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JP2002511259A - ５’ｅｓｔおよびコードされるヒトタンパク質 - Google Patents

５’ｅｓｔおよびコードされるヒトタンパク質

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Publication number
JP2002511259A
JP2002511259A JP2000543599A JP2000543599A JP2002511259A JP 2002511259 A JP2002511259 A JP 2002511259A JP 2000543599 A JP2000543599 A JP 2000543599A JP 2000543599 A JP2000543599 A JP 2000543599A JP 2002511259 A JP2002511259 A JP 2002511259A
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JP
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est
seq
nos
nucleic acid
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Pending
Application number
JP2000543599A
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English (en)
Inventor
ミルヌ エドワーズ，ジャン−バプティスト ドゥマ
デュクレール，アイメリック
ジョルダン，ジャン−イヴ
Original Assignee
ジェンセット
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェンセット filed Critical ジェンセット
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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Abstract

(57)【要約】 分泌タンパク質をコードするｍＲＮＡから誘導される５’ＥＳＴの配列を開示する。５’ＥＳＴは、５’ＥＳＴに対応するｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを得るためのものである。５’ＥＳＴを、診断法、法医学的手法、遺伝子治療、および染色体マッピング手法に使用することもできる。５’ＥＳＴを使用して上流調節配列を得ることもできる。５’ＥＳＴを使用して、発現ベクターおよび分泌ベクターを設計することもできる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （背景技術） ヒト染色体に散在している推定５０，０００〜１００，０００の遺伝子は、ヒ
ト疾患の理解、診断および治療にかなり有望である。また、ヒトゲノム全体に分
布する遺伝子座に特異的にハイブリダイズすることができるプローブには、高分
解能染色体マップの構築および個体の識別における用途がある。
【０００２】 過去には、ヒト遺伝子を１本だけでも特性化することが骨の折れるプロセスで
あり、何年もの努力を要した。最近、クローニングベクター、ＤＮＡ配列決定お
よびコンピュータ技術分野の発達が合流したことにより、ヒトの遺伝子を単離、
配列決定、マッピングおよび特性化することができる速度が大いに加速された。
【０００３】 現在、ヒトゲノムに分布する遺伝子を同定し、特性化するための２つの異なる
方法が検討されている。一方の方法では、ゲノムＤＮＡの大きいフラグメントを
単離し、クローニングし、配列決定する。生物情報科学（Bioinformatics）ソフ
トウェアを使用して、これらのゲノム配列のオープンリーティングフレームと思
われるものを同定する。しかし、この方法は、ゲノム全体に分散するタンパク質
コード配列を見つけるために、タンパク質をコードしないヒトＤＮＡの大きなス
トレッチの配列決定を伴う。広範な配列決定が必要であることに加えて、生物情
報科学ソフトウェアは得られたゲノム配列を間違って特性化することがある（す
なわち、非コードＤＮＡをコードＤＮＡとして標識したり、コードＤＮＡを非コ
ードＤＮＡとして標識したりする）。
【０００４】 別の方法はヒトの遺伝子を同定し、特性化するさらに直接的な経路を取る。こ
の方法では、ヒトタンパク質をコードする単離されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）から相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する。この方法を使用すると、
ゲノムのタンパク質コード部分から誘導されるＤＮＡについてのみ配列決定が実
施される。しばしば、ｃＤＮＡのほんの短いストレッチを配列決定して、発現配
列タグ（ＥＳＴ）と呼ばれる配列を得る。次いで、ＥＳＴを使用して、ＥＳＴ配
列に隣接する配列を含む伸長ｃＤＮＡを単離または精製することができる。伸長
ｃＤＮＡは、それらを得るために使用されたＥＳＴの配列の全てを含んでいても
よいし、それらを得るために使用されたＥＳＴの配列の一部だけを含んでもよい
。また、伸長ｃＤＮＡは、ＥＳＴが誘導される遺伝子の全コード配列を含んでも
よく、または伸長ｃＤＮＡは、ＥＳＴが誘導される遺伝子のコード配列の一部を
含んでもよい。選択的スプライシングまたは第２プロモーターの活性の結果とし
てＥＳＴ配列を含む伸長ｃＤＮＡがいくつか存在し得ることが認識されよう。あ
るいは、部分的に重複した配列を有するＥＳＴを同定し、重複ＥＳＴのコンセン
サス配列を含むコンティグを同定してもよい。
【０００５】 過去には、これらの短いＥＳＴ配列はオリゴ−ｄＴプライム化ｃＤＮＡライブ
ラリーからしばしば得られた。従って、それらは主にｍＲＮＡの３’非翻訳領域
に相当した。一部には、ｍＲＮＡの３’末端から誘導されるＥＳＴ配列が普及し
たのは、ｃＤＮＡを得るための典型的な技法はｍＲＮＡの５’末端から誘導され
るｃＤＮＡ配列を単離するためにはあまり適していないという事実の結果である
（アダムス（Adams）ら、Nature 377:3〜174、1996;ヒリアー(Hillier)ら、Genome Res .6:807〜828、1996）。
【０００６】 また、より長いｃＤＮＡ配列が得られたと報告されている例では、その報告さ
れた配列は、一般に、コード配列に相当し、ｃＤＮＡが誘導されるｍＲＮＡの全
長の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含まない。実際に、５’ＵＴＲは、ｍＲＮ
Ａの安定性または翻訳のいずれかに影響を及ぼすことが明らかにされている。従
って、遺伝子発現の調節は、例えば、マイトジェン活性型細胞におけるメタロプ
ロテアーゼ組織インヒビターｍＲＮＡの翻訳（Waterhouseら、J Biol Chem.265:
5585-9.1990）について示されているように、代替的５’ＵＴＲを使用すること
によって達成することができる。さらに、変異、挿入、またはトランスロケーシ
ョン事象を介する５’ＵＴＲの改変は、病因にさえ関与し得る。例えば、脆弱Ｘ
症候群は先天性精神遅滞の最も一般的な原因であり、複数のＣＧＧトリヌクレオ
チドが脆弱ＸｍＲＮＡの５’ＵＴＲに挿入し、リボソームの抑制によってタンパ
ク質合成の阻害が生じることが原因の１つである（Fengら、Science 268:731-4,
1995）。癌原遺伝子ｃ−ｍｙｃの翻訳を阻害することが知られている５’ＵＴＲ
の領域の異常変異が、多発性骨髄腫患者由来の細胞においてｃ−ｍｙｃタンパク
質レベルのアップレギュレーションをもたらすことが明らかにされた（Willisら
、Curr Top Microbiol Immunol 224:269-76,1997）。さらに、オリゴ−ｄＴプラ
イム化ｃＤＮＡライブラリーを使用しても完全な５’ＵＴＲを単離することはで
きない。何故なら、このプロセスによって得られるこのような不完全な配列は、
特に第１のエキソンが短い場合には、ｍＲＮＡの第１のエキソンを含まないかも
しれないからである。さらに、それらは、スプライシング部位の上流に位置する
いくつかのエキソン（しばしば短いもの）を含まないことがある。従って、ｍＲ
ＮＡの５’末端から誘導される配列を得る必要性が存在する。
【０００７】 ヒトの染色体由来の多数の配列には実用的な用途があるが、タンパク質産物を
コードするこれらの染色体配列の同定および特性化に基づいた方法は、診断およ
び治療的用途に特に関連がある。場合によって、そのような治療または診断技術
において使用される配列は、それらが合成される細胞から分泌されるタンパク質
をコードする配列であってもよい。分泌タンパク質をコードする配列、ならびに
分泌タンパク質自体が、治療効果をもつ可能性のある薬剤として特に有用である
。このようなタンパク質はしばしば細胞間の連絡に関係しており、標的細胞にお
いて臨床的に適切な応答を生じる原因であり得る。実際、組織プラスミノーゲン
アクチベーター、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン、ヒト成長ホ
ルモン、インスリン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インター
フェロン−γおよびインターロイキン−２を含むいくつかの分泌タンパク質が現
在臨床的に使用されている。これらのタンパク質は、急性心筋梗塞、急性虚血性
卒中、貧血、糖尿病、成長ホルモン欠損症、肝炎、腎癌、化学療法による好中球
減少症および多発性硬化症を含む広範な症状を治療するために使用される。こう
した理由のために、分泌タンパク質またはその一部をコードする伸長ｃＤＮＡは
、治療薬の特に有用な供給源となる。従って、分泌タンパク質およびそれらをコ
ードする核酸を同定し、特性化する必要性が存在する。
【０００８】 それら自体が治療的に有用であることに加えて、分泌タンパク質は、アミノ末
端に、その分泌を指令するシグナルペプチドと呼ばれる短いペプチドを含む。こ
れらのシグナルペプチドは、分泌タンパク質をコードする遺伝子のコード配列の
５’末端に位置するシグナル配列によってコードされる。これらのシグナルペプ
チドは、それらが機能し得る形で連結している任意のタンパク質の細胞外分泌を
指令ことができる。また、膜輸送配列（membrane-translocating sequence）と
呼ばれるシグナルペプチドの一部を使用して、目的のペプチドまたはタンパク質
の細胞内への輸送を指令することもできる。これは、特定の遺伝子産物を、それ
を産生する細胞以外の細胞に送達することが望まれる遺伝子治療法において有用
であることが明らかである。シグナルペプチドをコードするシグナル配列には、
タンパク質の精製法を単純化するという用途も見出されている。このような用途
では、望ましいタンパク質が細胞外に分泌されることによって、不要なタンパク
質（これらのタンパク質から望ましいタンパク質を選択しなければならない）の
数を減少させることができ、精製はかなり容易になる。従って、シグナルペプチ
ドをコードする分泌タンパク質の遺伝子の５’部分を同定し、特性化する必要性
が存在する。
【０００９】 非分泌タンパク質をコードする配列も、治療剤または診断剤としての用途を見
出すことができる。特に、そのような配列を使用して、タンパク質のコード配列
の変異の結果として疾患などの検出可能な表現型を個体が発現する可能性がある
かどうかを決定してもよい。個体が、そのようなコード配列の変異の結果として
疾患または他の所望されない表現型を患う危険性を伴う場合、遺伝子治療を用い
て正常なコード配列を導入することによって、所望されない表現型を補正するこ
ともできる。あるいは、所望されない表現型がコード配列によってコードされる
タンパク質の過剰発現から生じる場合、アンチセンスまたは三重らせんに基づく
方法によって、タンパク質の発現を減少することができる。
【００１０】 コード配列によってコードされる分泌または非分泌ヒトポリペプチドを、ポリ
ペプチドをコードする配列の変異から生じる疾患などの状態を有する個体に直接
投与することによって、治療剤として使用してもよい。そのような場合、ポリペ
プチドを個体に投与することによって、該状態を治療または改善することができ
る。
【００１１】 さらに、分泌または非分泌ヒトポリペプチドまたはその一部を使用して、生物
学的サンプルの起源の組織型または種を決定するのに有用な抗体を生成してもよ
い。また、抗体を使用して、分泌または非分泌ヒトポリペプチドの細胞局在性あ
るいはヒトポリペプチドに融合しているポリペプチドの細胞局在性を決定しても
よい。さらに、抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィー技術に使用して
、ヒトポリペプチドもしくはヒトポリペプチドに融合している標的ポリペプチド
を単離、精製、または富化してもよい。
【００１２】 プロモーターおよび上流の調節領域が同定され、特性化されているヒト遺伝子
の数に関して公開されている情報は極めて少ない。一部には、このような調節配
列を単離する困難さによるかもしれない。転写因子結合部位などの上流の調節配
列は、一般に、非常に短いので、ヒトゲノムライブラリーからプロモーターを単
離するためのプローブとして利用することができない。最近、ヒトプロモーター
を単離するいくつかの方法が開発されている。それらの１つは、ＣｐＧアイラン
ドライブラリーを作製することである（クロス（Cross）ら、Nature Genetics 6
:236〜244,1994）。第２の方法は、ＳｐｅＩ結合タンパク質を使用することによ
って、ＳｐｅＩ結合部位を有するヒトゲノムＤＮＡ配列を単離することである。
（モートロック（Mortlock）ら、Genome Res.6:327〜335,1996）。これらの方法
はいずれも特異性または包括性の欠如による限界がある。従って、遺伝子の５’
部分を同定し、系統的に特性化される必要性が存在する。
【００１３】 本発明の５’ＥＳＴを使用して、タンパク質合成の位置、発達段階、速度およ
び量、ならびにｍＲＮＡの安定性を制御する５’ＵＴＲおよび上流調節領域を効
率的に同定して、単離することができる。これらの調節領域は、一旦同定され、
特性化されると、遺伝子治療またはタンパク質の精製法に使用して、望ましい量
および位置のタンパク質合成を得ることができ、または望ましくない遺伝子産物
の合成を阻害、軽減または防止することができる。
【００１４】 また、タンパク質遺伝子の５’末端を有するＥＳＴは、染色体マッピングおよ
び個体の識別のためのプローブとして有用な配列を含み得る。従って、遺伝子の
５’コード配列の上流配列を同定し、特性化する必要性が存在する。
【００１５】 （発明の概要） 本発明は、対応するｍＲＮＡの真正５’末端から誘導される配列を含む精製さ
れた、単離された、または富化された５’ＥＳＴに関する。「対応するｍＲＮＡ
」という用語は、５’ＥＳＴを産生するｃＤＮＡ合成の鋳型となったｍＲＮＡを
いう。これらの配列をこれ以後「５’ＥＳＴ」と呼ぶ。本発明はまた、重複配列
を含有する複数のＥＳＴ由来のコンセンサス配列を決定することによって組み立
てられるコンティグを含む、精製、単離または富化された核酸を含む。これらの
コンティグを本明細書では「コンセンサスコンティグ５’化ＥＳＴ」と呼ぶ。
【００１６】 本明細書において使用される「精製された」という用語は絶対的な純度を要求
するのではなく、むしろ、それは相対的な定義であると意図される。ｃＤＮＡラ
イブラリーから単離された個々の５’ＥＳＴクローンは、通常、電気泳動的均一
性が得られるまで精製されている。これらのクローンから得られる配列はライブ
ラリーまたはヒト全ＤＮＡから直接得ることはできなかった。ｃＤＮＡクローン
はそのままで天然に存在していないが、部分的に精製された天然の物質（メッセ
ンジャーＲＮＡ）を操作することによって得られる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブ
ラリーへの変換は合成物質（ｃＤＮＡ）を作製することを含み、純粋な個々のｃ
ＤＮＡクローンはクローン選択によって合成ライブラリーから単離することがで
きる。従って、メッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製し、その
後ライブラリーから個々のクローンを単離することによって、天然のメッセージ
の約１０4〜１０6倍の純度が得られる。出発材料または天然材料を少なくとも１
桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁まで精製すること
が特に意図されている。
【００１７】 本明細書において使用される「単離された」という用語は、物質がその元の環
境（例えば、それが天然のものである場合には、自然環境）から取り出されるこ
とを必要とする。例えば、生存動物に存在する天然型ポリヌクレオチドは単離さ
れていないが、天然系において共存する物質の一部または全てから分離された該
ポリヌクレオチドは単離されている。
【００１８】 本明細書において使用される「組換え」という用語は、５’ＥＳＴが、自然環
境では隣接していない「バックボーン」核酸に隣接していることを意味する。ま
た、「富化される」ためには、５’ＥＳＴが、核酸バックボーン分子の集団中の
核酸インサートの数の５％以上に相当する。本発明によるバックボーン分子には
、発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組込み核酸および目的の核酸インサ
ートを維持または操作するために使用される他のベクターまたは核酸などの核酸
が含まれる。好ましくは、富化された５’ＥＳＴは、組換えバックボーン分子の
集団中の核酸インサートの数の１５％以上に相当する。さらに好ましくは、富化
された５’ＥＳＴは組換えバックボーン分子の集団中の核酸インサートの数の５
０％以上に相当する。非常に好ましい実施形態では、富化された５’ＥＳＴは組
換えバックボーン分子の集団中の核酸インサートの数の９０％以上に相当する。
【００１９】 「ストリンジェントな」、「中程度の」および「低度の」ハイブリダイゼーシ
ョン条件は以下に規定される通りである。 「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さにかかわらず、アミノ酸のポ
リマーを指す。従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペ
プチドの規定内に含まれる。この用語はまた、本発明のポリペプチドの化学的ま
たは発現後修飾を指定も除外もせず、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン
酸基、脂質基などの共有結合性付着を含むポリペプチドが、特に用語ポリペプチ
ドに含まれる。また、１つ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然のアミノ
酸、関連しない生物系において天然にのみ存在するアミノ酸、哺乳動物系由来の
修飾されたアミノ酸など）を含有するポリペプチド、置換された結合を有するポ
リペプチド、ならびに天然に存在する場合および天然に存在しない場合における
当該分野において公知の他の修飾も規定に含まれる。
【００２０】 本明細書において交換可能に使用される用語として、「核酸」、「オリゴヌク
レオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは一本鎖また
は二本鎖のいずれか一方の形で１を超えるヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッド配列を含む。「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の形で
任意の長さのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分
子を説明するための形容詞として本明細書において使用される。「ヌクレオチド
」という用語はまた、個々のヌクレオチド、またはヌクレオチドの変異体を指す
名詞として本明細書において使用され、プリンもしくはピリミジン、リボースも
しくはデオキシリボースの糖部分、およびリン酸基、またはオリゴヌクレオチド
またはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合のホスホジエステル結合を含む
分子またはより大きな核酸分子での個々の単位を意味する。「ヌクレオチド」と
いう用語はまた、少なくとも１つの改変（ａ）代替的結合基、（ｂ）プリンのア
ナログ形態、（ｃ）ピリミジンのアナログ形態、または（ｄ）アナログ糖を含む
「改変されたヌクレオチド」を含むために本明細書において使用される。アナロ
グ結合基、プリン、ピリミジン、および糖の例については、例えば、ＰＣＴ公開
ＷＯ９５／０４０６４を参照のこと。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、
組換え、ｅｘ ｖｉｖｏ生成、またはそれらの組合せを含む任意の既知の方法に
よって、および当該分野において公知の任意の精製方法を利用して、調製するこ
とができる。
【００２１】 「塩基対」ならびに「ワトソン＆クリックの塩基対」という用語は、本明細書
において交換可能に使用され、チミンまたはウラシル残基が２本の水素結合でア
デニン残基に結合し、シトシンおよびグアニン残基が３本の水素結合で結合する
二重らせんのＤＮＡに見出される様式（Stryer,L.,Biochemistry、第４版、１９
９５を参照のこと）で、配列の同一性により相互に水素結合することができるヌ
クレオチドを指す。
【００２２】 「相補的」または「その相補」という用語は、相補領域全体にわたって、もう
１つの表記されたポリヌクレオチドとワトソン＆クリックの塩基対を形成し得る
ポリヌクレオチドの配列を指すために本明細書において使用される。本発明の目
的のために、第１のポリヌクレオチドのそれぞれの塩基がその相補的塩基と対を
形成する場合に、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに相補的で
あると考える。一般に、相補的塩基は、ＡおよびＴ（もしくはＡおよびＵ）、ま
たはＣおよびＧである。「相補」は、本明細書では、「相補的ポリヌクレオチド
」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」の同義語として使用する
。これらの用語は、ポリヌクレオチドの配列にのみ基づくポリヌクレオチドの対
に適用するものであって、２つのポリヌクレオチドが実際に結合する特定の組の
条件に適用するものではない。好ましくは、「相補的配列」は、対向する鎖にＴ
が存在するそれぞれの位置にＡが存在し、対向する鎖にＡが存在するそれぞれの
位置にＴが存在し、対向する鎖にＣが存在するそれぞれの位置にＧが存在し、対
向する鎖にＧが存在するそれぞれの位置にＣが存在する配列である。
【００２３】 従って、１つ以上の５’ＥＳＴがバックボーン分子中の核酸インサートの数の
５％以上を占めているｃＤＮＡライブラリー中の５’ＥＳＴは、本明細書中で定
義される「富化された組換え５’ＥＳＴ」である。同様に、本発明の１つ以上の
５’ＥＳＴがプラスミドバックボーン中のインサートの数の５％以上となるよう
に、本発明の１つ以上の５’ＥＳＴが挿入されたプラスミド集団中の５’ＥＳＴ
は、本明細書で定義する「富化された組換え５’ＥＳＴ」である。しかし、５’
ＥＳＴがバックボーン分子集団中の核酸インサートの数の５％未満を構成するｃ
ＤＮＡライブラリー、例えば、５’ＥＳＴインサートを有するバックボーン分子
が極めてまれであるライブラリーの５’ＥＳＴは、「富化された組換え５’ＥＳ
Ｔ」ではない。
【００２４】 一部の実施形態では、本発明は、分泌タンパク質をコードする遺伝子から誘導
される５’ＥＳＴに関する。本明細書において使用される「分泌」タンパク質は
、好適な宿主細胞内で発現されるとき、アミノ酸配列中のシグナルペプチドの結
果としての輸送を含む、膜を貫通してまたは通過して輸送されるタンパク質であ
る。「分泌」タンパク質は、それらが発現される細胞からその全体（例えば、可
溶性タンパク質）または一部（例えば、レセプター）が分泌されるタンパク質を
含むが、それに限定されない。「分泌」タンパク質はまた、小胞体の膜を貫通し
て輸送されるタンパク質も含むが、それに限定されない。
【００２５】 このような５’ＥＳＴは、５’ＥＳＴが誘導される遺伝子によりコードされる
タンパク質の細胞外分泌を指令するシグナルペプチドをコードする、シグナル配
列と呼ばれる核酸配列を含む。一般に、シグナルペプチドは分泌タンパク質のア
ミノ末端に位置する。
【００２６】 分泌タンパク質は、「粗面」小胞体に結合したリボソームによって翻訳される
。一般に、分泌タンパク質は、共翻訳的に小胞体膜に移送される。分泌タンパク
質の翻訳中のリボソームと小胞体の結合はシグナルペプチドによって仲介される
。シグナルペプチドは、一般に、小胞体内に共翻訳的に入った後に切断される。
小胞体への送達後、分泌タンパク質はゴルジ装置を通過して前進し得る。ゴルジ
装置では、タンパク質は翻訳後修飾を受けることができ、その後細胞膜を通過し
てそれらを輸送する分泌小胞に入る。
【００２７】 本発明の５’ＥＳＴにはいくつかの重要な用途がある。例えば、それらを使用
して、５’ＥＳＴが誘導されるｍＲＮＡのコード配列の５’末端から誘導される
真正の翻訳開始部位を含む、対応する遺伝子産物の全長のタンパク質コード配列
を含むｃＤＮＡクローンを取得し、それを発現させることができる。これらのｃ
ＤＮＡをこれ以後「全長ｃＤＮＡ」と呼ぶ。これらのｃＤＮＡはまた、翻訳開始
部位の上流のｍＲＮＡ配列から誘導されるＤＮＡを含んでもよい。全長ｃＤＮＡ
配列は、５’ＥＳＴに対応するタンパク質を発現させるために使用することがで
きる。上記のように、分泌タンパク質および非分泌タンパク質は治療上重要であ
る。従って、ｃＤＮＡから発現されるタンパク質は種々のヒト症状を治療および
予防する際に有用となり得る。５’ＥＳＴはまた、対応するゲノムＤＮＡを得る
ために使用することもできる。「対応するゲノムＤＮＡ」という用語は、５’Ｅ
ＳＴが誘導されるｍＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡをいう。
【００２８】 あるいはまた、５’ＥＳＴを使用して、タンパク質の一部をコードする伸長ｃ
ＤＮＡを取得し、発現させることができる。分泌タンパク質の場合、この部分は
、分泌タンパク質のシグナルペプチドまたはシグナルペプチドが切断されたとき
に生成する成熟タンパク質を含み得る。
【００２９】 本発明は、単離、精製、または富化された「ＥＳＴ関連核酸」を含む。「単離
された」、「精製された」、または「富化された」という用語は、上記で示した
意味を有する。本明細書において使用される「ＥＳＴ関連核酸」という用語は、
配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸、配列番号２４〜８１１
および１６００〜１６２２の核酸を使用して取得され得る伸長ｃＤＮＡ、配列番
号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸を使用して取得され得る全長ｃ
ＤＮＡ、または配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸を使用し
て取得され得るゲノムＤＮＡを意味する。本発明はまた、ＥＳＴ関連核酸に相補
的な配列を含む。
【００３０】 本発明はまた、単離、精製、または富化された「ＥＳＴ関連核酸のフラグメン
ト」を含む。「単離された」、「精製された」、および「富化された」という用
語は、上記で示した意味を有する。本明細書において使用される「ＥＳＴ関連核
酸のフラグメント」という用語は、ＥＳＴ関連核酸の少なくとも１０、１２、１
５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、１００、
２００、３００、５００、または１０００個の連続するヌクレオチドを、これら
の長さのフラグメントが、言及されている特定のＥＳＴ関連核酸の長さと一致す
る程度で含むフラグメントを意味する。特にＥＳＴ関連核酸のフラグメントは、
「表ＩＩに記載のポリヌクレオチド」、「表ＩＩＩに記載のポリヌクレオチド」
、および「表ＩＶに記載のポリヌクレオチド」を指す。本発明はまた、ＥＳＴ関
連核酸のフラグメントに相補的な配列を含む。
【００３１】 本発明はまた、単離、精製、または富化された「ＥＳＴ関連核酸の位置的セグ
メント」を含む。本明細書において使用される「ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメ
ント」という用語は、ＥＳＴ関連核酸のヌクレオチド１〜２５、２６〜５０、５
１〜７５、７６〜１００、１０１〜１２５、１２６〜１５０、１５１〜１７５、
１７６〜２００、２０１〜２２５、２２６〜２５０、２５１〜３００、３０１〜
３２５、３２６〜３５０、３５１〜３７５、３７６〜４００、４０１〜４２５、
４２６〜４５０、４５１〜４７５、４７６〜５００、５０１〜５２５、５２６〜
５５０、５５１〜５７５、５７６〜６００および６０１〜末端ヌクレオチドを、
そのようなヌクレオチドの位置が、言及されている特定のＥＳＴ関連核酸の長さ
と一致する程度で含むセグメントを含む。「ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント
」という用語はまた、ＥＳＴ関連核酸のヌクレオチド１〜５０、５１〜１００、
１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜
３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５０〜５００、５０１〜５５０、
５５１〜６００または６０１〜末端ヌクレオチドを、そのようなヌクレオチドの
位置が、言及されている特定のＥＳＴ関連核酸の長さと一致する程度で含むセグ
メントを含む。「ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント」という用語はまた、ＥＳ
Ｔ関連核酸のヌクレオチド１〜１００、１０１〜２００、２０１〜３００、３０
１〜４００、５０１〜５００、５００〜６００または６０１〜末端ヌクレオチド
を、そのようなヌクレオチドの位置が、言及されている特定のＥＳＴ関連核酸の
長さと一致する程度で含むセグメントを含む。さらに、「ＥＳＴ関連核酸の位置
的セグメント」という用語は、ＥＳＴ関連核酸のヌクレオチド１〜２００、２０
１〜４００、４００〜６００、または６０１〜末端ヌクレオチドを、そのような
ヌクレオチドの位置が、言及されている特定のＥＳＴ関連核酸の長さと一致する
程度で含むセグメントを含む。本発明はまた、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメン
トに相補的な配列を含む。
【００３２】 本発明はまた、単離、精製、または富化された「ＥＳＴ関連核酸の位置的セグ
メントのフラグメント」を含む。本明細書において使用される「ＥＳＴ関連核酸
の位置的セグメントのフラグメント」という用語は、ＥＳＴ関連核酸の位置的セ
グメントの少なくとも１０、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５
、４０、５０、７５、１００、１５０、または２００個の連続するヌクレオチド
を含むフラグメントを指す。本発明はまた、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント
のフラグメントに相補的な配列を含む。
【００３３】 本発明はまた、単離または精製された「ＥＳＴ関連ポリペプチド」を含む。本
明細書において使用される「ＥＳＴ関連ポリペプチド」という用語は、ＥＳＴ関
連核酸によってコードされるポリペプチドを意味し、配列番号８１２〜１５９９
のポリペプチドを含む。
【００３４】 本発明はまた、単離または精製された「ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメン
ト」を含む。本明細書において使用される「ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメ
ント」という用語は、ＥＳＴ関連ポリペプチドの少なくとも５、１０、１５、２
０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、または１５０個の連続する
アミノ酸を、これらの長さのフラグメントが、言及されている特定のＥＳＴ関連
ポリペプチドの長さと一致する程度で含むフラグメントを意味する。特に、ＥＳ
Ｔ関連核酸のフラグメントは、「表ＩＩに記載のポリヌクレオチド」、「表ＩＩ
Ｉに記載のポリヌクレオチド」、および「表ＩＶに記載のポリヌクレオチド」に
よってコードされるポリペプチドを指す。
【００３５】 本発明はまた、単離または精製された「ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置的セグ
メント」を含む。本明細書において使用される「ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置
的セグメント」という用語は、ＥＳＴ関連ポリペプチドのアミノ酸残基１〜２５
、２６〜５０、５１〜７５、７６〜１００、１０１〜１２５、１２６〜１５０、
１５１〜１７５、１７６〜２００、または２０１Ｃ〜末端アミノ酸を、そのよう
なアミノ酸残基が、言及されている特定のＥＳＴ関連ポリペプチドの長さと一致
する程度で含むポリペプチドを含む。「ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置的セグメ
ント」という用語はまた、ＥＳＴ関連ポリペプチドのアミノ酸残基１〜５０、５
１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００または２０１Ｃ〜末端アミノ酸を
、そのようなアミノ酸残基が、言及されている特定のＥＳＴ関連ポリペプチドの
長さと一致する程度で含むセグメントを含む。「ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置
的セグメント」という用語はまた、ＥＳＴ関連ポリペプチドのアミノ酸１〜１０
０または１０１〜２００を、そのようなアミノ酸残基が、言及されている特定の
ＥＳＴ関連ポリペプチドの長さと一致する程度で含むセグメントを含む。さらに
、「ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置的セグメント」という用語は、ＥＳＴ関連ポ
リペプチドのアミノ酸残基１〜２００または２０１〜Ｃ末端アミノ酸を、アミノ
酸残基が、言及されている特定のＥＳＴ関連ポリペプチドの長さと一致する程度
で含むセグメントを含む。
【００３６】 本発明はまた、単離または精製された「ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置的セグ
メントのフラグメント」を含む。本明細書において使用される「ＥＳＴ関連ポリ
ペプチドの位置的セグメントのフラグメント」という用語は、ＥＳＴ関連ポリペ
プチドの位置的セグメントの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３
５、４０、５０、７５、１００、または１５０個の連続するアミノ酸を、これら
の長さのフラグメントが、言及されている特定のＥＳＴ関連ポリペプチドの長さ
と一致する程度で含むフラグメントを意味する。
【００３７】 本発明はまた、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメ
ント、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置的セグメント、またはＥＳＴ関連ポリペプ
チドの位置的セグメントのフラグメントを特異的に認識する抗体を含む。配列番
号１５５４〜１５８０のような分泌タンパク質の場合では、シグナルペプチドが
切断されるときに精製される成熟タンパク質を特異的に認識する抗体を、以下に
記載のように取得することもできる。同様に、配列番号８１２〜１５１６または
１５５４〜１５８０のシグナルペプチドを特異的に認識する抗体を得ることもで
きる。
【００３８】 一部の実施形態では、分泌タンパク質の場合、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核
酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、または核酸の位置的セ
グメントのフラグメントは、シグナル配列を含む。他の実施形態では、ＥＳＴ関
連核酸、またはＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメ
ント、または核酸の位置的セグメントのフラグメントは、タンパク質に対する全
コード配列あるいは、分泌タンパク質の場合、成熟タンパク質（すなわち、シグ
ナルペプチドの切断時に生成されるタンパク質）の全コード配列を含み得る。さ
らに、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置
的セグメント、または核酸の位置的セグメントのフラグメントは、遺伝子発現の
量、局在化、または発達段階を制御する翻訳開始部位の上流または停止コドンの
下流の調節領域を含んでもよい。
【００３９】 上記のように、両分泌および非分泌ヒトタンパク質は治療上重要であり得る。
従って、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位
置的セグメント、または核酸の位置的セグメントのフラグメントから発現される
タンパク質は、種々の様々なヒトの症状の治療または制御する際に有用となり得
る。
【００４０】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セ
グメント、または核酸の位置的セグメントのフラグメントは、個体を識別するた
めの法医学的手法または遺伝子の異常な発現による遺伝病を有する個体を識別す
るための診断的手法にも使用することができる。また、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ
関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、または核酸の位
置的セグメントのフラグメントは、高分解能ヒト染色体マップを構築するために
有用である。
【００４１】 本発明はまた、目的のタンパク質の分泌を指令することができる分泌ベクター
に関する。このようなベクターは、身体内の別の部位に送達しようとする遺伝子
産物をある細胞内で産生することが望まれる遺伝子治療法に使用することができ
る。分泌ベクターは所望されるタンパク質の精製を容易にすることもできる。
【００４２】 本発明はまた、挿入された遺伝子を望ましい場所で、望ましい時期に、または
望ましい量で発現させることを指令することができる発現ベクターに関する。こ
のようなベクターは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ
関連核酸の位置的セグメント、または核酸の位置的セグメントのフラグメントの
上流の配列、例えばプロモーターまたは上流調節配列を含んでもよい。
【００４３】 本発明はまた、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む、キメラ
ポリペプチドを作製するための融合ベクターを含む。そのようなベクターは、キ
メラポリペプチドの細胞局在性を決定するか、またはキメラペプチドを単離、精
製、もしくは富化するのに有用である。
【００４４】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セ
グメント、または核酸の位置的セグメントのフラグメントは、遺伝病を管理また
は治療する遺伝子治療に使用することもできる。分泌タンパク質の場合、シグナ
ルペプチドを異種タンパク質に融合させて、それらの細胞外分泌を指令すること
もできる。
【００４５】 非アラインメントの５’ＥＳＴ（単体ともいう）、およびコンセンサスコンテ
ィグ化５’ＥＳＴを取得するために、アラインメントされた５’ＥＳＴの配列を
含むインサートを有するブルースクリプト（Bluescript）プラスミドを含有する
細菌クローンは、内部名で本発明者らの実験室に４％（ｖ／ｖ）グリセロールに
入れ、-８０℃で現在保存されている。非アラインメントの５’ＥＳＴは、表Ｖ
のリストに記載の単一の組織から得られる単一のＥＳＴを含むものである。イン
サートは、適当なクローンを好適な培地で増殖させることによって保存物から回
収することができる。次いで、アルカリ溶解ミニプレップまたは大規模アルカリ
溶解プラスミド単離法などの当業者に周知のプラスミド単離法を使用してブルー
スクリプト（Bluescript）ＤＮＡを単離することができる。所望により、プラス
ミドＤＮＡを塩化セシウム勾配での遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィーま
たは陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに富化してもよい。次いで、
これらの手法を使用して得られるプラスミドＤＮＡを当業者に周知の標準的なク
ローニング技法を使用して操作することができる。または、挿入されたＥＳＴ関
連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、
または核酸の位置的セグメントのフラグメントの両端で設計されたプライマーを
用いてＰＣＲを実施することができる。次いで、当業者に周知の標準的なクロー
ニング技法を使用して、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳ
Ｔ関連核酸の位置的セグメント、または核酸の位置的セグメントのフラグメント
に対応するＰＣＲ産物を操作することができる。
【００４６】 本発明の１つの実施形態は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜
１６２２の配列ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２
２の配列に相補的な配列から成る群より選択される配列を含む精製された核酸で
ある。
【００４７】 本発明の別の実施形態は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１
６２２の配列ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２
の配列に相補的な配列から成る群より選択される配列の少なくとも１０、１２、
１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、１００
、２００、３００、５００、または１０００個の連続するヌクレオチドを、これ
らの長さのフラグメントが特定の配列と一致する程度で含む精製された核酸であ
る。
【００４８】 本発明のさらなる実施形態は、配列番号２４〜８１１の配列から成る群より選
択される配列のコード配列を含む精製された核酸である。
【００４９】 本発明のさらなる別の実施形態は、配列番号７６６〜７９２の配列から成る群
より選択される配列の全コード配列を含む精製された核酸であって、ここで、前
記全コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列および成熟タンパク質を
コードする配列を含む。
【００５０】 本発明のさらなる別の実施形態は、成熟タンパク質をコードする配列番号７６
６〜７９２の配列から成る群より選択される配列の連続スパンを含む精製された
核酸である。
【００５１】 本発明の別の実施形態は、シグナルペプチドをコードする配列番号２４〜７２
８および７６６〜７９２の配列から成る群より選択される配列の連続スパンを含
む精製された核酸である。
【００５２】 本発明の別の実施形態は、配列番号８１２〜１５９９の配列から成る群より選
択される配列を含むポリペプチドをコードする精製された核酸である。
【００５３】 本発明の別の実施形態は、配列番号１５５４〜１５８０の配列から成る群より
選択される配列を含むポリペプチドをコードする精製された核酸である。
【００５４】 本発明の別の実施形態は、配列番号１５５４〜１５８０の配列から成る群より
選択される配列に含まれる成熟タンパク質を含むポリペプチドをコードする精製
された核酸である。
【００５５】 本発明の別の実施形態は、配列番号８１２〜１５１６および１５５４〜１５８
０の配列から成る群より選択される配列に含まれるシグナルペプチドを含むポリ
ペプチドをコードする精製された核酸である。
【００５６】 本発明の別の実施形態は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１
６２２の配列ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２
の配列に相補的な配列から成る群より選択される配列にストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする、長さが少なくとも３０、３５、４０、５０、７５、１
００、２００、３００、５００、または１０００個のヌクレオチドの精製された
核酸である。
【００５７】 本発明の別の実施形態は、配列番号８１２〜１５９９の配列から成る群より選
択される配列を含む、精製または単離されたポリペプチドである。
【００５８】 本発明の別の実施形態は、配列番号１５５４〜１５８０から成る群より選択さ
れる配列を含む、精製または単離されたポリペプチドである。
【００５９】 本発明の別の実施形態は、配列番号１５５４〜１５８０から成る群より選択さ
れるポリペプチドの成熟タンパク質を含む、精製または単離されたポリペプチド
である。
【００６０】 本発明の別の実施形態は、配列番号８１２〜１５１６および１５５４〜１５８
０のポリペプチドから成る群より選択される配列のシグナルペプチドを含む、精
製または単離されたポリペプチドである。
【００６１】 本発明の別の実施形態は、配列番号８１２〜１５９９の配列から成る群より選
択される配列の少なくとも１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、
３５、４０、５０、７５、１００、２００、３００、５００、または１０００個
の連続するアミノ酸を、これらの長さのフラグメントが特定の配列と一致する程
度で含む精製または単離されたポリペプチドである。
【００６２】 本発明の別の実施形態は、ｃＤＮＡを作製する方法である。この方法は、ヒト
細胞由来のｍＲＮＡ分子の集合体と、配列番号２４〜８１１および配列番号１６
００〜１６２２の配列に相補的な配列から成る群より選択される配列の少なくと
も１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、または５０
個の連続するヌクレオチドを含むプライマーとを接触させ、前記プライマーを前
記タンパク質をコードする前記集合体中のｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、前記
ハイブリダイズしたプライマーを逆転写させて前記ｍＲＮＡから第１のｃＤＮＡ
鎖を作製し、第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を作製し、得られた
第１のｃＤＮＡ鎖および前記第２のｃＤＮＡ鎖を含み、前記タンパク質をコード
するｃＤＮＡを単離する、各ステップを含んで成る。
【００６３】 本発明の別の実施形態は、上記段落に記載する方法によって得られる、精製さ
れたｃＤＮＡである。
【００６４】 この実施形態の１つの態様では、前記ｃＤＮＡはヒトポリペプチドの少なくと
も一部をコードする。
【００６５】 本発明の別の実施形態は、ｃＤＮＡを作製する方法である。この方法は、ｃＤ
ＮＡと、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の配列から成
る群より選択される配列を含むｃＤＮＡを取得し、配列番号２４〜８１１および
配列番号１６００〜１６２２ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６
００〜１６２２の配列に相補的な配列から成る群より選択される配列の少なくと
も１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、または５０
個の連続するヌクレオチドを含む検出可能なプローブとを、前記プローブが前記
ｃＤＮＡにハイブリダイズすることを可能にする条件下で接触させ、前記検出可
能なプローブにハイブリダイズするｃＤＮＡを同定し、前記プローブにハイブリ
ダイズする前記ｃＤＮＡを単離する、各ステップを含んで成る。
【００６６】 本発明の別の実施形態は、上記段落に記載する方法によって得られる精製され
たｃＤＮＡである。
【００６７】 この実施形態の１つの態様では、該ｃＤＮＡはヒトポリペプチドの少なくとも
一部をコードする。
【００６８】 本発明の別の実施形態は、ｃＤＮＡを作製する方法である。この方法は、ヒト
細胞由来のｍＲＮＡ分子の集合体と前記ｍＲＮＡのポリＡテイルにハイブリダイ
ズし得る第１のプライマーとを接触させ、前記第１のプライマーを前記ポリＡテ
イルにハイブリダイズさせ、前記ｍＲＮＡを逆転写して第１のｃＤＮＡ鎖を作製
し、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の配列から成る群
より選択される配列の少なくとも１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、
３０、３５、４０、または５０個の連続するヌクレオチドを含む少なくとも１つ
のプライマーを使用して、前記第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を
作製し、そして得られた第１のｃＤＮＡ鎖と前記第２のｃＤＮＡ鎖を含むｃＤＮ
Ａを単離する、各ステップを含んで成る。
【００６９】 本発明の別の実施形態は、上記段落に記載する方法によって得られる精製され
たｃＤＮＡである。
【００７０】 この実施形態の１つの態様では、前記ｃＤＮＡはヒトポリペプチドの少なくと
も一部をコードする。
【００７１】 上記方法の別の態様では、前記第２のｃＤＮＡ鎖は、前記第１のｃＤＮＡ鎖と
第１のプライマー対（前記第１のプライマー対は、配列番号２４〜８１１および
配列番号１６００〜１６２２から成る群より選択される配列の少なくとも１２、
１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、または５０個の連続
するヌクレオチドを含む第２のプライマーならびに前記第１のプライマーの配列
内に全配列が含まれる第３のプライマーを含む）とを接触させること、前記第２
および第３のプライマーにより第１のポリメラーゼ連鎖反応を行い、第１のＰＣ
Ｒ産物を生成すること、前記第１のＰＣＲ産物と、第２のプライマー対（前記第
２のプライマー対は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２
から成る群より選択される前記配列の少なくとも１２、１５、１８、２０、２３
、２５、２８、３０、３５、４０、または５０個の連続するヌクレオチドを含む
第４のプライマーならびに第５のプライマーを含む）とを接触させることであっ
て、ただし、前記第４および第５のプライマーは前記第１のＰＣＲ産物内の配列
にハイブリダイズするものであること、および第２のポリメラーゼ連鎖反応を行
い、それによって第２のＰＣＲ産物を生成すること、によって作製される。
【００７２】 この実施形態の１つの態様は、上記段落に記載する方法によって得られる精製
されたｃＤＮＡである。
【００７３】 この実施形態の別の態様では、前記ｃＤＮＡはヒトポリペプチドの少なくとも
一部をコードする。
【００７４】 あるいは、前記第２のｃＤＮＡ鎖は、前記第１のｃＤＮＡ鎖と、配列番号２４
〜８１１および配列番号１６００〜１６２２から成る群より選択される配列の少
なくとも１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、また
は５０個の連続するヌクレオチドを含む第２のプライマーとを接触させること、
前記第２のプライマーを前記第１鎖ｃＤＮＡにハイブリダイズさせること、およ
び前記ハイブリダイズした第２のプライマーを伸長して、前記第２のｃＤＮＡ鎖
を生成すること、によって作製され得る。
【００７５】 上記の実施形態の１つの態様は、上記段落に記載する方法によって得られる精
製されたｃＤＮＡである。
【００７６】 この実施形態のさらなる態様では、前記ｃＤＮＡはヒトポリペプチドの少なく
とも一部をコードする。
【００７７】 本発明の別の実施形態は、ポリペプチドを作製する方法である。この方法は、
配列番号２４〜８１１から成る群より選択される配列を含む核酸によってコード
されるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、または配列番号２４〜８１１から成
る群より選択される配列によってコードされるポリペプチドの少なくとも６、８
、１０、１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、また
は５０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡを取得し
、前記ｃＤＮＡを、それがプロモーターに機能し得る形で連結されるように発現
ベクターに挿入し、前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより前記宿主
細胞に前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を産生させ、そして前記タン
パク質を単離する、各ステップを含んで成る。
【００７８】 この実施形態の別の態様は、上記段落に記載する方法によって得られる単離さ
れたタンパク質である。
【００７９】 本発明の別の実施形態は、プロモーターＤＮＡを得る方法である。この方法は
、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の配列ならびに配列
番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の配列に相補的な配列から
成る群より選択される配列を含む核酸の上流に位置するゲノムＤＮＡを取得し、
前記ゲノムＤＮＡをスクリーニングして、転写開始を指令し得るプロモーターを
同定し、そして前記同定されたプロモーターを含む前記ＤＮＡを単離する、各ス
テップを含んで成る。
【００８０】 この実施形態の1つの態様では、前記取得ステップは、配列番号２４〜８１１
および配列番号１６００〜１６２２ならびに配列番号２４〜８１１および配列番
号１６００〜１６２２に相補的な配列から成る群より選択される配列を含むゲノ
ムＤＮＡからの歩行を含む。この実施形態の別の態様では、前記スクリーニング
ステップは、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２ならびに
配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２に相補的な配列から成
る群より選択される配列の上流に位置するゲノムＤＮＡをプロモーターレポータ
ーベクターに挿入することを含む。例えば、前記スクリーニングステップは、転
写因子結合部位かまたは転写開始部位である、配列番号２４〜８１１および配列
番号１６００〜１６２２ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６００
〜１６２２に相補的な配列から成る群より選択される配列の上流に位置するゲノ
ムＤＮＡ中のモチーフを同定することを含み得る。
【００８１】 本発明の別の実施形態は、上記段落に記載する方法によって得られる、単離さ
れたプロモーターである。
【００８２】 本発明の別の実施形態は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１
６２２、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の配列に相補
的な配列、ならびに前記配列の少なくとも１２、１５、１８、２０、２３、２５
、２８、３０、３５、４０、５０、または１００個の連続するヌクレオチドを含
むフラグメントから成る群より選択される少なくとも１つの配列を、個別のＥＳ
Ｔまたは長さが少なくとも１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、
３５、４０、５０または１００個ヌクレオチドのそのフラグメントのアレイに加
えることである。この実施形態の一部の態様では、前記アレイは、配列番号２４
〜８１１および配列番号１６００〜１６２２、配列番号２４〜８１１および配列
番号１６００〜１６２２の配列に相補的な配列、ならびに前記配列の少なくとも
１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、または５０個
の連続するヌクレオチドを含むフラグメントから成る群より選択される少なくと
も２つの配列を含む。この実施形態の別の態様では、前記アレイは、配列番号２
４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２、配列番号２４〜８１１および配
列番号１６００〜１６２２の配列に相補的な配列、ならびに前記配列の少なくと
も１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３５、４０、５０、また
は１００個の連続するヌクレオチドを含むフラグメントから成る群より選択され
る少なくとも１、３、５、１０、１５、または２０の配列を含む。
【００８３】 本発明の別の実施形態は、富化された組換え核酸の集団であって、前記組換え
核酸はインサート核酸およびバックボーン核酸を含み、ここで、前記集団中の少
なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、５％、１
０％、または２０％の前記インサート核酸は、配列番号２４〜８１１および配列
番号１６００〜１６２２ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６００
〜１６２２に相補的な配列から成る群より選択される配列から成る。
【００８４】 本発明の別の実施形態は、配列番号８１２〜１５９９から成る群より選択され
る配列を含むポリペプチドに特異的に結合し得る、精製または単離された抗体で
ある。
【００８５】 本発明の別の実施形態は、配列番号８１２〜１５９９から成る群より選択され
る配列の少なくとも６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８
、３０、３５、４０、または５０個の連続するアミノ酸を含むポリペプチドに特
異的に結合し得る、精製または単離された抗体である。
【００８６】 本発明のさらに別の実施形態は、配列番号８１２〜１５９９のうち、いずれか
の少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２３、２５、２８、３０、３
５、４０、または５０個のアミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドのエピトー
プ含有フラグメントに選択的に結合し得る抗体組成物である。この組成物では、
前記抗体はポリクローナルかまたはモノクローナルである。
【００８７】 本発明の別の実施形態は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１
６２２の核酸コード、ならびに配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコード
から成る群より選択される配列を記憶して有するコンピュータ読取可能媒体であ
る。
【００８８】 本発明の別の実施形態は、プロセッサおよびデータ記憶装置を含むコンピュー
タシステムである。このシステムでは、データ記憶装置は、配列番号２４〜８１
１および配列番号１６００〜１６２２の核酸コードならびに配列番号８１２〜１
５９９のポリペプチドコードから成る群より選択される配列を記憶して有する。
この実施形態の１つの態様では、前記コンピュータシステムは、配列コンペアラ
および参照配列を記憶して有するデータ記憶装置をさらに含む。例えば、前記配
列コンペアラは、多型性を表示するコンピュータプログラムを含んでもよい。こ
の実施形態の別の態様では、前記コンピュータシステムは、前記配列の特徴を同
定するアイデンティファイアをさらに含む。
【００８９】 本発明の別の実施形態は、第１の配列と参照配列とを比較する方法である。こ
の方法では、前記第１の配列は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００
〜１６２２の核酸コードならびに配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコー
ドから成る群より選択されるものであり、配列を比較するコンピュータプログラ
ムを使用することにより、前記第１の配列および前記参照配列を読み取り、そし
て前記コンピュータプログラムによって、前記第１の配列と前記参照配列との間
の差異を判定する、各ステップを含んで成る。この実施形態の一部の態様では、
前記第１の配列と前記参照配列との間の差異を判定する前記ステップは多型性を
同定することを含む。
【００９０】 本発明の別の実施形態は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１
６２２の核酸コードならびに配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードか
ら成る群より選択される配列の特徴を同定する方法である。この方法は、配列の
特徴を同定するコンピュータプログラムを使用することにより、前記配列を読み
取り、そして前記コンピュータプログラムによって、前記配列の特徴を同定する
、各ステップを含んで成る。
【００９１】 本発明の別の実施形態は、上記の核酸のいずれか１つに従う核酸を含むベクタ
ーである。
【００９２】 本発明の別の実施形態は、上記ベクターを含有する宿主細胞である。
【００９３】 本発明の別の実施形態は、上記の核酸のいずれかを作製する方法である。この
方法は、前記核酸を、それが各宿主細胞において複数のコピーで存在するように
宿主細胞に導入し、そして前記宿主細胞から前記核酸を単離する、各ステップを
含んで成る。
【００９４】 本発明の別の実施形態は、上記核酸のいずれかの核酸を作製する方法である。
この方法は、前記核酸中のヌクレオチドを順次連結するステップを含んで成る。
【００９５】 本発明の別の実施形態は、上記のポリペプチドのいずれかを作製する方法であ
る。この方法では、前記ポリペプチドは１５０アミノ酸以下の長さであり、この
方法は、前記ポリペプチドのアミノ酸を順次連結するステップを含んで成る。
【００９６】 本発明の別の実施形態は、上記のポリペプチドのいずれかを作製する方法であ
る。この方法は、前記ポリペプチドは１２０アミノ酸以下の長さであり、前記ポ
リペプチドのアミノ酸を順次連結するステップを含んで成る。
【００９７】 （好適な実施形態の詳細な説明） （Ｉ．対応するｍＲＮＡの５’末端を含むｃＤＮＡライブラリーからの５’ＥＳ
Ｔの取得） 対応するｍＲＮＡの５’末端を含むｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーから
本発明の５’ＥＳＴを得た。そのようなｃＤＮＡを得るために使用される一般的
方法を実施例１〜５に記載する。
【００９８】 実施例１ （ｍＲＮＡの調製） ２９の異なる組織に由来するヒト全ＲＮＡまたはポリＡ+ＲＮＡは、それぞれ
ＬＡＢＩＭＯおよびＣＬＯＮＴＥＣＨから購入し、下記の通りに、４４のｃＤＮ
Ａライブラリーを作製するために使用した。購入したＲＮＡは、酸性グアニジウ
ムチオシアネート-フェノール−クロロホルム抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｉｓｋｉ
および Ｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １
６２：１５６−１５９， １９８７））を使用して、細胞または組織から単離し
ておいたものである。リボソームＲＮＡを除去するために、ＡｖｉｖおよびＬｅ
ｄｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：１
４０８−１４１２， １９７２に記載の通りに、オリゴｄＴクロマトグラフィー
に２回通過させることにより、ポリＡ+ＲＮＡを全ＲＮＡ（ＬＡＢＩＭＯ）から
単離した。
【００９９】 ポリＡ＋ＲＮＡの品質および完全性を調べた。グロビンプローブとハイブリダ
イズさせたノーザンブロットを使用して、ｍＲＮＡが分解されてないことを確認
した。リボソーム配列によるポリＡ+ｍＲＮＡの汚染を、ノーザンブロット法お
よび２８Ｓ ｒＲＮＡの配列に由来するプローブを使用して調べた。ｒＲＮＡが
５％未満であるｍＲＮＡの調製物をライブラリー構築に使用した。外因性配列（
原核生物または菌類）により汚染されたＲＮＡを用いてライブラリーを構築しな
いように、ＰＣＲを使用して、細菌の１６Ｓリボソーム配列の存在または高度に
発現される２種の菌類ｍＲＮＡの配列の存在を調べた。
【０１００】 実施例２ （完全な５’末端を有するｍＲＮＡを取得する方法） 上記の通り、様々な組織からｍＲＮＡを調製した後、完全な５’末端を有する
ｍＲＮＡの選択および上記ｍＲＮＡの５’末端へのオリゴヌクレオチドタグの特
異的結合を、化学的方法もしくは酵素的方法を使用して実施する。両技術とも、
完全なｍＲＮＡの５’末端の特徴を成し、かつ一般に７位にて一度メチル化され
たグアノシンを含む、「キャップ」構造の存在を利用する。該化学的方法を図１
に例示する。
【０１０１】 化学的修飾方法は、３’末端のリボースの２’，３’−シスジオールの任意の
除去、ｍＲＮＡの５’末端のキャップに連結されたリボースの２’，３’，−シ
スジオールのジアルデヒドへの酸化、および上記の得られたジアルデヒドの誘導
されたオリゴヌクレオチドタグへのカップリングを含む。完全な５’末端を有す
るｍＲＮＡを得るための化学的アプローチに関するさらなる詳細は、１９９６年
１１月７日に公告された国際出願第ＷＯ９６／３４９８１号に開示されている。
【０１０２】 オリゴヌクレオチドタグを、完全な５’末端を有するｍＲＮＡの５’末端に連
結する酵素的方法は、キャップされていない不完全なｍＲＮＡの５’末端に存在
するリン酸基の除去、後続の、完全な５’末端を有するｍＲＮＡの脱キャップ、
および脱キャップされたｍＲＮＡの５’末端に存在するリン酸のオリゴヌクレオ
チドタグへの連結を含む。完全な５’末端を有するｍＲＮＡを得るための酵素的
アプローチに関するさらなる詳細は、Dumas Milne Edwards J.B.(Doctoral Thes
is of Paris VI University, Le clonage des ADNc complets: difficultes et
perspectives nouvelles. Apports pour l’etude de la regulation de l’ex
pression de la tryptophane hydroxylase de rat, 20 Dec. 1993)、EPO 625572
およびKatoら、Gene 150:243-250 (1994）に開示されている。
【０１０３】 化学的方法または酵素的方法のいずれの場合にも、オリゴヌクレオチドタグは
、その後のクローニング方法を容易にするための制限酵素部位（例えば、Ｅｃｏ
ＲＩ部位）を中に有する。オリゴヌクレオチドタグをｍＲＮＡに結合した後、オ
リゴヌクレオチドタグに相補的なプローブを使用したノーザンブロットを実施す
ることにより、ｍＲＮＡの完全性を試験した。
【０１０４】 実施例３ （完全な５’末端を有するｍＲＮＡテンプレートを使用するｃＤＮＡ合成） オリゴヌクレオチドタグに結合させたｍＲＮＡについては、逆転写酵素とプラ
イマープライマーとしてランダムノナマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡの合成を
実施した。ｃＤＮＡの内部ＥｃｏＲＩ部位をこの手法の後続のステップでの消化
から保護するために、メチル化ｄＣＴＰを第１鎖合成に使用した。アルカリ加水
分解によってＲＮＡを除去した後、残存するプライマーを除去するために、イソ
プロパノールを使用して、第１鎖ｃＤＮＡを沈殿させた。
【０１０５】 連結されたオリゴヌクレオチドの５’末端に対応するプライマーを使用して、
クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用いてｃＤＮＡの第２鎖を合成した。
好ましくは、プライマーは２０〜２５塩基の長さである。クローニングステップ
中に、ｃＤＮＡ内の内部ＥｃｏＲＩ部位を、消化から保護するために、第２鎖合
成にもメチル化ｄＣＴＰを使用した。
【０１０６】 実施例４ （完全な５’末端を有するｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡのＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ
へのクローニング） 第２鎖の合成後に、ｃＤＮＡの両端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）で平滑化し、ＥｃｏＲＩでｃＤＮＡを消化した。ｃＤＮＡ合成中にメチル
化ｄＣＴＰを使用したため、タグ中に存在するＥｃｏＲＩ部位は、唯一のヘミメ
チル化部位であり、従って、ＥｃｏＲＩ消化を受けやすい唯一の部位であった。 次いで、排除クロマトグラフィー（ＡｃＡ， Ｂｉｏｓｅｐｒａ）を使用して
ｃＤＮＡをサイズ分画し、１５０ｂｐを超えるｃＤＮＡに対応する画分をプール
し、エタノール沈殿した。このｃＤＮＡを、ファージミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ
ｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ末端に特定方
向にクローニングした。連結混合物を細菌にエレクトロポレーションで導入し、
適当な抗生物質選択下で増殖させた。
【０１０７】 実施例５ （オリゴヌクレオチドタグを結合させたクローンの選択） 次いで、結合したオリゴヌクレオチドタグを含むクローンを下記の通りに選択
した。上記の通りに作製した５’ＥＳＴライブラリーを含むプラスミドＤＮＡを
精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。下記の通りに、タグ付きクローンの陽性選択を実施
した。簡単に記載すると、この選択方法で、ファージＦ１の遺伝子ＩＩエンドヌ
クレアーゼを、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＴ７遺伝子６エキソヌクレアー
ゼなどのエキソヌクレアーゼと併用して（Changら、Gene 127:95-8, 1993）、プ
ラスミドＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに変換した。次いで、このようにして得られた１
本鎖ＤＮＡを、Ｆｒｙら、Biotechniques,13:124-131, 1992に記載の通りに、常
磁性ビーズを使用して精製した。この方法では、１本鎖ＤＮＡを、オリゴヌクレ
オチドタグの３’末端に対応する配列を有するビオチン化オリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズさせた。ストレプトアビジン被覆磁気ビーズと共にインキュベー
トすることにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むクロー
ンを捕捉し、次に磁気的に選択した。陽性クローンの捕捉後、磁気ビーズからプ
ラスミドＤＮＡを放出させ、Amersham Pharmacia Biotechから入手されるThermo
SequenaseなどのＤＮＡポリメチラーゼを使用して、２本鎖ＤＮＡに変換した。
次いで、２本鎖ＤＮＡを細菌にエレクトロポレーションで導入した。ドットブロ
ット分析を使用して、５’タグ付きオリゴヌクレオチドを有する陽性クローンの
割合は一般に９０〜９８%の範囲であると推定された。
【０１０８】 エレクトロポレーション後、ライブラリーを３８４マイクロタイタープレート
（ＭＴＰ）に並べた。ＭＴＰのコピーを今後使用するために保管した。次いで、
ライブラリーを９６ＭＴＰに移し、以下に記載のように配列決定した。
【０１０９】 実施例６ （選択したクローン中のインサートの配列決定） ＳＥＴＡ−ＡおよびＳＥＴＡ−Ｂプライマー（GensetSA）、AmpliTaqGold (Pe
rkin-Elmer)、dNTP(Boehringer)、Perkin-Elmer Corporationが推奨する緩衝液お
よびサイクル条件を使用し、ＰＥ−９６００サーモサイクラー（Perkin-Elmer,
Applied Biosystems Division, Foster City, CA）を用いて、ＰＣＲにより、プ
ラスミドインサートを先ず増幅した。
【０１１０】 次いで、自動ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７シークエンサー（Perkin-Elmer）を
使用して、ＰＣＲ生成物を配列決定した。ＰＥ９６００サーモサイクラーと標準
染料−プライマー化学およびThermoSequenase(Amersham Pharmacia Biotech）を
使用して、配列決定反応を実施した。使用したプライマーは、適宜、Ｔ７または
２１Ｍ１３（Ｇｅｎｓｅｔ ＳＡから入手可能）であった。このプライマーを、
ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡ染料で標識した。配列決定反応で使用
したｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰは、Boehringerから購入した。配列決定用緩衝液
、試薬濃度およびサイクル条件は、Amershamが推奨した通りであった。
【０１１１】 配列決定反応後、サンプルをエタノールで沈殿させ、ホルムアミドローディン
グ緩衝液に再懸濁し、標準４％アクリルアミドゲルに載せた。ＡＢＩ３７７シー
クエンサーで３０００Ｖにて２．５時間、電気泳動を実施し、配列データを収集
し、ABI Prism DNA Sequencing Analysis Software、バージョン２．１．２を使
用して分析した。
【０１１２】 実施例７ （完全な５’末端を有するｍＲＮＡから得られる伸長ｃＤＮＡライブラリーから
の５’ＥＳＴの取得） あるいは、他のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーから５
’ＥＳＴを単離することができる。そのようなｃＤＮＡライブラリーまたはゲノ
ムDNAライブラリーは、商業的ソースから得ることができるか、あるいは当業者
に知られている他の技術を使用して作製することができる。そのようなｃＤＮＡ
ライブラリーの構築の１例（全長ｃＤＮＡライブラリー）は以下に記載の通りで
ある。
【０１１３】 ポリＡ＋ＲＮＡを調製し、実施例１に記載のようにそれらの質を確認する。次
いで実施例２に記載のように、ポリＡ＋ＲＮＡの５’末端のキャップをオリゴヌ
クレオチドタグに特異的に連結する。オリゴヌクレオチドタグはＥｃｏＲＩなど
の制限部位を含有し、さらなるサブクローニング手順を容易にし得る。次いで、
ノーザンブロッティングを行い、連結されたオリゴヌクレオチドタグを有するｍ
ＲＮＡのサイズを確認し、ｍＲＮＡが実際にタグ付加されるように確実にする。
【０１１４】 ランダムノナマーをオリゴｄＴプライマーによって置き換えることを除いて、
上記の実施例３に記載のように、オリゴヌクレオチドタグに結合されたｍＲＮＡ
を対象に第１鎖の合成を順次行う。例えば、このオリゴｄＴプライマーは、組織
ごとに異なる４ヌクレオチドの内部タグを含有し得る。ｍＲＮＡの５’末端に付
着したオリゴヌクレオチドタグに含有されるプライマーを使用して第２鎖を合成
した後、得られる二本鎖全長ＤＮＡの平滑末端を粘着末端に改変し、サブクロー
ニングを容易にする。例えば、全長ｃＤＮＡの両末端を改変し、オリゴヌクレオ
チドタグのＥｃｏＲＩ部位および全長ｃＤＮＡの３’末端へのＨｉｎｄＩＩＩア
ダプター付加を使用して、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＥｃｏＲＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位へのサブクローニングを可能にすることができる。
【０１１５】 次いで、当業者に知られている技術を用いて、全長ｃＤＮＡを、それらのサイ
ズに従い、幾つかの画分に分離する。例えば、３または６の異なる画分を得るた
めに電気泳動分離を適用してもよい。ゲル抽出および精製後、ｃＤＮＡ画分をＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターなどの適切なベクターにサブクローニングし、コン
ピテント細菌に形質転換し、そして適切な抗生物質条件下で増殖させる。続いて
、実施例５に記載のように、タグ付加された全長ｃＤＮＡを含有するプラスミド
を陽性選択する。
【０１１６】 次いで、そのようなｃＤＮＡライブラリーから単離した全長ｃＤＮＡの５’末
端を実施例６に記載のように配列決定して、５’ＥＳＴを回収してもよい。
【０１１７】 （ＩＩ．単離された５’ＥＳＴのコンピュータ分析：ＳｉｇｎａｌＴａｇ（登録
商標）データベースの構築） 上記の通りに作製したｃＤＮＡライブラリーの配列データを、データベースに
転送し、そこで品質管理とバリデーションステップを実施した。Ｕｎｉｘシステ
ムを使用して作動する塩基コーラー（ｂａｓｅ−ｃａｌｌｅｒ）は、ピークの形
状、ピーク間分解能およびノイズレベルを考慮して、疑わしいピークを自動的に
信号旗で知らせた。塩基コーラーは、自動トリミングも実施した。疑わしいピー
クが４つより多い２５個以下の塩基の伸長部はいかなるものも信頼性がないとみ
なされ、破棄された。クローニングベクターまたは連結オリゴヌクレオチドに対
応する配列は、EST配列から自動的に除かれた。しかし、得られた５’ＥＳＴ配
列は、上述の配列に属する１〜５塩基を５’末端に含有してもよい。必要に応じ
て、これらはケースごとに容易に除去することができる。
【０１１８】 上記のように配列決定した後、５’ＥＳＴの配列を、以下に記載する通りに、
記憶と操作のためにデータベース入力した。目的の配列についてデータベース内
の５’ＥＳＴを検索する前に、目的以外のｍＲＮＡから誘導された５’ＥＳＴを
同定した。簡単に記載すると、このような望まれていない配列は３つのタイプの
ものと考えられる。第１に、内因性（リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ
、ミトコンドリアＲＮＡ）起源または外因性（原核生物ＲＮＡおよび菌類ＲＮＡ
）起源のいずれかの汚染物質を同定した。第２に、情報価値のない配列、すなわ
ち、不必要な配列、小さい配列および高度に縮重した配列を同定した。第３に、
反復配列（Ａｌｕ反復、Ｌ１反復、ＴＨＥ反復およびＭＥＲ反復、ＳＳＴＲ配列
またはサテライト反復、マイクロサテライト反復、またはテロメア反復）を同定
し、その後のステップでマスクした。
【０１１９】 この配列決定方法の精度ならびに上述の５’選択効率を決定するために、それ
ぞれ、実施例８および９に記載の分析を、内因性および外因性の混入の削除後お
よび反復のマスキング後に５’ＥＳＴに対して実施した。
【０１２０】 実施例８ （既知の配列との比較による配列決定精度の測定） 実施例６に記載の配列決定方法の精度をさらに決定するために、既知の配列か
ら誘導された５’ＥＳＴの配列を同定し、元の既知の配列と比較した。最初に、
本文書の提出時に入手可能な公的なヒトｍＲＮＡデータベースの収録事項と一致
するものを同定するために、両末端にある５塩基対より短い突出部を用いたＦＡ
ＳＴＡ分析を、５’ＥＳＴに実施した。次いで、既知のヒトｍＲＮＡと一致した
５’ＥＳＴを、起源を同じくするｍＲＮＡと再度アライメントをとり、ダイナミ
ックプログラミングを使用して、認識されるであろう「エラー」のリストに置換
、挿入および欠失を含めた。擬似クローニング部位が配列決定精度の分析に含ま
れることを避けるために、５’ＥＳＴ配列の最後の１０塩基に発生するエラーを
無視した。この分析で、データベースに収録された配列の精度は９９．５％を超
えることが明らかになった。
【０１２１】 実施例９ （５’ＥＳＴ選択の効率の決定） ５’ＥＳＴの起源である、ｍＲＮＡの５’末端に近い配列を含む５’ＥＳＴを
上記手法で単離した効率を決定するために、延長因子1サブユニットおよびフェ
リチン重鎖遺伝子から誘導された５’ＥＳＴの末端の配列を、これらの遺伝子に
ついて、既知のｃＤＮＡ配列と比較した。両遺伝子の転写開始部位は十分に特性
化されているため、これらを使用して、真正の転写開始部位を含むこれらの遺伝
子から誘導された５’ＥＳＴの百分率を決定することが可能である。両遺伝子と
も、得られた５’ＥＳＴの９５％より多くが、対応するｍＲＮＡの５’末端付近
の配列または５’末端上流の配列を実際に含んでいた。
【０１２２】 データベースのＥＳＴから５’ＥＳＴを単離する方法の信頼性の分析を拡大す
るために、比較用のＧｅｎＢａｎｋデータベースリリース９７から抽出したヒト
ｍＲＮＡ配列から成るデータベースを使用して、同様の分析を実施した。Ｇｅｎ
ｅＢａｎｋデータベースに含まれる、ｍＲＮＡから誘導された５’ＥＳＴの場合
、その８５％超が、既知の配列の５’末端に近い５’末端を有していた。Ｇｅｎ
Ｂａｎｋデータベースで入手できるｍＲＮＡ配列の一部は、ゲノムの配列から推
定されるため、これらの配列と一致する５’末端を、内部一致として数える。従
って、ここで使用される方法では、対応するｍＲＮＡの真正の５’末端を含むＥ
ＳＴの収率が過少評価される。
【０１２３】 実施例１０ （５’ＥＳＴライブラリーの新規性指数の算出） ５’ＥＳＴライブラリーの新規性を評価するために、以下の分析を行った。配
列決定された各５’ＥＳＴライブラリーについて、５’末端により、その配列を
クラスター化した。ライブラリーの各配列を他と比較し、該クラスター内に存在
する最長配列をグループの代表として使用した。次いで、新規性率（ＮＲ）を次
のように定義した：ＮＲ＝１００×（ライブラリー内に存在する新しい独特の配
列数／ライブラリーの配列総数）。一般に、新規性率は、５’ＥＳＴライブラリ
ーを得た組織に依存して、１０％〜４１％の範囲である。ライブラリーの大部分
について、新規性率が２０％に達するまで、５’ＥＳＴライブラリーのランダム
配列決定を遂行した。
【０１２４】 実施例１１ （コンセンサスコンティグ化（ｃｏｎｔｉｇａｔｅｄ）５’ＥＳＴの生成） 上記で作製したｃＤＮＡライブラリーは、同じｍＲＮＡから誘導された複数の
５’ＥＳＴを含んでいるため、重複５’ＥＳＴを集めて連続配列を作製すること
が可能である。下記の方法は、異なる遺伝子から誘導されたｍＲＮＡに関するコ
ンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ配列のみならず選択的スプライシングされた
ｍＲＮＡなどの、同一遺伝子から転写された異なるｍＲＮＡ、いわゆる変異体に
関するコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ配列を生成するために、複数の５’
ＥＳＴを効率的にアラインメントする方法について説明するものである。
【０１２５】 先ず、この配列の全セットを、所与の長さについて互いに完全な一致を示し、
かつ少数の異なる遺伝子から誘導された配列を含む小さいクラスターに分けた。
幾つかの５’ＥＳＴ配列、いわゆる単体は、他の配列と相同でなかったため、こ
の方法を使用するアラインメントは行わなかった。
【０１２６】 その後、専売のソフトウェアを使用して、各クラスター内の、所与の遺伝子の
全変異体を同定した。次いで、同じ変異体に属する５’ＥＳＴ配列をコンティグ
化し、各変異体について、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ配列を生成した
。続いて、全てのコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ配列を、それらを取得す
るために使用した個々の５’ＥＳＴ配列の全セットと比較した。
【０１２７】 必要に応じて、本明細書に記載のいずれかの方法を使用して、コンセンサスコ
ンティグ化５’ＥＳＴの配列に基づいたプローブにハイブリダイズする、ｃＤＮ
Ａライブラリーなどの、生物組織に由来する核酸サンプル中のクローンを同定し
、これらのクローンを配列決定することにより、コンセンサスコンティグ化５’
ＥＳＴ配列を検証することが可能である。
【０１２８】 内因性混入物および情報価値のない配列を含まず、反復のマスキング後の５’
ＥＳＴの選択されたセットにこのアラインメント方法を適用すると、コンセンサ
スコンティグ化５’ＥＳＴ配列または多くの個々の５’ＥＳＴを含むクラスター
化された遺伝子の変異体を生じた。次いで、アラインメントされなかった５’Ｅ
ＳＴ（すなわち、単体）およびコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴをすでに既
知の配列と比較し、ヒトｍＲＮＡ配列に一致するそれらの配列をさらなる分析か
ら除外した。
【０１２９】 実施例１２ （５’ＥＳＴのオープンリーディングフレームの同定） 続いて、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有するものを同定するた
めに、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴおよび５’ＥＳＴをスクリーニング
した。
【０１３０】 このようなオープンリーディングフレームは、単に、４５ヌクレオチドより長
く、かつＡＴＧコドンで開始する連続した核酸配列であると定義された。
【０１３１】 あるいは、先ず、核酸配列を幾つかの部分列に分割し、そのコーディング傾向
を、Ｎ量体頻度およびその変異体の評価などの、当業者に周知の１つの方法また
はいくつかの異なる方法（FickettおよびTung, Nucleic Acids Res;20:6441-50(
1992))またはAverage Mutual Information法（Grosseら、International Confer
ence on Intelligent Systems for Molecular Biology, Montreal, Canada. Jun
e 28-July 1, 1998)を使用して、別々に評価した。次いで、上記の技術により得
られた各スコアを、それらの分布極値により標準化し、次いで、ニューラルネッ
トワークを使用して、所与の部分列のコーディング確率を示す独特のスコアに融
合した。次いで、各部分列について得られたコーディング確率スコア、従って、
各リーディングフレームについて得られた確率スコアプロフィールを、その配列
上に存在する開始コドンに連結した。ＡＴＧコドンで開始する核酸配列と定義さ
れた、各オープンリーディングフレームについて、ＯＲＦスコアを決定した。こ
のスコアは、局所的に高いスコア値を否定的に解釈し、持続的に高いスコア値を
肯定的に解釈する機能によって修正された、正確なリーディングフレーム内で考
えられるＯＲＦに対応する各部分列についてコンピュータ処理された確率スコア
の合計であることが好ましい。最高のスコアを有する最も有望なＯＲＦを選択し
た。
【０１３２】 一部の実施形態において、本明細書に記載の「不完全なＯＲＦ」、すなわち、
開始コドンは同定されているが、停止コドンが同定されていないオープンリーデ
ィングフレームをコードする核酸配列が得られた。
【０１３３】 他の実施形態において、本明細書で使用される、「完全なＯＲＦ」核酸配列、
すなわち、開始コドンおよび停止コドンが同定されているオープンリーディング
フレームコードする核酸配列が得られる。
【０１３４】 好ましい実施形態において、少なくとも５０アミノ酸のポリペプチドをコード
するオープンリーディングフレームが得られた。
【０１３５】 選択されたＯＲＦがポリペプチドを実際にコードしていることを確認するため
に、本明細書に記載の技術のいずれか、特に実施例１９および２０に記載の技術
を使用し、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたは５’ＥＳＴを使用して伸
長ｃＤＮＡを得ることができる。次いで、取得したこのような伸長ｃＤＮＡを、
本明細書に記載の技術のいずれかを使用して、最も有望なオープンリーディング
フレームについてスクリーニングすることが可能である。次いで、伸長ｃＤＮＡ
によりコードされるＯＲＦが、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたは５’
ＥＳＴによりコードされるものと基本的に同じであるかどうかを決定するため、
本明細書に記載のアルゴリズムのいずれかおよびパラメータを使用して、コンセ
ンサスコンティグ化化５’ＥＳＴまたは５’ＥＳＴによりコードされるＯＲＦの
アミノ酸配列を、伸長ｃＤＮＡによりコードされるＯＲＦのアミノ酸配列と比較
することが可能である。
【０１３６】 あるいは、選択されたＯＲＦがポリペプチドを実際にコードしていることを確
認するために、本明細書に記載の技術のいずれか、特に、実施例１９および２０
に記載の技術を使用し、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたは５’ＥＳＴ
を使用して、伸長ｃＤＮＡを得ることができる。次いで、このような伸長ｃＤＮ
Ａを、適当な発現ベクターに挿入し、本明細書に記載の伸長ｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチドを発現させるのに使用することができる。本明細書に記載
の通りに、発現したポリペプチドを、単離、精製、あるいは富化することが可能
である。次いで、当業者に周知の幾つかの方法を使用しては、発現したポリペプ
チドが、本明細書で予期されるポリペプチドと呼ばれる、選択されたＯＲＦによ
り実際にコードされるものであるかどうかを決定することができる。このような
方法は、そのアミノ酸配列、そのサイズまたはその電荷を含むがその限りではな
い、発現したポリペプチドの予測し得る特徴の決定、およびこれらの特徴と、予
期されるポリペプチドに関して予測された特徴との比較に基づく。以下のパラグ
ラフに、このような方法の例を示す。
【０１３７】 これらの方法の１つは、発現したポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一
部を、当業者に周知のいずれかの技術を使用して決定することにある。例えば、
Ｎ末端残基が共有結合で標識されているポリペプチドの酸加水分解のＳａｎｇｅ
ｒの技術に基づく技術か、またはＮ末端残基が逐次標識され、目的のポリペプチ
ドから切断される、ポリペプチドのＥｄｍａｎ分解に基づく技術のいずれか一方
を使用して、アミノ末端の残基を決定することが可能である。次いで、その中に
記載されているいずれかのアルゴリズムおよびパラメータを使用して、発現した
ポリペプチドのアミノ酸配列を、予期されるポリペプチドについて予測されるア
ミノ酸配列と比較してもよい。
【０１３８】 あるいは、クーマシーブルーまたは銀染色などの当業者に周知の技術を使用し
て、発現したポリペプチドのサイズを決定し、続いて、予期されるポリペプチド
について予測されるサイズと比較してもよい。一般に、発現したポリペプチドに
対応するバンドは、伸長cDNAのオープンリーディングフレーム内のアミノ酸の数
に基づいて予期されるものに近い移動度を有する。しかし、バンドは、グリコシ
ル化、ユビキチン化、または酵素的切断などの、修飾の結果として予期されるも
のとは異なる移動度を有する可能性がある。
【０１３９】 あるいは、実施例３４に記載の通り、予期されるポリペプチドに対する特異的
抗体または抗ペプチドを生成し、これを使用して、発現したポリペプチドに対す
る免疫ブロット研究または免疫沈降研究を実施することが可能である。関連のな
いポリペプチドをコードする発現ベクターを含む細胞から得たサンプルに存在し
ないバンドが、伸長ｃＤＮＡを含む発現ベクターを含む細胞から得たサンプルに
存在することは、予期されるポリペプチドまたはその一部が発現していることを
示す。一般に、発現したポリペプチドに対応するバンドは、伸長ｃＤＮＡのオー
プンリーディングフレーム内のアミノ酸の数に基づいて予期されるものに近い移
動度を有する。しかし、バンドは、グリコシル化、ユビキチン化、または酵素的
切断などの、修飾の結果として予期されるものとは異なる移動度を有する可能性
がある。
【０１４０】 実施例１３ （５’ＥＳＴにおける潜在的シグナル配列の同定） 次いで、潜在的シグナルモチーフを同定するために、Von Heijne(Nucleic Aci
ds Res. 14:4683-4690,1986）に開示されている手順に一部修正を加えたものを
使用して、ＯＲＦをコードすることが確認された５’ＥＳＴまたはコンセンサス
コンティグ化５’ＥＳＴを検索した。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅシグナルペプチド同
定マトリックスで少なくとも３．５のスコアを有する１５アミノ酸長ストレッチ
をコードしている配列を、シグナル配列を有すると考えた。既知のヒトｍＲＮＡ
またはＥＳＴ配列と一致し、かつ既知の５’末端の下流に、好ましくは２０ヌク
レオチドよりも下流に５’末端を有する核酸配列を、さらなる分析から除外した
。シグナル配列を中に有する残りの核酸を、ＳｉｇｎａｌＴａｇ（登録商標）と
呼ばれるデータベースに含めた。
【０１４１】 実施例１４ （５’ＥＳＴにおける潜在的シグナル配列の同定精度の確認） 全てのヒトＳｗｉｓｓＰｒｏｔタンパク質のＮ末端に位置する４３のアミノ酸
に本方法を適用することによって、シグナルペプチドをコードしているシグナル
配列を同定するための上記手順の精度を評価した。各タンパク質のコンピュータ
処理したＶｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアを、分泌タンパク質または非分泌タンパク
質であるとして、タンパク質の既知の特性化と比較した。この方法で、３．５よ
り高いスコアを有する（偽陽性）非分泌タンパク質数および３．５より低いスコ
アを有する（偽陰性）分泌タンパク質数を算出することができた。
【０１４２】 上述の分析結果を使用して、ｍＲＮＡの５’領域によりコードされるペプチド
が、実際に、そのＶｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアに基づいた真正のシグナルペプチ
ドである確率を、ヒトタンパク質の１０％が分泌されるという仮説またはヒトタ
ンパク質の２０％が分泌されるという仮説のいずれかに基づいて算出した。この
分析結果を、図２に示す。
【０１４３】 上述の分泌タンパク質同定方法を使用して、分泌されることが判明している以
下のポリペプチドの５’ＥＳＴを取得した：ヒトグルカゴン、γインターフェロ
ン誘導性モノカイン前駆体、分泌シクロフィリン様タンパク質、ヒトプレイオト
ロピン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、およびヒトビオチニダーゼ前駆体。従って
上述の方法は、シグナルペプチドをコードする５’ＥＳＴを首尾よく同定した。
【０１４４】 ５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴによりコードされるシ
グナルペプチドが、シグナルペプチドとして実際に機能することを確認するため
に、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴからのシグナル配列
を、シグナルペプチドの同定用に設計されたベクターにクローニングすることが
可能である。このようなベクターは、機能し得る形で連結されたシグナル配列を
有するベクターを含有する宿主細胞のみに、選択培地で増殖する能力を与えるよ
うに設計されている。例えば、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’
ＥＳＴが真正のシグナルペプチドをコードすることを確認するためには、５’Ｅ
ＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴのシグナル配列を、米国特許第
５，５３６，６３７号に記載されているようなシグナルペプチド選択ベクター中
の非分泌型酵母インベルターゼ遺伝子の上流に読取り枠が合うように挿入すれば
よい。正確に挿入された５’ＥＳＴシグナル配列またはコンセンサスコンティグ
化５’ＥＳＴシグナル配列を含むシグナル配列選択ベクターを含有する宿主細胞
が増殖することによって、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳ
Ｔが真正のシグナルペプチドをコードすることが確認される。
【０１４５】 あるいは、シグナルペプチドの存在は、ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ
化５’ＥＳＴを用いて得られる伸長ｃＤＮＡを、以下に記載するｐＸＴ１などの
発現ベクターにクローニングするか、シグナルペプチドとアッセイ可能なレポー
タータンパク質との間に融合タンパク質をコードするプロモーター-シグナル配
列-レポーター遺伝子ベクターを構築することによって確認することが可能であ
る。適当な宿主細胞（例えば、ＣＯＳ細胞やＮＩＨ ３Ｔ３細胞）にこれらのベ
クターを導入した後、増殖培地を回収して、分泌されたタンパク質の有無につい
て分析することが可能である。これらの細胞から得られる培地を、シグナル配列
または伸長ｃＤＮＡインサートが欠如しているベクターを含有する対照細胞から
得られる培地と比較して、機能的シグナルペプチドまたは真正の分泌タンパク質
をコードするベクターを同定する。
【０１４６】 実施例１５ （本発明の配列の分析） 実施例１１に記載の通りに、本発明の核酸配列のセット（配列番号２４〜８１
１および１６００〜１６２２）を取得した。続いて、実施例１２および１３に記
載の通りに、本発明の全配列について、最も有望なオープンリーディングフレー
ムを決定し、シグナル配列を検索した。
【０１４７】 配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２のヌクレオチド配列ならびに
配列番号２４〜８１１によりコードされるポリペプチド配列（すなわち、配列番
号８１２〜１５９９のポリペプチド配列）を添付の配列リストに示すが、それら
の構造は以下の通りである。
【０１４８】 配列番号２４〜７２８は、シグナルペプチドをコードする不完全ＯＲＦを有す
る核酸である。不完全ＯＲＦおよびシグナルペプチドをコードする配列の位置を
添付の配列表に列挙する。さらに、実施例１３に記載のように算定されるシグナ
ルペプチドのｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコアを、添付の配列表に「スコア」として
列挙する。シグナルペプチドの配列を、添付の配列表に「配列（ｓｅｑ）」とし
て列挙する。シグナルペプチド配列の「／」は、シグナルペプチドのタンパク質
切断が生じて成熟タンパク質を生成する位置を表す。
【０１４９】 配列番号７２９〜７６５は、現在までにシグナルペプチドをコードする配列が
同定されていない不完全ＯＲＦを有する核酸である。しかし、以後の分析では、
これらの核酸中のシグナルペプチドをコードする配列を同定することが可能であ
る。不完全ＯＲＦの位置を添付の配列表に列挙する。
【０１５０】 配列番号７６６〜７９２は、シグナルペプチドをコードする完全ＯＲＦを有す
る核酸である。完全ＯＲＦおよびシグナルペプチドの位置、シグナルペプチドの
ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコア、シグナルペプチドの配列、ならびにタンパク質切
断部位を上記と同様に示す。
【０１５１】 配列番号７９３〜８１１は、現在までにシグナルペプチドをコードする配列が
同定されていない完全ＯＲＦを有する核酸である。しかし、以後の分析では、こ
れらの核酸中のシグナルペプチドをコードする配列を同定することが可能である
。完全ＯＲＦの位置を添付の配列表に列挙する。
【０１５２】 配列番号８１２〜１５１６はシグナルペプチドを含む「不完全ポリペプチド配
列」である。「不完全ポリペプチド配列」は、開始コドンが同定されているが、
停止コドンは同定されていない核酸によってコードされるポリペプチド配列であ
る。これらのポリペプチドは、配列番号２４〜７２８の核酸によってコードされ
る。シグナルペプチドの位置、シグナルペプチドのｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコア
、シグナルペプチドの配列、およびタンパク質切断部位を上記と同様に示す。
【０１５３】 配列番号１５１７〜１５５３は、現在までにシグナルペプチドが同定されてい
ない不完全ポリペプチド配列である。しかし、以後の分析では、これらのポリペ
プチド中のシグナルペプチドを同定することが可能である。これらのポリペプチ
ドは、配列番号７２９〜７６５の核酸によってコードされる。
【０１５４】 配列番号１５５４〜１５８０は、シグナルペプチドを含む「完全ポリペプチド
配列」である。「完全ポリペプチド配列」は、開始コドンおよび停止コドンが同
定されている核酸によってコードされるポリペプチド配列である。これらのポリ
ペプチドは、配列番号７６６〜７９２の核酸によってコードされる。シグナルペ
プチドの位置、シグナルペプチドのｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコア、シグナルペプ
チドの配列、およびタンパク質切断部位を上記と同様に示す。
【０１５５】 配列番号１５８１〜１５９９は、現在までにシグナルペプチドが同定されてい
ない完全ポリペプチド配列である。しかし、以後の分析では、これらのポリペプ
チド中のシグナルペプチドを同定することが可能である。これらのポリペプチド
は、配列番号７９３〜８１１の核酸によってコードされる。
【０１５６】 配列番号１６００〜１６２２は、現在までにオープンリーディングフレームが
最終的に同定されていない核酸配列である。しかし、以後の分析では、これらの
核酸中のオープンリーディングフレームを同定することが可能である。
【０１５７】 添付の配列表において、核酸配列中の記号「ｎ」の全ての事例は、ヌクレオチ
ドがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンであり得ることを意味する。場
合により、配列表のポリペプチド配列は、記号「Ｘａａ」を含有する。これらの
「Ｘａａ」の記号は、（１）ヌクレオチド配列のあいまいさのために同定するこ
とができない残基または（２）出願人が（配列がより正確に決定された場合に）
存在すべきではないと考える決定された配列中の停止コドンのいずれか一方を表
す。場合により、不明のアミノ酸の幾つか可能な同一物は、遺伝子コードによっ
て示唆され得る。
【０１５８】 分泌タンパク質の場合、配列表を管理する規則に従い、添付の配列表では、全
長タンパク質（すなわち、シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を含有するタ
ンパク質）が負の数を有するアミノ酸残基から正の数を番号付けしたＣ末端アミ
ノ酸残基にまで及ぶことに注意するべきである。従って、シグナルペプチドの切
断によって生じる成熟タンパク質の１番目のアミノ酸にアミノ酸番号１を付し、
シグナルペプチドの１番目のアミノ酸に適切な負の数を付す。
【０１５９】 配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸配列の１つが、１つま
たは複数の不正確なまたは曖昧なヌクレオチドを含むことが疑われる場合、評価
すべきヌクレオチドを含むフラグメントを再度配列決定することにより、曖昧性
を容易に解消することができる。１つまたは複数の不正確なまたは曖昧なヌクレ
オチドが検出された場合、配列が単離されたクラスターに、正確な配列を含め、
これを使用して、他のＯＲＦが同定されるであろう他のコンセンサスコンティグ
化配列をコンピュータ処理すべきである。配列決定エラーまたは曖昧性を解消す
るための核酸フラグメントは、寄託されたクローンから取得してもよく、本明細
書に記載の技術を使用して単離してもよい。このような曖昧性またはエラーの解
消は、曖昧な配列またはエラーを含む配列の近くに位置する配列にハイブリダイ
ズするプライマーを使用することによって促進することができる。例えば、プラ
イマーは、曖昧性またはエラーのある５０〜７５塩基以内の配列にハイブリダイ
ズすればよい。エラーまたは曖昧性が解消すれば、エラーまたは曖昧性を含むＤ
ＮＡによりコードされるタンパク質配列中で、対応する訂正を行うことができる
。ある特定のクローンによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列も、適当な
宿主細胞におけるそのクローンの発現、タンパク質の回収、およびその配列の決
定によって、決定することができる。
【０１６０】 さらに、配列番号８１２〜１５９９の配列の１つが、その配列におけるフレー
ムシフトの結果として、先端が切られたＯＲＦを含むことが疑われる場合、下記
の２つの方法を併用することにより、このようなフレームシフト性エラーを修正
することが可能である。最初の方法は、全ての二重予測、すなわち、異なるリー
ディングフレーム上に位置する２つのＯＲＦについて、確率スコアが高くかつ近
い、好ましくは０．４未満だけ異なるあらゆるケースの徹底的な試験を含む。２
つの可能なＯＲＦが重複する領域の精密な試験は、フレームシフトの検出に役立
ち得る。第２の方法では、既知のタンパク質との相同性を使用して、疑われるフ
レームシフトを修正する。
【０１６１】 同定されたクラスターのうち幾つかは、多重変異体であること、すなわち、同
一遺伝子の幾つかの変異体を含むことが証明された。表Ｉは、内部リファレンス
によって名づけられた各多重変異体クラスター（第１欄）、すべての変異体コン
センサスコンティグ化５’ＥＳＴのリスト（第２欄）を示し、それぞれ、異なる
配列番号で表されている。
【表１】
【０１６２】 表ＩＩは、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴの誘導体である好ましいポリ
ヌクレオチドフラグメントのリストを示す。本明細書で使用する用語「表ＩＩに
記載のポリヌクレオチド」は、以下の方式で、表ＩＩに明示されている好ましい
ポリヌクレオチドフラグメントの全てを指す。第１欄に該フラグメントを配列番
号によって表す。次いで、「好ましいフラグメントの位置」という表題の第２欄
に示すように、好ましいポリヌクレオチドフラグメントを、コンセンサスコンテ
ィグ化５’ＥＳＴの配列番号からのヌクレオチド位置の範囲によって規定する。
好ましいポリヌクレオチドフラグメントは、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳ
Ｔを得るためにアラインメントされた個々の５’ＥＳＴおよび優先権書類におい
て出願されたものに対応する。「変異体ヌクレオチド」という表題の第３欄は、
以下のようなコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴと好ましいポリヌクレオチド
フラグメントとの間に認められるヌクレオチド配列の変異を説明している： Ａ）好ましいポリヌクレオチドフラグメントを誘導するためのコンセンサスコ
ンティグ化５’ＥＳＴの配列における置換を「Ｓ」で表し、それに続く数字は、
一連なりの置換されたヌクレオチドにおいて置換されるべき特定の配列番号にお
ける最初のヌクレオチドの位置かまたは置換されたヌクレオチドが１個である場
合は置換されたヌクレオチドの位置を表す。次いで、コンマ（ｃｏｍａ）に続い
て、１個以上の小文字は、置換された位置に存在するヌクレオチドの同一性を示
す。例えば配列番号３４０１；好ましいフラグメントの位置：１〜２５０；変異
体ヌクレオチドＳ４５，ａｔｃは、好ましいポリヌクレオチドフラグメントが、
配列番号３４０１の配列と比較して、好ましいポリヌクレオチドの４５位、４６
位、および４７位のヌクレオチドがそれぞれＡ、Ｔ、およびＣに置換されたこと
を除き、配列番号３４０１の１〜２５０位の配列を有したことを示す。 Ｂ）好ましいポリヌクレオチドフラグメントを誘導するためのコンセンサスコ
ンティグ化５’ＥＳＴの配列における挿入を「Ｉ」で表し、それに続く数字は、
一連なりのヌクレオチドが挿入された後の特定の配列番号におけるヌクレオチド
の位置かまたは挿入されたヌクレオチドが１個である場合はヌクレオチドが挿入
された後の位置を表す。次いで、コンマに続いて、１個以上の小文字は、挿入さ
れた位置に存在するヌクレオチドの同一性を示す。例えば、配列番号７９３４；
好ましいフラグメントの位置：１〜５００；変異体ヌクレオチドＩ３６，ｇａｔ
ａｃａは、好ましいポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号７９３４の配列
と比較して、３６位のヌクレオチドより後ろでＧＡＴＡＣＡの一連なりのヌクレ
オチドが好ましいポリヌクレオチドに挿入されることを除き、配列番号７９３４
の１〜５００位の配列を有したことを示す。 Ｃ）好ましい核酸フラグメントを誘導するためのコンセンサスコンティグ化５
’ＥＳＴの配列における欠失を「Ｄ」で表し、それに続く数字は、一連なりの欠
失されたヌクレオチドにおいて欠失されるべき特定の配列番号における最初のヌ
クレオチドの位置かまたは欠失されたヌクレオチドが１個である場合は欠失され
たヌクレオチドの位置を表す。次いで、コンマに続く数字は、配列番号において
提供された配列から欠失されるヌクレオチドの数を示す。例えば、配列番号５３
９８；好ましいフラグメントの位置：５６〜７８０；変異体ヌクレオチドＤ１１
４，５は、好ましいポリヌクレオチドフラグメントが、配列番号５３９８の配列
と比較して、好ましいポリヌクレオチドの１１４位〜１１８位のヌクレオチドが
欠失していることを除き、配列番号５３９８の５６位〜７８０位の配列を有した
ことを示す。
【０１６３】 本発明は、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０
、５０、７０、８０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドの長さの連続
したスパンが、特定のポリヌクレオチド、表ＩＩに記載されているポリヌクレオ
チドまたはそれに相補的な配列の長さと一致する程度まで、これらの長さの連続
したスパンから成るか、本質的に成るか、またはこれを含み、表ＩＩに記載され
ている上記ポリヌクレオチドが、表ＩＩに記載されているポリヌクレオチドから
個々に選択されるかもしくは任意に組み合わせて選択される、単離された、精製
された、または組換え型の核酸を含む。本発明はまた、表ＩＩに記載されている
ポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列から成るかまたは本質的に成り、
上記ポリヌクレオチドが表ＩＩに記載されているポリヌクレオチドから個々に選
択されるかもしくは任意に組み合わせて選択される、単離された、精製された、
または組換え型の核酸を含む。本発明は、表ＩＩに記載されているポリヌクレオ
チドによってコードされる少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５
、３５、４０、５０、７０、８０、１００個のアミノ酸の連続したスパンから成
るか、本質的に成るか、またはこれを含む、単離されたまたは精製されたポリペ
プチドをさらに含む。
【表２】
【０１６４】 実施例１６ （５’ＥＳＴおよびコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴの分類） 下記の通りに、本発明の核酸配列（配列番号２４〜８１１および１６００〜１
６２２）を、既知の配列との相同性に基づいて分類した。全ての配列を、ＥＭＢ
Ｌリリース５７およびＢＬＡＳＴＮを使用する出願時に利用可能なデーリーリリ
ースと比較した。最小で２５ヌクレオチドが９０％の相同性を有する全ての一致
を回収し、表ＩＶおよびＶを算定するために使用した。
【０１６５】 一部の実施形態では、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ
の核酸配列は、既知の脊椎動物配列のいずれとも、公的に入手可能なＥＳＴ配列
のいずれとも一致せず、すなわち、完全に新規である。
【０１６６】 他の実施形態では、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴは
、既知の配列に一致する。表ＩＩＩおよびＩＶは、第１欄に、このカテゴリーに
おける本発明の各配列を配列同定番号によって表し、「好ましいフラグメントの
位置」という表題の第２欄に、それらの好ましいフラグメントの位置を表す。本
明細書で使用する用語「表ＩＩＩに記載のポリヌクレオチド」は、このような方
式で、表ＩＩＩに明示されている好ましいポリヌクレオチドフラグメントの全て
を指し、用語「表ＩＶに記載のポリヌクレオチド」は、このような方式で、表Ｉ
Ｖに明示されている好ましいポリヌクレオチドフラグメントの全てを指す。本発
明は、少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０
、７０、８０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドの長さの連続したス
パンが、特定のポリヌクレオチド、表ＩＩＩまたは表ＩＶに記載されているポリ
ヌクレオチドまたはそれに相補的な配列の長さと一致する程度まで、これらの長
さの連続したスパンから成るか、本質的に成るか、またはこれを含み、表ＩＩＩ
または表ＩＶに記載されている上記ポリヌクレオチドが、表ＩＩＩまたは表ＩＶ
に記載されているポリヌクレオチドから個々に選択されるかもしくは任意に組み
合わせて選択される、単離された、精製された、または組換え型の核酸を含む。
本発明はまた、表ＩＩＩまたは表ＩＶに記載されているポリヌクレオチド、また
はそれに相補的な配列から成るかまたは本質的に成り、上記ポリヌクレオチドが
表ＩＩＩまたは表ＩＶに記載されているポリヌクレオチドから個々に選択される
かもしくは任意に組み合わせて選択される、単離された、精製された、または組
換え型の核酸を含む。
【表３】
【表４】
【０１６７】 （ＩＩＩ．５’ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたはＥＳＴ関連
核酸に対応するｍＲＮＡの空間的発現および時間的発現の評価） 実施例１７ （５’ＥＳＴを取得したｍＲＮＡの発現パターン） 以下の通り、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２のそれぞれも、
その対応するｍＲＮＡを取得した組織に基づいて分類した。 表Ｖは、第１欄に、本発明の各核酸配列（配列番号２４〜８１１および１６０
０〜１６２２）の空間的分布をその配列番号によって示す。組織分布という表題
の第２欄に、空間的分布を、所与の組織について、コンセンサスコンティグ化５
’ＥＳＴを組み立てるために使用される個々の５’ＥＳＴの数によって表す。表
Ｖに記載の組織のそれぞれのタイプを１つの文字でコード化する。文字コードと
組織のタイプとの間の対応を表ＶＩに示す。
【表５】
【表６】
【０１６８】 ５’ＥＳＴおよびコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴを、それらの起源であ
る組織に関して分類するほかにも、以下の実施例１８に記載の通りに、５’ＥＳ
Ｔおよびコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴに対応するｍＲＮＡの空間発現パ
ターンおよび時間発現パターン、ならびにそれらの発現レベルを決定することが
可能である。
【０１６９】 以下でさらに詳細に検討を加えるが、これらのmRNAの空間的発現パターン、時
間的発現パターンおよび発現レベルを特性化することは、所望の空間的方式また
は時間的方式で、所望のレベルの遺伝子産物を産生することができる発現ベクタ
ーの構築に有用である。
【０１７０】 さらに、対応するｍＲＮＡが疾患状態に関与する５’ＥＳＴおよびコンセンサ
スコンティグ化５’ＥＳＴも同定することが可能である。例えば、ある特定の疾
患は、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴに対応するｍＲＮ
Ａの発現の欠如、過剰発現、または過少発現に起因すると考えられる。健常者か
ら採取したサンプルにおけるｍＲＮＡの発現パターンと量を、ある特定の疾患に
罹患した個体のものと比較することによって、その疾患の原因である５’ＥＳＴ
またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴを同定することが可能である。
【０１７１】 上述の５’ＥＳＴおよびコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴに関する特性化
手順の結果が、５’ＥＳＴおよびコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴに隣接す
る配列を含む伸長ｃＤＮＡ（下記の通りに得られる）にもあてはまることは明ら
かであろう。また、必要に応じて、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化
５’ＥＳＴ自体を特性化するよりむしろ、伸長ｃＤＮＡが得られるまで特性化を
遅らせてもよいことも明らかであろう。
【０１７２】 実施例１８ （ＥＳＴ関連核酸に対応するｍＲＮＡの発現レベルおよび発現パターンの評価） 国際特許出願第ＷＯ９７／０５２７７号に記載の長いプローブを用いた溶液ハ
イブリダイゼーションで、ＥＳＴ関連核酸に対応するｍＲＮＡの発現レベルおよ
び発現パターンを分析することが可能である。簡単に記述すると、特性化すべき
ｍＲＮＡをコードしている遺伝子に対応する、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸
のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の
位置的セグメントのフラグメントを、バクテリオファージ（Ｔ３、Ｔ７またはＳ
Ｐ６）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのすぐ下流のクローニング部位に挿入し
て、アンチセンスＲＮＡを作製する。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグ
メント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セ
グメントのフラグメントは、１００以上のヌクレオチドの長さであることが好ま
しい。プラスミドを線状にし、修飾リボヌクレオチド（すなわち、ビオチン−Ｕ
ＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰ）を含むリボヌクレオチドの存在下で転写する。この
二重に標識した過剰のＲＮＡを、溶液中で、目的の細胞または組織から単離した
ｍＲＮＡとハイブリダイズさせる。標準的なストリンジェント条件下で（８０％
ホルムアミド、０．４Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７〜８）中、４０〜５０℃で１
６時間）、ハイブリダイゼーションを行う。一本鎖ＲＮＡに特異的なリボヌクレ
アーゼ（すなわち、ＲＮａｓｅＣＬ３、Ｔ１、ＰｈｙＭ、Ｕ２またはＡ）で消化
することによって、ハイブリダイズしていないプローブを除去する。ビオチン−
ＵＴＰ修飾が存在すれば、ストレプトアビジンを被覆したマイクロタイタープレ
ート上にハイブリッドを捕捉することが可能になる。ＤＩＧ修飾が存在すれば、
アルカリホスファターゼに結合させた抗ＤＩＧ抗体を使用するＥＬＩＳＡによっ
て、ハイブリッドを検出および定量することが可能になる。
【０１７３】 英国特許出願第２３０５２４１Ａに開示されている通りに、ＥＳＴ関連核酸、
ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、またはＥ
ＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフラグメントに、遺伝子発現の連続分析（Ｓ
ＡＧＥ）用のヌクレオチド配列をタグ付けすることもできる。この方法で、細胞
、組織、生物、または遺伝子発現パターンを決定しなければならない核酸の他の
起源から、ｃＤＮＡを調製する。このようにして得られたｃＤＮＡを２つのプー
ルに分ける。各プール中のｃＤＮＡを、大部分のｃＤＮＡに少なくとも一つ存在
すると思われる認識部位を有する第１の制限エンドヌクレアーゼ（アンカリング
酵素と呼ばれる）で切断する。切断されたｃＤＮＡの５’または３’領域を最も
多く含むフラグメントを、ストレプトアビジン被覆ビーズのような捕捉媒体に結
合させることによって単離する。増幅プライマーをハイブリダイズさせるための
第１配列と、いわゆるタグ付きエンドヌクレアーゼに対する内部制限部位とを有
する第１のオリゴヌクレオチドリンカーを、第１のプール中の消化ｃＤＮＡに連
結する。第２のエンドヌクレアーゼで消化して、ｃＤＮＡから短いタグ付きフラ
グメントを生成する。
【０１７４】 増幅プライマーをハイブリダイズさせるための第２の配列と内部制限部位を有
する第２のオリゴヌクレオチドを、第２のプール中の消化ｃＤＮＡに連結する。
第２のプールのｃＤＮＡフラグメントも、タグ付きエンドヌクレアーゼで消化し
て、第２のプールのｃＤＮＡに由来する短いタグフラグメントを生成する。アン
カリング酵素およびタグ付きエンドヌクレアーゼを用いた、第１のプールおよび
第２のプールの消化によって生じたタグを互いに連結して、いわゆるジタグ（ｄ
ｉｔａｇ）を生成する。一部の実施形態では、ジタグをコンカテマー化して、ジ
タグを２〜２００含有する連結産物を生成する。次いで、タグ配列を決定し、Ｅ
ＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメ
ント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフラグメントの配列と比較し
て、細胞、組織、生物、またはタグが由来する核酸の他の起源に、どの５’ＥＳ
Ｔ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡが発現されるかを
決定する。この方法で、細胞、組織、生物、または核酸の他の起源における５’
ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ、または伸長ｃＤＮＡの発現パタ
ーンが得られる。
【０１７５】 アレイを使用して遺伝子発現の定量分析を実施することも可能である。本明細
書で使用する用語「アレイ」は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメン
トの、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セグ
メントのフラグメント、一次元、二次元、または多次元の配列（ａｒｒａｎｇｅ
ｍｅｎｔ）を意味する。このＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、
ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント
のフラグメントは、長さが少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、２３、２
５、２８、３０、３５、４０、または５０ヌクレオチドであることが好ましい。
さらに好ましくは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関
連核酸の位置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフラグ
メントは、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。さらに好ましくは、フ
ラグメントは、１００ヌクレオチドを超える長さである。一部の実施形態では、
ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグ
メント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフラグメントは、長さが５
００ヌクレオチドを超えることもある。
【０１７６】 例えば、Schenaら（Science 270:467-470,1995; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S
.A.93:10614-10619,1996）により記載されている通り、相補的ＤＮＡマイクロア
レイ中のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位
置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフラグメントを用
いて、遺伝子発現の定量分析を実施することが可能である。ＥＳＴ関連核酸、Ｅ
ＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、またはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置的セグメントのフラグメントをＰＣＲで増幅し、高速ロボット
工学を使用して、９６ウェルマイクロタイタープレートからシリル処理した顕微
鏡スライド上に配列させる。プリントされたアレイを湿潤チャンバ内でインキュ
ベートしてアレイエレメントに再度水分を加え、０．２％ＳＤＳ中で１分間１回
、水中で１分間２回および水素化ホウ素ナトリウム溶液中で５分間１回すすぐ。
このアレイを９５℃の湯に２分間沈め、０．２％ＳＤＳに１分間移し、水で２回
すすぎ、風乾し、２５℃の暗所に保存する。
【０１７７】 細胞または組織ｍＲＮＡを単離するか購入し、１ラウンドの逆転写によってプ
ローブを調製する。プローブを、１ｃｍ2のマイクロアレイに、１４×１４ｍｍ
のカバーガラス下、６０℃で６〜１２時間ハイブリダイズさせる。アレイを、低
ストリンジェンシー洗浄用緩衝液（１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）中、２５℃で
５分間、次いで、高ストリンジェンシー洗浄用緩衝液（０．１×ＳＳＣ／０．２
％ＳＤＳ）中、室温で１０分間洗浄する。特注のフィルターセットを取り付けた
蛍光レーザー走査装置を使用して、０．１×ＳＳＣ中でアレイを走査する。２つ
の独立したハイブリダイゼーションの比率の平均をとることにより、正確な示差
的発現の測定値が得られる。
【０１７８】 Pietu ら (Genome Research 6:492-503, 1996）により記載されている通り、
相補的ＤＮＡアレイ中のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳ
Ｔ関連核酸の位置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフ
ラグメントを用いて、遺伝子発現の定量分析を実施することも可能である。ＥＳ
Ｔ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメン
ト、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフラグメントをＰＣＲ増幅し、
膜上にスポットする。次いで、様々な組織または細胞に由来するｍＲＮＡを放射
性ヌクレオチドで標識する。制御条件でハイブリダイズさせて洗浄した後、ハイ
ブリダイズしたｍＲＮＡを、ホスホ−イメージングまたはオートラジオグラフィ
ーで検出する。実験を２回実施し、次いで、示差的に発現したｍＲＮＡの定量分
析を実施する。
【０１７９】 あるいは、Lockhartら(Nature Biotechnology 14: 1675-1680, 1996）およびS
osnowskyら（Proc. Natl. Acad. Sci. 94:1119-1123, 1997）により記載されて
いる通り、高密度ヌクレオチドアレイによって、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核
酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸
の位置的セグメントのフラグメントの発現分析を行うことができる。ＥＳＴ関連
核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、ま
たはＥＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフラグメントの配列に対応する１５〜
５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドをチップ上に直接合成する（Lockhartら
、前掲）か、合成してからチップに処理する（Sosnowskyら、前掲）。オリゴヌ
クレオチドは、約２０〜２５ヌクレオチドの長さが好ましい。
【０１８０】 ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光染料などの、適当な化合物で標識したｃ
ＤＮＡプローブを、適当なｍＲＮＡ集団から合成し、次いで、５０〜１００ヌク
レオチドの平均サイズまで無作為にフラグメント化する。次いで、前述のプロー
ブをチップにハイブリダイズさせる。Lockhartら（前掲）に記載されている通り
に洗浄し、異なる電場を印加（Sonowskyら、前掲）した後、染料または標識化合
物を検出し、定量する。ハイブリダイゼーションを２回実施する。異なるｃＤＮ
Ａサンプル中の同一標的オリゴヌクレオチド上のｃＤＮＡプローブに由来するシ
グナルの強度を比較分析することで、オリゴヌクレオチド配列が設計されるもと
となった５’ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡ
に対応するｍＲＮＡの示差的発現がわかる。
【０１８１】 （ＩＶ．伸長ｃＤＮＡのクローニングおよび対応するゲノムＤＮＡのクローニン
グのための５’ＥＳＴの使用） 上述の手順を使用して、一旦、対応するｍＲＮＡの５’末端を含む５’ＥＳＴ
またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴを選択するとその後は、それらを使
用して、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴに隣接する配列
を含む伸長ｃＤＮＡを単離することができる。この伸長ｃＤＮＡは、真正の翻訳
開始部位を含め、対応するｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の全コード配
列を含有してもよい。伸長ｃＤＮＡが分泌タンパク質をコードする場合、伸長ｃ
ＤＮＡは、シグナル配列、およびシグナルペプチドの切断後に残る成熟タンパク
質をコードする配列を含んでもよい。
【０１８２】 対応するｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の全コード配列を含む伸長ｃ
ＤＮＡを、本明細書で「全長ｃＤＮＡ」と呼ぶ。あるいは、伸長ｃＤＮＡは、対
応するｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の全コード配列を含まなくてもよ
いが、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴに隣接する配列を
含む。分泌タンパク質をコードしているｍＲＮＡから伸長ｃＤＮＡが誘導される
一部の実施形態では、伸長ｃＤＮＡは、シグナルペプチドの切断後に残る成熟タ
ンパク質をコードしている配列のみを含んでもよく、シグナルペプチドをコード
している配列のみを含んでもよい。
【０１８３】 以下の実施例１９および２０に、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化
５’ＥＳＴおよびそれに相同な核酸を使用して伸長ｃＤＮＡを得るための一般的
な方法を説明する。以下の実施例２１に、数種の分泌タンパク質について対応す
るｍＲＮＡの真正の５’末端を含む全長ｃＤＮＡを含む、数種の伸長ｃＤＮＡの
クローニングおよび配列決定について説明する。
【０１８４】 実施例１９および２０の方法を使用して、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコン
ティグ化５’ＥＳＴに対応する遺伝子によりコードされるタンパク質の全コード
配列より少ない配列をコードする伸長ｃＤＮＡを得ることもできる。一部の実施
形態では、これらの方法を使用して単離される伸長ｃＤＮＡは、配列番号２４〜
８１１および１６００〜１６２２の配列によってコードされるタンパク質類のう
ちの１つのタンパク質の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、
４０、５０、７５、１００、または１５０個連続したアミノ酸をコードする。一
部の実施形態では、これらの方法を使用して単離される伸長ｃＤＮＡは、配列番
号２４〜８１１の配列によってコードされるタンパク質類のうちの１つのタンパ
ク質の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５
、１００、または１５０個連続したアミノ酸をコードする。
【０１８５】 実施例１９ （５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴを使用して、対応する
ｍＲＮＡの全コード領域および真正の５’末端を含む伸長ｃＤＮＡのクローニン
グおよび配列決定するための一般的な方法） 下記の一般的な方法を使用して、伸長ｃＤＮＡの取得に使用される５’ＥＳＴ
またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴの配列に隣接した配列を含む、伸長
ｃＤＮＡを迅速かつ効率よく単離することが可能である。この方法は、分泌タン
パク質をコードしている５’ＥＳＴおよびコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ
を含め、本発明の任意の５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ
に関する伸長ｃＤＮＡを取得するのに使用することができる。こ方法を、図３に
示す。
【０１８６】 （１．伸長ｃＤＮＡの取得） 本方法は、ｍＲＮＡの既知の５’配列を利用する。ｍＲＮＡの３’末端に対応
するｃＤＮＡの末端に既知の配列を付加することが可能な５’末端にヌクレオチ
ド配列を含有するポリｄＴプライマーを用いて、精製ｍＲＮＡに逆転写反応を実
施する。このようなプライマーおよび市販の逆転写酵素酵素を緩衝化ｍＲＮＡサ
ンプルに加え、ＲＮＡの３’ポリＡ部位に固定された逆転写物を生成する。次い
で、ヌクレオチドモノマーを加えて第１鎖合成を完成させる。
【０１８７】 第１ｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズしたｍＲＮＡをアルカリ加水分解で除去した
後、アルカリ加水分解の生成物および残留ポリｄＴプライマーを、排除カラムで
除去することができる。
【０１８８】 続いて、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴの既知の５’
配列、および第１鎖合成に使用したポリｄＴプライマーによって付加された既知
の３’末端に基づいて、各末端に一対のネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー
を設計する。プライマーの設計に使用されるソフトウェアは、OSP(Illierおよび
Green, PCR Meth. Appl. 1:124-128, 1991）などの、ＧＣ含有量およびオリゴヌ
クレオチド融解温度か、PC-Rare(http:// bioinformatics.weizmann.ac.il/soft
ware/PC-Rare/doc/manuel.html）などの、オクターマー頻度相違法（Griffaisら
, Nucleic Acids Res. 19: 3887-3891, 1991）のいずれかに基づく。５’末端の
ネステッドプライマーおよび３’末端のネステッドプライマーは、互いに４〜９
塩基離れていることが好ましい。ＰＣＲで使用するのに適した融解温度および特
異性を有するように、これらのプライマー配列を選択することが可能である。
【０１８９】 ネステッドプライマー対のそれぞれに由来する外側プライマーを使用して、第
１のＰＣＲを実施する。次いで、第１のＰＣＲ産物の少量のサンプルに対して、
ネステッド対のそれぞれに由来する内側プライマーを使用して、第２のＰＣＲを
実施する。その後、プライマーおよび残りのヌクレオチドモノマーを除去する。
【０１９０】 （２．伸長ｃＤＮＡまたはそのフラグメントの配列決定） ＯＳＰソフトウェアを使用したＰＣＲ用に適合する５’ネステッドプライマー
の設計に対する位置の制約がないため、２つのタイプのアンプリコンが得られる
。第２の５’プライマーは翻訳開始コドンの上流に位置し、従って、コード配列
全体を含むネステッドＰＣＲ産物が生成することが好ましい。以下のセクション
ａに記載の通り、このような伸長ｃＤＮＡを、直接クローニング手順に使用する
ことができる。しかし、第２の５’プライマーが翻訳開始コドンの下流に位置し
、その結果、ＯＲＦの一部のみを含むＰＣＲ産物が生成する場合もある。このよ
うな不完全なＰＣＲ産物を、以下のセクションｂに記載されている改良された手
順に供する。
【０１９１】 ａ）完全なＯＲＦを含むネステッドＰＣＲ産物 結果として得られるネステッドＰＣＲ産物が、５’ＥＳＴ配列またはコンセン
サスコンティグ化５’ＥＳＴ配列から予測されるような、完全なコード配列を含
むとき、セクション３に記載の通り、そのＰＣＲ産物を適当なベクターにクロー
ニングする。
【０１９２】 ｂ）不完全なＯＲＦを含むネステッドＰＣＲ産物 アンプリコンが完全なコード配列を含まないとき、完全なコード配列と、全コ
ード配列を含むＰＣＲ産物の両者を得るための中間ステップが必要である。異な
るＰＣＲ産物から直接決定される数個の部分的配列から、完全なコード配列を組
み立てることができる。
【０１９３】 一旦、全コード配列が完全に決定されると、その後は、コード領域全部を含む
アンプリコンを得るために、ＰＣＲ用に適合する新しいプライマーを設計する。
しかし、そのような場合、ＰＣＲ用に適合する３’プライマーは、対応するｍＲ
ＮＡの３’ＵＴＲの内側に位置し、従って、図３に図示する通り、この領域の一
部（すなわち、ポリＡ区域および時にはポリアデニル化シグナル）が欠如したア
ンプリコンが生成する。次いで、セクション３に記載の通り、このような伸長ｃ
ＤＮＡを適当なベクターにクローニングする。
【０１９４】 ｃ）伸長ｃＤＮＡの配列決定 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼＦＳキットを用いたダイターミネーター（Ｄｉｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）
法を使用して、伸長ｃＤＮＡの配列決定を実施することができる。
【０１９５】 長いＰＣＲフラグメントを配列決定するために、プライマーを選択するための
ＯＳＰのようなソフトウェア、および最初の５’タグを含む歩行配列のコンティ
グ（ｃｏｎｔｉｇ）を構築するためのASMG(Suttonら、Genome Science Technol.
1: 9-19, 1995）のような自動化コンピュータソフトウエアを使用して、プライ
マ−歩行を実施する。全長ｃＤＮＡの配列が得られるまでプライマ−歩行を実施
することが好ましい。
【０１９６】 所与の伸長ｃＤＮＡフラグメントの配列決定の完了は、配列長を、対応するネ
ステッドＰＣＲ産物のサイズと比較することによって、査定することが可能であ
る。ノーザンブロットデータを入手できるとき、所与のＰＣＲ産物に関して検出
されたｍＲＮＡのサイズを使用して、配列が完全であることを最終的に査定する
ことも可能である。これらの基準を満たさない配列を除去し、新しい単離手順に
供する。
【０１９７】 ３．伸長ｃＤＮＡのクローニング 次いで、全コード配列を含有するＰＣＲ産物を適当なベクターにクローニング
する。例えば、伸長ｃＤＮＡを、当技術分野で周知の任意の発現ベクター、例え
ば、pED6dpc2(DiscoverEase, Genetics Institute, Cambridge, MA）にクローニ
ングすることができる。
【０１９８】 次いで、クローン当たり少なくとも２つの配列を得るために、クローニングＰ
ＣＲ産物を完全に配列決定する。下記の一部修正を加えた前述の手順に従って、
センス鎖とアンチセンス鎖の両者から配列を得ることが好ましい。第１に、クロ
ーンの同一性を確認するために、クローニングＰＣＲ産物の５’末端と３’末端
の両者を配列決定する。第２に、未だ、全コード領域が得られていなければ、プ
ライマー歩行を実施する。次いで、クローニング産物については、プライマー歩
行配列を使用し、未クローニングＰＣＲ産物については、既にコンティグ化され
た歩行配列を使用して、コンティグ化を実施する。このようにして得られたコン
ティグが全コード領域ならびに両端にベクターＤＮＡを有する重複配列を含むと
き、配列は完全であると考えられる。次いで、各クローニングアンプリコンに関
する全てのコンティグ化配列を使用して、コンセンサス配列を得る。
【０１９９】 （４．クローニングされた全長配列の選択） ａ）伸長ｃＤＮＡのコンピュータ分析 汚染物質を同定し、反復をマスキングした後、続いて、伸長ｃＤＮＡの配列の
構造上の特徴、例えば、ポリＡテイルやポリアデニル化シグナルを、当業者に周
知の方法を使用して決定する。例えば、図１０に明示されているアルゴリズム、
パラメータおよび基準を使用することができる。簡単に説明すると、ポリＡテイ
ルは、せいぜい多くて１つの代替塩基を中に含む、Ａが少なくとも１１個のホモ
ポリマーストレッチであると定義される。ポリＡテイル検索は、配列の最後の２
０ヌクレオチドに制限され、１１個連続したＡのストレッチに限定されるが、そ
れは、このようなポリＡストレッチの後は、しばしば配列決定反応を読み取るこ
とができないためである。ポリアデニル化シグナルについて検索するためには、
全長配列からポリＡテイルを切り取る。起こり得る配列決定エラーならびにポリ
アデニル化シグナルの規定の標準的な配列における既知の変化の原因である１つ
の不一致を認めながら、ポリＡテイルの前の５０ヌクレオチドを、規定の標準的
なポリアデニル化ＡＡＵＡＡＡシグナルについて検索する。
【０２００】 次に、伸長ｃＤＮＡの配列の機能的特徴、例えばＯＲＦやシグナル配列を、下
記の通りに決定する。翻訳開始コドンで始まり、停止コドンで終わる最長フラグ
メントであると定義されるＯＲＦについて、伸長ｃＤＮＡの上部鎖フレーム３つ
を検索する。少なくとも８０アミノ酸をコードしているＯＲＦが好ましい。分泌
タンパク質をコードしている伸長ｃＤＮＡが望まれる場合、実施例１３に記載の
マトリックス法を使用して、シグナルペプチドの存在について、見出された各Ｏ
ＲＦを走査する。
【０２０１】 次いで、伸長ｃＤＮＡの配列を、提出時に入手可能な公的配列と、ヌクレオチ
ドベースまたはタンパク質ベースで比較する。
【０２０２】 ｂ）目的の全長ｃＤＮＡの選択 次いで、汚染物質またはＰＣＲ人工産物のいずれかに起因する不要なクローニ
ング配列を排除するために、下記の通りに、陰性選択を実施することが可能であ
る。ベクターＤＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ配列などの、汚染物質配
列と一致する配列、ならびに反復と広範囲にわたる相同性を示すＯＲＦ配列をコ
ードするものを除去する。直接クローニング（セクション１ａ）によって得られ
るが、ポリＡテイルが欠如している配列を除去することができる。ポリＡテイル
の前（セクション１ａ）またはクローニング３’ＵＴＲの末端の前（セクション
１ｂ）のいずれかで終わるＯＲＦのみを選択することができる。分泌タンパク質
をコードしている伸長ｃＤＮＡが望まれる場合、シグナルペプチドを含むＯＲＦ
が考えられる。加えて、サイズが２０アミノ酸未満または未成熟タンパク質サイ
ズの２５％未満である成熟タンパク質などの好ましくない成熟タンパク質を含む
ＯＲＦを排除することができる。
【０２０３】 次いで、下記の基準を使用して、数個のＯＲＦを含む残りの各全長ｃＤＮＡに
ついて、ＯＲＦの予備選択を実施してもよい。最長のＯＲＦが好ましい。分泌タ
ンパク質をコードしている伸長ｃＤＮＡが望ましく、かつＯＲＦサイズが類似し
ているのであれば、選択されるＯＲＦは、シグナルペプチドがＶｏｎ Ｈｅｉｊ
ｎｅ方法による最高スコアを有するものである。
【０２０４】 次いで、反復配列のマスキング後、全長ｃＤＮＡクローンの配列をペアで比較
することができる。広範な相同性を示す全長ｃＤＮＡ配列を、同じクラス内で、
クラスター化することが可能である。次いで、各クラスターを、内部プライミン
グまたは選択的スプライシングにより生じる配列、同一配列または数個のフレー
ムシフトを含む配列を検出するクラスター分析に供することが可能である。両者
が目的の配列を含む場合、両者とも選択される可能性がある、相同であるが別個
のＯＲＦをコードしているクローンを検出するために、同じクラスに属するクロ
ーン間で、選択を操作してもよい。
【０２０５】 次いで、下記の基準を使用して、目的の配列をコードしている全長ｃＤＮＡク
ローンの選択を実施することが可能である。構造パラメータ（最初のタグ、ポリ
アデニル化部位およびシグナル）を最初に確認する。次いで、クローン配列が既
知のヌクレオチド／タンパク質配列と一致するかどうかを決定するために、また
、後者の場合、その被覆率（covering rate）およびその配列が公になった期日
を決定するために、既知の核酸およびタンパク質との相同性を調べる。ＥＳＴま
たはゲノムＤＮＡ以外の配列との広範な一致がなければ、あるいはクローン配列
が、既に判明しているタンパク質をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシング
により生じるタンパク質をコードしているなど、実質的に新しい情報を提供する
のであれば、その配列を記憶する。目的の配列を含むこのようなクローニング全
長ｃＤＮＡの例を、実施例２１で説明する。この手順の間に、キメラまたは二重
インサートにより生じる配列、または他の配列との相同性によって評価されるよ
うな、染色体切断点に位置する配列を除去することが可能である。
【０２０６】 続いて、サブクローニング、ＰＣＲ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏオリゴヌクレオ
チド合成のような従来の技術を使用して、上述の通りに調製された伸長ｃＤＮＡ
を操作し、伸長ｃＤＮＡの所望の部分を含む核酸を得ることが可能である。例え
ば、当業者に周知の技術を使用して、全コード配列のみを含む核酸を得ることが
できる。あるいは、従来の技術を使用して、コード配列の部分のみを含む核酸を
得ることができる。分泌タンパク質をコードしている核酸の場合、シグナルペプ
チドの切除後に残る成熟タンパク質に関するコード配列のみを含む核酸、または
シグナルペプチドに関するコード配列のみを含む核酸を得ることができる。
【０２０７】 同様に、コードされたタンパク質に関するコード配列の、任意の他の望ましい
部分を含む核酸を得ることも可能である。例えば、核酸は、伸長ｃＤＮＡの少な
くとも１０、１５、１８、２０、２５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、
１００、１５０、２００、３００、４００または５００個連続した塩基を含んで
もよい。
【０２０８】 一旦、伸長ｃＤＮＡが得られると、伸長ｃＤＮＡを配列決定し、伸長ｃＤＮＡ
がコードするアミノ酸配列を決定することができる。一旦、コードされたアミノ
酸配列が決定されると、遺伝子暗号の縮重を使用するだけで、そのタンパク質を
コードする、多くの考え得るｃＤＮＡを作成して同定することができる。例えば
、下記の通りに、対立遺伝子の変異体または他の相同な核酸を同定することがで
きる。あるいは、所望のアミノ酸配列をコードしている核酸を、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで合成することができる。
【０２０９】 好ましい実施形態で、ｃＤＮＡが発現されるべき宿主生物に関する既知のコド
ンまたはコドン対優位を使用して、コード配列を選択することが可能である。
【０２１０】 対応するｍＲＮＡの真正５’末端ならびに対応するｍＲＮＡの完全なタンパク
質コード配列を含むｃＤＮＡを得るためのＰＣＲに基づく方法に加えて、伝統的
なハイブリダイゼーションに基づく方法を使用することもできる。これらの方法
を使用して、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴが誘導され
るｍＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ、伸長ｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡ、ある
いは伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴと
相同な核酸を得ることもできる。以下の実施例１９に、このような方法の例を提
供する。
【０２１１】 実施例２０ （対応するｍＲＮＡの全コード領域および真正５’末端を含む伸長ｃＤＮＡ、ま
たは伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴもしくはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴに
相同な核酸を取得する方法） 実施例７に記載の方法を使用して、全長ｃＤＮＡライブラリーを作製すること
ができる。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを
商業的ソースから入手してもよく、または当業者に周知の技術を使用して作製し
てもよい。
【０２１２】 下記の通りに、このようなｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラ
リーを使用して、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴから取
得した伸長ｃＤＮＡ、または伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコン
ティグ化５’ＥＳＴに相同な核酸を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリ
ーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを、検出可能なプローブにハイブリダイズさ
せる。この検出可能なプローブは、５’ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’
ＥＳＴ、または伸長ｃＤＮＡの、少なくとも１０、１５、１８、２０、２５、２
８、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００
または５００個連続したヌクレオチドを含んでもよい。
【０２１３】 Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第２版、Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989）には、所与のプローブ配列にハイブリダイズ
するｃＤＮＡライブラリーのｃＤＮＡクローンを同定する技術が開示されている
。同じ技術を用いてゲノムＤＮＡを単離できる。簡単に説明すると、さらなる操
作のために、下記の通りに検出可能なプローブにハイブリダイズするｃＤＮＡク
ローンまたはゲノムＤＮＡクローンを同定し、単離する。前のパラグラフに記載
の検出可能なプローブは、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素または蛍光
分子で標識されている。プローブを標識する技術は周知であり、ポリヌクレオチ
ドキナーゼを用いたリン酸化、ニックトランスレーション、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転
写および非放射性技術が含まれる。ライブラリー中のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮ
Ａをニトロセルロースフィルターまたはナイロンフィルターに移動させ、変性さ
せる。非特異的部位を遮断した後、このプローブにハイブリダイズすることがで
きる配列を含むｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡにプローブを結合させるのに十分な
時間、フィルターを標識プローブと共にインキュベートする。
【０２１４】 下記の通りに、検出可能なプローブにハイブリダイズする伸長ｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡの同定に使用されるハイブリダイゼーション条件のストリンジェン
シーを変えることによって、プローブとの相同性のレベルが異なる伸長ｃＤＮＡ
またはまたはゲノムＤＮＡを同定し、単離することができる。
【０２１５】 （１．標識プローブと高度の相同性を有するｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ配
列の同定） プローブ配列と高度の相同性を有するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを同定する
ために、次式を使用して、プローブの融解温度を算出することが可能である：
【０２１６】 １４〜７０ヌクレオチドの長さのプローブの場合、次式： Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ （Ｎａ＋））＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）−
（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さである）を使用して、融解温度（Ｔ
ｍ）を算出する。
【０２１７】 ホルムアミドを含有する溶液中でハイブリダイゼーションを実施する場合、式
：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ （Ｎａ＋））＋０．４１（画分Ｇ＋Ｃ）
−（０．６３％ホルムアミド）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはプローブの長さで
ある）を使用して、融解温度を算出することができる。
【０２１８】 プレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％
ＳＤＳ、１００μｇの変性されフラグメント化されたサケ精子ＤＮＡ中、または
６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇの変性されフラ
グメント化されたサケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド中で実施することが可能
である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）には、ＳＳＣおよびデンハルト溶液に関す
る処方が記載されている。
【０２１９】 検出可能なプローブを上記プレハイブリダイゼーション溶液に加えることによ
ってハイブリダイゼーションを実施する。プローブが二本鎖ＤＮＡを含む場合、
これを変性させてからハイブリダイゼーション溶液に加える。プローブに相補的
な配列またはプローブに相同な配列を含む伸長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡとプ
ローブをハイブリダイズさせるのに十分な時間、フィルターをハイブリダイゼー
ション溶液と接触させる。長さが２００ヌクレオチドを超えるプローブの場合、
Ｔｍより１５〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーションを実施することが可能
である。オリゴヌクレオチドプローブのような、より短いプローブの場合、Ｔｍ
より１５〜２５℃低い温度でハイブリダイゼーションを実施することが可能であ
る。６×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーションする場合、約６８℃でハイブリダイ
ズすることが好ましい。５０％ホルムアミド含有溶液中でハイブリダイゼーショ
ンする場合、約４２℃でハイブリダイズすることが好ましい。
【０２２０】 前述のハイブリダイゼーションは全て、「ストリンジェントな」条件下である
と考えられるであろう。
【０２２１】 ハイブリダイゼーション後、フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、室
温にて１５分間洗浄する。次いでこのフィルターを０．１×ＳＳＣ、０．５％Ｓ
ＤＳで、室温にて３０分〜１時間洗浄する。その後、この溶液を、０．１×ＳＳ
Ｃ、０．５％ＳＤＳで、ハイブリダイゼーション温度にて洗浄する。最終的な洗
浄を、０．１×ＳＳＣで、室温にて実施する。
【０２２２】 プローブとハイブリダイズしたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、オートラジオ
グラフィーまたは他の従来技術で同定する。
【０２２３】 （２．標識プローブと低度の相同性を有するｃＤＮＡ配列またはゲノムＤＮＡ配
列の取得） プローブ配列との相同性レベルが低いｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを同定する
ために、上記手順を改変することが可能である。例えば、検出可能プローブとの
相同性が低いｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを取得するために、より低いストリン
ジェント条件を使用してもよい。例えば、ナトリウム濃度が約１Ｍのハイブリダ
イゼーション緩衝液中で、ハイブリダイゼーション温度を、６８℃から４２℃ま
で５℃ずつ下げてもよい。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション
温度にて、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでフィルターを洗浄してもよい。これら
の条件は、５０℃以上で「中程度」条件、５０℃未満で「低度」条件であると考
えられる。
【０２２４】 あるいは、ホルムアミドを含む６×ＳＳＣのような緩衝液中、温度４２℃でハ
イブリダイゼーションを実施してもよい。この場合、プローブとの相同性レベル
が低いクローンを同定するために、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムア
ミド濃度を５０％から０％まで５％ずつ下げてもよい。ハイブリダイゼーション
後、５０℃の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでフィルターを洗浄してもよい。これ
らの条件は、２５％を超えるホルムアミドで「中程度」条件、２５％未満のホル
ムアミドで「低度」条件と考えられる。プローブにハイブリダイズしたｃＤＮＡ
またはゲノムＤＮＡを、オートラジオグラフィーで同定する。
【０２２５】 （３．取得したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと、５’ＥＳＴ、コンセンサスコン
ティグ化５’ＥＳＴ、または伸長ｃＤＮＡとの間の相同性の程度、あるいは、取
得したｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡによりコードされるポリペプチドと、５’Ｅ
ＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ、または伸長ｃＤＮＡによりコード
されるポリペプチドとの間の相同性の程度の決定） ハイブリダイズしたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡと、プローブの起源である５
’ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡとの間の相
同性のレベルを決定するために、ハイブリダイズした核酸のヌクレオチド配列と
、プローブの起源である５’ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまた
は伸長ｃＤＮＡとを比較する。プローブの起源である５’ＥＳＴ、コンセンサス
コンティグ化５’ＥＳＴまたは伸長ｃＤＮＡの配列および検出可能なプローブに
ハイブリダイズしたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの配列を、以下に記載の、下記
のようなコンピュータ読取可能媒体に記憶し、当業者に周知の様々なアルゴリズ
ムのいずれかを使用して互いに比較することができる。
【０２２６】 ハイブリダイズするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡによりコードされるポリペプ
チドと、プローブの起源である５’ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳ
Ｔまたは伸長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドとの間の相同性のレベル
を決定するために、ハイブリダイズした核酸によりコードされるポリペプチド配
列と、プローブの起源である５’ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ
または伸長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列とを比較する。プロー
ブの起源である５’ＥＳＴ、コンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたは伸長ｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチドの配列および検出可能なプローブにハイ
ブリダイズしたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡによりコードされるポリペプチド配
列を、下記のようなコンピュータ読取可能媒体に記憶し、以下に記載の当業者に
周知の様々なアルゴリズムのいずれかを使用して互いに比較することができる。
【０２２７】 当技術分野で周知の様々な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれか
を使用してタンパク質および／または核酸配列相同性を評価することができる。
このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳ
ＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、およびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Pearson およびLi
pman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-2448; Altschulら、1990,
J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Thompsonら、1994, Nucleic Acids Res. 22(2)
:4673-4680; Higginstら、1996, Methods Enzymol. 266:383-402; Altschulら、19
90, J. Mol. Biol. 215(3):403-410; Altschulら、1993, Nature Genetics 3:266
-272）が挙げられるが、決してこの限りではない。
【０２２８】 特に好ましい実施形態において、当技術分野で周知のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ
Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を使用して
タンパク質および核酸配列相同性を評価する（例えば、KarlinおよびAltschul,
1990, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:2267-2268; Altschulら、1990, J. Mol. B
iol. 215:403-410; Altschulら、1993, Nature Genetics 3:266-272; Altschulら
、1997, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402を参照）。特に、５つの特殊なＢＬＡＳ
Ｔプログラムを使用して、下記の作業を実施する： （１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３は、アミノ酸照会配列を、タンパク質
配列データベースと比較する。 （２）ＢＬＡＳＴＮは、ヌクレオチド照会配列を、ヌクレオチド配列データベ
ースと比較する。 （３）ＢＬＡＳＴＸは、照会ヌクレオチド配列（両鎖）の概念上の６フレーム
翻訳産物を、タンパク質配列データベースと比較する。 （４）ＴＢＬＡＳＴＮは、照会タンパク質配列を、全６リーディングフレーム
（両鎖）内の、翻訳されたヌクレオチド配列データベースと比較する。 （５）ＴＢＬＡＳＴＸは、ヌクレオチド照会配列の６フレーム翻訳を、ヌクレ
オチド配列データベースの６フレーム翻訳と比較する。
【０２２９】 ＢＬＡＳＴプログラムは、照会アミノ酸配列または核酸配列と、好ましくはタ
ンパク質または核酸配列データベースから取得した試験配列との間の、本明細書
で「高スコアセグメント対」と呼ぶ類似したセグメントを同定することにより、
相同な配列を同定する。スコアマトリックス（その多くは当技術分野で周知であ
る）により、高スコアセグメント対が同定される（すなわち、アラインメントさ
れる）ことが好ましい。好ましくは、使用するスコアマトリックスは、ＢＬＯＳ
ＵＭ６２マトリックス（Gonnetら、1992, Science 256:1443-1445; Henikoffお
よびHenikoff, 1993, Proteins 17:49-61）である。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリッ
クスほど好ましくはないが、ＰＡＭマトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリック
スを使用してもよい（例えば、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編、1978
, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequen
ce and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundationを
参照のこと）。
【０２３０】 ＢＬＡＳＴプログラムは、同定された全ての高スコアセグメント対の統計学的
有意性を評価し、使用者指定パーセントの相同性などの、使用者が指定する有意
性の閾値を満足させるセグメントを好ましくは選択する。Ｋａｒｌｉｎの統計学
的有意性の式（例えば、KarlinおよびAltschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87:2267-2268を参照のこと）を使用して、高スコアセグメント対の統計学
的有意性を評価することが好ましい。
【０２３１】 試験した配列長および相同性の程度に応じて、上記アルゴリズムと一緒に使用
されるパラメータを改変することが可能である。一部の実施形態では、このパラ
メータは、使用者からのインストラクションがない条件で、アルゴリズムにより
使用されるデフォルトパラメータであってもよい。
【０２３２】 一部の実施形態において、Brutlagら（Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990
）に記載されているＦＡＳＴＤＢアルゴリズムを使用して、ハイブリダイズした
核酸と、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、または５’コンセン
サスコンティグ化ＥＳＴとの間の相同性のレベルを、決定することが可能である
。このような分析では、このパラメータを、下記の通りに選択してもよい：マト
リックス＝一段ユニタリ（Ｕｎｉｔａｒｙ）、ｋタプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）＝４
、ミスマッチペナルティ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝１、連結ペナ
ルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝３０、無作為化群長（Ｒａｎｄｏ
ｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕ
ｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ）＝１、間隙ペナルティ（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝５
、間隙サイズペナルティ＝０．０５、どちらが短くても、ウインドウサイズ＝５
００またはプローブにハイブリダイズする配列の長さ。相同性レベルを算出する
とき、ＦＡＳＴＤＢプログラムは５’切断または３’切断を考慮しないため、プ
ローブにハイブリダイズする配列が、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡ、５’
ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴの配列と比較して切り取ら
れている場合、ハイブリダイズ配列と一致しないか、またはアラインメントして
いない伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ
のヌクレオチドの数を算出し、ハイブリダイズ配列の総ヌクレオチドのうちの、
一致しないまたはアラインメントしていない全ヌクレオチドを表す百分率を決定
し、この百分率を相同性レベルから差し引くことによって、相同性レベルを手で
調整する。例えば、ハイブリダイズ配列が７００ヌクレオチドの長さであり、伸
長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ配列が１
０００ヌクレオチドの長さであれば、伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセ
ンサスコンティグ化５’ＥＳＴの５’末端における最初の３００塩基が、ハイブ
リダイズ配列に存在せず、重複する７００ヌクレオチドが同じである場合、相同
性レベルは、下記の通りに調整されるであろう。一致せず、アラインメントしな
かった、３００塩基は、伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンテ
ィグ化５’ＥＳＴの長さの３０％を表す。重複する７００ヌクレオチドが１００
％同じであれば、調整された相同性レベルは、１００−３０＝７０％相同性とな
る。先の調整は、一致しないまたはアラインメントされなかったヌクレオチドが
、５’末端または３’末端にあるときに行われるに過ぎないことに留意すべきで
ある。一致しないまたはアラインメントしていない配列が内部にあるか、または
他の条件下にあれば、調整は行われない。
【０２３３】 例えば、上記方法を使用して、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳ
Ｔ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴと、少なくとも９５％の核酸相
同性、少なくとも９６％の核酸相同性、少なくとも９７％の核酸相同性、少なく
とも９８％の核酸相同性、少なくとも９９％の核酸相同性、または９９％を超え
る核酸相同性を有する核酸を取得および同定することができる。このような核酸
は、対立遺伝子変異体または他種に由来する関連核酸であってもよい。同様に、
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を次第に低くして、プローブの
起源である伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’Ｅ
ＳＴと、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％または少なく
とも７５％の相同性を有する核酸を取得して同定することができる。
【０２３４】 上記の方法およびＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを、試験した配列長および相
同性の程度によって異なるパラメータ、例えば、使用者からのインストラクショ
ンがない条件で、アルゴリズムにより使用されるデフォルトパラメータと一緒に
使用して、プローブの起源である伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサ
スコンティグ化５’ＥＳＴによりコードされるタンパク質と、少なくとも９９％
、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％
、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％または少なくとも７
５％の相同性を有するタンパク質をコードしている核酸を得ることができる。一
部の実施形態では、「デフォルト」オープニングペナルティ（ｏｐｅｎｉｎｇ
ｐｅｎａｌｔｙ）および「デフォルト」間隙ペナルティ、ならびにＰＡＭ２５０
（標準スコアマトリックス；Dayhoffら、Atlas of Protein Sequence and Struct
ure, Vol. 5, Supp. 3 (1978)）などのスコアマトリックスを使用して、相同性
レベルを決定することができる。
【０２３５】 あるいは、Brutlagら(Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990）により記載され
ているＦＡＳＴＤＢアルゴリズムを使用して、ポリペプチド相同性のレベルを決
定することができる。このような分析では、下記の通りにパラメータを選択する
ことができる：マトリックス＝ＰＡＭ０、ｋ−タプル＝２、ミスマッチペナルテ
ィ＝１、連結ペナルティ＝２０、無作為化群長＝０、カットオフスコア＝１、ウ
インドウサイズ＝配列長、間隙ペナルティ＝５、間隙サイズペナルティ＝０．０
５、どちらが短くても、ウインドウサイズ＝５００または相同な配列の長さ。Ｎ
末端および／またはＣ末端欠失の結果として、相同なアミノ酸配列が、伸長ｃＤ
ＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴによりコードさ
れるアミノ酸配列より短ければ、下記の通りに、その結果を手で修正する。第１
に、相同な配列と一致しないかまたはアラインメントしていない伸長ｃＤＮＡ、
５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴによりコードされるア
ミノ酸配列のアミノ酸残基の数を決定する。次いで、一致しないまたはアライン
メントしていないアミノ酸を表す伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサ
スコンティグ化５’ＥＳＴによりコードされる配列の長さのパーセンテージを算
出する。このパーセンテージを、相同性レベルから差し引く。例えば、伸長ｃＤ
ＮＡ、５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴによりコードさ
れるアミノ酸配列が１００アミノ酸の長さであり、かつ相同な配列の長さが８０
アミノ酸である場合、および伸長ｃＤＮＡまたは５’ＥＳＴによりコードされる
アミノ酸配列が、相同な配列に関してＮ末端で切断されている場合、相同性レベ
ルを下記の通りに算出する。先のシナリオでは、伸長ｃＤＮＡ、５’ＥＳＴ、ま
たはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴによりコードされる配列中に、２０個
一致しない、アラインメントしていないアミノ酸がある。これは、伸長ｃＤＮＡ
、５’ＥＳＴ、またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴによりコードされる
アミノ酸配列の長さの２０％を表す。２つの配列の間で、残りのアミノ酸が１０
０５個同じであれば、相同性レベルは、１００％−２０％＝８０％相同性となる
。一致しないまたはアラインメントしていない配列が内部にあるかまたはいずれ
かの他の条件下にある場合、調整は行われない。
【０２３６】 次のパラグラフに略述する通り、５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化
５’ＥＳＴを使用して伸長ｃＤＮＡを取得するために、上述の方法に加えて、他
のプロトコルが利用される。
【０２３７】 ポリＡ選択方法または当業者に周知の他の技術を利用したｍＲＮＡ調製方法を
使用して、目的の組織、細胞、または生物からｍＲＮＡを取得することによって
、伸長ｃＤＮＡを調製することが可能である。ｍＲＮＡのポリＡテイルにハイブ
リダイズすることができる第１のプライマーを、このｍＲＮＡにハイブリダイズ
させ、逆転写反応を実施して、第１のｃＤＮＡ鎖を生成する。
【０２３８】 第１のｃＤＮＡ鎖を、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の配列
の少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む第２のプライマーにハイブリダ
イズさせる。このプライマーは、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２
２の配列に由来する少なくとも１０、１２、１５、１７、１８、２０、２３、２
５、または２８個連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。一部の実施形態
において、プライマーは、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の配
列に由来する３０個より多いヌクレオチドを含む。真正の翻訳開始部位を含む、
全タンパク質コード配列を含む伸長ｃＤＮＡを取得することが望ましい場合、使
用される第２のプライマーは、翻訳開始部位の上流に位置する配列を含む。第１
のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を生成するために、第２のプライマー
を伸長する。あるいは、取得すべきｃＤＮＡの両端に由来するプライマーを使用
して、上述の通りにＲＴ−ＰＣＲを実施してもよい。
【０２３９】 配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の配列を含むｍＲＮＡの配列
と、プライマーをｍＲＮＡにハイブリダイズするＥＳＴ関連核酸のフラグメント
に相補的なフラグメントを含むプライマーとをハイブリダイズさせ、このハイブ
リダイズしたプライマーを逆転写してｍＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を作成する
ことにより、ｍＲＮＡの５’フラグメントを含む伸長ｃＤＮＡを調製することが
可能である。このプライマーは、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２
２に相補的な配列の、少なくとも１０、１２、１５、１７、１８、２０、２３、
２５、または２８個連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。
【０２４０】 その後、第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を合成する。第１のｃ
ＤＮＡ鎖の配列に相補的なプライマーを第１のｃＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせ
、プライマーを伸長して第２のｃＤＮＡ鎖を生成することによって、第２のｃＤ
ＮＡ鎖を作成することが可能である。
【０２４１】 上述の方法を使用して作成した二本鎖伸長ｃＤＮＡを単離してクローニングす
る。伸長ｃＤＮＡを、適当な宿主細胞で複製することができるプラスミドやウイ
ルスベクターなどのベクターにクローニングしてもよい。例えば、宿主細胞は、
細菌、哺乳類、鳥類、または昆虫の細胞であってもよい。
【０２４２】 ｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡにハイブリダイズしたプライマーを逆転写して第
１のｃＤＮＡ鎖を生成し、プライマーを伸長して第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第
２のｃＤＮＡ鎖を作成し、二本鎖ｃＤＮＡを単離して、二本鎖ｃＤＮＡをクロー
ニングする技術は、当業者に周知であり、Current Protocols in Molecular Bio
logy, John Wiley & Sons, Inc. 1997、およびSambrookら、Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989に記載されている。
【０２４３】 あるいは、全長ｃＤＮＡまたは伸長ｃＤＮＡを取得するために、他の手順を使
用してもよい。１つのアプローチでは、全長ｃＤＮＡまたは伸長ｃＤＮＡをｍＲ
ＮＡから調製し、下記の通り二本鎖ファージミドにクローニングする。次いで、
ファージＦ１のＧｅｎｅＩＩ産物のようなエンドヌクレアーゼ、およびエキソヌ
クレアーゼで処理することにより、二本鎖ファージミドのｃＤＮＡライブラリー
を一本鎖にする（Ｃｈａｎｇら、Ｇｅｎｅ１２７：９５−８， １９９３）。Ｅ
ＳＴ関連核酸のフラグメントの配列を含むビオチン化オリゴヌクレオチドを、一
本鎖ファージミドにハイブリダイズする。このフラグメントは、配列番号２４〜
８１１および１６００〜１６２２の配列の少なくとも１０、１２、１５、１７、
１８、２０、２３、２５、または２８個連続したヌクレオチドを含むことが好ま
しい。
【０２４４】 ビオチン化オリゴヌクレオチドとファージミドとの間のハイブリッドを、ハイ
ブリッドをストレプトアビジン被覆常磁性ビーズと共にインキュベートし、磁石
を用いてビーズを回収することによって単離する（Ｆｒｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ， １３： １２４−１３１， １９９２）。その後、このようにし
て得られたファージミドをビーズから放出させ、ビオチン化オリゴヌクレオチド
の設計に使用された５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ配列
に特異的なプライマーを使用して、二本鎖ＤＮＡに変換する。あるいは、Ｇｅｎ
ｅ Ｔｒａｐｐｅｒキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）のようなプロトコルを使用し
てもよい。このようにして得られた二本鎖ＤＮＡを、細菌に形質転換する。５’
ＥＳＴ配列またはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴ配列を含む伸長ｃＤＮＡ
または全長ｃＤＮＡを、コロニーＰＣＲまたはコロニーハイブリダイゼーション
により同定する。
【０２４５】 セクションＩＩＩで上述した方法のいずれかを使用し、全長タンパク質コード
配列またはタンパク質コード配列の一部を含む複数の伸長ｃＤＮＡを、コードさ
れたタンパク質を後で評価するためのｃＤＮＡライブラリーとして提供したり、
下記のような診断用アッセイに使用することができる。
【０２４６】 実施例２１ （全長ｃＤＮＡ） 実施例１９および２０に記載の手順を使用して、様々な組織で、５’ＥＳＴに
由来する伸長ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡを取得した。これらの手段により得ら
れたｃＤＮＡの若干の具体例を、下記のリストに示す。
【０２４７】 この手順を使用して、配列番号１（内部同定番号５８−３４−２−Ｅ７−ＦＬ
２）の全長ｃＤＮＡを取得した。このｃＤＮＡは、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコア
が５．５であるシグナルペプチドＭＷＷＦＱＱＧＬＳＦＬＰＳＡＬＶＩＷＴＳＡ
（配列番号２）をコードする。
【０２４８】 このアプローチを使用して、配列番号３（内部同定番号４８−１９−３−Ｇ１
−ＦＬ１）の全長ｃＤＮＡを取得した。このｃＤＮＡは、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ
スコアが８．２であるシグナルペプチドＭＫＫＶＬＬＬＩＴＡＩＬＡＶＡＶＧ（
配列番号４）をコードする。
【０２４９】 配列番号５（内部同定番号５８−３５−２−Ｆ１０−ＦＬ２）の全長ｃＤＮＡ
もこの手順を使用して取得した。このｃＤＮＡは、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅスコア
が１０．７であるシグナルペプチドＬＷＬＬＦＦＬＶＴＡＩＨＡ（配列番号６）
をコードする。
【０２５０】 さらに、伸長ｃＤＮＡまたは全長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを
、既知の構造モチーフまたは機能的モチーフの存在について、またはタンパク質
ファミリーの構成員の中に十分に保存されている小さいアミノ酸配列であるシグ
ネチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）の存在について、スクリーニングすることが可
能である。ＧＣＧパッケージのＰｒｏｓｃａｎソフトウェアおよびＰｒｏｓｉｔ
ｅ １５．０データベースを使用して、既知のタンパク質シグネチャーおよびモ
チーフの存在についてスクリーニングした、５’ＥＳＴから誘導された数種の全
長ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに関して、得られた結果を以下に示
す。
【０２５１】 配列番号７（内部呼称７８−８−３−Ｅ６−ＣＬ０＿１Ｃ）の全長ｃＤＮＡに
よりコードされ、成人前立腺で発現される配列番号８のタンパク質は、９０位〜
１１２位で特有のＰＲＯＳＩＴＥシグネチャーを示すホスファチジルエタノール
アミン結合性タンパク質に属する。線虫からハエ、酵母、囓歯類および霊長類種
までの、この広範囲におよぶファミリーに由来するタンパク質は、疎水性リガン
ド、例えば、リン脂質やヌクレオチドを結合する。これらのタンパク質は、主と
して脳および精巣において発現し、増殖および／または成熟、精子成熟および運
動性の調節、ならびに膜リモデリングにおいてある一定の役割を果たすと考えら
れる。これらのタンパク質は、シグナル伝達または酸化還元反応のいずれかを介
して作用する可能性がある（総説に関しては、SchoentgenおよびJolles, FEBS L
etters, 369:22-26 (1995）を参照のこと）。合わせて考えると、以上のデータ
から、配列番号８のタンパク質は、増殖、成熟および膜改造においてある一定の
役割を果たし、かつ／またはオスの生殖能に関することが示唆される。従って、
これらのタンパク質は、癌、神経変性疾患、および／またはオスの繁殖力および
不妊に関する疾患の診断および／または治療に有用な可能性がある。
【０２５２】 配列番号９（内部呼称１０８−０１３−５−Ｏ−Ｈ９−ＦＬＣ）の全長ｃＤＮ
Ａによりコードされる配列番号１０のタンパク質は、真核生物（酵母、ウサギ、
げっ歯類およびヒト）の間で保存されているリゾホスホリパーゼのファミリーに
相同性を示す。さらに、このファミリーの幾つかの構成員は、カルシウム依存性
ホスホリパーゼＡ２活性を示す（Portillaら、J.Am.Soc.Nephro.、9:1178-1186(19
98)）。このファミリーの全ての構成員は、配列番号１０のタンパク質にも存在す
るカルボキシエステラーゼの活性部位コンセンサスＧＸＳＸＧモチーフ（５４位
〜５８位）を示す。さらに、このタンパク質は、ソフトウェアTopPredII(Claros
およびvon Heijne, CABIOSapplic. Notes,10:685-686(1994))によって予測され
るように１つの膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であり得る。合わせて考え
ると、以上のデータから、配列番号１０のタンパク質は、脂肪酸代謝において、
おそらくホスホリパーゼとして役割を果たす可能性があることが示唆される。従
ってこのタンパク質またはその一部は、癌、糖尿病、およびパーキンソン病およ
びアルツハイマー病などの神経変性障害が挙げられるがこれらに限定されないい
くつかの障害の診断および／または治療に有用な可能性がある。該タンパク質は
また、感染因子に対する炎症応答を調節するおよび／または移植片拒絶を抑制す
るために有用であり得る。
【０２５３】 配列番号１１（内部呼称１０８−００４−５−０−Ｄ１０−ＦＬＣ）の伸長ｃ
ＤＮＡによりコードされる配列番号１２のタンパク質は動物（ヒト、げっ歯類、
ウシおよびトリ）において広範に保存されているβ４−ガラクトシルトランスフ
ェラーゼのサブファミリーに遠縁な相同性を示す。そのような酵素（通常、小胞
体またはゴルジ装置に位置するＩＩ型膜タンパク質）は糖タンパク質、糖脂質、
グリカンおよびラクトースの生合成を触媒する。Bretonら、J.Biochem.、123:1000-
1009(1998）におけるサブファミリーＡの特徴として規定されたそれらの特徴は
、配列番号１２のタンパク質、特にＵＤＰ結合または触媒プロセス自体のいずれ
かに関与すると考えられているＤＶＤモチーフ（１６３位〜１６５位）を含有す
る領域Ｉに極めて良好に保存されている。さらに、配列番号１２のタンパク質は
、ＩＩ型タンパク質の典型的な構造を有している。該タンパク質は、ソフトウェ
アTopPredII(Clarosおよびvon Heijne, CABIOSapplic. Notes,10:685-686(1994)
）によって予測されるように、短い２８アミノ酸長Ｎ末端テイル、２９位〜４９
位の膜貫通セグメントおよび２７８アミノ酸長Ｃ末端テイルを含む。合わせて考
えると、以上のデータから、配列番号１２のタンパク質は、ポリ多糖の生合成、
ならびに糖タンパク質および糖脂質の炭水化物モチーフの生合成においてならび
に／または細胞間認識においてある一定の役割を果たすとも考えられる。従って
、このタンパク質は癌、動脈硬化、心血管障害、自己免疫障害および慢性関節リ
ュウマチを含むリウマチ性疾患を含むが、この限りではない、幾つかの障害の診
断および／または治療に有用な可能性がある。
【０２５４】 配列番号１３の全長cDNAによりコードされる配列番号１４のタンパク質（内部
呼称１０８−００９−５−０−Ａ２−ＦＬＣ）は、転写因子のｂＺＩＰファミリ
ー、具体的にはヒト内腔(ｌｕｍａｎ)タンパク質に広範な相同性を示す。（Luら
、Mol. Cell. Biol.,17:5117-5126 (1997)）。一致は、塩基性ＤＮＡ結合ドメイ
ンおよびタンパク質の二量体化を可能にするロイシンジッパーから成る全ｂＺＩ
Ｐドメインを含む。特徴的なＰＲＯＳＩＴＥシグネチャー（２２４位〜２３７位
）により示されるように、塩基性ドメインは、２３３位においてアスパラギン酸
によりグルタミン酸が保存的置換されていることを除き、配列番号１４のタンパ
ク質に保存されている。ロイシンジッパーの典型的なＰＲＯＳＩＴＥシグネチャ
ー（２５９位〜２８０）も認められた。合わせて考えると、これらのデータから
、配列番号１４のタンパク質は、ＤＮＡに結合し、転写因子として遺伝子発現を
調節することが示唆される。従って、このタンパク質は、癌を含むがこれに限定
されない数種の障害の診断および／または治療に有用であり得る。
【０２５５】 上記の全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドを含有する細菌クローンは、先に示
した内部同定番号で本発明者の研究室に現在保存されている。適切な細菌のクロ
ーンのアリコートを適切な培地で増殖させることによって、寄託物からインサー
トを回収することができる。次いで、アルカリ溶解ミニプレップまたは大量アル
カリ溶解プラスミド単離法などの、当業者に周知のプラスミド単離手順を使用し
て、プラスミドＤＮＡを単離することができる。必要に応じて、塩化セシウム勾
配上での遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、または陰イオン交換クロマ
トグラフィーによって、プラスミドＤＮＡをさらに濃縮することが可能である。
次いで、当業者に周知の標準的なクローニング技術を用いて、これらの手順を用
いて得られるプラスミドＤＮＡを操作してもよい。あるいは、インサートの両末
端で設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことができる。次いで、当業者に
周知の標準的なクローニング技術を用いて、ｃＤＮＡインサートに対応するＰＣ
Ｒ産物を操作することができる。
【０２５６】 （Ｖ．ＥＳＴ関連核酸またはそのフラグメントによりコードされるタンパク質も
しくはポリペプチドの発現） ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セ
グメントおよびＥＳＴ関連核酸の位置的セグメントのフラグメントを使用して、
それらがコードするポリペプチドを発現させることができる。特に、それらを使
用して、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント、Ｅ
ＳＴ関連ポリペプチドの位置的セグメント、またはＥＳＴ関連ポリペプチドの位
置的セグメントのフラグメントを発現させることができる。一部の実施形態にお
いて、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、およびＥＳＴ関連
核酸の位置的セグメントのフラグメントを使用し、分泌タンパク質の全ポリペプ
チド（すなわち、シグナルペプチドと成熟ポリペプチド）、成熟タンパク質（す
なわち、シグナルペプチドの切断後に生じるポリペプチド）、または分泌タンパ
ク質のシグナルペプチドを発現させることができる。必要に応じて、シグナルペ
プチドをコードしている核酸を使用して、発現したタンパク質の分泌を促進する
ことができる。下記の通りに、複数のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグ
メント、ＥＳＴ関連核酸の位置的セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置的セ
グメントのフラグメントを、発現ベクターに同時にクローニングして、コードさ
れたタンパク質を分析するための発現ライブラリーを作成することができること
は明白であろう。
【０２５７】 実施例２２ （５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴに対応する遺伝子によ
ってコードされるタンパク質の発現） それらのコードされたタンパク質を発現するために、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ
関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核
酸の位置セグメントのフラグメントを、適切な発現ベクター内にクローニングす
る。一部のケースでは、ＥＳＴ関連ポリペプチド，ＥＳＴ関連ポリペプチドのフ
ラグメント，ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペ
プチドの位置セグメントのフラグメントをコードする核酸を適切な発現ベクター
内にクローニングすることが可能である。
【０２５８】 一部の実施形態においては、発現ベクター内に挿入された核酸は、配列番号２
４〜８１１から成るグループの中から選択された１つの配列のコード配列を含む
ことができる。他の実施形態においては、発現ベクター内に挿入された核酸は、
配列番号７６６〜７９２のうちの１つの全コード配列（すなわちシグナルペプチ
ドおよび成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド）を含んでもよい。一部の
実施形態においては、発現ベクター内に挿入される核酸は、成熟ポリペプチド（
すなわち、シグナルペプチドの切断後に生成されるポリペプチドをコードするヌ
クレオチド）をコードする配列番号７６６〜７９２の配列のうちの１つの配列の
ヌクレオチドを含んでもよい。さらなる実施形態においては、発現ベクター内に
挿入される核酸は、発現されたタンパク質の分泌を容易にするべくシグナルペプ
チドをコードする２４〜２７８および７６６〜７９２のヌクレオチドを含んでも
よい。発現ベクター内に挿入される核酸は、同様に、発現レベルを調節する配列
または組織特異的発現を付与する配列といったような、シグナルペプチドをコー
ドする配列の上流側の配列を含んでもよい。
【０２５９】 発現ベクター内に挿入される核酸は、配列番号８１２〜１５９９の配列の１つ
を含むポリペプチドをコードすることができる。一部の実施形態では、発現ベク
ター内に挿入される核酸は、配列番号１５５４〜１５８０のうちの１つの中に含
まれる完全ポリペプチド配列（すなわちシグナルペプチドおよび成熟ポリペプチ
ド）をコードすることができる。他の実施形態においては、発現ベクター内に挿
入される核酸は、配列番号１５５４〜１５８０の配列のうちの１つの中に含まれ
る成熟ポリペプチド（すなわち、シグナルペプチドの切断後に生成されるポリペ
プチド）をコードすることができる。さらなる実施形態においては、発現ベクタ
ー内に挿入される核酸は、８１２〜１５１６および１５５４〜１５８０の配列の
うちの１つの中に含まれるシグナルペプチドをコードすることができる。
【０２６０】 発現させるべきタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸は、従来のク
ローニング技術を用いて発現ベクター内のプロモーターに機能し得る形で連結さ
れる。発現ベクターは、当該技術分野において既知の哺乳動物、酵母、昆虫また
は細菌発現系のいずれであってもよい。市販のベクターおよび発現系は、Geneti
cs Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega
(Madison, Wisconsin) および Invitrogen (San Diego, California) を含めた
様々な供給業者から入手可能である。望ましい場合には、発現を増強し適切なタ
ンパク質折りたたみを容易にするために、Ｈａｔｆｉｅｌｄらの米国特許第５，
０８２，７６７号によって説明されているように、発現ベクターが中に導入され
る特定の発現生物のために、配列のコドンコンテキストおよびコドン対合を最適
化することができる。
【０２６１】 以下のものは、上述の核酸によってコードされるタンパク質を発現するための
一つの方法例として提供されている。一部のケースでは、発現させるべきタンパ
ク質またはポリペプチドをコードする核酸は、メチオニン開始コドンおよびポリ
Ａシグナルを内含する。発現させるべきポリペプチドをコードする核酸に、開始
部位として役立つメチオニンが欠如している場合、従来の技術を用いて核酸の第
１のコドンの隣りに開始メチオニンを導入することができる。同様にして、発現
させるべきタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸にポリＡシグナルが
欠如している場合、例えば、ＢａｌＩおよびＳａｌ制限エンドヌクレアーゼ酵素
を用いてｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からポリＡシグナルをスプライシン
グし、それを哺乳動物の発現ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中に
取込ませることによって、構築物にこの配列を付加することができる。ｐＸＴ１
はＬＴＲおよびモロニーマウス白血病ウイルスからの ｇａｇ遺伝子の一部分を
含有する。構築物の中のＬＴＲの位置は、効率の良い安定したトランスフェクシ
ョンを可能にする。ベクターには単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータおよ
び選択可能なネオマイシン遺伝子が内含されている。発現させるべきポリペプチ
ドをコードする核酸を、発現させるべきタンパク質またはポリペプチドをコード
する核酸がポリＡシグナルとの関係において確実に正しく配置されるよう注意を
払いながら、発現させるべきタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸に
相補的であり、かつ５’プライマーに取り込まれたＰｓｔＩおよび３’プライマ
ーの５’末端に取込まれたＢａｌ ＩＩ の制限エンドヌクレアーゼ配列を含有
するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して細菌ベクターからＰＣＲによって
得る。結果としてもたらされるＰＣＲ反応から得られた精製されたフラグメント
は、ＰｓｔＩで消化され、エキソヌクレアーゼで平滑末端にされ、Ｂａｌ ＩＩ
で消化され、精製され、今やポリＡシグナルを含有しＢａｌ ＩＩ で消化さ
れたｐＸＴ１に連結される。
【０２６２】 連結された生成物を、製品明細の中で概略的に記された条件下でリポフェクチ
ン（Life Technologies, Inc., Grand Island, New York）を用いて、マウスの
ＮＩＮ３Ｔ３細胞内にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を６
００μｇ／ｍのｌのＧ４１８（Sigma St. Louis, Missouri） の中で増殖させ
た後、正のトランスフェクタントが選択される。
【０２６３】 あるいは、発現させようとするタンパク質またはポリペプチドをコードする核
酸を、ｐＥＤ６ｄｐｃ２内にクローニングさせることが可能である。結果として
得られたｐＥＤ６ｄｐｃ２構築物を、ＣＯＳ１細胞といったような適切な宿主細
胞内にトランスフェクトさせることができる。メトトレキセート耐性細胞を選択
し増殖させる。発現されたタンパク質またはポリペプチドは、上述のとおりに分
離、精製または富化することができる。
【０２６４】 所望のタンパク質またはポリペプチドの発現を確認するためには、タンパク質
またはポリペプチドをコードする核酸インサートを伴うベクターを含有する細胞
により産生されたタンパク質またはポリペプチドを、このようなインサートの欠
如したものと比較する。発現されたタンパク質を、クーマシーブルーまたは銀染
色といったような当業者に良く知られた技術を用いてか、または、この核酸イン
サートによってコードされるタンパク質またはポリペプチドに対する抗体を用い
て検出する。目的のタンパク質を特異的に認識する能力をもつ抗体を、適切な核
酸によりコードされた配列をもつ合成１５−マーペプチドを用いて生成すること
ができる。合成ペプチドを、核酸によってコードされるポリペプチドに対する抗
体を生成するべくマウス内に注入する。
【０２６５】 核酸インサートによってコードされるタンパク質またはポリペプチドが分泌さ
れた場合、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸インサートを
含有する発現ベクターを含む宿主細胞または生体から調製された培地を、対照の
細胞または生体から調製された培地と比較する。対照細胞からの調製物には存在
しないバンドが、核酸インサートを含有する細胞からの培地内に存在することは
、その核酸インサートによりコードされるタンパク質またはポリペプチドが発現
され分泌されつつあるということを表している。一般に、核酸インサートにより
コードされるタンパク質に対応するバンドは、核酸インサートのオープンリーデ
ィングフレーム内のアミノ酸の数に基づいて予想されるものに近い移動度を有す
ることになる。しかしながら、このバンドは、グリコシル化、ユビキチン化また
は酵素的切断といった修飾の結果として予想されるものとは異なる移動度を有す
る可能性がある。
【０２６６】 あるいは、上述の発現ベクターから発現されたタンパク質がその分泌を指令す
る配列を含んでいない場合、分泌されたタンパク質またはその一部分をコードす
るインサートを伴う発現ベクターを含有する宿主細胞から発現されたタンパク質
を、インサートを伴わない発現ベクターを含有する対照宿主細胞内で発現された
タンパク質と比較することができる。インサート伴わない発現ベクターを含有す
る細胞からのサンプルには存在しないバンドがインサートを伴う発現ベクターを
含有する細胞からのサンプル内に存在することは、所望のタンパク質またはその
一部分が発現されつつあることを表している。一般に、このバンドは、分泌され
たタンパク質またはその一部分について予想される移動度を有することになる。
しかしながら、このバンドは、グリコシル化、ユピキチン化または酵素的切断と
いったような修飾の結果として予想されるものとは異なる移動度を有する可能性
がある。
【０２６７】 発現されたタンパク質またはポリペプチドは、さまざまな方法を用いて精製、
単離または富化することができる。一部の方法においては、タンパク質またはポ
リペプチドは、それに機能し得る形でリンクされたネイティブなシグナルペプチ
ドまたは異種シグナルペプチドを介して培地の中に分泌され得る。一部の方法で
は、タンパク質またはポリペプチドを、ニッケル結合ポリペプチドといったよう
なその単離、精製または富化を容易にする非相同ポリペプチドにリンクさせるこ
とが可能である。該タンパク質またはポリペプチドは同様に、ゲル電気泳動、イ
オン交換クロマトグラフィー、サイズクロマトグラフィー、ｈｐｌｃ、塩沈殿、
免疫沈降、これらの方法のいずれかの組合せ、または、当業者にとって良く知ら
れた単離、精製または富化技術のいずれかによっても得ることができる。
【０２６８】 核酸インサートによってコードされるタンパク質は同様に、以下でさらに詳し
く記述するように、コードされるタンパク質またはポリペプチドに対する抗体を
用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーを使用した標準的イムノクロマ
トグラフィ技術を用いても精製され得る。抗体産生が可能でない場合、所望のタ
ンパク質またはポリペプチドをコードする核酸インサートを、キメラポリペプチ
ドを利用した精製スキームの中で使用するように設計された発現ベクター内に取
込むことが可能である。このような戦略においては、核酸インサートのコード配
列を、キメラの残り半分をコードする遺伝子とインフレームで連結する。キメラ
の残り半分は、β−グロビンまたはニッケル結合性ポリペプチドでもよい。次い
で、付着させられたβ−グロビンまたはニッケル結合に対する抗体を有するクロ
マトグラフィマトリクスを、キメラタンパク質を精製するために使用する。遺伝
子またはニッケル結合ポリペプチドと伸長ｃＤＮＡまたはその一部分の間でプロ
テアーゼ切断部位が操作される。かくして、キメラの２つのポリペプチドを、プ
ロテアーゼ消化により互いから分離することができる。
【０２６９】 β−グロビンキメラを生成するための１つの有用な発現ベクターは、ウサギの
β−グロビンをコードするｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。ウサギβ
−グロビン遺伝子のイントロンＩＩは、発現された転写物のスプライシングを容
易にし、構築物内に取込まれたポリアデニル化シグナルは、発現レベルを増大さ
せる。記述のこれらの技術は、分子生物学の当業者には周知のものである。標準
的方法は、Ｄａｖｉｓら、（分子生物学の基本的方法、L.G.Davis, M.D.Dibner
およびJ.F. Battey編、Elsevier Press NY,1986）といったような方法教本中で公
表されており、方法のうちの多くがStratagene、Life Technologies,Inc、またはP
romegaから入手可能である。さらにポリペプチドは、Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓ（登録商標）翻訳キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）といったようなｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳システムを用いて、構築物から産生可能である。
【０２７０】 核酸インサートによってコードされるタンパク質またはポリペプチドの発現お
よび精製の後、以下の実施例２３に記述する通りにさまざまな細胞型の表面に結
合する能力について精製タンパク質を試験することができる。これらの核酸イン
サートから発現された複数のタンパク質を、以下で詳細に記述する活性ならびに
活性決定のためのアッセイが利用可能であるその他の生物学的役割について、同
時に評価されるべくタンパク質のパネル内に含まれることが可能である、という
ことがわかるだろう。
【０２７１】 実施例２３ （細胞表面に結合するか否かを決定するための、分泌タンパク質の分析） 実施例２２に記述されているもののような発現ベクターの中に、ＥＳＴ関連核
酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、ＥＳＴ
関連核酸の位置セグメントのフラグメント、ＥＳＴ関連ポリペプチドコードする
核酸、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメントをコードする核酸、ＥＳＴ関連ポ
リペプチドの位置セグメントをコードする核酸またはＥＳＴ関連ポリペプチドの
位置セグメントのフラグメントをコードする核酸をクローニングする。コードさ
れたタンパク質またはポリペプチドを、上述の通りに、精製、単離または富化す
る。精製、単離または富化の後、上述のタンパク質またはポリペプチドを、当業
者にとって既知の技術を用いて標識する。細胞表面上に存在するあらゆるレセプ
ターにタンパク質が結合できるようにするため、さまざまな臓器または組織に由
来する細胞または細胞系と、標識タンパク質またはポリペプチドをインキュベー
トする。インキュベーションの後、非特異的に結合したタンパク質またはポリペ
プチドを除去するため細胞を洗浄する。特異的に結合した標識タンパク質または
ポリペプチドをオートラジオグラフィーによって検出する。代替的には、非標識
タンパク質またはポリペプチドを細胞と共にインキュベートし、蛍光性分子とい
ったようなそれに付着した検出可能な標識を有する抗体を用いて、検出すること
が可能である。
【０２７２】 細胞表面結合の特異性は、標識タンパク質またはポリペプチドと共にさまざま
な量の非標識タンパク質またはポリペプチドをインキュベートする競合分析を行
なうことによって分析可能である。細胞表面に結合された標識タンパク質または
ポリペプチドの量は、競合する非標識タンパク質またはポリペプチドの量が増大
するにつれて減少する。対照としては、いくつかの結合反応の中で、標識タンパ
ク質またはポリペプチドと無関係の非標識タンパク質またはポリペプチドをさま
ざまな量で内含させる。細胞表面に結合された標識タンパク質またはポリペプチ
ドの量は、漸増量の無関係の非標識タンパク質を含有する結合反応においては減
少せず、このことはすなわち、核酸によりコードされたタンパク質またはポリペ
プチドが特異的に細胞表面に結合するということを示している。
【０２７３】 上述した通り、ヒトのタンパク質は、重要な生理学的効果を多数有しその結果
貴重な治療剤資源であることが示されてきた。上述の通りに作られたヒトタンパ
ク質またはポリペプチドは、以下で記述する通り、その生理学的活性を決定する
べく評価することができる。
【０２７４】 実施例２４ （サイトカイン、細胞増殖または細胞分化活性を対象とした、発現されたタンパ
ク質またはポリペプチドのアッセイ） 上述の通り、一部のヒトタンパク質は、サイトカインとして作用するかまたは
細胞増殖または分化に影響を及ぼす可能性がある。既知の全てのサイトカインを
含め、今日までに発見された数多くのタンパク質因子は、単数または複数の因子
依存性増殖アッセイにおいて活性を示してきており、従って、このアッセイは、
サイトカイン活性を適切に確認するものとして役立つ。本発明のタンパク質また
はポリペプチドの活性は、制限的な意味なく、３２Ｄ，ＤＡ２，ＤＡ１Ｇ，Ｔ１
０，Ｂ９，Ｂ９／１１，ＢａＦ３，ＭＣ９／Ｇ，Ｍ+（ｐｒｅＢＭ+，２Ｅ８，Ｒ
Ｂ５，ＤＡ１，１２３，Ｔ１１６５，ＨＴ２，ＣＴＬＬ２，ＴＦ−１，Ｍｏ７ｃ
およびＣＭＫを含む細胞系のための多数の日常的な因子依存性細胞増殖アッセイ
のうちのいずれか１つによって立証される。上述のように調製されたタンパク質
またはポリペプチドは、以上で記述されているものまたは以下の参考文献の中で
記述されているもののようなアッセイの中で、Ｔ細胞または胸腺細胞の増殖を調
節するその能力について評価することができる：Current Protocols in Immunol
ogy（免疫学における現行プロトコル）J.E.Coliganら編、Greene Publishing As
sociates and Wiley-Interscience;Takaiら、J.Immunol. 137:3494-3500,1986.,
Bertagnolliら、J. Immunol. 145:1706-1712,1990., Bertagnolliら、Cellular Im
munology 133:327-341,1991.Bertagnolliら、J.Immunol. 149:3778-3783,1992;Bo
wmanら、J.Immunol.152:1756-1761,1994。
【０２７５】 さらに、脾細胞、リンパ節細胞および胸線細胞の、サイトカイン産生および／ま
たは増殖についての数多くのアッセイが知られている。これらには、Current Pr
otocols in Immunology. J.E. Coliganら、Eds.,1:3.12.1-3.12.14,John Wiley a
nd Sons, Toronto. 1994;および Schreiber, R.D. Current Protocols in Immun
ology中.,前出1:6.8.1-6.8.8.の中で開示されている技術が含まれる。
【０２７６】 上述のように調製されたタンパク質またはポリペプチドは、同様に、造血細胞
またはリンパ球生成細胞の増殖および分化を調節する能力についてもアッセイさ
れ得る。以下の参考文献の中のアッセイを含め、かかる活性を対象とした数多く
のアッセイが当業者にはよく知られている：Bottomlyら、Current Protocols in
Immunology中、前出1:6.3.1-6.3.12,; de Vriesら、J.Exp.Med.173:1205-1211,199
1;Moreauら、Nature 36:690-692,1988;Greenbergerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
.S.A 80:2931-2938,1983;Nordan, R., Current Protocols in Immunology、 前出
1:6.6.1-6.6.5;Smithら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861,1986;Be
nnettら、Current Protocols in Immunology、前出1:6.15.1;Ciarlettaら、Current
Protocols in Immunology、 前出1:6.13.1。
【０２７７】 上述のように調製されたタンパク質またはポリペプチドは、抗体に対するＴ細
胞応答を調節するそれらの能力についてもアッセイすることができる。以下の参
照文献の中で記述されたアッセイを含め、このような活性のための数多くのアッ
セイが当業者には良く知られている：上述の Current Protocols in Immunolog
y中の第３章（マウスリンパ球機能についての Ｉｎ ｖｉｔｒｏ アッセイ）
、第６章（サイトカインおよびその細胞レセプター）および第７章（ヒトにおけ
る免疫学的研究）；Weinbergerら、Proc Natl. Acad. Sci. USA77:6091-6095,198
0;Weinbergerら、Eur. J. Immun. 11:405-411,1981;Takaiら、J.Immunol.137:3494
-3500,1986;Takaiら、J. Immunol.140:508-512,1988。
【０２７８】 このとき、サイトカイン、細胞増殖または細胞分化活性を示すこれらのタンパ
ク質またはポリペプチドを、医薬として処方し、細胞増殖または分化の誘発が有
益である臨床的状況を治療するのに使用することができる。あるいは、以下でさ
らに詳細に記述した通り、これらのタンパク質またはポリペプチドをコードする
核酸またはこれらのタンパク質またはポリペプチドの発現を調節する核酸を適切
な宿主細胞内に導入して、望みに応じてタンパク質またはポリペプチドの発現を
増減させることが可能である。
【０２７９】 実施例２５ （免疫系調節物質としての活性を対象とした発現されたタンパク質またはポリペ
プチドのアッセイ） 上述のとおりに調製されたタンパク質およびポリペプチドを、免疫調節物質と
してのその効果について評価することもできる。例えば該タンパク質またはポリ
ペプチドを、胸腺細胞または脾細胞の細胞障害性に影響を及ぼすその活性を対象
とした評価することが可能である。以下の参考文献の中に記述されているアッセ
イを含めて、かかる活性を対象とした数多くのアッセイが当業者にはよく知られ
ている：Current Protocols in Immunology 中の第３章（マウスリンパ球機能
についての In vitro アッセイ、3.1-3.19）および第７章（ヒトにおける免疫
学的研究）、J.E. Coliganら、Eds, Greene Publishing Associates および Wile
y-Interscience;Herrmannら、Proc. Natl.Acad. Sci. USA 78:2488-2492,1981;He
rrmannら、J.Immunol. 128:1968-1974,1982;Handaら、J.Immunol. 135:1564-1572,
1985;Takaiら、J.Immunol.137:3494-3500,1986;Takaiら、J.Immunol. 140:508-512
,1988;Bowmanら、J.Virology61:1992-1998;Bertagnolliら、Cell Immunol.133:327
-341,1991;Brownら、J.Immunol.153:3079-3092,1994。
【０２８０】 上述のように調製されたタンパク質またはポリペプチドを、Ｔ細胞依存性免疫
グロブリン応答およびアソタイプスイッチに対するそれらの効果についても評価
することができる。以下の参考文献中で開示されているアッセイを含め、かかる
活性を対象とした数多くのアッセイが当業者にはよく知られている。Maliszewsk
i, J.Immunol. 144:3028-3033,1990;Mondら、Current Protocols in Immunology、
1:3.8.1-3.8.16， 前出。
【０２８１】 上述のとおり調製されたタンパク質またはポリペプチドは、Ｔｈ１細胞および
細胞障害性リンパ球に対するそれらの効果を含め、免疫エフェクター細胞に対す
るそれらの効果について評価することもできる。以下の参照文献の中で開示され
たアッセイを含め、このような活性のための数多くのアッセイが当業者には良く
知られている：上述の Current Protocols in Immunology中の第３章（マウス
リンパ球機能についての In vitro アッセイ3.1-3.19）および第７章（ヒトに
おける免疫学的研究）；Takaiら、J.Immunol.137:3494-3500,1986;Takaiら、J. Im
munol.140:508-512,1988;Bertagnolliら、J.Immunol.149:3778-3783,1992。
【０２８２】 上述のとおりに調製されたタンパク質およびポリペプチドを、ナイーブＴ細胞
の樹状細胞介在性活性化に対するその効果について評価することもできる。以下
の参考文献の中で開示されているアッセイを含めて、かかる活性を対象とした数
多くのアッセイが当業者にはよく知られている：Gueryら、J. Immunol. 134:536-
544,1995;Inabaら、J.Exp. Med. 173:549-559,1991;Macatoniaら、J.Immunol.154:
5071-5079,1995;Porgadorら、J. Exp. Med 182:255-260,1995;Nairら、J.Virol. 6
7:4062-4069,1993;Huangら、Science 264:961-965,1994;Macatoniaら、J.Exp. Med
169:1255-1264,1989;Bhardwajら、Journal of Clinical Investigation94:797-8
07,1994;およびInabaら、J. Exp. Med 172:631-640,1990。
【０２８３】 上述のとおりに調製されたタンパク質およびポリペプチドを、リンパ球の寿命
に対するその影響について評価することもできる。以下の参考文献の中で開示さ
れているアッセイを含めて、かかる活性を対象とした数多くのアッセイが当業者
にはよく知られている：Darzynkiewiczら、Cytometry 13:795-808,1992;Gorczyca
ら、Leukemia 7:659-670,1993;Gorczycaら、Cancer Res.53:1945-1951,1993;Itoh
ら、Cell 66:233-243,1991;Zacharchuk, J. Immunol. 145:4037-4045,1990;Zamai
ら、Cytometry 14:891-897,1993;Gorczycaら、Int. J. Oncol.1:639-648,1992。
【０２８４】 上述のとおりに調製されたタンパク質またはポリペプチドを、Ｔ細胞の分化の
方向が決定され、細胞が発達してゆく初期の段階に対するそれらの影響について
評価することもできる。以下の参考文献の中で開示されているアッセイを制限的
意味なく含めて、かかる活性を対象とした数多くのアッセイが当業者にはよく知
られている：Anticaら、Blood84:111-117,1994;Fineら、Cell.Immunol.155:111-12
2,1994;Galyら、Blood85:2770-2778,1995;Tokiら、Proc. Nat. Acad Sci. USA 88:
7548-7551,1991。
【０２８５】 このとき免疫系調節物質活性としての活性を示すこれらのタンパク質またはポ
リペプチドを医薬として製剤して、免疫活性の調節が有益である臨床的状況を治
療するために使用することができる。例えば、該タンパク質またはポリペプチド
は、例えばＴおよび／またはＢリンパ球の成長および増殖を（アップまたはダウ
ン）レギュレートする上でならびにＮＫ細胞およびその他の細胞集団の細胞溶解
活性に影響を及ぼす上で、さまざまな免疫不全および障害（重症複合型免疫不全
を含む）の治療において有用であり得る。これらの免疫不全は、遺伝的なものま
たはウイルス（例えばＨＩＶ）ならびに細菌または菌類感染によりひき起こされ
るものである可能性もあるし、あるいは自己免疫障害の結果としてもたらされる
可能性もある。より特定的には、ウイルス、細菌、菌類またはその他の感染によ
りひき起こされる感染性疾患は、ＨＩＶ，肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、マ
イコバクテリア、リーシュマニア種、プラモディウムによる感染およびカンジダ
症といったさまざまな菌類感染を含み、該タンパク質またはポリペプチドを用い
て治療することができる。当然のことながらこの点において、ガン治療の場合が
そうであるように免疫系に対する増強が一般に望まれる可能性がある場合にもタ
ンパク質またはポリペプチドが有用であり得る。
【０２８６】 あるいは、上述のように調製されたタンパク質またはポリペプチドは、例えば
結合組織病、多発硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免
疫性肺炎、ギヤン−バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インシュリン依存性糖
尿症、重症筋無力症、移植片対宿主病および自己免疫性炎症性眼疾患を含めた自
己免疫障害の治療において使用することができる。かかるタンパク質またはポリ
ペプチドは同様に、ぜんそく（特にアレルギー性ぜんそく）またはその他の呼吸
器系障害といったような、アレルギー反応および症状の治療においても有用であ
る可能性がある。免疫抑制が望まれる（例えば臓器移植を含む）その他の状態も
同様に、該タンパク質またはポリペプチドを用いて治療可能である。
【０２８７】 本発明のタンパク質またはポリペプチドを用いると、免疫応答をアップまたは
ダウンレギュレートすることも可能となるかもしれない。ダウンレギュレーショ
ンにはすでに進行中の免疫応答を阻害または遮断することを含んでもよく）、あ
るいは免疫応答の誘発を予防することを含んでもよい。活性化Ｔ細胞の機能はＴ
細胞応答を抑制することまたはＴ細胞内の特異的寛容を誘発することまたはその
両方によって阻害され得る。Ｔ細胞応答の免疫抑制は一般に、抑制剤に対するＴ
細胞の連続的暴露を必要とする、能動的な非抗原特異的プロセスである。Ｔ細胞
内の非応答性またはアネルギーの誘発を含む寛容は、それが一般に抗原特異的で
あり寛容化剤に対する暴露が終了した後も持続するという点で、免疫抑制と区別
することができる。実際には、寛容化剤が存在しない場合に、特異的抗原に再暴
露されてもＴ細胞の応答がないことによって、寛容を実証することができる。
【０２８８】 単数または複数の抗原機能（例えばＢ７補助刺激といったようなＢリンパ球抗
原機能を含むがこれに限られるわけではない）をダウンレギュレートするかまた
は防止すること例えば、活性化Ｔ細胞による高レベルのリンホカイン合成を防止
することは、組織、皮膚および臓器の移植および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）と
いう状況下で有用となる。例えば、Ｔ細胞機能の遮断は、組織移植における組織
破壊の低減を結果としてもたらすはずである。標準的には、組織移植片において
、移植片の拒絶は、Ｔ細胞によりそれが異物であると認識されることによって開
始され、その後に移植片を破壊する免疫反応が続く。移植に先立ちまたは免疫性
細胞上でのＢ７リンパ球抗原とその天然リガンドの相互作用を阻害または遮断す
る分子（例えば、Ｂ７−２活性をもつペプチドの可溶性単量体形態）を単独で、
または別のＢリンパ球抗原（例えばＢ７−１，Ｂ７−３）の活性をもつペプチド
の単量体形態もしくは遮断用抗体と併用して投与することによって、対応する同
時刺激シグナルを伝達することなく、免疫性細胞上の天然リガンドに対する分子
の結合を導くことが可能である。この要領でＢリンパ球抗原機能を遮断すること
は、Ｔ細胞といった免疫性細胞によるサイトカイン合成を防止し、かくして免疫
抑制剤として作用する。その上、同時刺激の欠如だけで、Ｔ細胞をアネルギー化
するのに充分であり、かくして被験者体内に寛容が誘発される。Ｂリンパ球抗原
−遮断用試薬による長期寛容の誘発が、これらの遮断用試薬の反復的投与の必要
性を回避する可能性もある。被験者の体内での充分な免疫抑制または寛容を達成
するためには、Ｂリンパ球抗原の組合せの機能を遮断することも必要となり得る
。
【０２８９】 臓器移植拒絶またはＧＶＨＤの予防における特定の遮断用試薬の効力は、人間
における効力を予測するものである動物モデルを用いて評定できる。使用可能な
適切な系の例としては、共に Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：
７８９−７９２（１９９２）および Ｔｕｒｋａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８９：１１１０２−１１１０５（１９９２）に
記述されているように ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免
疫抑制効果を検査するために使用されてきた、ラットにおける同種異系間心臓移
植片およびマウスにおける異種すい島細胞移植片が含まれる。さらに、ｉｎ ｖ
ｉｖｏでＢリンパ球抗原機能を遮断することが該疾病の進行にもたらす効果を決
定するために、ＧＶＨＤのマウスモデル（Paul編、Fundamental Immunology, Rav
en Press, New York,1989,pp.846-847を参照のこと）を使用することができる。
【０２９０】 抗原機能を遮断することは、自己免疫疾患を処置するため治療的にも有用であ
り得る。数多くの自己免疫障害が、自己組織に対し反応性があり、かつ疾病の病
理学に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するＴ細胞の不適切な
活性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化の予防により疾病の症候を軽減
または除去することが可能である。Ｂリンパ球抗原のレセプター／リガンド相互
作用を分断させることによりＴ細胞の同時刺激を遮断する試薬の投与を使用して
、Ｔ細胞の活性化を阻害し、疾病プロセスに潜在的関与するＴ細胞由来のサイト
カインまたは自己抗体またはの産生を予防することができる。さらに、遮断用試
薬は、疾病からの長期軽減を導き得る自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘発
することができる。自己免疫障害を予防するかまたは軽減する上での遮断用試薬
の効力は、ヒト自己免疫疾患の充分に特性化された多数の動物モデルを使用して
決定することができる。例としては、マウスの実験的自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｐ
ｒ／ｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデ
ス、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真
性糖尿病およびマウスの実験的重症筋無力症が含まれる。（Paul編、Fundamental
Immunology, Raven Press, New York,1989,pp. 840-856を参照のこと）。
【０２９１】 免疫応答をアップレギュレートする手段としての抗原機能（好ましくはＢリン
パ球抗原機能）のアップレギュレーションも、治療上有用であり得る。免疫応答
のアップレギュレーションには、以下の例に示されるように既存の免疫応答を増
強させるかまたは初期免疫応答を惹起することを含んでもよい。例えば、ウイル
ス感染の場合、Ｂリンパ球抗原機能の刺激を通して免疫応答を増強させることが
有用であり得る。さらに、インフルエンザ、かぜおよび脳炎といった全身性ウイ
ルス疾患を、刺激性形態のＢリンパ球抗原の全身投与により軽減させることがで
きる。
【０２９２】 あるいは、患者からＴ細胞を取り出し、上述のタンパク質またはポリペプチド
を発現するかまたは上述のタンパク質またはポリペプチドの刺激性形態と共にこ
れらを発現するウイルス抗原パルス処理されたＡＰＣを用いてＴ細胞を ｉｎ
ｖｉｔｒｏ で同時刺激し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで初期免疫されたＴ細胞を患者の
体内に再度導入することによって、感染患者において抗ウイルス免疫応答を増強
させることができる。感染細胞は、このとき、ｉｎ ｖｉｖｏ でＴ細胞に同時
刺激シグナルを送達することができ、それによりＴ細胞を活性化できる。
【０２９３】 もう１つの利用分野では、腫瘍免疫を誘発する上で抗原機能（好ましくはＢリ
ンパ球抗原関数）のアップレギュレーションまたは増強が有用であり得る。タン
パク質またはポリペプチドをコードする前述の核酸の１つでトランスフェクショ
ンされた腫瘍細胞（例えば肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞、ガン
腫）を被験者に投与して、被験者における腫瘍特異的寛容を克服することができ
る。望まれる場合、腫瘍細胞をペプチドの組合せを発現するようトランスフェク
ションすることができる。例えば、患者から得た腫瘍細胞を、Ｂ７−２様の活性
をもつペプチドを単独でまたはＢ７−１様活性および／またはＢ７−３様活性を
もつペプチドと組合わせた形で発現するよう指令する発現ベクターを用いて、ｅ
ｘ ｖｉｖｏ でトランスフェクションすることができる。トランスフェクショ
ンされた腫瘍細胞は、トランスフェクションされた細胞の表面上でのペプチドの
発現を結果としてもたらすように患者の体内に戻される。あるいは、ｉｎ ｖｉ
ｖｏ でのトランスフェクションのため腫瘍細胞を標的化するため、遺伝子療法
技術を用いることができる。
【０２９４】 腫瘍細胞の表面上にＢリンパ球抗原の活性をもつ上述の核酸によりコードされ
たタンパク質またはポリペプチドが存在することで、トランスフェクションを受
けた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘発するためにＴ細胞に対して必
要な同時刺激シグナルが提供される。さらに、充分な量のＭＨＣクラスＩまたは
ＭＨＣクラスＩＩ分子が欠如したまたはこれを再発現できない腫瘍細胞を、ＭＨ
ＣクラスＩα鎖およびβ２ミクログロブリンまたはＭＨＣクラスＩＩＤ鎖および
ＭＨＣクラスＩＩβ鎖の全てまたは一部分（例えば細胞質ドメイン切断部分）を
コードする核酸を用いてトランスフェクションさせ、かくしてそれぞれ細胞表面
上でＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現することができる
。Ｂリンパ球抗原（例えばＢ７−１，Ｂ７−２，Ｂ７−３）の活性をもつペプチ
ドと組合せた形での適切なＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子の発現は、トラ
ンスフェクションされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘発する。任
意には、不変鎖といったようなＭＨＣクラスＩＩ関連タンパク質の発現を遮断す
るアンチセンス構築物をコードする核酸を、Ｂリンパ球抗原の活性をもつタンパ
ク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡとを同時トランスフェクションさせ
て、腫瘍関連抗原の提示を促進し腫瘍特異的免疫を誘発することもできる。かく
して、ヒトの被験体におけるＴ細胞媒介性免疫応答の誘発は、被験体内の腫瘍特
異的寛容を克服するのに充分なものであり得る。代替的には以下で詳述するよう
に、これらの免疫系調節物質タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸ま
たはかかるタンパク質またはポリペプチドの発現を調節する核酸を適切な宿主細
胞内に導入して、望まれる通りにタンパク質の発現を増減させることは可能であ
る。
【０２９５】 実施例２６ （造血調節活性を対象とした、発現されたタンパク質またはポリペプチドのアッ
セイ） 上述の核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプチドをそれらの造血
調節活性を対象として評価することもできる。例えば、胚性幹細胞の分化に対す
る該タンパク質またはポリペプチドの効果を評価することができる。以下の参考
文献の中で開示されているアッセイを含めて、かかる活性を対象とした数多くの
アッセイが当業者にはよく知られている：Johanssonら、Cell. Biol.15:141-151,
1995;Kellerら、Mol. Cell. Biol. 13:473-486,1993;McClanahanら、Blood 81:290
3-2915,1993。
【０２９６】 上述の核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプチドを、その幹細胞
の寿命および幹細胞の分化に対する影響について評価することも可能である。以
下の参考文献の中で開示されているアッセイを含めて、かかる活性を対象とした
数多くのアッセイが当業者にはよく知られている：Freshney, M.G．メチルセル
ロースコロニー形成アッセイ、Methylcellulose Culture of Hematopoietic Ce
lls.中 R.I.Freshneyら編、pp.265-268,Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994;
Hirayamaら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA89:5907-5911,1992;McNiece, L.K. およ
び Briddell, R.A. 高い増殖能をもつ始原造血コロニー形成細胞、Culture of H
ematopoietic Cells(前掲);Nebenら、Experimental Hematology 22:353-359,1994
;Ploemacher, R.E.コブルストーン部域形成細胞のアッセイ、Culture of Hemato
poietic Cells.(前掲);Spooncer, E., Dexter, M.およびAllen, T.間質細胞の存
在下での長期骨髄培養、Culture of Hematopoietic Cells（前掲）、ならびにSu
therland, H.J.長期培養開始細胞のアッセイ、Culture of Hematopoietic Cells
.（前掲）。
【０２９７】 次いで、造血調節活性を示すこれらのタンパク質またはポリペプチドを医薬と
して製剤し、造血調節が有益である臨床的状況を処置するためにこれを使用する
ことができる。例えば本発明のタンパク質またはポリペプチドは、造血調節にお
いて有用であり得、その結果として骨髄系またはリンパ球系の細胞不全の治療に
おいて有用であり得る。コロニー形成細胞または因子依存性細胞系を支持する最
低限の生物学的活性でさえ、造血を調節することにおいて関与を示し；例えば、
赤血球前駆細胞単独でまたはその他のサイトカインと組合せ、成長および増殖を
支持することにおける関与を示し、例えば、さまざまな貧血を治療する際に、あ
るいは赤血球前駆体および／または赤血球細胞の産生を刺激するための照射／化
学療法と組合せた使用に有用性を示し、例えば、結果としてもたらされる骨髄抑
制を予防または治療するため化学療法と組合わせた形で有用な顆粒球および単球
／マクロファージといったような骨髄性細胞の成長および増殖（すなわち従来の
ＣＳＦ活性）を支持することにおける関与を示し、巨核球ひいては血小板の成長
および増殖を支持することにおける関与を示し、それによって、血小板減少症と
いったさまざまな血小板障害の予防または治療を可能にし、一般に血小板輸血に
代ってまたはそれを補うものとして使用することを可能にし、および／または、
上述の造血細胞の一部または全てに至るまで成熟できる造血幹細胞の成長および
増殖を支持することにおける関与を示し、従って（制限的意味なく、再生不良性
貧血および発作性夜間血色素尿症を含めた通常は移植で治療される障害といった
）さまざまな幹細胞障害においてならびに正常細胞または遺伝子療法のために遺
伝子操作された細胞または正常な細胞としてｉｎ ｖｉｖｏ または ｅｘ ｖ
ｉｖｏで（すなわち骨髄移植あるいは（同種または異種の）末梢前駆細胞移植ま
たは骨髄移植と組合せた形での）放射線照射／化学療法後の幹細胞画分再増殖に
おいて治療的有用性をもつ。あるいは、以下で詳述するように、これらのタンパ
ク質またはポリペプチドをコードする核酸またはこれらのタンパク質またはポリ
ペプチドの発現を調節する核酸を適切な宿主細胞内に導入して、所望の通りにタ
ンパク質の発現を増減させることができる。
【０２９８】 実施例２７ （組織の成長の調節についての、発現されたタンパク質またはポリペプチドのア
ッセイ） 上述の核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプチドを、組織成長に
対するその効果について評価することも可能である。国際特許公報第ＷＯ９５／
１６０３５，国際特許公報ＷＯ９５／０５８４６および国際特許公報第ＷＯ９１
／０７４９１号の中で開示されているアッセイを含め、かかる活性を対象とした
数多くのアッセイが、当業者にはよく知られている。
【０２９９】 創傷治療活性を対象としたアッセイには、制限的な意味なく、Eaglstein およ
び Mertz, J.Invest. Dermatol 71:382-84(1978)によって修正された通りの W
inter, Epidermal Wound Healing, pps.71-112(Maibach, H1およびRovee, DT編
）， Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago の中で記述されているも
のが含まれる。
【０３００】 このとき組織成長の調節に関与するこれらのタンパク質またはおよびポリペプ
チドを医薬として製剤し、組織成長調節が有益である臨床的状態を治療するため
に使用することができる。例えば、タンパク質またはポリペプチドは、骨、軟骨
、腱、靱帯および／または、神経組織の成長または再生ならびに創傷治療および
組織の修復および置換のためおよび火傷、切開および潰瘍の治療において使用さ
れる組成物の中で有用である可能性がある。
【０３０１】 骨が正常に形成されていない状況において軟骨および／または骨の成長を誘発
する上述の核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチドは、ヒトま
たはその他の動物における骨折および軟骨損傷または欠陥の治ゆに応用される。
本発明のタンパク質またはポリペプチドを利用するこのような調製物は、閉鎖な
らびに開放骨折の減少において、同様に人工関節の改良型固定において予防的に
使用することができる。骨形成剤によって誘発される新たな骨合成は、先天性、
外傷由来のまたは腫瘍切除由来の脳顔面頭蓋欠損の修復に役立ち、同様に美容整
形外科においても有用である。
【０３０２】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、歯周疾患の治療およびその他の歯
の修復プロセスにおいても使用可能である。かかる薬剤は、骨形成細胞を引きつ
け、骨形成細胞の成長を刺激するかまたは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘発す
るための環境を提供することができる。本発明のタンパク質は同様に、例えば骨
および／または軟骨修復の刺激を通してまたは炎症または炎症性プロセスにより
媒介される組織破壊プロセス（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性など）を遮断す
ることによって、骨粗鬆症または変形性関節炎の治療においても有用であり得る
。
【０３０３】 上述の核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチドに帰すること
のできる組織再生活性のもう１つのカテゴリーは、腱／靱帯の形成である。腱／
靱帯様の組織またはその他の組織が正常に形成されない状況下でこのような組織
を誘発する、上述の核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプチドは、
ヒトおよびその他の動物において、腱または靱帯の断裂、変形およびその他の腱
または靱帯の欠損の治ゆにおいて応用される。腱／靱帯様の組織を誘発するタン
パク質を利用するこのような調製物は、腱または靭帯組織に対する損傷を防止す
る上で予防的に使用されてもよいし又、骨またはその他の組織への腱または靭帯
の改良型固定のためおよび腱または靭帯組織に対する欠損の修復のためにも使用
可能である。本発明のタンパク質またはポリペプチドによって誘発される新たな
腱／靱帯様組織の形成は、先天性、外傷性またはその他に由来する腱または靭帯
欠損の修復に役立ち、同様に美容整形外科における腱または靭帯の付着または修
復にも有用である。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、腱または靭帯形
成細胞を引き寄せるか、腱または靭帯形成細胞の増殖を刺激し、腱または靭帯形
成細胞の始原細胞の分化を誘発するかまたは、組織修復を行なうべく ｉｎ ｖ
ｉｖｏに戻すため ｅｘ ｖｉｖｏで腱または靭帯細胞または始原細胞の成長を
誘発するための環境を提供することができる。本発明のタンパク質またはポリペ
プチドは同様に、腱炎、手根管症候群およびその他の腱または靭帯欠損の治療に
おいても有用であり得る。治療用組成物は同様に、当該技術分野において周知の
とおり担体として適切なマトリクスおよび／または金属イオン封鎖剤を内含する
こともできる。
【０３０４】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは同様に、神経細胞の増殖のためおよ
び神経および脳組織の再生のため、すなわち中枢および末梢神経系疾患および神
経障害の治療ならびに神経細胞または神経組織に対する退化、死または外傷を含
む機械的および外傷性障害の治療のためにも有用であり得る。より特定的には、
タンパク質またはポリペプチドは、末梢神経系の疾病例えば末梢神経損傷、末梢
神経障害および局所的神経障害、および中枢神経系の疾病例えば、アルツハイマ
ー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症およびシャイード
レーガー症候群の治療において使用することができる。本発明に従って治療可能
であるさらなる身体状態としては、機械的障害および外傷性障害、例えば、脊髄
障害、頭部外傷および卒中といったような脳血管性疾患がある。化学療法または
その他の医学療法の結果としてもたらされた末梢神経障害も同様に本発明のタン
パク質またはポリペプチドを用いて治療可能である。
【０３０５】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは同様に、制限的な意味なく圧迫性潰
瘍、血管機能不全に関連する潰瘍、外科的および外傷性創傷などを含む、非治療
性外傷のより良いまたはより速い閉鎖を促すのにも有用であり得る。
【０３０６】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは、臓器（例えばすい臓、肝臓、腸、
腎臓、皮ふ、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）および脈管（脈
管内皮を含む）組織といったその他の組織の発生または再生のため、またはかか
る組織を含む細胞の増殖を促進するための活性を示す可能性があることも予想さ
れる。所望の効果の一部分は、正常な組織が発生できるようにするための繊維性
瘢痕形成の阻害または調節によるものであり得る。本発明のタンパク質またはポ
リペプチドは同様に脈管形成活性をも示す可能性がある。
【０３０７】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは同様に、消化管の保護または再生ま
たは肺または肝臓繊維症の治療、さまざまな組織内の再灌流傷害および全身性サ
イトカイン損傷に起因する身体状態の治療のためにも有用であり得る。
【０３０８】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは同様に、前駆体組織または細胞から
の上述の組織の分化を促進または阻害するため、または上述の組織の成長を阻害
するためにも有用であり得る。
【０３０９】 あるいは、以下で詳述するように、組織成長調節活性タンパク質またはポリペ
プチドをコードする核酸またはかかるタンパク質またはポリペプチドの発現を調
節する核酸を、所望の通りにタンパク質の発現を増減させるために適切な宿主細
胞の中に導入することが可能である。
【０３１０】 実施例２８ （生殖ホルモンの調節についての、発現されたタンパク質またはポリペプチドの
アッセイ）
【０３１１】 本発明のタンパク質またはポリペプチドを、卵胞刺激ホルモンといった生殖ホ
ルモンを調節するその能力について評価することもできる。以下の参考文献の中
で開示されているアッセイを含めて、かかる活性を対象とした数多くのアッセイ
が当業者にはよく知られている： Valeら、Endocrinol. 91:562-572,1972;Ling
ら、Nature321:779-782,1986;Valeら、Nature321:776-779,1986;Masonら、Nature31
8:659-663,1985;Forageら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3091-3095,1986.Cur
rent Protocols in Immunology 中の第６章，１２章 J.E. Coliganら編、Greene
Publishing AssociatesおよびWiley-Intersciece;Taubら、J. Clin. Invest.95:
1370-1376,1995;Lindら、APMIS103:140-146,1995;Mullerら、Eur. J. Immunol.25:
1744-1748;Gruberら、J. Immunol. 152:5860-5867,1994;Johnstonら、J.Immunol.1
53:1762-1768,1994。
【０３１２】 次いで、生殖ホルモンまたは細胞運動調節物質としての活性を示すこれらのタ
ンパク質またはポリペプチドを、医薬として製剤し、生殖ホルモンの調節が有益
である臨床的状態を治療するためにこれを使用することが可能である。例えば、
タンパク質またはポリペプチドは、アクチビンまたはインヒビン関連活性を示す
ことができる。インヒビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を阻害するそ
の能力によって特性化され、一方アクチビンは、ＦＳＨの放出を刺激するその能
力によって特性化される。かくして本発明のタンパク質またはポリペプチドは、
単独またはインヒビンファミリーの一員とのヘテロダイマーの形で、メスの哺乳
動物における生殖力を減少させオスの哺乳動物における精子生成を減少させるイ
ンヒビンの能力に基づく避妊薬として有用な可能性がある。充分な量のその他の
インヒビンの投与は、これらの哺乳動物における不妊症を誘発することができる
。代替的には、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、ホモダイマーまたは
インヒビンＢ群のその他のタンパク質サブユニットとのヘテロダイマーとして、
下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を刺激する上でのアクチビン分子の能力に基
づいて生殖能誘発療法として有用であり得る。例えば、米国特許第４，７９８，
８８５号を参照のこと。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、同様にウシ
、ヒツジおよびブタといったような家畜の生涯生殖能力を増大させるべく、性的
に未熟な哺乳動物における生殖能の開始を早めるのにも有用であり得る。
【０３１３】 あるいは、以下でさらに詳述するように、生殖ホルモン調節活性タンパク質ま
たはポリペプチドをコードする核酸または、かかるタンパク質またはポリペプチ
ドの発現を調節する核酸を適切な宿主細胞内に導入して、望むとおりにタンパク
質またはポリペプチドの発現を増減させることが可能である。
【０３１４】 実施例２９ （走化性／ケモキネシス活性を対象とした、発現されたタンパク質またはポリペ
プチドのアッセイ） 本発明のタンパク質またはポリペプチドを、走化性／ケモキネシス活性を対象と
して評価することもできる。例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドは
、例えば単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮および／
または内皮細胞を含む哺乳動物細胞に対する走化性／ケモキネシス活性をもつ（
例えばケモカインとして作用する）可能性がある。所望の作用部位に所望の細胞
集団を可動化するつまり引き寄せるために、走化性およびケモキネシスタンパク
質またはポリペプチドを使用することができる。走化性またはケモキネシスタン
パク質またはポリペプチドは、組織に対する創傷およびその他の外傷の治療なら
びに局所的感染の治療において特に利点を提供する。例えば、腫瘍または感染部
位へのリンパ球、単球または好中球の引き寄せは、腫瘍または感染因子に対する
改善された免疫応答を結果としてもたらし得る。
【０３１５】 タンパク質またはポリペプチドは、特定の細胞集団の指令された配向または運
動を直接的または間接的に刺激できる場合、この集団に対して走化性活性を有す
ることになる。好ましくは、上述のタンパク質またはポリペプチドは、細胞の誘
発された運動を直接的に刺激する能力を有する。特定のタンパク質またはポリペ
プチドが１つの細胞集団に対する走化性を有するか否かは、細胞の走化性につい
てのあらゆる既知のアッセイにおいてかかるタンパク質またはポリペプチドを利
用することによって容易に決定可能である。
【０３１６】 本発明のタンパク質またはポリペプチドの活性は、その他の手段の中でも、以
下の方法によって測定可能である：
【０３１７】 （走化性を誘発するかまたは防止するタンパク質またはポリペプチドを同定す
ることになる）走化活性を対象としたアッセイは、膜を横断した細胞の移動を誘
発するタンパク質またはポリペプチドの能力ならびに、細胞集団間の接着を誘発
するタンパク質またはポリペプチドの能力を測定するアッセイから成る。運動お
よび接着についての適切なアッセイには、制限的な意味なく、以下の文献の中で
記述されているものが含まれる。Current Protocols in Immunology, J.E. Coli
gan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.Shevach, W.Stober編、Greene Publis
hing Associates and Wiley-Interscience 刊行、第6.12章:6.12.1-6.12.28;Taub
ら、J. Clin, Invest.95:1370-1376,1995;Lindら、APMIS 103:140-146,1995;Muell
er et al., Eur. J. Immunol.25:1744-1748;Gruberら、J. Immunol.152:5860-586
7,1994;Johnstonら、J.Immunol.,153:1762-1768,1994。
【０３１８】 実施例３０ （血液凝固の調節についての、発現されたタンパク質またはポリペプチドのアッ
セイ） 本発明のタンパク質またはポリペプチドを同様に、血液凝固に対するその効果
について評価することもできる。以下の参考文献の中で開示されているアッセイ
を含めて、かかる活性を対象とした数多くのアッセイが当業者にはよく知られて
いる： Linetら、J. Clin. Pharmacol.26:131-140,1986;Burdickら、Thrombosis
Res. 45:413-419,1987;Humphreyら、Fibrinolysis 5:71-79(1991);Schaub, Prost
aglandins35:467-474,1988。
【０３１９】 このとき血液凝固の調節に関与するこれらのタンパク質またはポリペプチドを
、医薬として製剤し、血液凝固の調節が有益である臨床的状態を治療するために
これを使用することができる。例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチド
は、止血または血栓溶解活性をも示す可能性がある。その結果、かかるタンパク
質またはポリペプチドは、（血友病といった遺伝性傷害を含む）さまざまな凝血
障害の治療においても有用であり、又、外傷、外科手術その他の原因による創傷
を治療する上で凝血その他の止血事象を増強するものであると期待されている。
本発明のタンパク質またはポリペプチドは、血栓を溶解させるため、またはその
形成を阻害するためおよび、その結果としてもたらされる状態（例えば、心臓お
よび中枢神経形脈管の梗塞（例えば卒中）の治療または予防のためにも有用であ
り得る。あるいは、以下でさらに詳細に詳述されているように、血液凝固活性タ
ンパク質またはポリペプチドをコードする核酸またはかかるタンパク質またはポ
リペプチドの発現を調節する核酸を適切な宿主細胞内に導入して、所望の通りに
タンパク質またはポリペプチドの発現を増減させることが可能である。
【０３２０】 実施例３１ （レセプター／リガンド相互作用への関与について、発現されたタンパク質また
はポリペプチドのアッセイ） 本発明のタンパク質またはポリペプチドを、レセプター／リガンド相互作用へ
のそれらの関与について評価することも可能である。以下の参考文献の中で開示
されているアッセイを含めて、かかる関与を対象とした数多くのアッセイが当業
者にはよく知られている：Current Protocols in Immunology中、7.7.28.1-7.28.
22章、J.E.Coliganら編、Greene Publishing Associates Wiley-Interscience;Tak
ai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:6864-6868,1987;Biererら、J.Exp. M
ed.168:1145-1156,1988;Rosensteinら、J. Exp.Med.169:149-160,1989;Stoltenbo
rgら、J.Immunol. Methods 175:59-68,1994;Stittら、Cell80:661-670,1995;Gyuri
sら、Cell 75:791-803,1993。
【０３２１】 例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、レセプター、レセプター
リガンドまたはレセプター／リガンド相互作用の阻害物質またはアゴニストとし
ての活性を示すこともできる。かかるレセプターおよびリガンドの例としては、
制限的意味なく、サイトカインレセプターおよびそれらのリガンド、レセプター
キナーゼおよびそれらのリガンド、レセプターホスファターゼおよびそれらのリ
ガンド、細胞間相互作用に関与するレセプターおよびそれはのリガンド（制限的
意味なく細胞接着分子（例えば、セレクチン、インテグリンおよびそれらのリガ
ンドを含む）、および抗原提示、抗原認識および細胞および体液性免疫応答の発
生に関与するレセプター／リガンド対）が含まれる。レセプターおよびリガンド
は、関係するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチドまたは小分子阻
害物質のスクリーニングのためにも有用である。本発明のタンパク質又はポリペ
プチド（制限的な意味なくリガンド及びレセプターのフラグメントを含む）は、
レセプター／リガンド相互作用の阻害物質として有用であり得る。あるいは、以
下で詳述するように、レセプター／リガンド相互作用に関与するタンパク質また
はポリペプチドをコードする核酸またはかかるタンパク質またはポリペプチドの
発現を調節する核酸を適切な宿主細胞内に導入して、所望の通りにタンパク質ま
たはポリペプチドの発現を増減させることが可能である。
【０３２２】 実施例３２ （抗炎症活性を対象としたタンパク質またはポリペプチドのアッセイ） 本発明のタンパク質またはポリペプチドを、抗炎症活性を対象として評価する
こともできる。抗炎症活性は、炎症性応答に関与する細胞に対して刺激を提供す
ること、（例えば細胞接着といった）細胞間相互作用を阻害または促進すること
、炎症プロセスに関与する細胞の走化性を阻害または促進すること、細胞溢血を
阻害または促進すること、または炎症性応答をより直接的に阻害または促進する
その他の因子の産生を刺激または抑制することによって達成することができる。
かかる活性を示すタンパク質またはポリペプチドは、制限的な意味なく、感染に
伴う炎症（例えば敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症性応答症候群）、
虚血性再灌流障害、エンドトキシン致死率、関節炎、補体媒介型超急性拒絶、腎
炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病ま
たはＴＮＦまたはＩＬ−１といったサイトカインの過剰産生の結果としての疾患
を内含する慢性または急性身体状態を含めた炎症性状態を治療するために使用す
ることができる。本発明のタンパク質またはポリペプチドは、抗原性物質または
材料に対する過敏症及びアナフィラキシーおよび過敏症を治療するためにも有用
であり得る。あるいは、以下でさらに詳細するように、抗炎症活性タンパク質ま
たはポリペプチドをコードする核酸またはかかるタンパク質またはポリペプチド
の発現を調節する核酸を適切な宿主細胞内に導入して、所望の通りにタンパク質
またはポリペプチドの発現を増減させることが可能である。
【０３２３】 実施例３３ （腫瘍阻害活性を対象とした、発現されたタンパク質またはポリペプチドのアッ
セイ） 本発明のタンパク質またはポリペプチドを腫瘍阻害活性を対象として評価する
ことも可能である。腫瘍の免疫学的治療または予防のための上述の活性に加えて
、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、その他の抗腫瘍活性を示す可能性
がある。タンパク質またはポリペプチドは、（例えばＡＤＣＣを介して）直接的
または間接的に腫瘍の成長を阻害することができる。タンパク質またはポリペプ
チドは、腫瘍組織または腫瘍前駆体組織に作用すること、（例えば脈管新生を阻
害することにより）腫瘍の成長を支持するのに必要な組織の形成を阻害すること
、腫瘍の成長を阻害するその他の因子、作用物質または細胞型の産生をひきおこ
すことまたは、腫瘍の成長を促進する因子、作用物質または細胞型を抑制、除去
または阻害することによって、その腫瘍阻害活性を示すことができる。代替的に
は、以下でさらに詳細に記述されているように、腫瘍阻害活性をもつタンパク質
またはポリペプチドをコードする核酸またはかかるタンパク質またはポリペプチ
ドの発現を調節する核酸を適切な宿主細胞内に導入して、所望の通りにタンパク
質またはポリペプチドの発現を増減させることが可能である。
【０３２４】 本発明のタンパク質またはポリペプチドは同様に以下の付加的活性または効果
のうちの単数または複数のものを示す可能性もある：すなわち、制限的な意味な
く細菌、ウイルス、菌類およびその他の寄生虫を含む感染性作用物質の成長、感
染または機能を阻害するかまたは死滅させること；制限的な意味なく、身長、体
重、頭髪の色、目の色、皮ふ、肥満率またはその他の組織色素沈着、または臓器
または身体部分のサイズまたは形状（例えば胸部増大または縮小、骨の形態また
は形状変化）を含む身体的特徴に影響を及ぼす（抑制または増強する）こと；バ
イオリズムまたは概日周期または概日リズムに影響を及ぼすこと；雄または雌の
被験体の生殖能に影響を及ぼすこと；食事性脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物
、ビタミン、ミネラル、補助因子またはその他の栄養因子または成分の代謝、異
化、同化、処理、利用、貯蔵または除去を実施すること；制限的な意味なく、食
欲、性欲、ストレス、認識（認識障害を含む）、うつ状態（うつ病を含む）およ
び暴力的行動を含む行動特徴に影響を及ぼすこと；鎮痛効果またはその他の疼痛
軽減効果を提供すること；造血細胞系列以外の系列内で胚性幹細胞の分化および
成長を促進すること；ホルモンまたは内分泌活性；酵素の場合、酵素の欠乏を補
正し欠乏に関連する疾患を治療すること；（例えば乾癬といった）過剰増殖性障
害の治療；免疫グロブリン様活性（例えば抗原または補体を結合する能力）；お
よびかかるタンパク質またはそれと交差反応するもう１つの材料または実体に対
し免疫応答を発生させるべくワクチン組成物の中で抗原として作用する能力。あ
るいは、以下でさらに詳細に記述されるように、上述の活性のいずれかに関与す
るタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸またはかかるタンパク質の発
現を調節する核酸を適切な宿主細胞内に導入して、所望の通りにタンパク質また
はポリペプチドの発現を増減させることが可能である。
【０３２５】 実施例３４ （本発明のタンパク質またはポリペプチドと相互作用するタンパク質またはポリ
ペプチドの同定） レセプタータンパク質といったように本発明のタンパク質またはポリペプチド
と相互作用するタンパク質またはポリペプチドは、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗ
ｏ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， カタログ番号Ｋ１６
０４−１）といったツーハイブリッドシステム用いて同定することができる。キ
ットに添付のマニュアルに記述されているように、本発明のタンパク質またはポ
リペプチドをコードする核酸を、酵母転写アクチベーターＧＡＬ４のＤＮＡ結合
ドメインをコードするＤＮＡとインフレームになるように、発現ベクターの中に
挿入する。本発明のタンパク質またはポリペプチドと相互作用する可能性のある
タンパク質またはポリペプチドをコードするｃＤＮＡライブラリー内のｃＤＮＡ
を、それがＧＡＬ４の活性化ドメインをコードするＤＮＡとインフレームになる
ように、第２の発現ベクター内に挿入する。２つの発現プラスミドを酵母内に形
質転換し、酵母を、発現ベクターの各々の上の選択可能なマーカーの発現ならび
にＨＩＳ３遺伝子のＧＡＬ４依存性発現についての選択を行なう選択培地上でプ
レーディングする。ヒスチジンが欠如した培地上で増殖する能力をもつ形質転換
体を、ＧＡＬ４依存性 ｌａｃ Ｚ 発現についてスクリーニングするる。ヒス
チジン選択および ｌａｃ Ｚ アッセイの両方において陽性であるような細胞
は、本発明のタンパク質またはポリペプチドと反応するタンパク質またはポリペ
プチドをコードするプラスミドを含有する。
【０３２６】 あるいは、本発明のタンパク質またはポリペプチドと相互作用する分子を同定
するために、Ｌｕｓｔｉｇら、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２
８３：８３−９９（１９９７）に記述されているシステムを使用することもでき
る。このようなシステムにおいては、本発明のタンパク質またはポリペプチドを
コードする核酸インサートを含有するベクタープールについて、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ転写反応が実施される。核酸インサートを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を駆動する
プロモーターの下流側でクローニングする。結果として得られたｍＲＮＡプール
を、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ 卵母細胞内に導入する。その後この卵母細
胞を、所望の活性を対象としたアッセイする。
【０３２７】 代替的には、上述のように産生され、プールされた ｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写
産物を ｉｎ ｖｉｔｒｏ で翻訳することもできる。所望の活性または既知の
タンパク質またはポリペプチドとの相互作用について、プールされた ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ 翻訳産物をアッセイすることができる。 本発明のタンパク質またはポリペプチドと相互作用するタンパク質、ポリペプ
チドまたはその他の分子は、さまざまな付加的技術によって発見することができ
る。１つの方法では本発明のタンパク質またはポリペプチドを含有するアフィニ
ティカラムを構築することができる。この方法のいくつかのバージョンにおいて
は、アフィニティカラムは、本発明のタンパク質またはポリペプチドがグルタチ
オンＳ−トランスフェラーゼに融合されているキメラタンパク質を収容している
。上述のような発現されたタンパク質のプールまたは細胞タンパク質の混合物が
アフィニティカラムに適用される。その後カラムに付着したタンパク質またはポ
リペプチドと相互作用する分子を分離し、Ｒａｍｕｎｓｅｎら、Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ，１８，５８８−５９８（１９９７）の中で記述されているよ
うに２−Ｄ電気泳動ゲル上で分析することができる。代替的には、アフィニティ
カラム上に保持された分子を、電気泳動に基づく方法によって精製し、配列決定
することもできる。この同じ方法を用いて、抗体を分離するか、ファージディス
プレイ産物をスクリーニングするか、またはファージディスプレイヒト抗体をス
クリーニングすることができる。
【０３２８】 本発明のタンパク質またはポリペプチドと相互作用する分子を、Edwards & Le
atherbarrow, Analytical Biochemistry,246,1-6(1997）の中で記述されている
ような光学バイオセンサーを用いてスクリーニングすることもできる。この方法
の主な利点は、それが、タンパク質またはポリペプチドとその他の相互作用する
分子の間の会合速度の決定を可能にするという点にある。かくして、高いまたは
低い会合速度をもつ相互作用分子を特異的に選択することが可能である。標準的
には、標的分子がセンサー表面に（カルボキシメチルデキストランマトリクスを
通して）連結され、試験分子のサンプルが標的分子と接触した状態におかれる。
標的分子に対する試験分子の結合は、屈折率および／または厚みにおける変化を
ひき起こす。この変化は、それが（センサー表面から数百ナノメートル広がって
いる）一過性の場で起こるのであれば、バイオセンサーによって検出される。こ
れらのスクリーニングアッセイにおいては、標的分子は、本発明のタンパク質ま
たはポリペプチドのうちの１つであってよく、また、試験サンプルは組織または
細胞から抽出されたタンパク質、ポリペプチドまたはその他の分子の収集物、発
現されたタンパク質のプール、コンビナトリアルペプチドおよび／または化学ラ
イブラリーまたはファージディスプレイペプチドであってよい。試験分子が抽出
される組織または細胞はあらゆる種に由来するものであってよい。
【０３２９】 その他の方法では、標的タンパク質またはポリペプチドは固定化され、試験集
団は、本発明の独特なタンパク質またはポリペプチドの収集物である。
【０３３０】 本発明のタンパク質またはポリペプチドと薬物の相互作用を研究するため、Wa
ngら、Chromatographia,44,205〜208(1997）によって記述されたＨＰＬＣ方法と
組合わせた微小透析または Buschら、J.Chromatogr.777;311-328(1997）によっ
て記述されているアフィニティーキャピラリー電気泳動法を使用することができ
る。
【０３３１】 米国特許第５，６５４，１５０号に記述されているシステムを用いて、本発明
のタンパク質またはポリペプチドと相互作用する分子を同定することもできる。
このシステムにおいては、本発明のタンパク質またはポリペプチドをコードする
核酸のプールをｉｎ ｖｉｔｒｏ で転写および翻訳し、反応産物と既知のポリ
ペプチドまたは抗体との相互作用についてアッセイする。
【０３３２】 当業者であれば、以上で特定的に列挙されているものに加えて数多くの活性を
対象として本発明のタンパク質またはポリペプチドをアッセイすることができる
ということがわかるだろう。例えば、炎症、腫瘍増殖または転移、感染またはそ
の他の臨床的状態の管理および調節が関与する利用分野について、発現されたタ
ンパク質またはポリペプチドを評価することができる。さらに、タンパク質また
はポリペプチドは、栄養剤または化粧品として有用であり得る。
【０３３３】 本発明のタンパク質またはポリペプチドを使用して、本発明のタンパク質また
はポリペプチドに特異的に結合し得る抗体を生成することができる。抗体は、モ
ノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本明細書で使
用される「抗体」という用語は、抗原との免疫学的反応を可能にする、抗原の抗
原決定基の特徴に対し相補的な内部表面の形状および電荷分布を伴う三次元結合
空間を形成するため抗体分子の可変ドメインの折りたたみから結合ドメインが形
成される、少なくとも１つの結合ドメインで構成されたポリペプチドまたはポリ
ペプチド群を意味する。抗体としては、結合ドメインを含む組換えタンパク質、
ならびにＦａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2およびＦ（ａｂ’）2フラグメントを含
むフラグメントが挙げられる。
【０３３４】 本明細書で使用される「抗原決定基」は、抗原抗体反応の特異性を決定する抗
原分子の一部である。「エピトープ」は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピ
トープは、エピトープに独特な空間的コンホメーション中に僅か３個のアミノ酸
を含み得る。一般にエピトープは少なくとも６個のそのようなアミノ酸、より通
常的には、少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸から成る。エピトープを
構成するアミノ酸を決定する方法としては、Ｘ線結晶解析、２次元核磁気共鳴、
およびエピトープマッピング、例えば、H.Mario Geysenら、1984.Proc.Natl.Acad
.Sci.U.S.A.81:3998-4002；PCT公開第WO84/03564号；およびPCT公開第WO84/0350
6号に記載のＰｅｐｓｃａｎ法が挙げられる。
【０３３５】 一部の実施形態では、抗体は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメン
ト、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントの
フラグメントによってコードされる、タンパク質またはポリペプチドに対し特異
的に結合する能力を有することができる。一部の実施形態では、抗体は、ＥＳＴ
関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントま
たはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによってコードされるタン
パク質またはポリペプチドの中の抗原決定基またはエピトープを結合させる能力
を有していてよい。
【０３３６】 他の実施形態では抗体は、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチド
のフラグメント、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポ
リペプチドの位置セグメントのフラグメントに特異的に結合する能力を有してい
てよい。一部の実施形態では、抗体は、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポ
リペプチドのフラグメント、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥ
ＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントのフラグメントの中の抗原決定基または
エピトープを結合させる能力を有することができる。
【０３３７】 分泌タンパク質の場合、抗体は、本発明の核酸によりコードされる全長タンパ
ク質，本発明の核酸によりコードされる成熟タンパク質（すなわちシグナルペプ
チドの切断により生成されるタンパク質）または本発明の核酸によってコードさ
れるシグナルペプチドを結合させることができる。
【０３３８】 実施例３５ ヒトポリペプチドまたはタンパク質に対する抗体の産生 上述のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントまたは、Ｅ
ＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント、ＥＳＴ関連ポ
リペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントの
フラグメントをコードする核酸を、プロモーターに対し機能し得る形で連結し、
上述のとおり細胞内に導入する。
【０３３９】 分泌タンパク質の場合、完全タンパク質（すなわち成熟タンパク質およびシグ
ナルペプチド）をコードする核酸、成熟タンパク質（すなわちシグナルペプチド
切断により生成されるタンパク質）をコードする核酸、またはシグナルペプチド
をコードする核酸はプロモーターに対し機能し得る形でリンクされ、上述のとお
りに細胞内に導入される。
【０３４０】 このとき、コードされたタンパク質またはポリペプチドを、上述の通りに実質
的に精製または単離する。最終的調製物中のタンパク質の濃度を、例えば、Ａｍ
ｉｃｏｎフィルター装置上の濃度によって、数μｇ／ｍｌのレベルに調整する。
タンパク質またはポリペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗
体を次に以下の通りに調製することができる。
【０３４１】 （１．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の産生） 記述のとおりに同定され単離されたタンパク質またはポリペプチドのうちのい
ずれかのエピトープに対するモノクローナル抗体を、Kohler および Milstein,N
ature 256:495(1975）の古典的方法またはその派生的方法に従って、マウスハイ
ブリドーマから調製することができる。簡単に言うと、数週間の期間にわたり、
選択されたタンパク質またはそこから誘導されたペプチドを数マイクログラム、
マウスに反復的に接種する。その後マウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離
する。マウス骨髄腫細胞と脾細胞をポリエチレングリコールを用いて融合させ、
アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上でのその系の増殖により、余剰
の未融合細胞を破壊する。うまく融合した細胞を希釈し、希釈液のアリコートを
、培養物の増殖から続けられるマイクロタイタープレートのウェルの中に入れる
。Eugvall, Meth. Enzymol.70:419(1980）によって当初記述されたような Ｅｌ
ｉｓａといった免疫アッセイ手順により、ウェルの上清液の中の抗体を検出する
ことによって、抗体産生クローンを同定する。選択された陽性クローンを増殖さ
せ、そのモノクローナル抗体産物を使用のために収獲することができる。モノク
ローナル抗体の産生のための詳細な手順は、「分子生物学における基本的方法」
Elsevier, New York、第21-2節の中で Davis L.ら、により記述されている。
【０３４２】 （２．免疫化によるポリクローナル抗体の産生） 免疫原性の増強のため修飾されていてもよいしまたは修飾されていなくてもよ
い発現されたタンパク質またはそれから誘導されたペプチドを用いて適切な動物
を免疫化することによって、単一のタンパク質またはポリペプチドの異種起源の
エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清を調製することができ
る。有功なポリクローナル抗体の産生は、抗原および宿主種の両方に関連する数
多くの因子によって影響される。例えば、小さい分子はその他のものよりも免疫
原性が低い傾向にあり、担体およびアジュバントの使用を必要とする可能性があ
る。同様に、宿主動物の応答は接種の部位および用量に応じて変動し、抗原の不
適切なまたは過度の用量は共に抗血清の力価が低下するという結果をもたらす。
多数の皮内部位で投与される少ない抗原用量（ｎｇレベル）が最も信頼性の高い
ものであると思われる。ウサギのための有効な免疫化プロトコルは、Vaitukaiti
sら、J.Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991(1971）の中に見出すことができる
。
【０３４３】 ブースタ注射は、規則的な間隔で与えることができ、抗原の既知の濃度に対す
る例えば寒天中の２重免疫拡散によって半定量的に決定されるようなその抗体力
価が下降し始めた時点で、抗血清を収獲することができる。例えば、Handbook o
f Experimental Immunology D.Wier(編)Blackwell(1973)中の、Ouchterlonyら、
第１９章を参照されたい。抗体の安定水準濃度は通常、血清１ｍｌあたり０．１
〜０．２ｍｇ（約１２μＭ）の範囲内にある。抗原に対する抗血清の親和力は、
例えばManual of Clinical Immunology、第2版、(RoseおよびFriedman編)Amer. So
c.For Microbiol, Washington, D.C.(1980)、第４２章で Fisher Dにより記述
されているように、競合結合曲線を作成することによって決定される。
【０３４４】 上述のプロトコルのいずれかに従って調製された抗体調製物は、さまざまな状
況下で有用である。特に、ＥＳＴ関連核酸，ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントま
たはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによってコードされるタン
パク質またはポリペプチドの大規模単離、精製または富化を容易にするため、ま
たは、ＥＳＴ関連ポリペプチド，ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント，ＥＳ
Ｔ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグ
メントのフラグメントの単離、精製または富化のため、以下で記述されたものの
ようなイムノアフィニティークロマトグラフィー技術の中でこの抗体を使用する
ことができる。
【０３４５】 分泌タンパク質の場合、抗体を、完全タンパク質（すなわち成熟タンパク質お
よびシグナルペプチド），成熟タンパク質（すなわちシグナルペプチドの切断に
より生成されたタンパク質）またはシグナルペプチドの単離、精製または富化の
ために使用し得、プロモーターに機能し得る形でリンクし、上述のように細胞内
に導入する。
【０３４６】 付加的には、抗体を、ＥＳＴ関連核酸，ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまた
はＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによってコードされるタンパ
ク質またはポリペプチドにリンクされたポリペプチドを単離、精製または富化す
るため、またはＥＳＴ関連ポリペプチド，ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメン
ト，ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチドの
位置セグメントのフラグメントを単離、精製または富化させるため、以下で記述
するもののようなイムノアフィニティークロマトグラフィー技術の中で使用する
ことができる。
【０３４７】 抗体は同様に、ＥＳＴ関連核酸，ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによってコードされるタンパク質ま
たはポリペプチドによってコードされるポリペプチドの細胞局在化または、ＥＳ
Ｔ関連ポリペプチド，ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント，ＥＳＴ関連ポリ
ペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントのフ
ラグメントの細胞局在化を決定するためにも使用可能である。
【０３４８】 さらに、抗体は、ＥＳＴ関連核酸，ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥ
ＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによってコードされるタンパク質
またはポリペプチドにリンクされたポリペプチド，またはＥＳＴ関連ポリペプチ
ド，ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント，ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セ
グメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントのフラグメントにリン
クされたポリペプチドの細胞局在化を決定するためにも使用可能である。
【０３４９】 抗体は同様に、生物学的サンプル中の抗原保持物質の濃度を決定する定量的免
疫アッセイの中でも使用可能である。これらは同様に、生物学的サンプル中の抗
原の存在を同定するためまたは生物学的サンプル中に存在する組織型を同定する
ため、半定量的または定性的に使用することもできる。抗体は又、タンパク質を
発現する細胞を死滅させるかまたは体内のタンパク質レベルを低減させるための
治療用組成物の中でも同様に使用可能である。
【０３５０】 （ＶＩ． ５’ＥＳＴまたはコンセンサスコンティグ化５’ＥＳＴまたはそれか
ら得られる配列またはその一部分の、試薬としての使用） ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントを、単離手順、診断アッセイおよび法医学手順の中
で試薬として使用することができる。例えば、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸
の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントからの
配列を、検出可能な形で標識し、それらに対しハイブリタイズする能力をもつそ
の他の配列を単離するためのプローブとしてこれを使用することができる。さら
に、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントのフラグメントを使用して、単離、診断または法医学手順で使用
すべきＰＣＲプライマーを設計することも可能である。
【０３５１】 （１．ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核
酸の位置セグメントのフラグメントの、単離、診断および法医学的手順における
使用） 実施例３６ （ＰＣＲプライマーの調製およびＤＮＡの増幅） ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントのフラグメントを使用して、そのような配列にハイブリダイズし
得る核酸をクローニングするための単離方法、診断技術および法医学技術を含む
様々な適用のためのＰＣＲプライマーを調製することができる。一部の実施形態
において、ＰＣＲプライマーは、少なくとも１０，１５，１８，２０，２３，２
５，２８，３０，４０または５０ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態に
おいて、ＰＣＲプライマーは３０塩基を超える長さであってもよい。プライマー
対は、融解温度がほぼ同じであるように、ほぼ同じＧ／Ｃ比を有する。様々なＰ
ＣＲ技術が、当業者によく知られている。ＰＣＲ技術の概要については、Molecu
lar Cloning to Genetic Engineering, White,B.A.編、Methods in Molecular Bi
ology 67:Humana Press, Totowa 1997を参照のこと。これらのＰＣＲ手順のそれ
ぞれにおいて、増幅しようとする核酸配列のそれぞれの側に対するＰＣＲプライ
マーを、ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、またはＶｅ
ｎｔポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼと共に適切に調製された核酸サンプ
ルに添加する。サンプル中の核酸を変性し、ＰＣＲプライマーを、サンプル中の
相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたプライ
マーを伸張する。その後、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸張の別のサイ
クルが開始する。サイクルを複数回反復して、プライマー部位間の核酸配列を含
有する増幅されたフラグメントを生成する。
【０３５２】 実施例３７ （プローブとしてのＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、または
ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの使用） ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントのフラグメントから誘導されるプローブを、放射性同位体および
非放射性標識を含む、当業者によく知られた検出可能な標識物で標識し、検出可
能なプローブを提供することもできる。検出可能なプローブは、一本鎖または二
本鎖であってもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ニックトランスレーションまたは
キナーゼ反応を含む当業者に公知の技術を使用して作製してもよい。標識された
プローブにハイブリダイズすることができる配列を含有する核酸サンプルを、標
識したプローブに接触させる。サンプル中の核酸が二本鎖である場合、プローブ
に接触させる前に該核酸を変性してもよい。適用によっては、核酸サンプルを、
ニトロセルロースまたはナイロン膜などの表面上に固定化してもよい。核酸サン
プルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ＲＮＡ、または組織サンプルを
含むさまざまな供給源から得られる核酸を含むことができる。
【０３５３】 検出可能なプローブにハイブリダイズすることができる核酸の存在を検出する
ために使用される手順には、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、
ドットブロッティング、コロニーハイブリダイゼーション、およびプラークハイ
ブリダイゼーションなどの周知の技術が含まれる。適用によっては、標識された
プローブにハイブリダイズすることができる核酸を、発現ベクター、配列決定ベ
クター、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターなどのベクターにクローニングし
て、サンプル中のハイブリダイズ核酸の特性化および発現を容易にすることがで
きる。例えば、そのような技術を使用して、上記の実施例１８に記載の検出可能
なプローブにハイブリダイズすることができるゲノムライブラリーまたはｃＤＮ
Ａライブラリー中の配列を単離し、クローニングしてもよい。
【０３５４】 上記の実施例３６に記載のように作製されたＰＣＲプライマーは、以下の実施
例３８〜４２に記載のＤＮＡフィンガープリント技術などの法医学分析に使用す
ることもできる。そのような分析は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セ
グメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの配列に基づ
く検出可能なプローブまたはプライマーを利用することができる。
【０３５５】 実施例３８ （ＤＮＡの配列決定による法医学的一致）
【０３５６】 ある例示的方法では、従来の方法によって例えば、毛、精液、血液または皮膚
細胞の法医学的サンプルからＤＮＡサンプルを単離する。次いで、実施例３６に
従って、多くのＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントのフラグメントに基づくＰＣＲプライマーのパネル
を利用し、法医学的サンプルから長さ約１００〜２００塩基のＤＮＡを増幅する
。対応する配列は試験被験体から得られる。次いで、標準的な技術を使用して、
これらの同定ＤＮＡのそれぞれについて配列決定し、サンプルのデータベースを
比較することによって、被験体由来の配列とサンプル由来の配列との間に差異が
あればこれを決定する。被験体のＤＮＡ配列とサンプル由来のＤＮＡ配列との間
に統計学的に有意な差異が認められれば、その結果として同一性が欠如している
ことが明らかにされる。このような同一性の欠如は、例えば、ただ１つの配列に
よって証明することができる。一方、同一性を有することは、多数の配列でそれ
らが全て一致することによって実証されるべきである。好ましくは、長さが１０
０塩基の統計学的に同一な配列を最小でも５０個使用して、被疑体とサンプルと
の間の同一性を証明する。
【０３５７】 実施例３９ （ＤＮＡの配列決定による陽性同定） 先の実施例に概略されている技術をより大きな規模で使用して、任意の個体の
独特なフィンガープリント型同定を提供することができる。本技術では、多くの
ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントからプライマーを調製する。好ましくは、２０〜５
０個の異なるプライマーを使用する。これらのプライマーを使用して、実施例３
４に従い、問題の個体から相当する数のＰＣＲによって作製されたＤＮＡセグメ
ントを得る。実施例３６に記載の方法を使用して、これらのＤＮＡセグメントの
それぞれについて延期配列決定する。本手順を介して作製された配列のデータベ
ースは、配列が得られた個体を特異に同定する。次いで、後にプライマーの同じ
パネルを使用して、組織または他の生物学的サンプルと個体を絶対的に相関付け
ることができる。
【０３５８】 実施例４０ （サザンブロットによる法医学的同定） 実施例３８の手順を反復して、個体およびサンプルから少なくとも１０個の増
幅された配列のパネルを得る。好ましくは、パネルは少なくとも５０個の増幅さ
れた配列を含有する。より好ましくは、パネルは１００個の増幅された配列を含
有する。実施例によっては、パネルは２００個の増幅された配列を含有する。次
いで、このＰＣＲによって作製されたＤＮＡを、好ましくは４塩基特異的制限酵
素の１つまたは組み合わせで消化する。そのような酵素は市販されており、当業
者に既知である。消化後、得られた遺伝子フラグメントを、アガロースゲル上の
複数の二連ウェルでサイズにより分離し、当業者に周知のサザンブロッティング
技術を使用して、ニトロセルロースに移す。サザンブロッティングの概要につい
ては、Davisら(Basic Methods in Molecular Biology,1986, Elsevier Press62
〜65頁）を参照のこと。
【０３５９】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントのフラグメントの配列に基づくプローブのパネルを、ニックトラ
ンスレーション、末端標識などの当該分野において公知の方法を用い、放射性ま
たは発色性の標識を行い、当該分野において公知の方法（Ｄａｖｉｓら、前掲）
を用い、サザンブロットにハイブリダイズさせる。好ましくは、プローブは少な
くとも１０、１２、１５、１８、２０、２５、２８、３０、３５、４０、５０、
７５、１００、１５０、２００、３００、４００または５００ヌクレオチドの長
さである。好ましくは、プローブは少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、
２５、２８、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００
、４００または５００ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態において、プ
ローブは、４０ヌクレオチド以下の長さであるオリゴヌクレオチドである。
【０３６０】 好ましくは、少なくとも５〜１０個のこれらの標識されたプローブを使用し、
より好ましくは少なくとも約２０または３０個を使用して特異なパターンを提供
する。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核
酸の位置セグメントのフラグメントの大きなサンプルのハイブリダイゼーション
から出現して得られるバンドは、特異な同定物となる。制限酵素切断は全ての個
体に対して異なるため、サザンブロット上のバンドのパターンも特異である。プ
ローブの数が増加すると、同定において統計学的により高いレベルの信頼度が得
られる。何故なら、同定のために使用されるバンドの組の数が増加するからであ
る。
【０３６１】 実施例４１ （ドットブロット同定法） 本明細書において開示されるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメン
ト、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントを使用して個体を同
定するためのもう１つの技術はドットハイブリダイゼーション技術を利用する。
【０３６２】 同定しようとする被験体の核からゲノムＤＮＡを単離する。ＥＳＴ関連核酸、
ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフ
ラグメント由来の少なくとも１０個、好ましくは５０個の配列に相当するプロー
ブを調製する。プローブを使用して、当業者に既知の条件を介してゲノムＤＮＡ
にハイブリダイズさせる。ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を
使用して、オリゴヌクレオチドをＰ32で末端標識する。減圧ドットブロットマニ
ホールド（ＢｉｏＲａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用
して、ゲノムＤＮＡをニトロセルロースなどにスポットすることによってドット
ブロットを作製する。当該分野において公知の技術（Ｄａｖｉｓら、前掲）を用
いて、ゲノムの配列を含有するニトロセルロースフィルターをベーキングまたは
ＵＶによりフィルターに結合させ、プレハイブリダイズし、標識されたプローブ
でハイブリダイズする。32Ｐ標識ＤＮＡフラグメントを順に連続的にストリンジ
ェント条件でハイブリダイズさせ、３０ｂｐの配列とＤＮＡとの間の最低限の差
異を検出する。塩化テトラメチルアンモニウムは、少数のヌクレオチドのミスマ
ッチを含有するクローンを同定するのに有用である（Ｗｏｏｄら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２（６）：１５８５−１５８８
（１９８５））。ドットの特異なパターンにより、１つの個体ともう１つの個体
とが区別される。
【０３６３】 以下の代替的フィンガープリント技術では、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸
の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントを、
プローブとして使用することができる。一部の実施形態において、プローブは、
４０ヌクレオチド以下の長さであるオリゴヌクレオチドである。
【０３６４】 好ましくは、異なるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたは
ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメント由来の配列を有する複数のプロ
ーブを代替的フィンガープリント技術において使用する。以下の実施例４０は、
プローブがＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関
連核酸の位置セグメントのフラグメントから誘導される代表的な代替的フィンガ
ープリント手順を提供する。
【０３６５】 実施例４２ （代替的「フィンガープリント」同定法） Genset, Paris, Franceなどの市販のオリゴヌクレオチドサービスを用いて、
多数、例えば、５０，１００、または２００個のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核
酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントか
らオリゴヌクレオチドを調製する。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なく
とも１０，１５，１８，２０，２３，２５，２８または３０ヌクレオチドの長さ
である。しかしながら、一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、４０
、５０、６０、または７０ヌクレオチドよりも長い長さでもよい。
【０３６６】 当業者に周知の技術を用い、ＤＮＡを対象として試験被験体由来の細胞サンプ
ルを処理する。核酸をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩなどの制限酵素で消化する。消
化後、サンプルを電気泳動用ウェルにアプライする。ポリアクリルアミド電気泳
動に順応するために当該分野において既知の手順を改変してもよいが、本実施例
では、５μｇのＤＮＡを含むサンプルをウェルにロードし、０．８％のアガロー
スゲルで分離する。標準的なサザンブロッティング技術を使用して、ゲルをニト
ロセルロースに移す。
【０３６７】 １０ｎｇのそれぞれのオリゴヌクレオチドをプールし、32Ｐで末端標識する。
ニトロセルロースをブロッキング溶液でプレハイブリダイズし、標識したプロー
ブでハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ニトロセルロ
ースフィルターをＸ−Ｏｍａｔ ＡＲ Ｘ線フィルムに暴露する。得られるハイ
ブリダイゼーションのパターンはそれぞれの個体について特異である。
【０３６８】 本実施例では、更なる正確性または明確性のために使用されるプローブ配列の
数を変更することができることがさらに考慮される。
【０３６９】 法医学および同定におけるそれらの適用に加えて、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関
連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメン
トを、染色体の位置に対してマッピングすることができる。以下の実施例４１で
は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸
の位置セグメントのフラグメントを使用するヒト染色体領域の放射性ハイブリッ
ド（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ）（ＲＨ）マッピングについて記載する
。以下の実施例４２では、ヒト染色体上のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位
置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの位置の
マッピングの代表的手順について記載する。以下の実施例４３では、蛍光ｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による中期染色体上のＥＳＴ関連
核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメン
トのフラグメントのマッピングについて記載する。
【０３７０】 （２． 染色体マッピングにおけるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグ
メント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの使用） 実施例４３ （ヒトゲノムに対するＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、また
はＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの放射性ハイブリッドマッピ
ング） 放射性ハイブリッド（ＲＨ）マッピングは、体細胞の遺伝学的アプローチであ
り、ヒトゲノムの高分解能マッピングに使用することができる。本アプローチで
は、１つ以上のヒト染色体を含有する細胞株に致死的放射線を照射し、それぞれ
の染色体を、放射線の用量に依存するサイズを有するフラグメントに切断する。
これらのフラグメントを、培養したげっ歯類細胞との融合により回収し、ヒトゲ
ノムの異なる部分を含有するサブクローンを得る。本技術は、Benhamら(Genomic
s 4:509-517,1989)およびCoxら(Science 250:245-250,1990）に記載されている
。サブクローンは無作為的かつ独立した性質を有するため、任意のヒトゲノムマ
ーカーの効率的なマッピングが可能である。８０〜１００種の細胞株のパネルか
ら単離されたヒトＤＮＡは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント
、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントを順序よく配置するた
めのマッピング試薬を提供する。本アプローチでは、マーカー間の切断の頻度を
使用して、距離を測定し、従来のＥＳＴを用いて行われているのと同程度の細密
な解像度のマップを構築することが可能である（Ｓｃｈｕｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２７４：５４０−５４６， １９９６）。
【０３７１】 ＲＨマッピングを使用して、成長ホルモン（ＧＨ）およびチミジンキナーゼ（
ＴＫ）の遺伝子が横切るヒト染色体１７ｑ２２〜ｑ２５．３（Fosterら、Genomic
s 33:185-192, 1996）、ゴーリン症候群遺伝子を囲む領域（Obermayrら、Eur. J.
Hum. Genet.4:242-245,1996）、第１２染色体の全短腕に渡る６０個の遺伝子座
（Raeymaekersら、Genomics 29:170-178,1995）、２型神経繊維腫症の遺伝子座を
含有するヒト第２２染色体の領域（Frazerら、Genomics 14:574-585,1992）なら
びに第５染色体の長腕上の１３個の遺伝子座（Warringtonら、Genomics 11:701-7
08, 1991）の高分解能全ゲノム放射性ハイブリッドマップが作製されている。
【０３７２】 実施例４４ （ＰＣＲ技術を使用するヒト染色体に対するＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の
位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントのマッ
ピング） ＰＣＲに基づく方法論を使用して、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セ
グメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントをヒト染色体
に対して割り当てることができる。そのようなアプローチでは、ＥＳＴ関連核酸
、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントの
フラグメントからオリゴヌクレオチドプライマー対を設計して、イントロンを介
して増幅する可能性を最小限にする。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマ
ーの長さは１８〜２３ｂｐであり、ＰＣＲ増幅のために設計される。既知の配列
からＰＣＲプライマーを作成するのは当業者に周知である。ＰＣＲ技術の概要に
ついては、Erlich, PCR Technology, Principles and Applications for DNA Am
plification, 1992, W.H.Freeman and Co., New York を参照のこと。
【０３７３】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーを使用し、全ヒトゲノム
ＤＮＡからテンプレートを増幅する。ＰＣＲ条件は以下の通りである：６０ｎｇ
のゲノムＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして使用し、８０ｎｇのそれぞれのオ
リゴヌクレオチドプライマー、０．６単位のＴａｑポリメラーゼ、および１μＣ
ｕの32Ｐ標識デオキシシチジン三リン酸を伴う。ＰＣＲは、マイクロプレートサ
ーモサイクラー（Ｔｅｃｈｎｅ）において、以下の条件で行う：９４℃、１．４
分間；５５℃、２分間；および７２℃、２分間の３０サイクル；７２℃で１０分
間の最終伸長。増幅産物を６％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル上で分析し、
オートラジオグラフィーで可視化する。得られるＰＣＲ産物の長さが、プライマ
ーが誘導された５’ＥＳＴにおけるプライマー配列の末端間の距離と同一であれ
ば、ヒト−げっ歯類体細胞ハイブリッドの２つのパネル、ＢＩＯＳ ＰＣＲａｂ
ｌｅ ＤＮＡ（ＢＩＯＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＮＩＧＭＳヒト−げ
っ歯類体細胞ハイブリッドマッピングパネルナンバー１（ＮＩＧＭＳ，Ｃａｍｄ
ｅｎ，ＮＪ）由来のＤＮＡテンプレートでＰＣＲ反応を繰り返す。
【０３７４】 ＰＣＲを使用して、ヒト染色体の規定された組を含有する一連の体細胞ハイブ
リッド細胞株を、所定の５’ＥＳＴの存在を対象にスクリーニングする。体細胞
ハイブリッドからＤＮＡを単離し、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグ
メント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメント由来のプライマ
ー対を使用するＰＣＲ反応のための開始テンプレートとして使用する。ＥＳＴ関
連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメ
ントのフラグメントに対応するヒト遺伝子を含有する染色体を有するそれらの体
細胞ハイブリッドのみが、増幅されたフラグメントを生じる。体細胞ハイブリッ
ドＤＮＡテンプレート由来のＰＣＲ産物の分離パターンを分析することによって
、５’ＥＳＴｓを染色体に対して割り当てる。増幅されたフラグメントを生じる
全ての細胞ハイブリッドに存在する単一のヒトゲノムは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグ
メントを含有する染色体である。体細胞遺伝子のマッピング実験から生じる技術
およびその結果の分析の概要については、Ledbetterら、Genomics 6:475-481(199
0）を参照のこと。
【０３７５】 あるいは、以下の実施例４５に示されるように、ＦＩＳＨを用いてＥＳＴ関連
核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメン
トのフラグメントを個々の染色体にマッピングしてもよい。
【０３７６】 実施例４５ （蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いる染色体に対するＥＳＴ関
連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメ
ントのフラグメントのマッピング） 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、所定の染色体の特定の位
置に対してＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関
連核酸の位置セグメントのフラグメントをマッピングすることができる。蛍光ｉ
ｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術のために使用すべき染色体は、細胞培
養物、組織、または全血を含む様々な供給源から得ることができる。
【０３７７】 好ましい実施形態において、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメン
ト、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの染色体局在化は、
Ｃｈｅｒｉｆら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７
：６６３９−６６４３， １９９０）に記載のＦＩＳＨにより得られる。中期の
染色体をフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−刺激血液細胞供与体から調製する。
健常男性由来のＰＨＡ−刺激リンパ球を、ＲＰＭＩ−１６４０培地で７２時間培
養する。同調のために、メトトレキセート（１０μＭ）を１７時間添加し、続い
て、５−ブロモデオキシウリジン（５−ＢｒｄＵ、０．１ｍＭ）を６時間添加す
る。細胞を回収する前に、コルセミド（１μｇ／ｍｌ）を最後の１５分間添加す
る。細胞を回収し、ＲＰＭＩで洗浄して、ＫＣｌ（７５ｍＭ）の低張溶液と共に
３７℃で１５分間インキュベートし、メタノール：酢酸（３：１）を３回取り替
えて固定する。細胞懸濁物をスライドガラス上に滴下し、風乾する。ＥＳＴ関連
核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメン
トのフラグメントを、製造者（Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD
）の説明書に従い、ビオチン−１６ｄＵＴＰでニックトランスレーションにより
標識し、Sephadex G-50カラム(Pharmacia, Upsala, Sweden）を用いて精製し、沈殿 させる。ハイブリダイゼーションの直前に、ＤＮＡのペレットをハイブリダイゼ
ーション緩衝液（５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％デキストラン硫酸、
１ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、ｐＨ７）に溶解し、プローブを７０℃
で５〜１０分間変性させる。
【０３７８】 −２０℃に保たれたスライドをＲＮａｓｅ Ａ（１００μｇ／ｍｌ）により３
７℃で１時間処置し、２×ＳＳＣで３回濯いで、エタノール系列で脱水する。染
色体調製物を７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ中、７０℃で２分間変性させ、次
いで４℃で脱水する。スライドをプロテイナーゼＫ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ中１０μｇ／１００ｍｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ2）により、３７℃で８分間処置
し、脱水する。プローブを含有するハイブリダイゼーション混合物をスライド上
に配置し、カバーガラスで覆い、ゴム糊で封をして湿式チャンバにおいて３７℃
で１晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーシ
ョン後の洗浄後、ビオチン化されたプローブをアビジン−ＦＩＴＣで検出し、ビ
オチン化ヤギ抗アビジンおよびアビジン−ＦＩＴＣの更なる層で増幅する。染色
体局在化のために、前記のように蛍光Ｒバンドを得る（Ｃｈｅｒｉｆら、前掲）
。ＬＥＩＣＡ蛍光顕微鏡（ＤＭＲＸＡ）下でスライドを観察する。染色体をヨウ
化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）で対比染色し、蛍光Ｒバ
ンド染色体の両染色分体（赤色）上に２つの対称性の黄緑色のスポットとしてプ
ローブの蛍光シグナルが出現する。従って、特定のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連
核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメント
は、所定の染色体上の特定の細胞遺伝子的Ｒバンドに局在化し得る。
【０３７９】 一旦、上記の実施例４１〜４３に記載の技術を使用して、ＥＳＴ関連核酸、Ｅ
ＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラ
グメントが特定の染色体に対して割り当てられると、それらを利用して、それら
が局在する染色体の高分解能マップを構築するかまたはサンプル中の染色体を同
定することができる。
【０３８０】 実施例４６ （染色体マップを構築または拡大するためのＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の
位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの使用
） 上記のように、染色体マッピングは特定の染色体に所定の特異な配列を割り当
てることが必要である。一旦特異な配列が所定の染色体にマッピングされると、
該特異な配列は同じ染色体上に位置する他の特異な配列と比較して配置される。
染色体マッピングに対する１つのアプローチは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核
酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントが
得られる生物の染色体由来の数千もの長いインサートを有する一連の酵母人工染
色体（ＹＡＣ）を利用する。本アプローチについては、Ramaiah Nagarajaら、Gen
ome Research 7:210-222,March199７に記載されている。簡単に説明すると、本
アプローチでは、それぞれの染色体を、重複するフラグメントに切断して、ＹＡ
Ｃベクターに挿入する。ＰＣＲまたは他の方法を用いてＹＡＣインサートをスク
リーニングして、それらが位置を決定しようとするＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連
核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメント
を含むかどうかを決定する。一旦、５’ＥＳＴを含むインサートが見つかると、
該インサートをＰＣＲまたは他の方法を用いて分析し、該インサートが、染色体
上に、またはＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ
関連核酸の位置セグメントのフラグメントを誘導した領域内に存在することが知
られている他の配列を含有するかどうかを決定する。この過程はＹＡＣライブラ
リー内のそれぞれのインサートについて反復して、もう１つの既知の染色体マー
カーおよび他の既知の染色体マーカーに対するそれぞれのＥＳＴ関連核酸、ＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグ
メントの相対的な位置を決定することができる。本方法では、生物のそれぞれの
染色体に沿った多くの特異なマーカーの分布についての高分解能マップを得るこ
とができる。
【０３８１】 以下の実施例４５に記載のように、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セ
グメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントを使用して、
遺伝性疾患または薬物応答などの特定の表現型に関連する遺伝子を同定すること
もできる。
【０３８２】 ３． 遺伝子同定におけるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、
またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの使用 実施例４７ （遺伝性疾患または薬物応答に関連する遺伝子の同定） 本実施例は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントのフラグメントと特定の表現型特性との関連性につ
いて有用なアプローチを例示する。本実施例では、特定のＥＳＴ関連核酸、ＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグ
メントを試験プローブとして使用し、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セ
グメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントと特定の表現
型特性とを結びつける。
【０３８３】 実施例４１および４２に記載の技術または他の当該分野において公知の技術な
どの技術を使用して、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、また
はＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントをヒト染色体上の特定の位置
に対してマッピングする。A search of Mendelian Inheritance in Man(V.McKus
ick in Mendelian Inheritance in Man)(Johns Hopkins University Welch Medi
cal Libraryを介してオンラインで入手可能）は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連
核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメント
を含有するヒト染色体の領域が、いくつかの公知の遺伝子および遺伝子が同定さ
れていないいくつかの疾患または表現型を含有する非常に遺伝子の多い領域であ
ることを示している。従って、このＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグ
メント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントに対応する遺伝
子は、これらのそれぞれの遺伝子疾患についての直接的候補となる。
【０３８４】 これらの疾患または表現型を有する患者由来の細胞を単離し、培養で増殖させ
る。ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸
の位置セグメントのフラグメント由来のＰＣＲプライマーを使用して、患者から
得たゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをスクリーニングする。患者におい
てＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントのフラグメントが増幅しない場合、該配列は更なる分析によって
特定の疾患と関連性があると見なすことができる。あるいは、ＰＣＲ分析は、サ
ンプルが健常な個体から誘導される場合よりも、サンプルが疾患に関連する表現
型を有する個体から誘導される場合に様々な長さのフラグメントを生じ、このこ
とはＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸
の位置セグメントのフラグメントを含有する遺伝子が遺伝子疾患の原因である可
能性を示す。
【０３８５】 （ＶＩＩ． ベクターを構築するためのＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置
セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの使用）
【０３８６】 本発明のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関
連核酸の位置セグメントのフラグメントを使用して、ベクター内の遺伝子により
コードされるタンパク質の分泌を指令し得る分泌ベクターを構築することもでき
る。そのような分泌ベクターは、所望のタンパク質を精製または富化しなければ
ならないバックグランドのタンパク質の数を減少することによって、ベクターに
挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質の精製または富化を容易にする
ことができる。例示的な分泌ベクターについては以下の実施例４８に記載する。
【０３８７】 （１． 分泌ベクターの構築） 実施例４８ （分泌ベクターの構築） 本発明の分泌ベクターは、目的の宿主細胞、組織、または生物において遺伝子
の発現を指令することができるプロモーターを含む。そのようなプロモーターと
しては、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒトサイト
メガロウイルスプロモーター、および当業者によく知られている他のプロモータ
ーが挙げられる。
【０３８８】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントのフラグメントのいずれか１つに由来のシグナル配列は、プロモ
ーターから転写されるｍＲＮＡがシグナルペプチドの翻訳を指令するように、プ
ロモーターに機能し得る形で連結している。好ましくは、シグナル配列は、配列
番号２４〜８１１の核酸のうちの１つである。宿主細胞、組織、または生物は、
ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントのシグナル配列によりコードされるシグナルペプチ
ドを認識する任意の細胞、組織、または生物であり得る。適切な宿主としては、
哺乳動物の細胞、組織もしくは生物、鳥類の細胞、組織もしくは生物、昆虫の細
胞、組織もしくは生物、または酵母が挙げられる。
【０３８９】 さらに、分泌ベクターは、分泌されるべきタンパク質をコードする遺伝子を挿
入するためのクローニング部位を含む。クローニング部位は、シグナルペプチド
が、挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質に融合している融合タンパ
ク質が、プロモーターより転写されるｍＲＮＡから発現されるように、シグナル
配列とインフレームの挿入遺伝子のクローニングを容易にする。シグナルペプチ
ドは融合タンパク質の細胞外分泌を指令する。
【０３９０】 分泌ベクターはＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、宿主の染色体に組み込ま
れていてもよいし、宿主の染色体外レプリコンとして安定に維持されていてもよ
いし、人工染色体であってもよいし、または宿主内に一過的に存在していてもよ
い。好ましくは、分泌ベクターは各宿主細胞の複数のコピー中に維持される。本
明細書において使用する、「複数のコピー」とは、１つの細胞に対する少なくと
も２，５，１０，２０，２５，または５０のコピーを意味する。一部の実施形態
において、複数のコピーは染色体外的に維持される。他の実施形態において、複
数のコピーは染色体配列の増幅によって生ずる。
【０３９１】 分泌ベクターの用途に適切な多くの核酸バックボーンが当業者に公知であり、
レトロウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、ウシパピローマウイルスベクター
、酵母組込み型プラスミド、酵母エピソームプラスミド、酵母人工染色体、ヒト
人工染色体、Ｐ因子ベクター、バキュロウイルスベクター、または宿主に一過的
に導入され得る細菌プラスミドが挙げられる。
【０３９２】 分泌ベクターはまた、ポリＡシグナルが分泌ベクターに挿入される遺伝子の下
流に位置するようにポリＡシグナルを含み得る。
【０３９３】 分泌が所望されるタンパク質をコードする遺伝子を分泌ベクターに挿入した後
、この分泌ベクターを、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレ
クトロポレーション、リポソーム媒介性トランスエフェクション、ウイルス粒子
を用いて、または裸のＤＮＡとして、宿主の細胞、組織または生物に導入する。
次いで、硫安沈殿、免疫沈降、イムノアフィニティークロマトグラフィー、サイ
ズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびＨＰＬＣな
どの慣用の技術を使用して、挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質を
上清より精製するかまたは富化する。あるいは、分泌されたタンパク質は、更な
る富化を行わずとも意図する目的のために使用することができるように、十分に
富化されたまたは純粋な状態で上清中または宿主の増殖培地中に存在してもよい
。
【０３９４】 シグナル配列はまた、遺伝子治療のために設計されたベクターに挿入してもよ
い。そのようなベクターでは、シグナル配列は、プロモーターから転写されるｍ
ＲＮＡがシグナルペプチドをコードするように、プロモーターに機能し得る形で
連結される。クローニング部位は、シグナル配列の下流に配置して、分泌が所望
されるタンパク質をコードする遺伝子が容易にベクターに挿入され、シグナル配
列に融合され得るようにする。ベクターを適切な宿主細胞に導入する。プロモー
ターから発現されるタンパク質は細胞外に分泌され、それによって、治療効果を
呈する。
【０３９５】 実施例４９ （融合ベクター） ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントのフラグメントは、キメラポリペプチドの発現のための融合ベク
ターを構築するのに用いることができる。キメラポリペプチドは、第１のポリペ
プチド部分と第２のポリペプチド部分とを含む。本発明の融合ベクターにおいて
、第１のポリペプチド部分をコードする核酸と第２のポリペプチド部分をコード
する核酸とが互いにインフレームにおいて結合することによって、キメラポリペ
プチドをコードする核酸が生ずる。キメラポリペプチドをコードする核酸は、キ
メラポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現を指令するプロモーターに機能し
得る形で連結されている。このプロモーターは、実施例２１および４８に記載さ
れるものを含む本明細書に記載される発現ベクターのいずれにあってもよい。
【０３９６】 好ましくは、融合ベクターは各宿主細胞の複数のコピー中に維持される。一部
の実施形態において、複数のコピーは染色体外的に維持される。他の実施形態に
おいて、複数のコピーは染色体配列の増幅によって生ずる。
【０３９７】 第１のポリペプチド部分は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメン
ト、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによってコードされ
るポリペプチドのいずれを含んでいてもよい。一部の実施形態において、第１の
ポリペプチド部分は、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラ
グメント、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメント、またはＥＳＴ関連ポリペ
プチドの位置セグメントのフラグメントの１つであってもよい。
【０３９８】 第２のポリペプチド部分は、目的のポリペプチドであればいずれを含んでいて
もよい。一部の実施形態において、第２のポリペプチド部分は、グリーン蛍光タ
ンパク質やβガラクトシダーゼのような検出可能な酵素活性を有するポリペプチ
ドを含んでいてもよい。第２のポリペプチド部分が検出可能なポリペプチドを含
んでいるキメラポリペプチドは、第１のポリペプチド部分の細胞内局在化を決定
するのに用いることができる。そのような手順において、キメラポリペプチドを
コードする融合ベクターは、キメラポリペプチドの発現を促進する状況下におい
て宿主細胞に導入される。しかるべき場合には、これらの細胞を、顕微鏡で識別
できる検出剤で処理し、検出可能なポリペプチドと触媒反応させて、この検出剤
の細胞位置を決定する。例えば、検出可能な酵素活性を有するポリペプチドがβ
ガラクトシダーゼである場合、これらの細胞はＸガルで処理されてもよい。ある
いは、検出可能なポリペプチドが検出剤を添加せずに直接検出可能である場合、
キメラポリペプチドの細胞内位置は、検出可能なポリペプチドが識別できる状況
下において顕微鏡検査を行うことによって決定される。例えば、検出可能なポリ
ペプチドがグリーン蛍光タンパク質またはそれを改質したものである場合、この
グリーン蛍光タンパク質またはそれを改質したものを発光させるのに適当な波長
を有する光に対してこれらの宿主細胞を露光することによって顕微鏡検査が 行われる。
【０３９９】 あるいは、第２のポリペプチド部分は、単離、精製または富化が所望されるポ
リペプチドを含んでいてもよい。そのような実施形態において、第２のポリペプ
チド部分の単離、精製または富化は、それが結合している第１のポリペプチド部
分に対する抗体を有するイムノアフィニティーカラムを用いて以下に記載される
イムノアフィニティークロマトグラフィー法を実施することによって達成されて
もよい。
【０４００】 実施例５０に記載のように、サンプルが誘導される組織タイプまたは細胞種を
同定するために、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによりコードされるタンパク質、あ
るいはＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント、ＥＳ
Ｔ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグ
メントのフラグメントを使用して、本明細書に記載の抗体を作製することもでき
る。
【０４０１】 実施例５０ （標識組織特異的抗体による組織型または細胞種の同定） 検出可能なマーカーに直接的または間接的に結合した、本明細書に記載の抗体
調製物によって組織特異的抗原を可視化することによって、特異的な組織の同定
が達成される。選択された標識抗体種は、組織切片、細胞懸濁物、または組織サ
ンプル由来の可溶性タンパク質抽出物におけるそれらの特異的抗原結合パートナ
ーに結合して、定量的または半定量的解釈のためのパターンを提供する。
【０４０２】 これらの手順のための抗血清は、ネイティブな調製物の効力を超える効力を有
さなければならない。このため、抗体は、γグロブリン画分を単離することによ
って、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは硫安分画によってｍｇ／ｍ
ｌレベルに濃縮される。また、最も特異的な抗血清を提供するために、抗体をマ
ーカーで標識する前に、例えば、不溶性免疫吸着剤によって、γグロブリン画分
から、例えば、一般的なタンパク質に対する所望されない抗体を除去しなければ
ならない。モノクローナル抗血清または異種抗血清のいずれも、いずれの手順に
適切である。
【０４０３】 （１． 免疫組織化学技術） 上記のように調製した精製された高力価の抗体を、例えば、Fudenberg、H.、Bas
ic 503 Clinical Immunology、3版、26章、3版、Lange, Los Altos編,California(19
80)、またはRoseら、Methods in Immunodiagnosis、2版、12章、2版、John Wiley and
Sons編、New York(1980）に記載のように検出可能なマーカーに結合する。
【０４０４】 蛍光マーカーであるフルオレセインまたはローダミンのいずれかが好ましいが
、基質との発色反応を支持する西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素で抗体を
標識することもできる。以下に記載のように、第２のステップにおいて組織結合
抗体にマーカーを添加することもできる。あるいは、特異的抗組織抗体をフェリ
チンまたは他の電子高密度粒子で標識し、電子顕微鏡で抗原−抗体複合体に結合
したフェリチンの局在を調べることができる。もう１つのアプローチでは、抗体
を例えば125Ｉで放射性標識し、抗体処理調製物を写真乳剤で覆うことによって
検出する。
【０４０５】 手順を実施するための調製物は、組織型、例えば、脳組織に対して特異的であ
ると同定される単一のタンパク質またはペプチドに対するモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体を含むことができるか、あるいはいくつかの抗原性が異なる
組織特異的抗原に対する調製物はは、パネル内で、必要であれば独立してまたは
混合物で使用することができる。
【０４０６】 一般的な組織学的技術により、免疫組織化学的試験のための組織切片および細
胞懸濁物を調製する。未知の組織および既知の対照の複数のクリオスタット切片
（約４μｍ、未固定）をマウントし、それぞれのスライドを異なる希釈の抗体調
製物で覆う。既知および未知の組織の切片はまた、陽性対照、陰性対照、例えば
、前免疫血清、および非特異的染色に対する対照、例えば、緩衝液を提供する調
製物で処置されなければならない。
【０４０７】 処理された切片を湿式チャンバで３０分間室温でインキュベートし、濯ぎ、次
いで、３０〜４０分間、緩衝液で洗浄する。過度の液を滴り落として除き、マー
カーを展開する。
【０４０８】 組織特異的抗体を第１のインキュベーションで標識しなかった場合、この時点
で、該抗体は、第２の抗体−抗体反応、例えば、抗血清産生種の免疫グロブリン
クラスに対するフルオレセインまたは酵素結合抗体、例えば、マウスＩｇＧに対
するフルオレセイン標識抗体を添加することによって標識することができる。そ
のような標識血清は市販されている。
【０４０９】 上記の手順によって組織において見出される抗原を、組織切片上の色または蛍
光の強度を測定することによって、および適切な標準を用いてシグナルを較正す
ることによって定量することができる。
【０４１０】 （２． 組織特異的可溶性タンパク質の同定） 組織特異的タンパク質の可視化および該手順に由来する未知の組織の同定を、
免疫組織化学について記載された標識抗体試薬および検出戦略を使用して行うが
、サンプルを電気泳動技術に従って調製し、検出のために分子量に基づいて規則
的なアレイに、順序で組織から抽出されたタンパク質を分配する。
【０４１１】 Ｖｉｒｔｉｓ装置を用いて、組織サンプルをホモジナイズする。Ｄｏｕｎｃｅ
ホモジナイゼーションまたは浸透圧溶解により細胞懸濁物を破壊するが、いずれ
の場合でも、細胞膜を破壊するのに必要であって当該分野において慣例となって
いる界面活性剤を使用する。核、ミクロソーム、および膜フラグメントなどの不
溶性の細胞成分を、超遠心分離によって除去し、必要であれば、可溶性のタンパ
ク質を含有する画分を濃縮して、分析のために保存する。
【０４１２】 例えば、Davis, L.ら、Basic Methods in Molecular Biology、19-2節(P.Leder
編),Elsevier, New York(1986）に記載の従来のＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動によって、サンプル中で検出しようとするタンパク質の全分子量範囲を分離
する範囲の量のポリアクリルアミドゲルを１組のゲルに使用して、可溶性タンパ
ク質のサンプルを個々のタンパク質種に分離する。構成タンパク質の分子量を見
積もる目的で、平行してサイズマーカーを泳動させる。分析のためのサンプルの
サイズは５〜５５μｌの簡便な容量で、約１〜１００μｇのタンパク質を含有す
る。ニトロセルロースフィルター紙にブロットすることによって、分離されたタ
ンパク質のそれぞれのアリコートを移し、この過程では分離のパターンは維持さ
れている。複数のコピーを調製する。ウエスタンブロット分析として知られる手
順については、Ｄａｖｉｓ， Ｌ．ら、前掲、１９−３節に詳細に記載されてい
る。ニトロセルロースブロットの１つの組をクーマシーブルー染料で染色して、
抗体に結合したタンパク質と比較するために全てのタンパク質の組を可視化する
。次いで、残りのニトロセルロースフィルターを、実施例２０および３３に記載
のように調製した組織特異的タンパク質に対する１以上の特異的抗血清の溶液と
共にインキュベートする。本手順では、上記の手順Ａにおけるように、適切な陽
性および陰性サンプルならびに試薬対照を泳動する。
【０４１３】 上記手順のいずれにおいても、様々な戦略およびそれらの並べ替えに従って、
検出可能な標識を１次組織抗原−１次抗体複合体に付着させることができる。簡
潔なアプローチでは、１次特異的抗体を標識することができる。あるいは、非標
識複合体を、標識された２次抗ＩｇＧ抗体に結合させることができる。他のアプ
ローチでは、１次抗体または２次抗体のいずれかをビオチン分子に結合させる。
該ビオチン分子は、その後のステップにおいて、アビジン結合マーカーと結合す
る。もう１つの戦略によれば、酵素標識または放射性プロテインＡは任意のＩｇ
Ｇと結合する特性を有し、最終ステップで１次抗体または２次抗体のいずれかと
結合する。
【０４１４】 実施例５１ （ポリペプチドの免疫組織化学的局在化） 上記で本明細書に記載されるように調製された抗体は、ポリペプチドの細胞位
置を決定するのに用いられてもよい。このポリペプチドは、ＥＳＴ関連核酸、Ｅ
ＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグ
メントによりコードされるポリペプチドであればいずれでもよく、あるいは、こ
のポリペプチドは、ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグ
メント、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチ
ドの位置セグメントのフラグメントの１つでよい。一部の実施形態において、こ
のポリペプチドは、実施例４９の融合ベクターによってコードされるもののよう
なキメラポリペプチドでもよい。
【０４１５】 局在化されるポリペプチドを発現する細胞を顕微鏡のスライドに載せ、Curren
t Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. 1997 に記載
される方法のような免疫組織化学的局在化法に一般的に用いられる任意の手順を
用いて固定する。洗浄ステップの後に、これらの細胞を抗体と接触させる。一部
の実施形態において、この抗体は、前述のように、検出可能なマーカーに結合し
ており、検出を容易にしている。あるいは、一部の実施形態において、上記細胞
を局在化されるポリペプチドに対する抗体と接触させた後に、検出可能なマーカ
ーに結合している２次抗体を入れて、前記局在化されるポリペプチドに対する抗
体と接触させる。
【０４１６】 その後に、ポリペプチドの細胞位置を可視化するのに適切な条件下で顕微鏡検
査を行う。
【０４１７】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントによりコードされるポリペプチドに対するあるいは
ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント、ＥＳＴ関連
ポリペプチドの位置セグメント、またはＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメン
トのフラグメントに対する１つ以上の組織特異的抗体に結合する組織特異的抗原
を、対照組織で見られるレベルを超えるレベルで可視化すると、未知の起源の組
織、例えば、法医学的サンプル、または他所の身体部位に転移した分化型腫瘍組
織を同定することができる。
【０４１８】 また、本明細書に記載の抗体は、下記のイムノアフィニティークロマトグラフ
ィー法において、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによりコードされるポリペプチドを
単離、精製または富化するために、あるいはＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関
連ポリペプチドのフラグメント、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントまた
はＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントのフラグメントを単離、精製または
富化するために用いられてもよい。また、下記のイムノアフィニティークロマト
グラフィー法は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによりコードされるポリペプチドに
結合したポリペプチドを単離、精製または富化するために、あるいはＥＳＴ関連
ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント、ＥＳＴ関連ポリペプチ
ドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントのフラグメ
ントに結合したポリペプチドを単離、精製または富化するために用いられてもよ
い。
【０４１９】 実施例５２ （イムノアフィニティークロマトグラフィー） 上記のように調製された抗体を支持体に結合させる。好ましくは、これらの抗
体はモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体を使用してもよい。前記
支持体は、例えばセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ−４Ｂ（Pharmacia,
Piscataway,NJ）、セファロースＣＬ−２Ｂ（Pharmacia,Piscataway,NJ）、アフ
ィ−ゲル（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ）１０（Biorad,Richmond,CA）またはガラスビード
などの、イムノアフィニティークロマトグラフィーにおいて一般的に利用される
もののいずれでもよい。
【０４２０】 これらの抗体は、例えば臭化シアンのような、イムノアフィニティークロマト
グラフィーにおいて一般的に利用される任意のカップリング剤を用いて支持体に
結合されてもよい。抗体を支持体に結合させた後に、この支持体を、単離、精製
または富化が所望される標的ポリペプチドを含有するサンプルと接触させる。こ
の標的ポリペプチドは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまた
はＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによりコードされるポリペプ
チドでもよいし、あるいはＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドの
フラグメント、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリ
ペプチドの位置セグメントのフラグメントの１つでもよい。また、この標的ポリ
ペプチドは、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関
連核酸の位置セグメントのフラグメントによりコードされるポリペプチドに結合
したポリペプチドでもよいし、あるいは前述の融合ベクターを用いたＥＳＴ関連
ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント、ＥＳＴ関連ポリペプチ
ドの位置セグメントまたはＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントのフラグメ
ントに結合したポリペプチドでもよい。
【０４２１】 好ましくは、上記サンプルは、標的ポリペプチドの少なくとも５０％を支持体
と結合した抗体に対して特異的に結合させるのに十分な時間と適切な条件下にお
いて、前記支持体と接触するように配置される。
【０４２２】 その後に、この支持体を適切な洗浄液で洗浄し、この支持体に非特異的に付着
したポリペプチドを除去する。この洗浄液は、例えばＰＢＳ、トリス−塩化リチ
ウム緩衝液（０．１Ｍリジン塩基および０．５Ｍ塩化リチウム、ｐＨ８．０）、
トリス−塩酸塩緩衝液（０．０５Ｍトリス−塩酸塩、ｐＨ８．０）、またはトリ
ス／トリトン／塩化ナトリウム緩衝液（５０ｍＭトリス．ｃｌ、ｐＨ８．０また
は９．０、０．１％トリトンＸ−１００、および０．５ＭＮａＣｌ）のような、
イムノアフィニティークロマトグラフィーにおいて一般的に利用されるものであ
ればいずれでもよい。
【０４２３】 洗浄後、特異的に結合した標的ポリペプチドを、イムノアフィニティークロマ
トグラフィーにおいて一般的に利用される高ｐＨまたは低ｐＨ溶離溶液を用いて
支持体から溶離させる。特に、この溶離溶液は、トリエタノールアミン、ジエチ
ルアミン、塩化カルシウム、チオシアン酸ナトリウム、臭化カリウム、酢酸、ま
たはグリシンのような溶離液を含有していてもよい。一部の実施形態において、
この溶離溶液は、トリトンＸ−１００またはオクチル−β−Ｄ−グルコシドのよ
うな界面活性剤を含有していてもよい。
【０４２４】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントを使用して、遺伝子の発現を調節することができる
５’ＥＳＴの上流に位置する配列をクローニングしてもよく、そのような配列と
しては、プロモーター配列、エンハンサー配列、および転写レベルまたは翻訳レ
ベルに影響を及ぼす他の上流配列が含まれる。一旦同定されてクローニングされ
たら、これらの上流調節配列は、所望の空間的、時間的、発生的または量的様式
で挿入遺伝子の発現を指令するように設計された発現ベクターにおいて使用する
ことができる。実施例５１では、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメ
ントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの上流にある配列を
クローニングするための方法について説明する。
【０４２５】 （２．プロモーター活性または調節活性を有する上流配列の同定） 実施例５３ （ゲノムＤＮＡ由来の上流配列をクローニングするためのＥＳＴ関連核酸、ＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメ
ントの使用） 染色体歩行技術を用い、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントま
たはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントから誘導される配列を使用
して、相当する遺伝子のプロモーターを単離することができる。Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈより販売されているＧｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ（登録商標）キットを利用す
る１つの染色体歩行技術では、５つの完全なゲノムＤＮＡサンプルのそれぞれを
、６塩基の認識部位を有し、かつ平滑末端を生じる異なる制限酵素で消化する。
消化後、オリゴヌクレオチドアダプタを、得られたゲノムＤＮＡフラグメントの
両末端に連結する。
【０４２６】 ５つのゲノムＤＮＡライブラリーのそれぞれについて、キットに付属している
外側アダプタプライマーおよび外側遺伝子特異的プライマーを使用して、製造者
の説明書（引用により本明細書に組み入れる）に従って第１のＰＣＲ反応を実施
する。遺伝子特異的プライマーは、目的の５’ＥＳＴに特異的であるように選択
されるべきであり、かつ、ＰＣＲ反応での該プライマーの使用に適合する融解温
度、長さ、およびＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントのフラグメントにおける位置を有するべきである。
それぞれの第１のＰＣＲ反応物は、５０μｌの全容量中に、５ｎｇのゲノムＤＮ
Ａ、５μｌの１０×Ｔｔｈ反応緩衝液、０．２ｍＭの各種ｄＮＴＰ、外側アダプ
タプライマーおよび外側遺伝子特異的プライマーをそれぞれ０．２μＭ、１．１
ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）2、および１μｌのＴｔｈポリメラーゼ５０×ミックスを
含有する。第１のＰＣＲ反応の反応サイクルは以下の通りである：１分間−９４
℃／２秒間−９４℃、３分間−７２℃（７サイクル）／２秒間−９４℃、３分間
−６７℃（３２サイクル）／５分間−６７℃。
【０４２７】 第１のＰＣＲ反応の産物を希釈し、第１のＰＣＲ反応から生じるアンプリコン
の内部に位置するネステッドプライマーの対を用い、製造業者の説明書に従った
第２のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用する。例えば、第１のＰＣＲ反応混
合物の５μｌの反応産物を１８０倍に希釈してもよい。ネステッドプライマーを
使用すること以外は第１のＰＣＲ反応の組成と同一の組成を有する５０μｌの容
量で反応を行う。第１のネステッドプライマーは、アダプターに特異的であり、
Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ（登録商標）キットに付属している。第２のネステ
ッドプライマーは、該プロモーターをクローニングしようとする特定のＥＳＴ関
連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメン
トのフラグメントに特異的であり、かつ、ＰＣＲ反応における使用に適合する融
解温度、長さ、および該ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまた
はＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメント中での位置を有するべきであ
る。第２のＰＣＲ反応の反応パラメータは以下の通りである：１分間−９４℃／
２秒間−９４℃、３分間−７２℃（６サイクル）／２秒間−９４℃、３分間−６
７℃（２５サイクル）／５分間−６７℃。第２のＰＣＲ反応の産物を標準的な技
術を用いて精製し、クローニングし、配列決定する。
【０４２８】 あるいは、２種以上の制限酵素を用いることによって、２種以上のヒトゲノム
ＤＮＡライブラリーを構築することができる。消化されたゲノムＤＮＡを、一本
鎖、環状、または鎖状ＤＮＡに変換可能なベクターにクローニングする。ＥＳＴ
関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメ
ントのフラグメント配列由来の少なくとも１０、１２、１５、１８、２０、２３、
２５、２７、３０、３５、４０、または５０個のヌクレオチドを含むビオチン化
オリゴヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズさせる。ビオチン化オリ
ゴヌクレオチドとＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントのフラグメントを含む一本鎖ＤＮＡとのハイブリッ
ドを、上記のように単離する。その後、そのＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントを含有す
る一本鎖ＤＮＡをビーズから放出させ、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置
セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントに特異的なプ
ライマーまたはクローニングベクターに含まれる配列に対応するプライマーを使
用し、二本鎖ＤＮＡに変換する。得られる二本鎖ＤＮＡを細菌に形質転換する。
ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置
セグメントのフラグメントを含有するｃＤＮＡを、コロニーＰＣＲまたはコロニ
ーハイブリダイゼーションによって同定する。
【０４２９】 上記のように上流ゲノム配列をクローニングし配列決定したら、該上流配列内
の予期されるプロモーターおよび転写開始部位は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連
核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの
上流にある配列を、既知の転写開始部位、転写因子結合部位またはプロモーター
配列を含有するデータベースと比較することによって同定することができる。
【０４３０】 さらに、実施例５４に記載のようにして、プロモーターレポーターベクターを
使用して、上流配列内のプロモーターを同定することができる。
【０４３１】 実施例５４ （クローニングされた上流配列におけるプロモーターの同定） ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントの上流のゲノム配列を、例えばｐＳＥＡＰ−Ｂａｓ
ｉｃ、ｐＳＥＡＰ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−
Ｅｎｈａｎｃｅｒ、またはＣｌｏｎｔｅｃｈより市販されているｐＥＧＦＰ−１
プロモーターレポーターベクターなどの適切なプロモーターレポーターベクター
にクローニングする。簡単に説明すると、これらのプロモーターレポーターベク
ターのそれぞれは、分泌型アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、また
はグリーン蛍光タンパク質などの容易にアッセイをすることができるタンパク質
をコードするレポーター遺伝子の上流に位置する多重クローニング部位を含む。
ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置
セグメントのフラグメントの上流の配列を、レポーター遺伝子の上流のクローニ
ング部位に両方向で挿入し、適切な宿主細胞に導入する。レポータータンパク質
のレベルをアッセイし、クローニング部位にインサートがないベクターから得ら
れるレベルと比較する。対照のベクターと比較して、インサートを含有するベク
ターの発現レベルの上昇が認められれば、インサートにプロモーターが存在する
ことになる。必要であれば、上流配列を、弱いプロモーター配列からの転写レベ
ルを増大させるためのエンハンサーを含有するベクターにクローニングすること
もできる。インサートを含まないベクターの場合に認められる上記の発現の有意
なレベルは、プロモーター配列が挿入上流配列に存在することを示す。
【０４３２】 プロモーターレポーターベクターに適切な宿主細胞は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳ
Ｔ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメ
ントの発現パターンの上記の判定の結果に基づいて選択することができる。例え
ば、発現パターンの分析から、特定のＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セ
グメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントに対応するｍＲ
ＮＡが繊維芽細胞において発現されることが示された場合、プロモーターレポー
ターベクターをヒト繊維芽細胞系に導入することができる。
【０４３３】 上流ゲノムＤＮＡ内のプロモーター配列は、エキソヌクレアーゼＩＩＩ消化な
どの慣用の技術を使用して、上流ＤＮＡにおいてネステッド欠失を構築すること
によって、さらに明確化することができる。得られる欠失フラグメントをプロモ
ーターレポーターベクターに挿入して、その欠失がプロモーター活性を低下させ
るかまたは失わせるかどうかを判定することができる。このようにして、プロモ
ーターの境界を規定することができる。所望であれば、プロモーター内の潜在的
な転写因子結合部位を除去するための部位特異的突然変異誘発もしくはリンカー
スキャニングを単独または組合せて使用して、プロモーター内の潜在的な個々の
調節部位を同定してもよい。プロモーターレポーターベクターのクローニング部
位に変異を挿入することによって、転写レベルに対するこれらの変異の効果を決
定することができる。
【０４３４】 実施例５５ （プロモーターのクローニングおよび同定） ５’ＥＳＴを用いた上記の実施例５１に記載の方法を用いて、いくつかの遺伝
子の上流の配列を得た。プライマー対ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＴＡ
ＧＴＡ ＴＴＧ ＣＣＴ Ｇ（配列番号１５）およびＣＴＧ ＣＣＡ ＴＧＴ
ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＡＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＴＣ（配列番号１６）を使用し、
内部呼称Ｐ１３Ｈ２（配列番号１７）を有するプロモーターを得た。
【０４３５】 プライマー対ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＧＧＧ ＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＴＴ
ＧＣ（配列番号１８）およびＣＴＧ ＴＧＡ ＣＣＡ ＴＴＧ ＣＴＣ ＣＣＡ
ＡＧＡ ＧＡＧ（配列番号１９）を使用して、内部呼称Ｐ１５Ｂ４（配列番号
２０）を有するプロモーターを得た。
【０４３６】 プライマー対ＣＴＧ ＧＧＡ ＴＧＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＧＧ ＴＡ（配列
番号２１）およびＧＡＧ ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＡＧ ＣＴＡ ＧＡＣ ＡＡ（配
列番号２２）を使用して、内部呼称Ｐ２９Ｂ６（配列番号２３）を有するプロモ
ーターを得た。
【０４３７】 図４は、単離されたプロモーターの概略図および対応する５’タグでそれらを
組み立てる方法を示す。コンピュータプログラムＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒリリ
ース２．０（１９９６年８月）を使用して、転写因子結合部位または既知の転写
開始部位に類似するモチーフの存在に基づいて、上流配列をスクリーニングした
。
【０４３８】 図５は、これらのプロモーターのそれぞれに存在する転写因子結合部位を示し
ている。「マトリックス」と書いた欄は、使用したＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒマ
トリックスの名称を示す。「位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」と書いた欄は、プロモ
ーター部位の５’位を示す。配列の番号付けは、ゲノム配列と５’ＥＳＴ配列と
の一致により決定した転写部位から開始する。「配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ
）」と書いた欄は、その部位が見出されたＤＮＡ鎖を示し、＋鎖は、ゲノム配列
と５’ＥＳＴの配列とが一致することで決定されたコード鎖である。「スコア」
と書いた欄は、この部位に対するＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒのスコアを示す。「
長さ」と書いた欄は、部位の長さ（ヌクレオチド単位による）を示す。「配列」
と書いた欄は、見出された部位の配列を示す。
【０４３９】 上記のプロモーター配列を含有するプラスミドを含有する細菌クローンは、先
に示した内部同定番号で本発明者の研究室に現在保存されている。適切な細菌の
クローンのアリコートを適切な培地で増殖させることによって、寄託物からイン
サートを取り出すことができる。次いで、アルカリ溶解ミニプレップまたは大量
アルカリ溶解プラスミド単離法などの当業者によく知られているプラスミド単離
手順を使用して、プラスミドＤＮＡを単離することができる。所望であれば、塩
化セシウム勾配上での遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、または陰イオ
ン交換クロマトグラフィーによって、プラスミドＤＮＡをさらに富化してもよい
。次いで、当業者によく知られている標準的なクローニング技術を用いて、これ
らの手順を用いて得られるプラスミドＤＮＡを操作してもよい。あるいは、挿入
されたＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸
の位置セグメントのフラグメントの両末端で設計したプライマーを用いてＰＣＲ
を行うことができる。次いで、当業者によく知られている標準的なクローニング
技術を用いて、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ
関連核酸の位置セグメントのフラグメントに対応するＰＣＲ産物を操作すること
ができる。
【０４４０】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントの上流に位置するプロモーターおよび他の調節配列
を使用して、所望の空間的、時間的、発生的または量的様式で挿入遺伝子の発現
を指令し得る発現ベクターを設計することができる。上記の発現分析の結果を使
用して、所望の空間的、時間的、発生的または量的パターンを指令し得るプロモ
ーターを選択することができる。例えば、筋肉において高レベルの発現をもたら
すプロモーターが望まれる場合、筋肉において高レベルで発現されるｍＲＮＡか
ら誘導されるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関
連核酸の位置セグメントのフラグメントの上流のプロモーター配列は、上記の方
法で決定されるように、発現ベクターで使用することができる。
【０４４１】 好ましくは、所望のプロモーターを多重制限部位の付近に配置して、プロモー
ターの下流の所望のインサートのクローニングを容易にし、それによってプロモ
ーターが挿入遺伝子の発現を駆動することができるようにする。染色体外複製、
宿主染色体への組み込みまたは一過性発現のために設計された通常の核酸バック
ボーンにプロモーターを挿入することができる。本発明の発現ベクターの適切な
バックボーンとしては、レトロウイルスのバックボーン、ＳＶ４０またはウシパ
ピローマウイルスなどの真核生物エピソーム由来のバックボーン、細菌エピソー
ム由来のバックボーン、または人工染色体が挙げられる。
【０４４２】 好ましくは、この発現ベクターはまた、該発現ベクターに挿入された遺伝子か
ら転写されるｍＲＮＡのポリアデニル化を指令するための、多重制限部位の下流
にあるポリＡシグナルを含む。
【０４４３】 プロモーター配列を同定した後、以下の実施例５６に記載するようにして、プ
ロモーターと相互作用するタンパク質を同定することができる。
【０４４４】 実施例５６ （プロモーター配列、上流調節配列、またはｍＲＮＡと相互作用するタンパク質
の同定） 既知の転写因子結合部位に対する相同性によって、あるいはプロモーター配列
を含有するレポータープラスミドの慣用の変異誘発または欠失分析により、転写
因子に結合しやすいプロモーター領域内の配列を同定することができる。例えば
、アッセイ可能なレポーター遺伝子に機能し得る形で連結した目的のプロモータ
ー配列を含有するレポータープラスミド内に欠失を作製することができる。プロ
モーター領域内に様々な欠失を保有するレポータープラスミドを適切な宿主細胞
にトランスフェクトし、発現レベルに対する欠失の影響を評価する。部位特異的
変異、リンカーリンカースキャニング分析、または当業者によく知られている他
の技術を使用して、欠失により発現レベルが低下する領域内で転写因子結合部位
をさらに局在化することができる。
【０４４５】 Ｃｌｏｎｔｅｃｈより市販のＭａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ
Ｓｙｓｔｅｍキット（カタログ番号Ｋ１６０３−１）に添付されている説明書に
記載のシステムのようなワンハイブリッドシステム（ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ ｓ
ｙｓｔｅｍ）を使用して、プロモーター内の配列と相互作用するタンパク質をコ
ードする核酸を同定することができる。簡単に説明すると、Ｍａｔｃｈｍａｋｅ
ｒ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍは以下のようにして使用する。結合タ
ンパク質を同定することが所望される標的配列を、選択レポーター遺伝子の上流
にクローニングし、酵母のゲノムに組み込む。好ましくは、標的配列の複数のコ
ピーをタンデムにレポータープラスミドに挿入する。プロモーターに結合する能
力について評価しようとするｃＤＮＡとＧＡＬ４などの酵母転写因子の活性化ド
メインとの融合物をから成るライブラリーを、組み込まれたレポーター遺伝子配
列を含有する酵母株へ形質転換する。この酵母を選択培地に蒔き、プロモーター
配列に連結した選択マーカーを発現している細胞を選択する。選択培地上で増殖
するコロニーは、標的配列に結合するタンパク質をコードする遺伝子を含有する
。配列決定することによって、融合タンパク質をコードする遺伝子内のインサー
トをさらに特性化する。さらに、インサートは、発現ベクターかまたはｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ転写ベクターに挿入してもよい。インサートによりコードされるポリペ
プチドとプロモーターＤＮＡとの結合は、ゲルシフト分析またはＤＮＡｓｅ保護
分析などの当業者によく知られている技術によって確認することができる。
【０４４６】 （ＶＩＩＩ． 遺伝子治療におけるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグ
メントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの使用） 本発明はまた、以下の実施例５７および５８に記載のアンチセンスおよび三重
らせん戦略を含む遺伝子治療におけるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セ
グメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの使用を包含す
る。アンチセンスアプローチでは、ｍＲＮＡに相補的な核酸配列を細胞内でｍＲ
ＮＡにハイブリダイズさせることによって、該ｍＲＮＡによりコードされるタン
パク質の発現を阻止する。アンチセンス配列は、様々な機構を介して遺伝子の発
現を妨げることができる。例えば、アンチセンス配列は、リボソームがｍＲＮＡ
を翻訳する能力を阻害することができる。あるいは、アンチセンス配列は、核か
ら細胞質へのｍＲＮＡの輸送を阻止して、翻訳に利用可能なｍＲＮＡの量を制限
することができる。アンチセンス配列が遺伝子発現を阻害し得るもう１つの機構
は、ｍＲＮＡのスプライシングを干渉することによるものである。さらにもう１
つの戦略では、標的のｍＲＮＡを特異的に切断し得るリボザイムにアンチセンス
核酸を取り込ませることができる。
【０４４７】 実施例５７ （アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製および使用） 遺伝子治療において使用すべきアンチセンス核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配
列のいずれであってもよく、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメント
またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントの配列に相補的な配列を
含んでいてもよい。アンチセンス核酸は、二本鎖の状態でｍＲＮＡの発現を阻害
するのに十分安定に細胞内二本鎖を形成し得るよう、十分な長さおよび融解温度
を有するべきである。遺伝子治療の用途に適切なアンチセンス核酸を設計するた
めの方法については、Greenら、Ann. Rev. Biochem. 55:569-597(1986)およびIza
ntおよびWeintraub、Cell36:1007-1015(1984）に開示されている。
【０４４８】 いくつかの方法では、細胞中で正常に転写される鎖とは反対側の鎖を転写する
ように、プロモーターに対してコード領域の配向を逆にすることによって、タン
パク質をコードするヌクレオチド配列からアンチセンス核酸を得る。Ｔ７または
ＳＰ６ポリメラーゼを使用して転写物を作製する系などのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
系を用いて、アンチセンス分子を転写することができる。もう１つのアプローチ
は、アンチセンス配列を含有するＤＮＡを発現ベクターのプロモーターに機能し
得る形で連結することによるｉｎ ｖｉｖｏでのアンチセンス核酸の転写に関与
するものである。
【０４４９】 あるいは、細胞中で正常に転写される鎖に相補的なオリゴヌクレオチドをｉｎ
ｖｉｔｒｏで合成してもよい。従って、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡ
に相補的であり、ｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖を作製することができる
。一部の実施形態では、アンチセンス配列は、改変された糖リン酸バックボーン
を含有するため安定性が増し、ＲＮａｓｅ活性に対する該アンチセンス配列の感
受性が低下する。アンチセンス法での使用に適した改変の例については、Rossi
ら、Pharmacol. Ther. 50(2):245-254(1991)に記載されている。
【０４５０】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントの配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド
の様々な型を使用することができる。１つの好ましい実施形態では、国際出願で
あるＰＣＴ ＷＯ９４／２３０２６号に記載の安定および半安定なアンチセンス
オリゴヌクレオチドを使用する。これらの分子では、３’末端または３’および
５’両末端は、相補的な塩基対間の分子内水素結合で結ばれている。これらの分
子はエキソヌクレアーゼの攻撃にさらに耐えることができ、従来のアンチセンス
オリゴヌクレオチドに比べて安定性が向上している。
【０４５１】 別の好ましい実施形態では、国際出願ＷＯ９５／０４１４１号に記載の単純ヘ
ルペスウイル１型および２型に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド
を使用する。
【０４５２】 さらに別の好ましい実施形態では、国際出願ＷＯ９６／３１５２３号に記載の
共有結合で架橋されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。これらの二
本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドは、それぞれ１つ以上のオリゴヌクレオチ
ド間またはオリゴヌクレオチド内の共有架橋結合を有し、ここで、該結合は、そ
れぞれ、一方の鎖の第一級アミン基と他方の鎖のカルボキシル基との間のアミド
結合、または同じ鎖の第一級アミン基とカルボキシル基との間のアミド結合から
成り、それぞれ、第一級アミン基は、鎖ヌクレオチドの単糖環の２’位で直接置
換されており、カルボキシル基は、他方の鎖または同じ鎖のヌクレオチドまたは
ヌクレオチド類似体上に置換されている脂肪族スペーサー基によって担持されて
いる。
【０４５３】 国際出願ＷＯ９２／１８５２２号に開示のアンチセンスオリゴデオキシヌクレ
オチドおよびオリゴヌクレオチドも使用することができる。これらの分子は分解
に対して安定であり、制御タンパク質に結合する少なくとも１つの転写制御認識
配列を含有するため、そのデコイとして有効である。これらの分子は、「ヘアピ
ン」構造、「ダンベル」構造、「修飾されたダンベル」構造、「架橋された」デ
コイ構造および「ループ」構造を含有し得る。
【０４５４】 別の好ましい実施形態では、欧州特許出願第０ ５７２ ２８７Ａ２号に記載
の環状二本鎖オリゴヌクレオチドを使用する。これらの連結オリゴヌクレオチド
「ダンベル」は、転写因子のための結合部位を含有し、転写因子を封鎖（ｓｅｑ
ｕｅｓｔｅｒ）することによって、転写因子の制御下にある遺伝子発現を阻害す
る。
【０４５５】 国際出願ＷＯ９２／１９７３２号に開示されている閉環型アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの使用も考慮される。該参考文献は参考として援用される。これら
の分子は遊離の末端を持たないため、従来のオリゴヌクレオチドよりもエキソヌ
クレアーゼによる分解に対して耐性が高い。これらのオリゴヌクレオチドは多機
能性であり得、標的ｍＲＮＡに隣接していない複数の領域と相互作用する。
【０４５６】 遺伝子の発現を阻害するのに必要なアンチセンス核酸の適切なレベルは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ発現分析を用いて決定することができる。当該分野において公知の
手順を用いる拡散、注入、感染またはトランスフェクションにより、アンチセン
ス分子を細胞に導入することができる。例えば、アンチセンス核酸を露出したま
たは裸のオリゴヌクレオチド、脂質にカプセル化させたオリゴヌクレオチド、ウ
イルスタンパク質に封入したオリゴヌクレオチド、または発現ベクターに含まれ
るプロモーターに機能し得る形で連結させたオリゴヌクレオチドとして、アンチ
センス核酸を身体に導入することができる。発現ベクターは当該分野において公
知の様々な発現ベクターのいずれであってもよく、レトロウイルスベクターまた
はウイルスベクター、染色体外複製が可能なベクター、または組込みベクターが
挙げられる。ベクターは、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。
【０４５７】 アンチセンス分子を、好ましくは１×１０-10Ｍ〜１×１０-4Ｍの間の多くの
異なる濃度で細胞サンプルに導入する。適切に遺伝子発現を制御することができ
る最小濃度が同定されれば、その最適化用量がｉｎ ｖｉｖｏでの使用に適切な
用量と解釈される。例えば、培養物の場合の１×１０-7の阻害濃度は約０．６ｍ
ｇ／ｋｇ体重の用量と解釈される。１００ｍｇ／ｋｇ体重以上に達するオリゴヌ
クレオチドのレベルは、実験動物でオリゴヌクレオチドの毒性を試験すれば可能
である。脊椎動物から細胞を取り出し、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置
して、脊椎動物に再導入することもさらに考慮される。
【０４５８】 アンチセンスオリゴヌクレオチド配列をリボザイム配列に取り込ませ、アンチ
センスを特異的にその標的ｍＲＮＡに結合させてこれを切断し得るようにするこ
ともさらに考慮される。リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの技
術的適用については、Ｒｏｓｓｉら（前掲）を参照のこと。
【０４５９】 本発明の好ましい適用では、翻訳に対するアンチセンス阻害の有効性を監視で
きるように、遺伝子によりコードされるポリペプチドを最初に同定する。監視に
はＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ、機能アッセイ、または放射性標識などの抗体介在性
試験を含む技術が使用されるが、これらに限定されない。
【０４６０】 ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントを、細胞内三重らせん形成に基づく遺伝子治療に使
用することもできる。三重らせんオリゴヌクレオチドを使用してゲノムからの転
写を阻害する。それらは、細胞活性の変化を研究するのに特に有用である。何故
なら、これは特定の遺伝子に関連するからである。本発明のＥＳＴ関連核酸、Ｅ
ＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグ
メントまたは、より好ましくは、それらの配列の一部は、特定の遺伝子の発現に
関連する疾患を有する個体の遺伝子発現を阻害するために使用することができる
。同様に、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連
核酸の位置セグメントのフラグメントを使用して、細胞内での特定の遺伝子の転
写を阻害する効果を研究することができる。従来は、ホモプリン配列は三重らせ
ん戦略に最も有用であると考えられていた。しかし、ホモピリミジン配列も遺伝
子の発現を阻害することができる。そのようなホモピリミジンオリゴヌクレオチ
ドは、ホモプリン：ホモピリミジン配列の主溝に結合する。従って、ＥＳＴ関連
核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメント
のフラグメント由来の両タイプの配列は、本発明の範囲内にあるものとする。
【０４６１】 実施例５８ （三重らせんプローブの調製および使用） ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントの配列を走査して、遺伝子発現を阻害するための三
重らせんに基づくストラテジーに使用し得る１０マー〜２０マーのホモピリミジ
ンまたはホモプリンストレッチを同定する。ホモピリミジンまたはホモプリンス
トレッチの候補の同定後、候補配列を含有する様々な量のオリゴヌクレオチドを
、標的遺伝子を正常に発現する組織培養細胞に導入することによって、遺伝子発
現の阻害効率を評価する。オリゴヌクレオチドは、特注オリゴヌクレオチド合成
装置で調製するか、またはGENSET,Paris,Franceなどのオリゴヌクレオチド合成
の専門業者より購入することができる。
【０４６２】 当業者に既知の様々な方法を用いて、オリゴヌクレオチドを細胞に導入するこ
とができ、このような方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン法、エレクトロポレーション法、リポソーム介在トランスエフェクショ
ン法または自然取り込み法が挙げられるが、それらに限定されない。
【０４６３】 ノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、またはＰＣＲに基づくス
トラテジーなどの技術を用いて、処理された細胞を細胞機能の変化または遺伝子
発現の減少についてモニタリングし、オリゴヌクレオチドで処理されている細胞
の標的遺伝子の転写レベルをモニタリングする。該オリゴヌクレオチドが誘導さ
れるＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の
位置セグメントのフラグメントに相当する標的遺伝子の、特定の機能に関連して
いる既知の遺伝子配列との相同性に基づいて、モニタリングしようとする細胞機
能を予測する。特に、本明細書に記載の技術を用いて、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ
関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメン
トが疾患と関連付けられる場合には、特定の遺伝性疾患を有する個体から誘導さ
れる細胞内の異常な生理活動の存在に基づいて、細胞機能を予測することもでき
る。
【０４６４】 次いで、実施例５７に記載のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの結果に基づいて算
出された用量で、上記の技術および実施例５６に記載の技術を用いて、組織培養
細胞における遺伝子発現を阻害するのに有効なオリゴヌクレオチドをｉｎ ｖｉ
ｖｏで導入することができる。
【０４６５】 一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド単位の天然の（β）アノマーを
αアノマーで置換し、該オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより耐性に
することができる。さらに、臭化エチジウムなどの挿入化剤（ｉｎｔｅｒｃａｌ
ａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などをαオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させて
、三重らせんを安定化することができる。三重らせん形成に適切なオリゴヌクレ
オチドの作製に関する情報については、Griffinら(Science 245:967-971(1989)
）を参照されたい。
【０４６６】 実施例５９ （宿主生物においてコードされるタンパク質を発現させるためのＥＳＴ関連核酸
、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフ
ラグメントの使用） ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸の位置セグメントまたはＥＳＴ関連核酸の位
置セグメントのフラグメントを使用して、宿主生物においてコードされるタンパ
ク質またはポリペプチドを発現し、有益な効果を生じることもできる。さらに、
ＥＳＴ関連ポリペプチド、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セグメントまたはＥＳ
Ｔ関連ポリペプチドの位置セグメントのフラグメントをコードする核酸を使用し
て、宿主生物においてコードされるタンパク質またはポリペプチドを発現し、有
益な効果を生じることができる。
【０４６７】 そのような手順において、コードされるタンパク質またはポリペプチドは、宿
主生物において一過的に発現させてもよいし、宿主生物において安定的に発現さ
せてもよい。コードされるタンパク質またはポリペプチドは、上記の活性のいず
れかを有することができる。コードされるタンパク質またはポリペプチドは宿主
生物が欠くタンパク質またはポリペプチドであってもよいし、あるいはコードさ
れるタンパク質は、宿主生物におけるタンパク質の現存のレベルを増大するもの
であってもよい。
【０４６８】 このタンパク質またはポリペプチドが分泌される一部の実施形態において、全
長タンパク質（すなわち、シグナルペプチドと成熟タンパク質）をコードする核
酸、あるいは成熟タンパク質（すなわち、シグナルペプチドの切断した際に生ず
るタンパク質）のみをコードする核酸を宿主生物に導入することができる。
【０４６９】 これらのタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸は、当業者に公知の
様々な技術を用いて、宿主生物に導入することができる。例えば、コードされる
タンパク質が宿主生物で発現され、これにより有益な効果を生じるように、伸長
ｃＤＮＡを裸のＤＮＡとして宿主生物に注入することができる。
【０４７０】 あるいは、前記タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を、宿主生物
において活性なプロモーターの下流において発現ベクター中にクローニングする
ことができる。発現ベクターは遺伝子治療での使用のために設計された発現ベク
ターのいずれであってもよく、このようなものとしては、ウイルスまたはレトロ
ウイルスベクターが挙げられる。コードされるタンパク質が宿主生物において発
現され、これにより有益な効果を生じるように、発現ベクターを宿主生物に直接
導入することができる。他の方法では、発現ベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞
に導入することができる。その後、発現ベクターを含有する細胞を選択して宿主
生物に導入すると、ここで、該細胞はコードされるタンパク質またはポリペプチ
ドを発現して有益な効果を生じる。
【０４７１】 実施例６０ （タンパク質を細胞に移入するためのシグナルペプチドの使用） 配列番号２４〜７２８および７６６〜７９２の配列によりコードされるシグナ
ルペプチドの短いコア疎水性領域（ｈ）を、目的のペプチドまたはタンパク質、
いわゆるカーゴを組織培養細胞へ移入するキャリアとして使用することもできる
（Linら、J. Biol. Chem. 270:14225-14258(1995)、Duら、J. Peptide Res., 51:23
5-243(1998)、Rojasら、Nature Biotech., 16: 370-375(1998））。
【０４７２】 制限されたサイズ（約２５個のアミノ酸まで）の細胞透過性ペプチドを細胞膜
を横切って移送しようとする場合、化学合成を使用して、目的のカーゴペプチド
のＣ末端またはＮ末端のいずれかにｈ領域を加えることができる。あるいは、さ
らに長いペプチドまたはタンパク質を細胞に移入しようとする場合、当業者によ
く知られている技術を用いて、核酸に遺伝子操作を施し、ｈ領域をコードする伸
長ｃＤＮＡ配列を、カーゴポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’または３
’末端に連結することができる。次いで、そのように遺伝子操作された核酸を、
適切な細胞にトランスフェクション後、得られる細胞透過性ポリペプチドを産生
するための従来の技術を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのい
ずれかで翻訳する。次いで、適切な宿主細胞を単純に細胞透過性ポリペプチドと
共にインキュベートし、次に、このポリペプチドは膜を横切って輸送される。
【０４７３】 本方法は、多様な細胞内機能および細胞プロセスを研究するために適用するこ
とができる。例えば、本方法は、細胞内タンパク質の機能関連ドメインを探査し
たり、シグナル伝達経路に関連のタンパク質−タンパク質相互作用を調べるのに
使用されている（Ｌｉｎら、前掲；Linら、J. Biol. Chem. 271:5305-5308(1996)
、Rojasら、J. Biol. Chem., 271:27456-27461(1996)、Liuら、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 93: 11819-11824(1996)、Rojasら、Bioch. Biophys. Res. Commun., 234
:675-680(1997)）。
【０４７４】 そのような技術は、治療効果を生じるタンパク質を移入するための細胞医療に
使用することができる。例えば、患者から単離された細胞を、移入される治療用
タンパク質で処理し、次いで、宿主生物に再導入することができる。
【０４７５】 あるいは、本発明のシグナルペプチドのｈ領域は、核局在化シグナルと組み合
わせて使用され得、核酸を細胞の核に送達することができる。そのようなオリゴ
ヌクレオチドは、標的細胞ＲＮＡのプロセシングおよび成熟化を阻害するために
、前述のように、三重らせんを形成するために設計されるアンチセンスオリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０４７６】 実施例６１ （コンピュータの実施形態） 本明細書において使用される「配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２
２の核酸コード」という用語は、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２
２のヌクレオチド配列、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２のフラ
グメント、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２に相同なまたは配列
番号２４〜８１１および１６００〜１６２２のフラグメントに相同なヌクレオチ
ド配列、およびこれらのすべての配列に対して相補的な配列を意味する。前記フ
ラグメントには、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の少なくとも
１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２
００、３００、４００、５００個の連続したヌクレオチドを含む配列番号２４〜
８１１および１６００〜１６２２の一部を包含する。好ましくは、前記フラグメ
ントは新規のフラグメントである。好ましくは、前記フラグメントは、表ＩＩに
記載されるポリヌクレオチド、表ＩＩＩに記載されるポリヌクレオチド、ＩＶに
記載されるポリヌクレオチド、あるいは表ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶに記載され
るポリヌクレオチドの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５４０、５
０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００個の連続し
た一部を含むそれらのフラグメントを包含する。配列番号２４〜８１１および１
６００〜１６２２の相同配列および相同フラグメントは、これらの配列に対して
少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％
、または７５％の相同性を有する配列を意味する。相同性は、例えばデフォルト
パラメータまたはそれ以外の任意のパラメータを用いるＢＬＡＳＴ２Ｎのような
、実施例１８に記載される任意のコンピュータプログラムおよびパラメータを用
いて決定されてもよい。また、相同配列には、配列番号２４〜８１１および１６
００〜１６２２の核酸コードのチミンをウリジンで置き換えたＲＮＡ配列も包含
される。これらの相同配列は、本明細書に記載される任意の手順を用いて得るこ
ともできるし、あるいは前述の配列決定のエラーを修正することによって生ずる
こともある。好ましくは、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の相
同配列および相同フラグメントは、表ＩＩに記載されるポリヌクレオチド、表Ｉ
ＩＩに記載されるポリヌクレオチド、表ＩＶに記載されるポリヌクレオチド、あ
るいは表ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶに記載されるポリヌクレオチドの少なくとも
１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２
００、３００、４００、または５００個の連続したヌクレオチドを含むそれらの
一部を包含する。配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コード
は、慣用の単一文字形式（Ｓｔｙｌｅｒ，Ｌｕｂｅｒｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，第３版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．の裏
表紙の内側を参照のこと）または配列のヌクレオチドの同定を記録できるあらゆ
る他の形式で表すことができることは理解できよう。
【０４７７】 本明細書において使用される「配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコー
ド」という用語は、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の５’ＥＳ
Ｔコードによりコードされる配列番号８１２〜１５９９のポリペプチド配列、配
列番号８１２〜１５９９のポリペプチドに相同なポリペプチド配列、またはこれ
らの配列の任意のフラグメントを意味する。相同ポリペプチド配列は、配列番号
８１２〜１５９９のポリペプチド配列の１つに対して少なくとも９９％、９８％
、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％の相同性を
有するポリペプチド配列を意味する。相同性は、例えばデフォルトパラメータま
たはそれ以外の任意のパラメータを用いるＦＡＳＴＡのような、本明細書に記載
される任意のコンピュータプログラムおよびパラメータを用いて決定されてもよ
い。これらの相同配列は、本明細書に記載される任意の手順を用いて得ることも
できるし、あるいは前述の配列決定のエラーを修正することによって生ずること
もある。ポリペプチドフラグメントは、配列番号８１２〜１５９９のポリペプチ
ドの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、
１００、または１５０個の連続したアミノ酸を含む。好ましくは、前記フラグメ
ントは新規のフラグメントである。好ましくは、これらのフラグメントは、表Ｉ
Ｉに記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、あるいは表
ＩＩに記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの少なくと
も５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００または
１５０個の連続したアミノ酸を含むそれらの一部を包含する。配列番号８１２〜
１５９９のポリペプチドコードは、慣用の単一文字形式または３文字形式（Star
rier,Lubert.Biochemistry，第３版，W.H.Freeman & Co.、New York．の裏表紙の
内側を参照のこと）または配列のポリペプチドの同定を記録できるあらゆる他の
形式で表すことができることは理解できよう。
【０４７８】 配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コードと配列番号８１
２〜１５９９のポリペプチドコードが、コンピュータが読み取りおよびアクセス
できる任意の媒体上に記憶および記録および前記媒体上で操作できることは当業
者らに理解されるであろう。本明細書において使用される「記録された」および
「記憶された」という用語は、コンピュータ媒体に情報を格納する処理を意味す
る。コンピュータ読取可能媒体に情報を記録し、配列番号２４〜８１１および１
６００〜１６２２の核酸コードの１つ以上と配列番号８１２〜１５９９のポリペ
プチドコードの１つ以上を含む産物を生じさせる現在公知の方法は、いずれも当
業者が容易に採用できるものである。本発明の別の態様とは、配列番号２４〜８
１１および１６００〜１６２２の少なくとも２，５，１０，１５，２０，２５，
３０または５０個の核酸コードを記憶して有するコンピュータ読取可能媒体であ
る。本発明の別の態様とは、配列番号８１２〜１５９９の少なくとも２，５，１
０，１５，２０，２５，３０または５０個のポリペプチドコードを記憶して有す
るコンピュータ読取可能媒体である。
【０４７９】 コンピュータ読取可能媒体には、磁気的に読み取り可能な媒体、光学的に読み
取り可能な媒体、電子的に読み取り可能な媒体、および磁気／光学媒体が包含さ
れる。例えば、このコンピュータ読取可能媒体は、ハードディスク、フロッピー
ディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＡＭ、またはＲＯＭ、および
当業者らに公知である他の種類の媒体でもよい。
【０４８０】 本発明の実施形態には、システム、特に本明細書に記載される配列情報を記憶
および操作するコンピュータシステムが包含される。コンピュータシステム１０
０の一例が図６にブロック線図の形式で示されている。本明細書において使用さ
れる「コンピュータシステム」という用語は、配列番号２４〜８１１および１６
００〜１６２２の核酸コードのヌクレオチド配列、または配列番号８１２〜１５
９９のポリペプチドコードのアミノ酸配列を分析するのに用いられるハードウェ
ア部分と、ソフトウェア部分と、データ記憶部分とを意味する。ある実施形態に
おいて、コンピュータシステム１００は、サンエンタープライズ１０００サーバ
ー（Sun Microsystems、 Palo Alto、 CA）である。コンピュータシステム１００
は、配列データにアクセスし、かつ前記データを処理および操作するためのプロ
セッサを包含することが好ましい。プロセッサ１０５として、例えばインテル社
（Intel Corporation）のペンティアムＩＩＩ（Pentium III）、あるいはサン（
Sun）、モトローラ（Motorola）、コンパック（Compaq）またはＩＢＭ製造の同
等なプロセッサのようなあらゆる公知のＣＰＵ（Central Processing Unit）が
使用できる。
【０４８１】 好ましくは、コンピュータシステム１００は、プロセッサ１０５と、データを
記憶するための１つ以上の内部データ記憶部品１１０と、この内部データ記憶部
品に記憶されたデータを検索するための１つ以上のデータ検索装置とを具備する
汎用システムである。現在入手できるコンピュータシステムのすべてが好適であ
ることは当業者には容易に理解できよう。
【０４８２】 ある特定の実施形態においては、コンピュータシステム１００は、（好ましく
はＲＡＭとして装備される）メインメモリ１１５と、データが記録されたハード
ドライブおよび／または他のコンピュータ読取可能媒体のような、１つ以上内部
データ記憶装置１１０とに接続されたバスに接続されたプロセッサ１０５を包含
する。一部の実施形態においては、コンピュータシステム１００は、内部データ
記憶装置１１０に記憶されたデータを読み出すための１つ以上のデータ検索装置
１１８をさらに包含する。
【０４８３】 データ検索装置１１８は、例えばフロッピーディスクドライブ、コンパクトデ
ィスクドライブ、磁気テープドライブなどでもよい。一部の実施形態においては
、内部データ記憶装置１１０は、制御論理および／または記録データを有するフ
ロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどのような取外し可能で
コンピュータ読取可能媒体である。コンピュータシステム１００は、前記データ
検索装置に一旦挿入されたデータ記憶部品から制御論理および／またはデータを
読み取るための適切なソフトウェアを包含していてもよいし、あるいはこのソフ
トウェアによってプログラムされてもよい点で有利である。
【０４８４】 コンピュータシステム１００は、コンピュータのユーザーに対してアウトプッ
トを表示するのに用いられるディスプレィ１２０を包含する。また、コンピュー
タシステム１００をネットワークまたはワイドエリアネットワークに存在する他
のコンピュータシステム１２５ａ〜１２５ｃと接続させてコンピュータシステム
１００との集中型アクセスを与えることができることにも注意されたい。
【０４８５】 配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コードのヌクレオチド
配列、または配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードのアミノ酸配列に
アクセスし、かつ処理するための（検索ツール、比較ツールおよびモデリングツ
ールのような）ソフトウェアは、実行中にメインメモリ１１５中に常駐していて
もよい。
【０４８６】 一部の実施形態において、コンピュータシステム１００は、コンピュータ読取
可能媒体に記憶された前述の配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の
核酸コードまたは配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードと、コンピュ
ータ読取可能媒体に記憶された基準ヌクレオチド配列または基準ポリペプチド配
列とを比較するための配列コンペアラをさらに含んでもよい。「配列コンペアラ
」とは、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と、前記データ記憶手段内に
記憶された他のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列および／または、これ
らに限定されるわけではないが、例えばペプチド、ペプチドミメティック、およ
び化学物質のような化合物とを比較するためにコンピュータシステム１００に装
備される１つ以上のプログラムのことを意味する。例えば、この配列コンペアラ
は、コンピュータ読取可能媒体に記憶された配列番号２４〜８１１および１６０
０〜１６２２の核酸コードのヌクレオチド配列または配列番号８１２〜１５９９
のポリペプチドコードのアミノ酸配列と、コンピュータ読取可能媒体に記憶され
た参照配列とを比較して、相同性、生物学的機能に必要なモチーフまたは構造モ
チーフを同定することができる。本特許明細書の他の部分に見られる様々な配列
比較プログラムは、本発明のこの態様における使用に関して特に考慮される。
【０４８７】 図７は、新規のヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列データベースの
配列と比較し、新規の配列とデータベース中の配列の間の相同性の程度を決定す
るためのプロセス２００の実施形態の１つを表す流れ図である。この配列データ
ベースはコンピュータシステム１００の内部に記憶される私用のデータベースで
もよいし、あるいはインターネットを通じて使用できるＧＥＮＢＡＮＫ、ＰＩＲ
またはＳＷＩＳＳＰＲＯＴのような公用のデータベースであってもよい。
【０４８８】 プロセス２００は、スタートステート２０１から始まり、そして比較される新
規の配列をコンピュータシステム１００のメモリに格納するステート２０２に進
む。前述のように、前記メモリとして、ＲＡＭまたは内部記憶装置のようなあら
ゆる種類のメモリを使用することができる。
【０４８９】 次に、プロセス２００は、配列のデータベースを分析および比較のために開く
ステート２０４へと進む。次に、プロセス２００は、データベースに記憶されて
いる１番目の配列をコンピュータのメモリに読み込むステート２０６に進む。そ
して、ステート２１０において、この第１の配列が第２の配列と同じかどうかを
決定する比較を行う。このステップが、新規な配列とデータベースの１番目の配
列との間の完全な比較を行うことに限定されるわけではないことを述べることは
重要である。２つのヌクレオチド配列またはタンパク質配列が同一でない場合に
も比較を行うための公知の方法は、当業者らにとって周知である。例えば、試験
対象の２つの配列の一方にギャップを導入し、これらの２つの配列の間の相同性
の程度を向上させることができる。比較中に配列にギャップまたは他の特徴を導
入するかどうかを制御するパラメータは、通常コンピュータシステムのユーザー
によって入力される。
【０４９０】 一旦ステート２１０において上記２つの配列の比較がなされると、これらの２
つの配列が同じであるかどうかを決定ステート２１０において決定する。もちろ
ん、「同じ」という用語は、完全に同一である配列に限定されるわけではない。
ユーザーによって入力された相同性パラメータの範囲にある配列もプロセス２０
０において「同じ」と見なされる。
【０４９１】 これらの２つの配列が同じであると判断された場合、プロセス２００は、この
データベースから読み出された配列の名称をユーザーに対して表示するステート
２１４へと進む。このステートは、その名称が表示された配列が、入力された相
同性の制約条件を満たすことをユーザーに知らせる。この記憶されている配列の
名称が一旦ユーザーに対して表示されると、プロセス２００は、データベースに
まだ配列があるかどうかを決定する決定ステート２１８に進む。データベースに
もう配列がない場合、プロセス２００は、エンドステート２２０で終了する。し
かし、データベースにまだ配列が残っている場合、プロセス２００は、ポインタ
をデータベースの次の配列に移動して新規の配列と比較できるようにするステー
ト２２４に進む。このようにして、新規な配列は、データベースのすべての配列
とアラインメントされて比較される。
【０４９２】 決定ステート２１２において２つの配列の間に相同性がないと決定された場合
に、プロセス２００は、直接決定ステート２１８に進み、データベースに比較す
る配列がまだ他にあるかどうかを決定することに注意すべきである。
【０４９３】 従って、本発明の一態様は、プロセッサと、配列番号２４〜８１１および１６
００〜１６２２の核酸コードまたは配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコ
ードを記憶して有するデータ記憶装置と、配列番号２４〜８１１および１６００
〜１６２２の核酸コードまたは配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコード
と比較されるための基準ヌクレオチド配列または基準ポリペプチド配列が検索可
能に記憶されたデータ記憶装置と、その比較を行う配列コンペアラとを具備する
コンピュータシステムである。この配列コンペアラは、比較される２つの配列の
間の相同性の程度を示してもよいし、上記配列番号２４〜８１１および１６００
〜１６２２の核酸コードおよび配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコード
の構造モチーフを同定してもよいし、あるいはこれらの核酸コードとポリペプチ
ドコードと比較される配列の構造モチーフを同定してもよい。一部の実施形態に
おいて、上記データ記憶装置には、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６
２２の核酸コードまたは配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードの少な
くとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０または５０個の配列が記憶されて
いてもよい。
【０４９４】 本発明の別の態様は、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸
コードと基準ヌクレオチド配列の間の相同性の程度を決定するための方法であり
、この方法は、相同性の程度を決定するコンピュータプログラムを用いて前記核
酸コードと前記基準ヌクレオチド配列とを読み取るステップと、前記コンピュー
タプログラムを用いて前記核酸コードと前記基準ヌクレオチド配列の間の相同性
を決定するステップとから成る。このコンピュータプログラムは、例えばデフォ
ルトパラメータまたはそれ以外の任意のパラメータを用いるＢＬＡＳＴ２Ｎを初
めとする、本明細書に具体的に列挙されているもののような、相同性の程度を決
定するための多数のコンピュータプログラムのいずれでもよい。この方法は、前
述のコンピュータシステムを用いて実施されてもよい。また、この方法は、上記
コンピュータプログラムを用いて上記配列番号２４〜８１１および１６００〜１
６２２の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０または５０個の核酸
コードを読み取り、前記核酸コードと基準ヌクレオチド配列の間の相同性を決定
することによって実施することもできる。
【０４９５】 図８は、２つの配列が相同であるかどうかを決定するためのコンピュータのプ
ロセス２５０の実施形態の１つを表す流れ図である。プロセス２５０は、スター
トステート２５２から始まり、そして比較される第１の配列をメモリに格納する
ステート２５４に進む。次に、比較される第２の配列をステート２５６において
メモリに格納する。次に、プロセス２５０は、第１の配列の最初の文字を読み取
るステート２６０に進み、その後に第２の配列の最初の文字を読み取るステート
２６２に進む。この配列がヌクレオチド配列である場合、この最初の文字は、通
常Ａ，Ｔ，Ｃ，ＧまたはＵのいずれかであることは理解されるべきである。この
配列がタンパク質配列である場合、この最初の文字は、第１の配列と第２の配列
を容易に比較できるようにするために単一文字アミノ酸コードであるべきである
。
【０４９６】 そして、決定ステート２６４において、これらの２つの文字が同じであるかど
うかを決定する。もし同じであれば、プロセス２５０はステート２６８に進み、
上記第１の配列と第２の配列の次の文字を読み取る。そしてこれらの次の文字が
同じであるかどうかを決定する。もし同じであれば、プロセス２５０は、２つの
文字が異なるまでこのループを続ける。もし読み取られた２つの文字が同じでは
ないと判断された場合、プロセス２５０は決定ステート２７４に進み、どちらか
の配列にまだ読み取る文字があるかどうかを決定する。
【０４９７】 もし読み取る文字がなければ、プロセス２５０はステート２７６に進み、第１
の配列と第２の配列の間の相同性の程度をユーザーに対して表示する。相同性の
程度は、第１の配列の文字の総数のうちの、前記２つの配列の間でおなじであっ
た文字の割合を計算することによって決定される。従って、もし第１の１００ヌ
クレオチドの配列のすべての文字と第２の配列のすべての文字とが揃っているの
であれば、相同性の程度は１００％ということになる。
【０４９８】 あるいは、上記コンピュータプログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチ
ド配列と基準ヌクレオチド配列とを比較し、配列番号２４〜８１１および１６０
０〜１６２２の核酸コードが１つ以上の位置で基準核酸配列と異なっているかど
うかを決定するコンピュータプログラムでもよい。任意に、そのようなプログラ
ムは、基準ポリヌクレオチドか配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２
の核酸コードのどちらかの配列に対して挿入、欠失または置換されたヌクレオチ
ドの長さおよび同一性を記録してもよい。ある実施形態において、このコンピュ
ータプログラムは、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コー
ドのヌクレオチド配列が、基準ヌクレオチド配列に対してバイアレイック（ｂｉ
ａｌｌｅｉｃ）マーカーまたは一塩基多型（ＳＮＰ）を含有しているかどうかを
決定するプログラムでもよい。この一塩基多型は、１個の塩基が置換、挿入また
は欠失されているのに対し、このバイアレイックマーカーは、約１〜１０個の連
続した塩基が置換、挿入または欠失されていてもよい。
【０４９９】 本発明の別の態様は、配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードと基準
ポリペプチド配列の間の相同性の程度を決定するための方法であり、この方法は
、相同性の程度を決定するコンピュータプログラムを用いて前記配列番号８１２
〜１５９９のポリペプチドコードと前記基準ポリペプチド配列とを読み取るステ
ップと、前記コンピュータプログラムを用いて前記ポリペプチドコードと前記基
準ポリペプチド配列の間の相同性を決定するステップとからなる。
【０５００】 従って、本発明の別の態様は、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２
２の核酸コードが、１つ以上のヌクレオチドにおいて基準ヌクレオチド配列と異
なっているかどうかを決定するための方法であり、この方法は、２つの核酸配列
の差異を同定するコンピュータプログラムを用いて前記核酸コードと前記基準ヌ
クレオチド配列とを読み取るステップと、前記コンピュータプログラムを用いて
前記核酸コードと前記基準ヌクレオチド配列の間の差異を同定するステップとか
らなる。一部の実施形態において、前記コンピュータプログラムは、一塩基多型
を同定するプログラムである。上記方法は、前述のコンピュータシステムおよび
図８に示される方法によって実施されてもよい。また、この方法は、上記コンピ
ュータプログラムを用いて配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の少
なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０または５０個の核酸コードと基
準ヌクレオチド配列を読み取り、前記コンピュータプログラムを用いて前記核酸
コードと前記基準ヌクレオチド配列の間の差異を同定することによって実施する
こともできる。
【０５０１】 他の実施形態において、上記コンピュータをベースとしたシステムは、配列番
号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コードのヌクレオチド配列また
は配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードのアミノ酸配列の内部の特徴
を同定するためのアイデンティファイアをさらに含んでいてもよい。
【０５０２】 「アイデンティファイア」とは、前述の配列番号２４〜８１１および１６００
〜１６２２の核酸コードのヌクレオチド配列または配列番号８１２〜１５９９の
ポリペプチドコードのアミノ酸配列の内部の特定の特徴を同定する１つ以上のプ
ログラムを意味する。ある実施形態において、このアイデンティファイアは、配
列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２のｃＤＮＡコード内のオープンリ
ーディングフレームを同定するプログラムからなっていてもよい。
【０５０３】 図９は、配列内の特徴の存在を検出するためのアイデンティファイアプロセス
３００の実施形態の１つを表す流れ図である。プロセス３００はスタートステー
ト３０２から始まり、そしてステート３０４へと進み、特徴が調べられる第１の
配列をコンピュータシステム１００のメモリ１１５に格納する。次に、プロセス
３００は、ステート３０６に進み、配列特徴のデータベースを開く。そのような
データベースには、各特徴の名称と一緒に、その特徴の属性の一覧が包含されて
いる。例えば、特徴名称は「開始コドン」であり、その属性は「ＡＴＧ」である
。別の例では、特徴名称は「ＴＡＡＴＡＡボックス」であり、その特徴属性は「
ＴＡＡＴＡＡ」である。そのようなデータベースの一例がウィスコンシン大学（
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のジェネティクスコンピュ
ータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（ｗｗｗ．
ｇｃｇ．ｃｏｍ）によって構築されている。
【０５０４】 一旦特徴データベースがステート３０６において開かれると、プロセス３００
はステート３０８へと進み、このデータベースから第１の特徴を読み出す。そし
て、ステート３１０において、この第１の特徴の属性と上記第１の配列との比較
を行う。そして、決定ステート３１６において、前記特徴の属性が前記第１の配
列中に見つかったかどうかを決定する。もし見つかった場合、プロセス３００は
ステート３１８へと進み、この見つかった特徴の名称をユーザーに対して表示す
る。
【０５０５】 次に、プロセス３００は決定ステート３２０へと進み、データベースにまだ特
徴が残っているかどうかを決定する。もし特徴が残っていなければ、プロセス３
００は、エンドステート３２４で終了する。しかし、もしデータベースにまだ特
徴が残っているのであれば、プロセス３００はステート３２６において次の配列
特徴を読み取り、ステート３１０に戻って、この読み取った次の特徴の属性を上
記第１の配列と比較する。
【０５０６】 もし特徴属性が決定ステート３１６において第１の配列中に見つからない場合
には、プロセス３００は、直接決定ステート３２０に進み、データベースにまだ
特徴が残っているかどうかを決定する。
【０５０７】 別の実施形態において、上記アイデンティファイアは、配列番号８１２〜１５
９９のポリペプチドコードの三次元構造を決定する分子モデリングプログラムか
らなっていてもよい。一部の実施形態において、この分子モデリングプログラム
は、公知の三次元タンパク質構造中の残基の構造環境を表す特性と最も適合性の
ある標的配列を同定する。（例えば、Eisenberg et al.、１９９５年７月２５日
発行の米国特許第５，４３６，８５０号を参照のこと）。別の方法においては、
所定のファミリーのタンパク質の公知の三次元構造を重ね合わせて、そのファミ
リーにおける構造的に保存された領域を規定する。また、このタンパク質モデリ
ング法は、相同タンパク質の公知の三次元構造を用いて、配列番号８１２〜１５
９９のポリペプチドコードの構造を見積もる。（例えば、Srinivasan et al.、
１９９６年９月１７日発行の米国特許第５，５５７，５３５号を参照のこと）。
慣用の相同性モデリング法は、プロテアーゼおよび抗体のモデルを構築するのに
慣例的に用いられてきた。（Sowdhaminiら、Protein Engineering 10:207, 215(1
997））。目的のタンパク質が、テンプレートタンパク質に対して低い配列同一
性を有する場合に、比較方法を用いて三次元のタンパク質モデルを作ることもで
きる。場合によっては、タンパク質は、非常に弱い配列同一性を有しているにも
かかわらず、同様の三次元構造に折り畳まれる。例えば、多くのらせん状サイト
カインの三次元構造は、低い配列相同性にもかかわらず、同様の三次元位相に折
り畳まれる。
【０５０８】 昨今のスレッディング法の開発によって、現在では、標的とテンプレートの間
の構造的な関連性が配列レベルでは検出不可能である多くの状況において起こり
得る折畳みパターンの同定ができるようになった。折畳み認識を多配列スレッデ
ィング（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ，ＭＳＴ）
を用いて行うハイブリッド法では、構造的同等物は、低解像モデルを構築するた
めの距離幾何学プログラム（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ｐｒｏｇｒ
ａｍ）ＤＲＡＧＯＮを用いてスレッディング出力から推測され、そして全原子表
示（ｆｕｌｌ−ａｔｏｍ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）は、ＱＵＡＮＴＡの
ような分子モデリングパッケージを用いて構築される。
【０５０９】 この３段法によれば、まず初めに、候補テンプレートを、複数の位置合わせを
された配列を１つ以上の三次元構造に同時にスレッディングできる新規な折畳み
認識アルゴリズムＭＳＴを用いて同定する。第２段階においては、ＭＳＴ出力か
ら得られた構造的同等物を残基間距離拘束に変換し、２次構造予測から得られた
補助情報と一緒に距離幾何学プログラムであるＤＲＡＧＯＮに供給される。前記
プログラムは偏らないように前記拘束を組み合わせて、かなりの数の低解像モデ
ル確認を急速に作り出す。第３段階においては、これらの低解像モデル確認を全
原子モデルに変換し、分子モデリングパッケージであるＱＵＡＮＴＡを用いてエ
ネルギーの最小化に付す。（例えば、Aszodiら、Proteins:Structure, Function,
and Genetics, Supplement 1:38-42(1997）を参照のこと）。
【０５１０】 上記分子モデリング分析の結果は、そのまま配列番号８１２〜１５９９のポリ
ペプチドコードの活性を調整する薬剤を同定するための合理的薬物設計法に用い
られてもよい。
【０５１１】 従って、本発明の別の態様は、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２
２の核酸コードまたは配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコード内の特徴
を同定する方法であり、この方法は、前記コード内の特徴を同定するコンピュー
タプログラムを用いて前記核酸コードまたは前記ポリペプチドコードを読み取る
ステップと、前記コンピュータプログラムを用いて前記核酸コードまたは前記ポ
リペプチドコード内の特徴を同定するステップとからなる。ある実施形態におい
て、コンピュータプログラムは、オープンリーディングフレームを同定するコン
ピュータプログラムからなる。さらに別の実施形態において、前記コンピュータ
プログラムは、ポリペプチド配列の構造モチーフを同定する。別の実施形態にお
いて、前記コンピュータプログラムは、分子モデリングプログラムからなる。上
記方法は、前記コンピュータプログラムを用いて、配列番号２４〜８１１および
１６００〜１６２２の核酸コードまたは配列番号８１２〜１５９９のポリペプチ
ドコードの単一の配列あるいは少なくとも２，５，１０，１５，２０，２５，３
０または５０個を読み取り、そして前記コンピュータプログラムを用いて、前記
核酸コードまたはポリペプチドコード内の特徴を同定することによって実施する
ことができる。
【０５１２】 配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コードまたは配列番号
８１２〜１５９９のポリペプチドコードは多様なフォーマットで多様なデータプ
ロセッサプログラムで記憶および操作することができる。例えば、配列番号２４
〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コードまたは配列番号８１２〜１５９
９のポリペプチドコードは、マイクロソフト（Microsoft）ワード（WORD）もし
くはワードパーフェクト（WORDPERFECT）などのワード処理ファイル中にテキス
トとして、またはＤＢ２、ＳＹＢＡＳＥもしくはＯＲＡＣＬＥなどの当業者に周
知の種々のデータベースプログラム中にＡＳＣＩＩファイルとして記憶すること
ができる。さらに、様々なコンピュータプログラムおよびデータベースを、配列
コンペアラ、アイデンティファイア、あるいは配列番号２４〜８１１および１６
００〜１６２２の核酸コードまたは配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコ
ードと比較される基準ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のソースとして
用いることができる。下記の一覧は、本発明を限定するものではなく、配列番号
２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コードまたは配列番号８１２〜１
５９９のポリペプチドコードに対して有用なプログラムおよびデータベースを案
内するものである。使用できるプログラムおよびデータベースとしては、これら
に限定されるわけではないが、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、Ｄｉｓｃｏ
ｖｅｒｙＢａｓｅ（モレキュラーアプリケーションズグループ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｒｏｕｐ））、ＧｅｎｅＭｉｎｅ（モレキ
ュラーアプリケーションズグループ）、Ｌｏｏｋ（モレキュラーアプリケーショ
ンズグループ）、ＭａｃＬｏｏｋ（モレキュラーアプリケーションズグループ）
、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２（ＮＣＢＩ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴ
Ｘ（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４
０３（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（ペアソン（Ｐｅａｓｏｎ）およびリップマン
（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２
４４４，１９８８）、ＦＡＳＴＤＢ（ブルトラグら（Ｂｒｕｔｌａｇ ｅｔ ａ
ｌ．） Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５，１９９０）、
Ｃａｔａｌｙｓｔ（モレキュラーシミュレーションズ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．））、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ（モレ
キュラーシミュレーションズ社）、Ｃｅｒｉｕｓ2．ＤＢＡｃｃｅｓｓ（モレキ
ュラーシミュレーションズ社）、Ｈｙｐｏｇｅｎ（モレキュラーシミュレーショ
ンズ社）、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（モレキュラーシミュレーションズ社）、Ｄｉ
ｓｃｏｖｅｒ（モレキュラーシミュレーションズ社）、ＣＨＡＲＭｍ（モレキュ
ラーシミュレーションズ社）、Ｆｅｌｉｘ（モレキュラーシミュレーションズ社
）、ＤｅｌＰｈｉ（モレキュラーシミュレーションズ社）、ＱｕａｎｔｅＭＭ（
モレキュラーシミュレーションズ社）、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（モレキュラーシミュ
レーションズ社）、Ｍｏｄｅｌｅｒ（モレキュラーシミュレーションズ社）、Ｉ
ＳＩＳ（モレキュラーシミュレーションズ社）、Ｑｕａｎｔａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｄｅｓｉｇｎ（モレキュラーシミュレーションズ社）、ＷｅｂＬａｂ（モレキ
ュラーシミュレーションズ社）、ＷｅｂＬａｂ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｘｐｌ
ｏｒｅｒ（モレキュラーシミュレーションズ社）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ
（モレキュラーシミュレーションズ社）、ＳｅｑＦｏｌｄ（モレキュラーシミュ
レーションズ社）、ＥＭＢＬ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｅｉｎデータベース、ＭＤＬ
Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙデータベース
、ＭＤＬ Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｒｅｐｏｒｔデータベース、Ｃｏｍｐｒｅｈｅ
ｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙデータベース、Ｄｅｒｗ
ｅｎｔｓ’ｓ Ｗｏｒｌｄ Ｄｒｕｇ Ｉｎｄｅｘデータベース、ＢｉｏＢｙｔ
ｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅデータベース、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース、およびＧ
ｅｎｓｅｑｎデータベースが挙げられる。他の様々なプログラムおよびデータベ
ースは、本開示内容を与えられた当業者にとって明らかである。
【０５１３】 上記のプログラムを使用して検出することができるモチーフは、ロイシンジッ
パー、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチ
ン化部位、αヘリックスおよびβシート、コードされたタンパク質の分泌を指令
するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックスなどの転写調
節に関与する配列、酸性領域、酵素活性部位、基質結合部位並びに酵素的切断部
位をコードする配列を含む。
【０５１４】 実施例６２ （核酸の製造方法） 本発明は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸
の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントを製
造する方法をさらに含む。これらの方法は、複数のヌクレオチドを連続して連結
していくことによって、先の配列を含む核酸を製造する。核酸を合成する様々な
方法が、当業者らにとって周知である。
【０５１５】 これらの方法の多くは、合成を固体支持体上で行う。これらには、所望のオリ
ゴヌクレオチドの３’末端塩基が不溶性の担体上に固定される３’ホスホルアミ
ダイト法が包含される。付加されるヌクレオチド塩基は、５’ヒドロキシルにお
いてブロックされ、３’ヒドロキシルにおいて活性化されることによって、固定
ヌクレオチド塩基との結合が生じる。新規の固定ヌクレオチド化合物を脱ブロッ
ク化し、かつこのサイクルを反復することによって、所望のポリヌクレオチドが
得られる。あるいは、ポリヌクレオチドを、米国特許第５，０４９，６５６号に
記載されているように調製することもできる。一部の実施形態において、上記の
ように調製されたいくつかのポリヌクレオチドが連結されることによって、所望
の配列を有する長いポリオヌクレオチドとなる。
【０５１６】 実施例６３ （ポリペプチドの製造方法） 本発明は、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連核酸
の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメントによ
りコードされるポリヌクレオチドを製造する方法、およびＥＳＴ関連ポリペプチ
ド、ＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメント、ＥＳＴ関連ポリペプチドの位置セ
グメント、またはＥＳＴ関連ポリペプチドのフラグメントを製造する方法をさら
に含む。これらの方法は、複数のアミノ酸を連続して連結していくことによって
、先の配列を含む核酸ポリペプチドを製造する。一部の実施形態において、これ
らの方法によって製造されるポリペプチドの長さは、１５０個のアミノ酸以下で
ある。別の実施形態において、これらの方法によって製造されるポリペプチドの
長さは、１２０個のアミノ酸以下である。
【０５１７】 ポリペプチドを製造する様々な方法が、当業者らにとって周知であり、その例
として、カルボキシル末端アミノ酸がポリビニルベンゼンまたは他の適当な樹脂
に結合される方法を挙げることができる。付加されるアミノ酸は、そのアミノ部
分およびあらゆる側鎖反応基に対してブロック基を有しているので、そのカルボ
キシル部分のみが反応することができる。カルボキシル基は、カルボジイミドま
たは他の活性化剤によって活性化され、固定されたアミノ酸に結合させられる。
ブロック基を除いた後に、このサイクルを反復することによって、所望の配列を
有するポリペプチドが得られる。あるいは、米国特許第５，０４９，６５６号に
記載されている方法を用いることもできる。
【０５１８】 上記のように、ＥＳＴ関連核酸、ＥＳＴ関連核酸のフラグメント、ＥＳＴ関連
核酸の位置セグメント、またはＥＳＴ関連核酸の位置セグメントのフラグメント
は、さまざまな目的のために使用することができる。上述のポリヌクレオチドを
使用して、分析、特性化または治療用途のための組換えタンパク質を；対応する
タンパク質を（構成的かまたは組織分化または発生の特定の段階かまたは疾患状
態のいずれかにおいて）好適に発現させる組織のためのマーカーとしての、分泌
ポリペプチド、キメラポリペプチドまたは抗体の製造；サザンゲル上の分子量マ
ーカーとして；染色体を同定するかまたは関連遺伝子の位置をマッピングするた
めの染色体マーカーまたはタグ（標識される場合）として；患者の内在性ＤＮＡ
を比較して、潜在的遺伝子障害を同定するために；ハイブリダイズし、それによ
り新規の関連ＤＮＡ配列を発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープ
リントのためのＰＣＲプライマーを得るための情報の供給源として；「遺伝子チ
ップ」または他の支持体に付着するためのオリゴマーを選択し、作製するために
（発現パターンを調べることを含む）；ＤＮＡ免疫化技術を用いて、抗タンパク
質抗体を惹起するために；および抗ＤＮＡ抗体を惹起するかまたは別の免疫応答
を引き出すための抗原として、発現させることができる。ポリヌクレオチドが（
例えば、レセプターリガンド相互作用などにおいて）別のタンパク質またはポリ
ペプチドに結合するかまたは潜在的に結合するタンパク質またはポリペプチドを
コードする場合には、該ポリヌクレオチドを、結合が生じる他のタンパク質また
はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するかまたは結合相互作用
の阻害剤を同定するために、相互作用トラップアッセイ（例えば、Ｇｙｕｒｉｓ
ら、Ｃｅｌｌ７５：７９１−８０３（１９９３）などに記載のアッセイである）
にも使用することができる。
【０５１９】 本発明により提供されるタンパク質またはポリペプチドは、ハイスループット
スクリーニングのための複数のタンパク質のパネルを含む生物学的活性を決定す
るためのアッセイにおいて；抗体を惹起するかまたは別の免疫応答を引き出すた
めに；生物学的液体におけるタンパク質（またはそのレセプター）のレベルを定
量的に決定するために設計されたアッセイにおける試薬（標識された試薬を含む
）として；対応するタンパク質を（構成的かまたは組織分化または発生の特定の
段階かまたは疾患状態のいずれかにおいて）好適に発現させる組織用のマーカー
として；そして、もちろん、相関関係にあるレセプターまたはリガンドを単離す
るために、同様に使用することができる。タンパク質またはポリペプチドが（例
えば、レセプターリガンド相互作用などにおいて）もう１つのタンパク質または
ポリペプチドに結合するかまたは潜在的に結合する場合、該タンパク質を、結合
が生じる他のタンパク質を同定するかまたは結合相互作用の阻害剤を同定するた
めに使用することができる。これらの結合相互作用に関与するタンパク質または
ポリペプチドは、ペプチドまたは小分子阻害剤または結合相互作用のアゴニスト
をスクリーニングするためにも使用することができる。
【０５２０】 これらの研究有用性のいくつかまたは全ては、研究用製品として商品化するた
めに試薬レベルまたはキット形態にまで開発することが可能である。
【０５２１】 上記に列挙された用途を達成するための方法は当業者に周知である。そのよう
な方法を開示している参考文献としては、Molecular Cloning;A Laboratory Man
ual、2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook,J.,E.F.Fritschおよ
びT.Maniatis編、1989、ならびにMethods in Enzymology;Guide to Molecular Clo
ning Techniques, Academic Press, Berger,S.L.およびA.R.Kimmel編、1987が挙
げられるが、これらに限定されない。
【０５２２】 本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質またはポリペプチドを栄養供給源
または補助食品として使用することもできる。そのような使用としては、タンパ
ク質またはアミノ酸補助物としての使用、炭素源としての使用、窒素源としての
使用および炭水化物源としての使用が挙げられるが、これらに限定されない。そ
のような場合、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドを特定の生物の食物
に添加することができ、または個別の固体または液体調製物として、散剤、丸剤
、溶液、懸濁液またはカプセルの剤形などで投与することができる。微生物の場
合、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドを、微生物が培養される培地に
添加することができる。
【０５２３】 本発明を特定の好適な実施形態の形態で説明してきたが、本明細書の開示内容
から当業者に明らかである他の実施形態も本発明の範囲内にある。従って、本発
明の範囲は、添付の請求の範囲を参考にすることによってのみ規定されることを
意図している。
【０５２４】 （配列表のフリーテキスト） 添付の配列表に以下のフリーテキストを加える。 von Heijneマトリックス スコア 名称 Matinspector予想
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｃＤＮＡが誘導されるｍＲＮＡの５’末端由来を含むように選択
されているｃＤＮＡを得る方法の要約を示す。第１のステップ（１）では、完全
なｍＲＮＡのキャップを酸化して、化学的にオリゴヌクレオチドタグに連結する
。第２のステップ（２）では、ランダムプライマーを使用して逆転写を行い、第
１のｃＤＮＡ鎖を生成する。第３のステップ（３）では、ｍＲＮＡを消去して、
オリゴヌクレオチドタグに含まれるプライマーを使用して、第２鎖合成を行う。
【図２】 本明細書に記載するシグナルペプチド同定法を用いて偽陽性およ
び偽陰性の頻度を調べるための、全てのヒトスイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏ
ｔ）タンパク質の４３アミノ末端アミノ酸の分析を示す。
【図３】 ５’ＥＳＴに隣接する配列を有する伸長ｃＤＮＡをクローニング
かつ配列決定するために使用される一般的な方法を示す。
【図４】 単離したプロモーターの模式図およびそれらに対応する５’タグ
と共に組み立てる方法を示す。
【図５】 図４の各プロモーターに存在する転写因子結合部位を示す。
【図６】 例示的コンピュータシステムの構成図を示す。
【図７】 新規のヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列データベー
スと比較し、新規の配列とデータベース中の配列の間の相同性の程度を決定する
ためのプロセス２００の実施形態の１つを表す流れ図を示す。
【図８】 ２つの配列が互いに相同であるかどうかを決定するためのコンピ
ュータのプロセス２５０の実施形態の１つを表す流れ図を示す。
【図９】 配列の特徴の存在を検出するための同定物プロセス３００の実施
形態の１つを表す流れ図を示す。
【図１０】 伸長ｃＤＮＡ分析の各ステップに用いることができる全パラメ
ータを記載した表を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０６Ｆ 17/50 ６３８ Ｇ０１Ｎ 33/53 17/30 １７０Ｆ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０６Ｆ 17/50 ６３８ 5/00 Ａ // Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ (72)発明者 ジョルダン，ジャン−イヴ フランス国 エフ−75018 パリ，ル ド ュエスム，12

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の
    配列ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の配列に
    相補的な配列から成る群より選択される配列を含む、精製された核酸。
  2. 【請求項２】 配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の
    配列ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の配列に
    相補的な配列から成る群より選択される配列の少なくとも１５個連続したヌクレ
    オチドを含む、精製された核酸。
  3. 【請求項３】 配列番号８１２〜１５９９の配列から成る群より選択される
    配列を含む、精製されたまたは単離されたポリペプチド。
  4. 【請求項４】 ｃＤＮＡを製造する方法であって、 ａ） ヒト細胞由来のｍＲＮＡ分子の集合体と、配列番号２４〜８１１および配
    列番号１６００〜１６２２に相補的な配列から成る群より選択される配列の少な
    くとも１５個連続したヌクレオチドを含むプライマーとを接触させ、 ｂ） 前記プライマーを、前記タンパク質をコードする前記集合体中のｍＲＮＡ
    にハイブリダイズさせ、 ｃ） 前記ハイブリダイズしたプライマーを逆転写して前記ｍＲＮＡから第１の
    ｃＤＮＡ鎖を作製し、 ｄ） 第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を作製し、そして ｅ） 得られた第１のｃＤＮＡ鎖と前記第２のｃＤＮＡ鎖を含むｃＤＮＡを単離
    する、 各ステップを含んで成る上記方法。
  5. 【請求項５】 ｃＤＮＡを製造する方法であって、 ａ） 配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２から成る群より
    選択される配列を含むｃＤＮＡを取得し、 ｂ） 前記ｃＤＮＡと、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２
    ２の配列ならびに配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２に相
    補的な配列から成る群より選択される配列の少なくとも１５個連続したヌクレオ
    チドを含む検出可能なプローブとを、前記プローブが前記ｃＤＮＡにハイブリダ
    イズすることを可能にする条件下で接触させ、 ｃ） 前記検出可能なプローブにハイブリダイズするｃＤＮＡを同定し、そして ｄ） 前記プローブにハイブリダイズする前記ｃＤＮＡを単離する、 各ステップを含んで成る上記方法。
  6. 【請求項６】 ｃＤＮＡを製造する方法であって、 ａ） ヒト細胞由来のｍＲＮＡ分子の集合体と前記ｍＲＮＡのポリＡテイルにハ
    イブリダイズ可能な第１のプライマーとを接触させ、 ｂ） 前記第１のプライマーを前記ポリＡテイルにハイブリダイズさせ、 ｃ） 前記ｍＲＮＡを逆転写して第１のｃＤＮＡ鎖を作製し、 ｄ） 配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２から成る群より
    選択される配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含む少なくとも１つ
    のプライマーを用いて、前記第１のｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のｃＤＮＡ鎖を作
    製し、そして ｅ） 得られた第１のｃＤＮＡ鎖と前記第２のｃＤＮＡ鎖を含むｃＤＮＡを単離
    する、 各ステップを含んで成る上記方法。
  7. 【請求項７】 ポリペプチドを製造する方法であって、 ａ） 配列番号２４〜８１１から成る群より選択される配列を含む核酸によって
    コードされるポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、または配列番号２４〜８１１
    から成る群より選択される配列によってコードされるポリペプチドの少なくとも
    １０個連続したアミノ酸を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡを取得し、 ｂ） 前記ｃＤＮＡがプロモーターに作動可能に連結されるように、前記ｃＤＮ
    Ａを発現ベクターに挿入し、 ｃ） 前記発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、前記宿主細胞にお
    いて前記ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を産生させ、そして ｄ） 前記タンパク質を単離する、 各ステップを含んで成る上記方法。
  8. 【請求項８】 個別のＥＳＴまたは長さが少なくとも１５ヌクレオチドのそ
    のフラグメントのアレイであって、その改良点が、配列番号２４〜８１１および
    配列番号１６００〜１６２２の配列、配列番号２４〜８１１および配列番号１６
    ００〜１６２２の配列に相補的な配列ならびに前記配列の少なくとも１５個連続
    したヌクレオチドを含むフラグメントから成る群より選択される少なくとも１つ
    の配列を前記アレイに含めることから成る、上記アレイ。
  9. 【請求項９】 配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の
    配列、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２の配列に相補的
    な配列ならびに前記配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含むフラグ
    メントから成る群より選択される少なくとも５つの配列を含む、請求項８に記載
    のアレイ。
  10. 【請求項１０】 富化された組換え核酸の集団であって、前記組換え核酸は
    インサート核酸およびバックボーン核酸を含み、ここで、前記集団中の少なくと
    も５％の前記インサート核酸は、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００
    〜１６２２の配列、配列番号２４〜８１１および配列番号１６００〜１６２２に
    相補的な配列ならびに前記配列の少なくとも１５個連続したヌクレオチドを含む
    フラグメントから成る群より選択される配列から成る、上記集団。
  11. 【請求項１１】 配列番号８１２〜１５９９のうちいずれかの少なくとも８
    個のアミノ酸の連続スパンを含むポリペプチドのエピトープ含有フラグメントに
    選択的に結合し得る抗体組成物であって、前記抗体はポリクローナルかまたはモ
    ノクローナルである、上記組成物。
  12. 【請求項１２】 配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コ
    ードならびに配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードから成る群より選
    択される配列を記憶して有するコンピュータ読取可能媒体。
  13. 【請求項１３】 プロセッサおよびデータ記憶装置を含むコンピュータシス
    テムであって、データ記憶装置は、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６
    ２２の核酸コードならびに配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードから
    成る群より選択される配列を記憶して有する、上記システム。
  14. 【請求項１４】 配列コンペアラおよび参照配列を記憶して有するデータ記
    憶装置をさらに含む、請求項１３に記載のコンピュータシステム。
  15. 【請求項１５】 前記配列コンペアラは、多型性を表示するコンピュータプ
    ログラムを含む、請求項１４に記載のコンピュータシステム。
  16. 【請求項１６】 前記配列の特徴を同定するアイデンティファイアをさらに
    含む、請求項１３に記載のコンピュータシステム。
  17. 【請求項１７】 第１の配列と参照配列とを比較する方法であって、前記第
    １の配列は、配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コードなら
    びに配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードから成る群より選択される
    ものであり、 ａ） 配列を比較するコンピュータプログラムを使用することにより、第１の配
    列および参照配列を読み取り、そして ｂ） 前記コンピュータプログラムによって、第１の配列と参照配列との間の差
    異を判定する、 各ステップを含んで成る上記方法。
  18. 【請求項１８】 第１の配列と参照配列との間の差異を判定する前記ステッ
    プは多型性を同定することを含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 配列番号２４〜８１１および１６００〜１６２２の核酸コ
    ードならびに配列番号８１２〜１５９９のポリペプチドコードから成る群より選
    択される配列の特徴を同定する方法であって、 ａ） 配列の特徴を同定するコンピュータプログラムを使用することにより、前
    記配列を読み取り、そして ｂ） 前記コンピュータプログラムによって、前記配列の特徴を同定する、 各ステップを含んで成る上記方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１または２のいずれか１項に記載の核酸を含むベク
    ター。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の核酸を含有する宿主細胞。
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