 ZA70 4C085 AA14 BB11 CC32 4C086 AA01 AA03 EA16 NA14 ZA70 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA45 DA89 EA50 FA74

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の段階を含む、ある化合物を、体重を調節するために用
    いることができるか否かを決定する方法： a） 化合物の存在下および非存在下において、細胞試料中のLIG46、LIG56、T
    gtp、LRG-47、RC10-II、およびStra13からなる群より選択される１つまたは複数
    の遺伝子の発現レベルを測定する段階；ならびに b） 化合物の存在下において、選択した１つまたは複数の遺伝子の発現レベ
    ルが、化合物の非存在下における、選択した１つまたは複数の遺伝子の発現レベ
    ルと異なれば、化合物が体重を調節するために有用であると同定される段階。
  2. 【請求項２】 細胞試料中の細胞が神経細胞である、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 細胞がOb受容体を発現する、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 発現がレプチンの存在下で測定される、請求項３記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 以下の段階を含む、ある化合物を、体重を調節するために用
    いることができるか否かを決定する方法： a） 化合物の存在下および非存在下において、試料中のLIG46、LIG56、Tgtp、L
    RG-47、RC10-II、およびStra13からなる群より選択される１つまたは複数の蛋白
    質の活性を測定する段階；ならびに b） 化合物の存在下において、選択した１つまたは複数の蛋白質の活性が、
    化合物の非存在下において、選択した１つまたは複数の蛋白質の活性と異なれば
    、化合物が体重を調節するために有用であると同定される段階。
  6. 【請求項６】 試料が細胞を含み、上記細胞が神経細胞である、請求項５記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 細胞がOb受容体を発現する、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 活性がレプチンの存在下で測定される、請求項７記載の方法
    。
  9. 【請求項９】 以下の段階を含む、ある化合物を、体重を調節するために用
    いることができるか否かを決定する方法： a） 化合物で処置した哺乳類から単離した細胞の試料および無処置哺乳類か
    ら単離した細胞の試料において、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、およ
    びStra13からなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の発現レベルを測定
    する段階；ならびに b） 処置した哺乳類から単離した細胞の試料において、選択した１つまたは
    複数の遺伝子の発現レベルが、無処置哺乳類から単離した細胞の試料において、
    選択した１つまたは複数の遺伝子の発現レベルと異なれば、化合物が体重を調節
    するために有用であると同定される段階。
  10. 【請求項１０】 試料中の細胞が神経細胞である、請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】 哺乳類がマウスである、請求項９記載の方法。
  12. 【請求項１２】 以下の段階を含む、ある化合物を、体重を調節するために
    用いることができるか否かを決定する方法： a） 化合物で処置した哺乳類から単離した細胞の試料および無処置哺乳類か
    ら単離した細胞の試料において、LIG46、LIG56、Tgtp、LRG-47、RC10-II、およ
    びStra13からなる群より選択される１つまたは複数の蛋白質の活性レベルを測定
    する段階；ならびに b） 処置した哺乳類から単離した細胞の試料において、選択した１つまたは
    複数の蛋白質の活性レベルが、無処置哺乳類から単離した細胞の試料において、
    選択した１つまたは複数の蛋白質の活性レベルと異なれば、化合物が体重の調節
    にとって有用であると同定される段階。
  13. 【請求項１３】 試料中の細胞が神経細胞である、請求項12記載の方法。
  14. 【請求項１４】 上記哺乳類がマウスである、請求項12記載の方法。
  15. 【請求項１５】 以下からなる群より選択される単離核酸分子： a） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、もしくは配列番号：７の
    ヌクレオチド配列と少なくとも55％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子
    、またはその相補体： b） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、もしくは配列番号：７の
    ヌクレオチド配列の少なくとも300ヌクレオチドの断片を含む核酸分子、または
    その相補体； c） 配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミノ酸配列を含
    むポリペプチドをコードする核酸分子； d） 断片が配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６の隣接するア
    ミノ酸少なくとも15個を含む、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：
    ６のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片をコードする核酸分子；および e） 核酸分子がストリンジェントな条件で配列番号：１または配列番号：３
    を含む核酸分子とハイブリダイズする、配列番号：２、配列番号：４、または配
    列番号：６のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異
    体をコードする核酸分子。
  16. 【請求項１６】 以下からなる群より選択される、請求項15記載の単離核酸
    分子： a） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、もしくは配列番号：７の
    ヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその相補体；および b） 配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミノ酸配列を含
    むポリペプチドをコードする核酸分子。
  17. 【請求項１７】 ベクター核酸配列をさらに含む、請求項15記載の核酸分子
    。
  18. 【請求項１８】 異種ポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請
    求項15記載の核酸分子。
  19. 【請求項１９】 請求項15記載の核酸分子を含む宿主細胞。
  20. 【請求項２０】 哺乳類の宿主細胞である、請求項19記載の宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 請求項15記載の核酸分子を含むヒト以外の哺乳類宿主細胞
    。
  22. 【請求項２２】 以下からなる群より選択される、単離ポリペプチド： a） 断片が配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６の隣接するア
    ミノ酸少なくとも15個を含む、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：
    ６のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片； b） ポリペプチドが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、または配
    列番号：７を含む核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸
    分子によってコードされる、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６
    のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体； c） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、または配列番号：７のヌク
    レオチド配列を含む核酸と少なくとも55％同一であるヌクレオチド配列を含む核
    酸分子によってコードされるポリペプチド。
  23. 【請求項２３】 配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミ
    ノ酸配列を含む請求項22記載の単離ポリペプチド。
  24. 【請求項２４】 異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項22記載のポリペプ
    チド。
  25. 【請求項２５】 請求項22記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
  26. 【請求項２６】 核酸分子が発現される条件で、ポリペプチドをコードする
    DNA分子を有する宿主を培養する段階を含む、以下からなる群より選択されるポ
    リペプチドを生成する方法： a） 配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミノ酸配列を含
    むポリペプチド； b） 断片が配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６の隣接するアミ
    ノ酸少なくとも15個を含む、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６
    のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片；および c） ポリペプチドが配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、または配列
    番号：７を含む核酸分子とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸分
    子によってコードされる、配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６の
    アミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体。
  27. 【請求項２７】 配列番号：２、配列番号：４、または配列番号：６のアミ
    ノ酸配列を含む、請求項22記載の単離ポリペプチド。
  28. 【請求項２８】 以下の段階を含む、試料中の請求項22記載のポリペプチド
    の有無を検出する方法： a） 請求項22記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物を試料に接触さ
    せる段階；および b） 化合物が試料中のポリペプチドに結合するか否かを決定する段階。
  29. 【請求項２９】 ポリペプチドに結合する化合物が抗体である、請求項28記
    載の方法。
  30. 【請求項３０】 請求項22記載のポリペプチドに選択的に結合する化合物お
    よびその使用説明書を含むキット。
  31. 【請求項３１】 以下の段階を含む、試料中に請求項15記載の核酸分子の有
    無を検出する方法： a） 核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブまたはプライマー
    を試料に接触させる段階；および b） 核酸プローブまたはプライマーが試料中の核酸分子に結合するか否かを
    決定する段階。
  32. 【請求項３２】 試料がmRNA分子を含み、該試料を核酸プローブに接触させ
    る、請求項31記載の方法。
  33. 【請求項３３】 請求項15記載の核酸分子に選択的にハイブリダイズする化
    合物およびその使用説明書を含むキット。
  34. 【請求項３４】 以下の段階を含む、請求項22記載のポリペプチドに結合す
    る化合物を同定する方法： a） 請求項22記載のポリペプチド、または該ポリペプチドを発現する細胞に
    、試験化合物を接触させる段階；および b） ポリペプチドが試験化合物に結合するか否かを決定する段階。
  35. 【請求項３５】 試験化合物のポリペプチドに対する結合が以下からなる群
    より選択される方法によって検出される、請求項34記載の方法： a） 試験化合物／ポリペプチド結合を直接検出することによる結合の検出； b） 競合的結合アッセイ法を用いる結合の検出。
  36. 【請求項３６】 請求項22記載のポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現
    する細胞に、該ポリペプチドの活性を調節するために十分な濃度で該ポリペプチ
    ドに結合する化合物を接触させる段階を含む、請求項22記載のポリペプチドの活
    性を調節する方法。
  37. 【請求項３７】 LIG46、LIG56、Tgtp、LRP-47、RC10-IIおよびStra13から
    なる群より選択される蛋白質の活性の発現を減少させる分子を投与することを含
    む、体重障害を治療する方法。
  38. 【請求項３８】 上記分子がアンチセンス分子である、請求項37記載の方法
    。
  39. 【請求項３９】 レプチンを投与することをさらに含む、請求項37記載の方
    法。
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