JP2002514397A - ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法に関する。詳細には、本発明は、造血を調節することによる血小板新生および貧血の処置の方法に関する。本発明はまた、造血を制御するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド投与による免疫系再構築を調節する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを使用する造血を調節するための方
法に関する。詳細には、本発明は、造血を調節することにより血小板新生および
貧血を処置する方法に関する。本発明はまた、造血を操作するためにＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドを投与することにより免疫系再構築を調節する方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） 放射線照射処置または化学療法処置は、重度の可逆性の血小板新生、貧血、お
よび好中球減少を生じる。化学療法および放射線照射と関連した骨髄（ＢＭ）に
おける造血前駆体の枯渇は、出血性および感染性の合併症を生じる。造血系の重
度の抑制は、化学療法の使用および用量増大を制限する主要な要因である。多く
の造血サイトカインが、現在、臨床試験において、このような合併症を防ぐかま
たは低下させる処置として存在する。

【０００３】 造血発達は、２つのカテゴリーの因子によって調節されることが考慮される。
１つのカテゴリーには、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（これは、コロニー形成お
よび種々の系統の細胞の増殖を促進する）が含まれる。別のものは、強化因子（
ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）であり、これは、成熟または分化を強化する。例えば
、巨核球−ＣＳＦ（Ｍｅｇ−ＣＳＦ）としては、報告されているのは、ＩＬ−３
、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および幹細胞因子
（ＳＣＦ）が挙げられ、そして巨核球強化因子（Ｍｅｇ−Ｐｏｔ）としては、報
告されているのは、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、エリスロポエチン（ＥＰ
Ｏ）、および白血球阻害因子（ＬＩＦ）が挙げられる。血小板産生は、インビボ
での巨核球発達における最終の現象である。トロンボポイエチン（ＴＰＯ）は、
Ｍｅｇ−ＣＳＦおよびＭｅｇ−Ｐｏｔの両方を有することが報告された。

【０００４】 インターフェロン（ＩＦＮ）研究の初期において、Ｉｓａａｃｓらは、外来Ｄ
ＮＡが、ＩＦＮを誘導すると仮定した。Ｒｏｔｅｍ，Ｚら（１９６３）Ｎａｔｕ
ｒｅ １９７：５６４−５６６；Ｊｅｎｓｅｎ，ＫＥら（１９６３）Ｎａｔｕｒ
ｅ ２００：４３３−４３４。後に、合成二本鎖ＲＮＡが、ＩＦＮを誘導し得、
そしてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージの両方を活性化し得
ることが発見された。Ｆｉｅｌｄ、ＡＫら（１９６７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ５８：１００４−１０１０。続いて、Ｙａｍａｍｏｔｏ
、Ｔｏｋｕｎａｇａ、および共同研究者らは、もともとはマウスにおいてカルメ
ット‐ゲラン杆菌（ＢＣＧ）媒介腫瘍耐性を分析することを目標とした一連の研
究により免疫刺激ＤＮＡを発見した。ＢＣＧから抽出した画分（ＭＹ−１と称す
る）は、インビボで抗腫瘍活性を示し、ＮＫ細胞活性を増強し、そしてインビト
ロでマウス脾臓細胞またはヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）からＩ型およびＩＩ型
のＩＦＮ放出を引き起こすことが示された。Ｔｏｋｕｎａｇａ、Ｔら（１９８４
）Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ７２：９５５−９６２；Ｙａｍａｍ
ｏｔｏ、Ｓ．ら（１９８８）Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７９：８６６
−８７３；Ｍａｓｈｉｂａ、Ｈら（１９８８）Ｊｐｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ Ｂ
ｉｏｌ ４１：１９７−２０２。これらの活性は、ＭＹ−１のＤＮａｓｅ前処理
によって破壊され得たが、ＲＮａｓｅ処理では破壊され得なかった。Ｐｉｓｅｔ
ｓｋｙおよび共同作業者らは、独立して、正常マウスが、ヒトと同様に、抗ＤＮ
Ａ抗体を産生することにより、脊椎動物ＤＮＡではなく細菌ＤＮＡに対して応答
したことを観察した。Ｍｅｓｓｉｎａ、ＪＰら（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
１４７：１７５９−１７６４。彼らは、細菌ＤＮＡがマウスＢ細胞に対して分
裂促進性であったことを認め、この活性が「非保存的構造決定基」から生じると
仮定した。脊椎動物ＤＮＡに対する細菌ＤＮＡのこの差次的な刺激能もまた、Ｙ
ａｍａｍｏｔｏらによるＮＫ細胞活性の誘導について示した。Ｙａｍａｍｏｔｏ
、Ｓら（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６：９８３−９９
７。ＢＣＧ抽出物のＨＰＬＣ分析は、ＭＹ−１画分が、４５塩基でのピークを伴
う広範なサイズのＤＮＡフラグメントで構成されていることを示した。ＢＣＧ
ｃＤＮＡ配列由来の合成４５マーオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、Ｉ
ＦＮ誘導能およびＮＫ細胞傷害性の増強についてポジティブであった。Ｔｏｋｕ
ｎａｇａ、Ｔら（１９９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６：５５
−６６。

【０００５】 同時に、アンチセンスＯＤＮを研究する研究者らは、配列依存性免疫刺激効果
を観察した。続いて、Ｋｒｉｅｇらは、細菌ＤＮＡまたは合成ＤＮＡのパターン
認識の理解のためにフレームワークを処方した。Ｋｒｉｅｇ、ＡＭら（１９９５
）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９。アッセイとしてＢ細胞に対する配列
特異的ＣｐＧ含有ＯＤＮ媒介分裂促進性を用いて、彼らは、特定のＣｐＧジヌク
レオチド（詳細には、５’−Ｐｕ−Ｐｕ−ＣｐＧ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒ−３’塩基配
列を提示するＤＮＡモチーフ内の）が生物学的に活性であることを発見した。

【０００６】 細菌ＤＮＡ、いくつかのウイルスＤＮＡ、および無脊椎動物ＤＮＡは、脊椎動
物ＤＮＡとは構造的に異なるようである。細菌ＤＮＡは、１：１６のＣｐＧジヌ
クレオチドの予期された頻度を有する。対照的に、哺乳動物ＤＮＡは、ＣｐＧ抑
制を示し、そしてランダム塩基使用法により推定される約４分の１のみの量のＣ
ｐＧを有する。Ｂｉｒｄ、ＡＰ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：２０９−２
１３。５’−Ｐｕ−Ｐｕ−ＣｐＧ−Ｐｙｒ−Ｐｙｒ−３’モチーフの使用は、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのゲノムと比較して哺乳動物においてよりずっ
と抑制される。Ｋｒｉｅｇ、ＡＭら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６
−５４９。さらに、真核生物５’−ＣｐＧ−３’モチーフは、優先的にメチル化
され、そして５’−ＣｐＧ−３’の配列特異的メチル化は、それらの刺激能を廃
止する。Ｋｒｉｅｇ、ＡＭら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４
９、Ｂｉｒｄ、ＡＰ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：２０９−２１３。これ
らの配列は脊椎動物ＤＮＡにおいて十分に提示されないという認識は、しばしば
、免疫系による非自己パターン認識の状況におけるいくつかの生物学的観察につ
いての説明を提供する。

【０００７】 （ＣｐＧ ＤＮＡ誘導インビボ免疫応答） タンパク質様天然抗原および組換え精製抗原の免疫原性は、アジュバントによ
り補助されなければ弱い。免疫系による外来ＤＮＡに対する見かけ上の認識およ
び応答のために、ＣｐＧ ＤＮＡがアジュバントとして働く可能性が以前に試験
された。マウスが、Ｌｉｐｆｏｒｄらにより記載のプロトコルを用いてリポソー
ムカプセル化オボアルブミン（抗原として使用）およびＣｐＧ−ＯＤＮ（アジュ
バントとして使用）で皮下でチャレンジされた。Ｌｉｐｆｏｒｄ、ＧＢら（１９
９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：３４２０−３４２６。ＣｐＧ−ＯＤ
Ｎを同時投与したマウスは、排出リンパ節（ＬＮ）における強いペプチド特異的
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性を発現した。さらに、抗体応答が増強され
ただけでなく、ＣｐＧ−ＯＤＮは、イソタイプパターンをＴｈ１タイププロフィ
ールに切り替えた。このため、抗原特異的ＩｇＧ２ａが優性になった。Ｌｉｐｆ
ｏｒｄ、ＧＢら（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：３４２０−３
４２６。抗体レパートリにおける強いＣＴＬ誘導およびＴｈ１の偏向のこのパタ
ーンは、他のタンパク質抗原に拡大されている。続いて、抗原キャリアとしての
リポソームの使用はＣＴＬ誘導のために必要ではないことが見出されている。こ
の観察は、代表的には可溶性のタンパク質抗原が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ
）クラスＩ提示経路に侵入し得ず、従って、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により前駆
ＣＴＬに対して提示され得ないので、予期されなかった。

【０００８】 タンパク質抗原と同時投与されたとときのＣｐＧ ＤＮＡのＴｈ１偏向は、い
まや十分に実証されている。Ｒｏｍａｎらは、アジュバントとしてＣｐＧ−ＯＤ
Ｎ、ＣｐＧモチーフを含有するプラスミドＤＮＡ、または細菌ＤＮＡのいずれか
を使用する場合、抗原特異的ＩｇＧ２ａ誘導の優性を示した。ＣｐＧ−ＯＤＮの
Ｔｈ１促進アジュバント性は、Ｔｈ２により駆動される障害に対する防御的な、
または治癒的でさえある応答への再方向付けのために有用であり得る。モデルは
Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ卵で誘導された喘息のマウスモデルに
おけるＴｈ２により駆動される気道炎症のＣｐＧ−ＯＤＮ調節である。気道好酸
性物質、Ｔｈ２サイトカイン誘導、ＩｇＥ産生、および気管支過反応性（ｈｙｐ
ｅｒｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）は、卵感作とのＣｐＧ−ＯＤＮの同時投与により予
防された。さらに、ＣｐＧ−ＯＤＮおよび抗原での感作７日後に処置された卵感
作マウスは、気道好酸性物質から保護された。同様の結果が、ＣｐＧ−ＯＤＮが
致死性のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ感染に対してＢＡＬＢ／ｃマウスを
保護したという本発明者らの実証により提供された、Ｔｈ２応答の防御性Ｔｈ１
応答への再方向付けのための感染モデルにおいて得られた。Ｌｉｐｆｏｒｄ，Ｇ
Ｂら（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：２３４０−２３４４；Ｚ
ｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｓら（１９９８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０：３６２７
−３６３０。Ｌ．ｍａｊｏｒ感染後Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、防御的なＴｈ１駆
動応答を発現するが、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、防御的でないＴｈ２駆動応答を発
現する。Ｔｈ２駆動感染性障害のこの系において、ＣｐＧ−ＯＤＮの投与は、感
染後１５日程度の遅くに適用した場合、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ感染
ＢＡＬＢ／ｃマウスを治癒した。Ｌ．ｍａｊｏｒチャレンジへの初期応答はＴｈ
２様であったが、応答後ＣｐＧ介入後の応答の表現型はＴｈ１様であった。Ｃｐ
Ｇ−ＯＤＮは、注射後血清へのＩＬ−１２の放出を引き起こし、そしてＩＬ−１
２はＴｈ１分化の公知の誘導因子である。しかし、ＩＬ−１２の波は、一過性で
あり、２〜４時間でピークに達し、そして２４時間までに基線近くまで戻る。Ｌ
．ｍａｊｏｒでの処置後の抗ＩＬ−４またはＩＬ−１２での実験的処理は、最初
の３日内でのみ有効である；後の時点で、ＩＬ−１２の複数の注射でさえ、感染
の経過に影響を与え得ない。ＣｐＧ−ＯＤＮがＮＫ細胞を有効に刺激してＩＦＮ
−γを産生するので、そしてＩＦＮ−γはインビトロおよびインビボでＴｈ２応
答を再方向付けし得るという証拠があるので、これは、可能な説明であり得る。
しかし、治癒効果の実際の細胞および分子機構はまだ十分には理解されていない
。

【０００９】 （ＯＤＮによる巨脾腫の誘導） 巨脾腫は、いくつかのオリゴヌクレオチド注射に伴う十分に認識されている現
象である。Ｂｒａｎｄａらは、マウスが、ＨＩＶ−１ゲノムのｒｅｖ領域の一部
に対してアンチセンスであるホスホロチオエートオリゴマーの静脈内注射後２日
以内に、大巨脾腫（ｍａｓｓｉｖｅ ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ）およびポリク
ローン性高ガンマグロブリン血症を発症したことを観察した。Ｂｒａｎｄａ、Ｒ
Ｆら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４５：２０３７−２０
４３。注射した動物由来の脾臓の組織学的試験は、小さなリンパ球の均一に見え
る集団の顕著な拡大を示した。フローサイトメトリー分析は、応答細胞が主にＢ
リンパ球であったことを示した。Ｍｏｊｃｉｋらは、ｅｎｖ遺伝子の開始領域に
対するアンチセンスでのマウスの注射が、（ｉ）脾臓細胞数の増加（主に脾臓性
Ｂ細胞の増加に起因する）、（ｉｉ）Ｂ細胞におけるクラスＩＩ ＭＨＣ発現の
増大、（ｉｉｉ）ＲＮＡおよびＤＮＡ合成の増大、ならびに（ｉｖ）免疫グロブ
リン（Ｉｇ）産生細胞の数の増大を生じたことを観察した。Ｍｏｊｃｉｋ、ＣＦ
ら（１９９３）Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ６７：
１３０−１３６。彼らは、特定の内因性レトロウイルス配列の産物がインビボで
リンパ球活性化を調節することを結論付けた。インビボでＮＦ−κＢ ｐ６５オ
リゴヌクレオチドの効力を試験する試みにおいて、ＭｅＩｎｔｙｒｅらは、予期
せぬことに、コントロールのｐ６５センスオリゴヌクレオチドが、マウスにおい
て大巨脾腫を引き起こすが、ｐ６５アンチセンスセンスオリゴヌクレオチドでは
引き起こさないことを観察した。ＭｅＩｎｔｙｒｅ、ＫＷら（１９９３）Ａｎｔ
ｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ Ｄｅｖ ３：３０９−３２２。この研究において、彼ら
は、ｐ６５センスオリゴヌクレオチドでの処置により、インビボおよびインビト
ロでの両方で、脾臓細胞増殖の配列特異的刺激を実証した。この処置によって拡
大された細胞は、主にＢ−２２０＋、ｓＩｇ＋Ｂ細胞であった。ｐ６５センスオ
リゴヌクレオチド処理脾臓細胞による免疫グロブリンの分泌もまた、増強された
。さらに、ｐ６５センス処理脾臓細胞は、核抽出物においてＮＦ−κＢ様活性の
上方調節を示したが、いくつかの他の細胞株は示さなかった。この効果は、新規
なタンパク質またはＲＮＡの合成に依存しない。Ｚｈａｏらは、ホスホロチオエ
ートＯＤＮがＢ細胞増殖に起因して巨脾腫を誘導すると結論した。Ｚｈａｏ Ｑ
ら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５１：１７３−１８２。
追跡研究において、Ｚｈａｏらは、２７マーのホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドのマウスへの投与が、投与４８時間後に、巨脾腫、およびＩｇＭ産生の増
加を生じたことを見出した。Ｚｈａｏ Ｑら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ ５２：１５３７−１５４４。

【００１０】 Ａｇｒａｗａｌらは、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（ＰＳ
オリゴ）のインビボでの毒物学効果を評価した。Ａｇｒａｗａｌ、Ｓら（１９９
７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７：
５７５−５８４。オリゴデオキシヌクレオチドが、雄および雌のラットに、３、
１０、および３０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で１４日間、静脈内投与された。ラット
は、１５日目に殺傷され、血液サンプルが、血液学および臨床化学決定のために
採集され、そして組織（リンパ節、脾臓、肝臓、および腎臓を含む）が病理学的
試験に供された。４つのオリゴデオキシヌクレオチドの毒性プロフィールは、非
常に類似していたが、大きさは異なっていた。血液学的パラメータの変化は、血
小板新生、貧血、および好中球減少を含んだ。脾臓、肝臓、および腎臓の用量依
存性拡張が観察された。病理学的研究は、試験した組織において、網内皮系の一
般化された過形成を示した。

【００１１】 Ｋｒｉｅｇらは、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する細菌ＤＮＡおよ
び合成オリゴデオキシヌクレオチドが、インビトロおよびインビボで免疫グロブ
リンを増殖および分泌するようにマウスＢ細胞を誘導することを報告した。Ｋｒ
ｉｅｇ、ＡＭら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−５４９。この活性
化は、抗原レセプターを通じて送達される同時シグナルによって増強される。至
適なＢ細胞活性化は、ＤＮＡモチーフを必要とする。このモチーフでは、非メチ
ル化ＣｐＧジヌクレオチドが２つの５’プリンおよび２つの３’ピリミジンに隣
接される。このＣｐＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチドは、全て
の脾臓性Ｂ細胞の９５％より多くを、細胞周期に入るように誘導する。Ｍｏｎｔ
ｅｉｔｈらによる研究では、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドで
のげっ歯類の処置は、巨脾腫、リンパ球過形成、高ガンマグロブリン血症、およ
び多数組織における混合単核細胞浸潤により特徴付けられる免疫刺激の形態を誘
導した。Ｍｏｎｔｅｉｔｈ ＤＫら（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕ
ｇ Ｄｅｓ １２：４２１−４３２。免疫刺激が、組織データならびに特定のイ
ンビボおよびインビトロ研究の再検討を用いるインビボおよびインビトロでの研
究で、マウスにおいて評価された。評価した全てのホスホロチオエートオリゴデ
オキシヌクレオチドは、巨脾腫およびＢリンパ球増殖を誘導した。巨脾腫および
Ｂリンパ球増殖は、オリゴデオキシヌクレオチドの用量および濃度とともに増大
した。インビトロでのＢリンパ球増殖および巨脾腫についての効力の順位は、試
験したオリゴデオキシヌクレオチドによく相関した。従って、文献により提供さ
れる最も重要な証拠は、ＯＤＮにより誘導された巨脾腫の現象はおそらく配列依
存性であり、そしてＢ細胞分裂促進性によって説明されると結論付ける。

【００１２】 造血発達は、コロニー刺激因子（これは、種々の初期系統の細胞のコロニー形
成および増殖を促進する）および強化因子（これは、種々の血液細胞への成熟お
よび分化を強化する）によって調節されると考えられる。一般に、巨脾腫の所見
は、配列特異的様式での直接的なＯＤＮ Ｂ細胞分裂促進性によって説明される
。

【００１３】 （サイトカイン産生および造血） 上記のように、ＣｐＧ−ＯＤＮ注射により誘導されるサイトカインレパートリ
ーは、天然ではＴｈ１であり、そして十分な証拠は、これは後の免疫応答発生に
対して強力なＴｈ１偏向効果を発揮することを示唆する。Ｚｈａｏらは、２７マ
ーのホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（配列５’−ＴＣＧ ＴＣＧ ＣＴ
Ｇ ＴＣＴ ＣＣＧ ＣＴＴ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＣＣ−３’配列番号１０９（
ＳＥＱ ＩＤ１０９））（これは、マウスにおけるインビボ投与の際、巨脾腫症
および高ガンマグロブリン血症を引き起こすことが以前に示されている）をマウ
スに投与し、そして脾臓ｍＲＮＡレベルおよび血清タンパク質レベルの両方で、
サイトカイン産生のパターンおよび反応速度論を研究した。Ｚｈａｏら（１９９
７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７：
４９５−５０２。５０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドのｉ．ｐ．投与の後、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−１２、ｐ４０、ＩＬ−１βおよびＩＬ−ＩＲａの脾臓ｍＲＮＡレ
ベル、ならびにＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−１の血清レ
ベルにおいて有意な増大が観察された。対照的に、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−
５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γもしくはＭＩＦの脾臓ｍＲ
ＮＡレベル、またはＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γも
しくはＧＭ−ＣＳＦの血清レベルにおいては、有意な差異が検出されなかった。
これらの研究は、オリゴヌクレオチド投与の後の、サイトカイン産生の異なるパ
ターンおよび反応速度論を示し、そしてサイトカイン産生がホスホロチオネート
オリゴヌクレオチドの一般的特性ではないが、オリゴヌクレオチドの配列および
用量に依存することをさらに実証する。ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２および
ＴＮＦ−αの血清放出はまた、Ｌｉｐｆｏｒｄらによって確認された。Ｌｉｐｆ
ｏｒｄ，ＧＢら（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：２３４０〜２
３４４。

【００１４】 ＨｅｎｄｒｚａｋおよびＢｒｕｎｄａは、マウスにおけるＩＬ−１２の投与が
、血小板減少症、巨脾腫症、および単核細胞浸潤を引き起こしたこと、巨脾腫症
のための説明を実証した。ＨｅｎｄｒｚａｋおよびＢｒｕｎｄａ（１９９５）Ｌ
ａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７２：６１９〜６３７。ＩＬ−１２は、ＣｐＧ−ＯＤＮに
応答して放出されることが示されており、そしてＩＦＮ−γの誘発因子である。
細胞内細菌感染の制御は、Ｔｈ１ Ｔ細胞応答の樹立および細菌を殺傷するため
のマクロファージの活性化の、両方のためにＩＦＮ−γを必要とする。Ｍｕｒｒ
ａｙらは、ＩＦＮ−γが欠乏したマウスをミコバクテリア感染に曝露することに
より、Ｔｈ２ Ｔ細胞表現型、鮮紅色の細菌増殖、および死により特徴付けられ
る免疫応答を生じる。Ｍｕｒｒａｙ，ＰＪら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１：２
９１４〜２９２４。彼らは、ミコバクテリアを感染させたＩＦＮ−γ欠乏マウス
もまた、造血系の劇的な再構築を受けることを報告した。骨髄細胞増殖は、ミコ
バクテリア感染の経過を通して検査されずに先へ進み、その結果、骨髄外造血へ
の移行が生じる。感染されたＩＦＮ−γ欠乏マウスの脾臓の構造は、マクロファ
ージ、顆粒球、および骨髄外造血組織の増殖により完全に消失される。これらの
特徴は、巨脾腫症、脾臓骨髄コロニー形成活性の増大、および末梢血中の顕著な
顆粒球増加と同時に起こる。サイトカインの全身レベルは、高められる（特にＩ
Ｌ−６および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））。これらの結果は、細胞
免疫における中心的役割に加え、ＩＦＮ−γは、免疫エフェクター細胞および骨
髄発生の協調的調節における重要なサイトカインであり得る。いくつかの研究に
より、ＩＦＮ−γによるコロニー形成単位のインビボでの阻害が示されている。
従って、先行技術に従って、ＩＦＮ−γ放出により特徴付けられるような強力な
Ｔｈ１応答は、造血事象に対する阻害であり得る。

【００１５】 活性化Ｔ細胞により産生されるＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−５（Ｔｈ０お
よびＴｈ２サイトカイン）は、緊急時の造血細胞の増殖において主要な役割を果
たすと考えられているが、その結果は、ＩＬ−３／ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−５の全
体の機能は、緊急時および定常状態での造血のためには不必要であることを示す
。従って、両方の状況において血球を産生する代替的機構が存在するはずである
。近年同定されたＴｈ２サイトカインである、ＩＬ１３は、いくつかしかし全て
ではないＩＬ−４の機能を共有する。この機能は、単球およびマクロファージの
活性化の阻害、ヒトＢ細胞の刺激、ならびにマウス骨髄細胞のインビトロでの増
殖および分化の誘導を含む。Ｌａｉらは、安定してトランスフェクトされた、高
発現ＢＷ５１４７胸腺腫細胞由来の組換えマウスＩＬ−１３（ｒＩＬ−１３）の
インビボ効果を試験した。Ｌａｉ，ＹＨら（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １
５６：３１６６〜３１７３。陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製後、ｒ
ＩＬ−１３をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜腔に、浸透圧ポンプを介して７日間投与
した。ｒＩＬ−１３処置マウス由来の脾臓は、コントロールの脾臓と比較して、
細胞性の増大に起因して有意に腫脹した。特に、ｒＩＬ−１３の処置後、脾臓切
片において、未成熟の赤芽球および巨核球の数の増加が観察された。ｒＩＬ−１
３処置マウス由来の脾臓細胞は、マウスＩＬ−３、マウス顆粒球マクロファージ
ＣＳＦ、またはヒトＣＳＦ−１の組換え形態に対するインビトロでの応答性の大
きな増大を示し、より少ない程度では、マウスＩＬ−４またはＩＬ−１３に対す
る応答性を示した。さらに、ｒＩＬ−１３処置マウスはまた、脾臓においてＣＦ
Ｕ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｃおよび赤血球群発コロニーの有意な増加を示した。このこと
はさらに、数が増加した造血前駆体の存在を示す。血液分析は、ｒＩＬ−１３処
置がわずかな貧血および著しい単球増加を誘導したことを示した。最終的には、
ｒＩＬ−１３処置マウス由来の脾臓細胞は、ＬＰＳ刺激の際、有意により多くの
ＩＬ−６を産生した。興味深いことに、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｂｒ
ａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ感染により誘導される強力なＴｈ２応答もまた、脾臓中の
造血前駆体の頻度の増加に伴った。集合的には、これらのデータは、外因性ｒＩ
Ｌ−１３がマウスにおいて骨髄外造血を誘導することを示し、そしてＴｈ２サイ
トカインである、内因性ＩＬＫ−１３が強力なＴｈ２応答の間のエフェクター細
胞の再補充に寄与し得ることを示唆する。

【００１６】 （発明の要旨） 先行技術は、全体として、Ｔｈ２作動応答が骨髄外造血についての強い素因で
あることを示す。ＣｐＧ−ＯＤＮ注射は、Ｔｈ１偏向およびＴｈ２抑制である。
さらに、品質証明Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γは、造血コロニー形成に
対して抑制的とみなされ、そしてＴｈ２サイトカインであるＩｌ−１３は、造血
を誘導することが示されている。従って、先行技術では、ＣｐＧ−ＯＤＮ注射よ
り放出されるサイトカインレパートリーが造血を導くことは、当業者に示唆され
ていない。逆に、ＯＤＮ投与は、血小板減少症、貧血、および好中球減少症を導
くことが示されている。さらに、ＣｐＧ−ＯＤＮ効果における中心的サイトカイ
ンである、ＩＬ−１２の投与は、血小板減少症を誘導する。巨脾腫の徴候は、Ｏ
ＤＮのＢ細胞分裂促進性と反復的に相関しており、このことは、ＯＤＮが、Ｂ細
胞活性化を介して造血よりもむしろ巨脾腫を誘導することを示唆する。

【００１７】 本発明は、免疫系障害を処置するために造血を誘導するための方法に関する。
１つの局面において、本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導するための方法に関
する。この方法は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが使用されて造血を調節すること
により免疫系の再構築を誘導し得るという知見に基づく。ＣｐＧオリゴヌクレオ
チドおよび抗原が共に被験体に投与された後、初期免疫応答が生じる。この初期
免疫応答が、迅速に下降し、そして約４８時間後新しい免疫応答が発生すること
が、本発明に従って発見された。予期しないことには、ＣｐＧ投与の４８時間以
上後に抗原を投与する場合、抗原特異的免疫応答が抗原に対して増大する。この
免疫応答は、プライムされた免疫細胞を有するリンパ節および／または脾臓の再
増殖に起因する。

【００１８】 従って、１つの局面において、本発明は、少なくとも以下の式を含む、配列を
有するオリゴヌクレオチド： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ （ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、
ここでＣおよびＧは、メチル化されず、そして、ここでＸ₁およびＸ₂はヌクレオ
チドである）を被験体に投与し、そしてこのオリゴヌクレオチドを被験体に投与
した少なくとも３日間後に、被験体を抗原に曝露して抗原特異的免疫応答を生成
することによって、抗原特異的免疫応答を誘導するための方法である。

【００１９】 被験体は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが投与されて少なくとも４８時間後に、
抗原に曝露され得る。免疫系再構築は、ＣｐＧ投与の４８時間以内に生じ始める
ことが、発見されている。プライムされた免疫細胞は、なおＣｐＧ投与３０日後
でさえも抗原に対して応答し得ることもまた、発見されている。１つの実施態様
において、抗原は、オリゴヌクレオチドが被験体に投与されて少なくとも４日後
に、投与される。別の実施態様において、抗原は、オリゴヌクレオチドが被験体
に投与されて少なくとも７日後に、投与される。別の実施態様において、抗原は
、オリゴヌクレオチドが被験体に投与されて少なくとも１５日後に、投与される
。なお別の実施態様において、抗原は、オリゴヌクレオチドが被験体に投与され
て少なくとも３０日後に、投与される。

【００２０】 抗原は、当該分野において公知の、任意の型の抗原であり得る。例えば、いく
つかの実施態様において、抗原は細胞、細胞抽出物、タンパク質、ペプチド、ポ
リサッカライド、ポリサッカライド結合体、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルス
抽出物、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物、およびアレルゲンであり得る。他の
実施態様において、抗原は、抗原をコードする核酸であり得る。

【００２１】 好ましい実施態様において、この抗原はアレルゲンであり、そしてこの方法は
、アレルギーを処置するための方法である。別の実施態様において、この抗原は
、感染性細菌、感染性ウイルス、および感染性真菌からなる群より選択される感
染性生物由来であり、そしてこの方法は、感染性疾患を処置するための方法であ
る。

【００２２】 被験体は抗原に曝露される。被験体は、抗原に対して能動的に曝露され得る。
１つの実施態様において、被験体が抗原に能動的に曝露される場合、その抗原は
コロイド分散系とともに送達され得る。このコロイド分散系は、別の実施態様に
おいて、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベー
スの系からなる群より選択される。脂質ベースの系は、好ましくは、水中油型エ
マルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームからなる群より選択される
。別の実施態様において、抗原は、アジュバントとともに投与され得る。

【００２３】 被験体はまた、抗原に受動的に曝露され得る。１つの実施態様において、この
被験体は、癌を発症する危険性のある被験体である。別の実施態様において、被
験体は、アレルギー反応を発症する危険性がある。さらに別の実施態様において
、被験体は、喘息である。

【００２４】 抗原特異的免疫応答は、別の実施態様において、Ｔｈ１型免疫応答である。

【００２５】 被験体は、脊椎動物である。好ましくは、被験体はヒトである。しかし、いく
つかの実施態様において、被験体は、非ヒト脊椎動物である。１つの実施態様に
おいて、この脊椎動物非ヒト動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、
ヤギ、ニワトリ、霊長類、魚類、ラット、およびマウスからなる群より選択され
る。

【００２６】 別の局面において、本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、造血障害を有す
るかまたは造血障害を発症する危険性がある被験体に投与することにより、造血
を処置する方法である。造血障害は、１つ以上の造血細胞の数の損失または減少
に関与する障害である。造血細胞には、赤血球、白血球および血小板が含まれる
。

【００２７】 従って、１つの局面において、本発明は、血小板減少症を有する被験体に、少
なくとも以下の式を含む、配列を有するオリゴヌクレオチド： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ （ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、
ここでＣおよびＧは、メチル化されず、そして、ここでＸ₁およびＸ₂はヌクレオ
チドである）を、被験体中の血小板の数を増大させるのに有効な量で投与するこ
とによって、血小板減少症を有する被験体中の血小板の数を増加させるための方
法である。１つの実施態様において、この血小板減少症は、非化学療法で誘導さ
れる血小板減少症である。

【００２８】 別の局面に従って、本発明は、少なくとも以下の式： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ （ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、
ここで、ＣおよびＧはメチル化されず、そしてここでＸ₁およびＸ₂はヌクレオチ
ドである）を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを、血小板減少症の発生の危
険性のある被験体に、この被験体が血小板を枯渇している状態に曝されている場
合、被験体における血小板の枯渇している状態下で通常予期される血小板数の減
少を防止するのに効果的な量で投与することによって、血小板減少症の発生の危
険性のある患者を処置する方法である。

【００２９】 １つの実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、この被験体において血
小板数を１μｌあたり少なくとも１０，０００個の血小板まで増加させるのに効
果的な量で投与される。別の実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、こ
の被験体において血小板数を１μｌあたり少なくとも２０，０００個の血小板ま
で増加させるのに効果的な量で投与される。さらに別の実施態様において、この
オリゴヌクレオチドは、この被験体において血小板数を１００パーセント増加さ
せるのに効果的な量で、その被験体に投与される。

【００３０】 この血小板減少症は、当該分野で公知の任意の型の血小板減少症である。１つ
の実施態様において、この血小板減少症は、薬物誘導型血小板減少症である。別
の実施態様に従って、この血小板減少症は、特発性血小板減少症性紫斑病のよう
な自己免疫障害に起因する。さらに別の実施態様において、この血小板減少症は
、偶発的な放射線被爆から生じる血小板減少症である。この血小板減少症は、さ
らに別の実施態様において、治療用放射線被爆から生じる血小板減少症である。

【００３１】 別の局面に従って、本発明は、少なくとも以下の式： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ （ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、
ここで、ＣおよびＧはメチル化されず、そしてここでＸ₁およびＸ₂はヌクレオチ
ドである）を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを、貧血に罹患する被験体に
、この被験体に赤血球生成を誘導するのに効果的な量で投与することによって、
貧血を処置する方法である。

【００３２】 １つの実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、被験体において赤芽球
数を少なくとも１０パーセント増加させるのに効果的な量で投与される。別の実
施態様において、このオリゴヌクレオチドは、被験体において赤芽球数を少なく
とも２０パーセント増加させるのに効果的な量で投与される。さらに別の実施態
様に従って、このオリゴヌクレオチドは、被験体において赤芽球数を１００パー
セント増加させるのに効果的な量で、その被験体に投与される。

【００３３】 この貧血は、当該分野で公知の任意の型の貧血であり得る。１つの実施態様に
おいて、この貧血は、薬物誘導型の貧血である。別の実施態様において、この貧
血は、免疫溶血性（ｉｍｍｕｎｏｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）障害、遺伝的障害（例え
ば、異常血色素症および遺伝性溶血性貧血；適切な鉄分貯蔵にもかかわらず不適
切な産生；慢性疾患（例えば、腎不全）；ならびに慢性炎症性障害（例えば、慢
性関節リウマチ））からなる群より選択される。

【００３４】 造血障害を有するかまたはその危険性を有する被験体は、脊椎動物である。好
ましい実施態様において、この被験体はヒトである。別の好ましい実施態様にお
いて、この被験体はイヌである。さらに別の実施態様において、この被験体は、
ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、霊長類、魚類、ラット、お
よびマウスからなる群より選択される非ヒト脊椎動物である。

【００３５】 上記の本発明の局面の各々において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくと
も以下の式： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ を含む配列を有する、オリゴヌクレオチドである。

【００３６】 いくつかの実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、８〜１００ヌクレ
オチド長である。別の実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、８〜３０
ヌクレオチド長である。

【００３７】 好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、安定化されたオリゴヌクレオチドで
ある。１つの実施態様において、このオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエー
トまたはホスホロジチオエート修飾である、リン酸骨格修飾を含む。好ましい実
施態様において、このリン酸骨格修飾は、オリゴヌクレオチドの５’末端で生じ
る。別の好ましい実施態様において、このリン酸骨格修飾は、オリゴヌクレオチ
ドの３’末端で生じる。

【００３８】 本発明のこのましい実施態様に従って、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なく
とも以下の式： ５’Ｘ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁Ｘ₂は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ
、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴ、およびＴｐＧからなる群より選択されるヌ
クレオチドであり；そして、Ｘ₃Ｘ₄は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＴｐＧ、Ａｐ
Ｇ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡおよびＣｐＡからなる群
より選択されるヌクレオチドである、式を含む配列を有する。

【００３９】 別の実施態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも以下の式：
５’ＴＣＮＴＸ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ （ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃およびＸ₄はヌクレオチドであり、Ｎは、約０〜２５ヌ
クレオチドからなる核酸配列である）を含む配列を有する。

【００４０】 別の実施態様において、Ｘ₁Ｘ₂は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡから
なる群より選択されるヌクレオチドであり；そして、Ｘ₃Ｘ₄は、ＴｐＴおよびＣ
ｐＴからなる群より選択されるヌクレオチドである。

【００４１】 本発明の各々の限定は、本発明の種々の実施態様を包含し得る。したがって、
任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々は、本発明
の各々の局面に含まれ得ることが理解される。

【００４２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、造血の特定の局面を調節するための方法に関する。造血は、血球の
生成に関する。新しい血球の生成プロセスは、インターロイキンおよびＣＳＦの
ような免疫因子の複雑な相互作用を通して制御される。これらの因子を用いて、
免疫系は、生理学的な変化に応答して血中の細胞内成分の各々のレベルを調節し
得る。

【００４３】 赤血球、白血球および血小板は、ヒトの造血系の必須の細胞である。赤血球（
ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌとしてもまた知られる
）の主要な機能は、ヘモグロビンを輸送することであり、これは、次には、肺か
ら組織に酸素を運ぶ。酸素の結合したヘモグロビンは、赤血球を赤色にする。白
血球はまた、骨髄細胞ともいわれ、免疫応答を媒介する異種の細胞の群であり、
これらには、顆粒球（好酸球、好塩基球、および好中球を含む）；単球；ならび
にＴリンパ球およびＢリンパ球が含まれる。これらの細胞は、血液、骨髄、リン
パ器官、および上皮において優勢に見出される。白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）
は、天然の色素の欠如により、細胞に白っぽいかまたは透明の外見がもたらされ
るゆえに、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）とも呼ばれる。血小板
は、造血または出血の調節において役割を果たす。

【００４４】 多くの因子が、特定の型の血球の欠損または悪性腫瘍を引き起こす造血系に影
響を与え得る。造血系の障害は、その障害を引き起こす因子ならびに影響を受け
る細胞型に依存して変化する。

【００４５】 本発明は、ＣｐＧ含有ヌクレオチドが造血を調節し得、遺伝的な異常、環境的
な因子、または医学的治療によって引き起こされる生理学的な障害に応答する血
球の損失を阻害するという発見を含む。別の局面において、本発明は、造血がＣ
ｐＧオリゴヌクレオチドを用いて操作され得、抗原特異的な免疫応答を刺激する
ために免疫系の再構築を誘導するという発見を含む。

【００４６】 １つの局面において、本発明は、免疫系の再構築を誘導するための方法である
。免疫系の再構築のプロセスは、強力な抗原特異的免疫応答を生成するための調
製物中の刺激に応答する免疫細胞の生成に基づく。その刺激はＣｐＧオリゴヌク
レオチドである。本発明に従って、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが被験体に投与さ
れた場合、初期の遅延の後、被験体の免疫系は、抗原特異的応答を産生するため
にプライムされる免疫細胞の集団を産生する再増殖（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
）事象を受けることが発見された。この再生された細胞の集団は、長期間の間身
体に残存する。プライムされた細胞が抗原に遭遇した場合、その細胞は、抗原特
異的免疫応答を産生することにより抗原に応答する。実際、抗原は、アジュバン
トの非存在下でさえ、特異的な免疫応答を産生し得る。通常、アジュバントの非
存在下での抗原の投与は、特異的な免疫応答を産生しない。

【００４７】 出願人らは、特定の機構に縛られるのを望まないが、ＣｐＧが被験体に投与さ
れる場合に、ＣｐＧは、循環する免疫細胞を活性化し、それらを成熟した活性免
疫細胞に成熟させると考えられている。ＣｐＧが抗原と同時に、または抗原より
もわずかに前もしくは後に投与されたならば、循環する免疫細胞は、おそらく抗
原と接触し、そしてその抗原に対する特異的な免疫応答を発生する。約２４時間
の間の後、循環する免疫細胞は、もはや抗原特異的な免疫応答をマウントし得な
い。なぜなら、循環する細胞は、すでに活性化されかつ成熟しているからである
。しかし、本発明に従って、ＣｐＧの投与約２日後に、被験体の免疫系は、抗原
に応答して成熟かつ活性化され得る免疫細胞で再増殖されることが見出された。
抗原が少なくともＣｐＧの投与２日後に投与されたならば、免疫系は抗原特異的
な免疫応答を生成し得る。これは、ＣｐＧと同時の抗原投与に対する応答におい
て生成される免疫応答よりも、なおより強い強度であり得る。ＣｐＧの投与２日
後、再構築された免疫系は、抗原に応答可能な細胞の集団を含む。本発明に従っ
て、この細胞の集団は、長期間の間抗原に対して応答可能であることが実証され
た。例えば、ＣｐＧ投与後３０日より多い時点での抗原の投与は、なお抗原特異
的応答を産生し得る。

【００４８】 本発明は、ＣｐＧを投与することにより、抗原特異的な免疫応答を生成して、
抗原への曝露について準備するための免疫の再構築を誘導する方法を含む。被験
体は、特定の抗原に対する免疫を発生させるために、ＣｐＧ投与の２日以上後に
故意に抗原に曝露され得る。被験体はまた、受動的に抗原に曝露され得、このこ
とは、この患者が曝露される抗原に対して、環境からの特異的な免疫応答を発生
させる。従って、この免疫系は、侵入する物質（例えば、病原体）に応答するよ
うに準備ができた活性状態にあるように操作され得る。

【００４９】 本発明の免疫系再構築を誘導するための方法は、被験体に、少なくとも以下の
式： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを投与することによって、抗原特異的な
免疫応答を誘導するための方法であり、ここで、このオリゴヌクレオチドは少な
くとも８つのヌクレオチドを含み、ＣおよびＧはメチル化されておらず、そして
Ｘ₁およびＸ₂はヌクレオチドであり、そしてこのオリゴヌクレオチドが被験体に
投与される少なくとも３日後に被験体は抗原に曝露され、抗原特異的な免疫応答
を産生する、方法である。

【００５０】 本明細書中で使用される「抗原」は、免疫応答を引き起こし得る分子である。
抗原としては以下が挙げられるがそれらに限定されない：細胞、細胞抽出物、多
糖、多糖結合体、脂質、糖脂質、炭水化物、ペプチド、タンパク質、ウイルス、
およびウイルス抽出物。用語抗原は、宿主免疫系により外来であるとして認識さ
れる任意の型の分子を広範に含む。抗原としては、癌抗原、微生物抗原、および
アレルゲンが挙げられるがこれらに限定されない。

【００５１】 本発明の方法は、癌抗原に対する抗原特異的な免疫応答を刺激することにより
癌を処置するために有用である。本明細書中で使用されるような「癌抗原」は、
腫瘍または癌細胞の表面に会合する化合物（例えば、ペプチド）であり、そして
この化合物は、ＭＨＣ分子に関連する抗原提示細胞の表面上に発現された場合、
免疫応答を引き起こし得る。癌抗原は、癌細胞の粗抽出物を調製すること（例え
ば、Ｃｏｈｅｎら，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：１０５
５に記載される）、これらの抗原を部分的に精製すること、組換え技術、または
公知の抗原のデノボ合成のいずれかによって、癌細胞から調製され得る。癌抗原
としては、組換え的に腫瘍または癌の免疫原性部分である抗原または腫瘍全体も
しくは癌全体である抗原が挙げられる。このような抗原は、単離され得るか、ま
たは組換え的にもしくは当該分野で公知の任意の他の手段によって調製され得る
。癌または腫瘍は、以下を含むがそれらに限定されない：胆管癌；脳癌；乳癌；
頸部癌；絨毛癌；結腸癌；子宮体癌；食道癌；胃癌；表皮内新生物；リンパ腫；
肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽腫；口腔癌（
ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌
；精巣癌；甲状腺癌；および腎臓癌、ならびに他の癌腫および肉腫。

【００５２】 本発明の方法はまた、感染性疾患を処置するために有用である。感染性疾患は
、本明細書中で使用される場合、身体中の外来微生物の存在から生じる疾患であ
る。ＣｐＧを使用して、微生物の抗原に対するＴ細胞応答またはＢ細胞応答を活
性化し得る抗原特異的な免疫応答を刺激する。本方法は、抗原が微生物に特異的
であることを除いて微生物抗原を使用して、腫瘍に対して上記と同様の方法で達
成される。「微生物抗原」は、本明細書中で使用される場合、微生物の抗原であ
り、そして感染性ウイルス、感染性細菌、および感染性真菌を含むがこれらに限
定されない。このような抗原は、完全微生物、ならびに天然の単離物、およびそ
れらのフラグメントもしくは誘導体を含み、そしてまた、天然の微生物抗原に対
して同一または類似する合成化合物を含む。化合物が天然の微生物抗原に対して
免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導する場合、この化合物は天然の
微生物抗原に類似する。このような抗原は、当該分野において規定的に使用され
、そして当業者に周知である。

【００５３】 感染性ウイルスの例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｒ
ｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１
（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶもしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ
−ＩＩＩとしても言及される）；および他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ）；
Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；
エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、ＥＣＨＯウイ
ルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；Ｔｏｇ
ａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｒ
ｉｄａｅ（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏ
ｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄ
ａｅ（例えば、水疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉ
ｄａｅ（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、水
疱性口炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、エボ
ラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、パラインフルエンザ
ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；Ｏｒｔｈ
ｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖ
ｉｒｉｄａｅ（例えば、ハンターンウイルス、ブンヤウイルス（ｂｕｎｇａ ｖ
ｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ ｖｉｒｕｓ）
）；Ａｒｅｎａ ｖｉｒｉｄａｅ（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ（
例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；Ｂｉｒｎａｖｉ
ｒｉｄａｅ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏ
ｖｉｒｉｄａ（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウ
イルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ（主要なアデノウイ
ルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１およ
び２、水痘−帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウ
イルス）；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポック
スウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉａｅ（例えば、アフリカ豚コレラウイ
ルス）；ならびに分類されていないウイルス（例えば、海綿状脳障害の病因論的
因子、デルタ型肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えら
れる）、非Ａ型非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内部遺伝；クラス２＝親遺伝）（
すなわち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、ならびにア
ストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ））。

【００５４】 感染性細菌の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：

【００５５】

【化１】 。

【００５６】 感染性真菌の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：Ｃｒｙ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ，Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐ
ｓｕｌａｔｕｍ，Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ，Ｂｌａｓｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａ
ｔｉｓ，Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ。他の感染性生物体（すなわち、原
生生物）としては以下が挙げられる：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａ
ｅ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ，ならびにＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉ
ｖａｘおよびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ。

【００５７】 他の医療的に関連する微生物は、文献において広範に記載されている（例えば
、Ｃ．Ｇ．Ａ Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂ
ａｉｌｌｉｅｒｅ Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ Ｂｒｉｔａｉｎ １９８３（
この内容全体は、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。

【００５８】 本発明の方法はまた、アレルギー疾患を処置するために有用である。この方法
は、抗原がアレルゲンに特異的であるということを除いて、腫瘍免疫治療および
感染性疾患の処置について上記したのと同様の方法で達成される。現在、アレル
ギー疾患は、一般に、低用量の抗原の注射、引き続いて、増加性の用量の抗原の
注射により処置される。この手順は、記憶免疫応答を生じ、さらなるアレルギー
反応を防止すると考えられている。しかし、これらの方法は、アレルギー応答の
ような副作用の危険性を伴う。本発明の方法はこれらの問題を回避する。

【００５９】 「アレルゲン」とは、感受性の被験体においてアレルギー応答またはぜん息応
答を誘起し得る物質（抗原）をいう。アレルゲンの一覧は膨大であり、そしてこ
の一覧は、花粉、昆虫の毒液、動物の麟屑粉塵、真菌の胞子および薬物（例えば
、ペニシリン）を含み得る。天然の、動物および植物のアレルゲンの例としては
、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられるがそれらに限定されない：

【００６０】

【化２】 。

【００６１】 「アレルギー」とは、物質（アレルゲン）に対する後天性過敏症のことをいう
。アレルギー状態は、湿疹、アレルギー性鼻炎またはアレルギー性コリーザ、枯
草熱、気管支喘息、じんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（じんま疹（ｈｉｖｅｓ）
）および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性状態を含むが、これらに限定
されない。アレルギー反応を有する被験体は、アレルギーを有するかまたはアレ
ルギーの発症の危険にさらされている被験体である。

【００６２】 アレルギーは、一般的に、無害なアレルゲンに対するＩｇＥ抗体の産生によっ
て引き起こされる。非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドによって誘導されるサ
イトカインは主に、細胞性疫応答によって最も良く特徴付けされ、そしてＩＬ−
１２およびＩＦＮ−γに関連する「Ｔｈ１」と呼ばれるクラスである。他の主要
な型の免疫応答は、Ｔｈ２免疫応答と呼ばれ、これは１つよりも多い抗体免疫応
答およびＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０の産生に関連する。一般に、アレ
ルギー疾患は、Ｔｈ２型免疫応答によって媒介され、そして自己免疫疾患は、Ｔ
ｈ１免疫応答によって媒介されるようである。被験体における免疫応答をＴｈ２
応答（これはＩｇＥ抗体の産生およびアレルギーに関連する）からＴｈ１応答（
これはアレルギー反応に対して防御性である）へ変化させるオリゴヌクレオチド
の能力に基づき、有効な用量のＣｐＧオリゴヌクレオチドを被験体へ投与し、ア
レルギーを処置または予防し得る。

【００６３】 ＣｐＧオリゴヌクレオチドはまた、喘息の処置において有意な治療上の有用性
を有し得る。Ｔｈ２サイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ−５は、喘息の被験
体の気道において上昇される。これらのサイトカイン、特にＩＬ−４およびＩＬ
−５は、喘息の被験体の気道において上昇される。これらのサイトカインは、Ｉ
ｇＥアイソトープ転換、好酸球走化性および好酸球活性化、ならびに肥満細胞増
殖を含む喘息の炎症性答の重要な局面を促進する。Ｔｈ１サイトカイン、特にＩ
ＦＮ−γおよびＩＬ−１２は、Ｔｈ２クローンの形成およびＴｈ２サイトカイン
の産生を抑制し得る。「喘息」とは、炎症によって特徴付けられる呼吸器系の障
害（気道の狭窄および吸入物質に対する気道の増大した反応性）のことをいう。
喘息は、アトピー性症状またはアレルギー性症状に広範に関連しないが、頻繁で
ある。

【００６４】 抗原は、再増殖した免疫系における樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）
によって取り上げられることが考えられる。次いで、ＡＰＣは、Ｔリンパ球と相
互作用することによる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＬＴ）応答か、またはＢリンパ
球と相互作用することによる抗体応答を生じるためにその細胞表面上に抗原をプ
ロセスし、そして提示する。好ましくは、この抗原は、ＣｐＧ添加の４８時間後
の免疫細胞に曝露される。より好ましい実施態様において、被験体の免疫細胞は
、ＣｐＧの６０時間後に抗原に曝露される。他の実施態様において、被験体の免
疫細胞は、ＣｐＧの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４
、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６
、３７、３８、３９、または４０日後に抗原に曝露される。

【００６５】 「被験体」とは、ヒトまたはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、
ニワトリ、霊長類（例えば、サル）、魚（養殖漁業種）（例えば、サケ）、ラッ
トおよびマウスを含むが、これらに限定されない脊椎動物を意味する。

【００６６】 上記の多くの障害は、ヒトの疾患に関連するが、本発明はまた、他の非ヒト脊
椎動物を処置するために有用である。非ヒト脊椎動物はまた、癌、感染、アレル
ギー、および喘息を発症し得る。例えば、感染性ヒト疾患の処置に加えて、本発
明の方法は、動物の感染を処置するために有用である。本明細書中で用いられる
ように、感染性疾患に関して用いられる場合に、用語「処置」または「処置する
」とは、病原体との感染に対する被験体の抵抗性を増大させる予防的な処置を言
う（すなわち、被験体が病原体に感染する可能性を低下させる）。非ヒト脊椎動
物の処置のための多くのワクチンは、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｋ．Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕ
ｍ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，第３版、Ｎｏｒｔｈ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｓ，Ｉｎｃ．，１９９５に開示される。

【００６７】 従って、本発明は、ヒトおよび非ヒト動物における抗原特異的免疫応答を誘導
するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドの使用を意図する。上で議論されるように
、抗原は、ウイルス、細菌および真菌のような感染性微生物、ならびに天然の供
給源に由来するか、または合成的に誘導されるそれらのフラグメントを含む。ヒ
トおよび非ヒト脊椎動物の両方の感染ウイルスは、レトロウイルス、ＲＮＡウイ
ルス、およびＤＮＡウイルスを含む。レトロウイルスのこのグループは、単純レ
トロウィルスおよび複合レトロウイルスの両方を含む。この単純レトロウイルス
は、Ｂ型レトロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、およびＤ型レトロウイルスのサ
ブグループを含む。Ｂ型レトロウイルスの例は、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴ
Ｖ）である。Ｃ型レトロウイルスは、Ｃ型グループＡ（ラウス肉腫ウイルス（Ｒ
ＳＶ）、鳥類の白血病ウイルス（ＡＬＶ）、および鳥類骨髄芽球症ウイルス（Ａ
ＭＶ）を含む）およびＣ型グループＢ（マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ネコ
白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、マウス肉腫ウイルス（ＭＳＶ）、テナガザル白血
病ウイルス（ＧＡＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）、細網内皮症ウイルス（
ＲＶ）およびサル肉腫ウイルス（ＳＳＶ）を含む）のサブグループを含む。Ｄ型
レトロウイルスは、マソン−ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）およびサルレ
トロウイルス１型（ＳＲＶ−１）を含む。複合レトロウイルスは、レンチウイル
ス、Ｔ細胞白血病ウィルスおよびフォーミーウイルスのサブグループを含む。レ
ンチウイルスは、ＨＩＶ−１を含むが、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）
もまた含む。Ｔ細胞白血病ウイルスは、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ
細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）、およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）を含む
。フォーミーウイルスは、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）、サルフォーミー
ウイルス（ＳＦＶ）およびウシフォーミーウイルス（ＢＦＶ）を含む。前述のリ
ストは例示的なものであり、限定を意図するものではない。

【００６８】 脊椎動物における抗原である他のＲＮＡウイルスの例は、以下のファミリーの
メンバーを含むがこれらに限定されない：レオウイルス科ファミリー（オルトレ
オウイルス属（哺乳動物レトロウイルスおよび鳥類レトロウイルスの両方の複数
の血清型）、オルビウイルス属（ブルータングウイルス、ユーベナンギー（Ｅｕ
ｇｅｎａｎｇｅｅ）ウイルス、ケメロボウイルス、アフリカウマ病ウイルス、お
よびコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラス
カ仔ウシ下痢症ウイルス、マウスロタウイルス、サルロタウイルス、ウシまたは
ヒツジロタウイルス、鳥類ロタウイルス）を含む）；エンテロウイルス属（ポリ
オウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、腸細胞障害性（ｅｎｔｅｒｉｃ
ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ）ヒトオーファン（ＥＣＨＯ）ウイルス、Ａ型肝炎ウイ
ルス、サルエンテロウイルス、マウス脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、マウスポリオ
ウイルス、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス）、カーディオウイル
ス属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、ライノウイルス属（少
なくとも１１３のサブタイプを含む、ヒトライノウイルス；他のライノウイルス
）、アフトウイルス属（口蹄疫（ＦＭＤＶ））を含む、ピコルナウイルス科ファ
ミリー；ブタ小水疱性発疹ウイルス、サンミグエルアザラシウイルス、ネコピコ
ルナウイルス、およびノーウォークウイルスを含む、カルシウイルス科ファミリ
ー；アルファウイルス属（東部ウマ脳炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、シン
ドビスウイルス、チクングンヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロス川ウイ
ルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス
属（蚊媒介（ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｂｏｒｎｅ）黄熱病ウイルス、デング熱ウイル
ス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス
、ウエストナイルウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介（ｔｉ
ｃｋ ｂｏｒｎｅ）ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林病ウイ
ルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、
ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、豚コレ
ラウイルス、ボーダー病ウイルス）を含む、トガウイルス科ファミリー；ブンヤ
ウイルス属（ブンヤムウェラ熱ウイルスおよびブンヤムウェラ熱関連ウイルス、
カリフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱シシリ
ー型（Ｓｉｃｉｌｉａｎ）ウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイル
ス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）、およ
びウウクウイルス属（ウウクニエミーウイルスおよびウウクニエミー関連ウイル
ス）を含む、ブンヤウイルス科ファミリー；インフルエンザウイルス属（インフ
ルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイプ）；ブタインフルエンザウイルス
、ならびに鳥類インフルエンザウイルスおよびウマのインフルエンザウイルス；
インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（考
えられる別個の属）を含む、オルトミクソウイルス科ファミリー；パラミクソウ
イルス属（パラインフルエンザウイルス１型、センダイウイルス、血球吸着性ウ
イルス、パラインフルエンザウイルス２〜５型、ニューカッスル病ウイルス、流
行性耳下腺炎ウイルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎
ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（ＲＳウイ
ルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、およびマウス肺炎ウイルス）を含む、パラ
ミクソウイルス科ファミリー；森林（ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、シンドビスウイ
ルス、チクングニンウイルス、オニョンニョンウイルス、ロス川ウイルス、ベネ
ズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）、フラビウイルス属（蚊媒介
（ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｂｏｒｎｅ）黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳
炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ウエスト
ナイル脳炎ウイルス、クンジンウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介（ｔｉｃｋ
ｂｏｒｎｅ）ウイルス、極東ダニ媒介ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、
跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血性熱ウイルス）、ルビウ
イルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、豚コレラウイ
ルス、ボーダー病ウイルス）；ブンヤウイルス属（ブンヤムウェラ熱ウイルスお
よびブンヤムウェラ熱関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボ
ウイルス属（サシチョウバエ熱シシリー型（Ｓｃｉｌｉａｎ）ウイルス、リフト
バレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血性熱ウイルス、
ナイロビヒツジ病ウイルス）、およびウウクウイルス属（ウウクニエミーウイル
スおよびウウクニエミー関連ウイルス）を含む、ブンヤウイルス科ファミリー；
インフルエンザウイルス属（インフルエンザウイルスＡ型、多くのヒトサブタイ
プ）；ブタインフルエンザウイルス、ならびに鳥類インフルエンザウイルスおよ
びウマのインフルエンザウイルス；インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ
）、およびインフルエンザＣ型（考えられる別個の属）を含む、オルトミクソウ
イルス科ファミリー；パラミクソウイルス属（パラインフルエンザウイルス１型
、センダイウイルス、血球吸着性ウイルス、パラインフルエンザウイルス２〜５
型、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）、麻疹ウイルス属（
麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイルス、ジステンパーウイルス、牛疫ウイ
ルス）、肺炎ウイルス属（ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、ウシＲＳウイルス、および
マウス肺炎ウイルス）を含む、パラミクソウイルス科ファミリー；ベシクロウイ
ルス属（ＶＳＶ）（チャンディプラウイルス、フランダース−ハートパークウイ
ルス）、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）、魚類ラブドウイルス、および２
つの考えられる（ｔｗｏ ｐｒｏｂａｂｌｅ）ラブドウイルス（マルブルクウイ
ルスおよびエボラウイルス）を含む、ラブドウイルス科ファミリー；リンパ球脈
絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス複合体、およびラッサウイルス
を含む、アレナウイルス科ファミリー；伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マ
ウス肝炎ウイルス、ヒト腸（ｅｎｔｅｒｉｃ）コロナウイルス、およびネコの伝
染性腹膜炎（ネココロナウイルス）を含む、コロナウイルス科ファミリー。

【００６９】 脊椎動物における抗原である例示的ＤＮＡウイルスは以下を含むが、これらに
限定されない：オルトポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サル痘ワクシニア
、牛痘、スイギュウポックス（Ｂｕｆｆａｌｏｐｏｘ）、家兎痘、エクトロメリ
ア）、レポリポックスウイルス属（線維性粘液腫、線維腫）、トリポックスウイ
ルス属（鶏痘、他の鳥類ポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（羊痘
、ヤギ痘）、スイポックスウイルス（豚痘）、パラポックスウイルス属（感染性
膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）を含む、ポックス
ウイルス科ファミリー；イリドウイルス科ファミリー（アフリカ豚コレラウイル
ス、カエルウイルス２および３、魚類のリンパ嚢腫ウイルス）；アルファヘルペ
スウイルス（単純ヘルペス１型および２型、水痘−帯状疱疹、ウマ流産ウイルス
、ウマヘルペスウイルス２および３、仮性狂犬病ウイルス、ウシの伝染性角膜炎
ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性喉頭気
管支炎ウイルス）、ベータヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルス、なら
びにブタ、サルおよびげっ歯類のサイトメガロウイルス）、ガンマヘルペスウイ
ルス（エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、マレク病ウイルス、リスザルヘ
ルペスウイルス、クモザルヘルペスウイルス、ノウサギヘルペスウイルス、モル
モットヘルペスウイルス、ルッケ腫瘍（Ｌｕｃｋｅ ｔｕｍｏｒ）ウイルス）を
含む、ヘルペスウイルス科ファミリー；マストアデノウイルス属（ヒトサブグル
ープＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および非グループ化；サルアデノウイルス（少なくと
も２３の血清型）、イヌの伝染性肝炎、およびウシ、ブタ、ヒツジ、カエルおよ
び多くの他の種のアデノウイルス）、トリアデノウイルス属（鳥類のアデノウイ
ルス）を含む、アデノウイルス科ファミリー；および培養不可能な（ｎｏｎ−ｃ
ｕｌｔｉｖａｔａｂｌｅ）アデノウイルス；パピローマウイルス属（ヒトパピロ
ーマウイルス、ウシパピローマウイルス、ショープウサギ乳頭腫ウイルス、およ
び他の種の種々の病原性パピローマウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオ
ーマウイルス、サル空胞形成因子（ｖａｃｕｏｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（Ｓ
Ｖ−４０）、ウサギ空胞形成因子（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣ
ウイルス、および他の霊長類ポリオーマウイルス（例えば、リンパ増殖性（ｌｙ
ｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）パピローマウイルス）を含む、パポバウイルス科ファ
ミリー；アデノ関連ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイル
ス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイル
スなど）を含む、パルボウイルス科ファミリー。最後に、ＤＮＡウイルスは、上
記のファミリーに一致しないウイルス（例えば、クールーウイルスおよびクロイ
ツフェルト−ヤーコプ病ウイルス、ならびに慢性感染神経障害因子（ｃｈｒｏｎ
ｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ａｇｅｎｔ）（ＣＨＩ
ＮＡウイルス））を含み得る。

【００７０】 グラム陰性およびグラム陽性細菌の両方は、脊椎動物における抗原として作用
する。このようなグラム陽性細菌には、上記のような細菌、ならびにＰａｓｔｅ
ｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｈｙｌｏｃｏｃｃｉ種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ種が含まれるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌には、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、およびＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ種が含まれるが、これらに限定されない。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ腸炎菌は、
商業的な層産業（ｌａｙｅｒ ｉｎｄｕｓｔｒｙ）における重要な病原である。
なぜなら、層の卵巣集落形成定着（ｏｖａｒｉａｎ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ
）は、食用卵における母性的に伝播したＳａｌｍｏｎｅｌｌａを生じ得るからで
ある。

【００７１】 ヒトにおいて抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド
の使用に加えて、好ましい実施態様の方法は、メンドリ、ニワトリ、七面鳥、ア
ヒル、ガチョウ、ウズラ、およびキジのような鳥類の処置のために特によく適し
ている。鳥類は、ＡＩＤＳまたは免疫不全ウイルスを含む多くの型の感染のため
の主要な標的である。

【００７２】 孵化している鳥類は、誕生のすぐ後に、病原性の微生物に曝露される。これら
の鳥類は、最初に母親に由来する抗体により病原に対して保護されるが、この保
護は、一時的なものに過ぎず、そしてそのトリ自身の未熟な免疫系が、そのトリ
を病原に対して保護し始めなければならない。それらが最も感受性であるときに
、若いトリにおける感染を防止することは、しばしば望ましい。特にそのトリが
より密接な区域（ｑｕａｒｔｅｒ）に収容されていて、迅速な疾患の伝播に導か
れる場合は、老齢のトリにおける感染を予防することもまた所望される。従って
、抗原が存在する場合には、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドを、トリに投与
して、抗原特異的免疫応答を増強することが望ましい。

【００７３】 ニワトリにおける一般的な感染の例は、ニワトリ感染貧血ウイルス（ＣＩＡＶ
）である。ＣＩＡＶは、マレック病ワクチン接種ブレイク（ｂｒｅａｋ）の調査
の間に、１９７９年に日本で最初に単離された（Ｙｕａｓａら、１９７９、Ａｖ
ｉａｎ Ｄｉｓ．２３：３６６−３８５）。この時以来、ＣＩＡＶは、全ての主
な家禽生産国の養鶏において検出されている（ｖａｎ Ｂｕｌｏｗら、１９９１
、６９０−６９９頁、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ，第九版、Ｉｏ
ｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。

【００７４】 ＣＩＡＶ感染は、若い感受性のニワトリにおいて、貧血、出血および免疫抑制
によって特徴づけられる臨床疾患を生じる。ＣＩＡＶ感染したニワトリの胸腺の
萎縮症および骨髄の萎縮症ならびに一貫した病変もまた、ＣＩＡＶ感染の特徴で
ある。胸腺におけるリンパ球の枯渇、および時折ファルビキウス嚢におけるリン
パ球の枯渇は、免疫抑制を生じ、そして二次的なウイルス感染、細菌感染、また
は真菌感染（次いで、これは疾患の経過を複雑にする）に対する感受性を増大さ
せる。免疫抑制は、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性ファルビキウス嚢病ウ
イルス、細網内皮症ウイルス、アデノウイルス、またはレオウイルスの１つ以上
に感染後に疾患を悪化させる原因となり得る。ＭＤＶの病原性は、ＣＩＡＶによ
って増強されることが報告されている（ＤｅＢｏｅｒら、１９８９、２８頁、Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ３８ｔｈ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｐｏｕｌｔ
ｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｔｅｍｐｅ，Ａｒｉｚ．）。
さらに、ＣＩＡＶが、伝染性ファルビキウス嚢病の徴候を悪化させることが報告
されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９８９、Ａｖｉａｎ Ｄｉｓ．３３
：７０７−７１３）。ニワトリは、ＣＡＡによって実験的に引き起された疾患に
対して年齢抵抗性（ａｇｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を発生させる。これは、本
質的に、２週齢までに完了するが、老齢のトリは、感染に対して未だ感受性であ
る（Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、１９７９前出；Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、Ａｒｉａｎ Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓ ２４，２０２−２０９，１９８０）。しかし、ニワトリを、Ｃ
ＡＡおよび免疫抑制因子（ＩＢＤＶ、ＭＤＶなど）に二重に感染させる場合、こ
の疾患に対する年齢抵抗性は、遅延される（Ｙｕａｓａ，Ｎ．ら、１９７９およ
び１９８０前出；Ｂｕｌｏｗ ｖｏｎ Ｖ．ら、Ｊ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ ３３：９３−１１６，１９８６）。疾患の伝染を増強し得るＣ
ＩＡＶの特徴は、環境的な不活性化およびいくつかの通常の消毒剤に対する高い
抵抗性を含む。家禽産業に対するＣＩＡＶ感染の経済的影響は、疾患に感染した
トリの１０％〜３０％が、死を突発するという事実から明らかである。

【００７５】 トリのワクチン接種は、他の脊椎動物のように、任意の年齢で行われ得る。通
常、ワクチン接種は、生きた微生物については１２週齢までに行われ、そして不
活性化微生物または他の型のワクチンについては１４〜１８週の間に行われる。
卵内（ｉｎ ｏｖｏ）ワクチン接種については、ワクチン接種が、胚発生の最後
の四半期（ｌａｓｔ ｑｕａｒｔｅｒ）に行われ得る。このワクチンは、皮下、
スプレーによって、経口、眼内、気管内、経鼻、卵内（ｉｎ ｏｖｏ）、または
本明細書中に記載される他の方法によって投与され得る。従って、本発明のＣｐ
Ｇオリゴヌクレオチドは、慣用的なワクチンスケジュールを用いてトリおよび他
の非ヒト脊椎動物へ投与され得、そして抗原は、本明細書中に記載される適切な
時間の後に投与される。

【００７６】 ウシおよび家畜もまた、感染に対して感受性である。これらの動物を冒す疾患
は、（特にウシの間で）深刻な経済損失を生じ得る。本発明の方法を用いて、家
畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）における感染に対して防
御し得る。

【００７７】 ウシは、ウシウイルスによって感染され得る。ウシウイルス性下痢性ウイルス
（ＢＶＤＶ）は、小エンベロープ化（ｓｍａｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）プラス
鎖ＲＮＡウイルスであり、そして豚コレラウイルス（ＨＯＣＶ）およびヒツジボ
ーダー病ウイルス（ＢＤＶ）と共に、ペスチウイルス属に分類される。ペスチウ
イルスは、以前にトガウイルス科ファミリーに分類されたが、いくつかの研究は
、フラビウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）グループと共にフラビウイ
ルス科ファミリーへの再分類を示唆している（Ｆｒａｎｃｋｉら、１９９１）。

【００７８】 ＢＶＤＶ（これはウシの重要な病原体である）は、細胞培養分析に基づいて、
細胞病原性（ＣＰ）生物型および非細胞病原性（ＮＣＰ）生物型へ区別され得る
。両方の生物型は、ウシにおいて見出され得るが、ＮＣＰ生物型がより広範囲に
及ぶ。妊娠中のウシが、ＮＣＰ株に感染する場合、ウシは、持続的に感染させた
ウシ、すなわち、その一生の間ウイルスを伝播する免疫寛容ウシを出産する。持
続的に感染させたウシは、粘膜疾患で死に得、次いで、両方の生物型が、この動
物から分離され得る。臨床的症状は、流産、奇形発生、ならびに呼吸の問題、粘
膜疾病および軽度の下痢を含み得る。さらに、この動物の死を生じ得る、群れの
伝染病に関連する重篤な血小板減少症が記載されており、そしてこの疾患と関連
する株は、古典的なＢＶＤＶよりも病原性であると思われる。

【００７９】 ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、ウマにおいて無症状疾患から致命的疾患
までにわたる種々の感染を引き起こす、抗原性的に区別された生物学的因子の群
を含む。これらは、ウマにおける遍在性の病原体であるウマヘルペスウイルス−
１（ＥＨＶ−１）を含む。ＥＨＶ−１は、流産、気道疾患、および中枢神経系障
害の流行病に関連する。若いウマの上気道の初期の感染は、８〜１０日間続く熱
病（ｆｅｂｒｉｌｅ ｉｌｌｎｅｓｓ）を生じる。免疫学的経験をした雌馬は、
疾患が明らかになることなしに気道を通じて再感染され得、その結果、流産は、
通常前兆なしに生じる。神経学的症候群は、呼吸疾患、または流産に関連し、任
意の年齢のいずれかの性別の動物を冒し得、共調運動不能、衰弱および後部麻痺
（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｐａｒａｌｙｓｉｓ）を導く（Ｔｅｌｆｏｒｄ，Ｅ．Ａ
．Ｒ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９，３０４−３１６，１９９２）。他のＥＨ
Ｖは、ＥＨＶ−２、またはウマサイトメガロウイルス、ＥＨＶ−３、ウマ交疹ウ
イルス、およびＥＨＶ−４（以前はＥＨＶ−１サブタイプ２に分類された）を含
む。

【００８０】 ヒツジおよびヤギは、ビスナ−マエディを含む種々の危険な微生物によって感
染され得る。

【００８１】 サル（ｍｏｎｋｅｙ）、サル（ａｐｅ）、およびマカクのような霊長類は、サ
ル免疫不全ウイルスによって感染され得る。不活性化細胞−ウイルスおよび無細
胞の全サル免疫不全ワクチンは、マカクに防御をもたらすことが報告されている
（Ｓｔｏｔｔら、（１９９０）Ｌａｎｃｅｔ ３６：１５３８−１５４１；Ｄｅ
ｓｒｏｓｉｅｒｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８９）８６：６３５３−６３５７
；Ｍｕｒｐｈｅｙ−Ｃｏｒｂら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２９
３−１２９７；およびＣａｒｌｓｏｎら、（１９９０）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．Ｈｕ
ｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ６：１２３９−１２４６）。組換えＨＩＶ
ｇｐ１２０ワクチンは、チンパンジーに防御をもたらすことが報告されている
（Ｂｅｒｍａｎら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４５：６２２−６２５）。

【００８２】 ネコ（家庭内および野生の両方）は、種々の微生物での感染に感受性である。
例えば、ネコの伝染性腹膜炎は、家ネコ、および野生のネコ（例えば、ライオン
、ヒョウ、チーター、およびジャガー）の両方において生じる疾患である。この
型のおよび他の型の病原性生物体を用いてネコにおける感染を防御することが望
ましい場合、本発明の方法を用いて、ネコにワクチン接種し、感染からネコを防
御し得る。

【００８３】 家ネコは、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦｅＳＶ）
、内因性Ｃ型オンコルナウイルス（ＲＤ−１１４）、およびネコシンシチア形成
（ｆｏｒｍｉｎｇ）ウイルス（ＦｅＳＦＶ）を含むが、これらに限定されない、
いくつかのレトロウイルスで感染させ得る。これらのうち、ＦｅＬＶは、最も有
意な病原体であり、これは、リンパ性細網（ｌｙｍｐｈｏｒｅｔｉｃｕｌａｒ）
新生物および骨髄性新生物、貧血、免疫媒介性障害（ｉｍｍｕｎｅ ｍｅｄｉａ
ｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、およびヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に
類似した免疫不全症候群を含む多様な症状を引き起こす。最近、ＦｅＬＶ−ＡＩ
ＤＳと命名された特定の複製不全（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖ
ｅ）ＦｅＬＶ変異体が、免疫抑制特性とより詳細に関連付けされている。

【００８４】 ネコＴリンパ指向性（Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）レンチウイルス（ネコ
免疫不全ともいわれる）の発見は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９８７）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３５：７９０−７９３に最初に報告された。ＦＩＶの特徴は、Ｙａｍａ
ｍｏｔｏら（１９８８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１２月 補遺 ２：２０４Ｓ−２１
５Ｓ；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４９：１２
４６−１２５８；およびＡｃｋｌｅｙら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５
６５２−５６５５に報告されている。ＦＩＶのクローニングおよび配列分析は、
Ｏｌｍｓｔｅｄら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：２４４８−２４５２および８６：４３５５−４３６０に報告されている
。

【００８５】 ネコの伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）は、家ネコ科および野生のネコ科において予測
不可能に生じる散発性疾患である。ＦＩＰは、主に家ネコの疾患であるが、ライ
オン、アメリカライオン、ヒョウ、チーター、およびジャガーにおいて診断され
ている。ＦＩＰに冒されている小型の野生のネコは、ヤマネコおよびカラカル、
サンドキャット（ｓａｎｄ ｃａｔ）、およびパラスキャット（ｐａｌｌａｓ
ｃａｔ）を含む。家ネコにおいて、全ての年齢のネコが感受性であるが、この疾
患は、若い動物において主に生じる。発生率のピークは、６と１２ヶ月齢の間で
生じる。発生率の低下が、５〜１３歳で認められ、次いで１４〜１５歳のネコに
おいて発生率の増加が認められる。

【００８６】 魚類、甲殻類または他の水性生物品種におけるウイルス疾患および細菌疾患は
、養殖漁業産業について深刻な問題を提起する。孵化タンクまたは閉鎖された海
洋養殖領域における動物の高い密度が原因で、感染性疾患は、例えば、魚類設備
、甲殻類設備、または他の水性生物品種設備において大部分のストックを死滅さ
せ得る。疾患の予防は、疾患が進行してすぐの介入よりも、魚類へのこれらの脅
威に対するより好適な救済策である。魚類のワクチン接種は、免疫によって長期
間の防御を提供し得る唯一の予防法である。ワクチン接種に基づく核酸は、Ｄａ
ｖｉｓへ発行された米国特許第５，７８０，４４８号に記載される。

【００８７】 魚類の免疫系は、哺乳動物免疫系に類似した多くの特性を有する（例えば、Ｂ
細胞、Ｔ細胞、リンホカイン、補体、および免疫グロブリンの存在）。魚類は、
哺乳動物のＢ細胞およびＴ細胞のリンパ球サブクラスに多くの点で類似している
と思われる役割を有するリンパ球サブクラスを有する。ワクチンは、経口投与さ
れるか、あるいは液浸または注入によって投与され得る。

【００８８】 養殖漁業種は、魚類、甲殻類または他の水性動物を含むが、これらに限定され
ない。魚類は、全ての魚形脊椎動物を含む。これは、例えば、サケ科、コイ、ナ
マズ、ブリ、タイ、およびスズキのような硬骨魚類または軟骨魚類であり得る。
サケ科は、マス（ニジマスを含む）、サケ、および北極イワナ（Ａｒｃｔｉｃ
ｃｈａｒ）を含む魚類のファミリーである。甲殻類の例は、ハマグリ、ロブスタ
ー、エビ、カニ、およびカキを含むが、これらに限定されない。他の養殖水性動
物は、ウナギ、イカ、およびタコを含むが、これらに限定されない。

【００８９】 ウイルス性水性生物病原体のポリペプチドは、ウイルス性出血性敗血症ウイル
ス（ＶＨＳＶ）の糖タンパク質（Ｇ）または核タンパク質（Ｎ）；伝染性造血組
織壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）のＧタンパク質またはＮタンパク質；伝染性膵臓壊
死ウイルス（ＩＰＮＶ）のＶＰ１構造、ＶＰ２構造、ＶＰ３構造、またはＮ構造
タンパク質；コイ春ウイルス血症ウイルス（ＳＶＣ）のＧタンパク質；ならびに
ブチナマズウイルス（ＣＣＶ）の膜関連タンパク質、外被（ｔｅｇｕｍｉｎ）タ
ンパク質およびキャプシドタンパク質または糖タンパク質を含むが、これらに限
定されない。

【００９０】 細菌性病原体のポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：Ａｅｒｏｍｏｎｉｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの鉄調節外膜タンパク質
（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ），およびＡ−タンパク質（これは、
フルンケル多発症を引き起こす）、Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｌｍｏｎ
ｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質（これは、細菌性腎疾患（ＢＫＤ）を引き起こ
す）、Ｙｅｒｓｉｎｉｏｓｉｓの主要表面関連抗原（ｍｓａ）、表面発現細胞毒
素（ｍｐｒ）、表面発現溶血素（ｉｓｈ）、および鞭毛抗原；Ｐａｓｔｅｕｒｅ
ｌｌｏｓｉｓの細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、鉄調節外膜タンパク質（ＩＲＯＭ
Ｐ）、および構造タンパク質；Ｖｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍおよ
びＶ．ｏｒｄａｌｉｉのＯＭＰおよび鞭毛タンパク質；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌ
ｏｓｉｓ ｉｃｔａｌｕｒｉおよびＥ．ｔａｒｄａの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタ
ンパク質、ａｒｏＡおよびｐｕｒＡ；ならびにＩｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕ
ｓの表面抗原；ならびにＣｙｔｏｐｈａｇａ ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造タンパ
ク質および調節タンパク質；ならびにＲｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造タンパク質お
よび調節タンパク質。

【００９１】 寄生性病原体ポリぺプチドとしては、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表
面抗原が挙げられるがこれに限定されない。

【００９２】 被験体は抗原に曝露される。本明細書で使用される場合、用語「曝露される（
する）」とは、インビボで、被験体を抗原と接触させる能動的な工程または被験
体を抗原と受動的に接触させる工程のいずれかをいう。被験体を抗原に能動的に
暴露するための方法は、当該分野において周知である。一般に、抗原は、任意の
手段（例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、鼻腔内、気管内、または皮
下投与）によって被験体に直接的に投与される。抗原は、全身的または局所的に
投与され得る。抗原とＣｐＧとを投与するための方法は、以下に詳細に記載され
る。被験体は、抗原が身体内の免疫細胞への曝露に利用可能となる場合に、抗原
に対して受動的に曝露される。被験体は、例えば、外来抗原のその身体への進入
によって、または外来抗原を細胞表面に発現する腫瘍細胞の発達によって、抗原
に受動的に曝露され得る。被験体が抗原に受動的に曝露される場合、ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドは、８〜１００ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり
、そして／またはリン酸修飾骨格を有することが好ましい。オリゴヌクレオチド
を第１の抗原と組み合わせて投与することもまた好ましい。

【００９３】 被験体を抗原に受動的に曝露する方法は、特に、ＣｐＧオリゴヌクレオチド投
与の時期に依存する。例えば、癌またはアレルギー反応もしくは喘息反応を発症
する危険性がある被験体において、この被験体は、危険性が最も高い時期（すな
わち、アレルギーの季節または癌誘導因子（ｃａｎｃｅｒ ｃａｕｓｉｎｇ ａ
ｇｅｎｔ）への曝露の後）に、規則的にＣｐＧオリゴヌクレオチドを投与され得
る。さらに、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、旅行者が感染性因子に曝露される危
険性がある外国に旅行する前に、旅行者に投与され得る。同様に、ＣｐＧオリゴ
ヌクレオチドは、生物戦争（ｂｉｏｗａｒｆａｒｅ）に曝露される危険性のある
軍人または民間人に投与され得る。

【００９４】 従って、本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの定期投与を意図する。本発明
のオリゴヌクレオチドは、毎週または毎月を規準として被験体に投与され得る。
被験体が抗原（複数または単数）に曝露される危険性を有する場合、ＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドは、初回刺激した免疫系（これは、曝露に際し抗原を即座に認識
し、そして抗原特異的な免疫応答を引き起こす）を維持するように、規則的な基
準に基づいて投与され得る。抗原に曝露される危険性を有する被験体とは、抗原
に曝露されそしてその抗原に対する免疫応答を引き起こす高い可能性を有する任
意の被験体である。抗原がアレルゲンであり、その被験体がその特定の抗原に対
するアレルギー応答を発生し、そしてその被験体がその抗原に曝露された場合（
すなわち、花粉の季節の間）、被験体はその抗原に曝露される危険性を有する。
そのような患者が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを毎月を規準として投与された場
合、その被験体は、抗原を認識しそして反応し得る、初回刺激された免疫細胞の
セットを維持する。

【００９５】 癌を発生する危険性を有する被験体はまた、本発明の方法に従って、ＣｐＧへ
の曝露の後に抗原に受動的もしくは能動的に暴露することによって処置され得る
。癌を発生する危険性を有する被験体とは、癌を発症する高い可能性を有する被
験体である。これらの被験体としては、例えば、遺伝的異常を有する被験体（遺
伝的異常の存在は、癌を発生するより高い可能性と相関関係を有することが実証
されている）、ならびにタバコ、石綿、または他の化学毒素のような癌誘導因子
に曝露された被験体が挙げられる。癌を発生する危険性を有する被験体が、Ｃｐ
Ｇを用いて、規則的に（例えば、毎月）処置された場合、この被験体は初回刺激
された免疫細胞のセットを維持する。この細胞のセットは、抗原特異的な免疫応
答を認識し得、そしてその応答を起こし得る。被験体において腫瘍が形成を開始
する場合、この被験体は、１つ以上の腫瘍抗原に対する特異的な免疫応答を起こ
す。

【００９６】 本発明のこの局面は、被験体が曝露された抗原が未知である場合に特に有効で
ある。例えば、生物戦争に対して曝露される危険性を有する軍人においては、軍
人がどのような生物兵器に曝露され得るかは一般的に未知である。同様に、外国
に旅行する被験体は、彼らがどのような感染因子と接触し得るかは知らない可能
性がある。免疫系がその免疫系を再構築するように誘導することによって、任意
の抗原に対して応答するように初回刺激する。

【００９７】 抗原は、単独で、またはキャリアを伴って、被験体の免疫系に送達され得る。
例えば、コロイド分散系が、被験体に抗原を送達するために使用され得る。本明
細書中で使用される場合、「コロイド分散系」とは、被験体中に抗原を送達およ
び放出し得る、細菌学的供給源またはウイルス性供給源由来以外の、天然の分子
または合成分子をいう。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル
（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅ）、ミクロスフェア、ビーズ、および脂質に基づく系
（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）が挙げ
られる。本発明の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームとは、
インビボまたはインビトロの送達ベクターとして有用な人工膜血管である。サイ
ズが０．２〜４．０μの範囲である大きな単層血管（ＬＵＶ）は、水性の内部に
大きな高分子をカプセル化し得、そしてこれらの高分子は生物学的に活性な形態
で細胞に送達され得ることが示されている（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．６：７７（１９８１）。

【００９８】 トランスフェクションのための脂質処方物は、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ^TM （特別なＤＮＡ濃縮エンハンサーを有する非リポソーム脂質）およびＳＵＰＥＲ
−ＦＥＣＴ^TM（新規の作用性デンドリマー技術（ａｃｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｍ
ｅｒｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））としてＱＩＡＧＥＮから、ならびに、例え
ば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ^TMおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ^TM（これらは、例え
ば、Ｎ−［１−（２，３ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメ
チルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモ
ニウムブロミド（ＤＤＡＢ）のようなカチオン性脂質から構成される）としてＧ
ｉｂｃｏ ＢＲＬから市販される。リポソームを作製するための方法は当該分野
において周知であり、そして多くの刊行物に記載されている。リポソームは、Ｇ
ｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ３：２３５−２４１（１９８５）（これは、本明細書中で参考として援用さ
れる）による概説文献に記載された。

【００９９】 抗原が、この抗原をコードする核酸分子において被験体に送達され得、その結
果、この抗原がインビボで発現されるに違いないことが想像される。その抗原を
コードする核酸は、真核生物細胞内での抗原核酸の発現を指向する遺伝子発現配
列に、作動可能に連結される。「遺伝子発現配列」は、それに対して作動可能に
連結される抗原核酸の効率的な転写および翻訳を促進する、任意の調節ヌクレオ
チド配列（例えば、プロモーター配列、またはプロモーター−エンハンサーの組
合わせ）である。遺伝子発現配列とは、例えば、哺乳動物プロモーターまたはウ
イルス性プロモーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター
）であり得る。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子についての
プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸
キナーゼ、β−アクチンプロモーターおよび他の構成的プロモーター。真核生物
細胞中で構成的に機能する、例示的なウイルス性プロモーターとしては、例えば
、シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病
ウイルスおよび他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、ならびに単純ヘ
ルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター由来のプロモーターが挙げられ
る。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列
として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモー
ターは、誘導因子の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモータ
ーは、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される
。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。

【０１００】 一般的に、遺伝子発現配列は、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始
に関与する、５’−非転写配列および５’−非翻訳配列（例えば、ＴＡＴＡボッ
クス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列など）を含む。特に、そのような５’−非転
写配列は、作動可能に連結された抗原核酸の転写制御についてのプロモーター配
列を含むプロモーター領域を含む。この遺伝子発現配列は、必要に応じてエンハ
ンサー配列、または所望される場合には上流のアクチベーター配列を含む。

【０１０１】 抗原核酸は、遺伝子の発現配列に作動可能に連結される。本明細書中で使用さ
れる場合、抗原核酸配列および遺伝子発現配列が、この遺伝子発現配列の影響下
または制御下で、この抗原コード配列の発現あるいは転写および／または翻訳さ
せるように配置するような様式で共有結合される場合に、それらを「作動可能に
連結」されている状態であるという。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列
中のプロモーターの誘導が、抗原配列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ
配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入を生じない、（２）
抗原配列の転写を指向する、プロモーター領域の能力を妨害しない、または（３
）タンパク質に翻訳される、対応するＲＮＡの転写の能力を妨害しない場合に、
作動可能に連結されているという。従って、遺伝子発現配列は、その遺伝子発現
配列が、抗原核酸配列の転写をもたらし得、その結果、得られる転写産物が所望
のタンパク質またはポリペプチドに翻訳される場合に、抗原核酸配列に作動可能
に連結される。

【０１０２】 本発明の抗原核酸は、単独で、またはベクターと共に、免疫系に送達され得る
。最も広範な意味で、「ベクター」とは、免疫系の細胞、および好ましくはＡＰ
Ｃへの抗原核酸の移行を促進し得、その結果、その抗原がＡＰＣの表面上で発現
および提示され得る、任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクタ
ーの非存在下で生じる崩壊の程度と比較して、崩壊性を低減して免疫細胞に核酸
を輸送する。ベクターは、必要に応じて、ＡＰＣでの抗原核酸の発現を増強する
ために上記の遺伝子発現配列を含む。一般的に、本発明において有用なベクター
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗原核酸配列の挿入ま
たは組込みによって操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス
供給源または細菌性供給源由来の他のビヒクル。ウイルスベクターは、ベクター
の好ましい型であり、これは以下のウイルス由来の核酸配列を含むがこれらに限
定されない：レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベ
イマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）；
アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイル
ス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワ
クシニアウイルス；ポリオウイルス；およびＲＮＡウイルス（例えば、レトロウ
イルス）。列挙されていないが、当該分野において公知の他のベクターを容易に
使用し得る。

【０１０３】 好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子が目的の遺伝子と置き換えら
れている、非細胞障害性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞障害性ウイルスと
しては、その生活環が、引き続き宿主の細胞性ＤＮＡへのプロウイルスの組込み
を伴う、ＤＮＡへのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写に関与するレトロウイルスが
挙げられる。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療試行について認可されている
。最も有用なものは、複製欠損した（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向
し得るが、感染性粒子を生産し得ない）レトロウイルスである。そのような遺伝
的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率性
形質導入について、一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生す
るための標準的プロトコール（外因性の遺伝物質をプラスミドに組込む工程、プ
ラスミドによる、パッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッ
ケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生工程、組織培養培地からの
ウイルス粒子の回収工程、およびウイルス粒子を用いた標的細胞の感染工程を含
む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、「Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅ
ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｗ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎ Ｃ．Ｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．
Ｊ．編「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第７巻
、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｆｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓ
ｅｙ（１９９１）に提供される。

【０１０４】 特定の適用について好ましいウイルスは、アデノ随伴ウイルス（二本鎖ＤＮＡ
ウイルス）である。このアデノ随伴ウイルスは、複製欠損となるように操作され
得、そして広範な細胞型および種に感染し得る。これはさらに、熱安定性および
脂質溶媒安定性；多様な系列の細胞（造血細胞を含む）中への高い形質導入頻度
；および重感染阻害の欠如（従って、複数回の連続した形質導入を可能にする）
のような利点を有する。報告されているように、アデノ随伴ウイルスは、ヒトの
細胞ＤＮＡ中に部位特異的様式で組み込み得、それによって挿入変異誘発および
レトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の可変性の可能性を最小化する。
さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在下で１００を超える
継代の組織培養に続く。これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安
定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外様式にお
いても機能し得る。

【０１０５】 他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクタ
ーは、当該分野で広く記載されており、そして当業者に周知である。例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと。最近数年では、プラ
スミドベクターは、宿主ゲノム内に複製またはそこに組み込むことができないた
めに、インビボで細胞に遺伝子を送達するために特に有利であることが見出され
ている。しかし、宿主細胞に適合されたプロモーターを有するこれらのプラスミ
ドは、プラスミド内に作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る
。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが
挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。従って、プラスミドは、
制限酵素および連結反応を使用して特別に設計されて、ＤＮＡの特定のフラグメ
ントを除去し、そして付加し得る。

【０１０６】 プラスミドを保有する遺伝子は、細菌を使用して免疫系に送達され得ることが
最近発見されている。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのような細菌の改変形態は、プラス
ミドを用いてトランスフェクトされ得、そして送達ビヒクルとして使用され得る
。細菌送達ビヒクルは、宿主被験体に経口または他の投与手段によって投与され
得る。細菌は、おそらく腸関門を通過することによって、免疫細胞（例えば、樹
状細胞）にプラスミドを送達する。高レベルの免疫防御は、この方法論を使用し
て確立されている。

【０１０７】 本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫再構築核酸分子である。「免疫再
構築核酸分子」とは、核酸分子をいい、この核酸分子は、非メチル化シトシン−
グアニンジヌクレオチド配列（すなわち、「ＣｐＧ ＤＮＡ」または５’シトシ
ン、次いで３’グアノシンを含むＤＮＡ、そしてリン酸結合により連結される）
を含み、そして免疫細胞の再増殖（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を刺激する。免
疫再構築核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得る。一般に、二本鎖分子は、
インビボでより安定であり、一方、一本鎖分子は増大された免疫活性を有する。

【０１０８】 「核酸」または「オリゴヌクレオチド」は、複数のヌクレオチド（すなわち、
リン酸基および交換可能な有機塩基に連結された糖（例えば、リボースまたはデ
オキシリボース）を含む分子であり、これらの塩基は、置換型ピリミジン（例え
ば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換型プリ
ン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである）を意味
する。本明細書中で使用される場合、この用語は、オリゴリボヌクレオチドおよ
びオリゴデオキシリボヌクレオチドをいう。この用語はまた、ポリヌクレオシド
（すなわち、リン酸基を除くポリヌクレオチド）および任意の他の有機塩基含有
ポリマーを含む。核酸分子は、既存の核酸供給源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮ
Ａ）から得られ得るが、好ましくは、合成（例えば、オリゴヌクレオチド合成に
より生成される）核酸分子である。ＣｐＧオリゴヌクレオチド全体は、非メチル
化であってもよいし、部分的にメチル化されていてもよいが、少なくとも５’Ｃ
Ｇ３’は非メチル化でなければならない。

【０１０９】 １つの好ましい実施態様において、本発明は、以下の式により示されるＣｐＧ
オリゴヌクレオチドを提供する： ５’Ｎ₁Ｘ₁ＣＧＸ₂Ｎ₂３’ ここで、少なくとも１つのヌクレオチドは、連続的なＣｐＧとは離れており；Ｘ ₁ は、アデニン、グアニン、またはチミジンであり；Ｘ₂は、シトシン、アデニン
、またはチミジンであり；Ｎは、任意のヌクレオチドであり、そしてＮ₁および
Ｎ₂は、約０〜２５のＮから構成される核酸配列である。

【０１１０】 別の実施態様において、本発明は、以下の式により示される、単離されたＣｐ
Ｇオリゴヌクレオチドを提供する： ５’Ｎ₁Ｘ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄Ｎ₂３’ ここで、少なくとも１つのヌクレオチドは、連続的なＣｐＧとは離れており；Ｘ ₁ Ｘ₂は、ＧｐＴ、ＧｐＡ、ＡｐＡおよびＡｐＴからなる群より選択され；Ｘ₃Ｘ₄ は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＴｐＣおよびＡｐＴからなる群より選択され；Ｎは、任意
のヌクレオチドであり、そしてＮ₁およびＮ₂は、約０〜２５のＮから構成される
核酸配列である。好ましい実施態様において、核酸のＮ₁およびＮ₂は、ＣＣＧＧ
四量体（ｑｕａｄｍｅｒ）を含まず、１つを超えるＣＣＧまたはＣＧＧ三量体も
含まない。別の好ましい実施態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列
５’ＴＣＮ₁ＴＸ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’を有する。

【０１１１】 好ましくは、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ
およびＡｐＡからなる群より選択されるＸ₁Ｘ₂を含み、そしてＸ₃Ｘ₄は、ＴｐＴ
、ＣｐＴおよびＴｐＣからなる群より選択される。細胞への取り込みを容易にす
るために、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、好ましくは、８〜３０塩基長の範
囲にある。しかし、８ヌクレオチドを超える（多ｋｂ長ですらある）任意の大き
さの核酸は、十分な免疫刺激モチーフが存在する場合、免疫再構築を誘導し得る
。なぜなら、より大きな核酸が、細胞の内部でオリゴヌクレオチドに分解される
からである。好ましい合成オリゴヌクレオチドは、５’および／または３’末端
でまたはその付近でＣＣＧＧ四量体を含まず、１つを超えるＣＣＧまたはＣＧＧ
三量体も含まない。安定にされたオリゴヌクレオチド（ここで、オリゴヌクレオ
チドは、より詳細に以下で議論されるように、リン酸骨格修飾を組み込む）が、
やはり好ましい。この修飾は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチ
オエート修飾であり得る。好ましくは、リン酸骨格修飾は、核酸の５’末端で、
例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端の最初の２つのヌクレオチドで生じる。
さらに、リン酸骨格修飾は、核酸の３’末端で、例えば、核酸の３’末端の最後
の５つのヌクレオチドで生じ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは、完全に修
飾されていてもよいし、部分的に修飾されていてもよい。

【０１１２】 好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、８〜１００の範囲、より好ましく
は、８〜３０ヌクレオチドの範囲の大きさにある。あるいは、ＣｐＧオリゴヌク
レオチドは、プラスミドにおいて大規模に生成され得、これは、被験体に投与さ
れた後、オリゴヌクレオチドに分解される。

【０１１３】 ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、被験体に直接投与され得るか、または核酸送達
複合体と共に投与され得る。「核酸送達複合体」は、標的する手段（例えば、標
的細胞に対してより高い親和性結合を生じる分子（例えば、樹状細胞表面および
／または標的細胞による増大した細胞取り込み））と関連する（例えば、そこに
イオン結合するか、もしくは共有結合する；またはその内部にカプセル化される
）核酸分子を意味する。核酸送達複合体の例としては、以下と関連する核酸分子
が挙げられる：ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオ
ン性脂質、ビロゾームまたはリポソーム）、または標的細胞特異的結合因子（例
えば、標的細胞特異的レセプターによって認識されるリガンド）。好ましい複合
体は、標的細胞によるインターナリゼーションの前に重要な脱共役を防ぐように
インビボで十分に安定であるべきである。しかし、この複合体は、核酸が機能的
形態で放出されるように、細胞内の適切な条件下で切断可能であるべきである。

【０１１４】 「パリンドローム配列」は、逆転した反復（すなわち、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ
’Ｂ’Ａ’のような配列であり、ここでＡおよびＡ’は、通常ワトソンクリック
塩基対を形成し得る塩基である）を意味する。インビボでは、このような配列は
、二本鎖構造を形成し得る。１つの実施態様において、ＣｐＧオリゴヌクレオチ
ドは、パリンドローム配列を含む。この状況で使用されるパリンドローム配列は
、ＣｐＧがパリンドロームの一部分であるパリンドロームをいい、そして好まし
くは、パリンドロームの中心にある。別の実施態様において、ＣｐＧオリゴヌク
レオチドは、パリンドロームを含まない。パリンドロームを含まないＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがパリンドロームの一部分ではないオ
リゴヌクレオチドである。このようなオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧがパリンド
ロームの一部分ではないパリンドロームを含み得る。

【０１１５】 「安定にされた核酸分子」は、インビボ分解（例えば、エキソヌクレアーゼま
たはエンドヌクレアーゼを介する）に比較的耐性である核酸分子を意味する。安
定化は、長さまたは二次構造の関数であり得る。数百ｋｂ長である非メチル化Ｃ
ｐＧオリゴヌクレオチドは、インビボ分解に対して比較的耐性である。より短い
ＣｐＧオリゴヌクレオチドについては、二次構造は、それらの効果を安定にし得
、そして増大させ得る。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端が、ある種のス
テムループ構造にたたみ戻し得、そしてそれを形成し得るように、上流領域に対
して自己相補性を有する場合、このオリゴヌクレオチドは、安定になり得、それ
故、より高い活性を示す。

【０１１６】 本発明の好ましい安定にされたオリゴヌクレオチドは、修飾された骨格を有す
る。オリゴヌクレオチド骨格の修飾が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドがインビボで
投与された場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの増強された活性を提供することが
実証されている。ＣｐＧ構築物（３’末端（好ましくは、５’末端での）複数の
ホスホロチオエート連結においてオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端で
少なくとも２つのホスホロチオエート連結を含む）は、最大の活性を提供し、そ
して細胞内エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴ
デオキシリボヌクレオチドを防御した。他の修飾されたオリゴデオキシリボヌク
レオチドとしては、ホスホジエステル修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド、ホ
スホジエステルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドの組
み合わせ、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエ
ート、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。これらの組み合わせの各々お
よびそれらの特定の免疫細胞に対する効果は、米国特許出願０８／７３８，６５
２号および同第０８／９６０，７７４号（それぞれ、１９９６年１０月３０日お
よび１９９７年１０月３０日に出願）（これらの内容全体は本明細書に、より参
考として援用される）に優先権を主張する、同時係属中のＰＣＴ公開特許出願に
より詳細に議論されている。これらの修飾されたオリゴヌクレオチドは、増強さ
れたヌクレアーゼ耐性、増強された細胞取り込み、増大されたタンパク質結合、
および／または改変された細胞内位置に起因するより大きな刺激活性を示し得る
と考えられる。

【０１１７】 ＣｐＧモチーフを含有するホスホロチオエートおよびホスホジエステルの両方
のオリゴヌクレオチドは、樹状細胞のようなＡＰＣにおいて活性である。しかし
、ＣｐＧ特異的効果を誘導するに必要な濃度に基づいて、ヌクレアーゼ耐性ホス
ホロチオエート骨格ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、より強力である（ホスホジエ
ステルでの合計９０２μｇ／ｍｌに対してホスホロチオエートでは２μｇ／ｍｌ
）。

【０１１８】 他の安定にされたオリゴヌクレオチドとしては、非イオン性ＤＮＡアナログ（
例えば、アルキルリン酸およびアリールリン酸（ここで、荷電したホスホネート
酸素はアルキル基またはアリール基により置換される）、ホスホジエステルおよ
びアルキルホスホトリエステル）が挙げられ、ここで、荷電した酸素部分は、ア
ルキル化される。いずれかの末端または両末端でジオール（例えば、テトラエチ
レングリコールまたはヘキサエチレングリコール）を含むオリゴヌクレオチドは
また、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性である。

【０１１９】 免疫再構築を誘導するに有用な本発明の核酸配列は、上記に広範に記載される
。例示的な配列としては、表１に示される配列および以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：

【０１２０】

【化３】 特定のＣｐＧオリゴヌクレオチドが免疫系再構築を誘導する能力は、オリゴヌ
クレオチドの刺激指数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）を評価する種々
の免疫細胞アッセイにおいて試験され得る。好ましくは、Ｂ細胞増殖に関してＣ
ｐＧオリゴヌクレオチドの刺激指数は、マウスＢ細胞培養物における³Ｈウリジ
ンの取り込みにより測定されるように、少なくとも約５、好ましくは、少なくと
も約１０、より好ましくは少なくとも約１５、そして最も好ましくは少なくとも
約２０である。このマウスＢ細胞培養物は、２０μＭのＯＤＮと３７℃で２０時
間接触され、そして１μＣｉの³Ｈウリジンでパルスされ；そして米国特許出願
第０８／７３８，６５２号および同第０８／９６０，７７４号（それぞれ、１９
９６年１０月３０日および１９９７年１０月３０日に出願）に優先権を主張する
同時係属中のＰＣＴ公開特許出願に詳細に記載されるように、４時間後に回収さ
れて計数された。インビボでの使用については、例えば、免疫系再構築を誘導す
るために、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、樹状細胞のようなＡＰＣの生成を効果
的に誘導し得ることが重要である。これを達成し得るオリゴヌクレオチドは、例
えば、米国特許出願第０８／７３８，６５２号および同第０８／９６０，７７４
号（それぞれ、１９９６年１０月３０日および１９９７年１０月３０日に出願）
に優先権を主張するＰＣＴ公開特許出願に詳細に記載されるオリゴヌクレオチド
である。

【０１２１】 本発明の１つの局面において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを使用して、免疫細
胞および好ましくはＡＰＣの再増殖を誘導する。ＡＰＣは、当該分野におけるそ
の通常の意味を有し、そして例えば、樹状細胞（例えば、未成熟樹状細胞および
前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）ならびに樹状細胞前駆体（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ
））、ならびに抗原を取り込みそして発現し得る成熟樹状細胞を含む。そのよう
なＡＰＣまたは樹状細胞の集団を、ＡＰＣまたは樹状細胞の感作（ｐｒｉｍｅｄ
）集団という。

【０１２２】 ＣｐＧオリゴヌクレオチドを、抗原を投与する前に単独で被験体に投与し得る
。このオリゴヌクレオチドはまた、抗原と組み合わされて被験体に投与されて、
すぐに抗原特異的応答を提供し得る。第１の抗原と同じであっても良いしまたは
異なっても良い第２の抗原は、次いで、ＣｐＧの投与の少なくとも２日後に被験
体に投与され得る。用語、〜と組み合わされては、第１の抗原の直前、直後、ま
たは同時のＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与をいう。用語、直前および直後は、
２４時間の期間および好ましくは１２時間の期間をいう。

【０１２３】 ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、第１の抗原と組み合わされて投与される場合、
第１の抗原は、早急な免疫応答の特異性を決定する。ＣｐＧオリゴヌクレオチド
は、効果的な「危険シグナル」として作用し、そしてその領域において新しい抗
原に活発に応答する免疫系を生じる。この作用の様式は、おそらく主に樹状細胞
および他の「前駆体」抗原提示細胞に対するＣｐＧオリゴヌクレオチドの刺激性
の局所的効果、ならびにＢ細胞に対する同時刺激効果から生じる。この効果は、
ＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与の際に早急に生じ、そして約２日後に見られる
再増殖事象と区別される。

【０１２４】 治療における使用のために、有効量の適切なＣｐＧオリゴヌクレオチド単独ま
たは核酸送達複合体として処方されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを、オリゴヌク
レオチドが適切な標的細胞（例えば、樹状細胞）に取り込まれるように任意の様
式により被験体に投与し得る。好ましい投与の経路は、経口、経皮（例えば、パ
ッチを介して）、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、鞘内など）、経鼻、気
管内、および粘膜が挙げられるが、これらに限定されない。注射は、ボーラスま
たは連続的注入であり得る。

【０１２５】 用語ＣｐＧオリゴヌクレオチドの「有効量」は、所望の生物学的効果を認識す
るのに必要な量または十分な量をいう。例えば、免疫系不全を処置するための少
なくとも１つの非メチル化ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドの有効量は、免
疫系の再増殖を生じ、抗原に曝露した際の抗原特異的免疫応答の発生を生じるに
必要な量であり得る。任意の特定の適用についての有効量は、処置される疾患ま
たは状態、投与される特定のＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、非メチル化Ｃ
ｐＧモチーフの数、または核酸内でのその位置）、被験体の大きさ、あるいは疾
患または状態の重篤度のような因子に依存して変化し得る。当業者は、過度の実
験を必要とすることなく特定のオリゴヌクレオチド有効量を経験的に決定し得る
。

【０１２６】 造血の調節による免疫系の再構築を誘導することに加えて、本発明は、特定の
免疫細胞（例えば、血小板および赤芽球）の造血を誘導する方法に関する。その
ような方法は、それぞれ血小板減少症および貧血を処置するために有用である。

【０１２７】 血小板減少症は、血小板の欠乏に関する障害である。血液凝固に重要な役割を
果たす血小板は、骨髄において見られる前駆幹細胞（巨核球）の細胞質の細分に
より誘導される。形成後、血小板は、骨髄を離れそして脾臓を介してそして血液
に運ばれ、およそ１／３の血小板が脾臓において壊死巣分離される。血液に運ば
れた血小板は、約７〜１０日間循環する。通常ヒトの血液中に、１μｌあたり１
５０，０００〜４００，０００の濃度で存在する血小板は、止血または出血の調
節において重要な役割を果たす。血小板のレベルが被験体において通常よりも低
い場合、被験体における出血の危険性が増加する。

【０１２８】 通常、循環している血小板のレベルが減少した場合、フィードバック機構が開
始され、これは、巨核球の数、サイズ、および倍数性における産生の増加を生じ
る。この機構は、次ぎに、さらなる血小板の産生および循環中への放出を引き起
こす。血小板レベルのフィードバック調節は、通常循環中の正常な血小板レベル
を維持するのに十分であるが、いくつかの生理学的状態が、血小板レベルの重大
な不均衡を引き起こし得る。そのような状態は、血小板減少症または血小板増加
症（血液中の血小板レベルの増加により引き起こされる状態）のいずれかを生じ
る。

【０１２９】 少なくとも３つの生理学的状態が、血小板減少症を生じる事が公知である：骨
髄における血小板産生の減少；血小板の脾性壊死巣分離の増加；あるいは血小板
破壊の加速。血小板減少症を首尾良く処置するための通常の治療において、どの
機構が血小板レベルの減少を引き起こしているのかが最初に同定すべきことであ
り、次いで血小板減少の根本にある原因を排除する薬物を投与することによるか
またはその原因を排除する手順を実施することにより被験体を処置すべきである
。

【０１３０】 骨髄の産生の減少に起因する血小板の喪失は、巨核球の減少した数を実証する
、骨髄吸引または生検の実験により証明され得る。骨髄産生の減少は、γ線照射
、放射線に対する治療的曝露、または細胞傷害性薬物処置の結果としての骨髄抑
制から生じ得る。ベンゼンまたはアントラセン含有化学薬品（ｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）およびいくつかの通常使用される薬物（例えば、クロラムフェニコール、チ
オウラシル、およびバルビツール睡眠薬）でさえ骨髄抑制を引き起こし、血小板
減少症を生じ得る。さらに、まれな骨髄障害（例えば、先天性無巨核球発育不全
（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃ ｈｙｐｏｐｌａｓ
ｉａ）、および橈骨の欠損をともなう血小板減少症（血小板減少−橈骨欠損症候
群））は、選択的に巨核球の産生を減少させ、血小板減少症を生じ得る。

【０１３１】 血小板の脾性壊死巣分離は、脾臓サイズの増加を引き起こし得る。脾性壊死巣
分離は、しばしば脾臓サイズを推定するためにベッドサイド触診により決定され
得る。脾臓サイズの増加または巨脾腫症は、代表的に、肝臓疾患に従属的な門脈
圧亢進症、骨髄増殖障害またはリンパ球増殖障害の腫瘍細胞での脾臓浸潤、ある
いはマクロファージ蓄積障害（例えば、ゴシェ病）により引き起こされる。脾摘
出が、しばしば用いられて、過剰な脾性壊死巣分離の場合に血小板数を増加する
。

【０１３２】 血小板破壊の加速により生じる血小板減少症は、一般的に、骨髄の産生障害お
よび脾性壊死巣分離が除外された場合に、血液中の血小板のレベルの減少の原因
である。加速された血小板の破壊は、免疫学的障害または非免疫学的障害のいず
れかにより生じる。免疫学的血小板減少症は、例えば、自己免疫障害（例えば、
特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ））、ウイルス感染、細菌感染および薬物に
より生じ得る。非免疫学的血小板減少症は、脈管炎、溶血性尿毒症症候群、血栓
性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）および人
工心臓弁により生じる。慢性のＩＴＰは、しばしば、高用量のステロイド、静脈
内γグロブリン、脾摘出術、および免疫抑制剤さえ用いて処置される。これらの
各々の治療方法は、一時的な救出を提供するにすぎず、そして重篤な副作用と関
連している。さらに慢性ＩＴＰ患者の約２０％が、公知の処置のいずれにも応答
しない。

【０１３３】 本発明は、白血球減少症を示す被験体、または白血球減少症を発症する危険性
のある被験体において白血球減少症を処置する方法である。本明細書において使
用する場合、「白血球減少症」は、罹患した個体における血小板のレベルが、個
体において正常な血小板の範囲以下に低下する障害である。

【０１３４】 血小板減少症は、感染誘導血小板減少症、処置誘導血小板減少症、および生理
学的誘導血小板減少症を含む。感染誘導血小板減少症は、細菌またはウイルスの
ような感染性因子により引き起こされる、末梢血における低血小板レベルにより
特徴づけられる障害である。処置誘導血小板減少症は、γ線照射、放射線への治
療的曝露、細胞障害性薬剤、ベンゼンまたはアントラセン含有化学薬品、および
いくつかの通常使用される薬物さえ（例えば、クロラムフェニコール、チオウラ
シルにより、およびバルビツール睡眠薬）のような治療的処置により引き起こさ
れる、末梢血における低血小板レベルにより特徴づけられる障害である。生理学
的誘導血小板減少症は、血小板減少症を引き起こす感染性因子または治療的処置
以外の任意の機構により引き起こされる、末梢血における低血小板レベルにより
特徴づけられる障害である。生理学的誘導血小板減少症を引き起こす因子には、
先天性無巨核球発育不全および橈骨の欠損をともなう血小板減少症（血小板減少
−橈骨欠損症候群）のような稀な骨髄障害、肝臓疾患に従属的な門脈圧亢進症に
より引き起こされる脾臓サイズの増加すなわち巨脾腫症、あるいはマクロファー
ジ蓄積障害（例えば、ゴシェ病）、自己免疫障害（例えば、特発性血小板減少性
紫斑病（ＩＴＰ））、脈管炎、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病
（ＴＴＰ）、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）および人工心臓弁が挙げられる
が、これらに限定されない。

【０１３５】 血小板減少症を有する被験体とは、任意の型の血小板減少症を有する被験体で
ある。いくつかの実施態様において、血小板減少症を有する被験体は、非化学療
法誘導血小板減少症を有する被験体である。非化学療法血小板減少症を有する被
験体は、任意の型の血小板減少症を有する被験体であるが、この被験体は、化学
療法を受けていない。他の実施態様において、被験体は、化学療法誘導血小板減
少症を有する被験体であり、これは、血小板減少症を有し、かつ化学療法薬剤で
処置されている任意の被験体を含む。

【０１３６】 本明細書において使用する場合、「血小板減少症を発症する危険性のある被験
体」は、血小板減少症を獲得するまたは発症する高い可能性を有する被験体であ
る。例えば、化学療法処置を処方された悪性腫瘍を有する患者は、処置誘導血小
板減少症を発症する危険性があり、そして感染性因子に曝露される危険性の増加
した被験体は、感染性誘導血小板減少症を発症する危険性がある。

【０１３７】 １つの局面において本発明は、血小板減少症を有する被験体または血小板減少
症を発症する危険性のある被験体において、少なくとも以下の式を含む配列を有
するオリゴヌクレオチドを被験体に投与することにより、血小板数を増加するた
めの方法である： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのヌクレオチドを含み、こ
こでＣおよびＧは、非メチル化型であり、そしてここでＸ₁およびＸ₂は、被験体
において血小板数を増加するために有効な量の、または被験体が血小板を枯渇す
る状態に曝露された場合に、被験体において血小板を枯渇する状態下で通常予想
される血小板数の減少を予防するために有効な量のヌクレオチドである。被験体
において血小板数を増加するに有効な量とは、循環血小板の量のレベルにおける
増加を生じる量である。達成される血小板の実際のレベルは、被験体の免疫系の
最初の状態（すなわち、被験体が、軽度から重篤な血小板減少症（例えば、自己
免疫疾患または脾性壊死巣分離から生じる）を有するかどうか）のような多くの
変数に依存して変化する。一般的に、重篤な血小板減少症を有する被験体の血小
板レベルは、最初は非常に低い。正常レベルよりなお低いレベルへの増加でさえ
、そのような被験体の血小板レベルの任意の増加は、被験体にとって有利であり
得る。

【０１３８】 一方、血小板減少症を発症する危険性のある被験体の血小板レベルは、一般的
に正常範囲内である。オリゴヌクレオチドは、そのような被験体の血小板レベル
を、被験体が血小板減少症を引き起こす状態に曝露された場合に通常生じるレベ
ルへの低下から保護する。従って、被験体へのオリゴヌクレオチド投与は、別な
場合、本発明に従う処置の非存在下で生じる血小板数の減少を医学的に有意な範
囲まで阻害する。それにより、被験体が血小板減少症を生じる状態に曝露された
場合に通常生じる範囲の血小板減少症の発症を予防する。好ましくは、有効量は
、血小板レベルが、１μｌあたり５０，０００の血小板のレベル未満に減少する
ことを防ぐ量である。

【０１３９】 血小板レベルを増加させるための有効な量のオリゴヌクレオチドは、血小板レ
ベルを測定するため、または血小板レベルと相関する変数を測定するための当該
分野において公知の任意の従来方法によって測定され得る。血小板数は、単に、
血液サンプルを得て、そして１マイクロリットルの血液あたりの血小板の数をカ
ウントすることによって決定される。血小板レベルはまた、出血時間と相関し得
る。

【０１４０】 本発明は、血小板減少誘発事象後の、血小板減少症の早期処置のために特に有
用である。以下の実施例において示されるように、血栓崩壊誘発事象に曝露され
た被験体が、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを投与される場合、その被験体は、血小
板減少誘発事象に曝露されたがＣｐＧオリゴヌクレオチドで処理されていない被
験体と比較して、増加した血小板数を有する。この応答は、その被験体がその誘
発事象に曝露された後の短い時間において特に有意である。例えば、血小板数に
おける有意な増加は、４日後に観察される。

【０１４１】 貧血は、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）または赤血球（ｅｒｙｔｈ
ｒｏｃｙｔｅ）のレベルにおける減少と関連する血液障害である。赤血球は、血
小板と同じ、骨髄中の未分化の前駆細胞（多能性幹細胞と呼ばれる）から誘導さ
れる。多能性幹細胞は、赤芽球バースト形成単位を生成し得、この単位は、次い
で赤芽球コロニー形成単位を形成し得る。これらの細胞は、最終的に、赤芽球、
続いて赤血球に分化する。

【０１４２】 １つの局面において、本発明は、貧血を有する被験体に、その被験体において
赤血球生成を誘導するに有効な量のオリゴヌクレオチドを投与することによって
貧血を処置するための方法であり、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも以下
の式を含む配列を有し： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも８ヌクレオチドを含み、ここで
ＣおよびＧは非メチル化されており、そしてここでＸ₁およびＸ₂はヌクレオチド
である。

【０１４３】 被験体における赤芽球の量は、骨髄中の赤芽球の数を測定することによって、
または末梢血中の赤血球の量を測定することによって評価され得る。末梢血中の
赤血球の測定を含むアッセイがより簡便であり、そして赤芽球の数に対する合理
的な相関を提供する。

【０１４４】 本明細書中で使用される「貧血」とは、赤血球の数および／またはヘモグロビ
ン濃度における損失が存在する疾患をいう。貧血の被験体は、通常には、血球質
量における減少、および血液の酸素運搬能における対応する減少を経験する。多
くの型の潜在的な（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）疾患が貧血を引き起こす。これらは
、以下において非常に詳細に議論されている：Ｈａｒｒｉｓｏｎｓ，Ｐｒｉｎｃ
ｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｉｓｓｅｌｂａｃｈ
ｅｒら編；第１３版；ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１
９９４。貧血には、例えば以下が含まれるがそれらに限定されない：薬物誘導貧
血、免疫溶血性（ｉｍｍｕｎｏｈｅｍｏｌｙｔｉｃ）障害、遺伝障害（例えば、
異常ヘモグロビン症および遺伝性溶血性貧血）；十分な鉄貯蔵にもかかわらず、
不十分な生成；慢性疾患（例えば、腎不全）；ならびに慢性炎症性障害（例えば
、慢性関節リウマチ）。

【０１４５】 先に議論されるように、被験体には、ヒトおよび非ヒト脊椎動物が挙げられる
。ヒトの血小板減少症および貧血の処置に加えて、本発明は、非ヒトの血小板お
よび他の血球の障害を処置するために有用である。例えば、最も一般的なイヌの
免疫媒介疾患には、免疫媒介溶血性貧血および免疫媒介血小板減少症（ＩＴＰ）
が挙げられる。これらの障害の両方は、それぞれ赤血球または血小板を攻撃する
抗体によって誘発される。この抗体は、赤血球または血小板の枯渇を導く、細胞
の破壊を引き起こす。これらの障害は、イヌにおいて生命を脅かし得る。従って
、本発明は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与を介する、イヌの免疫媒介溶血性
障害の処置を意図する。

【０１４６】 イヌにおける貧血を評価するための１つの方法は、血球数を決定することによ
る。低いＰａｃｋｅｄ Ｃｅｌｌ Ｖｏｌｕｍｅ（充填赤血球量）（ＰＣＶ）は
、単純なヘマトクリットで評価され得、貧血を示す。イヌについての正常なＰＣ
Ｖは、４０〜５９であり、そしてネコについては２９〜５０である。貧血の重篤
な場合において、動物は、一般的に、その口における蒼白性の膜を有し、そして
虚弱および疲労を示す。貧血は、再生性または非再生性のいずれかとして分類さ
れ得る。再生性貧血において、動物は、新しい網状赤血球を循環系に放出するこ
とによって応答し得る。非再生性貧血において、サンプル中には未成熟のＲＢＣ
が存在しないか、または非常にわずかに存在し、そしてその身体は赤血球を失い
続けるが、新しい赤血球は産生されない。本発明は、両方の型の貧血を処置する
ために有用であるが、特に、非再生性貧血を処置することにおいて有用である。

【０１４７】 動物の所定の量の血液中のＲＢＣの実際の数もまた測定され得る。赤血球数は
、１マイクロリットル（ｍ ｌ）中に見出される細胞の実際の数として測定され
る。各実験室は、ＲＢＣ数についてそれら自体の「正常な」範囲のセットを有す
るが、平均は、イヌについて１マイクロリットルあたり５．６〜８．７×１０⁶
ＲＢＣであり、そしてネコについて６．１〜１１．９×１０⁶／ｍ ｌである。
赤血球の数もまた、存在するヘモグロビンの量を定量することによって評価され
得る。イヌについての正常なヘモグロビンレベルは、１４〜２０グラム／デシリ
ットルであり、そしてネコについて９〜１５．６ｇ／ｄｌである。イヌおよびネ
コについての正常な血液学値を、以下の表に示す。

【０１４８】

【表１】 ウマもまた、造血障害（例えば、貧血）を発病する。ウマが発病する１つの貧
血状態は、米国特許第４，５００，５３０号に記載されるような円鋸歯状（ｃｒ
ｅｎａｔｅｄ）または針状（ｓｐｉｃｕｌａｔｅｄ）の赤血球の数における運動
誘導された増加である。この赤血球の針状体（ｓｐｉｃｕｌａｔｉｏｎ）は、ス
ポーツ貧血を導く細胞の破壊を生じる。本発明の方法を使用して、運動を経てい
る動物におけるこの障害を処置または予防し得る。例えば、ウマは、貧血の予防
または処置のために、レースの前または後に、ＣｐＧを投与され得る。

【０１４９】 本発明の方法に従って有用なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、上記のＣｐＧオリ
ゴヌクレオチドである。本発明の製剤は、有効な量で投与される。オリゴヌクレ
オチドの有効量は、単独またはさらなる用量とともに、例えば被験体の血小板ま
たは赤芽球の循環レベルを増加することによって、血小板または赤芽球のレベル
を望ましく調製する量である。１ナノグラム／キログラム〜１００ミリグラム／
キログラムの範囲の用量（投与の様式に依存する）が有効であると考えられる。
好ましい範囲は、特に皮下で与えられる場合、０．１〜１０．０ｍｇ／用量であ
ると考えられる。より好ましくは、この量は、０．５〜１．０ｍｇ／用量の範囲
内である。好ましくは、有効量が、１回より多く投与される。好ましくは、有効
量が、毎日〜３０日毎、そしてより好ましくは５日毎〜１５日毎に投与される。
このレジメンは、６ヶ月〜１年まで、または被験体の生存期間にまでさえ維持さ
れ得る。１つの実施態様において、有効量が、５２週間まで；より好ましくは３
２週間まで、そしてさらにより好ましくは４〜１４週間まで、１週間に１度投与
される。絶対量は、種々の因子（投与を、血小板減少症または貧血を処置する他
の方法と組み合わせるか否か、用量の数、および個々の患者の変数（年齢、身体
状態、サイズおよび重量を含む）を含む）に依存し、そして慣用的実験で決定さ
れ得る。一般には、最大用量、すなわち正しい医学判断による最も高い安全な用
量が使用されることが好ましい。

【０１５０】 別の実施態様において、このオリゴヌクレオチドの投与の期間の後に、４〜５
２週間治療は中断され、そして再開される。さらにより好ましくは、治療は、８
〜１４週間後に再開される。

【０１５１】 本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液で投与される。この溶液は、慣用
的には、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存剤、適合性キャリア、ア
ジュバント、および必要に応じて他の治療用成分を含み得る。

【０１５２】 このＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび抗原は、それ自体で（生の）、または薬
学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。医薬において使用される場合、塩は
、薬学的に受容可能であるべきであるが、非薬学的に受容可能な塩は、その薬学
的に受容可能な塩を調製するために簡便に使用され得る。そのような塩には、以
下の酸から調製される塩が挙げられるがそれらに限定されない：塩酸、臭化水素
酸、硫酸（ｓｕｌｐｈｕｒｉｃ）、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル
酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マ
ロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸。ま
た、そのような塩は、カルボン酸基のアルカリ金属塩またはアルカリ土類塩（例
えば、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩）として調製され得る。

【０１５３】 適切な緩衝化剤には、以下が挙げられる：酢酸および塩（１〜２％ ｗ／ｖ）
；クエン酸および塩（１〜３％ ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％
ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ ｗ／ｖ）。適切な保存剤
には、ベンザルコニウムクロリド（０．００３〜０．０３％ ｗ／ｖ）；クロロ
ブタノール（０．３〜０．９％ ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％
ｗ／ｖ）；ならびにチメロサール（０．００４〜０．０２％ ｗ／ｖ）が挙げら
れる。

【０１５４】 本発明の薬学的組成物は、有効量のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび抗原（必
要に応じて、薬学的に受容可能なキャリア中に含まれる）を含む。用語「薬学的
に受容可能なキャリア」は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与のために適切であ
る１つ以上の適合性の、固体または液体のフィラー、希釈剤、またはカプセル化
物質を意味する。用語「キャリア」は、適用を容易にするために活性成分と組み
合わされる、天然または合成の有機または無機成分を示す。薬学的組成物の成分
はまた、所望の薬学的効率を実質的に低減する相互作用が存在しないような様式
で、本発明の化合物、および互いと混合され得る。

【０１５５】 非経口投与のための適切な組成物は、簡便には、滅菌水性調製物を含み、これ
はレシピエントの血液と等張性であり得る。受容可能なビヒクルおよび溶媒には
、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌の
不揮発性油は、溶媒または懸濁化媒体として従来的に使用される。この目的のた
めに、任意の刺激の少ない（ｂｌａｎｄ）不揮発性油（合成のモノグリセリドま
たはジグリセリドを含む）が使用され得る。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン
酸）は、注射剤（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｓ）の調製における使用を見出す。皮下
、筋肉内、腹腔内、静脈内などの投与に適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて見いだされ
得る。

【０１５６】 本発明において有用なＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは抗原は、１つより多く
のＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは抗原の混合物で送達され得る。混合物は、い
くつかのＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは抗原からなり得る。

【０１５７】 種々の投与経路が使用可能である。選択される特定の様式は、当然のことなが
ら、選択される特定のＣｐＧオリゴヌクレオチドまたは抗原、処置されている特
定の状態、および治療効力のために必要とされる投与量に依存する。本発明の方
法は、一般的に言えば、医学的に受容可能である任意の投与様式（臨床的に受容
不能な副作用を引き起こすことなく、有効なレベルの免疫応答を生じる任意の様
式を意味する）を使用して実施され得る。投与の好ましい様式は、上記に議論さ
れる。

【０１５８】 この組成物は、都合よく、単位投薬形態で提供され得、そして薬学の分野にお
いて周知の任意の方法により調製され得る。全ての方法は、この化合物を１以上
の付属成分を構成するキャリアと会合させる工程を含む。一般に、この組成物は
、この化合物を、液体キャリア、微細に分割した固体キャリア、またはその両方
と均一かつ緊密に会合させること、次いで必要な場合、その製品を成形すること
によって調製される。

【０１５９】 他の送達系には、時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）、遅延放出（ｄｅｌ
ａｙｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）または持続放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａ
ｓｅ）の送達系が挙げられ得る。このような系は、この化合物（ＣｐＧまたは抗
原のいずれか）の投与の繰り返しを回避し得、被検体および医師に対する簡便性
を増大させる。多くの型の放出送達系は、当業者に利用可能であり、そして公知
である。これらの送達系としては、ポリマーベースの系（例えば、ポリ（ラクチ
ド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルア
ミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物）が挙げら
れる。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５
，０７５，１０９号、において記載される。送達系にはまた、ステロール（例え
ば、コレステロール）、コレステロールエステルおよび脂肪酸、または中性脂肪
（例えば、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド）を含む脂質；
ヒドロゲル放出系；サイラスティック系；ペプチドベースの系；ろうコーティン
グ；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合したインプラ
ントなどの非ポリマーの系が挙げられる。特定の例は、以下を含むがこれらに限
定されない：（ａ）侵食系（ｅｒｏｓｉｏｎａｌ ｓｙｓｔｅｍ）（ここで、本
発明の薬剤は、マトリクス内の形態中に含まれる（例えば、米国特許第４，４５
２，７７５号、同第４，６７５，１８９号、および同第５，７３６，１５２号に
記載される系）、および（ｂ）拡散系（ここで、活性成分は、ポリマーから制御
された速度で浸透する（例えば、米国特許第３，８５４，４８０号、同第５，１
３３，９７４号および同第５，４０７，６８６号に記載される系）。さらに、ポ
ンプベースのハードウェア送達系が使用され得、これらのうちのいくつかは、移
植用にて改造される。

【０１６０】 本発明はさらに、以下の実施例によって例示され、これらの実施例は、決して
さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願の至るところで引用される
全ての参考文献（文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属
特許出願を含む）の全内容は、本明細書によって、参考として明らかに援用され
る。

【０１６１】 （実施例） （実施例１：ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、造血を誘導する） （方法） （マウス）雌性Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＣＢＡ／Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ
およびＳＣＩＤマウスを、Ｈａｒｌａｎ Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ（Ｂｏｒｃｈｅ
ｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｗｉｇａ（Ｓｕｌｚｆｅ
ｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＢｏｍｈｏｌｔｇａｒｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａ
ｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ Ｌｔｄ．（Ｒｙ、Ｄｅｎｍａｒｋ）か
ら購入した。全ての動物を、特定の病原体が存在しない条件下で飼育し、そして
８〜１２週齢（体重１８〜２１ｇ）で使用した。

【０１６２】 （組織および細胞）大腿および脾臓を、無菌的に取り出し、そして氷冷したマ
ウス張度ＰＢＳ中に収集した。単一細胞の懸濁液を調製し、そして集塊を、１０
０μｍ孔サイズのフィルター（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して取り除いた。Ｂ細胞（
Ｂ２２０陽性）およびＴ細胞（ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性）の枯渇のために、
脾細胞を、脾臓の非Ｂ細胞および非Ｔ細胞の部分のネガティブ選択を可能にする
それぞれの抗体でコートした磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）とともにインキュベートした。効率をＦＡＣＳ分析によって調べ、枯
渇後に５％未満のＢ２２０陽性細胞および３％未満のＣＤ３陽性細胞を得た。

【０１６３】 （微生物刺激および合成オリゴヌクレオチド）ホスホロチオエート安定化オリ
ゴヌクレオチド（ＯＤＮ）を、ＴｉｂＭｏｌＢｉｏｌ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）によって合成した。ＯＤＮ配列「ＣＧ１」（＝ＯＤＮ１６６８、下線を
付した文字で印を付けられた「ＣＧ−モチーフ」を含む：５’−ＴＣＣ−ＡＴＧ −ＡＣＧ−ＴＴ Ｃ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−ＣＴ）（配列番号２４：ＳＥＱ ＩＤ２４
）およびコントロールＧＣ−ＯＤＮ（「逆位（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ＣＧ」＝ＯＤ
Ｎ１７２０：５’−ＴＣＣ−ＡＴＧ−ＡＧＣ−ＴＴＣ−ＣＴＧ−ＡＴＧ−ＣＴ）
（配列番号１０６：ＳＥＱ ＩＤ１０６）を、Ｋｒｉｅｇ，ＡＭら（１９９５）
Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９から得た。第２のＣｐＧ−ＯＤＮ「ＣＧ
２」（＝ＯＤＮ ＩＬ １２ｐ４０：５’−ＡＧＣ−ＴＡＴ−ＧＡＣ−ＧＴＴ−
ＣＣＡ−ＡＧＧ）（配列番号１０７：ＳＥＱ ＩＤ１０７）およびコントロール
ＯＤＮ「ｎＣＧ」（「非ＣＧ’」＝ＯＤＮ ＡＰ１、ＣＧモチーフなし：５’−
ＧＣＴ−ＴＧＡ−ＴＧＡ−ＣＴＣ−ＡＧＣ−ＣＧＧ−ＡＡ）（配列番号１０８：
ＳＥＱ ＩＤ１０８）が、最近記載された。Ｌｉｐｆｏｒｄ，ＧＢら（１９９７
）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：２３４０〜２３４４。Ｅ．Ｃｏｌｉ由来
のＬＰＳを、Ｓｉｇｍａ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。Ｌｉ
ｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ
ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ株４３２５１）から入手し、
そして一晩の培養で、ブレインハートインフュージョン（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＵＳＡ）において増殖さ
せた。細菌数をＯＤ₆₀₀により決定し、そしてコロンビア血液アガープレート上
に１０倍段階希釈の１０μｌのアリコートをプレートし、そして３７℃での一晩
のインキュベーションの後に、コロニー形成単位を計数することによって調べた
。

【０１６４】 （マウスの処理）ＣｐＧ−ＯＤＮを、低エンドトキシン水性処方注射剤におい
て、１〜５０ｎｍｏｌ／マウスで腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射し、ＬＰＳを１０μ
ｇ／マウスで使用した。陰性コントロールマウスは、水性処方注射剤単独で注射
を受けた。マウスの致死量下の放射線照射（４Ｇｙ）を、⁶⁰Ｃｏ放射線照射器（
Ｂｕｃｈｌｅｒ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実行
した。オボアルブミン（ＯＶＡ）特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するために、Ｏ
ＶＡを含有するリポソームを、記載されるように調製した。Ｌｉｐｆｏｒｄ，Ｇ
Ｂら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ １２：７３〜８０。アジュバントとしてのＱ
ｕｉｌＡとともにリポソームに捕捉されたＯＶＡを含有する接種物を、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６マウスのフットパッドの後部に注射し、そして４日後にドレイニング（ｄ
ｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節を回収した。リンパ節細胞を、１０Ｕ／ｍｌの組換え
（ｒ）ＩＬ−２とともに４日間培養し、そしてＣＴＬアッセイを、上記のように
実行した。Ｌｉｐｆｏｒｄ，ＧＢら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ １２：７３〜
８０。Ｌｉｓｔｅｒｉａ感染については、２．５〜５×１０⁵のＬｉｓｔｅｒｉ
ａ／マウスを、致死量下で放射線照射されたマウス（４Ｇｙ）（放射線照射１４
日後）に、３００μｌの容量のブレインハートインフュージョンにおいて腹腔内
に接種し、そして生存を以降３０日間記録した。ＯＤＮ保護したマウスは、放射
線照射後３０分以内に１０ｎｍｏｌのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１）を腹腔内に受け
た。コントロールマウスを、モック処理（水性処方注射剤の注射）した。実行し
た各々の実験は、１時点当たりで１群当たり３〜１０匹のマウスを有した。

【０１６５】 （組織病理学）ＯＤＮ注射後の種々の時点で、マウスを、ＣＯ₂での窒息によ
って殺傷した。選択した組織（脾臓、肝臓、リンパ節および骨髄を含む）を取り
出した。巨脾腫の決定のために、器官から脂肪および連続する組織を切り取り、
そして秤量した。器官／身体の重量比を算定した。顕微鏡での評価のために処理
した組織を、１０％中性緩衝化ホルマリンにおいて固定化し、パラフィンに埋包
し、切片（５μｍ切片）にし、スライド上に乗せて、そしてヘマトキシリンおよ
びコシン（ｃｏｓｉｎ）（ＨＥ）を用いて染色した。

【０１６６】 （サイトカイン）マウス（ｍｕ）組換え（ｒ）キットリガンド（ｈｉｓＫＬ）
の精製した調製物は、Ｒ．Ｍａｉｌｈａｍｍｅｒ博士（ＧＳＦ−Ｆｏｒｓｃｈｕ
ｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により快く提供された
。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現され、アフィニティークロマトグラフィーによ
って記載されるように精製されていた。マウス組換えインターロイキン３（ＩＬ
−３）を、マウスＩＬ−３遺伝子を保有するレトロウイルスベクターでトランス
フェクトされたＸ６３Ａｇ８−６５３骨髄腫細胞によって産生した。サイトカイ
ン依存性指標細胞株での短期の増殖アッセイにおいて、１％（ｖ／ｖ）Ｘ６３Ａ
ｇ８−６５３上清の最終濃度は、Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ（Ｈｅｉ
ｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られた１０ｎｇ/ｍｌの精製されたｍ
ｕ ＩＬ−３の効果と等価であった。マウス組換えＧＭ−ＣＳＦは、Ｉｍｍｕｎ
ｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）からの快い贈呈であった。ヒトｒ ＩＬ
−６を、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。

【０１６７】 （ＧＭ−ＣＦＵの定量）マウス由来の個々の脾細胞のサンプルを、以前に記載
されたように、ソフトアガーコロニーアッセイによって、ＧＭ−ＣＦＵについて
分析した。Ｓｔａｂｅｒ，ＦＧら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８：７９〜８
２。簡潔には、所望の数の脾細胞（最終濃度は、通常１ｍｌ当たり３×１０⁵〜
１×１０⁶）を、アガー培地混合物に添加し、そして１ｍｌを、三連において３
５ｍｍ直径培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｎｅｕｒｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）に添加した。細胞のプレーティングの前に、飽和量の予め試験したカクテ
ルの骨髄腫細胞増殖促進性サイトカイン（ｍｕ ｒ ｈｉｓＫＬ、ｍｕ ｒ Ｉ
Ｌ−３およびｒ ＧＭ−ＣＳＦ（それぞれ、５０μｌ／プレートを含む））を、
５００ｎｇ／ｍｌ ｈｉｓＫＬ、５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−３、および２５ｎｇ／ｍ
ｌ ＧＭ−ＣＳＦの最終濃度に対応するプレートに添加した。４℃でのアガー培
地のゲル化の後に、この培養物を、空気中において１０％ ＣＯ₂の充分に加湿
した雰囲気下で、３７℃で７日間インキュベートした。少なくとも５０の細胞を
含む細胞凝集物を、コロニーとしてスコア付けした。

【０１６８】 （ＢＦＵ−Ｅアッセイ）市販されている（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ Ｖｅｒｔｒｉｅｂ ＧｍｇＨ、Ｒｅｍａｇｅｎ、Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）培養培地組成物（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ^TMＨＣＣ−３３４０）を使用し
た（これは、α改変イーグル培地中に０．９％メチルセルロースを含んだ）。３
０％ウシ胎仔血清１％ＢＳＡ、１０^-4Ｍ ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ
Ｌ−グルタミンおよび３単位／ｍｌのｒヒト（ｈｕ）エリスロポエチン。この培
地（２．７ｍｌ／チューブ）に、０．３ｍｌの細胞懸濁液（１３．２×１０⁵／
ｍｌの脾細胞を含む）を添加した。この培養培地にさらに、１００μｌ ｍｕ
ｒ ｈｉｓＫＬ（ストック：１０μｇ／ｍｌ）、１００μｌ ｍｕ ｒ ＩＬ−
３（ストック：１μｇ／ｍｌ）、および１００μｌ ｈｕ ｒ ＩＬ−６（スト
ック：１００ｎｇ／ｍｌ）を補充し、そして１．４×４０ｍ針をはめ込んだシリ
ンジを用いて注意深く混合した。これは、３μｇ／ｍｌ ｈｉｓＫＬ、３ｎｇ／
ｍｌ ｍｕ ｒ ＩＬ−３、３ｎｇ／ｍｌ ｈｕ ｒ ＩＬ−６および４×１０ ⁵ ／ｍｌ脾細胞の最終濃度を生じ、これを、ペトリ皿（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｎｅｕ
ｒｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）当たり１ｍｌの三連のアリコートにおいてプ
レートした。赤血球系（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）コロニー（＜５０ヘモグロビン含
有細胞）の増殖を、空気中において１０％ ＣＯ₂を含む充分に加湿した雰囲気
下で、３７℃で９日間インキュベートした後にスコア付けした。

【０１６９】 （１１日目 ＣＦＵ−アッセイ）脾臓コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｓ）を、Ｔ
ｉｌｌおよびＭｃＣｕｌｌｏｃｈの肉眼での脾臓コロニーアッセイによって測定
した。１２週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／マウスを、８Ｇｙ（¹³⁷Ｃｓ）（内因的な肉
眼での脾臓コロニーの形成を全く生じないことが見出されている、潜在的な致死
用量）で放射線照射した。１〜４時間以内に、放射線照射したマウスを、ジエチ
ルエーテルで麻酔し、そして眼窩後方の叢に、個々の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウス
由来（それぞれ、ＣｐＧ−ＯＤＮまたはビヒクルで処理した５匹のマウス群）ま
たは１０ｎｍｏｌ／マウスＣｐＧ−ＯＤＮでの腹腔内処置の６日後に屠殺したマ
ウス由来の２．５×１０⁵脾細胞／２００μｌ／マウスを注射した。各々のドナ
ー脾臓懸濁液を、５匹の放射線照射したマウスに注射した。移植の１１日後に、
レシピエントマウスを殺傷し、そしてそれらの脾臓を切り出し、そしてＢｏｕｉ
ｎ固定に置き、肉眼で見える脾臓コロニーの数を決定した。

【０１７０】 （フローサイトメトリー）細胞（５×１０⁵〜１０⁶）を、２％ ＦＣＳを含む
ＰＢＳ中で洗浄し、そしてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）からの抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ抗体とともに４℃で１０分間インキュベー
トして、以下の抗体試薬の非特異的結合をブロックした。Ｂ２２０に対するｍＡ
ｂを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（５〜２０μｇ ｍｌで使用された）。
ＣＤ３ Ｍａｃ−１およびＧＲ−１、ＦＩＴＣおよびＰＥ標識抗体を、Ｐｈａｒ
Ｍｉｎｇｅｎ（Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。アイソタイプ
コントロールは、精製ラットＩｇＧ２ａ、精製ラットＩｇＧ２ｂ、および精製ハ
ムスターＩｇＧ（全てＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含んだ。全てのインキュベーシ
ョン工程（３０分、４℃）の間に、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳを用いて洗浄した。Ｆ
ＡＣＳ分析を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメーター（Ｋｒ
ｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行し、１０，０００事象を得た。ＦＡＣＳデ
ータを、ＷｉｎＭＤＩ ２．６ ＦＡＣＳソフトウェアを使用して分析した。

【０１７１】 （結果） （ＣｐＧ−ＯＤＮは一過性の巨脾腫症を引き起こす）ＯＤＮでｉ．ｐ．チャレ
ンジされたマウスは、劇的な巨脾腫症を提示する（図１）。動力学的に、脾臓重
量は、６日目のピークまで増加し、続いて正常化する。表８の（ａ）列に詳説さ
れるように、ＣＰＧ ＯＤＮ（ＣＧ１またはＣＧ２）の注射は、巨脾腫症を有意
に誘導したが、コントロールであるＣｐＧ ＯＤＮ注射されていない動物の脾臓
は、偽の注射をされた動物と有意には異ならなかった。このように、マウス巨脾
腫症は、ＣｐＧモチーフ依存性様式で誘導され、そして注射の６日後にピークに
なった。

【０１７２】 図１は、ＣｐＧ−ＯＤＮにより誘導されて増加した脾臓重量の動力学を示す。
ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１）に、０日目に１回ｉ．ｐ．注射した（１０ｎｍｏｌ／
マウス）。脾臓を、０、４、６および１２日目に取り出し、隣接する組織を刈り
取り、そして秤量した。器官重量を、脾臓重量（ｍｇ）／全体重（ｇ）として提
示する（１グループにつき５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの平均値±ＳＤ）。

【０１７３】 ＣｐＧ ＯＤＮは、チャレンジ後１〜３日の間に最大であるＢ細胞増殖を誘導
することが示されている。ＭｃＩｎｔｙｒｅ，ＫＷら（１９９３）Ａｎｔｉｓｅ
ｎｓｅ Ｒｅｓ Ｄｅｖ ３：３０９〜３２２；Ｂｒａｎｄａ，ＲＦら（１９９
３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４５：２０３７〜２０４３。従って
、本発明者らは、観察された巨脾腫症がＣｐＧ ＯＤＮ誘導性Ｂ細胞分裂促進性
（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）に起因したのか否かという問題に取り組んだ。Ｆ
ＡＣＳ分析による脾臓細胞の細胞表面の表現型決定により、Ｂ２２０陽性細胞（
Ｂ細胞マーカーとして使用した）の絶対的頻度がほんのわずかにしか増加されな
いことが明らかになった（図２）。しかし、観察された最も劇的な効果は、Ｂ２
２０−ＣＤ３二重陰性区画における、６日目の一過性だが有意な増加であった、
組織学的には、増加した数の大きな未成熟芽球および赤芽球が検出され、６日目
に最大であった。このことは、増大した造血活性を示唆する。

【０１７４】 図２は、ＣｐＧ−ＯＤＮでの刺激後の、脾臓細胞の表現型の変化を示す。Ｃｐ
Ｇ−ＯＤＮ（ＣＧ１）は、０日目に１回ｉ．ｐ．注射された（１０ｎｍｏｌ／マ
ウス）。脾臓を示した時点で取り出し、そしてＢ２２０／ＣＤ３およびＧＲ−１
／Ｍａｃ−１についてＦＡＣＳ染色した（二重染色）。絶対的な細胞数の増加を
、０日目のコントロール脾臓細胞に対する率として表す（３個体のＣ５７ＢＬ／
６マウスの平均値）。

【０１７５】 （巨脾腫瘍は細胞外造血に関連する）ヒトと対照的に、マウスは、脾臓におけ
る基底造血活性を提示する。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＪら（１９９５）Ａｎｎｕ
Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １１：３５〜７１。ＣｐＧ−ＯＤＮが増
大した脾臓造血活性と相関する巨脾腫瘍を誘導したか否かを分析するために、本
発明者らは、ＣｐＧ ＯＤＮ処置したマウスの脾臓における顆粒球−マクロファ
ージ前駆細胞（ＧＭ−ＣＦＵ）の数を測定した。６日目に脾臓ＧＭ−ＣＦＵの数
において７．４倍の増加が存在した。これは、全脾臓細胞数の動力学を反映して
いる（図３（Ａ）、３（Ｂ））。本発明者らはまた、処置されたマウス由来の骨
髄におけるＧＭ−ＣＦＵの誘導を分析した。６日目の脾臓での増加に先行する骨
髄におけるＧＭ−ＣＦＵの数のわずかな増加が存在した（４日目）。これは、あ
たかも脾臓への骨髄由来の前駆体細胞の移動が生じたかのようである（図３（Ｃ
））。さらに、本発明者らは、免疫磁気的（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ）分
離により、ＣｐＧ処置マウスまたはＣｐＧ非処置マウスの６日目の脾臓からＢ２
２０／ＣＤ３二重陰性細胞画分を濃縮し、そしてＧＭ−ＣＦＵ形成について試験
した。これらの細胞は、骨髄性前駆体細胞について非常に濃縮されたことが示さ
れた（図３（Ｄ））。このように、ＣｐＧ−ＯＤＮ注射後６日目の非Ｂ非Ｔ細胞
画分の劇的な増加は、脾臓内の増加したＧＭ−ＣＦＵの数により達成された。

【０１７６】 図３は、脾臓の細胞数、脾臓およびＢＭのＧＭ−ＣＦＵの数におけるＣｐＧ−
ＯＤＮ誘導性の変化を示す。Ａ：脾臓細胞計数におけるＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１
）誘導性の変化の動力学（１時点あたりの、３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの平均
値±ＳＤ）。Ｂ：ＣｐＧ−ＯＤＮ処置マウスの脾臓における造血前駆体細胞の評
価。グラフは、時点あたりの脾臓あたりのＧＭ−ＣＦＵの数を示す（３匹のマウ
スの３通りの脾臓細胞培養の平均値±ＳＥＭ）。Ｃ：１時点あたりの、３匹のマ
ウスからプールされた骨髄細胞におけるＧＭ−ＣＦＵの頻度。Ｄ：Ｂ２２０／Ｃ
Ｄ３二重陰性脾臓細胞画分におけるＧＭ−ＣＦＵの増加した数。４匹の非処置Ｃ
５７ＢＬ／６マウスおよび３匹のＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１）注射されたマウス由
来の脾臓細胞（±ＳＥＭ）を、ｉ．ｐ．注射の６日目にプールした。これらの細
胞の一部は、Ｂ２２０＋細胞、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を枯渇させ、そ
して非枯渇脾臓細胞および枯渇（ｄ）脾臓細胞の両方を、軟寒天コロニーアッセ
イによりＧＭ−ＣＦＵについて分析した。

【０１７７】 脾臓造血の誘導はＣｐＧ−ＤＯＮ用量および配列依存性であった（図４、また
、図３Ｄ、表１ｂおよび１ｃも参照のこと）。「ＣｐＧモチーフ」を欠く配列（
ｎＣＧ）は、骨髄外造血を誘導せず、そしてＣＧ逆位（ＧＣ−ＯＤＮ）は、ＯＤ
Ｎ ＣＧ１の造血効果をほとんど完全に廃止した。ＣｐＧ ＯＤＮの１回の注射
もまた、ＬＰＳにより誘発される証明された造血活性に十分匹敵した（図４）。
Ａｐｔｅ，ＲＮら（１９７６）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７１〜７８；Ａ
ｐｔｅ，ＲＮ ら（１９７６）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ４：１０〜１８；Ｓｔ
ａｂｅｒ，ＦＧら（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
７７：４３２２〜４３２５。顆粒球−マクロファージ前駆体に加えて、ＣｐＧ
ＯＤＮ注射後の純粋な赤血球前駆体の数もまた、脾臓あたりのバースト形成単
位（ＢＦＵ−Ｅ）の数により決定されたように増加した（図５）。１２日間にわ
たる末梢血の分析により、２〜４日目の一過性の白血球増加を除けば、有意な変
化がないことが明らかになった。このように、ｓｓＤＮＡを注射されたマウスに
おいて観察された一過性の巨脾腫症は、ＣｐＧモチーフ依存性であり、かつ骨髄
外造血に関連した。

【０１７８】 図４は、ＣｐＧ−ＯＤＮの用量力価決定を示す。３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに
、異なる濃度（１ｎｍｏｌ／マウス、１０ｎｍｏｌ／マウスおよび５０ｎｍｏｌ
／マウス、灰色の棒線）のＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１）か、または陰性コントロー
ルとして供したＬＰＳ（１０μｇ／マウス、黒色の棒線）、溶媒（注射可能に処
方した水溶液、白色の棒線）およびＧＣ−ＯＤＮ（濃い灰色の棒線）を、注射し
た。ＣｐＧ−ＯＤＮにより誘導された脾臓細胞およびＧＭ−ＣＦＵの脾臓あたり
の増加した数（平均値±ＳＥＭ）を、注射後６日目に測定した。

【０１７９】 図５は、ＣｐＧ−ＯＤＮにより誘導したＢＦＵ−Ｅの増加した数を示す。ＯＤ
Ｎ ＣＧ１（黒色の棒線）かまたは溶媒コントロール（注射可能に処方した水溶
液、白色の棒線）で処置されたマウスの脾臓細胞を、注射後６日目にメチルセル
ロースベースのコロニーアッセイにプレーティングし、そしてインビトロで９日
のインキュベート期間の後、ヘモグロビン含有赤血球コロニーの増殖について計
数した（５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの平均値±ＳＥＭ）。

【０１８０】 （脾臓前駆体細胞の増加した数は、脾臓コロニー形成単位アッセイ（ＣＦＵ−
Ｓ）により測定可能である）。脾臓コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｓ）細胞は、脾
臓中に存在し得、そして骨髄を切除した宿主への養子移入（ａｄｏｐｔｉｖｅ
ｔｒａｎｓｆｅｒ）１１日の肉眼で見える小節を形成し得る。図６に示すように
、有意に増大した数のＣＦＵ−Ｓを、ＣｐＧ−ＯＤＮで前処理したマウスから採
取した脾臓細胞において検出した。ＣＦＵ−Ｓは、始原造血幹細胞の多くの特徴
（例えば、広範な増殖能力、自己再生の能力および致死量の照射から動物を救い
得る複数の造血系列の細胞を含む脾臓コロニーを生成する能力）を示す。Ｓｐａ
ｎｇｒｕｄｅ，ＧＪら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５８〜６２。この
データを考慮して、ＣｐＧ−ＯＤＮ処置マウスの脾臓において含まれる、ＣＦＵ
−Ｓの養子移入による致死量を照射されたマウスの再構成を調べる実験を設計し
た。

【０１８１】 図６は、正常な脾臓細胞対ＣｐＧ−ＯＤＮ誘導された脾臓細胞の脾臓コロニー
形成単位の決定を示す（ＣＦＵ−Ｓアッセイ）。ＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１）で誘
導された脾臓の造血は、致死量で照射されたマウスへの注射後に、増加した数の
肉眼で見えるコロニーをもたらす。グラフは、致死量照射後の非処置マウス（灰
色の棒線）の脾臓あたりの肉眼で見える小節の数を示し、これは、２．５×１０ ⁵ の正常な脾臓細胞の注射後の致死量照射マウス（白色棒線）およびＯＤＮで前
処置したマウス由来の脾臓細胞を注射した照射マウス（ＯＤＮ ＣＧ１の後６日
、黒色棒線）と比較したものである（３〜５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用し
た５つの独立した実験の脾臓あたりの平均値±ＳＥＭ）。

【０１８２】 （ＣｐＧ−ＯＤＮは、骨髄抑制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）におけ
る放射能防御効果を媒介する）。造血前駆体細胞は、むしろ放射能耐性であると
考えられている。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＪら（１９９５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃ
ｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １１：３５〜７１。ＣｐＧ−ＤＯＮは、脾臓へのＣ
ＦＵ−Ｓの移動を介して骨髄外造血を誘導するので、本発明者らは、ＣｐＧ−Ｏ
ＤＮが致死量以下で照射されたマウスにおける放射能防御効果を媒介し得るか否
かを分析した。致死量以下で照射されたマウス（４Ｇｙ）のＣｐＧチャレンジは
、１４日以内に、脾臓のＧＭ−ＣＦＵの４倍の増加をもたらした（図７Ａ）。次
いで、本発明者らは、致死量以下で照射されたマウスにおけるＣｐＧ−ＯＤＮで
駆動された造血が、免疫系の促進された回復を可能にするか否かという問いに取
り組んだ。２つの実験系を選択した：１つは、タンパク質様抗原に対するＣＴＬ
応答の誘導（Ｌｉｐｆｏｒｄ，ＧＢら（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
２７：２３４０〜２３４４）であり、２つ目は、細胞内病原であるＬｉｓｔｅ
ｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対する耐性である（Ｅｎｄｒｅｓ，Ｒら
（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：４１９〜４３２）。マウスを、致死量以下
の照射（４Ｇｙ）後３０分以内にＣｐＧ−ＯＤＮで処置し、１８日間回復させ、
その後、アジュバントとしてリポソームおよびＱｕｉｌ Ａを含むオボアルブミ
ン（ＯＶＡ）で皮下（ｓ．ｃ）免疫した。４日後、排出しているリンパ節の細胞
を、収集し、さらに４日間培養し、そしてＯＶＡ特異的ＣＴＬ活性についてアッ
セイした。図７Ｂに詳細なように、ＣｐＧ−ＯＤＮで処置した照射マウス由来の
リンパ球は、非処置の照射マウスと比較して増強したＣＴＬ応答を提示した。基
本的に同様の結果を、Ｌ．Ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染を使用する感染モデ
ルにおいて１４日目に得た。図７に示したデータ全体が、ＣｐＧ−ＯＤＮ誘導性
骨髄外造血と、細菌感染に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答をマウントする能力また
は免疫応答を防御する能力との間の相関関係を示す。ＣｐＧ−ＯＤＮは、造血前
駆体細胞からの再生を促進することにより、リンパ−造血系の照射誘導性損傷を
補償する。

【０１８３】 図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、ＯＤＮ注射後のＣＭ−ＣＦＵの増加した数および
増強したＣＴＬ応答機能が、致死量以下で照射されたマウスにおける致死性のリ
ステリア症に対する増強した応答と相関することを示す。Ａ：致死量以下での照
射（４Ｇｙ）およびＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１）の注射後１４日目の、１００万個
の細胞あたりのＧＭ−ＣＦＵの増加した数（左のパネル）および脾臓あたりのＧ
Ｍ−ＣＦＵ（右のパネル）。１グループあたり３匹のマウスの脾臓のＧＭ−ＣＦ
Ｕの数（±ＳＥＭ）（ＯＤＮ注射あり（＋）およびＯＤＮ注射なし（−））を、
照射をしていない正常なマウスと比較した。Ｂ：ＯＤＮ ＣＧ１をアジュバント
として使用したＯＶＡ特異的１次ＣＴＬ応答。致死量以下での照射後１８日目に
免疫した、ＯＤＮ処置マウスのＣＴＬ機能（四角）と偽もの処置マウスのＣＴＬ
機能（円）を比較した。標的細胞は、ＥＬ４細胞（点線）かまたはＳＩＩＮＦＥ
ＫＬペプチドでパルスしたＥＬ４細胞（実線）であり、そして特異的溶菌を⁵¹Ｃ
ｒ放出より測定した（１グループあたり３匹のマウスの平均値±ＳＤ）。Ｃ：照
射のみ（白色三角）と比較した、ＣＧ１で処置した（黒色円）致死量以下で照射
したマウスにおけるリステリア感染に対する増加した耐性。マウスを、照射後１
４日目に５×１０⁵のリステリアに感染させ、そして生存を３０日間記録した。

【０１８４】 この実施例において、ＣｐＧ−ＯＤＮにより誘導される骨髄外造血を記載し、
そして特徴付ける。ＣｐＧ−ＯＤＮでチャレンジしたマウスは、６日目にピーク
となる一過性の巨脾腫症を発症する。これは、Ｂ２２０／ＣＤｓ二重陰性細胞の
増加した脾臓頻度と関連する。このサブセットにおいて、造血前駆体細胞を、Ｇ
Ｍ−ＣＦＵおよびＢＦＵのインビトロアッセイにより検出した。ＣｐＧ−ＯＤＮ
は、脾臓への増強されたＣＦＵ輸送を介して造血再生を改善することにより、照
射誘導性骨髄抑制（ｍｙｃｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）の期間を短くする。結
果として、細胞傷害性Ｔ細胞応答の回復および細菌感染に対する耐性が、致死量
以下での照射後のより早い時間に発生した。

【０１８５】 細菌性ＤＮＡおよびＣｐＧ−ＯＤＮは、Ｂ細胞をポリクローナル性に活性化し
、ＡＰＣ（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）を刺激する。Ｋｒｉｅｇ，
ＡＭら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；Ｓｐａｒｗａｓｓ
ｅｒ，Ｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８６：３３６〜３３７；Ｓｐａｒｗａ
ｓｓｅｒ，Ｔら（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：１６７１〜１
６７９；Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，Ｔら（１９９８）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ
２８：２０４５〜２０５４；Ｓｔａｃｅｙ，ＫＪら（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ １５７：２１１６〜２１２２；Ｌｉｐｆｏｒｄ，ＧＢら（１９９７）Ｅ
ｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：３４２０〜３４２６。ＣｐＧ−ＯＤＮは、Ｄ
Ｃおよびマクロファージをインビトロで活性化して、造血的に活性な多量のサイ
トカイン（ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αを含
む）を分泌させる。Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，Ｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３
８６：３３６〜３３７；Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，Ｔら（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：１６７１〜１６７９；Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，Ｔら（１
９９８）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：２０４５〜２０５４；Ｌｉｐｆｏ
ｒｄ，ＧＢら（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：３４２０〜３４
２６；Ｈａｌｐｅｎ，ＭＤら（１９９６）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６７：
７２〜７８；Ｃｈａｃｅ，ＪＨら（１９９７）Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍ
ｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ ８４：１８５〜１９３；Ｒｏｍａｎ，Ｍら（１９９７）
Ｎａｔ Ｍｅｄ ３：８４９〜８５４ ３１〜３３。ＣｐＧ−ＯＤＮでチャレン
ジしたマウスもまた、高血清濃度のこれらのサイトカインを一過性に示す。Ｓｐ
ａｒｗａｓｓｅｒ，Ｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８６：３３６〜３３７；
Ｌｉｐｆｏｒｄ，ＧＢら（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：３４
２０〜３４２６。今日まで、これらのうちのどれが、骨髄外造血を誘発するかは
不明である。ＣｐＧ−ＯＤＮが、骨髄間質細胞を標的して造血的に活性なサイト
カインを放出させることは可能である。

【０１８６】 最初に、本発明者らは、この観察された巨脾腫症が、ＣｐＧ−ＯＤＮ誘導性Ｂ
細胞の分裂促進性を反映したと予期した。なぜなら、ほとんどの参考文献が、Ｃ
ｐＧ誘導性巨脾腫症をＢ細胞に帰因させているからである。Ｋｒｉｅｇ，ＡＭら
（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６〜５４９；ＭｃＩｎｔｙｒｅ，ＫＷ
ら（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ Ｄｅｖ ３：３０９〜３２２；Ｂ
ｒａｎｄａ，ＲＦら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４５：
２０３７〜２０４３。しかし、Ｂ２２０⁺細胞を増殖することが、脾臓の細胞充
実性における相対的増加の原因であるのは、ＣｐＧ−ＯＤＮチャレンジ後のほん
の１〜４日間だけである（図２）。非Ｂ、非Ｔ細胞が巨脾腫症に関与するという
結論を支持して、脾臓の拡大が、ＢおよびＴ細胞を欠くＳＣＩＤマウスにおいて
も観察された。ＣｐＧ−ＯＤＮチャレンジの６日後、Ｂ２２０^-／ＣＤ３^-脾臓細
胞は優勢であり（図２）、そして組織学によって、骨髄外造血の指標である、豊
富で大きな未成熟芽球が明らかとなった。ＧＭ−ＣＦＵインビトロアッセイにお
いて、増加した造血活性は、Ｂ２２０^-／ＣＤ３^-集団に対して規定され得る。イ
ンビトロコロニーアッセイ（図４、５、６、表８）によって、顆粒球、マクロフ
ァージおよび初期赤血球前駆体細胞の脾臓での数の大量の増加が示された。しか
し、マウスの末梢血において、白血球溶解ならびに赤血球および血小板の数のわ
ずかな減少が観察された点で、変化は異なる。ヒトと異なり、マウスの脾臓は、
造血活性の大部分の原因である。

【０１８７】 細菌性の刺激（熱殺傷したミコバクテリアを含むＬＰＳまたは完全フロイント
アジュバント）は、おそらく、戦場細菌感染で必要な血液細胞の生成および援動
を刺激する造血増殖因子（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ＳＪら（１９９５）Ａｎｎｕ Ｒ
ｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １１：３５７１に総説される）に由来する
マクロファージを介して、脾臓の造血の増加を誘発し得る（Ａｐｔｅ，ＲＮら（
１９７６）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７１〜７８；Ｓｔａｂｅｒ，ＦＧら
（１９８０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４３２２
〜４３２５；ＭｃＮｅｉｌｌ，ＴＡ（１９７０）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８：
６１〜７２）。ここで、本発明者らは、細菌性ＤＮＡの免疫刺激効果を模倣す
ることが公知であるＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｋｒｉｅｇ，ＡＭら（１９９５）Ｎａｔｕ
ｒｅ ３７４： ５４６−５４９）が、造血を増強する能力を提示したことを示
す。さらに、ＣｐＧ−ＯＤＮは、致死量以下の照射によって生じるような骨髄抑
制（ｍｙｅｌｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）から造血再生を増強することを示した
。例えば、照射しそしてＣｐＧ−ＯＤＮ処置したマウスは、脾臓ＧＭ−ＣＦＵの
数の増加を示し、抗原特異的ＣＴＬ応答を増大し、そしてＬｉｓｔｅｒｉａ ｍ
ｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染に対する耐性の増大を提示した（図７Ａ、７Ｂお
よび７Ｃ）。ＣｐＧ−ＯＤＮの注射の２週間後の脾臓ＧＭ−ＣＦＵの数の増大は
、骨髄抑制化マウスにおける増強した免疫系回復と相関した。造血抑制および引
き続く潜在的に致死的な日和見感染に対する感受性は、化学療法、放射線療法ま
たは偶発的な放射線曝露後の現象を十分に実証する。骨髄抑制の安価な緩和は、
大いに臨床的価値がある。本発明者らのデータは、ＣｐＧ−ＯＤＮが、免疫系の
促進された再構成において生じる造血の増強を介して放射線誘導性の骨髄抑制を
緩和し得ることを示す。

【０１８８】

【表２】 表８は、ＣｐＧ−ＯＤＮの注射後のＧＭ−ＣＦＵの脾臓重量および数の増加を
示す。ａ）ＣｐＧ−ＯＤＮによって誘導される脾臓重量の増加。ＣｐＧ−ＯＤＮ
（ＣＧ１、ＣＧ２）は、マウスにおいて有意な巨脾腫症（１群あたり３匹のＣ５
７ＢＬ／６マウスの平均値±ＳＤ、ｔ検定：ｐ≦０．０５）を誘導したが、一方
、非ＣｐＧ ＯＤＮ（ｎＣＧ）は誘導しなかった。ＣＧジヌクレオチド（ＧＣ−
ＯＤＮ）の転位は、ＧＣ１の効果をほぼ完全に無効にする。ＯＤＮ処置したマウ
ス（１０ｎｍｏｌ／マウス）と偽処置したマウス（注射用の水での注射）との間
の比較。ｂ）脾臓あたりのＧＭ−ＣＦＵの数（１群あたり３匹のＣ５７ＢＬ／６
マウスの３連の値の平均値±ＳＥＭ）。ｃ）１００万個の細胞あたりのＧＭ−Ｃ
ＦＵの数（１群あたり３匹のマウスの３連の値の平均値±ＳＥＭ）。

【０１８９】 （実施例２：５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対するＣｐＧ−ＯＤＮ誘導
された血液および細胞の耐性） ２つの群のＢＡＬＢ／ｃマウス（１０週齢の各９匹のマウス）を、０日目に、
２００μｌの滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１５０ｍｇ／ｋｇの５
−ＦＵで腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。第３の群のＢＡＬＢ／ｃマウス（１０週
齢の９匹のマウス）に、０日目に、２００μｌの滅菌ＰＢＳのみをｉ．ｐ．注射
した。２４時間後、５−ＦＵ処置したマウスの一方の群に、２００μｌの滅菌Ｐ
ＢＳ中の３ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＧＣＩ）を投与した；他方の５−ＦＵ
処置群およびＰＢＳ処置群は、ＰＢＳのみを受けた。これによって、３つの実験
群を生じた：偽処置群（Ｍｏｃｋ）、５−ＦＵ処置群（５−ＦＵ）、および５−
ＦＵとＣｐＧ−ＯＤＮとの組合せ処置群（５−ＦＵ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ）。５−Ｆ
Ｕ処置の４、７および１０日後、各群から３匹のマウスを屠殺し、そしてアッセ
イを、化学療法処置に対する免疫耐性を評価するために実施した。

【０１９０】 １．脾臓重量および脾臓細胞の計数。０、４、および１０日目に取り出した脾
臓から脂肪および隣接する組織を切り取り、次いで秤量した。次いで、これらを
細かく切り刻み、そして細胞計数のために分散させた。赤血球を、ＮＨ₄Ｃｌ溶
解によって除去し、その後細胞を計数した。図８において示されるように、５−
ＦＵおよびＣｐＧ−ＯＤＮで処置した動物由来の脾臓を、５−ＦＵのみを受ける
動物由来の脾臓を計数するよりも、５−ＦＵ処置後４日目および１０日目にさら
に秤量した。そして脾臓細胞計数は、５−ＦＵのみを受ける動物においてよりも
、組合せ処置を受ける動物において、より高くかつ正常に近い傾向にあった。

【０１９１】 ２．ＣｐＧ−ＯＤＮを伴う、およびＣｐＧ−ＯＤＮを伴わない５−ＦＵ後の示
差的な脾臓リンパ球の計数。脾臓リンパ球（５×１０⁵〜ｌ×１０⁶）を、２％ウ
シ胎仔血清を含むＰＢＳ中で洗浄し、そして抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ抗体と共に
４℃で１０分間インキュベートして、ＦＩＴＣ標識化抗Ｂ２２０またはＦＩＴＣ
標識化抗ＣＤ３の非特異的結合をブロックした。細胞を、１：１のＰＢＳ／ＦＣ
Ｓを用いて３０分間のインキュベーション工程の間に洗浄した。ＦＡＣＳ分析を
、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメーターを使用して実施し、
データ点あたり１０，０００の事象を獲得した。図９において示されるように、
Ｔ細胞は、５−ＦＵのみで処置した動物において４日目に減少し、そして７日目
に正常に回復した。５−ＦＵおよびＣｐＧ−ＯＤＮを受ける動物は、４日目に正
常な脾臓Ｔ細胞計数を有し、そして７日目および１０日目においてコントロール
脾臓Ｔ細胞計数よりも高い傾向を有した。図１０は、脾臓Ｂ細胞計数は、４日目
におけるコントロールと比較して、５−ＦＵ群および５−ＦＵ＋ＯＤＮ群の両方
において実際に低下した。しかし、５−ＦＵおよびＣｐＧ−ＯＤＮを受ける動物
は、７日に正常な脾臓Ｂ細胞計数に回復し、一方、５−ＦＵのみを受ける動物は
、１０日から、コントロールよりもより低い脾臓Ｂ細胞計数を有し続ける。

【０１９２】 ３．末梢白血球数（ＷＢＣ）。示差的な血液細胞分析を、マウス細胞について
プログラム化された自動化血球計によって、０、４、７、および１０日目におい
て実施した。図１１において示されるように、５−ＦＵ処置の４日後、ＷＢＣは
、偽処置した動物においてよりも、５−ＦＵを受ける全ての動物において有意に
より低かった。しかし、５−ＦＵおよびＣｐＧ−ＯＤＮを受ける動物は、５−Ｆ
Ｕのみで処置した動物よりも、４日目を含む各日において、より高いＷＢＣを有
した。

【０１９３】 ４．末梢赤血球数（ＲＢＣ）。５−ＦＵおよびＣｐＧ−ＯＤＮで処置したマウ
スは、全ての時点で正常な赤血球数を維持するが、一方、５−ＦＵのみを受ける
動物は、コントロールと比較して１０日に至る間ＲＢＣにおいて有意な低下を示
した。図１２を参照のこと。

【０１９４】 ５．血小板数。５−ＦＵおよびＯＤＮを受ける動物における血小板数の低下は
、５−ＦＵのみで処置したマウスにおいて同様に作用しなかった（図１３を参照
のこと）。７日目および１０日目まで連続して、血小板数は、５−ＦＵ群および
５−ＦＵ＋ＯＤＮ群の両方において、コントロール以上に反跳して回復した。

【０１９５】 ６．５−ＦＵに対する細胞傷害性Ｔリンパ球の機能的耐性。１０週齢の、２つ
の群のＣ５７ＢＬ／６マウスを、０日目に、２００μｌの滅菌ＰＢＳ中の１５０
ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵで静脈内注射した；同様のマウスのコントロール群は、２
００μｌの滅菌ＰＢＳのみを受けた。２４時間後、５−ＦＵ処置群の一方のマウ
スに、１００μｌの滅菌ＰＢＳ中の３ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１）を
皮下的に投与した；他方の５−ＦＵ処置群およびＰＢＳ処置群は、ＰＢＳのみを
受けた。これによって、３つの実験群を生じた：偽処置群（コントロール）、５
−ＦＵ処置群（５−ＦＵ）、および５−ＦＵおよびＣｐＧ−ＯＤＮでの組合せ処
置群（５−ＦＵ ＋ＯＤＮ）。５−ＦＵ処置の１０日後、各群からのマウスに、
オボアルブミン（ＯＶＡ）の接種物を投与して、細胞傷害性Ｔ細胞の発生を誘導
した。１４日目（ＯＶＡ投与の４日後）に、マウスを屠殺し、そして⁵⁷Ｃｒ放出
ＣＴＬアッセイを標準的手順に従って実施した。Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓら（１９
９２）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６：９８３〜９９７。図１４に
おいて示されるように、５−ＦＵのみで処置したマウスからのＣＴＬ応答は、コ
ントロールと比較して、試験した標的細胞比に対してエフェクターの範囲全体に
わたって著明に抑制された。５−ＦＵおよびＣｐＧ−ＯＤＮを受けるマウスは、
比較により、５−ＦＵのみの群において観察されるよりもはるかに強力なＣＴＬ
応答を示した。従って、５−ＦＵを合わせることにおけるＣｐＧ−ＯＤＮの投与
の効果は、未処置動物において観察されるレベルに近いレベルで、そして５−Ｆ
Ｕのみで処置した動物において観察される明確に高いレベルで、有効なＣＴＬ応
答をマウントする能力を持続することである。

【０１９６】 （実施例３：造血の再構築） １．樹状細胞。２つの群のＣ５７ＢＬ／６マウスに、０日目に、２００μｌの
滅菌ＰＢＳ中の３ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（ＣＧ１）またはＰＢＳのみを投
与した。７日後、マウスを屠殺し、そして脾臓を実施例２のように分析のために
収集した。このようにして得られた脾臓を、コラゲナーゼを用いるさらなる処置
に供して、実施例２において得られるよりも、脾臓あたり、より高い脾細胞の総
数を生じた。次いで、脾細胞を計数し、そして等分した；各処置群からのアリコ
ートを、ＦＡＣＳ分析のために抗ＣＤ１１ｃおよび抗ＣＤ１１ｂを用いて染色し
て、常在性の脾性ＤＣの総数を定量した。図１５の左パネルにおいて示されるよ
うに、ＣｐＧ−ＯＤＮで処置した動物の脾臓におけるＣＤ１１ｃ／ＣＤ１１ｂの
二重陽性（ｄｏｕｂｌｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の脾臓の数は、コントロールより
も７倍増加した。７日目に収集した脾細胞のアリコート残りの部分を、ＤＣ増殖
に好都合であることが公知な増殖因子の存在下において、さらに７日間培養して
増殖させた。Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，Ｔら（１９９８）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ ２８：２０４５〜２０５４。次いで、培養において生存可能な細胞を計数
し、そして上記のようにＦＡＣＳによって分析して、培養において残存するＣＤ
１１ｃ／ＣＤ１１ｂの二重陽性細胞の集団（ＤＣ）を決定した。図１５の右パネ
ルにおいて示されるように、ＣｐＧ−ＯＤＮで処置し、そしてこれらの条件下で
増殖したマウス由来の脾細胞は、ＤＣについて高度に富化されていたが、一方、
偽注射したマウス由来の脾細胞は、ほとんど何も増殖しなかった（それぞれ、５
１×ｌ０⁶／脾臓 対 ０．６×ｌ０⁶／脾臓）。

【０１９７】 ２．抗体の抗原への誘導に対する造血の再構築の効果。４つの群のＣ５７ＢＬ
／６マウスを、２００μｌの滅菌ＰＢＳ中の３ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｃ
Ｇ１）で注射した；第５の群を、ＰＢＳのみで注射した。次いで、注射したマウ
スを、２１日間に及ぶ固定化スケジュールに従ってＯＶＡを用いて免疫し、Ｃｐ
Ｇ−ＯＤＮまたはＰＢＳ注射に関して種々の時間で開始した。免疫プロトコルは
１００μｇのＯＶＡの注射、続く１４日後のＯＶＡのブースター注射からなる。
さらなる７日間の休止後、血清サンプルを収集し、そしてＯＶＡコーティングし
たプレートおよび連続希釈液を使用して、ＩｇＧアイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡ
によって分析して、アッセイした各アイソタイプについての平均終点力価を決定
した。結果を図１６に示す。ここで、同じ日にＣｐＧ−ＯＤＮおよびＯＶＡに対
するこれらの最初の曝露を受ける動物を、０日目として示し、ＯＶＡに対するこ
れらの最初の曝露の３５日前にＣｐＧ−ＯＤＮを受ける動物を−３５日目と示し
た。ＯＶＡ免疫を受けたがＤＮＡを受けなかった動物を、コントロールとした。
０日目の群におけるＩｇＧ２ａ応答は、正常よりも３対数以上増強し、ＣｐＧ−
ＯＤＮ投与の３５日後程度長く示された抗原に対する残渣の増強したＩｇＧ２ａ
応答を有する。増強した応答および持続した応答がまた、ＩｇＧＩおよびＩｇＧ
２ｂについて明らかであった。

【０１９８】 ３．抗原に対するＣＴＬ応答の誘導に対する造血の再構築の効果。Ｃ５７ＢＬ
／６マウスの群に、２００μｌの滅菌ＰＢＳ中の３ｍｇ／ｋｇのＣｐＧ−ＯＤＮ
（ＣＧ１）を、またはＰＢＳのみを注射した。次いで、注射したマウスを、Ｃｐ
Ｇ−ＯＤＮ投与の後、種々の時点で１００μｇのＯＶＡで一回注射した。ＯＶＡ
特異的ＣＴＬアッセイを、先に記載の手順に従って、標的としてＯＶＡトランス
フェクト化ＥＬ４細胞を使用して、実施した。Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ，Ｔら（１
９９８）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：２０４５〜２０５４。図１７にお
いて示されるように、ＣＴＬ応答は、二相性パターンを示した：抗原およびＣｐ
Ｇ−ＯＤＮが同時に投与される場合に、最初の５０パーセントの特異的溶解後、
抗原がＣｐＧ−ＯＤＮの２４〜４８時間後に最初に遭遇される場合の応答、続い
て抗原がＣｐＧ−ＯＤＮの７日後に最初に遭遇される場合に生じる最大応答（６
５パーセントの特異的溶解）は、非常に鈍化する。次いで、ＣＴＬ応答は、７日
間を超えてのＤＮＡ注射と最初のＯＶＡ曝露の延長との間の間隔につれて、徐々
に減少するが、応答は、少なくとも３５日の間隔の間、コントロールよりも大き
いままである。これらの結果はまた、図１８において示される。これはまた、Ｃ
ｐＧ−ＤＮＡを受けない動物において、ＣＴＬ応答が本質的に存在しないことを
示す。

【０１９９】

【化４】 上記の詳細な説明は、当業者が本発明を実施し得るに十分であると考えられる
。本発明は、提供される実施例によって範囲を限定されるべきではない。なぜな
ら、本実施例は、本発明の１つの局面の１つの例示として意図されているからで
あり、他の機能的に等価な実施態様は本発明の範囲内にあるからである。本明細
書中に示されおよび記載される改変に加えて、種々の改変は、上記の明細書から
当業者に明確であり、そして添付の特許請求の範囲の範囲内にある。本発明の利
点および目的は、本発明の各実施態様によって包含される必要はない。

【０２００】 本出願中に引用される全ての文献、特許および特許出願は、本明細書において
、その全体が参考として援用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＣｐＧ−ＯＤＮによって誘導された脾臓重量の増加の速度論を示すグ
ラフである。

【図２】 図２は、ＣｐＧ−ＯＤＮによる刺激後の脾臓細胞の表現型の変化を示すグラフ
である。

【図３】 図３は、脾臓細胞数、脾臓ＧＭ−ＣＦＵ数およびＢＭ ＧＭ−ＣＦＵ数におけ
るＣｐＧ−ＯＤＮで誘導された変化を示すグラフである。

【図４】 図４は、ＣｐＧ−ＯＤＮの用量力価を示すグラフである。

【図５】 図５は、ＣｐＧ−ＯＤＮによって誘導されたＢＦＵ−Ｅ数の増加を示すグラフ
である。

【図６】 図６は、正常脾臓細胞対ＣｐＧ−ＯＤＮ誘導された脾臓細胞の、脾臓コロニー
形成単位の決定を示すグラフである（ＣＦＵ−Ｓアッセイ）。

【図７】 図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、ＯＤＮ注射が、致死下量照射したマウスにおける
致死性リステリア症に対する耐性の増加と相関する後の、ＣＭ−ＣＦＵ数の増加
およびＣＴＬ機能の増強を示すグラフである。

【図８】 図８は、ＣｐＧ−ＯＤＮの同時投与を伴うか、または伴なわない、マウスへの
５フルオロウラシル投与後５日目の、脾臓重量および脾臓細胞数を示すグラフの
対である。

【図９】 図９は、ＣｐＧ−ＯＤＮの同時投与を伴うか、または伴なわない、マウスへの
５フルオロウラシル投与後４日目、７日目および１０日目の、脾臓Ｔリンパ球数
を示すグラフである。

【図１０】 図１０は、ＣｐＧ−ＯＤＮの同時投与を伴うか、または伴なわない、マウスへ
の５フルオロウラシル投与後４日目、７日目および１０日目の、脾臓Ｂリンパ球
数を示すグラフである。

【図１１】 図１１は、ＣｐＧ−ＯＤＮの同時投与を伴うか、または伴なわない、マウスへ
の５フルオロウラシル投与後４日目、７日目および１０日目の、白血球数を示す
グラフである。

【図１２】 図１２は、ＣｐＧ−ＯＤＮの同時投与を伴うか、または伴なわない、マウスへ
の５フルオロウラシル投与後４日目、７日目および１０日目の、赤血球数を示す
グラフである。

【図１３】 図１３は、ＣｐＧ−ＯＤＮの同時投与を伴うか、または伴なわない、マウスへ
の５フルオロウラシル投与後４日目、７日目および１０日目の、血小板数を示す
グラフである。

【図１４】 図１４は、ＣｐＧ−ＯＤＮの同時投与を伴うか、または伴なわない、５フルオ
ロウラシル投与後１０日目の、特異的抗原（オボアルブミン、ＯＶＡ）に対する
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の誘導を示すグラフである。

【図１５】 図１５は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）によるコントロール処置と比較
した、マウスへのＣｐＧ−ＯＤＮ投与後７日目のより多い脾臓の樹状細胞集団を
示すグラフ（左）、およびＣｐＧ−ＯＤＮ後の培養物中の脾細胞由来の樹状細胞
のより大きな増殖を示すグラフ（右）の対である。

【図１６】 図１６は、ＰＢＳで前処置したマウスと比較した、ＣｐＧ−ＯＤＮで前処置し
たマウスにおける遅延した抗原曝露に対する応答における、増強および拡大され
た抗体の誘導を示すグラフである。

【図１７】 図１７は、ＰＢＳで前処置したマウスと比較した、ＣｐＧ−ＯＤＮで前処置し
たマウスにおける遅延した抗原曝露に対する応答における、ＣＴＬ誘導の速度論
プロフィールを示すグラフである。

【図１８】 図１８は、ＰＢＳで前処置したマウスと比較した、ＣｐＧ−ＯＤＮで前処置し
たマウスにおける遅延した抗原曝露に対する応答における、ＣＴＬ誘導の速度論
プロフィールを示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ワグナー， ハーマン ドイツ国 デ−81675 ミュンヘン， ト ラゲルシュトラーセ ９， インスティチ ュート オブ メディカル マイクロバイ オロジー イミュノロジー アンド ハイ ジーン内 (72)発明者 リップフォード， グレイソン ドイツ国 デ−81675 ミュンヘン， ト ラゲルシュトラーセ ９， インスティチ ュート オブ メディカル マイクロバイ オロジー イミュノロジー アンド ハイ ジーン内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA03 EA02 EA04 FA20 GA11 HA17 4C057 BB05 DD01 MM04 4C084 AA17 MA01 NA14 ZA511 ZA512 ZA551 ZA552 ZB091 ZB092 4C085 AA38 FF24 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA51 ZA55 ZA59 ZA81 ZA96 ZB09 ZB13 ZB26

Claims (65)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原特異的免疫応答を誘導するための方法であって、以下： 少なくとも以下の式を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを被験体に投与す
   る工程であって： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ ここで、該オリゴヌクレオチドは少なくとも８ヌクレオチドを含み、ＣおよびＧ
   は、メチル化されておらず、そしてＸ₁およびＸ₂はヌクレオチドである、工程、 該オリゴヌクレオチドが抗原特異的免疫応答を生じるために該被験体に投与さ
   れた少なくとも３日後に、該被験体を抗原に曝露する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体に投与された少なくと
   も４日後に、前記抗原が投与される、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体に投与された少なくと
   も７日後に、前記抗原が投与される、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体に投与された少なくと
   も１５日後に、前記抗原が投与される、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体に投与された少なくと
   も３０日後に、前記抗原が投与される、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記オリゴヌクレオチドが８〜１００ヌクレオチド長である
   、請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート修飾またはホ
   スホロジチオエート修飾であるリン酸骨格修飾を含む、請求項１に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記リン酸骨格修飾が前記オリゴヌクレオチドの５’末端で
   生じる、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記リン酸骨格修飾が前記オリゴヌクレオチドの３’末端で
   生じる、請求項７に記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌクレ
    オチドは少なくとも以下の式を含む配列を有し： ５’Ｘ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁Ｘ₂は、以下：ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から
    選択されるヌクレオチドであり；そしてＸ₃Ｘ₄は、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴまたは
    ＴｐＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、方法。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌクレ
    オチドは少なくとも以下の式を含む配列を有し： ５’ＴＣＮＴＸ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃およびＸ₄は、ヌクレオチドであり、Ｎは、約０〜２５の
    ヌクレオチドから構成される核酸配列である、方法。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、Ｘ₁Ｘ₂が以下：ＧｐＴ、
    ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から選択されるヌクレオチドであり、そ
    してＸ₃Ｘ₄が、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴまたはＴｐＣからなる群から選択されるヌ
    クレオチドである、方法。
13. 【請求項１３】 前記抗原が抗原をコードする核酸である、請求項１に記載
    の方法。
14. 【請求項１４】 前記抗原が、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリサッカ
    ライド、ポリサッカライド結合体、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルス抽出物、
    ウイルス、細菌、真菌、寄生生物およびアレルゲンからなる群より選択される、
    請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記抗原がアレルゲンである、請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記抗原が感染性細菌、感染性ウイルス、および感染性真
    菌からなる群から選択される感染性生物体に由来する、請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記被験体が前記抗原に能動的に曝露される、請求項１に
    記載の方法。
18. 【請求項１８】 前記抗原がコロイド分散系と組み合わせて送達される、請
    求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 前記コロイド分散系が、高分子複合体、ナノカプセル、マ
    イクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系からなる群から選択される、請求
    項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記脂質ベースの系が水中油型エマルジョン、ミセル、混
    合ミセルおよびリポソームからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法
    。
21. 【請求項２１】 前記抗原と組み合わせてアジュバントを投与する工程をさ
    らに包含する、請求項１７に記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記被験体が前記抗原に受動的に曝露される、請求項１に
    記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記被験体が癌を発症する危険性のある被験体である、請
    求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記被験体がアレルギー反応を発症する危険性がある、請
    求項２２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記被験体が喘息である、請求項２２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記抗原特異的免疫応答がＴｈ１型免疫応答である、請求
    項１に記載の方法。
27. 【請求項２７】 血小板減少症を有する被験体において血小板数を増加する
    ための方法であって、以下： 血小板減少症（化学療法誘導性でない）を有する被験体に、少なくとも以下の式
    を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを、該被験体における血小板数を増加す
    るのに有効な量で、投与する工程であって： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ ここで、該オリゴヌクレオチドは少なくとも８ヌクレオチドを含み、ＣおよびＧ
    は、メチル化されておらず、そしてＸ₁およびＸ₂はヌクレオチドである工程、を
    包含する、方法。
28. 【請求項２８】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体における血小板数を
    １マイクロリットルあたり少なくとも血小板１０，０００個増加するのに有効な
    量で投与される、請求項２７に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体における血小板数を
    １マイクロリットルあたり少なくとも血小板２０，０００個増加するのに有効な
    量で投与される、請求項２７に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体に、該被験体におけ
    る血小板数を１００パーセント増加するのに有効な量で投与される、請求項２７
    に記載の方法。
31. 【請求項３１】 前記血小板減少症が薬物誘導性の血小板減少症である、請
    求項２７に記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記血小板減少症が特発性血小板減少性紫斑病のような自
    己免疫障害に起因する、請求項２７に記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記血小板減少症が偶発的な放射線曝露から生じる血小板
    減少症である、請求項２７に記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記血小板減少症が治療的な放射線曝露から生じる血小板
    減少症である、請求項２７に記載の方法。
35. 【請求項３５】 前記オリゴヌクレオチドが８〜１００ヌクレオチド長であ
    る、請求項２７に記載の方法。
36. 【請求項３６】 前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート修飾または
    ホスホロジチオエート修飾であるリン酸骨格修飾を含む、請求項２７に記載の方
    法。
37. 【請求項３７】 前記リン酸骨格修飾が前記オリゴヌクレオチドの５’末端
    で生じる、請求項３６に記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記リン酸骨格修飾が前記オリゴヌクレオチドの３’末端
    で生じる、請求項３６に記載の方法。
39. 【請求項３９】 請求項２７に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌク
    レオチドは少なくとも以下の式を含む配列を有し： ５’Ｘ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁Ｘ₂は、以下：ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から
    選択されるヌクレオチドであり；そしてＸ₃Ｘ₄は、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴまたは
    ＴｐＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、方法。
40. 【請求項４０】 請求項２７に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌク
    レオチドは少なくとも以下の式を含む配列を有し： ５’ＴＣＮＴＸ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃およびＸ₄は、ヌクレオチドであり、Ｎは、約０〜２５の
    ヌクレオチドから構成される核酸配列である、方法。
41. 【請求項４１】 請求項２７に記載の方法であって、Ｘ₁Ｘ₂が以下：ＧｐＴ
    、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から選択されるヌクレオチドであり、
    そしてＸ₃Ｘ₄が、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴまたはＴｐＣからなる群から選択される
    ヌクレオチドである、方法。
42. 【請求項４２】 血小板減少症を発症する危険性のある被験体を処置する方
    法であって、以下： 血小板減少症を発症する危険性のある被験体に、該被験体が血小板を枯渇する
    状態に曝露される場合、該被験体における血小板を枯渇する状態下で通常予期さ
    れる血小板数の低下を妨げるのに有効な量で、少なくとも以下の式を含む配列を
    有するオリゴヌクレオチドを投与する工程であって： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ ここで、該オリゴヌクレオチドは少なくとも８ヌクレオチドを含み、ＣおよびＧ
    は、メチル化されておらず、そしてＸ₁およびＸ₂はヌクレオチドである、工程、
    を包含する、方法。
43. 【請求項４３】 血小板減少症を発症する危険性のある前記被験体が血小板
    抑制薬で処置された障害を有している、請求項４２に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記オリゴヌクレオチドが８〜１００ヌクレオチド長であ
    る、請求項４２に記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート修飾または
    ホスホロジチオエート修飾であるリン酸骨格修飾を含む、請求項４２に記載の方
    法。
46. 【請求項４６】 前記リン酸骨格修飾が前記オリゴヌクレオチドの５’末端
    で生じる、請求項４５に記載の方法。
47. 【請求項４７】 前記リン酸骨格修飾が前記オリゴヌクレオチドの３’末端
    で生じる、請求項４５に記載の方法。
48. 【請求項４８】 請求項４２に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌク
    レオチドは少なくとも以下の式を含む配列を有し： ５’Ｘ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁Ｘ₂は、以下：ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から
    選択されるヌクレオチドであり；そしてＸ₃Ｘ₄は、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴまたは
    ＴｐＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、方法。
49. 【請求項４９】 請求項４２に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌク
    レオチドは少なくとも以下の式を含む配列を有し： ５’ＴＣＮＴＸ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃およびＸ₄は、ヌクレオチドであり、Ｎは、約０〜２５の
    ヌクレオチドから構成される核酸配列である、方法。
50. 【請求項５０】 請求項４２に記載の方法であって、Ｘ₁Ｘ₂が以下：ＧｐＴ
    、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から選択されるヌクレオチドであり、
    そしてＸ₃Ｘ₄が、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴまたはＴｐＣからなる群から選択される
    ヌクレオチドである、方法。
51. 【請求項５１】 貧血を処置するための方法であって、以下： 少なくとも以下の式を含む配列を有するオリゴヌクレオチドを、貧血を有する
    被験体において赤血球生成を誘導するのに有効な量で、該被験体に投与する工程
    であって： ５’Ｘ₁ＣＧＸ₂３’ ここで、該オリゴヌクレオチドは少なくとも８ヌクレオチドを含み、ＣおよびＧ
    は、メチル化されておらず、そしてＸ₁およびＸ₂はヌクレオチドである、工程、
    を包含する、方法。
52. 【請求項５２】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体において赤芽球数を
    少なくとも１０％増加するのに有効な量で投与される、請求項５１に記載の方法
    。
53. 【請求項５３】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体において赤芽球数を
    少なくとも２０％増加するのに有効な量で投与される、請求項５１に記載の方法
    。
54. 【請求項５４】 前記オリゴヌクレオチドが前記被験体に、該被験体におけ
    る赤芽球数を１００％増加するのに有効な量で投与される、請求項５１に記載の
    方法。
55. 【請求項５５】 前記貧血が薬物誘導性貧血である、請求項５１に記載の方
    法。
56. 【請求項５６】 前記貧血が免疫溶血性障害、異常血色素症および遺伝性溶
    血性貧血のような遺伝的障害；十分な鉄の貯蔵にもかかわらず不十分な生成；腎
    不全のような慢性疾患；および慢性関節リウマチのような慢性炎症性障害からな
    る群から選択される、請求項５１に記載の方法。
57. 【請求項５７】 前記オリゴヌクレオチドが８〜１００ヌクレオチド長であ
    る、請求項５１に記載の方法。
58. 【請求項５８】 前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート修飾または
    ホスホロジチオエート修飾であるリン酸骨格修飾を含む、請求項５１に記載の方
    法。
59. 【請求項５９】 前記リン酸骨格修飾が前記オリゴヌクレオチドの５’末端
    で生じる、請求項５８に記載の方法。
60. 【請求項６０】 前記リン酸骨格修飾が前記オリゴヌクレオチドの３’末端
    で生じる、請求項５８に記載の方法。
61. 【請求項６１】 請求項５１に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌク
    レオチドは少なくとも以下の式を含む配列を有し： ５’Ｘ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁Ｘ₂は、以下：ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から
    選択されるヌクレオチドであり；そしてＸ₃Ｘ₄は、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴまたは
    ＴｐＣからなる群から選択されるヌクレオチドである、方法。
62. 【請求項６２】 請求項５１に記載の方法であって、ここで前記オリゴヌク
    レオチドは少なくとも以下の式を含む配列を有し： ５’ＴＣＮＴＸ₁Ｘ₂ＣＧＸ₃Ｘ₄３’ ここで、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃およびＸ₄は、ヌクレオチドであり、Ｎは、約０〜２５の
    ヌクレオチドから構成される核酸配列である、方法。
63. 【請求項６３】 請求項５１に記載の方法であって、Ｘ₁Ｘ₂が以下：ＧｐＴ
    、ＧｐＧ、ＧｐＡおよびＡｐＡからなる群から選択されるヌクレオチドであり、
    そしてＸ₃Ｘ₄が、以下：ＴｐＴ、ＣｐＴまたはＴｐＣからなる群から選択される
    ヌクレオチドである、方法。
64. 【請求項６４】 前記貧血が偶発的な放射線曝露から生じる貧血である、請
    求項５１に記載の方法。
65. 【請求項６５】 前記貧血が治療的な放射線曝露から生じる貧血である、請
    求項５１に記載の方法。