JP2002524134A - 粒子分離装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、埋め込まれるかまたは輸送された細胞クラスターの分離装置を提供する。好ましい態様は、ランゲルハンス膵島を生成するインシュリンの単離であるが、本発明は、流体中の他の種類の細胞クラスターや粒子にも使用できる。本発明は、デジタルカメラによって細胞懸濁液を走査する、平坦な表面上または毛細管中での細胞懸濁液のデジタル画像処理に基づいている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、ランゲルハンス島を分離するという特別の目的で、細胞懸濁液から
細胞クラスターを分離する方法に関する。

【０００２】 （背景技術） 糖尿病は、インシュリン産生β細胞の欠陥を特徴とする。β細胞は、外分泌組
織で囲まれたランゲルハンス島に局在している。細胞外グルコースに対するβ細
胞の応答は、通常のグルコース恒常性には必須である。以下の幾つかの目的のた
めに、動物およびヒトの両者から島細胞を単離することが非常に必要とされてい
る；１．内分泌膵臓における基礎的な生理学上および病態生理学上の機構に対す
る研究、２．インシュリン分泌性、潜在的な抗糖尿病薬のスクリーニングおよび
試験、および３．島細胞の同種移植および異物移植。臨床上の島細胞の移植に投
ずる労力は、糖尿病状態を回復させるための適切な島細胞集団を分離するという
課題によって多いに削減される。島細胞を採取するプロセスは、原則的には異な
る２つの段階を伴う。一つ目は、外分泌組織と結合組織のコラゲナーゼ消化であ
り、２つ目は、分散された組織懸濁液からの島細胞の分離である。コラゲナーゼ
消化技術は、以前から知られており、膵臓の管系へのコラゲナーゼ（または別の
解離剤）の注入か、またはコラゲナーゼによる膵臓の小さな部分の処置を伴う（
レイシー・アンド・コスチアノフスキー、1967年）。これによって組織が崩壊す
る。

【０００３】 細胞の崩壊後、外分泌組織から前記島細胞を分離するのに、幾つかの異なる方
法が用いられる。これは、特に、以下のことを包含する：１）島細胞を、人の手
により採取するか、ピペットで吸引すること、２）連続的な篩い分け(siewing)
手順、３）層状フローチャンネル、４）密度勾配、５）細胞分離。これらの方法
の組み合わせも報告されている。

【０００４】 より小さな動物から島細胞を分離することを考えれば、島細胞を人の手で採取
することが、非常に普通である。この方法は時間がかかり、分離に用いられる長
い期間は、例えば、島細胞の分子生物学における研究には有害であることがある
。更に、この方法は、単調で座りっぱなしの作業を必要とする。このような大変
な労力を要する作業は、（供給源や慣例に依存して、）しばしば実験技術者、学
生、ＭＤ（医学博士）によって成される。

【０００５】 島細胞の分離に費やす時間は非常に有効に用いられ、および／または給与に係
る出費は自動化によって大いに低減し得る。座りっぱなしの単調な作業は、疾病
によって失われる日数を増やすことにも関することは周知である。（例えば、頸
や片部位の痛み、頭痛等の原因）。人的な島細胞の採取における他の重要な不利
益は明白である。すなわち、異なる作業者による島細胞の取り扱いや選択におけ
る相違の危険である（これは、全ての方法に共通である）。このことは、測定さ
れる生理学的パラメータに大きな変化をもたらす。明確には、最適な培養−媒体
への島細胞の迅速な輸送が島細胞への損傷を防止することが一般に容認されるこ
とから、時間的要因が重要である。

【０００６】 分離方法を改良するためには、島細胞の収率や品質の相違を詳細に記録するこ
とが避けられないという事実にも関わらず、特にヒトの島細胞分離の分野におけ
る分離方法の標準化および品質測定には普遍的な欠陥がある（（リコルディ、19
91年）参照）。

【０００７】 動物やヒトからの島細胞の大規模でかつ速い自動化分離のための方法を改良す
ることは非常に重要であり、幾つかの努力この分野にゆだねられている。しかし
ながら、前述のどの方法も広く容認されておらず、また広く使用もされていない
ということは明らかである。このことは、動物の島細胞の分離の分野において特
に重要である。

【０００８】 対照して、ヒトおよびブタの島細胞分離の分野では、島細胞の自動分離法の開
発が大きな成果を上げている。従って、リコルディらによって開発されたような
周知の島細胞の自動分離器（ＡＩＩ）（リコルディ、レイシーら、1988年；リコ
ルディ、フィンケら、1986年）や、この改良（テルヤ、イデズキら、1994年；レ
イキー、ワーノックら、1997年）は、ヒトの糖尿病の治療における島細胞の臨床
上および実験的な移植を可能にした。リコルディの方法は、同じ装置内の島細胞
の分離装置でのコラゲナーゼ消化を伴う。この島細胞は、品質が低下すると、組
織から連続的に放出される。

【０００９】 しかし、リコルディ法は、勾配遠心分離による別の精製も要求している（リコ
ルディ、フィンケら、1986年；リコルディ、レイシーら、1988；リコルディ、フ
ィンケら、1988年）。島細胞がコラゲナーゼで処理され、それによって品質や特
徴を変化しながら島細胞を生産することは、経時的な変化ももたらすこともある
。同じ装置内で消化プロセスと分離プロセスとを組み合わせることは有利でない
ことがある。

【００１０】 数種の他の方法、例えば、ヒトの島細胞用、およびげっ歯類犬、ブタおよびヒ
トからの島細胞の分離のための密度勾配遠心分離も開発されている（マルチェッ
ティ、フィンケら、1991年；ツェ、ウォングら、1976年；リコルディ、レイシー
ら、1988年；シバタ、ルドヴィクセンら、1976年；ブイトラゴ、ギルフェら、19
77年）。少数の研究室では、勾配遠心分離と細胞分離器を組み合わせている（レ
イク、バセットら、1989年；オラック、スワンソンら、1991年；プレヴォスト、
ローランドら、1995年）。勾配の使用は、島細胞細胞への浸透性損傷を引き起こ
すことがあることから、重大に評されることがある（レイク、ジャイムスら、19
86年；レイク、アンダーソンら、1987年）。このことは、潜在的には、島細胞移
植の成果にとって非常に重要であることがある。これらの方法を用いて報告され
る純度は顕著に変化し、その殆どが約７５％である。島細胞の純度を高めること
は、非常に有利であろう。

【００１１】 島細胞の消化／分離のための別の方法も記載されている（実施例参照（ブルニ
カルディ、スーら、1992年；グレイ・アンド・ベアード、1996年））；例えば、
免疫磁気分離（ナンディガラ、チェンら、1997年；ディビス、ジェームスら、19
95年）や、例えば亜鉛結合性染料（ジンダル、マクシェーンら、1994年）または
灰色がかった赤色（グレイ、ゴードら、1989年）でマーキングされた島細胞の蛍
光活性化細胞局在化（ＦＡＣＳ）。島細胞の精製のための消化された組織の層状
フローチャンネル（ラングレー、1993年）および濾過（シャープ、レーシーら、
1986年）も開発されている。組織標本の篩い分け（siewing）は、通常、大きな
非消化細胞片を抜き取るための、大雑把であるが最も重要な方法として用いられ
る。

【００１２】 動物の島細胞研究の分野では、上記のどの方法も広く使用されておらず、そし
て人的な島細胞分離が、医薬産業におけるものを含む大抵の研究室によって未だ
に非常に普通に使用されていることは明らかである。そのため、実質的な供給源
がこの方法で使用されることから、分離方法の簡便化に努力しなければならない
ことは明白である。加えて、長所は、分離された製品の高い品質であり、そして
本発明は、島細胞の選択における中間オペレータの変動も減らし得る。げっ歯類
の島細胞の分離のための改良法は、移植に関する研究に有用であり、この改良法
は、ヒトの島細胞移植にも伝わる見こみがある。

【００１３】 本発明の目的は、分離方法を実質的に改良することである。本発明は、対象で
ある組織の従来の分解方法における利点を利用し、そして改良点も含んでいる。
本発明は、周りの組織からの島細胞の予備分離のために使用されてもよいが、島
細胞の後続の精製または、一方の場所から別の場所への島細胞の移植のためにも
使用できる。主たる目標は、ランゲルハンス膵島を分離するための、迅速で信頼
性のある装置、およびその装置の実行考証を提供することである。

【００１４】 （発明の要旨） 本発明は、組織懸濁液中に埋め込まれた細胞クラスターの分離に関する。装置
は、膵島の分離のために好ましく設計されるが、多数の種類の細胞クラスター、
単細胞（例えば、精子）または非生物学上の粒子にも適用できる。これは、対象
である細胞クラスターを含む主要組織の従来の分解方法の長所を利用している。
本発明の原則は、装置が、組織懸濁液中の細胞クラスターを自動的に検出して、
その後分離し、それを別の場所へ輸送することである。細胞クラスターの検出は
、デジタル画像処理によって行なわれ、次いで、可動性ピペットまたは毛細管内
で実行される手段によって分離される。

【００１５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ランゲルハンス島を分離する、特にげっ歯類の島細胞を分離する特
定の目的で設計される。しかし、本発明の装置は、他の細胞クラスター、単細胞
または非生物学上の粒子にも使用できる。以下に、例えば、粒子（すなわち、ラ
ンゲルハンス島）によって装置を説明する。

【００１６】 装置は、生物医学的な研究や開発の多くの分野で使用できることを強調する。
島細胞の研究分野に関し、これは、例えば、島細胞の基礎研究（分泌、分子生物
学）、医薬品のスクリーニング、島細胞の移植、再凝集した島細胞（例えば、人
工的な島細胞／膵島）の分離、一般的に変性された島細胞または島細胞クラスタ
ーの分離を含み得る。前記装置は、ヒトの島細胞の分離にも使用でき、プログラ
ム（すなわち、異なる片毎の島細胞の特徴）を容易に学習する手段を提供するこ
とから、ソフトウェアのフレキシビリティが明白である。ヒトの島細胞は、（薬
剤開発を含む）基礎研究と島細胞の移植の両者、特に島細胞の移植に用いられる
。本発明は、別の生物医学的な研究分野でも使用でき、例えば、酵素分解された
器官（例えば、甲状腺および上皮小体）から、および動物やヒトからの細胞／細
胞クラスターの分離（参考資料(ロアール、1988年)、抗体抱合型細胞の分離（例
えば、赤血球(ルベ、ロッシら、1976年)）、そしてより広義には、この装置で同
定および加工できるどのような種類の細胞または細胞クラスターの分離および／
または移植で使用できる。ここでは、精子や卵子のような単細胞を包含する。装
置は、バクテリア、ウィルスのクラスターを含む単細胞有機体、抗体または別の
生物学的もしくは非生物学物質によって開始される細胞クラスターを形成するた
めに抱合または凝集された細胞から発生する細胞クラスターを包含する研究にも
適用できる。

【００１７】 本発明は最適な分離プロセスに対する以下の重要な要求を履行することをベー
スとする：

【００１８】 Ａ．分離プロセス中、島細胞がどんなふうにも−物理的または化学的にも−損
傷されないことが最も重要である。このことは、膵島のような壊れやすい島細胞
を分離するときに特に適切である（ｐレヴォスト、ローランドら、1995年）。す
なわち、装置は、色または抗体を用いずに、かつ勾配、遠心力、磁界などを用い
ずに、島細胞を検出したり、分離したりできる。このことは、島細胞の統合性を
完全に残すことを確実にする。ここで提案するピペットシステムは、島細胞の安
全な分離を確実にする特別な目的の為に、研究員に特定のピペットを選択させる
。

【００１９】 Ｂ．効率と純度：迅速な分離と高い純度は共に、本発明の装置によって確保さ
れる。文献から知られる全てのほかの方法や装置に比べて、この装置は、特別な
構造によって１００％に近い純度をもたらす。このことは、島細胞移植において
特に重要であって、拒絶反応を保護する。

【００２０】 Ｃ．元の組織懸濁液からの速い除去を確保して島細胞を迅速に単離し、そして
細胞の生存により適した状態（例えば、新鮮な培養媒体）に移動することが重要
である。少なくとも以下の２つの理由で、コラゲナーゼ処理後の島細胞の迅速な
分離を行なうことが好ましいと、一般には受け入れられている；１．残存コラゲ
ナーゼが未だ溶液中に残っているかもしれないためと、２．組織懸濁液中に含ま
れている物質（例えば、サイトカインや酵素）が島細胞に有害かもしれないため
。

【００２１】 Ｄ．前記分離は、細胞に損傷を与えない条件下（例えば、低温でかつ無菌／準
無菌状態）で行なわれるべきである。従って、装置は、冷蔵室（４℃）に配置す
るか、またはペトリ皿を支持する部分を冷却することができる。ピペット、チュ
ーブなどが殺菌処理される（かまたは一回だけ使用される）ことから、汚染の危
険は低減する。

【００２２】 優良な実験室実験における標準を実現しなければならない。デジタル画像処理
を用い、物理的パラメータ（寸法、形状、容積）を容易に測定することが可能で
ある。これは、日常の品質制御を行なう適性をヒトに与え、それによってコラゲ
ナーゼ消化が、真の目標判定基準に基づいて容易に最適化され得る。適正な考証
は、島細胞の寸法や品質を測定するための標準、例えば、島細胞の等価数(ＩＥ
Ｑ)において国際的な合意を達成するプロセスを助長する（リコルディ、グレイ
ら、1990年；ヴァンデウォール、デュイラードら、1999年）。手順の標準化と考
証は、「有料実験室規範（ＧＬＰ）」というコンセプトにも良く合致している。
デジタル画像分析は、コンピュータが評価した容積決定およびＤＮＡやインシュ
リン含量のような独立した量的パラメータと前述のように高い相関関係を有する
（ステゲンマン、オニールら、1997年；ステゲンマン、オニールら、1998年）。

【００２３】 Ｆ．経済性：一つの島細胞の分離に使用される費用は、分離された島細胞の品
質を妥協することなく、最小限に抑えなければならない。本発明の使用は、処理
が最少のオペレータ操作を要求することから、時間と金額を節約する。このこと
は、科学職員や研究所員にとって時間の有効利用を可能にし、単調なルーチンワ
ークを減らし、それにより、疾病によって失われる日数を減少させるであろう。

【００２４】 Ｇ．プロセスの自動化に基づく作業条件の改良

【００２５】 Ｈ．もう一つの観点：分離プロセスと品質制御が一つの装置内で組み合わされ
るという事実は、時間を節約する。より高い品質の島細胞は、行なわれる実験の
より高い成功率をもたらすであろうと予想される。長期の作業において、このこ
とは、実験に必要とされる動物の数を減少させるであろう。

【００２６】 本発明は、低コストと、効率および高品質の成果（すなわち、分離された島細
胞）とを組み合わせている。本発明の、後者のパラメータに関する有効性を文書
で照明するためには、分離された島細胞の統合性は、従来の方法で分離された島
細胞と同じかまたはそれ以上でなければならない。これは、分泌と物理的パラメ
ータの測定を包含する（ヴァンデウォール、デュイラードら、1999年）。

【００２７】 デジタル画像処理は、島細胞の物理的特性（例えば、計数や寸法）を説明する
のに用いられている（ステゲンマン、オニールら、1997年；ステゲンマン、オニ
ールら、1998年；マーチャント、ディラーら、1996年；フェッターホフ、ワイル
ら、1994年；ワイル、シュワルツコフら、1997年）が、島細胞の分離のためにそ
の方法を用いる処置は取られていなかった。

【００２８】 本発明の基礎は、組織分解のための従来法の使用である。本発明の装置は、組
織懸濁液中で細胞を分離される場所から放出するコラゲナーゼおよび／またはト
リプシンのような酵素溶液で処理された組織に特に有用である。しかし、どのよ
うな種類の解離物質または組織懸濁液を生成する方法も用いることができるため
、組織を冒す酵素溶液の使用に限定されない。

【００２９】 説明の為に、げっ歯類の膵臓をランゲルハンス島細胞を含む組織懸濁液に分解
する方法が好ましい態様であることから、これをここに記載する。簡単には、げ
っ歯類の膵臓の総胆管を、乳頭Vateriで結合する。肝臓の管をカニューレ処置し
た後、コラゲナーゼを含有する氷冷されたハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）を
膵臓の器官に挿入する（ゴトー、マキら、1987年）。膨張した膵臓を取り出して
、脂肪と血管を切り取る。膵臓を試験管に入れ、インキュベートするまで３７℃
で１６.５分〜１９分間氷上で保持する。２×５秒間ボルテックスした後、組織
溶液を氷冷ＨＢＳＳで洗浄する。結局、組織懸濁液をその後、ナイロンメッシュ
で篩い分けして（siewed）、分解していない組織、脂肪、血管などを抽出する（
ハラ、タニグチら、1988年）。組織の篩い分けは、必要ではないが、組織をここ
で記載したような分離プロセスに付する前の組織懸濁液の調製としては好ましい
処置である。組織標本の篩い分けは、大きな非消化組織片を取り除くための大雑
把であるが最も重要な方法として通常使用される。島細胞は、分離後すぐに使用
されるか、または実験もしくは移植に使用される前に回復期間に付されることが
ある。

【００３０】 ２つの装置IおよびIIの概略が示されている。解決策は共に、毛細管装置内で
の島細胞の写真検出（デジタル画像処理）に基づいている。装置Ｉでは、ペトリ
皿の懸濁液中の島細胞を、ピペットに吸い取り、別の容器に移す。装置ＩＩでは
、毛細管内の流体中を移動する島細胞を検出して分離する。

【００３１】 装置Ｉは、分離前に、分離株中で島細胞ではない組織による汚染が少ない、安
全な走査を確実にする。この装置は迅速で、用いられるピペットに依存して、即
座の分析または実験のために、島細胞を例えば多穴プレートまたはマイクロタイ
タープレートに広げることができる。迅速で信頼性のある分離を最少の汚染で確
実にするために、装置に好適なピペットを開発した。これを以下に示す。ピペッ
ト中での流動（以下に示す）は、ピペットチップが常時、ペトリ皿の流体に保持
されているため、分離プロセスをスピードアップさせる。これは、以下に概略を
示すソフトウェアの特徴の完全使用をも確実にする。

【００３２】 装置ＩＩは、毛細管に移された島細胞の迅速な分離を可能にし、１本以上の毛
細管が１個のカメラの下に置かれており、こうすることで高速分離が可能となる
。さらに、この装置は、最少の機械部品を含み、長期の作業において機械的に非
常に安定である。しかし、この装置は、毛細管内を速く流れる組織をオンライン
走査するため、装置Ｉよりも多くのデータ能力を要する。

【００３３】 図１は、装置Ｉの模式的な形態を示している。クレーム３で説明される装置Ｉ
は、デジタルカメラ（白黒または条件次第でカラーでもよい）またはラインスキ
ャンカメラ(1)が、デジタル画像分析用ソフトウェアを含むコンピュータ(2)に連
結されている。カメラが最初の容器（例えば、組織懸濁液を含むペトリ皿(3)）
をスキャンする。デジタルカメラ(1)は、カメラ(1)に目に見える寸法の画像領域
（例えば、１ｃｍ×１ｃｍ）を与えるズームレンズを装備している。図１に示す
ように、このモデルの毛細管素子(15)は、ピペット(4)と移動ステージ(8)を含む
。

【００３４】 カメラ(1)と、懸濁液から細胞クラスターを採取するためのピペット(4)は、本
発明の一態様では、互いに一つの装置として、移動ステージ(8)によってｘ−ｙ
−ｚ面で移動する。コンピュータ制御された電気モーターまたは圧電性装置(5)
は、ピペットマントル(7)内部のピストン(6)を動かす。移動ステージは、例えば
、コンピュータ制御された電気ステッパーモーター、またはこの目的のために改
良された市販のｘ−ｙ−ｚステージによって実行される迅速な移動により、ピペ
ット(4)をペトリ皿(3)の周囲で動かすことができる。

【００３５】 本発明のもう一つの態様では、ピペット(4)とカメラ(1)は、一つの装置のよう
には動かない。この場合、カメラ(1)が、独立したｘ−ｙ移動によって動くか、
または常時ある位置に保持されている。

【００３６】 ピペットチップ(12)（毛細管端部）は、カメラ(1)の視界に見えている。本発
明の一態様では、ピペット中での非流動が用いられ（以下で説明するモデル１参
照）、１個または数個の島細胞の分離後、ピペット(4)をペトリ皿(3)の外側に動
かせて、島細胞を別の容器(10；例えば、別のペトリ皿、培養フラスコもしくは
マイクロタイタープレート)に放出する。

【００３７】 本発明のもう一つの発明（以降で説明する別のモデル２〜４参照）では、ピペ
ット(4)は、輸送チューブ(9)を介して別の容器（例えば、培養媒体を含む培養フ
ラスコ(10)）と繋がっている。ピペットシステム(15)の原則は、以下のように表
すことができる；培養フラスコ(10)内に、吸引装置(11)によって小さな負の圧力
がかかるので、島細胞が皿(3)からピペット(4)を通じてフラスコ(10)へ移動する
。輸送チューブ(9)内の吸引圧は、１以上の圧力計で制御されている。

【００３８】 ペトリ皿の島細胞を空にした後、新しいペトリ皿(3)をカメラ(1)の画像領域に
おいて、島細胞を含む溶液を貯蔵槽(20)から新しいペトリ皿(3)に供給する。ペ
トリ皿内の溶液レベルを保持するために、供給容器（図示せず）から別の溶液を
加えることもできる。

【００３９】 ピペットシステムの凝固を避けるために、洗浄ルーチンがソフトウェアに含ま
れている。

【００４０】 分離される細胞クラスターの種類や寸法（例えば、０.０５〜０.１ｍｍ）に依
存して精密に実行するのには、迅速な移動が必要とされる。

【００４１】 島細胞の認識後、ピペットを島細胞の近くに移動させて、島細胞を含む懸濁液
のピペットへの吸引を開始する。吸引を開始するやいなや、周囲から別の組織で
はなく島細胞だけをピペットに吸引するために、ピペットを島細胞から離すよう
に（通常は上方へ）動かす。ここで、組織は、分離手順では所望されていない。

【００４２】 潜在的に、インキュベーションバイアルまたは穴プレートに島細胞を直接輸送
するのに、部品を使用することができる。

【００４３】 図２は、装置ＩＩの模式的な形態を示す。装置ＩＩは、クレーム２で説明され
ているように、ズームレンズ付きデジタルカメラ（白黒または条件次第でカラー
でもよい）(1)、例えば全視野画像処理カメラまたはラインスキャンカメラを含
んでおり、これはデジタル画像分析用ソフトウェアを格納したコンピュータ(2)
と繋がっている。カメラ(1)は、第１容器の透明部分(21；例えばガラスまたはプ
ラスチック製毛細管）を走査する。内径または透明チューブ(21)は、分離される
一番大きな島細胞よりも大きい；通常、島細胞の寸法は０.１〜０.３５ｍｍであ
る。透明部分(21)の長さは、変化でき、例えば２〜３ｃｍである。透明チューブ
(21)の内部形状は、断面部と長尺方向部で異なる幾何学的な形状であり得る（例
えば、丸または正方形）。透明チューブ(21)は、第１容器(22)の第１輸送部（例
えばシリコーンチューブ）を介して、組織懸濁液を含む貯蔵槽(20)と繋がってい
る。懸濁液は、貯蔵槽(20)から第１容器(22)の第１輸送部位と透明部位(21)と第
１容器の第２輸送部位(26)を通って、廃棄容器(27)に繋がる別のチューブ(28)へ
流れるか、あるいは懸濁液の再循環のために貯蔵槽(20)へ戻る。

【００４４】 輸送部位(21)中の島細胞が、コンピュータ(2)に組み込まれたコンピュータプ
ログラムで検出されると、マイクロポンプ(24)（または制御弁）がコンピュータ
プログラムによって正確な移動で活性化して、第１容器の第２輸送部位(26)と垂
直な方向に少量の液の流れが発生する。それによって島細胞は、別のチューブ(2
8)の代わりに、側方の管(25)へ向けられる。

【００４５】 マイクロポンプ(24)または弁の代わりに、側方の管(25)に繋がったピペットシ
ステムを用いることも可能である。このピペットシステムは、図３〜６で詳細に
説明されている。

【００４６】 潜在的に、この装置は、インキュベーションバイヤルまたは穴プレートに島細
胞を直接輸送するのに使用することもできる。

【００４７】ピペット−例 細胞クラスターの吸引のためのピペット(4)は、本発明の一部である。ピペッ
トの種類は、対象とされるプロセスや組織に依存して異なる。そのため、好まし
い態様であるランゲルハンスの島細胞の分離の場合には、流体のペトリ皿を速く
消耗させる危険のない、迅速で危険でなく、かつ連続的な細胞クラスターの輸送
機能を併せ持つような、設計モデル３のピペット（図５）が好ましい。さらに、
ピペットの迅速なｚ−移動と組み合わせると、対象である島細胞以外の物質を移
動させずに、島細胞をピペットと吸引することが可能である。このことは、分離
された細胞を含む懸濁液の精製に重要である。また、このことは、島細胞を分離
するときに、最小限の撹乱がピペットチップ(12)の周囲で生じることも確保する
。撹乱は、カメラとコンピュータプログラムによる同定を妨害することがある。

【００４８】 異なる種類のピペット(4)を開発するとき、ピペット(4)からペトリ皿(3)への
流体の戻り流を低減することも重要であった。戻り流は、ピストン(6)が最初の
位置（ピストンがピペットマントルに完全に挿入された時の位置）に戻るときに
生じることがある。この課題は、モデル４（図６）には表されていないが、モデ
ル２および３では，ピストンが最初の位置に戻ったときに、流体がチップ(12)か
ら流れ出す代わりに、出口(30)（図４および５）を通過できる特別な構造によっ
て最小限となる。

【００４９】 図３は、非流動型ピペットである、ピペットモデル１を表している。ピペット
(4)自体を構成する材料は、ガラス、プラスチック、金属、またはそれらの組み
合わせであり得る。カメラの視野を邪魔しないために、透明材料のチップ(12)が
好ましい。ピペット(4)は、例えば、プラスチックのピペットマントル全体(7)と
チップ(12)を利用するか、またはプラスチックからの打ち抜きによって作成でき
る。透明材料を使用すれば、これは、ピペットを通じて光を送ることも利用でき
、これはピペットチップ(12)を正しい位置に配置するのに役立てることができる
。ピペット(4)内部のピストン(6)は、どのような材料から造られていてもよいが
、ピペット(4)の内側(31)とピストン(6)との間での低い摩擦のために、テフロン
（登録商標）Ｏが好ましい。ピペット(4)内部のピストン(6)の移動のために、ピ ストン(6)は、電磁石または圧電性素子(5)と繋がっている。

【００５０】 ピペット(4)は、分離しようとする一番大きな細胞クラスターよりも少し大き
な内径を有するチップ(12)を通じて島細胞の吸引を可能にする（特に、大抵の島
細胞標本には、約２５０〜３５０ｍｍが最適である）。ピペット(4)のチップ(12
)の長さはどの程度でも良いが、細胞クラスターを分離する毎に、ピペットへ少
量の懸濁液だけを吸引する事を確実にするために、約１０ｍｍの長さが好ましい
。

【００５１】 ピストンを最初の位置から動かして、島細胞をピペットに吸引する。このとき
、ピストンは、ピペットマントル中へ（外見上は別の位置へ）できる限り速く動
かす。ピペット内の内容物を別の容器（例えば、培養フラスコ）へ移す前に、ピ
ストンを少しずつ外側へ動かすことで、多くの島細胞をピペット中に吸引するこ
とができる。

【００５２】 別法としては、唯一の島細胞をピペット中へ吸引して、別の容器へ移す。この
方法は、ゆっくりではあるが、ピペット内部の詰まりは回避される。

【００５３】 図４は、ピペットモデル２を表しており、これは連続的に輸送しない流動型ピ
ペットである。本発明のこの態様では、ピペット(4)は、出口(30)のための穴と
、ピペット(4)へ輸送チューブ(14)を結合するためのを短い側方の管(34)を備え
ている。ピストン(6)の前端(37)は、ピストン(6)の移動方向に対してある角度で
切断されている（例えば、４５度）。ピストン(6)をピペット(4)内部へ移動させ
るために、ピストン(6)を電磁石または圧電性素子(5)につなぐ。

【００５４】 ピストン(6)が最初の位置にあるとき、すなわち、完全にピペットマントル(7)
中に挿入されているときは、出口(30)が閉じているので、ピペットチップ(12)か
ら出口(30)への流れない回路がある。ピストン(6)を最初の位置から戻すように
動かすと、出口(30)が開いて、輸送チューブ(14)内のより低い圧力により、島細
胞をピペット(4)中へ吸引し、さらに出口を通じて輸送チューブ(14)へ吸引する
連続吸引が生じる。

【００５５】 図５は、モデル３を表しており、これは連続的に輸送する流動型ピペットであ
る。本発明のこの態様では、ピペットのマントル(7)は、流体の導入口(32)用の
穴と出口(30)用の穴を含んでいる。導入側の管(35)は、培養媒体用の供給源へチ
ューブ(26)を介して連結されており、出口側の管(34)は、輸送チューブ(14)に繋
がっている。

【００５６】 ピストン(6)は、横断溝(36)を有しており、その直径は、穴（30および32）の
内径と同じである。

【００５７】 最初に位置では、ピストン(6)は、完全にピペット(4)中に挿入されており、流
体が導入口(30)から前記溝(36)を介してピストン(6)中に流入し、そして出口(30
)を通じて輸送チューブ(14)へ流れ出ている。ピストン(6)をピペットから外側へ
移動させた次の位置では、ピストンが導入口(32)を閉鎖して、チップ(12)からピ
ペット室(39)へ、そして出口(30)を通って輸送チューブ(14)へ流れさせる。

【００５８】 ピストン(6)は、移動素子(5)に連結されている。この連結は、溝(36)を正しい
流れを確保する、導入口(32)と出口(32)に対して正しい位置に保持するために、
ピストンの回転も抑制する。

【００５９】 別法では、横断ピストン(36)の代わりにピストン(6)を、流体が導入口(32)か
ら出口(30)へピストンの周りを流れることができるような環状ノッチ付きの形状
にしてもよい。

【００６０】 図６は、ピペットモデル４を表しており、これは連続的に輸送しない流動型ピ
ペットである。本発明のこの態様では、ピペットは、シリンダーコア(16)を含む
シリンダーマントル(29)から構成されている。この投影図を図６ｃに示す。コア
(16)は、回転軸(42)を介してコア(16)に連結された回転素子(41；例えば、電気
モーターまたは圧電性装置)によって、マントル(29)内部で段階を追って回転で
きる。

【００６１】 ピペット(4)は、さらに、迅速なピペット操作と、細胞クラスターの輸送のた
めのピペットチップ(12)から輸送チューブ(14)への流れを確保している。コア(1
6)とマントル(29)は、例えば、金属またはプラスチックのようなどのような好適
な材料からも作成できる。プロセスを管理する目的の為に、材料は透明であるこ
とが好ましい。マントル(29)は、ピペットコア(16)の中心に向いた３つの穴(17
、18、19)を含んでいる。穴(17、18、19)は、１２０度の共通の角距離で配置さ
れている。

【００６２】 コア(16)には、内部溝(40)が設けられている。溝(40)は、穴(17、18、19)の直
径とほぼ同じ直径である。コア(16)は、例えば、導入口(17)と出口(18)のように
、３つの穴のうちの２つをつなぐように配置することができる。この配置では、
導入口(32)に連結された培養供給源から、コアの溝(40)を通じて輸送チューブ(1
4)への培養媒体の流れがある。

【００６３】 図６ｂに示すような、コア(16)が１２０度回転した次の位置では、ピペットチ
ップ(12)と輸送チューブ(14)との間の連結が確立されて、島細胞を内部コアの溝
(40)を通じて輸送チューブ(40)へ吸引する。

【００６４】 コアの回転は速いので、少量の媒体が島細胞と一緒にチップ(12)と水(40)へ吸
引される。

【００６５】 装置Ｉは、島細胞を吸引するのに適したどのような種類のピペットを装備して
いてもよい。そのため、周知のペルティエ則に基づくピペットをさらに設置する
こともできる。この種のピペットは、一操作当たり、制限された数のクラスター
の輸送を可能にし、そしてピペットは、溶液から島細胞を放出する必要がある。
ピペットは、小さな容積中の単一の細胞クラスターを定められた位置（例えば、
穴プレート）へ輸送するという概念であるが、ペルティエ則やモデル１のピペッ
トはいずれも、大量の島細胞の迅速な分離を確実にするのに十分に速い。

【００６６】 ピペット(12)のチップは、ペトリ皿(3)の底からピペットコアへの輸送中、流
れを方向付けて細胞クラスターを支持することから、重要である。ピペットチッ
プ(12)は、（図３〜６に示すタイプのように）真直ぐであっても、曲がっていて
もよい。チップの最先端は、（図３〜６のように）軸に対して直角であるか、ま
たは研磨されている。

【００６７】 第１容器には、前記媒体がどの位置からも入る光によって照らされている。し
かし、大抵の液状の製品では、光が水平に入ることが好ましい。これは、平坦な
繊維光学的な光によって、またはペトリ皿を用いる場合には、繊維光学的な環状
の光から確保できる。これらは市販されている。電圧（ボルト）は、電圧／カメ
ラのシャッタースピードを妨害しない。そのため、ＤＣ光源が好ましい。

【００６８】 可視同定は、全ての可能な波長で、同定および／または分析の目的の為に島細
胞／細胞クラスターが抗体または他の物質が必要である場合に、行なうことがで
き、蛍光技術を必要とすることがある。

【００６９】 図７は、組織懸濁液にふさわしい貯蔵槽(20)を示す。対象とされる粒子は、特
別に用心しないと、貯蔵槽(20)の溶液中で沈降する。沈降する速度は、溶液の特
性と溶液中の粒子の特性の両者に依存する。例えば、外分泌組織の存在は、島細
胞の沈降に影響する。

【００７０】 装置のカメラ(1)の組織懸濁液の十分な発現のためには、２つの要件を満たさ
なければならない。すなわち、第１には溶液が均一であること、第２には溶液中
の粒子の濃度が最適であることである。これらのパラメータは、表されたいずれ
かの装置（ＩまたはＩＩ）を使用する場合には、制御する必要がある。例えば、
最適な分離を確実にするためには、組織が均一なパターンを表すように、そして
薄すぎたりまたは濃すぎたりしないように、組織をペトリ皿の底へ入れなければ
ならない。本発明の一部として、この要求を満たすように貯蔵槽を開発した。し
かし、別の種類の貯蔵槽も適用できる。装置の特別な設計は、オペレータに、人
的な調停を伴わずに、粒子の近統制と濃度を容易に制御させることができる。結
局、貯蔵槽(20)は、ペトリ皿(3)（モデル１）またはチューブ(21)（モデル２）
をモニターするコンピュータ(2)によって制御できる。そのために、コンピュー
タ(2)が粒子濃度または均一性が最適でないことを検出すると、コンピュータ(2)
が、コンピュータプログラム中に組み込まれたルーチンによって両方のパラメー
タを自動的に調節することがある。

【００７１】 貯蔵槽(20)は、どのような形態を有していてもよいマントル(43)から構成され
るが、島細胞分離の為に、円筒状が好ましい。貯蔵槽(20)の内部では、第１液体
浸透性メンブラン(44)がシリンダー内の心棒(42)に沿って上下に動くことができ
る。第１メンブランは、液体を浸透すことはできるが、溶液中の粒子がメンブラ
ン(44)を通って流れるのを抑制する。第１メンブランの縁(47)は、シリンダーマ
ントル(43)の内壁(48)にしっかりと固定されており、細胞が貯蔵槽(20)の第１容
積(45)へ逃げるのも抑制する。第１容積は、第１メンブラン(44)と上部壁面(46)
との間の体積である。シリンダーの低い方の部分では、第２液体浸透性メンブラ
ン(49)が装備されている。そのため、シリンダーは、３つの容積から構成されて
いる。第１メンブランと上部壁面との間の第１容積(45)、メンブラン間の第２容
積(50)、そして第２メンブランと貯蔵槽(20)の下部壁面(52)との間の第３容積(5
1)。

【００７２】 第２容積(50)の寸法は、第１メンブラン(44)の移動によって変化し得る。第１
メンブランが下方に動くと、粒子はこの第２容積(50)中に閉じ込められているた
め、この減った体積中の粒子濃度が増加する。第１メンブランの移動は、移動素
子(53；例えば、心棒と連結しているコンピュータ制御された電気モーター)によ
って可能となる。したがって、貯蔵槽(20)中の合計体積（第１、第２および第３
容積の和）は一定である。

【００７３】 第１容積(45)からチューブを介して、出口(54)、コンピュータ制御されたポン
プ(55)および第３容積(51)への入り口を通る、流体の連続流動がある。第２メン
ブラン(49)を通過する媒体の安定した流れは、第２容積(50)中の粒子が第２メン
ブラン(49)で沈降するのを予防する。懸濁液の均一性を、ポンプ(55)におけるポ
ンプ圧によって変え、それによって第２メンブラン(49)を通過する流れを変える
ことができる。必要に応じ、流体は、図７に示すように再循環させる必要はない
が、その代わりとして液体の連続除去（および適用）を開始することがある。

【００７４】 貯蔵槽(20)内の媒体中の粒子は、貯蔵槽(20)から供給チューブ(57)を介して徐
々に抽出される。供給チューブ(57)を通る流れは、コンピュータにより、例えば
弁を含むことによって、制御される。供給チューブ(57)と貯蔵槽(20)の出口を通
じて流体と粒子の抽出によって誘発された溶液の消耗は、同量の流体の貯蔵槽(2
0)への添加（図７には示さず）によって回避される。

【００７５】 貯蔵槽は、例えばウォーターバスからの冷却チューブによって、冷却すること
ができる。

【００７６】 （装置の特徴の説明） ソフトウェアは、本発明自体の部品ではない。装置と設計されたソフトウェア
との組み合わせは、装置全体の以下の主な特徴を確実にする。目標は、 １．高容量および最適な品質の島細胞を分離でき、２．時間を節約し、３．操作
が容易で、４．島細胞の寸法と形状を定量でき、５．サブグループの島細胞を選
択でき、６．島細胞の品質スコアを計算でき、７．無菌状態で分離でき、８．ヒ
トの島細胞を含む種族から島細胞を潜在的に分離する装置を開発することである
。

【００７７】 装置は、コンピュータ（例えば、パーソナルコンピュータ（ＰＣ））にインス
トールされたソフトウェアによって制御される。ソフトコードの詳細な説明はこ
こには記載しないが、本発明の機能的な容量の解明に役立つことから、主な特徴
を以降に概説する。

【００７８】 一般には、プログラムの島細胞を同定できる部分は、アルゴリズムをベースと
している。プログラムは、例えばWindows（登録商標）９８またはWindows（登録 商標）ＮＴのようなユーザー・プラットフォームで作業するように設計されてい る。

【００７９】 カメラ(1)から得られたデータは、粒子の同定やアルゴリズムによる更なる処
理の為にコンピュータ内で使用される。アルゴリズムは、寸法、形状（例えば、
円形）、コントラスト、強度、縁のような島細胞のデータに基づいている。ファ
ジー理論の特徴は、プログラムに、特定の特徴の粒子を認識するように学習させ
ることができる。

【００８０】 オペレータは、ソフトウェアに関する詳細な知識を必要とせずに、アルゴリズ
ムを変えることも可能である。この特徴は、装置が異なる粒子を取り扱うのであ
れば、特に重要である。特定のパターンを有する粒子の同定を最適化し、かつ異
なる装置または装置セットから同一の出力を確実に得るために、アルゴリズムを
、神経系の一部のように、異なるコンピュータ間で交換することができる。

【００８１】 本発明は、カメラによって画像処理された懸濁液の発現を包含し、カメラの今
の画像をモニターにあらわすことが出きる。アルゴリズムに設定されているよう
な基準を満たす島細胞がプログラムによって同定され、スクリーンに記録される
。プログラムは、より大きな面積（例えば、ペトリ皿全体）がスクリーンに表す
ことができるように、単一面積のスキャンを組み合わせることができる。

【００８２】 （島細胞分離および考証） 操作モード：１．人的操作、２．援助された人的な操作、および３．自動操作
。人的操作モードでは、オペレータは、同定される粒子を目視で記録して、その
後または即座の分離のために、装置に島細胞の位置を記録させることができる。
援助された人的操作では（分離前の検査）、装置が（用いられるアルゴリズムの
設定に従って）粒子を同定し、オペレータが分離プロセスで厳重な制御を欲すれ
ば、モニターにそれをマーキングしてオペレータを助ける。それによって、オペ
レータは、分離前に同定を照合することができ、そして分離前にマーキングされ
ていない望ましくない粒子に対する機会がある。自動化モードでは、装置は（用
いられるアルゴリズムの設定に従って）迅速に同定を行ない、オペレータが間に
入ることなく、島細胞を分離する。装置１では、この全ての操作モードが可能で
あるが、装置ＩＩでは、自動化操作のみが用いられる。

【００８３】 走査モード：１．分離前に皿のフルスキャン、または２．現在の画像内でスキ
ャンして分離する。装置は、ペトリ皿全体をスキャンした後、島細胞を分離する
か、あるいは皿の一部を走査した後、連続して島細胞を分離することができる。
この特徴は、装置１のみで使用できる。

【００８４】 島細胞の選択：オペレータは、アルゴリズムに設定された予め決定された基準
の履行に基づいて、自動的に島細胞を選択することができる。選択基準は、例え
ば寸法、形状および／または品質であり得る。プログラムは、前もってセットさ
れた数の、特定の特徴を有する島細胞を分離するように設定することができる（
例えば、最も良い品質の島細胞３０個）。この特徴は、装置１にのみ使用するこ
とができる。選択特徴は、このパラメータの変動が、その後の実験から得られる
結果に大きな変動を生じさせ得るため、その後の実験の成果にとって重要である
。

【００８５】 データ運用：消化および分離プロセスを向上させるために、例えば分離された
島細胞の品質と収率のような物理的パラメータをモニターしかつ考証することが
重要である。プログラムは、分離された島細胞の量と品質、寸法（平均、最大／
最少）、形状、体積、色に関するデータを表示しかつ蓄積するように設計されて
いる。品質スコアは、各島細胞について計算され、スクリーン上に表示できる。
特定の分離日に得られた品質スコアの平均はファイルに蓄積され、その後の比較
および統計のために使用することができる。これらのデータは、異なる実験から
の結果を比較することができるため、重要である。

【００８６】 （プロセス運用） 自動較正、オートスタートおよび自動清浄。これらの特徴は、コンピュータの
プログラム中のルーチンであって、より広い範囲までの分離プロセスがオペレー
タから独立していることを確実にする。装置Ｉでは、自動較正特徴は、オートフ
ォーカスと、ｘ−ｙ−ｚ平面におけるピペットチップの正しい位置のチェックを
含んでいる。装置Ｉでは、ｚ−平面におけるピペットチップの正しい位置は、人
的調整、またはコンピュータ制御された調整によって確保されている。オートス
タート特徴は、ピペットとチューブの自動ファイル化を確実にする。自動化手順
は、分離が終了した後、（ピペットとチューブに例えばエタノールを吸引するこ
とによって）清浄化、さらには無菌化のためのルーチンも含んでいる。この特徴
は、チューブまたはピペットが詰まった場合にも操作される。例えば、モデル１
のピペットが組織の凝集によって詰まった場合、ピペットをペトリ皿から外に移
動し、流体を放出して、ペトリ皿にもう一度移動させる。

【００８７】 カメラの下のペトリ皿の自動供給および充填は、オペレータが自主的に確立す
るように実行される。

【００８８】 光の質および均一性と粒子濃度の自動チェックは、連続して行なわれる。分離
プロセスに最適な環境を確実にするため、コンピュータは、カメラデータを分析
して、光の質および粒子の均質性と濃度をモニターする。これらのパラメータは
、貯蔵槽（図７）内で制御できる。コンピュータは、センサーを介して、ピペッ
ト出口の吸引圧、貯蔵槽内のポンプ圧、そしてペトリ皿と貯蔵槽内の温度もモニ
ターする。

【００８９】 オペレータは、プログラムが、処理されている現在のペトリ皿の数、貯蔵槽内
の残留体積、および経過時間を表示することから、分離プロセスをモニターする
ことができる。

【００９０】 スクリーンには、ピペットとカメラの位置が連続して較正された座標で表され
る。これは、位置／再配置目的のために（例えば映像操作を行なう場合に）使用
できる。

【００９１】 （更なる考証データ） 鍵パラメータ（特定の分離に適用されるアルゴリズムとして、時間および日付
、オペレータＩＤ、分離にかかった時間、分離された島細胞の量および質）をフ
ァイルに蓄積することができる。オペレータが作成したコメントをファイルに書
き込むこともできる。同定された島細胞の数と分離された島細胞の数の間の差を
計算することもある。このことは、統計学上、適用されるアルゴリズムの効力に
ついてのオペレータに対する情報として重要である。

【００９２】 プログラムは、オペレータにスクリーンのスナップ写真を取って（それをファ
イルに蓄積させ）、そして、例えば島細胞の長さの測定や、表示された単一の島
細胞の面積および統計学的な体積の計算を行なわせることができる。

【００９３】 （環境とハードウェア） 数個の装置を同じコンピュータにつなぐことができ、大量の組織懸濁液の処理
速度を高めて、コストを低減させ、そして混雑した研究室内での場所を節約する
のに役立つ。コンピュータとしては、安価なグラフィックスカードを有する標準
的なＰＣを使用することができる。ピペットチップ中の光は、分離されたものの
近くにチップの位置を確保し、最先端に光を伝達するために透明なピペットマン
トルとチップを有することが有利である。換気フードは、ペトリ皿上に配置され
るか、または装置全体をフードの中に配置させることができ、（例えば、媒体中
のｐＨを保持するために）特定の気体へ媒体を曝露するのを容易にする。装置は
、低温で操作され得る。低温は、酵素プロセスの低い活性を確保する。これは、
媒体中に拡散している残留コラゲナーゼや有害な酵素の影響から島細胞を保護す
るために重要である。

【００９４】 （参考文献） Brunicardi FC, Suh E, Kleinman Rら著：島細胞の分離のために表示された膵臓
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【図面の簡単な説明】

【図１】 模式的な形態の装置Ｉを表す。

【図２】 模式的な形態の装置ＩＩを表す。

【図３】 ピペットモデル１：非流動型ピペット。

【図４】 ピペットモデル２：連続的に輸送しない、流動型ピペット。

【図５】 ピペットモデル３：連続的に輸送する、流動型ピペット。

【図６】 ピペットモデル４：連続的に輸送する、流動型ピペット。

【図７】 組織懸濁液のための貯蔵槽を表す。

【符号の説明】

１…カメラ、２…コンピュータ、３…第１容器、ペトリ皿、４…ピペット、５…
ピストンを動かす電気モータまたは圧電性素子、６…ピストン、７、２９…ピペ
ットマントル、８…移動ステージ、９、１４…輸送チューブ、１０…第２容器、
培養フラスコ、１１…吸引装置、１２…毛細管末端部、ピペットチップ、１３…
ピペットチップ周囲の体積、１５…毛細管素子、１６…リシンダーコア（ピペッ
トモデル４）、１７…導入用穴（ピペットモデル４）、１８…出口用穴（ピペッ
トモデル４）、１９…チップ用穴（ピペットモデル４）、２０…貯蔵槽、２１…
第１容器の透明部分、２２…第１容器の第１輸送部、２３…マイクロポンプ、２
４…マイクロポンプまたは制御弁、２５…側方の管、２６…第１容器の第２輸送
部、シリコーンチューブ、２７…廃棄容器、２８…（廃棄容器に繋がる）別のチ
ューブ、３０…出口（穴）、３１…シリンダーの内側、３２…導入口（穴）、３
４…側方の管、３５…導入側の管、３６…横断溝（ピペットモデル４）、３７…
ピストンの前端、３８…ピストン前端とピストンの移動方向との間の角度、３９
…ピペット室、４０…内部溝、４１…回転素子、４２…心棒、４３…マントル、
４４…第１（液体浸透性）メンブラン、４５…第１容積、４６…上部壁面、４７
…メンブランの縁、４８…内壁、４９…第１（液体浸透性）メンブラン、５０…
第２容積、５１…第３容積、５２…下部壁面、５４…出口、５５…ポンプ、５６
…入り口、５７…供給チューブ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C077 AA08 AA15 BB10 EE10 NN20 5B057 AA04 CA12 CB12 CC04 DA12 DB02 DC01 DC36 5C054 AA01 CA04 CF01 CF05 CG01 EA01 FC12 FC15 GC01 GC03 HA05

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 −粒子を有する溶液を含む貯蔵槽、 −ある一定量の粒子を有する溶液が前記貯蔵槽から供給される第１容器、 −前記粒子の特定のものを蓄積するための第２容器、 −第１容器から特定の粒子の一を抜き取って、該特定の粒子を第２容器へ輸送す
   るための毛細管素子、 −コンピュータシステム、 −粒子の画像を記録して、画像をデジタル方式でコンピュータシステムに伝達す
   るためのカメラシステム、 −コンピュータシステム内で実行されるコンピュータプログラムであって、画像
   を評価し、同定し、そして予め決められたパラメータ、プロトコル、特定の粒子
   の物理的／化学的および／または生化学的特徴によって画像から特定の粒子を選
   択し、該特定の粒子の抜き取りおよび輸送を制御するもの を含んで成る、粒子の自動分離装置。
2. 【請求項２】 −第１容器が透明部分を有するチューブを含み、該チューブ
   が貯蔵槽と連結されており、 −前記チューブが、粒子を含む溶液の貯蔵槽からの内部流れを有し、 −カメラシステムが透明部分で粒子の画像を記録し、 −毛細管素子が、前記チューブと繋がっているマイクロポンプを含み、該マイク
   ロポンプが、コンピュータシステムからの信号によって、第２容器と連結されて
   いる側方の管へ特定の粒子を含む少量の溶液を汲み上げることにより特定の粒子
   を前記溶液から抜き取る 請求項１記載の装置。
3. 【請求項３】 毛細管素子が、 −特定の粒子を第１容器から抜き取るための、透明な毛細管先端部を有するピペ
   ットであって、コンピュータプログラムを含むコンピュータシステムで制御され
   る移動素子によって移動するピストンを含むもの、 −ピペットを特定の粒子の位置へと移動させて、特定の粒子を抜き取った後、該
   特定の粒子を第２容器へ輸送するためのモーターを含む移動ステージであって、
   コンピュータプログラムを含むコンピュータシステムで制御されているもの を含む、請求項１記載の装置。
4. 【請求項４】 毛細管素子が、 −粒子を含む少量の溶液を第１容器から吸引することによって特定の粒子を第１
   容器から抜き取るための、透明な毛細管先端部を有するピペット、 −特定の粒子を毛細管先端部から第２容器へ輸送するためにピペットと連結され
   た輸送チューブ、 −ピペット内部のピストン、 −ピストンを第１位置と第２位置との間で動かすための移動素子であって、前記
   ピストンが第１位置では操作を阻止し、そして第２位置で毛細管先端部と輸送チ
   ューブの間に連結を確立するような第１位置と第２位置を決めるコンピュータプ
   ログラムを含むコンピュータシステムで制御されるもの、 −ピストンが第２位置にあるときに、溶液が毛細管先端部から輸送チューブへ輸
   送されるように、第２容器内および輸送チューブ内に低い圧力を生じさせる吸引
   素子、 −毛細管先端部を有するピペットを、第１容器内の溶液中の選択された特定の粒
   子の位置へと移動させるためのモーターを含む移動ステージであって、コンピュ
   ータプログラムを含むコンピュータシステムで制御されているもの を含む、請求項１記載の装置。
5. 【請求項５】 毛細管素子が、 −粒子を含む少量の溶液を第１容器から吸引することによって特定の粒子を第１
   容器から抜き取るための、透明な毛細管先端部を有するピペット、 −特定の粒子を毛細管先端部から第２容器へ輸送するための、ピペットと連結さ
   れた輸送チューブ、 −ピペットに連結された供給用チューブ、 −ピペット内部のピストン、 −ピストンを第１位置と第２位置との間で動かすための移動素子であって、該移
   動素子が、前記ピストンが、第２位置において、毛細管先端部と輸送チューブの
   間に連結を確立し、かつ供給用チューブと輸送チューブの間の連結を阻止するよ
   うな第１位置と第２位置を決めるコンピュータプログラムを含むコンピュータシ
   ステムで制御されるもの、 −ピストン内の中空の溝であって、第１位置でのピストンが、毛細管先端部と前
   記２種のどのチューブの間の連結も阻止するが、供給用チューブから輸送チュー
   ブへ流体が流れることができるように供給用チューブと輸送チューブとを繋いて
   いるもの、 −ピストンが第１位置にあるときには、溶液が供給用チューブから輸送チューブ
   へ輸送され、ピストンが第２位置にあるときには、溶液が毛細管先端部から輸送
   チューブへ輸送されるように、第２容器内および輸送チューブ内に低い圧力を生
   じさせる吸引素子、 −毛細管先端部を有するピペットを、第１容器内の溶液中の選択された特定の粒
   子の位置へと移動させるためのモーターを含む移動ステージであって、コンピュ
   ータプログラムを含むコンピュータシステムで制御されているもの を含む、請求項１記載の装置。
6. 【請求項６】 毛細管素子が、 −粒子を含む少量の溶液を第１容器から吸引することによって特定の粒子を第１
   容器から抜き取るための、透明な毛細管先端部を有するピペット、 −特定の粒子を毛細管先端部から第２容器へ輸送するための、ピペットと連結さ
   れた輸送チューブ、 −ピペットに連結された供給用チューブ、 −ピペット内部の回転可能なシリンダーコア、 −該回転可能なシリンダーコアを第１位置と第２位置との間で回転させるための
   回転素子であって、第１位置と第２位置を決めるコンピュータプログラムを含む
   コンピュータシステムで制御されているもの、 −回転可能なシリンダーコア内の中空の溝であって、回転可能なシリンダーコア
   が第１位置にあるときには、供給用チューブと輸送チューブを繋いでかつ毛細管
   先端部との連結を閉鎖し、そして回転可能なシリンダーコアが第２位置にあると
   きには、毛細管先端部と輸送チューブを繋いでかつ供給用チューブを閉鎖するも
   の、 −回転可能なシリンダーコアが第１位置にあるときには、溶液が供給用チューブ
   から輸送チューブへ輸送され、回転可能なシリンダーコアが第２位置にあるとき
   には、溶液が毛細管先端部から輸送チューブへ輸送されるように、第２容器内お
   よび輸送チューブ内に低い圧力を生じさせる吸引素子、 −毛細管先端部を有するピペットを、第１容器内の溶液中の選択された特定の粒
   子の位置へと移動させるためのモーターを含む移動ステージであって、コンピュ
   ータプログラムを含むコンピュータシステムで制御されているもの を含む、請求項１記載の装置。
7. 【請求項７】 貯蔵槽が、 −上部壁面、下部壁面および曲がった壁面を有する、懸濁液の周りのシリンダー
   マントル、 −貯蔵槽内の内部容積を第１、第２および第３容積に互いに明確に分割する第１
   および第２液体浸透性メンブランであって、第１容積が第１メンブランとマント
   ルの上部壁面との間であり、第２容積が前記メンブラン間であり、および第３容
   積が第２メンブランとマントルの下部壁面との間であるもの、 −貯蔵槽の少なくとも部分的に内部にある心棒であって、シリンダーマントルの
   中心に沿って位置し、心棒に沿って第１メンブランが可動し得るもの、 −心棒に沿った第１メンブランの制御された移動のための移動素子、 −チューブ付きポンプであって、第１容積からチューブを通じて第３容積へ懸濁
   液を汲み上げるもの、 −貯蔵槽から第１容器へ懸濁液を供給するための供給用チューブ を含む、請求項１記載の装置。
8. 【請求項８】 粒子が特定の細胞種である請求項１〜７のいずれかに記載の
   装置。
9. 【請求項９】 粒子が、器質的な組織を解離法で処理することによって得ら
   れる細胞クラスターである請求項１〜８のいずれかに記載の装置。
10. 【請求項１０】 粒子がランゲルハンス島である請求項１〜９のいずれかに
    記載の装置。