JP2002511949A - 疾患の予測及び／又は診断用の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 自由給餌した個体及び食餌制限した個体の生物学的試料を分析して、その試料の分子的構成を表す頻度分布パターンを作成し、そのパターンを比較することにより疾患を診断する。

Description

【発明の詳細な説明】 疾患の予測及び／又は診断用の方法 発明の分野 本発明は一の態様において、生きている動物における疾患の予測及び／又は診 断用の方法に関する。本発明は特に、生きている動物における将来の特定の疾患 の危険性を診断及び／又は予測することにおいて有用性を有し、このような有用 性との関連において以下に記載するが、他の有用性についても熟慮する。本発明 は別の態様において、グループを識別することが可能である、疾患、又は将来に おいて疾患になる無症状の状態についての標識を同定することに関し、更にはこ れらの標識の部分集合にも関するが、ここでこのような標識の有用性は、例えば 単一変量、多変量、又はパターン認識に基づく分析により決定することが可能で あり、及び／又は記載した方法により重要であると同定された標識は、他の分析 方法を使用して測定することも可能である。本発明は癌、ＩＩ型糖尿病、心血管 疾患、脳血管疾患、及び病因が食餌又は栄養により緩和されることが確立又は椎 定されている他の疾患、即ちアルツハイマー病、パーキンソン病、及びハンティ ングトン病{１}等の神経発生的（neurogenerative）疾患の危険性を予測するこ とへの適用を特に有し、更に血清又は血漿の代謝物を使用して乳癌の危険性を決 定することへの適用と特に関連させて以下に記載する。しかしながら、他の有用 性について、また他の組織や生物学的液体試料（例えば白血球、脳脊髄液、尿、 及び／又は組織の試料）を血液の代わりに使用することについて、そして乳癌以 外の疾患及び病状についても、上記したように扱う。同様に、疾患に加えて（長 期又は短期の）栄養状態の調査について も、種々の潜在的な臨床的環境下での医学的試験として、本発明の更に別の態様 に調和して利用することができるし、又は疫学的若しくは薬学的試験の管理にお いても使用できる。更に他の有用性、例えば毒素への露出及び／又は毒素への露 出についての感受性の検出についても考慮する。 発明の背景 食餌制限(ＤＲ)、即ち栄養失調とならないように栄養不足にすることは、消耗 性及び腫瘍性の疾患の双方を低減するのに効果があることが確立されている。Ｄ Ｒは平均及び最大の寿命の双方を延ばし、加齢に関連した疾病率を低減し、更に は加齢に関連した生理学的機能不全のある種のものを遅延若しくは予防すること ができるので{２、３}、１９３０年代に初めて使用されてから広く利用されてい る。ＤＲはまた、代謝、ホルモンバランス、及び反応性の酸素種の生成、解毒、 及び耐性を含む多くの基本的な生理学的プロセスを改変する{４}。ＤＲは複数の 方法において実施することができる{例えば５−１３}。更に、トータルカロリー の制限は、特定の因子（例えば脂肪、蛋白質、ビタミン及びミネラル等{１４、 １５}）の摂取を低減するよりもより重要であると信じられている。ＤＲは、複 数のほ乳類（ラット、マウス、モルモツト{２、５−１３、１６}）を含む、試み た実質的に全ての動物において寿命を長引かせることが報告されている。更には 、ＤＲの有益性のうち少なくとも一部、特にグルコース代謝に関するものは、ヒ ト以外の霊長類においても起こることを示唆する有望なデータもあり{１７−２ １}、おそらくはヒトにおいてもそうであろう{２２、２３}。これらの観察をま とめると、ＤＲ効果は、ほ乳類において強固であることが示唆される。 ＤＲは、非腫瘍性疾患の発生及び重症度の双方を低減することが示されている 。一例としては、ＳＤラットのオス及びメスの両方において急性糸球体腎炎、 動脈周囲炎、及び心筋変性症に対する効果が挙げられる。他の系統においても、 他の疾患、例えば肺病｛２５｝について同様の観察がなされている。ＤＲはまた 、いくつかの種特異性疾患、例えばＮＺＢ／ＮＺＷＦ１マウス｛２６｝及びＭＲ Ｌ／ｌｐｒマウス｛２７｝における自己免疫疾患、並びにＪＣＲ：ＬＡ-ｃｐマ ウスにおけるアテローム性動脈硬化症｛２８｝及び心筋虚血症｛２９｝を予防す る効果がある。 ＤＲはまた、腫瘍性疾患の発生及び重症度の両方を低減することが示されてい る。ＤＲによって仲介される腫瘍の低減には、白血病、下垂体腺腫、乳腺及び前 立腺の腫瘍、肝細胞癌の発症の遅延が含まれる{３０、３１}。乳腺の腫瘍へのＤ Ｒの効果についての観察は典型的なものである{３２−３６}。ＤＲは発症の遅延 （イニシエーションの低減及びプロモーションの遅延の両方により）と、腫瘍の 前進（プログレッション）の遅延との両方により乳癌の減少に作用する{３０}。 乳腺の腫瘍になりやすいトランスジェニックマウスにおいては、ＤＲは腫瘍発生 率を６７％低減した{３２}。この結果は、乳癌になりやすいという遺伝的体質を ＤＲにより克服することが可能であることを明らかにしている。発癌物質で処理 したラットの研究｛３３｝によれば、高脂肪高カロリーの食餌は共発癌性（co-c arcinogenic）であり、４０％ＤＲの養生法で維持したラットはいずれも乳腺の 腫瘍にならず、一方、６０％のＡＬで食餌したラットは乳腺の腫瘍になった。こ の効果は一部において、腫瘍の増殖に利用できる脂肪の低減により媒介されると いうことは、その後の研究につながった{３４}。ＤＲの食餌は高脂肪であるにも 関らず、結果は、乳腺の腫瘍を有するラットにおいて、そして腫瘍を有する群の 動物当たりの腫瘍の数が７５％低減するということを示している。更により印象 的であることには、ＤＲは全腫瘍産出、平均腫瘍サイズ、及び平均腫瘍負担（me an tumor burden）を９３乃至９８％ 低減した。とりわけ、Ｓｉｎｈａらは２０％ＤＲの養生法でさえもホルモンレベ ルや生殖能に影響せずに腫瘍を６５％低減することを証明した{３５}。 よって、ＤＲが仲介する実験室モデルにおける乳癌に対する保護は、１）相当 なものであり（ラットでは１００％もの癌率の低減が見られ{３２}）且つ反復性 も高く{3０−３４}；２）強固であり、また遺伝的体質のモデルや発癌物質への 露出のモデルを含む、種々の動物モデルにおいて良く証明されていて{３１、３ ２}；３）生殖能やホルモンレベルに影響しない、より適度の（２０％）制限規 範でさえも見られ{３４}；４）種々のレベル（イニシエーション、プロモーショ ン、プログレッション）で効果的である。従って、本発明は一の側面において、 ＤＲを反映した標識の異なる亜集団は、異なる疾患を予測するという観察に基づ いている。例えば、ＤＲの表現型を反映する標識を、例えば血清中で同定するこ とは、乳癌や、食餌により影響される他の状態を引き起こす危険性を反映する標 識となるであろう。 寿命及び疾患への広い影響と一致して、ＤＲは全身的な現象であるが、その効 果には自由給餌した（adlibitum）(ＡＬ)動物のものと比較して測定可能なほど 異なる血液組成が含まれる{３７}。既になされた多くの研究はホルモンの測定に 集中している。例えば、血漿のコルチコステロンのパターン及びレベルにおける 変化{３８}；メスの生殖ホルモン{３９}、血漿のクレシストキニン（chlecystok inin）の５０％減少{４０}；Ｔ４ではなくＴ３の減少{４１};そしていくつかの ＤＲモデルにおける血漿インシュリンの６０％もの減少{４２}が研究により示さ れている。これらの研究は有益であるが、関与する技術の複雑さ（例えば概日周 期性、刺激への迅速な応答）のためにいくぶん制限されている。より安定な他の 標識を探求した他の研究では、エネルギー及びフリーラジカルの代謝についての 標識を調べたが、これによりＤＲは血漿中の グルコース、アスコルビン酸塩（例：４３−４５）、そしてグリコヘモグロビン のレベルを減少させていることが判明した{４３}。全体としてこのデータは、血 清型における違いにより、ＡＬ動物とＤＲ動物とを区別することを示していて、 またこれらの差にはアッセイすることが比較的簡単で、且つ生理機能、代謝、及 びフリーラジカルの生物学（例：生成、感受性、及び解毒）へのＤＲの有益な効 果を反映するいくつかの代謝物が含まれることを示している。 理論に拘束されるわけではないが、ＡＬ及びＤＲの血清型は、これらのグルー プの間の強固な生理学的差異を反映しているので、種間で交叉し、ヒトにおける 疾患の発症の相対的危険性を予測する代謝物又は代謝物のプロフィールがこれら の血清型には含まれると信じられている。この概念と一致するデータは、乳癌へ のＤＲの効果は、主として（イニシエーションと呼ばれる）急性の効果｛３０、 ３１｝ではなく、（プロモーションと呼ばれる）慢性の効果により起こるという ことを示した研究に由来する。これらのデータは、乳癌になる相対的危険性は、 長期間の一般的代謝に多分反映されているということを示唆するであろう。従っ て、相対的な危険性は明白な疾患の発生よりもずっと以前に血清中で検出可能で あるはずである。ヒトの場合、カロリー摂取に関して広い範囲におかれているが 、ＡＬ血清型により近くフィットしていること（即ち、高カロリー摂取に典型的 な生物学的応答）は、疾患のより高い相対的危険性を予測するであろうし、一方 、ＤＲ血清型へよりフィットしていること（即ち、低カロリー摂取に典型的な生 物学的応答）は、より低減された危険性と関連しているであろう。以前の研究で はＡＬ動物とＤＲ動物との間の差異が証明されたが、それらは予め決めておいた 特定の標識を見ることのみが可能であり、栄養状態を決定したり種を越えた健康 状態を予測することに使用する標識を同定するための、十分に広くて強力な検索 を行うことは本質的に不可能である。 発明の要約 本発明によれば、システム、即ち動物間における分子、特には小型の分子代謝 物の濃度の差異を決定する方法及び装置であって、動物の二以上の健康状態又は 栄養状態を再現可能に区別するのに使用することが可能な代謝物データベースを 作り出すものを提供する。特に本発明は、分析技術を利用して、自由給餌した( ＡＬ)、及び食餌制限した(ＤＲ)個体の試料の代謝経路パターンについての小型 分子目録（inventory）を提供するものであるが、これにより、動物の異なる食 餌状態、動物の健康状態を再現可能に区別し、動物における特定の疾患の発症の 相対的危険性を再現可能に予測する。 このアプローチの基礎は、二の（又はそれよりも多い）興味ある状態を再現可 能に区別するのに十分に特異的で、再現可能で、測定可能な変化が、異なる状態 での小型分子代謝物の全体的生化学において存在しているということにある。異 なる実体、及び／又は標識の亜集団若しくは組合せを使用して、異なる疾患又は 無症状の状態を同定することが可能である。来国特許第４，８６３，８７３号は 参照することにより本願に取り込むが、このＨＰＬＣ−電気化学的分析に基づく アプローチにより、ＡＬ及びＤＲ血清の組成物についてのデータベースの創出が 可能になった。 図面の説明 本発明の性質及び目的の完全な理解のためには、添付の図面とともに以下の詳 細な説明を参照する必要がある。 図１は、本発明によるクロマトグラフ法のポンプのプロフィールである。 図２Ａ−２Ｃは、本発明による血清試料のクロマトグラフのアレーである。 図３は、本発明により生化学的に同定された血清代謝物の表である。 図４は、本発明により生化学的に識別された血清代謝物の棒グラフである。 図５Ａ及び５Ｂは、デンドグラム（dendograms）であり、図５Ｃ及び５Ｄは、 本発明により生化学的に識別された血清代謝物のＰＣＡパターンである。そして 、 図６は、本発明により生化学的に同定された血清代謝物の亜集団の表である。 好ましい態様の詳細な記載 試料分析及びデータベース創出の方法 試料の調製 標準的な動物利用ガイドラインに従って断頭した後、末端全採血してフィッシ ャー３４４ラットのオスから血液を回収した。試料は３０分間氷上におき、遠心 し、得られる血清を液体窒素中で急速凍結し、分析まで（-）８０℃で保存した 。 試料を沈殿させ、の４倍量の-２０℃のアセトニトリル（Ａｎ）／０.４％酢酸 （ＨＡｃ）で抽出した。遠心した上清を１ｍｌ除去し、真空下で蒸発させて乾燥 し、以下に記載の２００ｍｌの移動層Ａに再構築した。このプロトコールは、ア スコルビン酸塩、及びホモゲンチジン酸等の反応性種を１ｎｇ／ｍｌの濃度で保 存する。再構築した抽出物の１００ｍｌを二つの自動サンプラーガラス瓶のそれ ぞれにとり、一方をすぐに分析にかけ、もう一方を−８０℃で凍結して後の確認 分析用にした。接種前に、試料は４℃で維持した。 移動層：クロマトグラフ用溶媒には、イソプロピルアルコール、メタノール、 アセトニトリル、水酸化リチウム、氷酢酸、及びペンタンスルホン酸が含まれる 。保持時間及び応答能の安定性を維持するため、新規の移動層の組みを開発した ：移動層Ａ（１１ｇ／ｌのＰＳＡであって、酢酸でｐＨを３.００にしたもの） 及び移動層Ｂ(０.１ＭのＬｉＡｃであって、８０／１０／１０のメタ ノール／Ａｎ／イソプロパノール中の酢酸でｐＨを３.００にしたもの)。ＰＳＡ は蛋白質及びペプチドの断片を可溶化してＨＰＬＣカラム（Ｃ１８）及び電量検 出器の両方から除去する改善された能力があり、一方、高有機性変性剤(移動層 Ｂ)は効果的に脂質及びポリサッカリドの残渣を除去することが証明されている 。しかしながらスルホン酸は本質的に汚染されていて、ＰＳＡ／ＨＡｃ濃縮緩衝 液（４００ｇ／ｌ ＰＳＡを４１）を１０００ｍＶ ｖｓ Ｐｄ（Ｈ）のポテン シャルの熱分解グラファイトで電気分解する洗浄プロトコールが必要である。 クロマトグラフ法： 図１においてクロマトグラフ法は、０％移動層Ｂから１００％移動層Ｂへの１ ２０分間の複合勾配で、流速がアジオトロピックな（aziotropic）粘性効果を補 償するように調節されている。勾配の操作は、二つのSchimadzuLC-10AD HPLCポ ンプにより行った。煩雑な前洗浄プロトコール、及び高度に精製された溶媒、よ りすぐりの有機性変性剤の使用にもかかわらず、疑似のピークが勾配の後期にお いて生じる。この問題は、Ｃ１８と同様の吸着特性を有する電気化学的に励起さ れた多孔性炭素に基づく装置の開発により処理された。ピークサプレッサー／勾 配混合器（ＰＳ／ＧＭ）のプロトタイプをＨＰＬＣインジェクターの前につなげ て設置した。このＰＳ／ＧＭ混合器は、移動層の汚染物をトラップして広げる役 目を有するフロー割込溝を有する２.５ｃｍのロッド部分と組み合わされた、直 径が１ｃｍである２ｃｍ長のＣ１８プレカラムを組み込んでいる。これらが勾配 をかけている間に溝のあいた部分に放出されると、ｃａ.１４０秒の半分の高さ でのピーク幅にまで混合される。これにより移動層による汚染シグナルが、後に データ換算中に除去される波へと効果的に変換される。この混合勾配は、自動試 料インジェクターを通ってＣ１８カラ ムへと流れる前に、ＰＳ／ＧＭからＰＥＥＫで並んだパルスダンパーへ（a PEEK lined pulse damper）と運ばれる。試料抽出物を、３ｍｍのＯＤＳ粒子が含ま れ、８０ｍｍ×４.６ｍｍＩ.Ｄ.を測定する二重のＰＴＦＥで並んだＨＲ８０カ ラム（dual PTFE lined HR80 columns）上で分離した。 分析物の検出は、マサチューセッツ州ケルムスフォードのＥＳＡ，Ｉｎｃ.よ り入手可能な、ＮＣＡ化学分析器、モデルＣＥＡＳ 多重電極電気化学検出シス テムで行った。これにはＥＳＡモデル６２１０分析用セル、及び-１００ｍＶか ら+９４０ｍＶまで増大する１６チャンネルの電量電極の列であって、還元可能 及び酸化可能な化合物の検出を行うものが含まれる。ＰＳ／ＧＭ、パルスダンパ ー、カラム、及び検出器を３５℃に温度制御された囲い中に収める。システムの 機能は、遠隔の４８６ベースのコンピュータであってデータ保存、変換及び分析 が行なわれるものにネットワーク接続された３８６マイクロコンピュータにイン ストールされたＥＳＡ，Ｉｎｃ.モデル４.１２Ｃ ＣＥＡＳソフトで制御した。 ＣＥＡＳ分析ソフトで作られた報告をスプレッドシート／データベースソフトに インポートして更なる統計的分析及び報告に供した。 データの変換、監視、及び分析： 純粋な標準物質及び同定された試料化合物でモニターしたクロマトグラフ保持 時間は、１％を越えては変動しない。絶対的な定性的チャンネル比応答(the abs olute qualitive channel ratio responses)は、２０％を越えては変動せず、真 性の標準物質を含めることにより５％内に制御された。可能ならば、試料クロマ トグラフピークの同一性は、妥当な真性標準物質でスパイキングして確認した。 最終的な確認は、標準物質及び試料のピークのマッチング比（Ｒ）の比較により 行った。Ｒは、優性な酸化チャンネルと並列されたサブ優性なチャンネルとの間 の比を表す。ある化合物が特定のポテンシャルで酸化 され、従っていかなる化合物も保持時間とポテンシャルとで記載することができ る。実際には、化合物をその酸化ポテンシャルの近傍にセットされた優性な検出 器上で酸化し、その前及び後の検出器ではより小さい応答を示した。優性の及び 近傍の検出器応答の間で示される比は、与えられた化合物の特徴であり、その比 からの変動は、標準物質が試料化合物の濃度に近い場合には、共溶出性の汚染物 質を意味する。 それぞれの検出器のアナログシグナルのデータを変換し、他の検出器のデータ と組合せて時間−ポテンシャルマップを構築したが、これを標準物質と比較し、 更には試料間でも比較した。保持時間、検出チャンネル比、及びより低度にはピ ークの高さについての制限下でのマッチに基づき、試料のピークについての分析 値を計算したが、これは連続モニタ分析の分析者により最適化した優先順序にし たがった。化合物の同一性が既知の場合、標準的な応答に基づき、試料をｍｌ当 たり何ｎｇであるかで計算した。 分析を自動化するため、１００と定義した濃度を有する一群の多重試料のプー ルより、化合物表を作りだした。その後の試料分析により、プール値の割合で表 された報告値を作りだす。この表を使用して(まずはマニュアルの監視で、次に 自動的に)、他のプール全て及び研究対象の二三の試料を分析した。ＣＥＡＳ分 析ソフトには、内蔵の「学習」能力があり、これは分析の「標準的な」定義機能 の本質的一部をなす。操作を行う者が二三の分析を監督して、他の化合物に対す る参照保持時間や、チャンネル比からのどの程度の変動が許容されるのかという 変数についての決断を行った。分析においける問題点及び不明瞭さをモニターし て、この分析の試験フェーズ中に解決した。結果として、標準物質をプールした 表は、試料中の潜在的分析物の大部分をいかに見つけだすかを「学習」するであ ろう。典型的には４００よりも多い化合物が血漿中において、 ２０ナノアンペアのゲインで溶解している。報告値をデータベースへダウンロー ドするのに適したファイルへ保存した。 実施例Ｉ 電量アレー検出器と連結した複合ＨＰＬＣ分離器の使用により、血清から４０ ０を越える化合物を同時に定量することが可能になる(図２Ａ)。保持時間(図２ Ｂ)と、近傍の検出器からの応答比（図２Ｃ）とを配列した組合せにより、多数 の実行（run）における一定のピークを再現可能に同定すること、及びＡＬやＤ Ｒのラットからの血清等の興味ある試料の比較が可能となる。全部で、約７０の 生化学的に同定された化合物と、３５０以上の末だ末同定の化合物とか、これら の技術を利用して再現可能に測定された。表Ｉ、図３を参照のこと。 電量アレー検出器と連結したＨＰＬＣ分離 データはまず、ＣＥＡＳ／電量システムにより、１６の一連のクロマトグラム の形態で作成した（それそれの検出器につき一つ）。図２Ａは、全クロマトグラ ムの約５分の１を示すが、これには６カ月齢のオスのフィッシャー３４４ラット に由来する約７０の独立した、同定可能、且つ定量可能なピークが含まれる。セ ンサーポテンシャルは、Ｔ，-１００ｍｖからＴ₁₆＋９４０ｍＶの範囲であった 。結果を中間ゲインで示した(２００ｎＡ)。ｘ軸は保持時間であり、ｙ軸は応答 強度であり、１６の平行なトレースはアレー１〜１６（下から上）の１６の検出 器を表す。図２Ｂは、３つのＡＬラット(上の３つのトレース)、及び３つのＤＲ ラット（下の３つのトレース）由来のクロマトグラムの後半部分を示す。明確に するため、チャンネル（検出器）８からのデータのみを示す(ゲイン＝５００ｎ Ａ)。矢印はＤＲによって減少した二つの代謝物を示す。図２Ｃは、図２Ａ（化 合物１２３、図４参照）由来のクロマトグラムの領域であって、一のＡＬ動物( 上側)、及び一のＤＲ動物（下側）由来のものを示す(ゲイン１ ５ｕＡ)。図２Ａのように、１６のパラレルなトレースは、１−１６（下側から 上側）の１６のアレー検出器を表す。検出器を横切る応答の比率が一定であるこ とに注意すべし。 この技術をＡＬ及びＤＲのラット由来の血清の研究に適用することにより、こ れらの群の間で異なっている３４の化合物が判明した(図４)。これら３４の化合 物のうち、６は６カ月及び１２カ月の月齢のラットで再現可能に変化していて、 これら６のうちの少なくとも５についてはまた、１８カ月齢のラットにおいても 変化していた。残りの２８の標識には明らかな年齢特異性を有するもの、そして その有効性については現在調査中である他のものが含まれている。これらの標識 は、もともとは６カ月齢のＡＬ及びＤＲラットで同定されたものであるが、これ らは、階層的クラスター分析と主成分分析の両方により正しい食餌群に分離でき る程十分に、ＡＬとＤＲ群との間で異なっている(図５Ａ及び５Ｂ)。 実行可能性を確認するため、上記のＨＰＬＣシステムを使用して、６カ月齢の オスのＡＬ及びＤＲフィッシャー３４４ラットの血清に由来する２１７の代謝物 の相対的レベルを決定した。ボンフェローニ（Bonferroni）補正を考慮しないｔ −検定による分析によって、２２の代謝物がＡLおよびＤＲラットの間で異なっ ていることが判明した(図４参照)。これら２２の化合物（表ＩＩ、図６参照）を 、次の試験（Ｎ＝８／群、１２カ月齢のＡＬ及びＤＲフィッシャーラット）の最 初の興味ある変数とした。これらのデータの分析により、これら２２の化合物の うちの６についての統計的有意さが確認された(図４中、星印でマークした)。更 には、これら６のうちの５はまた、１８カ月齢のＡＬ及びＤＲラットの間で統計 的に異なっている(ｐ値＜０.０２、＜０.００２、＜０.００１、＜０.０００２ 、＜０.０００１)；６番目のもの（ホモバニリン酸で あると確認された代謝物＃７１）は、同様の傾向を示したが、ｐ＞０.０５であ った(β＜０.１で、”Ｎ”を増大させると統計的有意さを生じることを示唆する )。残りの１６の化合物は、１２カ月の試料のみにおいて統計的に有意であった １２の化合物と同様に、タイプＩの統計エラーであるもの、”Ｎ”が増大してい るときは統計的に有意であるもの（多くのものに付いてはβは現在のところ、＜ ０.８であり、このうちの一部は第二の年齢群において統計的な有意さに近づく ）を含んでいるようであったが、いくつかの代謝物は特定の年齢においてＤＲ表 現型を反映しているかも知れない。記載した方法を利用した更なる実験により、 これらの可能性を区別したり、また他の興味ある標識を同定することができる。 更に別の化合物が、短期間のカロリー制限後に＞９９％減少することが判明した 。 上記の実施例よりわかるように、動物を維持する食餌規範の変化を使用して、 特殊なパターン又はプロフィールを得ることができる。例としては、異なる年齢 のオス及びメスのラットの試験により、年齢及び性に依存する、及び依存しない プロフィールであってＤＲに関連するものを同定することが可能である。ＤＲ食 餌養生の期間及び程度における特定の変化により、長期間及び短期間のカロリー 取及びバランスの標識に関する、拡張された代謝データベースを作製することが 可能となる。 得られるデータは同様に、単一変量統計(例えばｔ−検定)、多変量統計（例え ばＡＮＯＶＡ）や多変量分析（階層的クラスター分析、主要成分文政）を使用し たり、又はパターン認識アルゴリズムを使用して定性的及び定量的に代謝物のプ ロフィール及び関係を同定して分析することができる。 ＤＲ用の血清標識 図４においては、オスのフィッシャー３４４ラットに由来する血清試料を、 上記のＥＳＡモデルＣＥＡＳにかけた。６カ月齢及び１２カ月齢のＡＬ及びＤＲ ラットに由来する血清を分析した(Ｎ＝８／群)。データは６カ月齢のＡＬラット のうちの一匹の血清中の分析物のレベルの割合で表した。垂直な線の左側の棒は 、６カ月齢のＡＬ及びＤＲラットの間で統計的に異なっている化合物を示し、右 側の棒は１２カ月のＡＬ及びＤＲラットの間で統計的に異なっている化合物を示 す。星印は、双方の群で統計的に異なっている６つの化合物を示す(棒は６カ月 のデータのみを示す；下のｐ値は、６カ月時のものである)。定量された２１７ の分析物のうち、３４がボンフェローリ補正前に＜０．０５のｐ値を示す(未補 正値は、線の左側から順にｐ≦0.0008、0.0008、0.001、0.001、0.005、0.0073 、0.0089、0.0091、0.012、0.012、0.013、0.014、0.017、0.017、0.017、0.019 、0.023、0.026、0.026、0.037、0.04、0.05；線の右側からはｐ≦0.0017、0.00 27、0.003、0.0075、0.011、0.014、0.014、0.016、0.023、0.034、0.035、0.04 )。 観察： 図２及び４のデータは、既知の群における代謝物の差異を同定することが可能 であることを示し、図５は相互的なもの、即ち、電量アレー技術により生成され る代謝物のプロフィールには一試料が属する群を同定するのに十分な情報が含ま れるということを示している。従って、長期間のＤＲを反映したものである代謝 物のプロフィールを使用してヒトのグループ分けを行うことが可能であり、作ら れたグループは次に試料の同一性（例えば後に乳癌になる女性ｖｓ癌にはならな い女性、そして疾患にかかる危険性が高い者ｖｓ疾患にかかる危険性の低い者） を反映することができる。 本発明の方法を実用的なものにする構成は５つある。最初のものは、疾患の頻 度を再現可能に低減する動物系を同定する能力である。これは、食餌制限し たラットを使用して行われるが、これは寿命の延び、及び疾病率の減少が、自由 給餌したものに比較して確実なものである。第二のものは、自由給餌したラット と食餌制限したラットとの間で異なる血清成分を捕獲することを可能にする方法 である。この構成を実行する本発朋の実用性の直接的な証拠が、図２Ｂ、２Ｃ、 ４、及び５に示されている。第三のものは、同定された代謝物は、カロリー摂取 により動物をグループ分けするのには十分であるという観察に基づいている。こ のことは図５に示されている。第四の構成は、ヒト以外の種において同定された 標識（代謝物）の少なくとも一部は、ヒトにおいても同定されうるという観察に 基づいている。このことは、全ての補乳類の代謝の間で全体的な類似性かあるの で本当である。Milburyらがクマとヒトについて行った研究｛４６｝により、以 前から直接的に確認されている。最後に第五の構成は、これらの標識又はそれら の亜集団が、ヒトにおける疾患の危険性を予測したり診断したりする能力である 。このことは、ほ乳類間の代謝の一般的類似性、多くのヒトの疾患がカロリー摂 取と強く関連すること(例えばある種の癌、ＩＩ型糖尿病、心血管及び脳血管の 疾患)、そしてＤＲが多くの疾病率の形態に対して有効であることが確立されて いることから当然である。更に、標識のうちどの亜集団が実用性を有するかを決 定する方法には、動物における標識の生成及び確認であって、ヒトの疫学用に開 発された方法を使用してヒトの集団におけるこれらの標識についての試験とカッ プリングさせたものが含まれる。ヒトにおける多重パターンを定義された栄養摂 取でもってテストするような中間段階を使用して、この方法を容易且つ強固なも のにすることができる。 図５は、６カ月齢のＡＬ及びＤＲラットで異なっている同定された代謝物に基 づいて、６カ月齢及び１２カ月齢のラット由来の血清試料についてなされたグル ープ分けを示す。図５（パネルＡ及びＢ）におけるデンドグラムは、アイ ンサイト（Einsight）データ分析パッケージの階層的クラスター分析パッケージ を使用して作成したものである。階層的クラスター分析は、データの組の自然な グループ分けを強調したデータ分析方法である。二つの群における差異を強調し た分析方法とは対照的に、階層的クラスター分析では複雑なデータの組みを低減 して想定した区分なしでこれらの群を確立するアルゴリズムを使用している。こ のデンドグラムでは、全研究集団の中で相対的類似性が横軸上で右（０.０）か ら左（１.０、生化学的同一性）へと移動するにつれて増加する。同一性（左側 ）から、二つの試料（群）が垂直な線で結ばれている点までの距離が小さいほど 、二つの試料（群）の関連性は大きい。あるいは、二つの試料間の割れ目が図の 右側へ近いほど、二つの試料又は一群の試料の間の不均衡さは大きい。 固有ベクトル又は主成分分析（ＰＣＡ）を使用して更に分析を行ったが、これ により群の分離に最も貢献する分析物を決定する(図５のパネルＣ及びＤ)。この 種の分析においては、データベース中の変動の説明において最も重要な二つのＰ ＣＡ成分を、それぞれＰＣ１及びＰＣ２と命名する。データの組（ＰＣ-１及び ＰＣ-２、正確な値は任意のものである）を最も良く区別する、二つの群の分析 物に対して、相対的に正確な（mathematical）値を割り当てた。次いで、Ｘ軸に ついてはＰＣ−１値を、Ｙ軸についてはＰＣ−２値を使用して散布図をプロット した。本発明の事情においては主要成分（固有ベクトル）分析により、ＡＬ及び ＤＲ動物に間で異なる可能性のあるどの多重成分が分類の目的には最も有益であ るかを同定することが可能になった。この分析はまた、プロフィール中から異な る分析物を除去する結果を推定する手段を与える。この種の分析により、一の群 の構成員を別のものの構成員と区別する（例えば特定の疾患になる危険性が高い ヒトｖｓその疾患になる危険性が高くないヒト）の にどの分析物が最も貢献するかを決定することを容易にする。 図５に示されるように、十分な威力を有するデータが生成され、階層的クラス ター分析及び主成分分析の両方により、６カ月齢のラットの初期群(１００％の 正確性、図５Ａ及び５Ｃ）並びに、１２カ月齢及び１８カ月齢の二つの独立した 群（＞８５％の正確性、図５Ｂ及び５Ｄ）の両方において食餌群によりラットの 血清を分離することが可能となった。血清中に存在する情報の十分な画分をそれ 自身で保持して試料の起源を正確に同定することを可能にする一連の標識が、初 期群によって確認される。最も重要なことに、二つの独立したデータの組での研 究は、このデータは未知の独立した試料を＞８５％で正確に同定するのに十分な 威力を有する一連の標識を同定することが可能であることを明らかにしている。 ２２の標識全てを使用したか、又は６カ月及び１２カ月の試料の両方で異なって いる６個の標識のみを使用したかには関らず、３つの年齢全てにおいて同様に良 好な分離が行われた。誤った分類は、群についての少量の亜集団［２−４匹のラ ット］に限られ、使用した標識（６又は２２）及び分析に使用したアルゴリズム に依存した。 ＡＬラット及びＤＲラットを区別する血清標識 ６カ月齢のＡＬラット及びＤＲラットにおける潜在的な標識として同定された ２２の血清代謝物(図４、縦軸の左)、及び６カ月齢及び１２カ月齢のラットで再 現可能であると示された６の標識（図４、星印）を使用して、３組のＡＬ及びＤ Ｒラットのグループ分けを決定した(６、１２、及び１８カ月、１８カ月のデー タは示さず)。ラットの命名（例えばＡ１）は、年齢群と一致している(垂直に、 例えば図５Ａ及び５ＣにおけるＡ１は、同じラットであるが、図５Ａ及び５Ｂの Ａ１は異なる)。当該データについての階層的クラスター分析（Ａ、Ｂ）及び主 要成分（固有ベタ）分析（Ｃ、Ｄ）の両方を示す。（Ａ）１４の６ カ月齢ラット由来の血清の分析についてのデンドグラム。２２の化合物全てを使 用して自然なグループ分けをおこなったが、同様の結果が６の再現可能な標識の みを使用しても得られた。（Ｂ）１５の１２カ月齢ラット由来の血清の分析につ いてのデンドグラム(独立した試験の組)。２２の化合物全てを使用して自然なグ ループ分けを行った。同様の結果が、６の再現可能な標識のみを使用しても、又 １８カ月齢のラットにおいても得られた。（Ｃ）１４の６カ月齢ラット由来の血 清について、２２全ての標識を使用した主成分分析。同様の結果が、６の再現可 能な標識のみを使用しても得られた。(Ｄ)独立した試験の組における１５の１２ カ月齢のラットに由来する血清についての、６の再現可能な標識を使用した主成 分分析。同様の結果が、１８カ月齢のラットに由来する試料におけるのと同様に して２２全ての標識を使用しても得られた。全ての分析は第一のパスデータに基 づいているが、これはＨＰＬＣデータ分析ソフトが、ＡＬ及びＤＲラットを区別 するのに十分な質のデータを回収するためのいかなる追加トレーニングもいかな る人間の介在も要しないことを意味する。 図２、４、及び５に示されるデータは、本発明によりＡＬラットとＤＲラット との間で再現可能に異なる標識を同定することを可能にすること、そしてこれら の標識に基づく代謝物のプロフィールは、階層的クラスター析及び主成分分析に より＞８５％の正確さで、たとえこれらの表現型が一部において年齢関連性及び ／又は個体変動により不明瞭であっても、正しい食餌群に血清試料を分類するの に十分に強力であることを証明する。”Ｎ”を増大させると、より大きく、従っ てより情報量に富むトーレニング組を生成し、そして非情報性の代謝物をプロフ ィールより除去することでシグナル対ノイズ比を増大させることによりこれらの 結果の正確性と威力がすぐに増大する。更に拡張されたデータベースを、特殊な 改変を施された食餌養生で維持されたラットを使用して構 築すると、代謝物及び代謝物のプロフィールを解析して威力を増大させることが 可能になるであろう(例えば短期間の食餌を反映する標識を同定して、真に長期 間の低減カロリー摂取を反映したものと区別することが可能になる)。これら標識 の組はともに異なる使用への実用性を有するかも知れない。最後に、得られたデ ータを単一変量、多変量、又はパターン認識ベースの分析により分析することが でき、これらの分析は他の分析には見られない実用性を検出することが可能であ る。 従って、電量アレー検出器を有するＨＰＬＣを有益に使用して、特殊な化学標 識、即ち代謝物、代謝物の組、及び／又は（血清又は他の生物学的試料で検出さ れる）代謝物プロフィールであって、ＡＬラットをＤＲラット又は他の動物から 分離するものを同定することが可能であり、また、このような代謝物、代謝物の 組、又は代謝物のプロフィールを次に使用して疾患の状態又は将来の疾患の危険 性を診断又は予測するのに使用することが可能であることがわかる。このような 疾患には、糖尿病、特にはＩＩ型の糖尿病、心血管の疾患、卒中(stroke)、心臓 まひ、脳血管の疾患、及び他の疾患であってその病因が（例えばアルツハイマー 病｛１｝のように）食餌又は栄養により改変されることが確立又は椎定されてい るもの等の退行性疾患が含まれるが、もっとも他の疾患における実用性も考慮さ れていて、これには腫瘍性及び非腫瘍性の疾患、例えば乳癌、大腸癌、膵臓癌、 リンパ腫、前立腺癌、及び白血病や、神経学的疾患、神経退行性疾患、自己免疫 疾患、内分泌腺疾患、腎臓疾患、ハンチントン病、パーキンソン病、ルーゲリッ グ病等、更には毒素、例えば工業的及び／又は環境的毒素に対する感受性が含ま れる。更には、本発明の技術を数多くの試料に適用することにより、より大きな 数の化学的パターンの特徴を観察し、新規の化学的パターン、及び／又は特定の 疾患及び／又は将来において特定の疾患に なる無症状の状態に特異的な新規の標識を同定することが可能になる。これは次 に、早期の調査を可能にし、よって恐らくは疾患の発症を阻止する。本発明はま た、有益には他の疾患の状態、又は無症状の状態、即ち観察可能な身体的兆候の 前であって、将来において疾患の状態になるものの診断用に利用することが可能 である。他の実用性も考慮されるが、疾患に加えて栄養状態の調査も同様に、種 々の潜在的臨床環境下での医学試験として、疫学的又は薬学的試験の制御におい て有益であるかもしれない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (71)出願人 コーネル リサーチ ファウンデイション インコーポレーテッド アメリカ合衆国 ニューヨーク 14050 イタカ トーンウッド ドライヴ 20 ス ウィート 105 (72)発明者 クリスタル，ブルース エス アメリカ合衆国 ニューヨーク 10605 ホワイト プレインズ ママロネック ア ヴェニュ 801 アパートメント 101 (72)発明者 マトソン，ウェイン アール アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01433 エイヤー ワン ハーヴァード ロード（番地なし) (72)発明者 ミルベリー，ポール イー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01938 イプスウィッチ スカイトップ ロード 17

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 生物学的試料を分析し、当該試料の分子的構成を表す頻度分布パターン を作成する、疾患の診断及び／又は予測の方法であって、 自由給餌した個体と食餌制限した個体についての試料の構成の頻度分布パター ンを比較することを特徴とする方法。 ２． 前記の試料が体液を具備することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３． 前記の体液が、血清、血漿、血小板、唾液、及び尿からなる群より選択 されることを特徴とする請求項２に記載の方法。 ４． 前記の疾患が、腫瘍性若しくは非腫瘍性、心血管若しくは脳血管の疾患 、腎臓疾患、自己免疫疾患、神経学的若しくは神経退行性疾患、内分泌腺疾患、 及び糖尿病からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ５． 前記の疾患が、乳癌、大腸癌、膵臓癌、リンパ腫、前立腺癌、及び白血 病からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ６． 前記の疾患が腎炎を具備することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７． 前記の疾患が、動脈周囲炎（periarateris）を具備することを特徴とす る請求項１に記載の方法。 ８． 前記の疾患が、心筋変性症、心臓疾患、及び卒中からなる群より選択さ れることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ９． 前記の疾患が、関節硬化症（altherosclorosis）を具備することを特徴 とする請求項１に記載の方法。 １０． 前記の疾患が、下垂体腺腫を具備することを特徴とする請求項１に 記載の方法。 １１． 前記の疾患が、ＩＩ型の糖尿病を具備することを特徴とする請求項１ に記載の方法。 １２． 前記の疾患が、毒素に対する感受性を具備することを特徴とする請求 項１に記載の方法。 １３． 前記の比較が、単一変量統計を利用して行われることを特徴とする請 求項１に記載の方法。 １４． 前記の比較が、多変量統計を利用して行われることを特徴とする請求 項１に記載の方法。 １５． 前記の比較が、階層的クラスター分析を利用して行われることを特徴 とする請求項１に記載の方法。 １６． 前記の比較が、主成分分析を利用して行われることを特徴とする請求 項１に記載の方法。 １７． 前記の比較が、パターン認識アルゴリズムを利用して定性的及び定量 的に代謝物プロフィール及び相関を同定して行われることを特徴とする請求項１ に記載の方法。 １８． 前記の生物学的試料が、電気化学的に活性な化合物を具備し、また当 該液体試料を連続的に液体クロマトグラフィーのカラムに通し、当該カラムより 溶出する物質についての時間−空間分離を行う工程と、また電気化学的検出装置 であって当該電気化学的に活性な化合物の電気化学的パターンを作成するものと を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 １９． 前記の電気化学的に活性な化合物を当該電気化学的検出装置の電気化 学的特性により分離する工程を含むことを特徴とする請求項１８に記載の方法。