JP2002524065A

JP2002524065A - 副甲状腺ホルモン化合物のルシフェラーゼレポーターバイオアッセイ

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Publication number: JP2002524065A
Application number: JP2000568460A
Authority: JP
Inventors: リチャードエフラボーディニール; クラレンスシーモース; キンティユー; グレッグアールクラムリー
Original assignee: アヴェンティスファーマシューティカルズインコーポレイテッド
Priority date: 1998-09-04
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2002-08-06
Also published as: CA2342926C; EP1151156B1; AU749288B2; NO20011118L; EP1151156A4; WO2000013651A3; DE69924027T2; NO326423B1; EP1151156A2; WO2000013651A2; ATE290214T1; DE69924027D1; CA2342926A1; ES2235547T3; AU6023799A; NO20011118D0

Abstract

(57)【要約】本発明は、副甲状腺ホルモン化合物の機能性を決定するためのバイオアッセイに関する。特に、本発明は、試験される化合物を、複数のｃＡＭＰ応答要素の転移制御下にあるレポーター遺伝子を保持する副甲状腺ホルモンレセプター発現性細胞の培養物に添加するバイオアッセイに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）発明の分野本発明は副甲状腺ホルモン化合物の機能性を決定するためのバイオアッセイに
関する。より具体的には、本発明は、複数のc-AMP応答要素の転写制御下にある
レポーター遺伝子を保持する副甲状腺ホルモンレセプター発現細胞の培養物にテ
ストすべき化合物が添加されるバイオアッセイに関する。更に具体的には、本発
明は、複数のc-AMP応答要素の転写制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝
子を保持する副甲状腺ホルモンレセプター発現細胞の培養物にテストすべき化合
物が添加されるバイオアッセイに関する。

【０００２】発明の背景ヒト副甲状腺ホルモン(hPTH)はカルシウム恒常性の主要な制御因子である、84
アミノ酸のタンパク質である。副甲状腺関連タンパク質（hPTHrP）はhPTHにN-末
端相同性を有する139〜171アミノ酸のタンパク質である。hPTHおよびhPTHrPのN-
末端断片、特に１〜34アミノ酸からなる断片は、もとのホルモンの完全な生物学
的活性を維持している。 hPTHの生物学的活性は以下の２種の２次メッセンジャー系の活性化に反映され
る：G-タンパク質共役アデニルシクラーゼ(AC)およびプロテインキナーゼＣ(PKC
)活性。N-末端断片hPTH(1-34)OHおよびhPTH(1-31)NH₂はそれぞれヒトおよび卵巣
摘出ラットにおいて骨形成に関して同化的であることが示されている。この骨成
長における増大はアデニルシクラーゼ活性の刺激と共役していることが示されて
いる。これらのN-末端断片のアナログは、低カルシウム血症、骨粗しょう症、オ
ステオペニア(osteopenia)、骨粗しょう症およびオステオペニアと関連した疾病
、および、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症並びにクッシング症候群の
ようなオステオペニア、グルココルチコイド-および免疫抑制剤-誘導性オステオ
ペニア、および骨折並びに再骨折修復、を含む骨細胞カルシウム制御と関連した
生理学的状態の治療に関して重要な治療的潜在能力を有している。 hPTHアナログの発見を効果的にするために、これらのアナログの機能性を決定
する方法に対する需要が存在する。そのような方法は簡単で、感度が良く、複数
の化合物を迅速にスクリーニングできるように自動化に向いているべきである。

【０００３】（発明の開示）発明の概要本発明は、副甲状腺ホルモン化合物の機能性を決定するための方法であり、（ａ）複数のcAMP応答要素の転写制御下にあるレポーター遺伝子を保持した副甲
状腺ホルモンレセプター発現細胞の培養物に化合物を添加すること、および（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現の変化を測定すること、を含む方法である。

【０００４】好ましくは、レポーター遺伝子発現の変化は、レポーター遺伝子発現の適当な
対照レベルに比較される。測定されることのある適切な対照には、副甲状腺ホル
モン化合物の非存在下における発現および／または既知の副甲状腺ホルモンレセ
プターアゴニストの存在下における発現が含まれるが、これらには限定されない
。副甲状腺ホルモンアゴニストには、hPTH(1-34)OHおよびhPTH(1-31)NH₂が含ま
れるが、これらには限定されない。細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。好ましくは、細胞は哺乳
動物細胞である。細胞は副甲状腺ホルモンレセプターをコードする内在性または
外来性核酸を含んでいてよい。好ましくは、細胞は副甲状腺ホルモンレセプター
をコードする外来性核酸を含んでいる。 cAMP応答要素の数は、cAMPの存在下でレポーター遺伝子の細胞内発現を駆動す
るために充分でなければならない。好ましくは、cAMP応答要素の数は約１０より
も多い。より好ましくは、cAMP応答要素の数は約16である。レポーター遺伝子は、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼおよびルシフェラーゼから選ばれて
よいが、これらには限定されない。

【０００５】（発明を実施するための最良の形態）発明の詳細な説明本発明の種々の側面が以下の節においてより詳細に記述される。種々の節に構
成するのは本発明の理解を容易にすることを意図したものであり、いかなる点で
も本発明の限定を意図したものではない。

【０００６】定義以下に定義する用語は本明細書を通して使用され、本発明の範囲および実施を
理解する上で助けになるはずである。具体的な実施態様において、「約」または「およそ」とは、与えられた値また
は範囲の20％以内、好ましくは10％以内、より好ましくは５％以内をいう。「核酸」とは、共有結合したヌクレオチドと呼ばれる単位からなるポリマー化
合物である。核酸には、ポリリボ核酸（RNA）およびポリデオキシリボ核酸(DNA)
が含まれ、いずれも一本鎖であっても二本鎖であってもよい。DNAにはcDNA、ゲ
ノムDNA、合成DNA、半合成DNAが含まれる。「遺伝子」とは、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合をいい、cDNA
およびゲノムDNA核酸を含む。「組換えDNA分子」とは、分子生物学的操作を受けたDNA分子を言う。

【０００７】「ベクター」とは、核酸を宿主細胞に導入する一切の手段を言う。ベクターは
別のDNA断片が接続されたレプリコンであってよく、その結合された断片の複製
を生じさせるものであってよい。「レプリコン」とは、in vivo DNA自己複製単
位として機能する、すなわち、自身の制御下に複製可能な一切の遺伝的要素であ
る（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）。用語「ベ
クター」は、核酸を細胞にin vitro、ex vivo、またはin vivoで導入するための
ウイルス性および非ウイルス性手段の両方を含む。ウイルスベクターには、レト
ロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスベクター、バキュ
ロウイルスベクター、単純ヘルペスベクター、エプスタイン-バーウイルスベク
ターおよびアデノウイルスベクターが含まれ、以下により詳しく記述される。非
ウイルス性ベクターには、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチ
ン）、DNA-タンパク質複合体およびバイオポリマーが含まれる。核酸に加えて、
ベクターは１以上の制御領域および／または選抜、測定、および核酸導入結果（
導入組織、発現の持続時間等）の監視に有用な選抜マーカーを含んでもよい。

【０００８】「クローニングベクター」とは、プラスミド、ファージまたはコスミドのよう
なレプリコンであって、別のDNA断片が接続されてその接続された断片の複製を
生じさせるようなものであってよい。クローニングベクターは一つの細胞型にお
いて複製可能で、他の細胞型において発現可能であってもよい（「シャトルベク
ター」）。「カセット」とは、特定の制限酵素部位においてベクターに挿入可能なDNA断
片をいう。DNA断片は注目しているポリペプチドをコードしており、カセット及
び制限酵素部位は、転写および翻訳のための適切なオープンリーディングフレー
ム中へのカセットの挿入を保証すべく設計される。外来性または異種DNAが細胞内へ導入された場合に、細胞はそのようなDNAによ
って「トランスフェクション」されたという。導入されたDNAが表現型変化を生
じさせた場合に、細胞は外来性または異種DNAによって「形質転換」されたとい
う。形質転換DNAは染色体DNAに組み込まれて（共有結合）その細胞のゲノムを構
成し得る。

【０００９】「核酸分子」とは、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンま
たはシチジン；「RNA分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデ
ノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンまたはデオキシシチジン；「DN
A分子」）のリン酸エステルポリマー型、または、ホスホロチオエートおよびチ
オエステルのようなそれらのリン酸エステルアナログをいい、１本鎖型および二
重らせんのいずれをもいう。二重鎖DNA-DNA、DNA-RNAおよびRNA-RNAらせんが可
能である。用語、核酸分子、特にDNAまたはRNA分子とは、分子の１次および２次
構造をいい、特定のいかなる３次形態に限定されるものではない。従って、この
語は、特に直線又は環状DNA分子（例えば、制限断片）、プラスミドおよび染色
体に見られる二重鎖DNAを含む。本明細書において特定の二重鎖DNA分子の構造を
議論する際に、通常の慣習に従ってDNAの非転写鎖の5'から3'方向にその配列の
みを記載することによってその配列が記載されることがある。「組換えDNA分子
」は分子生物学的操作を受けたDNA分子である。

【００１０】核酸分子は、一本鎖状態にある該核酸分子が、適当な温度並びに溶液イオン強度
条件下で、他の核酸分子とアニール可能な場合には、該他の核酸分子、例えばcDNA、
ゲノムDNA、またはRNAと「ハイブリッド化可能」である(Sambrook等の上記文献参照
)。これらの温度並びにイオン強度条件は、このハイブリダイゼーションの「厳密性
」を決定付ける。相同核酸について予備的にスクリーニングするためには、T_m55℃
に相当する厳密性の低いハイブリッド化条件、(例えば5xSSC、0.1% SDS、0.25％ミ
ルク、およびホルムアミド添加なし；または30%ホルムアミド、5xSSC、0.5% SDS)を
利用できる。中程度に厳密なハイブリダイゼーション条件は、より高いT_m、例えば4
0%ホルムアミド、5xまたは6xSSCに相当する。高度に厳密なハイブリッド化条件は、
最大のT_m、例えば50%ホルムアミド、5xまたは6xSSCに相当する。ハイブリダイゼー
ションは、これら２種の核酸が、相補的な配列を含むことを要求するが、該ハイブ
リダイゼーションの厳密性に依存して、塩基間のミスマッチも起こり得る。核酸の
ハイブリッド化のための適当な厳密性は、当分野で周知の変数である、核酸の長さ
および相補性の程度に依存する。２種のヌクレオチド配列間の類似性または相同
性の程度が高いほど、これら配列を持つ核酸のハイブリッドに関するT_mの値は高
くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性(より高いT_mに対応)は、以
下の順に低くなる：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。長さ100ヌクレオチドを超える
ハイブリッドについて、T_mを計算するための式が導かれている(Sambrook等の上記
文献、9.50-0.51参照)。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイ
ゼーションについては、ミスマッチの位置は、より一層重要になり、該オリゴヌク
レオチドの長さが、その特異性を決定付ける(Sambrook, Fritsch & Maniatis, Mo
lecular Cloning: A Laboratory Manual,第2版(1989), Cold Spring Harbor Pre
ss, Cold Harbor Spring, NY, 11.7-11.8)。好ましくは,ハイブリッド化可能な核
酸に関する最小の長さは,少なくとも約10ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約
15ヌクレオチドであり、また最も好ましくは、該長さは少なくとも約20ヌクレオチ
ドである。

【００１１】特定の一態様において、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」とは、T_m5
5℃を意味し、また上記のような条件を使用する。好ましい一態様において、該T_mは
60℃であり、より好ましい態様において、該T_mは6５℃である。 DNAコード配列は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたは
インビボで、細胞内のポリペプチドに転写され、かつ翻訳される。該コード配列の
境界は、その5'(アミノ)末端における開始コドンおよびその3'(カルボキシル)末
端における翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核配列、真核mRN
A由来のcDNA、真核生物(例えば、哺乳動物)DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DN
A配列さえも包含するが、これらに制限されない。該コード配列が、真核細胞内での
発現を意図している場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は、通常該
コード配列に対して3'に位置するであろう。転写および翻訳調節配列は、DNA調節配列、例えばプロモータ、エンハンサー、タ
ーミネータ等であり、これらは宿主細胞内でコード配列を発現するために与えら
れる。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは、制御配列である。

【００１２】「プロモータ配列」とは、細胞内のRNAポリメラーゼと結合でき、かつ下流側(3'方
向)のコード配列の転写を開始することのできる、DNA調節領域である。本発明を完
成する目的で、該プロモータ配列は、その3'末端において、該転写開始サイトと結
合しており、かつ上流側(5'方向)に伸びて、バックグラウンドを越える検出可能な
レベルにて、転写を開始するのに必要な、最小数の塩基または要素を含む。該プロ
モータ配列内には、転写開始サイト(例えば、ヌクレアーゼS1を用いたマッピング
によって、有利に定義される)並びにRNAポリメラーゼの結合に対して応答性のタ
ンパク結合ドメイン(共通配列)が見出される。コード配列は、RNAポリメラーゼが該コード配列をmRNAに転写する場合(該mRNA
は、次いで(該コード配列がイントロンを含む場合には)、trans-RNAスプライシン
グされ、かつ該コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される)、細胞
内で、転写および翻訳制御配列の「制御下に」ある。本明細書で使用する「相同」とは、そのあらゆる文法上の形態および表記上の変
形において、上科由来のタンパク(例えば、免疫グロブリンの上科)および異なる種
由来の同類タンパク(例えば、ミオシン軽鎖等)を包含する、「共通の進化上の起源」
をもつタンパク質間の関係を意味する(Reeck等, Cell, 1987, 50:667)。このよう
なタンパク(およびそのコード遺伝子)は、これらの高い配列類似性によって反映
されるように、配列の相同性を持つ。

【００１３】従って、用語「配列類似性」とは、そのあらゆる文法上の形態において、核酸と、共
通の進化上の起源をもつまたはもたないタンパクのアミノ酸配列との間の、同一
性または相関の程度を意味する(Reeck等の上記文献)。しかし、通常の使用および
本特許出願において、該用語「相同」とは、「高度に」等の副詞により修飾された場合
には、配列類似性を意味し、共通の進化上の起源をもたない可能性がある。特定の態様において、２つのDNA配列は、該ヌクレオチドの少なくとも約50%(好
ましくは少なくとも約75%、および最も好ましくは少なくとも約90または95%)が、D
NA配列の規定された長さに渡り一致する場合には、「実質的に相同」または「実質的
に類似」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて入手できる標
準的なソフトウエアを利用して、あるいは例えば該当する特定の系について規定
された厳密な条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において、これら配
列を比較することによって明らかにすることができる。適当なハイブリダイゼー
ション条件の規定は、当業者の能力の範囲内にある。例えば、Maniatis T.等のMole
cular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Harbo
r Spring, NY, 1982; (第2版, 1989)を参照のこと。「シグナル配列」は、細胞表面上で発現されるタンパク質の、コード配列の初めに
含まれている可能性がある。この配列は、該成熟ポリペプチドに対してN-末端のシ
グナルペプチドをコードし、該シグナルペプチドは、該宿主細胞が、該ポリペプチ
ドを転位するするよう指示する。該用語「転位シグナル配列」とは、本明細書におい
て、この種のシグナル配列をあらわすために使用する。転位シグナル配列は、真核
生物および原核生物に固有の種々のタンパク質と結合していることを理解するこ
とができ、またこれら両者の型の生物において、しばしば機能性である。

【００１４】「調節配列」とは、第二の核酸配列の発現を調節する、核酸配列を意味する。調節
配列は、当然特定の核酸(相同領域)の発現を担う配列を含むことができ、あるいは
異なるタンパク質あるいは合成タンパク質(異種領域)の発現をも担う、異なる起
源の配列を含むこともできる。特に、これら配列は、真核生物またはウイルス遺伝
子の配列であり得、または特異的または非-特異的に、あるいは誘発的または非-誘
発的に、遺伝子の転写を刺激または抑制する誘導配列であり得る。調節領域は、複
製の起点、RNAスプライシングサイト、プロモータ、エンハンサー、転写終止配列、該
ポリペプチドを該ターゲット細胞の分泌経路に向かわせるシグナル配列、および
プロモータを含む。「異種の源」由来の調節領域は、発現された核酸とは必ずしも結合していない調
節配列である。この異種調節配列に含まれるものは、種々の種由来の調節領域、異
なる遺伝子を由来とする調節領域、ハイブリッド調節配列、および天然には存在し
ないが、当業者により設計される調節配列である。「異種」DNAとは、必ずしも該細胞中にまたは該細胞の染色体サイトには存在しな
いDNAを意味する。好ましくは、この異種DNAは、該細胞にとっては外来の遺伝子を
包含する。 "ポリペプチド"は、共有結合したアミノ酸残基を含むポリマー化合物である。
アミノ酸は以下の一般構造を有する：

【００１５】

【００１６】アミノ酸は、側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類される：（１）脂肪族側鎖、（２
）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含む側鎖、（３）硫黄原子を含む側鎖、（４）酸性
基又はアミド基を含む側鎖、（５）塩基性基を含む側鎖、（６）芳香族環を含む
側鎖及び（７）プロリン、側鎖がアミノ基と縮合しているイミノ酸。本発明のポ
リペプチドは好ましくは少なくとも１４のアミノ酸を含む。 “タンパク質”は、生細胞において構造上の又は機能的な役割を果たすポリペ
プチドである。 “副甲状腺ホルモン”及び“ＰＴＨ”という用語は、ヒトの副甲状腺ホルモン
（ｈＰＴＨ）及びヒト副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ｈＰＴＨｒＰ）を意味
する。

【００１７】ＰＴＨ又はｈＰＴＨポリペプチド又はタンパク質の“変種”は、ポリペプチド
又はタンパク質から誘導する類似体、断片、誘導体又は変異体のすべてであり、
かつ該ポリペプチド又はタンパク質の生物学的な性質の少なくとも一つを維持し
ているものである。ポリペプチド又はタンパク質の異なる変種は天然に存在し得
る。これらの変種は、タンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列に
おける相違を特徴とする対立遺伝子の変種であることができ、又はディファレン
シャルスプライシング（differential splicing）若しくは翻訳後変性を含んで
もよい。当業者は単一又は複数のアミノ酸を置換、削除、付加又は交換した変種
を製造することができる。これらの変種はとりわけ以下を含む：（ａ）１以上の
アミノ酸残基をコンサーバティブ（conservative）又は非−コンサーバティブな
（non-conservative）アミノ酸で置換した変種、（ｂ）１以上のアミノ酸をポリ
ペプチド又はタンパク質に付加した変種、（ｃ）１以上のアミノ酸が置換基を含
む変種及び（ｄ）ポリペプチド又はタンパク質が他のポリペプチド、例えば血清
アルブミンと縮合した変種。これらの変種を得る技術には、遺伝子的なもの（抑
圧、欠失、突然変異等）、化学的なもの、及び酵素によるものがあり、当分野に
おける当業者に公知である。

【００１８】このような対立遺伝子の変異体、類似体、断片、誘導体、突然変異体、及び変
性体、並びに代替的なｍＲＮＡスプライシング形態及び代替的な翻訳後変性形態
が、結果としてポリペプチドの生物学的な特性のいずれかを保持するポリペプチ
ド誘導体となる場合は、これらが本発明の範囲内に含まれることが意図されてい
る。細胞中で自然に産生されないタンパク質を“異種タンパク質”という。約４０％を越えるアミノ酸が同一である場合、又は６０％を越えるアミノ酸が
類似している（機能的に同一である）場合に、二つのアミノ酸配列は“実質的に
相同“又は“実質的に類似”である。好ましくは、類似する又は相同の配列を、
例えばＧＣＧ（Genetic Computer Group, Program Manual for the GCG Package
, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアップ（pileup）プログラムを使用
して一直線に並べて同定する。 “対応する”という用語を本明細書では、類似性又は相同性を調べる分子と正
確な位置が同一であるか又は異なっている分子を、類似又は相同配列と呼ぶため
に使用する。核酸配列又はアミノ酸配列の列びはスペースを含むことができる。
従って、“対応する”という用語は配列の類似性をいうのであって、アミノ酸残
基又はヌクレオチド塩基の番号をいうのではない。

【００１９】 “副甲状腺ホルモン化合物”という用語は、本明細書で規定する副甲状腺ホル
モン又はその断片、変種若しくは類似体を意味する。“類似体”という用語は、
副甲状腺のレセプターに結合することができるすべての化合物を意味する。副甲
状腺ホルモン化合物は親のヒト副甲状腺ホルモン又はヒト副甲状腺ホルモン関連
タンパク質の誘導体であることができる。これらの誘導体を、ペプチド化合物に
おけるＮ−末端から始まるアミノ酸残基の数を示すためにかっこ内の数字を使用
して示す。例えば、ｈＰＴＨ（１−３４）は、ヒト副甲状腺ホルモンの最初の３
４個のアミノ酸を含む副甲状腺ホルモン化合物である。 “副甲状腺レセプター”及び“ＰＴＨレセプター”は天然に存在する若しくは
“野性型の”若しくは同起源のヒト副甲状腺ホルモンレセプター、又は天然に存
在する同起源のレセプターに対応している操作して変性した若しくは遺伝子工学
的に操作した相同体を意味する。副甲状腺レセプターを変性し又は遺伝子工学的
に操作した相同体に関して使用する場合に“操作して”という用語は、変性し又
は遺伝子工学的に操作したレセプターがその意図した目的に作用することを意味
する。副甲状腺ホルモン化合物の“機能性”は、その化合物が副甲状腺ホルモンのレ
セプターに結合し、かつ細胞間ｃＡＭＰの産生を刺激し又は阻害する能力に関す
る。好ましくは、該機能性はｃＡＭＰの産生を刺激するものである。

【００２０】 “レポーター遺伝子”は、異種プロモーター又はエンハンサーに結合したコー
ディング配列を意味し、構造体を細胞に導入した場合にその産生物が容易にかつ
定量的に分析される。本発明に従うと、異種プロモーターは複数のｃＡＭＰ応答
要素を含み、該素子がｃＡＭＰと結合すると遺伝子の発現を誘導する。レポータ
ー遺伝子の細胞への導入は米国特許第５，２９８，４２９号に記載されており、
これを参考として本明細書に取り込む。代表的なレポーター遺伝子は、β−ガラ
クトシダーゼ（ｌａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ｃａｔ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）等をコードする細菌遺伝子及びル
シフェラーゼを含む。好ましいレポーター遺伝子はルシフェラーゼである。ルシ
フェラーゼのレポーター遺伝子としての使用は以下の刊行物に記載されており、
これらを参考として本明細書に取り込む。 1. Babichuk, et. al., 1996, Journal of Biological Chemistry, 1996, 271(2
8), 16485-16493; 2. Castanon, et. al., Biochemical and Biophysical Research Communication
s, 1994, 198(2), 626-631; 3. Goa, et. al., Journal of Immunology, 1993, 150(10), 4376-4385; 4. Germain, et. al., Biochemical Journal, 1996, 316, 107-113; 5. Ghozi, et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 1935-1940; 6. Himmeler, et. al., Journal of Receptor Research, 1993, 13(1-4), 79-94
; 7. Midgeon, et. al., Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(46), 291
46-29152; 8. Pei, et. al., Molecular Endocrinology, 1991, 5(4), 521-534; 9. Stachowiak, et. al., Brain Research. Molecular Brain Research, 1994,
22(1-4), 309-319; 及び 10. Tilly, et. al., Encocrinology, 1992, 131(2), 799-806。

【００２１】本発明のバイオアッセイを、ＰＴＨレセプターを発現する細胞にレポーター遺
伝子を導入することによって構築する。レポーター遺伝子のプロモーター領域に
は複数のｃＡＭＰ応答要素が含まれ、これがｃＡＭＰと結合すると遺伝子の発現
を誘導する。従って、レポーター遺伝子が発現する程度は、細胞中のｃＡＭＰレ
ベルの関数として変化する。副甲状腺ホルモン化合物が結合すると、ＰＴＨレセ
プターが細胞間ｃＡＭＰの産生を刺激し、その程度は副甲状腺ホルモン化合物に
よるレセプターの活性化の大きさに依存する。従って、ｃＡＭＰにおけるレセプ
ターが仲介する増加はレポーター遺伝子の発現の増加に関連している。レポータ
ー遺伝子の発現を測定することにより、副甲状腺ホルモン化合物によるＰＴＨレ
セプターの活性化を直ちに測定することができる。本発明が、本発明の目的を達成するのに十分適合し、先に述べた本発明に固有
の結果及び利点を得ることを、当業者は直ちに理解するであろう。以下に記載す
る実施例は好ましい態様の代表例として示され、又は典型例を意図しており、本
発明の範囲を限定する意図はない。

【００２２】実施例一般的な分子生物学的技術分子生物学において伝統的に使用される方法、例えばプラスミドＤＮＡの分離
抽出、塩化セシウム勾配中でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロース又はア
クリルアミドゲル電気泳動、電気溶出（electroelution）によるＤＮＡフラグメ
ントの精製、フェノール又はフェノール／クロロホルムを用いたタンパク質抽出
、生理的食塩水媒体中でのＤＮＡのエタノール又はイソプロパノール沈殿及び大
腸菌（Escherichia coli）での形質転換等は当業者にとって周知であり、文献に
十分に記載されている（Maniatis Tら, "Molecular Cloning, a Laboratory Man
ual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; (2n
d Ed. 1989); Ausubel F.M.ら（編）, "Current Protocols in Molecular Biolo
gy", John Wiley & Sons, New York, 1987）。通常のクローニング媒体には、ｐＢＲ３２２及びｐＵＣタイプのプラスミド並
びにＭ１３シリーズのファージが含まれる。これらは商業的に入手されるだろう
（Bethesda Research Laboratories）。連結のために、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気
泳動によりその大きさにしたがって分離し、フェノール／クロロホルム混合物に
より抽出し、エタノールで沈殿させ、次いで製造者の勧めにしたがいファージＴ
４ＤＮＡリガーゼ（Biolabs）の存在下でインキュベートするだろう。５’側の突き出た（protruding）末端の充填は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントを製造者による説明書にしたがい用いて行われるだろう
。３’側の突き出た末端の破壊は、製造者の勧めにしたがい用いたファージＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ（Biolabs）の存在下で行う。５’側の突き出た末端の破
壊は、Ｓ１ヌクレアーゼによる制御された処理により行う。合成オリゴデオキシヌクレオチドによるin vitro変異誘発は、Amershamにより
配布されるキットを用いて、Taylorら（Nucleic Acids Res. 13(1985) 8749-876
4）により開発された方法にしたがい行われるだろう。ＰＣＲ技術（ポリメラーゼ連鎖反応、Saiki R.K.ら, Science 230(1985) 1350
-1354; Mullis K.B.及びFaloona F.A., Meth. Enzym. 155(1987) 335-350）によ
るＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、「ＤＮＡサーマルサイクラー」（Perkin
Elmer）を製造者による説明書にしたがい使用することにより行われるだろう。ヌクレオチド配列の確認は、Amershamにより配布されるキットを用いて、Sang
erら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74(1977) 5463-5467）により開発された方
法により行われるだろう。プラスミドＤＮＡは、Qiagenプラスミド精製システムを製造者の指示にしたが
い用いて精製されるだろう。

【００２３】ヒトＰＴＨレセプター発現ＨＥＫ−２９３細胞この細胞系は、Pinesら, Endocrinology, 1994, 135(4), 1713-1716に記載（
参照することにより本明細書に組み込まれる）の方法により得られる。ルシフェラーゼレポーター遺伝子ｃＡＭＰ応答要素を保持するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を、Spen
glerら, Nature, 1993, 365:170-175に記載（参照することにより本明細書に組
み込まれる）の方法を用い、ｐＤＭＣ１６ＬＵＣベクターからＰＣＲにより増幅
する。ＭＭＴＶプロモーター、１６のｃＡＭＰ応答要素及びルシフェラーゼ遺伝
子を含むＰＣＲ産物をゼオシン（zeocin）耐性ベクター（ｐＵＴＳＶ１（InVitr
ogen））へ挿入する。ｐＭＣＬ３ｚｅｏと命名した最終のベクターを、リポフェ
クタミン（lipofectamine）法（試薬及び方法はGibco/BRLより入手）を用いて、
ＰＴＨレセプター発現ＨＥＫ−２９３細胞へ導入する。ルシフェラーゼレポータ
ー遺伝子を取り込んだ細胞は、培養培地にゼオシンを含ませることにより選択す
る。限界希釈により異なる細胞クローンを単離し、拡張する。これらのクローン
を、ルシフェラーゼ発現の点からＰＨＴに対する反応性について試験する。ＰＴ
Ｈにより５〜６倍のルシフェラーゼ誘導を示したクローンをアッセイの開発に使
用する。ルシフェラーゼレポーターッセイ手順ルシフェラーゼレポーター遺伝子を保持するｈＰＴＨレセプター発現ＨＥＫ−
２９３細胞を８０〜９０％のコンフルエンシーで培養する。試薬がＰＴＨレセプ
ターと相互作用する能力を評価するために、試験化合物を培養培地へ適切な希釈
で添加する。ｈＰＴＨ（１−３４）をポジティブコントロールとして使用する。
ルシフェラーゼ発現の誘導は３７℃で行う。誘導後、培養培地を除去し、細胞を
溶菌緩衝液（ルシフェラーゼアッセイキット（Promega Corp.））の添加により
溶菌する。溶菌液を黒色の９６穴プレートに分取する。溶菌液中のルシフェラー
ゼ活性は、ルシフェリン基質（Promegaアッセイキット）添加による光の生成の
より測定する。光の出力はWallac Trilux microbeta plate readerにて測定する
。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を保持するｈＰＴＨレセプター発現ＨＥＫ−
２９３細胞をｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰＴＨ（１−２７）及びｈＰＴＨ（１−
２８）を用いて８時間誘導した後のルシフェラーゼ活性を図１に示す。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を保持するｈＰＴＨレセプター発現ＨＥＫ−
２９３細胞をｈＰＴＨ（１−３４）、ｈＰＴＨ（１−３１）及びｈＰＴＨ（１−
２７）及びｈＰＴＨ（３−３４）を用いて一晩（約１６時間）誘導した後のルシ
フェラーゼ活性を図２に示す。

【００２４】本発明は、明細書に記載する特定の態様によってその範囲が制限されるもので
はない。実際に、本明細書に記載の態様に加えて本発明の種々の改変が、本明細
書及び図面から当業者に明らかであろう。そのような改変も本発明の範囲内にあ
ることが意図される。更に核酸又はポリペプチドについて与えられる全ての塩基の大きさ又はアミノ
酸の大きさ及び分子量の値は概算値であり、それが明細書に記載される。本明細書において引用した種々の刊行物及びその開示内容は参照することによ
りその全体が本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はルシフェラーゼレポーター遺伝子を保持したhPTHレセプタ
ー発現HEK-293細胞を、hPTH(1-34)（◆で表した）、hPTH(1-27)（■で表した）
およびhPTH(1-28)（▲で表した）で８時間刺激したことに伴うルシフェラーゼ誘
導のプロットである。

【図２】図２は、図１はルシフェラーゼレポーター遺伝子を保持したhP
THレセプター発現HEK-293細胞を、hPTH(1-34)（◆で表した）、hPTH(1-31)（■
で表した）、hPTH(1-27)（▲で表した）およびhPTH(３-34)（記号×で表した）
で一晩（約16時間）の刺激に伴うルシフェラーゼ誘導のプロットである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/68 33/566 33/74 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 33/74 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者モースクラレンスシーアメリカ合衆国ペンシルバニア州 19468 ロイアーズフォードバックウォルターロード 34 (72)発明者ユーキンティアメリカ合衆国ペンシルバニア州 19468 リムリックギャリーウェイ 26 (72)発明者クラムリーグレッグアールアメリカ合衆国ペンシルバニア州 19147 フィラデルフィアクリスチャンストリート 620 アパートメント１エイＦターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 DA20 DA54 FB02 FB07 4B024 AA11 BA63 CA02 DA02 EA04 FA01 FA10 GA13 HA11 4B063 QA01 QA05 QQ08 QQ13 QQ22 QQ94 QR57 QR77 QR80 QS36 QS38 QX02 4B065 AA90Y AA93X AB01 AC14 BA05 BB19 CA16 CA24 CA28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】副甲状腺ホルモン化合物の機能性を決定する方法であって、
該方法が、 (a) 複数のｃＡＭＰ応答要素の転写制御下にあるレポーター遺伝子を保持す
る副甲状腺ホルモンレセプター発現性細胞の培養物に前記化合物を添加する工程
；及び (b) 前記レポーター遺伝子の発現における変化を測定する工程、を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】前記細胞が、哺乳類の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記細胞が、副甲状腺ホルモンレセプターをコードする異種
核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記ｃＡＭＰ応答要素の数が、約１０より大きい、請求項１
に記載の方法。
【請求項５】前記ｃＡＭＰ応答要素の数が、約１６である、請求項１に記
載の方法。
【請求項６】前記レポーター遺伝子が、β−ガクトシダーゼ、クロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、及びルシフェ
ラーゼからなる群から選択されたタンパク質をコードする、請求項１に記載の方
法。
【請求項７】前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼをコードする、請
求項６に記載の方法。
【請求項８】前記副甲状腺ホルモンレセプターが、ヒト副甲状腺ホルモン
レセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】副甲状腺ホルモンレセプターを細胞表面で発現し、及び複数
のｃＡＭＰ応答要素の転写制御下にあるレポーター遺伝子を含むことを特徴とす
る細胞。
【請求項１０】前記細胞が、哺乳類の細胞である、請求項９に記載の細胞
。
【請求項１１】副甲状腺ホルモンレセプターをコードする異種核酸を含む
、請求項９に記載の細胞。
【請求項１２】前記ｃＡＭＰ応答要素の数が、約１０より大きい、請求項
９に記載の細胞。
【請求項１３】前記ｃＡＭＰ応答要素の数が、約１６である、請求項１２
に記載の細胞。
【請求項１４】前記レポーター遺伝子が、β−ガクトシダーゼ、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、及びルシフ
ェラーゼからなる群から選択されたタンパク質をコードする、請求項９に記載の
細胞。
【請求項１５】前記レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼをコードする、
請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】前記副甲状腺ホルモンレセプターが、ヒト副甲状腺ホルモ
ンレセプターである、請求項９に記載の細胞。