JP2002508971A

JP2002508971A - 多量体キメラ蛋白質を使用する生物学的イベントの調節

Info

Publication number: JP2002508971A
Application number: JP2000540254A
Authority: JP
Inventors: クラクソン，ティモシー・ピー; ギルマン，マイケル・ズィー; ホルト，デニス・エイ; キーナン，テレンス・ピー; ラザムス，レナード; ヤン，ウ
Original assignee: アリアド・ジーン・セラピューティクス・インコーポレーテッド
Priority date: 1998-01-15
Filing date: 1999-01-15
Publication date: 2002-03-26
Also published as: AU755784B2; AU2213299A; WO1999036553A3; EP1045915A2; CA2318402A1; WO1999036553A2

Abstract

(57)【要約】標的遺伝子転写及び遺伝子工学的処理した細胞の成長、増殖または分化のような生物学的イベントの調節のための材料及び方法が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景ラパマイシンは、ストレプトミセスヒグロスコピカス(Streptomyces hygrosc
opicus)によって生産されるマクロライド抗生物質であり、ＦＫ５０６−結合タンパク質ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６−binding protein)と高アフィニティーで結合し
て、ラパマイシン：ＦＫＢＰ複合体を形成する。相互作用について報告されてい
るＫｄ値は、２００ｐＭ程の低さである。ラパマイシン；ＦＫＢＰ複合体は、大
分子の細胞タンパク質ＦＲＡＰと高アフィニティーで結合し、３分節系の［ＦＫ
ＢＰ：ラパマイシン］：［ＦＲＡＰ］複合体を形成する。その複合体内で、ラパ
マイシンは、ダイマライザー(dimerizer)またはアダプターとして作用し、ＦＫＢＰをＦＲＡＰに結合させる。

【０００２】

【化５】

【０００３】数多くの天然発生ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰｓ）が知られている。
例えば、Ｋａｙ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１４，３６１−３８５（
論評）を参照の事。遺伝子操作細胞内での生物スイッチに用いるため、ＦＫＢＰ
誘導ドメインをキメラタンパク質の設計に採用した。そのようなスイッチは、タ
ンパク質成分のリガンド仲介多量体化によって、所望の生物学的イベントを誘発
する。例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１０１
９−１０２４およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０１６１７を参照のこと。ＦＫ５０６の
強力な免疫抑制活性は、特に動物内で、多量体化薬剤としてのその有効性を制限
するであろうが、そのような免疫抑制活性を欠く、ＦＫ５０６の二量体（および
関連化合物）を作り出すことができる。そのような二量体は、ＦＫＢＰ−誘導リ
ガンド結合ドメインを含むキメラタンパク質の多量体化に有効であることが分か
った。

【０００４】また、ＦＫ５０６のようなラパマイシンは、適当に設計されたキメラタンパク
質を多量体化する能力を持つ。以前、我々は、多量体化薬剤としてラパマイシン
およびその様々な誘導体または類似体［「ラパログ」("rapalogs) ］を用いて、
生物スイッチを設計したことがある（ＷＯ９６／４１８６５を参照のこと）。ラ
パマイシンそれ自身では、強力な免疫抑制活性を含むその有意な生物学的活性は
、ある適用での、特にラパマイシンに感受性である動物または動物細胞での、生
物スイッチへのその使用をかなり厳しく制限する。そのような適用のために改良
されたラパログ、特に免疫抑制活性を減少させたラパログ、は非常に望ましいで
あろう。

【０００５】免疫抑制剤としての化合物の治療指数を改良するために、典型的には代替発酵
生成物としてか、または合成努力から生じた、数多くのラパマイシン構造変異体
が報告されている。例えば、類似体、誘導体および構造上ラパマイシンと関連す
るその他の化合物（「ラパログ」）についての広範な文献には、この他にもいろ
いろあるが、ラパマイシンに関連する次の修飾：脱メチル化、Ｃ７、Ｃ４２およ
び／あるいはＣ２９のメトキシの除去または置換；Ｃ１３、Ｃ４３および／また
はＣ２８のヒドロキシの除去、誘導体化または置換；Ｃ１４、Ｃ２４および／ま
たはＣ３０のケトンの減少、除去または誘導体化；プロリル五員環でのピペコレ
ート六員環の置換；ならびにシクロヘキシル環上の代替置換または置換シクロペ
ンチル環でのシクロヘキシル環の置換：が含まれる。さらなる歴史的情報は、合
衆国特許第５，５２５，６１０号；５，３１０，９０３号および５，３６２，７
１８号の発明の背景の項に示されている。

【０００６】合衆国特許第５，５２７，９０７号は、特許文献の例証となる。その文書は、
副作用を減少させた免疫抑制性ラパログを作り出すために、努力して合成された
一連の化合物について開示している。化合物は、７つの一般構造式、次いで、ラ
パマイシン環上の様々な位置での可能な置換を並べた広範なリスト（テキストの
２−５またはそれより多くの欄）を通して、開示されている。文書には、１８０
以上の合成例が含まれている。その発明の多数の構造変異体は、強力な免疫抑制
剤であると、報告されている。発明の要約本発明は、好ましくはラパマイシンの免疫抑制効果を無効にした改良ラパログ
を用いて、遺伝子操作細胞内でキメラタンパク質を多量体化するための方法およ
び材料を提供する。

【０００７】遺伝子操作細胞は、本明細書中に記載されたような特定のキメラタンパク質を
コードする一つ以上の組換え核酸構築物を含む。典型的には、第一のキメラタン
パク質は、本発明の改良ラパログと結合する能力を持つＦＫＢＰドメインを、一
つ以上の含む。また、第一キメラタンパク質を、本明細書中では、「ＦＫＢＰ融
合タンパク質」と呼び、さらに、少なくも一つのそのＦＫＢＰドメインと非相同
である少なくとも一つのタンパク質ドメインを含む。ラパログへのＦＫＢＰ融合
タンパク質の結合によって形成された複合体は、一つ以上のＦＲＢドメインを含
む第二のキメラタンパク質（「ＦＲＢ融合タンパク質」）と結合する能力を持つ
。さらに、ＦＲＢタンパク質は、少なくとも一つのそのＦＲＢドメインと非相同
な少なくとも一つのタンパク質ドメインを含む。いくつかの実施態様では、ＦＫ
ＢＰ融合タンパク質およびＦＲＢ融合タンパク質は、互いに異なる。しかしなが
ら、その他の実施態様では、ＦＫＢＰ融合タンパク質は、またＦＲＢ融合タンパ
ク質でもある。それらの実施態様では、キメラタンパク質は、一つ以上のＦＫＢ
Ｐドメインならびに一つ以上のＦＲＢドメインを含む。そのような場合、第一お
よび第二のキメラタンパク質は、同一タンパク質であることができ、ＦＫＢＰ−
ＦＲＢ融合タンパク質と呼ぶこともでき、そしてＦＫＢＰおよび／またはＦＲＢ
ドメインと非相同な少なくとも一つのドメインを含む。

【０００８】キメラタンパク質は、適当に選択された非相同ドメインを採用することを基本
として、それらの多量体化が一つ以上の広範な所望の生物応答を誘発するように
、容易に設計することができる。ラパログ仲介複合体化によって誘発された生物
応答の種類は、融合タンパク質内の非相同ドメインを選択することによって、決
定付けられる。それ故、非相同ドメインは、「作用」または「エフェクター」ド
メインと呼ばれる。本発明の実施に用いられる遺伝子操作細胞は、キメラタンパ
ク質をコードする一つ以上の組換え核酸構築物を含み、ある適用では、さらに、
一つ以上の標的遺伝子構築物のような、一つ以上のアクセサリー核酸構築物を含
むであろう。実例となる生物応答、システムの適用およびアクセサリー核酸構築
物の型を、以下に詳細に論ずる。

【０００９】関連する材料および方法を含むシステムは、ＷＯ９６／４１８６５（Ｃｌａｃ
ｋｓｏｎら）に開示されており、その他にもいろいろあるが、研究用途および治
療適用を含む、様々な適用に有用であると期待される。そのシステムは、ラパマ
イシンまたは一般式

【００１０】

【化６】

【００１１】［式中、Ｕは、−Ｈ、−ＯＲ¹、−ＳＲ¹、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ¹、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ¹、−
ＮＨＲ¹、−ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ¹、−ＮＨＳＯ₂−Ｒ¹または−Ｒ²であり；Ｒ²は、アリ
ールまたはアリルまたはアルキルアリール（例えばベンジルあるいは置換ベンジ
ル）であり；Ｖは、ＯＲ³または(＝Ｏ)であり；Ｗは、＝Ｏ、＝ＮＲ⁴、＝ＮＯＲ ⁴ 、＝ＮＮＨＲ⁴、−ＮＨＯＲ⁴、−ＮＨＮＨＲ⁴、−ＯＲ⁴、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁴、−Ｏ
Ｃ(Ｏ)ＮＲ⁴または−Ｈであり；Ｙは、−ＯＲ⁵、−ＯＣ(Ｏ)ＮＨＲ⁵であり；Ｚ
は、＝Ｏ、−ＯＲ⁶、−ＮＲ⁶、−Ｈ、−ＮＣ(０)Ｒ⁶、−ＯＣ(０)Ｒ⁶、または−
ＯＣ(０)ＮＲ⁶であり；Ｒ³は、Ｈ、−Ｒ⁷、−Ｃ(Ｏ)Ｒ⁷、−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ⁷また
はＣ−２８／Ｃ−３０環状炭酸(cyclic carbonate)であり；そして、Ｒ⁴は、Ｈ
またはアルキルであり；Ｒ¹、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷は、Ｈ、アルキル、アルキルアリールまたはアリールから独立的に選択され、そのような用語は、ＷＯ９
６／４１８６５に定義されている］のラパログを含む多量体化薬剤を用いることを含む。数多くのラパログが、上記
文書内に具体的に開示されている。

【００１２】発明の主題は、ＷＯ９６／４１８６５に開示されたそれと類似したシステムを
基にしているが、多量体化薬剤のような改良されたラパログの使用が含まれる。
従って、発明の主題は、（ａ）所望のキメラタンパク質の発現を指示する核酸構
築物および任意の所望のアクセサリー組換え構築物を含む適当な遺伝子操作細胞
を提供すること；および（ｂ）本明細書中に記載されたような改良ラパログまた
はその医薬として許容しうる誘導体と細胞を接触させること；を含む、細胞内で
キメラタンパク質を多量体化する方法を提供することである。ラパログは、それ
自身および少なくとも２つのキメラタンパク質（類）分子を含む複合体を形成す
る。この発明に用いられる改良ラパログには、以下の物が含まれる。

【００１３】本発明に用いられる改良ラパログの一つのクラスは、式Ｉ

【００１４】

【化７】

【００１５】に示されるように、任意数の様々な置換基を持ち、本発明に反しない限りにおい
て所望であれば一つ以上のＣ−Ｃ結合が不飽和である、サブ構造を含むそれら化
合物からなり、ラパマイシンと比較して実質上減少した免疫抑制効果を持つ。「
実質上減少した免疫抑制効果」とは、ラパログが、臨床的にまたはヒト免疫抑制
活性のインビトロあるいはインビボでの適当な代理物内でのいずれかで測定した
場合、等モル量のラパマイシンで認められるまたは期待される免疫抑制効果より
０．１倍少なく、好ましくは０．０１倍より少なく、より好ましくは０．００５
倍より少ない免疫抑制効果を持つこと、または、代わりに、ラパログは、そのよ
うなインビトロでのアッセイにおいて、同アッセイでラパマイシンについて認め
られたＥＣ５０値より、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、よ
り好ましくは少なくとも２５０倍大きい、ＥＣ５０値が得られる、ことを意味し
ている。

【００１６】インビトロでヒトの患者の免疫抑制の一つの適当な代用として、インビトロで
のヒトＴ細胞の増殖阻害が挙げられる。これは、その他にもいろいろあるが、ヒ
トＰＢＬｓおよびＪｕｒｋａｔ細胞を含む様々なヒトＴ細胞または細胞系を用い
て、数多くの周知の変法で行うことのできる慣用のアッセイアプローチである。
このように、ラパログは、ヒト免疫抑制活性についてアッセイされ、ラパマイシ
ンと比較することができる。適当なインビトロアッセイで測定したラパマイシン
に関する免疫抑制活性の減少は、ラパマイシンに関するヒトの免疫抑制活性の減
少を予測する。そのようなインビトロアッセイを用いて、ラパログの相対免疫抑
制活性を評価することができる。

【００１７】そのようなラパログの様々な実例をここに開示する。このクラスの改良された
ラパログには、その他にもいろいろあるが、任意の慣用のＦＫＢＰ結合またはロ
タマーゼアッセイにおいてラパマイシンで得られた結果の範囲内で、ヒトＦＫＢ
Ｐ１２と結合するか、またはそのロタマーゼ活性を阻害するそれらが含まれる。

【００１８】本発明で用いられるその他のクラスの改良ラパログは、式II

【００１９】

【化８】

【００２０】［式中、ａは

【００２１】

【化９】

【００２２】であり、Ｒ^C7aおよびＲ^C7bの一つは、Ｈであり、その他は、−Ｈ、ハロ、−Ｒ² 、−ＯＲ¹、−ＳＲ¹、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ¹または−ＯＣ(Ｏ)ＮＨＲ¹、−ＮＨＲ¹、−
ＮＲ¹Ｒ²、−ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ¹、または−ＮＨ−ＳＯ₂−Ｒ¹であり；式中、Ｒ²は、
脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール（例えば
、ベンジルあるいは置換ベンジル）であり；Ｒ^C30は、ハロ、−ＯＲ³または（＝Ｏ）であり；Ｒ^C24は、＝Ｏ、＝ＮＲ⁴、＝ＮＯＲ⁴、＝ＮＮＨＲ⁴、−ＮＨＯＲ⁴、−ＮＨＮＨＲ⁴、−ＯＲ⁴、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁴または−ＯＣ(Ｏ)ＮＲ⁴、ハロまたは−Ｈであり；Ｒ^C13およびＲ^C28は、独立的に、Ｈ、ハロ、−ＯＲ³、−ＯＲ⁵、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁵ 、−ＯＣ(Ｏ)ＮＨＲ⁵、−ＳＲ⁵、−ＳＣ(Ｏ)Ｒ⁵、−ＳＣ(Ｏ)ＮＨＲ⁵、−ＮＲ⁵ Ｒ^5'または−Ｎ(Ｒ⁵)(ＣＯ)Ｒ^5'であり；Ｒ^C14は、＝Ｏ、−ＯＲ⁶、−ＮＲ⁶、−Ｈ、−ＮＣ(Ｏ)Ｒ⁶、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁶、または−ＯＣ(Ｏ)ＮＲ⁶であり；Ｒ³は、Ｈ、−Ｒ⁷、−Ｃ(Ｏ)Ｒ⁷または−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ⁷またはＣ２８およびＣ３
０を架橋する環状部分（例えば炭酸）であり；Ｒ^C29は、ＨまたはＯＲ¹¹（例えば、ＯＨまたはＯＭｅ）であり；個々の置換基は、特に示さない限りにおいて、いずれかの立体化学方向で存在す
ることができ、Ｒ¹、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹のそれぞれは、
独立的に、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールおよびヘテロアリールから選択
され；Ｒ⁵は、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、＝Ｏ、−ＯＨ、−ＮＲ⁹Ｒ¹⁰、ＯＳＯ₂ＣＦ₃、
ＯＳＯ₂Ｆ、ＯＳＯ₂Ｒ^4'、ＯＣＯＲ^4'、ＯＣＯＮＲ^4'Ｒ^5'、またはＯＣＯＮ(ＯＲ ^4' )Ｒ^5'である］で示される構造を参照に定義される。

【００２３】式IIのラパログを含む、本発明の実施に有用な改良ラパログは、任意の可能な
立体異性配向で置換基を含むことができ、そして、他の立体異性体を実質上含ま
ない（モルベース上その他の立体異性体を＞９０％、好ましくは＞９５％含まな
い）一つの立体異性体を含むか、もしくは立体異性体の混合物を含む場合もある
。

【００２４】特に興味深い本発明に用いられる改良パラログの一つのクラスは、式II（式中
、Ｒ^C13およびＲ^C28の一つまたは両方は、独立的に、Ｈ、ハロ、−ＯＲ³、−ＯＲ⁵、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁵、−ＯＣ(Ｏ)ＮＨＲ⁵、−ＳＲ⁵、−ＳＣ(Ｏ)Ｒ⁵、−ＳＣ(Ｏ
)ＮＨＲ⁵、−ＮＲ⁵Ｒ^5'または−Ｎ(Ｒ⁵)(ＣＯ)Ｒ^5'であり、それぞれのハロ部分
は、独立的に、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選択される）のラパログである。そ
のような化合物の一つのサブセットは、Ｒ^C13およびＲ^C28の一つまたは両方での
み、構造上ラパマイシンとは異なる。そのような化合物のもう一つのサブセット
は、式IIに関して、または本明細書中で着目されたその他のクラスの任意の改良
ラパログに関して上記されたような、一つ以上のさらなる位置で、構造上ラパマ
イシンとは異なる。特に着目された両方のサブセットの化合物は、Ｒ^C13およびＲ^C28の一つまたは両方が、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから独立的に選択されたハロ置換基、または置換あるいは非置換のアミノ部分、またはそのアシル化誘導体
である。これらの化合物には、１３−ハロラパマイシン、２８−ハロラパマイシ
ン、１３，２８−ジハロラパマイシン、および、一つ以上のその他の部分（例え
ば、Ｃ７の一つまたは両方の置換基）ならびにＣ１３およびＣ２８置換基がラパ
マイシンの関連部分と異なる、関連化合物が含まれる。

【００２５】特に興味深い本発明に用いられる改良ラパログのもう一つのクラスは、Ｒ^C24 およびＲ^C30の両方が＝Ｏ以外である、式IIのラパログである。このクラスには、２４，３０−テトラヒドロラパマイシンならびにそのモノおよびジエーテル、
および２４，３０−ジハロラパマイシンが含まれる。そのような化合物の一つの
サブセットは、Ｒ^C24およびＲ^C30でのみ、構造上ラパマイシンと異なる。そのよ
うな化合物のもう一つのサブセットは、式IIに関して、または本明細書中で着目
された任意のその他のクラスの改良ラパログに関して上記されたように、一つ以
上のさらなる位置（例えばＣ７の一つまたは両方の置換基）で、構造上、ラパマ
イシンと異なる。

【００２６】特に興味ある本発明で用いられるその他のクラスの改良ラパログは、式II（式
中、Ｒ^C7aおよびＲ^C7bは、置換あるいは非置換のアリル基またはメトキシ部分以
外の部分である）の改良ラパログである。このクラスには、Ｒ^C7aおよびＲ^C7bの
一方がＨであり、他方がフェニル、ジ−あるいはトリ−置換フェニル、またはモ
ノ−あるいはジ−置換ヘテロ環状部分である、ラパログが含まれる。実例として
、その他にもいろいろあるが、ｏ，ｐ−ジアルコキシフェニル置換基［例えば、
ｏ，ｐ−ジメトキシフェニル、ｏ−メトキシ−ｐ−エトキシフェニル、ｏ−エト
キシ−ｐ−メトキシフェニル、ｏ，ｐ−ジエトキシフェニル、ｏ，ｐ−ジ（ｎ−
あるいはイソ−）プロポキシフェニル等］、トリアルコキシフェニル置換基、メ
チルチオフェン等のようなモノ置換ヘテロ環が含まれる。そのような化合物の一
つのサブセットは、Ｒ^C24およびＲ^C30でのみ、構造上、ラパマイシンと異なる。
そのような化合物のもう一つのサブセットは、式IIに関してまたは本明細書中で
着目された改良ラパログの任意のその他のクラスに関して上記したように、一つ
以上のさらなる位置で、構造上、ラパマイシンと異なる。

【００２７】本発明で用いられる特に興味ある改良ラパログのもう一つのクラスは、ｎが１
である式IIのラパログである。このクラスのラパログには、ピピコレート環系の
代わりにプロリル環系を含むラパログが含まれる。そのような化合物の一つのサ
ブセットは、ピピコレート環系に関してのみ、構造上、ラパマイシンと異なる。
そのような化合物のもう一つのサブセットは、式IIに関して、または本明細書中
で着目された任意のその他のクラスの改良ラパログに関して上記されたような、
一つ以上のさらなる構造的形態（例えばＣ７の一つまたは両方の置換基）に関し
て、構造上、ラパマイシンと異なる。

【００２８】本発明で用いられる特に興味あるもう一つのクラスの改良ラパログは、部分”
ａ”が、式

【００２９】

【化１０】

【００３０】以外である、式IIのラパログである。そのような化合物の一つのサブセットは、
リングシステム”ａ”に関してのみ、構造上、ラパマイシンと異なる。そのよう
な化合物のもう一つのサブセットは、式IIに連して、または本明細書中で着目さ
れるその他のクラスの任意の改良ラパログに関して上記したように、一つ以上の
さらなる構造形態（例えばＣ７の一つまたは両方の置換基）に関して、構造上、
ラパマイシンと異なる。このクラスのラパログには、４３位のヒドロキシル部分
が直前に示したそれと反対の立体化学配向を持つか、４３−ヒドロキシル基の立
体異性体混合物であるか、またはエーテル、エステル、カルバメート、ハライド
を含む、任意の前記の誘導体、および前記の４３位ラパログのその他の誘導体を
含む、４３−エピ−ラパログのクラスが含まれる。さらに、このクラスには、そ
の他の点でシクロヘキシル環が置換された、および／またはラパマイシンの特徴
的に置換されたシクロヘキシル環の代わりに５つの環原子を含む、ラパログが含
まれる。

【００３１】一方、本明細書中に記載された改良ラパログは、遺伝子操作細胞内でキメラタ
ンパク質を多量体化する方法に用いられる。方法は、（ａ）所望のキメラタンパ
ク質（および任意の所望のアクセサリー組換え構築物）の発現を指示する核酸構
築物を含む適当な遺伝子操作細胞を提供し、そして（ｂ）細胞を改良ラパログま
たはその医薬として許容しうる誘導体と接触させる、ことを含む。

【００３２】一つの実施態様では、少なくとも一つのキメラタンパク質は、そのペプチド配
列が天然発生のＦＫＢＰペプチド配列、例えばヒトＦＫＢＰ１２のペプチド配列
と、ペプチド配列内の最大で１０のアミノ酸残基が異なる、少なくとも一つのＦ
ＫＢＰドメインを含む。好ましくは、ペプチド配列の変化数は、５まで、より好
ましくは、１、２または３までに限定される。ラパログがＲ^C28、Ｒ^C24およびＲ ^C30 、および／またはＲ^C7aおよび／またはＲ^C7bでラパマイシンと関連する構造修飾を含む実施態様では、また、少なくとも一つのキメラタンパク質が、天然発
生のＦＫＢＰ、特にヒトＦＫＢＰ１２のような哺乳動物のＦＫＢＰ、の配列と関
連する少なくとも一つのアミノ酸置換を含む、少なくとも一つのＦＫＢＰドメイ
ンを含むことは、特に興味深い。特に興味ある変異には、独立的に選択された置
換アミノ酸、例えばバリン、メチオニン、アラニンまたはセリンでの、ヒトＦＫ
ＢＰ１２配列のＰｈｅ３６およびＰｈｅ９９の一方または両方の置換が含まれる
。

【００３３】もう一つの実施態様では、少なくとも一つのキメラタンパク質は、天然発生の
ＦＲＢペプチド配列、例えばヒトＦＲＡＰのＦＲＢドメインと、ペプチド配列内
に最大で１０のアミノ酸残基が異なるペプチド配列を持つ、少なくとも一つのＦ
ＲＢドメインを含む。好ましくは、ペプチド配列の変化数は、５まで、より好ま
しくは１、２または３までに限られ、多くの場合、ＦＲＢドメインは、ヒトＦＲ
ＡＰまたはあるその他の哺乳動物のＦＲＡＰ／ＴＯＲ種の相当するＦＲＢドメイ
ンのペプチド配列に関連する単一アミノ酸置換を含むことが好ましいであろう。
特に興味ある変異には、独立的に選択された置換アミノ酸、例えばＡ、Ｎ、Ｈ、
ＩまたはＳでの、ヒトＦＲＡＰから誘導されたＦＲＢドメインの一つ以上のＴ２
０９８、Ｄ２１０２、Ｙ２０３８、Ｆ２０３９、Ｋ２０９５の置換が含まれる。
また、独立的に選択された置換アミノ酸、例えば、Ｈ、Ｌ、Ｓ、ＡまたはＶでの
、酵母ＴＯＲ１から誘導されたＦＲＢドメインの一つ以上のＦ１９７５、Ｆ１９
７６、Ｄ２０３９およびＮ２０３５の置換、または酵母ＴＯＲ２から誘導された
ＦＲＢドメインの一つ以上のＦ１９７８、Ｆ１９７９、Ｄ２０４２およびＮ２０
３８の置換、が興味深い。

【００３４】ある実施態様では、キメラタンパク質は、天然発生の配列と比較して、一つ以
上のＦＫＢＰドメインおよび一つ以上のＦＲＢドメインの両方で、ペプチド配列
内に少なくとも一つの修飾、好ましくは最大で３まで修飾を含む。

【００３５】前記のように、本発明の様々な実施態様では、キメラタンパク質（類）は、Ｆ
ＲＢＰおよび／またはＦＲＢドメインに関して異種である、一つ以上の「作用」
または「エフェクター」ドメインを含む。エフェクタードメインは、ＤＮＡ結合
ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞局在化ドメインおよびシグナル化ドメイン
（例えばクラスター化または多量体化細胞成長時に、増殖、分化、アポトーシス
、遺伝子転写等を誘発する能力を持つドメイン）を含む、広範囲のタンパク質ド
メインから選択することができる。本発明を実施するに当たって用いることので
きる様々なエフェクタードメインの実例は、本明細書中に列挙された様々な化学
文献および特許文書に開示されている。

【００３６】例えば、ある実施態様では、一つの融合タンパク質は、少なくとも一つのＤＮ
Ａ結合ドメイン（例えば、ＧＡＬ４またはＺＦＨＤ１ＤＮＡ結合ドメイン）を
含み、もう一つの融合タンパク質は、少なくとも一つの転写活性化ドメイン（例
えば、ＶＰ１６またはｐ６５転写活性化ドメイン）を含む。融合タンパク質のリ
ガンド−仲介結合は、転写因子複合体の形成を表し、一つの融合タンパク質上の
ＤＮＡ結合ドメインによって認識される（例えば結合する能力を持つ）ＤＮＡ配
列と連結した標的遺伝子の転写開始を導く。

【００３７】その他の実施態様では、一つの融合タンパク質は、細胞膜、核、ＥＲあるいは
その他のオルガネラ、または細胞成分のような、特定の細胞の位置に融合タンパ
ク質を指示する能力を持つ、少なくとも一つのドメインを含む。細胞膜を標的と
する局在化ドメインには、例えば、ミリストイル化部位またはレセプタータンパ
ク質のトランスメンブレン領域またはその他の膜横断タンパク質の様なドメイン
が含まれる。もう一つの融合タンパク質は、膜局在化および／またはクラスター
化時に、細胞シグナルトランスダクション経路を活性化する能力を持つシグナル
化ドメインを含むことができる。シグナル化ドメインの例としては、成長因子の
細胞内ドメインまたはサイトカインレセプター、ＦＡＳあるいはＴＮＦ−Ｒ１の
細胞内ドメインのようなアポトーシス誘発ドメイン、およびＳＯＳ、Ｒａｆ、ｌ
ｃｋ、ＺＡＰ−７０等のようなその他の細胞内シグナル化タンパク質より誘導さ
れたドメインが含まれる。多数のシグナル化タンパク質が、ＰＣＴ／ＵＳ９４／
０１６１７（例えば２３−２６頁を参照のこと）に開示されている。さらなるそ
の他の実施態様では、個々の融合タンパク質は、少なくとも一つのＦＲドメイン
および少なくとも一つのＦＫＢＰドメイン、ならびに一つ以上の非相同ドメイン
を含む．そのような融合タンパク質は，ラパログ存在下で、ホモダイマー化しシ
グナル化を誘発する能力を持つ。一般に、宿主細胞に対して内因性のペプチド配
列を含むドメインは、全生物体を含む適用に好ましい。従って、ヒト遺伝子治療
への適用では、ヒト起源のドメインが、特に興味深い。

【００３８】また、融合タンパク質をコードする組換え核酸構築物は、それらの発現を指示
する能力を持つ核酸構築物、およびそれらを細胞、特に真核生物細胞、そのうち
特に興味あるのは酵母および動物細胞である、に導入するためのそのような構築
物を含むベクターと同様に、提供される。融合タンパク質の構成要素から見て、
それらをコードする組換えＤＮＡ分子は、（ａ）ＦＲＢドメインまたはＦＫＢＰ
ドメインを含むポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に；および（ｂ）非相同ド
メインまたは非相同タンパク質をドメインを誘導するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ分子に；選択的にハイブリダイズする能力を持つ。遺伝子コードの縮重がな
かったならハイブリダイズする能力を持つＤＮＡもまた、包含される。

【００３９】融合タンパク質をコードする核酸配列、真核細胞でのそれらの発現を指示する
核酸構築物、および、ベクターまたはそのような構築物を細胞、特に動物細胞内
に導入するためのその他の手段を用いて、多数の重要な用途用に、細胞、特に動
物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞、を遺伝子操作する
ことができる。そうするために、最初に、真核生物（好ましくは動物）細胞内で
の所望のキメラタンパク質の発現を指示する。発現ベクターまたは核酸構築物を
提供し、次いで、ＤＮＡ取込および少なくとも細胞の部分での導入されたＤＮＡ
の発現を可能にする様式で、細胞内に組換えＤＮＡを導入する。非相同遺伝子発
現のために細胞内にＤＮＡを導入するための任意の様々な方法および道具を用い
ることができ、様々な方法および道具が周知である、および／または市販されて
いる。

【００４０】従って、本発明の一つの目的は、本明細書中に記載した方法に従って、細胞、
好ましくは動物細胞内で、融合タンパク質を多量体化する方法である。要約する
と、一つの融合タンパク質は、本発明の改良ラパログと結合する能力を持ち、少
なくとも一つのＦＫＢＰドメインおよびそれと非相同の少なくとも一つのドメイ
ンを含む。第二の融合タンパク質は、少なくとも一つのＦＲＢドメインおよびそ
れと非相同の少なくとも一つのドメインを含み、第一の融合タンパク質および一
つ以上の改良ラパログ分子と３分節系(tripartite)の複合体を形成する能力を持
つ。いくつかの実施態様では、一つの融合タンパク質上に存在する一つ以上の非
相同ドメインは、その他の融合タンパク質上にも存在する、例えば, ２つの融合タンパク質は、一つ以上の共通の非相同ドメインを持つ。その他の実
施態様では、それぞれの融合タンパク質は、一つ以上の異なる非相同ドメインを
含む。

【００４１】方法には、細胞が存在する培養液にラパログを加えることによって、適当に操
作された細胞を改良ラパログと接触させること、またはラパログを細胞が存在す
る生物体に投与することが含まれる。細胞は、好ましくは真核生物であり、より
好ましくは動物細胞であり、最も好ましくは哺乳動物細胞である。霊長類細胞、
特にヒト細胞が、特に興味深い。ヒトまたは非ヒト動物への改良ラパログの投与
は、任意の医薬として許容しうる調合物および投与経路を用いると有効である。
一つ以上の医薬として許容しうるキャリヤー、バッファー、またはその他の補助
剤と共に改良ラパログを含む、医薬として許容しうる組成物の経口投与は、現在
のところ、非常に興味深い。

【００４２】本発明の具体的な目的は、その他の点で上記したように、ラパログ依存様式で
標的遺伝子の転写を誘導する方法である。典型的には、細胞は、２つの融合タン
パク質をコードする組換えＤＮＡに加えて、ラパマイシンまたはラパログを含む
融合タンパク質複合体の存在に対して応答するＤＮＡ配列と機能し得るように連
結された標的遺伝子を含む標的遺伝子構築物を含む。標的遺伝子構築物は、組換
え体であることができ、標的遺伝子および／またはそれと連結した調節核酸配列
は、宿主細胞に関して非相同であることができる。ある実施態様では、細胞は、
ＦＫＢＰ融合タンパク質と結合する改良ラパログと接触すると反応を示し、宿主
細胞の内因性ＦＫＢＰおよび／またはＦＲＢ−接触タンパク質と結合した上、検
出可能な選択物を含むＦＲＢ融合タンパク質との複合体と関係する。

【００４３】本発明のもう一つの具体的目的は、その他の点で上記したように、ラパログ依
存様式で細胞死を誘導するための方法である。そのような細胞では、少なくとも
一つの融合タンパク質、通常は２つの融合タンパク質上の、少なくとも一つの非
相同ドメインは、クラスター化時に細胞のアポトーシスを誘導する、ＦＡＳまた
はＴＮＦ−Ｒ１の細胞内ドメインのような、ドメインである。

【００４４】本発明のもう一つの具体的目的は、その他の点で上記したように、ラパログ依
存様式で、細胞の成長、分化または増殖を誘導するための方法である。そのよう
な細胞では、少なくとも一つの融合タンパク質の少なくとも一つの非相同ドメイ
ンは、例えば、細胞の成長、分化または増殖を仲介するホルモン用レセプターの
細胞内ドメインのようなシグナル化ドメイン、またはそのようなレセプターの下
流メディエーターである。細胞の成長、分化および／または増殖は、そのような
シグナル化ドメインのクラスター化に続いて起こる。そのようなクラスター化は
、ホルモン結合に続いて自然に、そして、改良ラパログとの接触に続いて本発明
の遺伝子操作細胞内で、起こる。

【００４５】様々な起源（ヒトまたはその他の種）の細胞の型を用いることができるが、ヒ
ト起源の細胞が、ヒトの遺伝子治療の適用には好ましいく、また、所望であれば
、ヒト患者で用いるために生物適合する材料内に被包することもできる。

【００４６】また、前述の遺伝子操作細胞を作成するための材料および方法も提供される。
この目的は、融合タンパク質をコードする組換え核酸、典型的にはＤＮＡ分子を
、標的遺伝子構築物のような任意の所望の補助的組換え核酸と共に提供し、そし
て、細胞による核酸の取込みが可能な条件下で、組換え核酸を宿主細胞内に導入
することによって、果たされる。そのようなトランスフェクションは、培養液内
に保持された宿主細胞を用いて、エキソビボで有効であることができる。次に、
培養液内で遺伝子操作された細胞を、例えば、エキソビボでの遺伝子治療に適用
するために、宿主生物体内に導入することができる。従って、そのように行うこ
とによって、本明細書中に提供されたような改良ラパログの存在に（本明細書中
に記載したように）応答する、宿主生物、好ましくはヒトまたは非ヒト哺乳動物
を提供するための方法が構成される。代わりの方法として、ヒトまたは非ヒト宿
主生物内に存在する宿主細胞を用いると、トランスフェクションもインビボで有
効であることができる。そのような場合、核酸分子は、一つ以上の宿主生物細胞
による核酸の取込みが可能な条件下で、宿主生物体内に直接導入される。従って
、このアプローチは、改良ラパログの存在に（本明細書中に記載されたように）
応答する、宿主生物体、好ましくはヒトまたは非ヒト哺乳動物、を提供する代わ
りの方法を構成する。培養液内の細胞または全生物体内の細胞にＤＮＡおよびＲ
ＮＡための様々な材料および方法は、この技術分野では既知であり、本発明の実
施に当たっての使用に適している。

【００４７】その他の目的は、本明細書中に記載の遺伝子操作細胞を用いることによって成
し遂げられる。例えば、本明細書中に記載の方法に従って遺伝子操作された細胞
を、ラパログが融合タンパク質と複合体を形成することができる有効量の改良ラ
パログと接触させることによって、本発明の融合タンパク質を多量体化するため
の方法が提供される。融合タンパク質の多量体化が標的遺伝子の転写を誘発する
実施態様では、これによって標的遺伝子の発現を活性化する方法が構成される。
融合タンパク質が一つ以上のシグナル化ドメインを含む実施態様では、これによ
って細胞シグナル導入経路を活性化する方法が構成される。クラスター化に次い
で細胞の成長、増殖、分化または細胞死を誘導するそれらの能力に基づいて、シ
グナル化ドメインが選択される実施態様では、改良ラパログ仲介クラスター化は
、細胞の成長、増殖、分化または細胞死を活性化する方法を構成する。これらの
方法は、細胞培養液、またはヒト患者を含む全生物体内で行うことができる。前
者の場合、ラパマイシンまたはラパログを培養液に加える。後者の場合、（医薬
組成物または家畜を治療するための組成物の形で存在することのできる）ラパマ
イシンまたはラパログを、全生物体に、例えば経口、非経口当で投与する。好ま
しくは、動物に投与された改良ラパログの投与量は、レシピエントに免疫抑制を
起こす原因となるであろう投与量レベルより低い。

【００４８】遺伝子操作細胞またはヒトあるいは非ヒト動物内で用いるためのキットもまた
、開示されている。そのようなキットの一つは、本発明の融合タンパク質をコー
ドする一つ以上の組換え核酸構築物を含む。組換え核酸構築物は、一般的には、
動物細胞内への導入に適しており、且つその中の融合タンパク質の発現を指示す
る能力を持つ、真核生物発現ベクターの形で存在するであろう。そのようなベク
ターは、本明細書中の他の場所に記載したような、ウイルスベクターであること
ができる。また、キットは、コードされた融合タンパク質と共に複合体を形成す
る能力を持つ本発明の改良ラパログのサンプルをも含むことができる。さらに、
キットは、ＦＫ５０６のような多量体化アンタゴニスト、および融合タンパク質
の一方とは結合する能力を持つが両方とは複合体を形成する能力を持たないいく
つかのその他の化合物を含む。ある実施態様では、融合タンパク質をコードする
組換え核酸構築物は、一つ以上の非相同ドメインをコードするＤＮＡの代わりに
クローニング部位を含み、これによって、開業医は、選択された非相同ドメイン
をコードするＤＮＡを導入することが可能になる。いくつかの実施態様では、キ
ットには、他により詳細に記載したように、複合した融合タンパク質の存在に応
答するＤＮＡ配列と連結した標的遺伝子またはクローニング部位を含む標的遺伝
子構築物を含むことができる。キットは、封入された核酸構築物を同定するため
のパッケージ挿入物、および／または宿主細胞または生物体内に構築物を導入す
るための装置を含むことができる。発明の詳細な説明定義以下の定義および適応情報は、本文書を完全に理解する助けとなる。

【００４９】ＦＲＢドメインは、ポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）、典型的に
は少なくとも約８９アミノ酸残基であり、ＦＫＢＰタンパク質およびラパマイシ
ン（または本発明の改良ラパログ）と３分節系複合体を形成する能力を持つ。Ｆ
ＲＢドメインは、ヒトおよびその他の種からのＦＲＡＰタンパク質（文献中では
”ＲＡＰＴＩ”または”ＲＡＦＴ”とも呼ばれている）；Ｔｏｒ１およびＴｏｒ
２を含む酵母タンパク質；ならびにカンジダＦＲＡＰ同族体；を含む、数多くの
天然発生タンパク質に存在する。ヌクレオチド配列、クローニングおよびこれら
のタンパク質のその他の態様に関する情報は、既に、この技術分野では既知であ
り、所望のＦＲＢペプチド配列をコードするＤＮＡの合成またはクローニングも
、例えば、既知の方法および公表された配列に基づいたＰＣＲプライマーを用い
ると、可能である。

【００５０】

【表１】

【００５１】一般に、本発明に用いられるＦＲＢドメインは、少なくとも約８９−１００の
アミノ酸残基を含む。Ｃｈｉｕら、上記、の図２は、ＦＲＢ保存領域に含まれる
ヒトＦＲＡＰ、ネズミＦＲＡＰ、Ｓ．ｃｅｒｅｂｉｓｉａｅＴＯＲ１およびＳ
．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴＯＲ２の１６０のアミノ酸長を示している。典型的
には、本発明の融合タンパク質に用いるために選択されたＦＲＢ配列は、少なく
とも８９のアミノ酸配列（図２の番号で、Ｇｌｕ−３９からＬｙｓ／Ａｒｇ−１
２７）に及ぶ。参考として、Ｃｈｅｎら、またはＳａｂｉｔａｎｉら、での番号
を用いると、８９−アミノ酸配列は、ヒトＦＲＡＰの場合、Ｇｌｕ−２０２５か
らＬｙｓ−２１１３であり、Ｔｏｒ２の場合、Ｇｌｕ−１９６５からＬｙｓ−２
０５３であり、Ｔｏｒ１の場合、Ｇｌｕ−１９６２からＡｒｇ−２０５０である
。本発明の融合タンパク質に用いられるＦＲＢドメインは、（例えば、本明細書
中に列挙されたＦＲＡＰ／ＲＡＦＴ／ＲＡＰＴおよびＴｏｒに関連する参考文献
で用いられているそのような結合を検出するための手段を含む、そのような結合
を検出するための直接的または間接的な任意の手段によって決定することができ
るように、）ラパマイシンまたは本発明の改良ラパログと結合するＦＫＢＰタン
パク質の複合体と結合する能力を持つであろう。そのようなＦＲＢドメインのペ
プチド配列には、（ａ）上記のタンパク質の少なくとも示された８９−アミノ酸
領域に及ぶ天然発生ペプチドまたは同族体タンパク質の関連領域、（ｂ）天然発
生ペプチド配列の最大で約１０まで（好ましくは１−５、より好ましくは１−３
、いくつかの実施態様ではちょうど１）のアミノ酸が、欠損、挿入または置換ア
ミノ酸で置き換えられた、天然発生のＦＲＢ配列の変異体；または（ｃ）天然発
生のＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子と選択的にハイブリダイズする能力
を持つＤＮＡ配列、または遺伝子コードの縮重を除くが天然発生のＦＲＢドメイ
ンをコードするＤＮＡ分子と選択的にハイブリダイズする能力を持つＤＮＡ配列
、によってコードされるペプチド配列：が含まれる。

【００５２】ＦＫＢＰｓ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０および
ラパマイシンのようなマクロライドのサイトゾルレセプターであり、種の系統を
越えて良く保存されている。本開示の目的では、ＦＫＢＰｓは、ラパマイシンま
たは本発明の改良ラパログと結合し、さらにＦＲＢ−含有タンパク質と３分節系
複合体を形成する能力を持つタンパク質またはタンパク質ドメインである。また
、ＦＫＢＰドメインは、「ラパマイシン結合ドメイン」とも呼ばれている。ヌク
レオチド配列、クローニングおよび様々なＦＫＢＰ種のその他の態様に関する情
報は、この技術分野では既に既知であり、例えば、周知の方法および公表された
配列を基にしたＰＣＲプライマーを用いて、所望のＦＫＢＰペプチド配列をコー
ドするＤＮＡの合成またはクローニングが可能になる。例えば、Ｓｔａｅｎｄａ
ｒｔら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ，３４６，６７１−６７４（ヒトＦＫＢＰ１２
）；Ｋａｙ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３１４，３６１−３８５（論評
）を参照のこと。また、その他の哺乳動物種、酵母、およびその他の生物体内で
相同なＦＫＢＰタンパク質も、この技術分野で知られており、本明細書に開示さ
れた融合タンパク質に用いることができる。例えば、Ｋａｙ、１９９６、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｊ．，３１４，３６１−３８５（論評）を参照のこと。本発明に用い
られるＦＫＢＰドメインの大きさは、用いられるＦＫＢＰタンパク質に依存して
、変化する。本発明の融合タンパク質のＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンまた
は本発明の改良ラパログと結合する能力を持ち、（そのような結合を検出するた
めの直接的または間接的任意の手段によって測定することができるような）ＦＲ
Ｂ−含有タンパク質と３文節系複合体を形成する。本発明のＦＫＢＰ融合タンパ
ク質のＦＫＢＰドメインのペプチド配列には、（ａ）好ましくは、ヒトＦＫＢＰ
１２タンパク質から誘導された天然発生のＦＫＢＰペプチド配列、またはもう一
つのヒトＦＫＢＰから、ネズミまたはその他の哺乳動物のＦＫＢＰから、または
いくつかのその他の動物、酵母あるいは真菌のＦＫＢＰ誘導されたペプチド配列
；（ｂ）天然発生のペプチド配列の最大で約１０まで（好ましくは、１−５、よ
り好ましくは１−３、さらにいくつかの実施態様では丁度１）のアミノ酸が、欠
損、挿入または置換アミノ酸と置き換えられた、天然発生のＦＫＢＰ配列の変異
体；または（ｃ）天然発生のＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子と選択的にハイブ
リダイズする能力を持つＤＮＡ配列、または遺伝子コードの縮重を除いて、天然
発生のＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子と選択的にハイブリダイズする能力を持
つであろうＤＮＡ配列、によってコードされるペプチド配列：が含まれる。

【００５３】本明細書中で使用する「選択的にハイブリダイズ可能な」なる用語は、当業者
によって選択または経験的に容易に決定し得るハイブリダイゼーション条件下で
、他のDNA分子が存在していても、二つのDNA分子が互いにハイブリダイゼーショ
ンを受け易いことを意味するものとする。かかる処置としては、非常に厳しい条
件(例えば、室温から65〜75℃の範囲の温度で、0.2〜6×SSCを含有及び／または
0.1%〜1%SDSを含有する緩衝液で頻繁に洗浄)が挙げられる。例えば、F.M.Ausube
lら編、Short Protocols in Molecular Biology、ユニット6.3及び6.4(John
Wiley & Sons、New York、第3版、1995)を参照されたい。

【００５４】「蛋白質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」なる用語は、本明細書中では
互換可能に使用する。

【００５５】本明細書中で使用する「核酸構築物」なる用語は、以下に定義するが、通常、
組換え体であり、遊離(即ち、他の核酸配列と共有結合していない)形で存在する
ことができ、また、DNAベクター、レトロウイルス若しくは他のウイルスベクターなどのより大きな分子または遺伝子的に加工処理された宿主細胞の染色体内に
存在することができる、本発明の実施で使用する核酸(通常、DNAであるが、例え
ば、レトロウイルス送達系でのRNAをも包含する)を表すものとする。特に重要な
核酸構築物としては、本発明の融合蛋白質をコードするもの、または標的遺伝子
及び発現制御要素を含むものがある。この構築物はさらに、転写、翻訳、及び／
またはコード領域またはその遺伝子産物の他のプロセシングの調整に関連する以
下の要素：転写プロモーター及び／またはエンハンサー配列、リボソーム結合サ
イト、イントロンなどのひとつ以上を含む核酸蛋白質を含む。

【００５６】本明細書中で使用する「組換え体」、「キメラ」及び「融合」なる用語は、自
然状態では同一配列中に一緒に発生しないという意味で相互に異種である他の成
分、配列または種々の成分ドメインを含む物質を表すものとする。特にこの成分
は、自然状態では同一連続ポリペプチドまたはヌクレオチド配列または分子内に
知見されず、少なくとも本発明のキメラ蛋白質または組換え体DNA分子に存在する同一間隔のオーダー若しくは配向または同一細胞には存在しない。「転写制御要素」なる用語は、それと操作可能に結合している蛋白質コード配列
の転写を誘導または制御する調節DNA配列(例えば、開始シグナル、エンハンサー
、及びプロモーター)を表す。「エンハンサー」なる用語は、プロモーターからの転写を強化、刺激、または促進し得る調節要素を含むものとする。かかる転写
調節成分は、コード領域の上流、または特定の場合(例えば、エンハンサー)には
、別の場所(例えば、イントロン、エキソン、コード領域、及び3'フランキング配列)にも存在し得る。

【００５７】「ダイマー化」、「オリゴマー化」及び「マルチマー化(multimerization)」なる用語は、本明細書中、互換可能に使用し、蛋白質の少なくともひとつに薬剤
を結合することによって介在する、二つ以上の蛋白質の結合物(association)またはクラスタリング(clustering)を指すものとする。好ましい態様では、マルチ
マー化は、かかる蛋白質分子の二つ以上を通常の二価または多価薬剤に結合する
ことによって媒介される。少なくとも二価であるFKBPリガンド(例えば、FK1012 またはAP1510)のひとつ以上の分子と一緒に、そのそれぞれがひとつ以上のFKBP ドメインを含有する二つ以上の蛋白質を含む複合体の形成は、かかる結合物また
はクラスタリングの一例である。蛋白質の少なくともひとつが1を超える薬剤結合ドメインを含有する場合、例えば、蛋白質の少なくともひとつが三つのFKBPド
メインを含有する場合、二価の薬剤が存在することによって2を超える蛋白質分子がクラスタリングする。薬剤結合ドメインを保持する蛋白質への結合能力にお
いて薬剤が二価を超える(例えば、三価)態様によっても、2を超える蛋白質分子のクラスタリングを得ることができる。少なくともひとつのFRBドメインを含有する蛋白質、少なくともひとつのFKBPドメインを含有する蛋白質及びラパマイシ
ン(rapamycin)の分子を含む三分節系複合体の形成は、かかる蛋白質のクラスタリングのもうひとつの例である。本発明の特定の態様では、融合蛋白質は多数の
FRB及び／またはFKBPドメインを含有する。かかる蛋白質の複合体は、ラパマイシンのひとつ以上またはその誘導体または他のダイマー化剤と構成要素蛋白質の
1を超えるコピーを含有することができる。さらに、かかるマルチマー複合体は、本明細書においては、ひとつ以上が多数のコピーによって表される場合であっ
ても、三種類の構成要素築分子の存在を示す三分節系複合体と称する。そのそれ
ぞれが少なくともひとつの薬剤結合ドメインを含有する、少なくともひとつの二
価薬剤と少なくとも二つの蛋白質分子とを含有する複合体の形成は、「オリゴマ
ー化」若しくは「マルチマー化」、または単に「ダイマー化」、「クラスタリン
グ」若しくは「結合」と称することができる。

【００５８】「ダイマー化剤：dimerizer」とは、マルチマー複合体内で二つ以上の蛋白質と一緒に結合する本発明の改良ラパログ(rapalog)を表す。

【００５９】本明細書中で遺伝子の発現または転写に適用する「活性化する」なる用語は、
遺伝子産物の産生において直接または間接的に観察可能な増加を表す。

【００６０】「遺伝子的に加工処理した細胞：genetically engineered cell」なる用語は、組換え体または不均質核酸(例えば、ひとつ以上のDNA構築物またはそれらの
RNA相補物)の導入によって修飾(形質導入)された細胞を指し、さらにかかる遺伝
子修飾の一部または全てを保持するかかる細胞の子孫を含むものとする。

【００６１】本発明の改良ラパログの「治療的有効投与量」とは、処置−または予防−有効
投与量、例えば、遺伝子的に加工処理した細胞において検出可能な標的遺伝子の
転写若しくは細胞成長、増殖、分化、死などをもたらす投与量、または動物若し
くは細胞培地モデルで得られたデータから外挿することによって処置−または予
防−有効であると予測される投与量を表すものとする。治療的有効投与量は通常
、ヒトまたは非−ヒトほ乳類の処置に好ましい。

【００６２】本発明は、改良ラパログを使用して遺伝子的に加工処理した細胞内でキメラ蛋
白質をマルチマー化する方法及び物質に関する。種々のダイマー化−ベースの生
物学的スイッチの設計及び完成が、中でもSpencerら及び本明細書中に参照した種々の国際特許出願中で報告されてきた。この一般的なアプローチのうまくいっ
た適用例の評価も報告されてきた。エフェクタードメインに融合したFRBドメインを含有するキメラ蛋白質もRiveraら、1996、Nature Medicine 2、1028-1032
並びにPCT国際公開第WO96/41865号(Clacksonら)及び同第WO95/33052号(Berlinら
)に開示された。既に記載の如く、融合蛋白質は、これらを含有する融合蛋白質のリガンド−介在「ダイマー化」若しくは「マルチマー化」によるエフェクター
ドメインの結合物が、所望の生物学的事象(例えば、所望の遺伝子の転写、細胞死、細胞増殖など)を誘発するように設計される。例えば、T細胞レセプターCD3 ゼータドメインの細胞内部分から誘導された作用ドメイン(action domain)を含
有するキメラ蛋白質のクラスタリングは、IL-2プロモーターまたはそれから誘導
したプロモーター要素の転写制御下で、遺伝子の転写を誘発する。他の態様では
、作用ドメインは、オリゴマー化時に細胞のアポトーシスを誘発し得る、蛋白質
の細胞内部分から誘導されたドメイン、例えば、FASまたはTNF-αレセプター(TN
Fα-R1)を含む。また他の態様では、作用ドメインは、キメラ蛋白質のオリゴマー化が、DNA結合ドメイン(と特定の結合相互作用し得ること)により認識されたD
NA配列に結合した遺伝子の転写を誘発する転写因子複合体のアセンブリを表すよ
うに対をなした、DNA-結合ドメイン(例えば、GAL4またはZFHD1)及び転写活性ドメイン(例えば、VP16またはp65)を含む。

【００６３】例えば、標的遺伝子の転写の活性化、細胞死または他のシグナル形質導入経路
、細胞局在化を誘発するためにひとつ以上のリガンド−結合ドメイン及びひとつ
以上の作用ドメインを含有するキメラ蛋白質は、上記PCT/US94/01617号、PCT/US
94/08008号(Spencerら)に開示されている。リガンド−媒介遺伝子−ノックアウト用及び遺伝子発現のリガンド−媒介遮断(blockade)または遺伝子産物機能の阻
害用のかかるキメラ蛋白質の設計及び使用は、PCT/US95/10591号に開示されてい
る。標的遺伝子の調節された転写を含む態様で有用なこれらが結合する新規DNA 結合ドメイン及びDNA配列は、Pomeranzらの1995、Science 267:93-96に開示されている。これらの文献は、類似キメラをコードするDNA構築物、標的遺伝子構築物及び本発明の実施者にも有用であり得る他の態様の設計、構築及び使用に関
連する実質的な情報、手引き並びに実施例を提供する。

【００６４】キメラ蛋白質を好適に選択することによって、本発明によって特許文献及び上
記参照の文献に記載の系と似たラパログ−依存形式で加工処理した細胞内で所望
の遺伝子の転写を活性化し；細胞増殖、増殖、分化またはアポトーシスを作動さ
せ；または他の生物学的事象を誘発することができる。加工処理細胞、好ましく
は動物細胞は、ヒト遺伝子治療、トランスジェニック動物、及び他のかかる用途
の場合と同様に、培地で増殖若しくは保持することができるか、または生物全体
の中に存在させることができる。場合によっては、(そのようにして誘発された標的遺伝子の転写、アポトーシスまたは他の生物学的プロセスをモニターするこ
とによって間接的に知見され得るように)FKBP融合蛋白質及びFRB融合蛋白質をマ
ルチマー化するような有効量で、細胞培地または加工処理細胞を含有する生物に
ラパログを投与する。生物全体に投与する場合には、ラパログは、ラパログと一
種以上の許容可能なベルターリナリー(verterinary)または医薬的希釈剤及び／または賦形剤を含有する組成物中で投与することができる。

【００６５】キメラ蛋白質のひとつに結合するがいずれのキメラ蛋白質と三分節系複合体を
形成しない化合物をマルチマー化アンタゴニストとして使用することができる。
それ故、ラパログの効果を遮蔽または逆転させる、即ち、キメラのマルチマー化
を妨害、阻害または邪魔するのに効果的な量(好ましくは、動物全体に投与する場合において上記した組成物中)で、加工処理細胞、またはそれらを含む生物に投与することができる。例えば、FKBP及びFRAPと三分節系複合体を形成しないFK
506、FK520または多くの合成FKBPリガンドのいずれもをアンタゴニストとして使
用することができる。

【００６６】本発明の重要な一態様では、所望の遺伝子の転写のラパログ−依存性の、直接
活性化用の物質及び方法を提供する。かかる一態様では、一連の二種以上の異な
るキメラ蛋白質、及び直接それらの発現が可能な対応するDNA構築物を提供する。かかるキメラ蛋白質のひとつは、その単数または複数種類の作用ドメインとし
て一種以上の転写活性ドメインを含有する。他のキメラ蛋白質はその単数または
複数種類の作用ドメインとして一種以上のDNA−結合ドメインを含有する。本発明のラパログは、ダイマーまたはマルチマー複合体を形成するためにいずれのキ
メラとも結合することができ、かくして少なくともひとつのDNA結合ドメインと少なくともひとつの転写活性化ドメインを含有する。標的遺伝子産物の存在また
は濃度を直接または間接的にモニターすることによって観察することができるよ
うに、かかる複合体の形成によってDNA-結合ドメインが結合できるDNA配列の転写制御下、これに結合した標的遺伝子が転写活性化される。

【００６７】 DNA結合ドメイン及びこれを含有するキメラは、他の、頻繁には多数の他のDNA
配列が存在するにも拘わらず、選択したDNA配列への結合が(直接または間接的に
)観察されるように十分な選択性でその認識DNA配列に結合する。選択DNA配列へのDNA−結合ドメインを含むキメラの結合は、任意の他のDNA配列と比較して選択
DNA配列と結合する遺伝子の転写レベル若しくは相対速度を測定することにより、または生体外結合研究により測定することにより、任意の他のDNA配列に結合するよりも、少なくとも２、より好ましくは３、さらに好ましくは４オーダーを
超える大きさであるのが好ましい。

【００６８】任意の所望の付帯構築物と一緒に、一連の構築物を含有するように遺伝子的に
加工処理された細胞を使用して、所望の生物学的事象のリガンド−介在、調整始
動を含む用途に使用することができ、所望の遺伝子の調整転写、シグナル形質導
入経路の調整誘発(例えば、アポトーシス、または他の事象の誘発)することがで
きる。例えば、標的遺伝子の調節可能な発現用に加工処理された細胞を、標的遺
伝子によってコードされた所望の蛋白質(または他の遺伝子産物)の調節産生に使
用することができる。かかる細胞は慣用法により培地で増殖させることができる
。細胞を含有する培地にラパログを添加すると、細胞による標的遺伝子の発現が
起こり、及びかかる遺伝子によりコードされた蛋白質が産生する。遺伝子の発現
及び蛋白質の産生は、培地にこれ以上マルチマー化剤を与えないようにすること
によって、培地から残存マルチマー化剤を除去することによって、またはマルチ
マー化アンタゴニスト試薬を培地に添加することによって停止させることができ
る。

【００６９】例えば、細胞が所望の蛋白質を産生するか、それらを含有する動物内にできる
ように、本発明により加工処理された細胞は、生物全体、好ましくは動物、特に
ヒトを処置(modify)するために産生及び／または生体内で使用することもできる
。かかる用例としては遺伝子治療用途が挙げられる。

【００７０】アポトーシスの調節可能な始動を含む態様では、ラパログ−誘導可能な細胞死
を受け易い加工処理細胞を提供する。かかる加工処理細胞は、これらが不都合な
特性を持っていたり若しくは発現しても、またこれらがもはや有用でなかったり
、安全でなかったり、望ましくなくても、これらをその所望の目的(例えば、所望の蛋白質または他の産物の産生)に合わせて利用した後に、細胞培地または宿主生物から除去することができる。ラパログを培地に添加するか、これを宿主生
物に投与することによって除去することができる。かかる場合において、キメラ
の作用ドメインは、FAS若しくはTNF-R1の細胞内ドメインなどの蛋白質ドメイン、そのシグナル化経路の下流成分またはオリゴマー化時にアポトーシスを誘発す
る他の蛋白質ドメインである。

【００７１】かくして本発明は、本発明のラパログを添加することによって細胞内で生物学
的効果を得るための物質及び方法を提供する。本発明の方法は、本明細書に記載
の如く加工処理した細胞を提供し、かかる細胞をラパログに暴露することを含む
。

【００７２】例えば、本発明は、細胞内で標的遺伝子の転写を活性化するための方法を提供
する。本発明の方法は、(a)ラパログ−介在マルチマー化時に標的遺伝子の転写を開始し得る本発明の一連のキメラ蛋白質をコードするDNA構築物と、(b)マルチ
マー化事象に感受性の付随同系DNA配列(例えば、認識された、即ち、上記キメラ
蛋白質のDNA−結合ドメインと結合し得るDNA配列)に結合した標的遺伝子とを含有する細胞を提供することを含む。本発明の方法は、標的遺伝子を発現させるの
に有効量のキメラ蛋白質に結合し得るラパログに細胞を暴露することを含む。細
胞が培地で増殖する場合、ラパログへの細胞の暴露は、培地にラパログを添加す
ることによって実施することができる。細胞が宿主生物中に存在する場合、ラパ
ログへの宿主生物の暴露は、宿主生物にラパログを投与することによって実施す
る。例えば、宿主生物がヒトまたは非−ヒトである場合、ラパログは、経口、頬
内、舌下、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、関節内またはそのために好適なビヒク
ル中での吸入によって宿主生物に投与することができる。さらに、任意の補助構
築物の設計及びキメラ蛋白質用の構築物の設計に依存して、ラパログ−介在生物
学的事象とは、細胞機能、例えば、細胞成長、細胞増殖、遺伝子形質転換、また
はアポトーシスを導くシグナル形質導入；重要な遺伝子の欠失、重要な遺伝子の
発現の遮断、または重要な遺伝子の機能の阻害；重要な遺伝子の直接形質転換の
活性化であり得る。

【００７３】本発明はさらに、医薬的に許容可能なキャリヤ及び場合により一種以上の医薬
的に許容可能な賦形剤と混合した本発明のラパログを含む医薬組成物を包含する
。かかる医薬組成物を使用して、動物全体で加工処理した細胞で、例えば、本明
細書中に開示された任意の目的を達成するためのヒト遺伝子治療用途で、本発明
のキメラのマルチマー化を促進させることができる。

【００７４】言い換えれば、本発明は、本発明の加工処理細胞を含み、該細胞が必要な、動
物、好ましくはヒト患者において、本発明の目的、例えば、標的遺伝子(通常、治療蛋白質用の異種遺伝子)の形質転換の活性化、細胞成長若しくは増殖、細胞死または他の幾つかの選択した生物学的事象のいずれをもを達成する方法を提供
する。本発明の方法は、加工処理細胞の少なくとも一部でキメラ蛋白質のマルチ
マー化を起こさせるのに有効な量及び投与経路によりラパログを含有する医薬組
成物を動物に投与することを含む。マルチマー化は、標的遺伝子の発現の発生；
細胞成長、増殖若しくは死；または、キメラが設計され、細胞が遺伝子的に加工
処理される為の他の目標を検出することによって間接的に検出することができる
。

【００７５】本発明はさらに、患者で本発明の加工処理細胞内のキメラ蛋白質のマルチマー
化度を、全部または一部、阻害或いは減少させるため、及び標的遺伝子の転写を
失活させるか、本発明の別の生物学的効果を停止させるために、医薬的に許容可
能なキャリヤ及び、場合により一種以上の医薬的に許容可能な賦形剤と混合した
本発明のマルチマー化アンタゴニストを含む医薬組成物を包含する。かくして、
医薬組成物を製造し、その薬理効果を得るためにマルチマー化アンタゴニスト試
薬とマルチマー化ラパログを使用することは本発明に含まれる。

【００７６】本発明のラパログに感受性の宿主生物、好ましくは動物、通常非−ヒトほ乳類
またはヒト患者を提供する方法も開示する。本発明の方法は、本発明によって加
工処理した生物細胞に導入すること、即ちキメラ蛋白質をコードするひとつ以上
の核酸構築物を含ませることを含む。加工処理した細胞は、宿主生物に導入する
前に種々の物質及び方法のいずれかを使用してカプセルに封入することができる
。或いは、例えば、ウイルスベクター、注射によるDNAの導入またはカテーテルなどを使用して、宿主生物のひとつ以上の細胞に構築物を含ませることができる
条件下で、本発明の核酸構築物を宿主生物(例えば、ほ乳類)に導入することがで
きる。

【００７７】本発明のラパログに感受性の細胞を産生するキットも提供する。そのようなキ
ットは、ラパログ−介在オリゴマー化時に、所望の生物学的応答を誘発するキメ
ラの発現を導くことができ、コードする一種以上の核酸構築物を含有する。この
キットは、このキットの(単数または複数種類の)構築物によってコードされたキ
メラ蛋白質分子をマルチマー化することができる特定量のラパログを含有するこ
とができ、さらに特定量のマルチマー化アンタゴニストを含有することができる
。本発明のキットは、さらに、マルチマー化キメラ蛋白質分子の存在下で、同系
DNA配列に結合した遺伝子を転写させるダイマー化キメラ蛋白質によって認識され得る同系DNA配列に結合した標的遺伝子(またはクローニングサイト)をコードする核酸構築物を含有する。該構築物は、トランスフェクタント(transfectant)
を便利に選択するためのひとつ以上の選択マーカー並びに、原核生物での複製、
真核生物での発現などに有用な他の慣用のベクター要素と結合させることができ
る。該選択マーカーはそれぞれ異なる構築物毎に同一または異なっていてもよく
、かかる(単数または複数種類の)構築物をそれぞれ含有する細胞を選択すること
ができる。

【００７８】同系DNA配列と共同して標的遺伝子を細胞内に導入するための付帯構築物は、標的遺伝子の代わりにクローニングサイトを含有することができる。かかる構築
物を含有するキットによって、熟練者によって提供されるべき遺伝子の調節可能
な発現用の細胞を加工処理することができる。

【００７９】本発明の他のキットは、転写活性化剤またはDNA結合蛋白質の代わりにひとつ以上がクローニングサイトを含むキメラ蛋白質用のひとつまたは二つ(またはそれ以上)の核酸構築物を含有し得、ユーザーが求めるどんなドメインでも挿入することができる。かかるキットは場合により、上記の他の要素、例えば、予備選
択したDNA結合ドメイン用の同系DNA配列を任意に含む標的遺伝子用の核酸構築物
を含有することができる。

【００８０】いずれのキットも、ラパログに対して細胞を暴露するのに応じて(CAT、ベータ
−ガラクトシダーゼまたは任意の慣用の検出可能な遺伝子産物用)リポーター遺伝子を発現するように、本発明の構築物で確実に形質転換した正の対照細胞も含
有することができる。リポーター遺伝子の発現の検出及び／または定量用試薬も
提供することができる。

【００８１】本発明を実施するのに適用し得る設計、構築及びかかる系またはその成分の使
用におけるさらなる情報及び手引きに関しては、以下の文献：Spencerら、1993 、上記；Rivesaら、1996、上記；Spencerら、1996、Current Biology 6、839-
847；Luoら、1996、Nature、383、181-185；Hoら、1996、Nature 382、822-826
；Belshawら、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93、4604-4606；Spence
r、1996、TIG 12(5)、181-187；Spencerら、1995、Proc., Natl. Acad. Sci
. USA 92、9805-9809；Holsingerら、1995、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92、9810-9814；Pruschyら、1994、Chemistry&Biology 1(3)、163-172；及び
発行されたPCT国際公開第WO94/18317号、第WO95/02684号、同第WO95/33052号、第WO96/20951号及び同第WO96/41865号を参照されたい。

【００８２】本発明の重要な点は、上記または本明細書中の他の場所に記載したようなFKBP
及びFRB融合蛋白質を使用する用途で、蛋白質−蛋白質相互作用の媒介物質として改良ラパログ類を使用することである。改良ラパログ類は、ヒト及び他のほ乳
類を含む生物全体に存在するか、培地で増殖若しくは保持された遺伝子的に加工
処理された細胞での生物学的事象を誘発することを含む、根本的なダイマー化−
ベースの方法の種々の用途で使用することができる。改良ラパログ類は、生体外
での生物学的実験、遺伝子的に加工処理した細胞を含有する動物で実施した実験
で研究用試薬として、並びに遺伝子的に加工処理した細胞を含有する患者でのヒ
トの健康管理及び動物での予防薬または治療薬として有用である。ラパログ類本明細書中で使用する「ラパログ類：rapalogs」なる用語は、ラパマイシン(r
apamycin)の種々の類似物、同族体及び誘導体並びに、ラパマイシンに構造的に関連する他の化合物を含む種類の化合物を指すものとする。「ラパログ類」とし
ては、任意の数の種々の置換基を保持し、及び場合により、本明細書中、他にそ
れと反対の記載がない限り、ひとつ以上の炭素−炭素結合で不飽和である式Iに示されている構造を含むラパマイシン以外の化合物が挙げられる。

【００８３】

【化１１】

【００８４】ラパログ類としては、中でも、ラパマイシンに関連して以下の変形：C7、C42 及び／またはC29におけるメトキシの脱メチル反応、除去または置換；C13、C43 及び／またはC28のヒドロキシでの除去、誘導体形成または置換；C14、C24及び／またはC30のケトンの還元、除去または誘導体形成；5-員のプロリル環のついた6-員とピペコレート環の置換；及びシクロヘキシル環の一つ以上の置換基の除
去、誘導体形成若しくは置換またはシクロヘキシル環と置換若しくは非置換シク
ロペンチル環の置換、のひとつ以上を有するラパマイシンの変異体が挙げられる
。本明細書中で使用するラパログ類という用語はラパマイシン自体を含まず、C1
〜C30の酸素橋を含まないのが好ましい。ラパログ類の代表例としては表Iに列記
した文献に開示されている。C7で変形したラパログ類の例を表IIに示す。

【００８５】

【表２】

【００８６】

【表３】

【００８７】

【表４】

【００８８】他の代表的なラパログ類としては、表IIIに示したものがある。

【００８９】

【表５】

【００９０】

【表６】

【００９１】本発明の種々の態様の実施に特に重要なラパログ類としては、式II：

【００９２】

【化１２】

【００９３】 [式中、

【００９４】

【化１３】

【００９５】であり、 R^C7a及びR^C7bの一方はHであり、他方は、-H、ハロ、-R²、-OR¹、-SR¹、-OC(O)R¹ 、-OC(O)NHR¹、-NHR¹、-NR¹R²、-NHC(O)R¹、または-NH-SO₂-R¹であり、但し、R² =脂肪族、複素環式脂肪族、アリール、ヘテロアリールまたはアルキルアリール(
例えば、ベンジル若しくは置換ベンジル)であり、 R^C30はハロ、-OR³または(=O)であり、 R^C24は、=O、=NR⁴、=NOR⁴、=NNHR⁴、-NHOR⁴、-NHNHR⁴、-OR⁴、-OC(O)R⁴または-O
C(O)NR⁴、ハロまたは-Hであり、 R^C13及びR^C28は独立して、H、ハロ、-OR³、-OR⁵、-OC(O)R⁵、-OC(O)NHR⁵、-SR⁵-
、-SC(O)R⁵、-SC(O)NHR⁵、-NR⁵R^5'または-N(R⁵)(CO)R^5'であり、 R^C14は=O、-OR⁶、-NR⁶、-H、-NC(O)R⁶、-OC(O)R⁶または-OC(O)NR⁶であり、 R³はH、-R⁷、-C(O)R⁷若しくは-C(O)NHR⁷またはC28とC30を橋かけする環式部分( 例えば、カーボネート)であり、 R^C29はHまたはOR¹¹(例えば、OH若しくはOMe)であり、但し、それぞれの置換基は、他に記載しない限りいずれかの立体化学的配向で存
在することができ、但し、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁹、R¹⁰及びR¹¹はそれぞれ、独
立してH、脂肪族、複素環式脂肪族、アリール及びヘテロアリールから選択され；及び R⁸はH、ハロ、-CN、=O、-OH、-NR⁹R¹⁰、OSO₂CF₃、OSO₂R^4'、OCOR^4'、OCONR^4'R^5' またはOCON(OR^4')R^5'である]の化合物が挙げられる。

【００９６】式IIの幾つかのラパログ類は、R^C13が-OMeであり、R^C14がHであり；R^C14が-OH
、-O(CO)NHMe、-O-CH₂(即ち、スピロエポキシド)、=NCH₂CH₂-OHまたは-O-フェニ
ルであり；R^C13は-NHC(O)Meであり；R⁴は=NRまたは-NHRであり、但しRは-OH、O-
アルキル(メチル、エチル、イソブチル、ベンジル)、-NH-アルキルまたは、C24 におけるO-カルボキシメチルオキシム若しくはO-カルボキサミドメチルオキシム
であり；R^C24は-O(CO)NHCH(CH₃)₂であり；R^C24は-O(CO)NC(O)CH₂CH₂C(O)であり、R^C28はO-TBDMSであり；R^C28またはR^C30は-OC(O)Rであるか、R^C28及びR^C30は一
緒になって6-員環のC28及びC30を結合する-OC(O)O-を構成するか；またはR^C7aま
たはR^C7bはイソプロポキシル、-S-フェニル、2-チオフェン-イル、3-インドール
-イルまたはアリル若しくはメタリルであるという点で、ラパマイシンとは異なる。表III及びLiberlesら、1997、Proc Natl Acad Sci USA 94：7825-7830
を参照されたい。前述のもの以外のラパログ類、即ち、ラパマイシンの構造に関
して別の変形または変形の組合せを含むものは、本発明の実施で使用するのに好
ましい。かくして、本発明の改良ラパログ類は、表IIIに示された以外のラパログ類である。

【００９７】ラパマイシンでは、R^C7aは-OMeであり；R^C7bはHであり；R^C14、R^C24及びR^C30 は、それぞれ(=O)であり；R^C13及びR^C28はそれぞれ-OHであり；R^C29はOMeであり
；R³及びR⁴はそれぞれHであり、立体異性を持つ全てのものが１頁に示されている。本発明の実施で有用なラパログ類は、任意の可能な立体異性体配向(stereoi
someric orientations)の置換基を含むことができ、他の立体異性体を実質的に
含まないひとつの立体異性体(>90%、好ましくは>95%、モルベースで他の立体異性を含まない)を含むことができ、または立体異性体の混合物を含むことができる。

【００９８】上記化合物の医薬的に許容可能な誘導体も含まれ、ここで「医薬的に許容可能
な誘導体」とは、かかる化合物の全ての医薬的に許容可能な塩、エステル、若し
くはかかるエステルの塩、または患者に投与した際に、本明細書中に記載したラ
パログを(直接または間接的に)提供し得る全ての他の付加物若しくは誘導体、ま
たはその代謝産物若しくは残留物を指すものとする。医薬的に許容可能な誘導体
としては、中でもラパログ類のプロ-ドラッグ(pro-drug)がある。プロ-ドラッグ
とは、通常、かなり少ない薬理学的活性を持つ化合物の誘導体であり、除去し易
い追加の部分を含み、生体内で薬理学的に活性種としての親分子を産生する。プ
ロ-ドラッグの一例としては、生体内で開裂して重要な化合物を産生するエステルがある。ラパマイシン及び他の化合物の種々のプロ-ドラッグ、並びにプロ-ド
ラッグを創製するために親化合物を誘導体化する物質及び方法は公知であり、本
発明に適合させることができる。

【００９９】本明細書中で使用する「脂肪族」なる用語は、ひとつ以上の官能基で場合によ
り置換された、飽和及び不飽和の、直鎖(即ち、非分岐)、分岐、環式または多環
式脂肪族炭化水素類のいずれをも含むものとする。他に記載しない限り、アルキ
ル、他の脂肪族、アルコキシ及びアシル基は好ましくは1〜8個、多くの場合に1 〜6個の隣接脂肪族炭素原子を包含する。代表的な脂肪族基の例としては、例えば、ひとつ以上の置換基を保持し得る、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロ
ピル、シクロプロピル、-CH₂-シクロプロピル、アリル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、シクロブチル、-CH₂-シクロブチル、n-ペンチル、
sec-ペンチル、イソペンチル、tert-ペンチル、シクロペンチル、-CH₂-シクロペ
ンチル、n-ヘキシル、sec-ヘキシル、シクロヘキシル、-CH₂-シクロヘキシル部分などが挙げられる。

【０１００】置換基の例としては、-OH、-OR^2'、-SH、-SR^2'、-CHO、=O、-COOH(またはエス
テル、カルバメート、ウレア、オキシム若しくはそのカーボネート)、-NH₂(また
は置換アミン、アミド、ウレア、カルバメート若しくはそのグアニジノ誘導体) 、ハロ、トリハロアルキル、シアノ、-SO₂-CF₃、-OSO₂F、-OS(O)₂R¹¹、-SO₂-NHR ¹¹ 、-NHSO₂-R¹¹、サルフェート、スルホネート、アリール及びヘテロアリール部
分が挙げられる。アリール及びヘテロアリール置換基はそれ自体置換または非置
換(例えば、モノ-、ジ-及びトリ-アルコキシフェニル；メチレンジオキシフェニ
ルまたはエチレンジオキシフェニル；ハロフェニル；または-フェニル-C(Me)₂-C
H₂-O-CO-[C3-C6]アルキル若しくはアルキルアミノ)であってもよい。

【０１０１】「脂肪族」なる用語は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル
、シクロアルケニル、及びシクロアルキニル部分を含むものとする。

【０１０２】本明細書中で使用する「アルキル」なる用語は、直鎖、分岐及び環式アルキル
基を含む。類似の慣例が他の総称、例えば、「アルケニル」、「アルキニル」等
に適用される。さらに、本明細書中で使用する「アルキル」、「アルケニル」、
「アルキニル」等は置換及び非置換基のいずれをも包含する。

【０１０３】「アルキル」なる用語は、通常1〜8個、好ましくは1〜6個の炭素原子を有する
基を指す。例えば、「アルキル」はメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル
、シクロプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、シクロブチル、ペンチル、イソペンチル、tert-ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシルなどを指す。好適な置換アルキル類としては、こ
れらに限定されないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチ
ル、2-フルオロエチル、3-フルオロプロピル、ヒドロキシメチル、2-ヒドロキシ
エチル、3-ヒドロキシプロピル、ベンジル、置換ベンジルなとが挙げられる。

【０１０４】「アルケニル」なる用語は、通常2〜8個、好ましくは2〜6個の炭素原子を持つ
基を指す。例えば、「アルケニル」はプロプ-2-エニル、ブト-2-エチル、ブト-3
-エニル、2-メチルプロプ-2-エニル、ヘキセ-2-エニル、ヘキセ-5-エニル、2,3-
ジメチルブト-2-エニルなどを指す。2〜8個、好ましくは2〜6個の炭素を有する基を指す「アルキニル」なる用語としては、これらに限定されないが、プロプ-2
-イニル、ブト-2-イニル、ブト-3-イニル、ペント-2-イニル、3-メチルペント-4
-イニル、ヘキセ-2-イニル、ヘキセ-5-イニル等が挙げられる。

【０１０５】本明細書中で使用する「シクロアルキル」なる用語は、特に、3〜7個、好まし
くは3〜10個の炭素原子を有する基を指す。好適なシクロアルキル類としては、これらに限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シ
クロヘキシル、シクロヘプチルが挙げられ、他の脂肪族若しくは複素環式脂肪族
またはヘテロ環部分の場合には、場合により置換されていてもよい。

【０１０６】本明細書中で使用する「複素環式脂肪族」なる用語は、例えば、炭素原子の代
わりにひとつ以上の酸素、硫黄、窒素、リン若しくは珪素原子を含有する脂肪族
部分を指す。複素環式脂肪族部分は、分岐、非分岐または環式であってもよく、
複素環(例えば、モルホリノ、ピロリジニルなど)が挙げられる。

【０１０７】本明細書中で使用する「複素環」なる用語は、環式複素環脂肪族基を指し、好
ましくは全部で3〜10個の環原子を持ち、オキセタン、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、モ
ルホリン、ピペラジンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【０１０８】本明細書中で使用する「アリール」及び「ヘテロアリール」なる用語は、置換
または非置換であってもよい、3〜14個の炭素原子を有する安定な単環式若しくは多環式、複素環式、多環式、及び多複素環式の不飽和部分を指す。置換基とし
ては、上記置換基のいずれもが挙げられる。有用なアリール環基の非限定的な例
としては、フェニル、ハロフェニル、アルコキシフェニル、ジアルコキシフェニ
ル、トリアルコキシフェニル、アルキレンジオキシフェニル、ナフチル、フェナ
ントリル、アントリル、フェンナントロ等が挙げられる。典型的な複素環基の例
としては、5-員の単環基、例えば、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾ
リル、フリル、イソチアゾリル、フラザニル、イソキサゾリル、チアゾリルなど
；6-員の単環基、例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル
、トリアジニル等；多環式複素環基、例えば、ベンゾ[b]チエニル、ナフト[2,3-
b]チエニル、チアントレニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル
、フェノキサチエニル、インドリジニル、イソインドリル、インドリル、インダ
ゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、
キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾチアゾール、ベンズイミダゾール、テト
ラヒドロキノリンシンノリニル、ペリジニル(pteridinyl)、カルバゾイル、ベー
タ-カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ペリミジニル、フェナントロニル、フェナジニル、イソチアゾリル、フェノチアジニル、フェノキサジ
ニルなど(例えば、Katrizky、Handbook of Heterocyclic Chemistry参照)が挙げられる。アリールまたは複素環部分は、ヒドロキシ、C1-C8アルコキシ、C1-
C8分岐または直鎖アルキル、アシルオキシ、カルバモイル、アミノ、N-アシルア
ミノ、ニトロ、ハロ、トリハロメチル、シアノ及びカルボキシルからなる群から
選択される1〜5個で置換されていてもよい。かくしてアリール部分としては、例
えば、フェニル；ハロ(例えば、クロロ若しくはフルオロ)、ヒドロキシ、C1-C6 アルキル、アシル、アシルオキシ、C1-C6アルコキシ(例えば、メトキシまたはエ
トキシ、中でもジアルコキシフェニル部分、例えば、2,3-、2,4-、2,5-、3,4-ま
たは3,5-ジメトキシまたはジエトキシフェニルまたは例えば、メチレンジオキシ
フェニル、または3-メトキシ-5-エトキシフェニル)を含む群から選択されるひと
つ以上の置換基を保持する置換フェニル；または三置換フェニル、例えば、トリ
アルコキシ(例えば、3,4,5-トリメトキシまたはエトキシフェニル)、3,5-ジメト
キシ-4-クロロフェニルなど、アミノ、-SO₂NH₂、-SO₂NH(脂肪族)、-SO₂N(脂肪族
)₂、-O-脂肪族-COOH、及び-O-脂肪族-NH₂(ひとつまたは二つのN-脂肪族またはN-
アシル置換基を含有し得る)が挙げられる。

【０１０９】本発明の「ハロ」置換基は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード置換基で
あってもよい。フルオロが好ましいハロゲンであることが多い。

【０１１０】表IIIに記載した全ての化合物を除く、式IIの化合物が特に重要であり、重要な種類の新規化合物を構築する。この種の化合物は、1、2、3、4、5、6または7 個の置換基部分に関してラパマイシンとは異なっている。この種類としては、中
でも、ラパマイシンに対して、C7及びC13；C7及びC14；C7及びa；C7及びC43；C7
及びC24；C7及びC28；C7及びC30；C7、C13及びC14；C7及びa；C7、C13及びC43；
C7、C13及びC24；C7、C13及びC28；C7、13及びC30；C7、C14及びa；C7、C14及び
C43；C7、C14及びC24；C7、C14及びC28；C7、C14及びC30；C7、a及びC24；C7、a 及びC28；C7、a及びC30；C7、C24、C30及びa；C7、C24、C30及びC13；C7、C24、
C30及びC14；C24、C30及びC13；C24、C30及びa；C24、C30及びC14；並びにC24、
C30、C13及びaで変形を受けたラパログ類が挙げられ、但し、他に記載しない限り、表IIIに記載した全ての化合物を除く。

【０１１１】本発明の方法を実施するために特に重要な改良ラパログ類の下位集合としては
、R^C7aがOMe以外の部分である式IIの化合物(または医薬的に許容可能なその誘導
体)がある。この下位集合(C7ラパログ類)としては、R^C7a及びR^C7bの一方がHであ
り、他方が置換若しくは非置換アルケニル、アリール、ヘテロアリールまたは-Z
-脂肪族、Z-アリール、-Z-ヘテロアリール、若しくはZ-アシルであり、但しZ及びZ'は独立してO、S若しくはNHであり、アシルは-CHO、-(C=O)-脂肪族-、(C=O)-
アリール、-(C=O)-ヘテロアリール、-(C=O)-Z'-脂肪族、-(C=O)-Z'-アリール、-
(C=O)-Z'-ヘテロアリールを含む。この下位集合の特定の態様では、R^C7a及びR^C7 ^b は独立して、以下の基：H、置換若しくは非置換の2〜8個の炭素の直鎖、分岐若
しくは環式アルケニル、アルコキシまたはアルキルメルカプト；置換若しくは非
置換アリール、ヘテロアリール、アリールオキシまたはヘテロアリールオキシ、
アリールメルカプトまたはヘテロアリールメルカプトから選択される。この下位
集合の化合物としては、中でも、R^C7aがH；(R^C7bと一緒になって)=O；アルコキシ；アルキルメルカプト；アミノ(1゜、2゜若しくは3゜)；アミド；カルバメート；アリール若しくは置換アリール；フェニル若しくは置換フェニル；置換若し
くは非置換ヘテロアリール、例えば、置換若しくは非置換チオフェニル、フリル
、インドリルなど；或いはベンジルオキシまたは置換ベンジルオキシが挙げられ
る。本発明の方法を実施する場合に使用し得る他の代表的なC7ラパログ類及びC7
ラパログ類の種としては、R^C7a及びR^C7bの一方がHであり、他方が-OEt-、-O-プロピル、-O-ブチル、-OCH₂CH₂-OH、-O-ベンジル、-O-置換ベンジル(例えば、3- ニトロ-、4-クロロ-、3-ヨード-4-ジアゾ-、3,4-ジメトキシ-、及び2-メトキシ-
)、-S-Me、-S-フェニル、-O(CO)Me-、アリル、-CH₂C(Me)=CH₂、-OCH₂-CCH、-OCH ₂ -CC-Me、-OCH₂-CC-Et、-OCH₂-CC-CH₂-OHまたは-2,4-ジメトキシフェニル、2,4,
6-トリメトキシフェニル、フラニル、チオフェン-イル、メチルイオフェン-イル
、ピロリル及びインドリルから選択されるようなものが挙げられる。上記種類の
ラパログ類では、C43でのヒドロキシ置換基は、本明細書の他の場所に記載されているように立体化学的配向で存在するか、変形されていてもよい。C7ラパログ
類はさらに、1、2、3、4、5以上の他の位置でラパマイシンと異なっている。表I
IIに列記した以外のC7ラパログ類は新規であり、本質的に重要な組成物として本
発明に含まれる。

【０１１２】本発明の種々の方法を実施する際に特に重要な改良ラパログ類の別の下位集合
は、式IIのC30、C24ラパログ類、即ち、式IIのラパログ類(但し、R^C30及びR^C24 は、いずれも(=O)以外である)である。特に、R^C7aがOMe以外の部分であるC30、C
24ラパログ類が重要である。この下位集合の特定の態様では、R^C7a及びR^C7bは独
立して、-H、-OR¹、-SR¹、-OC(O)R¹または-OC(O)NHR¹、-NHR¹、-NHC(O)R¹、-NH-
SO₂-R¹及び-R²から選択され、但し、R^C7a及びR^C7bがHである限りは、R²=置換アリール若しくはアリル若しくはアルキルアリール(例えば、ベンジル若しくは置換ベンジル)である。この下位集合の特定の態様では、R^C30及びR^C24はいずれも、例えば、[S]配置の-OHである。別の態様では、R^C30及びR^C24は独立してOR³から選択される。この下位集合としては、中でも、R^C30及びR^C24がOHであり、R^C7a 及びR^C7bの一方が式IIで特定した位置で任意の代わりの置換基を含み、表IIまた
はIIIの化合物で識別した任意のC7置換基を含む、全てのラパログ類が挙げられる。この下位集合としては、中でも、部分aに関してラパマイシンと異なる他のラパログ類が挙げられる。例えば、この下位集合としては、式：

【０１１３】

【化１４】

【０１１４】 [式中、R^C7a及びR^C7bの少なくとも一方は-OMe以外のものである]の化合物が挙げ
られる。R^C7a及び／またはR^C7bの別の置換基としては、本明細書中、別に記載さ
れたものがある。特に、R^C7a及びR^C7bの一方が、場合により置換されていてもよ
い、環式脂肪族、アリール、複素環またはヘテロアリールである化合物が重要で
ある。この下位集合内に含まれる他の化合物としては、ヒドロキシル基の1、2、
3、4または5個がエピマー化、フッ素化、アルキル化、アシル化されているか、或いは他のエステル、カルバメート、カーボネート若しくはウレア形成によって
変形されているようなものが挙げられる。代表的な化合物例としては、C43のヒドロキシル基がエピマー化され、C28及びC30のヒドロキシル基がアルキル化、ア
シル化若しくはカーボネート形成によって結合されている式IIIの化合物がある。

【０１１５】特に重要な改良ラパログ類の別の下位集合としては、R^C13及びR^C28の一方また
はいずれもがFである、式IIの化合物がある。この下位集合の種々の態様では、式IIの1、2、3、4または5個の他の置換基がラパマイシンで知見される置換基と異なる。例えば、この下位集合では、以下の構造：

【０１１６】

【化１５】

【０１１７】

【化１６】

【０１１８】 [式中、R^C7a及びR^C7bは上記定義通りである]のC13フルオロラパログ類、C28フル
オロラパログ類、及びC13、C28-ジフルオロラパログ類が挙げられる。

【０１１９】特定の13-フルオロラパマイシン及び類似物並びにラパマイシン自体の免疫抑制活性を損なわない種々の置換基を含有するその誘導体を含む13-フルオロラパログ類は、免疫抑制剤として重要である。

【０１２０】上記下位集合の化合物の幾つかの興味深い点は、式II[式中、R^C24及びR^C30はいずれも(=O)以外のものであり、R^C13及びR^C28の一方またはいずれもがFである]
の化合物または医薬的に許容可能なその塩を含む一連の改良ラパログ類である。
この一連のラパログ類は、特に、24,30-テトラヒドロ-13-Fラパログ類、24,30- テトラヒドロ-28-Fラパログ類及び24,30-テトラヒドロ-13,28-diFラパログ類並びに上記の任意のC7変異体(但し、R^C7aはOMe以外である)が挙げられる。この一連のラパログ類は、以下の構造：

【０１２１】

【化１７】

【０１２２】 [式中、R^C7a及びR^C7bは上記定義通りである]により示される。これらの化合物は、ラパマイシン自体のC14及びC43置換基に関し、例えば、R^C ¹⁴ 及びR^C43の一方または両方での変形によってさらに誘導体形成することができ
る。

【０１２３】特に重要な改良ラパログ類の別の下位集合としては、式II[式中、R^C14はO、OH
またはH以外のものである]の化合物があり、例えば、ラパマイシンに対してひと
つ以上の他の変形が任意にされている、R^C14が-OR⁶、-NR⁶、-NC(O)R⁶、-OC(O)R⁶ または-OC(O)NR⁶の化合物がある。

【０１２４】重要な改良ラパログ類の別の下位集合としては、ラパマイシンに対して他の位
置でひとつ以上の他の変形が任意にされている、式II[式中、R^C13はC1-C4アルキ
ル部分を含むアルコキシ基以外のものである]の化合物がある。例えば、これらの下位集合としては、(a)C13でのOHの代わりに、C1-C4アルコキシ基以外の置換基R^C13、及び(b)C7でのMeOの代わりに上記定義の如き置換基R^C7a及びR^C7bで処理
することによりラパマイシンと異なるラパログ類が挙げられる。

【０１２５】重要な改良ラパログ類の別の下位集合としては、ラパマイシンに対して他の位
置でひとつ以上の他の変形がされている式II[式中、R^C24は=O以外である]の化合
物がある。

【０１２６】本発明の方法を実施する際に特に重要な改良ラパログ類の別の下位集合として
は、ラパマイシンの化学異性体である式II[式中、R^C7aは-OMeであり、但しR^C30 は=Oではなく、R^C24は=Oではなく、R^C13は-OHではなく、R^C14は=Oではなく及び／またはR³及び／またはR⁴はHではない]の化合物が挙げられる。

【０１２７】重要な他の改良ラパログ類としては、式II[式中、R^C14はOHである]の化合物が
ある。

【０１２８】さらに、本発明は、分子内のラパマイシンの1、2、3、4、5または6位置の炭素
-炭素二重結合の一つ以上が飽和されているか、例えば、C7、C13、C43、C24、C2
8及び／またはC30のひとつ以上の他の場所での変形と組み合わせた、改良ラパロ
グ類を含む。本明細書に開示の任意の化合物において、当業界で公知の方法を使
用して、C3、C4二重結合はエポキシ化され得；C6メチル基は-CH₂OHまたは-CH₂OM
eで置換され得；C43ヒドロキシはF、Cl若しくはHまたは他の置換基に転換され得
；及びC42メトキシ部分は脱メチル化され得るとも考えられる。同様に、部分「a 」は、以下の：

【０１２９】

【化１８】

【０１３０】の任意のものによって置換され得る。合成の手引き発酵または全合成によってラパマイシンを製造することは公知である。発酵生
成物として種々のラパログ類を産生することも公知である。これらの例としては
、中でも、ラパマイシンの特徴的なシクロヘキシル環またはピペコレート環に別
の部分を保持するラパログ類、並びにC7-デスメチル-ラパマイシン、C29-デスメ
チル-ラパマイシン及びC29-デスメトキシラパマイシンが挙げられる。

【０１３１】発酵によりラパマイシン及び種々のラパログ類を得る方法と同様に、ラパマイ
シン及び構造的に関連するマクロライド類の種々の化学変形を実施する方法及び
物質は公知である。ラパマイシン及び種々のラパログ類の種々のかかる化学変形
は上記表Iに記載の特許文献に開示されており、これらは化学合成及び生成物回収、精製並びに配合を当業者に示すために提供されたものであり、本発明の実施
で適用し得る。所望のラパログ類を製造するために使用し得る以下の代表的な変
形及び／または参考文献は例示である。

【０１３２】

【表７】

【０１３３】種々のフルオロ及びジフルオロラパログ類の合成に対するアプローチを以下に
概略的に示す。

【０１３４】

【化１９】

【０１３５】

【化２０】

【０１３６】種々の24,30-テトラヒドロラパログ類の合成に対するアプローチを以下に示す
。

【０１３７】

【化２１】

【０１３８】さらなる例として、ラパマイシンの代わりに13-フルオロラパマイシンで出発すると、対応する13-フルオロ-24,30-テトラヒドロC7ラパログが得られる。

【０１３９】他のC13誘導体の合成に関するアプローチのひとつを以下に示す。

【０１４０】

【化２２】

【０１４１】さらに、本発明で使用するためのラパログ類並びにかかるラパログ類を製造す
るための中間体は、例えば、KatzらのPCT国際公開第WO93/13663号及びCaneらの同第WO97/02358号に開示の直接生合成により製造することができる。さらなる生
物学的方法に関しては、Khawら、1998、J.Bacteriology 180(4)：809-814号も参照されたい。

【０１４２】本発明の新規ラパログ類は、本明細書中に示された開示内容により手引きされ
たとおりに当業者に公知の方法及び物質により当業者によって製造することがで
きる。例えば、方法及び物質は、上記引用の文献に参照されたかまたは示された
公知方法に適合することができ、かかる引用文献の内容は全て本明細書中、参照
として含まれる。さらなる手引き及び実施例が、本明細書中説明のため、及び実
施者への手引きとして提供される。当業者の化学者は上記記載に変形を施すこと
、例えば、合成時に感受性の部分に対して好適な保護基を加え、その後、もはや
必要がなくなった場合にはかかる保護基を除去することが容易であると考えられ
、他の合成アプローチを容易に決定することができるだろう。FKBPドメイン及び融合蛋白質 FKBP融合蛋白質は、FKBPドメインのペプチド配列の全てまたは一部を含有する
少なくともひとつのFKBPドメインと、少なくともひとつの異種作用ドメインとか
ら構成される。キメラ蛋白質は、直接結合測定(例えば、蛍光クエンチング)、競
合結合測定(例えば、FK506に対して)、FKBP酵素(ロータマーゼ：rotamase)活性の阻害、または他のアッセイ法により測定されるように、好ましくは約100nM未満のKd値、より好ましくは約10nM未満のKd値、、さらに好ましくは約1nM未満のK
d値で、本発明の改良ラパログに結合できなければならない。通常、キメラ蛋白質は、天然のFKBP蛋白質(例えば、PCT/US94/01617号に開示のヒトFKBP12)から選
択されたペプチド配列を含むひとつ以上の蛋白質ドメインを含有する。かかるペ
プチド配列は、10未満、好ましくは5未満のアミノ酸残基の置換、挿入または削除によって、結合特性を変化させることができる。かかる変形は、以下の結合プ
ロフィール(a)変性FKBPドメイン、またはそのドメインを含有するキメラに、加工処理すべき宿主細胞に対して内因性のFKBPまたはFKBP12に対してよりも(任意の測定により)好ましくは少なくとも1、より好ましくは少なくとも2、さらに好ましくは3若しくは4以上の大きなオーダーで改良ラパログを結合させること；及
び(b)加工処理すべき宿主細胞に対して内因性の他のFRB-含有蛋白質またはFRAP に対してよりも(任意の測定により)好ましくは少なくとも1、より好ましくは少なくとも2、さらに好ましくは少なくとも3の大きなオーダーでFRB融合蛋白質にF
KBPラパログ複合体を結合させること、の一方またはいずれをも得るように特定の態様で選択される。

【０１４３】 FKBPキメラは少なくともひとつの異種作用ドメイン、即ち、非-FKBPペプチド配列を含有する蛋白質ドメインも含有する。かかる作用ドメインは、例えば、本
明細書の別の部分またはPCT/US94/01617号若しくは他の引用文献に開示されてい
るように、DNA-結合ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞局在化ドメイン、細胞
内シグナル形質導入ドメイン等であってもよい。通常、作用ドメインは、例えば
、同一または異なる作用ドメインを含有する蛋白質のマルチマー化時に、選択し
た細胞位置にキメラ蛋白質を向けるか、または他の作用ドメインとの結合若しく
は凝集時に生物学的作用を開始することができる。

【０１４４】かかる融合蛋白質をコードする組換え体核酸は、親FKBP蛋白質(例えば、ヒトF
KBP12)をコードするDNAに選択的にハイブリダイズすることができるか、遺伝子コードの変質(degeneracy)がなければかかるハイブリダイゼーションが可能であ
る。これらのキメラ蛋白質は他の蛋白質から誘導した作用ドメイン(例えば、Ga1
4、VP16、FAS、CD3ゼータ鎖など)を含有するため、キメラ蛋白質をコードする組
換え体DNAは、他の蛋白質をコードするDNAに対して選択的にハイブリダイズする
ことができるか、遺伝子コードの変質がなければかかるハイブリダイゼーション
が可能である。

【０１４５】本発明のFKBP融合蛋白質並びに、以下詳細に議論するFRB融合蛋白質は、ひとつ以上の作用ドメインのひとつ以上のコピー及びひとつ以上の異なるリガンド結
合ドメインのひとつ以上のコピーを含有することができる。(単数または複数種類の)リガンド結合ドメイン(即ち、FKBP及びFRBドメイン)は、N-末端、C-末端で
あるか、または(単数または複数種類の)作用ドメインが点在していてもよい。リ
ガンド結合ドメインの複数のコピーを含有する態様としては、通常、2、3または
4つのコピーがある。例えば、FKBP融合蛋白質は2、3または4つのFKBPドメインを
含有することができる。FKBP誘導蛋白質(及び以下議論するFRB融合蛋白質)の種々のドメインは、場合により隣接ドメインの一つから誘導され得るか異種であり
得るペプチド領域と結合することによって隔てられている。

【０１４６】本発明の実施で有用なFKBP融合蛋白質の代表例としては、PCT/US94/01617号(S
tanford&Harvard)、PCT/US94/08008号(Stanford&Harvard)、Spencerら(上記)、P
CT/US95/10591号(ARIAD)、PCT/US95/06722号(Mitotix,Inc)及び本明細書中に引用した他の文献に開示のFKBP融合蛋白質；以下の実施例に開示のFKBP融合蛋白質
；FKBPドメインの一つ以上に10個以下(好ましくは1-5個)のアミノ酸挿入、欠如または置換を含有し、ラパマイシン若しくはラパログに結合し得る上記FKBP融合
蛋白質の任意の変形体；天然のFKBPドメインをコードするDNA配列に選択的にハイブリダイズし得るDNA配列によりコードされるFKBPドメインの一つ以上のコピーを含み、ラパマイシンまたはラパログに対して結合し得る上記FKBP融合蛋白質
の任意の変形体；ひとつ以上の異種作用ドメインが削除、置換されているか、ま
たは異なる異種作用ドメインが補われた上記任意の変形体；ラパマイシンまたは
ラパログに結合し得、非-ヒト源から誘導されたFKBPドメインを含有する上記FKB
P融合蛋白質の任意の変形体；及びそのアミノ酸残基の一つ以上が異なるアミノ酸により置換され、変形体がラパマイシンまたはラパログに結合し得る、ヒトFK
BP12のTyr26、Phe36、Asp37、Arg42、Phe46、Phe48、Glu54、Val55またはPhe99 に対応するひとつ以上のアミノ酸残基を含有する上記FKBP融合蛋白質の任意の変
形体が挙げられる。

【０１４７】例えば、多くの場合において、FKBP融合蛋白質は、ACTAGAによりコードされた
2-アミノ酸リンカーThr-Argにより隔てられたヒトFKBP12のアミノ酸1-107を含有
するFKBPドメインの複数のコピーを含み、DNAの連結生成物はそれぞれ制限エンドヌクレアーゼSpeI及びXbalにより消化される。以下の表に、上記FKBP12配列を
ベースとした変異体FKBPドメインの代表的な下位集合を示す。

【０１４８】

【表８】

【０１４９】注記：記載事項はレターコード１文字及び配列位置、続いて変異体でのアミノ
酸置換で天然アミノ酸を識別する。従ってF36Vは、位置36のフェニルアラニンが
バリンで置き換わったヒトFKBP12配列を表す。F36V/F99Aは、位置36及び99でフェニルアラニンがバリン及びアラニンでそれぞれ置き換わった二重変異体である
。FRBドメイン類及び融合蛋白質 FRB融合蛋白質は、少なくともひとつのFRBドメイン(本明細書中、別に記載されたFRAP蛋白質のペプチド配列またはその変異体の全てまたは一部を含み得る) と少なくともひとつの異種エフェクタードメインを含む。

【０１５０】一般的に、FRBドメイン、またはそれを含むキメラ蛋白質は、天然のFRBドメイ
ンを含む蛋白質コードするDNA分子、例えば、ヒト若しくは他のほ乳類のFRAP蛋白質または酵母蛋白質、Tor-1若しくはTor-2または上記Candida FRB-含有蛋白質をコードするDNA分子に選択的にハイブリダイズし得るDNA分子によってコード
される。本発明のFRBドメインとしては、FKBP蛋白質と本発明の改良ラパログの複合体に結合し得るものが挙げられる。

【０１５１】 FRB融合蛋白質は、本発明の改良ラパログとFKBP融合蛋白質により形成した複合体に結合できなければならない。好ましくは、FRB融合蛋白質は、慣用法により測定して、200μM未満、より好ましくは10μM未満のKd値でかかる複合体に結合する。FRBドメインは、FKBP融合蛋白質とラパログとの複合体に対して高い親和性を保持するのに十分な長さ及び組成である。FRBドメインは、約150アミノ酸
長未満にわたることがあるが、約100アミノ酸未満の場合もある。かかる領域のひとつは、Val2012からTyr2144に伸張するヒトFRAPの133アミノ酸領域を含む。C
hiuら、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：12574-12578を参照された
い。特に重要なFRB領域は、ヒトFRAPのGlu2025からGln2114にわたり、FKBP12-ラ
パマイシン複合体またはFKBP-ラパログ複合体に対する親和性を保持する。態様によっては、Q2214は90-アミノ酸配列から除去されて、これを89-アミノ酸FRBド
メインとする。FRBペプチド配列は、通常、10未満、好ましくは5未満のアミノ酸
の置換、挿入または削除によって結合特性を調整するために変形することができ
る。異種FKBP及びFRAP蛋白質とラパログとの複合体を形成するよりも、FKBP融合
蛋白質、FRB融合蛋白質及び改良ラパログのひとつ以上の分子を含む複合体が優先的に形成するように特定の態様ではかかる変形を選択する。好ましくは、優先
性は、(任意の方法で測定して)少なくとも1、より好ましくは少なくとも2、さら
に好ましくは3オーダーの大きさである。

【０１５２】かかる蛋白質をコードする組換え体DNAは、FRAP種をコードするDNAに選択的に
ハイブリダイズし得るか、遺伝子コードがなければかかるハイブリダイゼーショ
ンをすることができる。これらのキメラ蛋白質は、例えば、Gal4、VP16、Fas、C
D3ゼータなどの別の蛋白質から誘導したエフェクタードメインを含有するので、
キメラ蛋白質をコードする組換え体DNAは他の蛋白質をコードするDNAに選択的に
ハイブリダイズし得るか、遺伝子コードの変質がなければかかるハイブリダイゼ
ーションをすることができる。

【０１５３】本発明を実施するのに有用なFRBキメラの代表例としては、以下の実施例で開示するもの、異種ドメインのひとつ以上が別の異種ドメインで置き換わっている
か、ひとつ以上の追加の異種ドメインが補われているその変異体、FRBドメインのひとつ以上が非-ヒトペプチド配列由来のドメイン(例えば、Tor2またはCandid
a)である変異体、及び、キメラがFKBP蛋白質及び本発明の改良ラパログにより形
成された複合体に対して結合し得る限り、本明細書中に記載されているようなア
ミノ酸置換、置き換えまたは挿入によりFRBドメインが変形されている変異体が挙げられる。FRB融合蛋白質の代表例としては、上述の如くSpeI-Xbalサイトの結
合により形成したリンカーTHr-Argによって隔てられた、ヒトFRAPの少なくとも残基2025-2113にわたる配列を含有する、少なくとも89-アミノ酸のひとつ以上の
FRBを含有する。本発明の任意の融合蛋白質でのかかる制限サイトまたはリンカーは、サイト-特異性突然変異誘発などの慣用法を使用して、削除、置換または伸張することができる。混合キメラ蛋白質キメラ蛋白質の第三の種類としては、ひとつ以上のFKBPドメイン、ひとつ以上
の異種エフェクタードメイン、及びFRB融合蛋白質に記載のひとつ以上のFRBドメ
インを含む。

【０１５４】混合キメラ蛋白質分子は、これらが結合している改良ラパログの存在下で、ホ
モダイマーまたはホモマルチマー蛋白質複合体を形成し得る。混合キメラを含む
態様は、二つの組換え体核酸構築物の代わりに単一組換え体核酸構築物を細胞に
導入しなければならないという利点があるが、そうでない場合には、FKBP融合蛋
白質及びFRB融合蛋白質のいずれもの発現を誘導しなければならない。

【０１５５】混合キメラ蛋白質コードする組換え体DNAは、FKBP蛋白質をコードするDNA、FR
APをコードするDNA、及びひとつ以上のエフェクタードメインが誘導される蛋白質をコードする異種DNA配列(例えば、Gal4、VIP6、Fas、CD3ゼータ鎖など)に選択的にハイブリダイズし得るか、遺伝子コードの変質がなければかかるハイブリ
ダイゼーションをすることができる。異種ドメイン上述の如く、FKBP及びFRB融合蛋白質の異種エフェクタードメインとは、これらを保持するキメラ蛋白質の相互結合時に、標的遺伝子のDNA-結合及び／または
転写を誘発(または阻害)し；細胞成長、分化、増殖またはアポトーシスを始動さ
せ；特定の細胞の位置に蛋白質を向け；または他の生物学的事象を始動させるこ
とができる蛋白質ドメインである。

【０１５６】調節可能な遺伝子転写を含む態様は、第一及び第二のキメラ蛋白質の異種ドメ
インの結合またはマルチマー化に感受性のDNA要素の転写制御下で、(ポリペプチ
ド、アンチセンスRNA、リボザイムをコードする)標的遺伝子を含む標的遺伝子構
築物の使用を含む。

【０１５７】転写の直接活性化を含む本発明の態様では、第一及び第二のキメラ蛋白質の異
種ドメインは、以下に議論するDNA結合ドメイン(例えば、GAl4)またはキメラDNA
結合ドメイン(例えば、ZFHD1)、及び転写活性化ドメイン(例えば、VP16またはp6
5から誘導したもの)をそれぞれ含む。DNA結合ドメインを含有するキメラ蛋白質にかかる転写活性ドメインを含有するキメラ蛋白質をマルチマー化すると、DNA 結合ドメインが結合するプロモーター要素に対して転写アクチベータを標的とし
、プロモーター要素に結合した標的遺伝子の転写を活性化する。転写活性ドメイ
ンなしで済ませるか、または転写活性ドメインの代わりにリプレッサードメイン
で置換すると(PCT/US94/01617号参照)、標的遺伝子の転写を阻害するのに有用な
類似のキメラが得られる。これらが結合する複合体DNA結合ドメイン及びDNA配列
は上記Pomerantzら、1995に開示されており、その内容は本明細書中、参照として含まれる。かかる複合体DNA結合ドメインは、複合体DBDが結合する同系DNA配列を含有する標的遺伝子構築物と一緒に、本発明の実施でDNA結合ドメインとして使用することができる。

【０１５８】転写の間接的活性化を含む態様では、キメラの異種ドメインは、凝集時または
マルチマー化時に個々のプロモーターの制御下で転写活性を始動するシグナリン
グ蛋白質(signaling protein)のエフェクタードメインである。例えば、シグナ
リングドメインは、凝集時にIL-2プロモーターまたはその誘導体(例えば、反復N
F-AT結合サイト)に結合した遺伝子の転写を誘発する、T細胞レセプターのゼータ
下位集合の細胞内ドメインであってもよい。

【０１５９】本発明の別の態様では、異種ドメインは、相互結合時に、細胞死を誘発し得る
蛋白質ドメインである。かかるドメインの例としては、Fas抗原またはTNF R1の
細胞内ドメインがある。Fasドメインを含有するキメラ蛋白質は、PCT/US94/0161
7号に開示と似た方法により設計且つ製造することができる。加工処理されたレセプタードメイン上述の如く、FKBP及びFRBドメインは、天然のFKBP及びFRBドメインのペプチド
配列から選択したペプチド配列を含むことができる。天然の配列としては、ヒト
FRAPのFRBドメイン及びヒトFKBP12の配列がある。或いは、ペプチド配列はかかる天然のペプチド配列から誘導することができるが、かかるペプチド配列のひと
つまたはいずれにも10個未満、好ましくは1-5個の突然変異を通常含む。本明細書中、別に詳細を開示したように、かかる突然変異は多くの重要な特徴を与える
。例えば、FKBPドメインは、非変形FKBPドメインによりラパログに結合するのに
対して、少なくとも1、好ましくは2、より好ましくは3若しくは4以上のオーダー
の大きさでこれが優先的に改良ラパログと結合し得るように変形することができ
る。FRBドメインは、これが(変形または非変形)FKBPラパログ複合体に優先的に結合し得るように、即ち、非変形FRBドメインに対して、少なくとも1、好ましく
は2、より好ましくは3オーダーの大きさでより効率的に結合し得るように、変形
することができる。FKBP及びFRBドメインは、これらが改良ラパログと三分節計複合体を優先的に形成し得るように、即ち、非変形FKBP及びFRBドメインに対して、少なくとも1、好ましくは2、より好ましくは3オーダーの大きさでより効率的に形成し得るように、変形することができる。 (a)FKBP 種々の置換基(隆起：bump)を含有するFK506の誘導体に結合する高い能力を与えるFKBP突然変異を識別する方法は、PST/US94/01617号に開示された。同様の方
法を使用して、優先的に隆起(bumped)ラパマイシン誘導体(即ち、ラパログ類)に
結合する変形FKBPを得ることができる。ラパマイシンとFKBP12との間の複合体の
構造は、公知である(例えば、Van Duyneら., J. Am. Chem. Soc. 1991、1
13、7433-7434参照)。かかるデータを使用して、種々のラパログ置換基と調和し
ないアミノ酸残基を明らかにすることができる。このアプローチでは、分子モデ
ル化を使用して、(単数または複数種類の)ラパログ置換基と適応するFKBPドメイ
ンでの候補アミノ酸置換を識別することができ、サイト-方向性突然変異誘発を使用して、かく識別した蛋白質突然変異体を加工処理することができる。突然変
異体は標準的な方法により発現され、突然変異体が好適な活性/親和性を持つ場合には、ラパログ類への結合親和性は、例えば、ロータマーゼ(rotamase)活性の
阻害または、例えばFK506などの分子との結合を競合させることによって測定する。

【０１６０】特に、本出願人は、本発明の特定の改良ラパログ類(例えば、C-13またはC-14 でラパマイシンに対して変形させたラパログ類)は、残基Tyr26、Phe36、Asp37、
Tyr82及びPhe99の一つ以上が、より小さな側鎖(例えば、Gly、Ala、Val、Met及びSer)をもつアミノ酸で置換されているFKBPに対して優先的に結合すると考えて
いる。位置26または36で変形させた突然変異体FKBPの例は、上記「代表的な突然
変異体FKBP」に記載した。同様に、本出願人は、C20で変形させたラパログ類(即
ち、R4が-H以外のものであるラパログ類)が、Tyr82及び／またはIle56が他のアミノ酸、特により小さな側鎖のアミノ酸で置換されているFKBPに優先的に結合す
ると考える。別の例では、本出願人は、C24で変形させたラパログ類(即ち、Wが=
O以外のもの)は、Phe46、Phe48及びVal55の一つ以上が他のアミノ酸、特により小さな側鎖をもつアミノ酸で置換されているFKBPと優先的に結合すると考える。
さらに本出願人は、C28及び／またはC30で変形させたラパログ類(即ち、R3がH以
外のものであり、及び／またはVが=O以外のものである)は、Glu54が他のアミノ酸、特により小さな側鎖を持つアミノ酸で置換されているFKBPと優先的に結合す
ると考える。上記全ての例において、単一または複数のアミノ酸置換を実施する
ことができる。特定例は先の表に示してある。

【０１６１】単一または複数の突然変異体を反復して加工処理及びテストする別の方法は、
ひとつ以上のラパログまたはラパマイシン置換体であるか、これと接触する構造
的に識別された残基を相互無作為化(co-randomize)することである。識別された
位置(例えば、上記段落で記載)で無作為化されたFKBPドメインを含有するポリペ
プチドの集団は、慣用の合成または遺伝子法を使用して製造する。かかる集団は
、かかる位置のひとつ以上で置換アミノ酸を含有する一連のFKBPドメインを表す
。集団をふるい分け、所望のラパログ結合特性を保持するFKBP変異体を選択する
。通常、同時に幾つかの残基を無作為化すると、側鎖間で有益な共同相互作用の
可能性を最大化するため、所与の隆起ラパログに関して親和性及び特異性が高い
突然変異体を産生すると予測される。別のサイトで無作為化したライブラリーを
製造する方法は公知であり、変質オリゴヌクレオチドを使用するプライマー-誘導突然変異誘発、変質オリゴヌクレオチドを使用するPCR、及び変質オリゴヌクレオチドを使用するカセット突然変異誘発が挙げられる(例えば、Lowman、H.B.,
及びWells,.J.A. Methods：Comp. Methods Enzymol. 1991. 3, 205-216；
Dennis,M.S.及びLazarus,R.A. 1994、J. Biol. Chem. 269, 22129-22136；
及びその中の参照文献を参照されたい)。

【０１６２】本出願人はさらに、多くの場合において、ラパマイシンの所定の位置の、また
は殆ど直接接触するたった数個の残基の無作為化は、ラパログ置換基(隆起)を最
適に収容できるFKBPコンフォメーションで可能な変形を完全には探求できないと
考えている。かくして、隆起ラパログに優先的に結合する僅かな突然変異または
その組合せを識別するために、構造的な考察をベースとしたのではない無作為置
換を含む無作為ライブラリーも予測する。アラニン-スキャニング突然変異誘発(
例えば、Cunningham及びWells、1989、Science 244, 1081-1085)、PCRミスインコーポレーション突然変異誘発(例えば、Cadwell及びJoyce、1992、PCR Meth
. Applic. 2, 28-33参照)及び「DNAシャッフリング」(Stemmer、1994、Natur
e 370, 389-391及びCrameriら、1996、Nature Medicine 2, 100-103)などの幾つかの好適な突然変異誘発スキームが記載されてきた。これらの方法では、
無作為突然変異体のライブラリー、または一連の単一突然変異体を製造し、次い
でスクリーニングまたは選択アプローチにより研究する。

【０１６３】多くの場合において、所定の隆起に優先的に結合する最適な突然変異体を識別
する効果的な方法は、構造-ベースのアプローチと無作為アプローチとの組合せである。Clackson及びWells、1994、Trends and Biothechnology 12, 173-1
84(再調査)を参照されたい。例えば、本出願人は、重要な接触残基が変質オリゴ
ヌクレオチドにより無作為化されたライブラリーの構築物を予測したが、無作為
部位でさらに突然変異を導入するためにエラー-促進条件を使用して増幅を実施した。別の例としては、DNAシャッフリングを使用する構造-ベース及び無作為ラ
ンダムライブラリー由来の成分DNAフラグメントの構築物がある。

【０１６４】所望の突然変異用のライブラリーのスクリーニングは、酵母2-ハイブリッド系
(Fields及びSong、1989, Nature 340, 245-246)を使用して実施することがで
きる。例えば、FRB-VP16融合物は、ひとつのベクター、及び別のGAL4融合ベクタ
ーにクローニングされた無作為化FKBP配列のライブラリーに導入することができ
る。酵母同時形質転換体をラパログで処理し、ハーバーリング相補FKBP突然変異
体(harboring compelementary FKBP mutant)は、例えば、ベータ-ガラクトシ
ダーゼ若しくはルシフェラーゼ産生(ふるい)、または使用したベクターが好適で
あれば、本質的な栄養物を欠くプレート上での生存(選出)により識別する。FKBP
-FRAP相互作用に結合する隆起ラパマイシンの必要条件は、誤ったポジティブ(po
sitives)を除去するための有用なふるいである。

【０１６５】 FKBP(またはFRB)突然変異体のライブラリー由来の変形リガンド-結合ドメイン
を単離する別の方法では、Huら(Hu,J.C.,ら1990、Science. 250：1400-1403；再調査に関してはHu,J.C. 1995. Structure.3：431-433を参照されたい)により記載された機能的ダイマー形成に関する遺伝子選別を使用する。この方法では
、バクテリオファージラムダリプレッサーcIがホモダイマーとしてDNAに結合すること、及びオペレーターDNAにかかるホモダイマーが結合すると、ファージのライフサイクルの溶解素経路に含まれるファージ遺伝子の転写を妨げるというこ
とを利用する。機能的ラムダリプレッサーを発現するこれらのバクテリア細胞は
、ファージラムダを重複感染することによる溶解に対して免疫性である。リプレ
ッサー蛋白質は、カルボキシ末端ダイマー化ドメインに40個のアミノ酸フレキシ
ブルリンカーにより結合した、アミノ末端DNA結合ドメイン(アミノ酸1-92)を含む。単離したN-末端ドメインは、不十分なダイマー形成のため親和性が低いDNA に結合する。高親和性DNA結合は、異種ダイマー化ドメイン(例えば、GCN4ロイシ
ンジッパー)で復元することができる。Huらは、非常に多くの配列からラムダリプレッサーダイマー形成を仲介することができるGCN4ロイシンジッパー突然変異
体を単離するために遺伝子選択としてファージ免疫性を使用する系について記載
した(Huら、1990)。

【０１６６】例えば、隆起ラパログに相補的なFRAP突然変異体を識別するためにラムダリプ
レッサー系を使用するには、突然変異体FRAP配列を保持するラムダリプレッサー
FRAPライブラリーを、野生型のラムダリプレッサー-FKBP蛋白質を発現する大腸菌細胞に形質転換する。FRAP突然変異体を発現するプラスミドを、「隆起」ラパ
マイシン化合物及びラムダファージの高力価を含むバクテリアプレート上での溶
解に絶えるコロニーから単離する。或いは、FKBP突然変異体を単離するために、
上記方法を、野生型のラムダリプレッサー-FRAP蛋白質を発現する大腸菌細胞に形質転換した突然変異体FKBP配列を保持するラムダリプレッサー-FKBPライブラリーで繰り返した。

【０１６７】さらに別の方法としては、無作為化FKBP配列をファージディスプレー用にベク
ターにクローニングし、ラパログに最適に結合する変異体を生体外で選択するこ
とができる。生体外での親和性の選択は種々の方法で実施することができる。例
えば、ラパログ類を、親和性ハンドル(affinity handle)(例えば、ヘキサ-ヒス
チジンタグ、またはGST)でタグをつけた組換え体FRAPの存在下、溶液中でライブ
ラリーファージプールと混合し、得られた複合体を好適な親和性マトリックス上
で捕捉して、FKBPハーバーリング相補突然変異を示すファージ量を高める。ファ
ージディスプレー法は記載されてきたが、他の生体外選択系も考えられる(例えば、ラムダファージ上のディスプレー、プラスミド上のディスプレー、バキュウ
ロウイルス上のディスプレー)。さらに、選択及びふるい分け法を使用して、本発明の用途で有益な他の特性(例えば、生体内での高い安定性)を改善することが
できる。再調査に関しては、Clackson、T. & Wells,. J.A. 1994、Trends
Biotechnol. 12, 173-184を参照されたい。（ｂ）ＦＲＡＰ同様の考察は、大環状分子のＦＲＡＰ結合部分におけるラパマイシンに対する
変異を含有する（すなわち「バンプした」）改良されたラパログ(rapalog)に優先的に結合する成熟ＦＲＢ優性種の発生に当てはまる。例えば、ヒトFRAP FRB ペプチド配列に基づいてFRBで置換された-OMe以外の置換基をC7位に持つが残基T
ry2038、Phe2039、Thr2098、Gln2099、Trp2101およびAsp2101のうちの一以上のアミノ酸置換基を持つラパログを用いて優位結合を得ることができる。突然変異
種の例として、Y2038、Y2038L、Y2038V、Y2038A、F23039H、F23039V、D2102A、T
2098A、T2098NおよびT2098Lが挙げられる。C28で-OH以外の置換基を持つおよび／またはC30で＝O以外の置換基を持つラパログを使用してGhu2032に対するアミノ酸置換を持つFRAPに対する優位結合を得ることができる。突然変異種の例とし
て、Ｅ2032ＡおよびＥ20325が挙げられる。上記位置における１またはそれ以上のアミノ酸置換を有するFRBを含むタンパク質、タンパク質またはこれらの位置でランダム化された（すなわち、これらの残基において種々の置換アミノ酸を有
する）タンパク質のライブラリー、全タンパク質ドメインをランダム化するライ
ブラリーまたはこれらの一連の突然変異種の組み合わせは、上記の方法を用いて
バンプされたラパログと優位に結合する突然変異FRAPを同定して作成される。

【０１６８】ラパログと複合するFKBPタンパク質に対する候補突然変異FRBの親和性は、数多くの技術、例えば生体外翻訳されたFRB突然変異種の薬剤の存在下でGST-FKBP との結合（Chen et al., 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4947-4951）によりあるいは酵母二混雑検定（yeast two-hybrid assay）による適当なFKBP融
合タンパク質を有するラパログ依存転写活性複合体に関与する能力により検定す
ることができる。

【０１６９】所望の結合能力を有するFRB突然変異種は、種々の分類戦略を用いてファージ上に表示されたライブラリーから単離することができる。

【０１７０】本発明の種々の実施の形態において変化し得るFRB融合タンパク質の付加的な特徴は、使用されたFRBドメインの正確な配列である。ある用途において、最小（８９アミノ酸）FRBドメインより大きいFRBのタンパク質を使用することが好ま
しい。これらには、N-末端の残基Glu2025（好ましくは少なくともArg2018または
2174あるいはそれ以上）への延長並びに位置2113を越えてのC末端延長、例えば位置2113、2141または2174あるいはそれ以上への延長を含み、そしてこれは数例
において折返しFRBドメインの安定性および／または発現の効率を改善する。異なるFRB配列末端を使用してもよい他の用途はとして、長いリンカーが立体的利用でFRBドメインの一方または両方の部位において必要とされる、例えば細胞膜でのあるいはDNA上でのFRB−媒介タンパク質−タンパク質結合に必要とされるポ
リペプチド鎖の湾曲を収容するのに必要とされるものを含む。逆に、別の用途に
おいて、FRBドメインの一方または両方の部位上の短いリンカーは、生物学的機能に適当な異質エフェクタードメインを与えるのに好ましいあるいは必要とされ
る。ヒト遺伝子治療用途において、かかるリンカーの自然発生ヒトFRAP配列は、
一般に異質配列を導入するのにあるいは宿主器官における免疫応答を無効にする
危険性を低減するのに一般に好ましい。

【０１７１】いくつかのラパログ、特にFKBP結合ドメインとFRAP結合ドメインとの境界に位
置すると信じられる位置、例えばC28、C30、C7およびC24で（ラパマイシンに対する）変性または置換基を有するラパログは、哺乳類FKBPおよびFRBドメイン両方を有する複合体、特に自然発生ヒトペプチド配列を有するこれらのドメインを
有する複合体を形成するラパマイシンに対する能力が軽減されている。能力が軽
減されているとは、本明細書に記載された直接または間接検定手段により測定さ
れた結合親和性が減少したとしてあるいは適当な検定、例えばT細胞増殖検定で測定された免疫抑制活性が減少されたとして表される。かかる場合において、反
復方法を用いて自然発生ヒトペプチド配列を含む対応するドメインよりもより効
率的なラパログと複合化することができる突然変異種FKBPと突然変異種FRB対を同定することができる。例えば、まずその複合体と結合できる補完変性FKBPドメ
インを前述の通り同定し、ついでこの突然変異FKBPドメインをラパログとの複合
における親和マトリックスとして使用してそのラパログと結合できる補完変性FR
Bドメインを選択してもよい。かかる突然変異誘発およびスクリーニングの数サイクルを行ってタンパク質対を最適化してもよい。

【０１７２】いくつかの実施の形態に関して、タンパク質−タンパク質相互作用を影響でき
る突然変異を含むFRBおよび／またはFKBPドメインを使用するのが望ましい。例えば、あるラパログと結合した際に突然変異FRBよりも著しく有効性が低い内因性FRBと複合できる突然変異FKBPドメインは、とても興味深いものである。また興味深いのは、内因性FKBPとラパログとの複合体よりもはるかに有効である突然
変異FKBPと所定のラパログとの複合体と結合できる突然変異ドメインである。前
述のものと同様の選択およびスクリーニング研究法を使用して（ｉ）所定のラパ
ログおよび内因性FRBとの三者間複合体を形成するドメインの能力と著しく一線を画すFKBPドメインへのアミノ酸置換、削除または追加を特定し、(ｉｉ)所定の
ラパログと内因性FKBPとの三者間複合体を形成するドメインの能力と著しく一線
を画すFRBドメインへのアミノ酸置換、削除または追加を特定し、そして(ｉｉｉ
)パートナータンパク質における競合突然変異種を選択および／または他に同定することができる。三者複合体形成において有効性が減少した好適な突然変異FK
BPの例として、 His87およびIｌe90の一方または両者がアミノ酸、例えば大きい側鎖基を含むArg
、Trp、Phe、TyrまたはLysで置換された哺乳類、好ましくはヒトFKBPを含み；好
ましくは哺乳類、より好ましくはヒトペプチド配列を含むFRBをついで上記の通り突然変異誘発して突然変異FKBPおよび所定のラパログを有する競合変種を発生
してもよい。H87WまたはH87R hFKBP12とともに有効である代表的FRB突然変異種
は、Y2038がV、S、AまたはLで置換された；F2039がAで置換されたおよび／またはR2042がL、AまたはSで置換されたヒトFRBを含む。I90WまたはhFKB12を用いて有効な代表的FRB突然変異種は、K2095がL、S、AまたはTで置換されたヒトFRBである。

【０１７３】付加的に、本発明のレセプタードメインを最適化するにあたって、ポリペプチ
ドの免疫性がMHCタンパク質によるペプチドの結合および与えられたペプチドの内因性T−細胞レセプターとしての認識を必要とすると考えられることを理解すべきである。少なくともヒト遺伝子治療用途において、連結ペプチド配列を含む
所定の異質ペプチド配列を適合させ、これを免疫学的にヒトに与えられる蓋然性
を最小化するのが好ましい。例えば、ヒトMHCクラスI分子に結合するペプチドは
、結合したペプチドにおけるキー「アンカー」位置における一定の残基にたいす
る厳密な要求を有している。すなわち、HLA-A2は、ロイシン、メチオニンまたは
イソロイシンを２位でおよびロイシンまたはバリンをC-末端で要求する（論評に
ついては、Stern and Wiley (1994) Structure 2, 145-251を参照）。従って、本発明の実施においてタンパク質を操作する際に、これらの残基の周期は、避け
るのが好ましく、特にヒト遺伝子治療用途においては避けるのが好ましい。前述
のことは、以下に限定されるものではないがレセプタードメインへのポイント変
異誘発の操作を含む本発明の全てのタンパク質操作態様および種々のタンパク質
ドメイン間の境界の選択および設計に当てはまる。他の成分、設計特徴および用途キメラタンパク質は、異種ドメインとして細胞ローカリゼーションドメイン、
例えば膜保持ドメインを含んでもよい。PCT/US94/01617明細書、特に第26〜27頁
を参照のこと。手短に言うと、膜保持ドメインは、宿主細胞に対して内因性であ
るか否かにかかわらず取り扱いやすい膜−結合タンパク質から単離することがで
きる。膜保持細胞ドメインは、膜透過保持ドメイン、すなわち数多くのレセプタ
ーを含む細胞表面タンパク質の場合のように膜を横切って延長するアミノ酸配列
であり得る。膜透過ペプチド配列を延長して膜外および／または膜内ドメインの
一部または全てを架橋(span)することができる。代わりに、膜保持ドメインは、
脂質保持ドメイン、例えば細胞表面膜を結合させるミリスチル化またはパルミチ
ル化であってもよい。脂質膜保持ドメインは、通常膜とのN-末端結合に対する配
列をコードする5’末端とそしてC-端末結合に対する３末端の基部に添加される。脂質結合を与える後転写処理を伴うペプチド配列は、Carr, et. al., PNAS US
A (1988) 79, 6128: Aitken et al., FEBS Lett. (1982) 150, 314; Henderson,
et al., PANAS USA (1983) 80, 319; Schulz, et. al., Virology (1984), 123
, 2131; Dellman el al., Nature (1985) 314, 374に記載されており、そしてAn
n Rev. of Biochem (1988) 57, 69に論評されている。興味深いアミノ酸配列は、配列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-Rを含んでいる。種々のDNA配列を使用して本
発明の種々のキメラタンパク質におけるかかる配列をコード化することができる
。他のローカリゼーションドメインは、小器官−標的化ドメインおよびこれらを
小胞体に運ぶタンパク質を標的とする配列、例えば-K-D-E-L-および-H-D-E-L-並
びに(直接)転写制御に意図されたキメラタンパク質に特に有効である核ローカリ
ゼーション配列を含む。種々の細胞ローカリゼーション配列および信号は当該技
術分野に周知である。

【０１７４】細胞質信号初期化ドメイン、例えばCD3ゼータ鎖を含む種々のエフェクタードメイン、VP16およびGAL3等を含む核転写ファクタードメイン、Fas細胞質ドメインを含むアポプトシス（apoptosis）を誘発できるドメイン等を含むキメラタンパク質をコード化する構造の設計、組み立ておよび用途に関して対象となる本発
明の実施に使用することができる詳細については、PCT/US94/01917号明細書およ
びPCT/US95/10591号明細書に記載されている。後者の国際特許出願はさらに生物
医療研究における疾病モデルとして使用し得る遺伝子工学動物の製造に特に適用
できる付加的特徴も開示している。これらの特徴は、キメラタンパク質の発言の
ための構成における細胞特定制御要素の使用およびloxP配列により側面に接した
(flanked)興味深い遺伝子の除去を導く標的遺伝子としてのCreリコンビナーゼの
発言に対して制御された転写の用途を含む。代わりに、flpおよびその同族認識配列を、Creおよびloxの代わりに使用し得る。これらの特徴は、対象とする本発
明に適合し得る。

【０１７５】種々の場合において、特に本発明に従って遺伝子操作された細胞を含む全動物
に関連する実施の形態において、キメラタンパク質の種々のドメインを宿主細胞
として同一種のタンパク質から誘導することがしばしば好ましく、そして数例に
おいては必要である。従って、ヒト細胞の遺伝子操作のために異質ドメイン（並
びにFKBPおよびFRBドメイン）が微生物、酵母あるいは非ヒト源であるというよりむしろヒト器官であることがしばしば好ましい。

【０１７６】本発明者等はまた、エピトープタッグを本発明のキメラタンパク質に導入して
決定が容易になったことに注目する。組織特異性または細胞型特異発現所定の実施の形態において、キメラタンパク質を細胞特異的にまたは組織特異
的に発現させるのが好ましい。かかる発現の特異性は、キメラタンパク質をコー
ド化する１または複数のＤＮＡ配列を細胞型特異性転写制御配列（プロモータ／
エンハンサー）に結合操作することによって達成し得る。数多くの細胞型特異性
転写制御配列が公知である。その他のものは、細胞特異的方法で発現された遺伝
子から得ることができる。PCT/US95/10591号明細書、特に第36〜37頁参照。

【０１７７】例えば、キメラタンパク質を発現する構造は、選択された組織中の特異発現用
の公知の遺伝子から誘導された制御配列を含んでもよい。代表例を、表に示す。

【０１７８】

【表９】

【０１７９】

【表１０】

【０１８０】標的遺伝子構成キメラタンパク質がこれらのマルチマー化が標的遺伝子の転写を活性化するよ
うに設計された本発明の実施の形態において、適当な標的遺伝子構成を、遺伝子
操作細胞にも使用される。適当な標的遺伝子構成は、標的遺伝子および同族転写
制御因子、例えばキメラタンパク質のマルチマー化に応答性であるプロモータお
よび／またはエンハンサーを含むものである。転写の直接活性を伴う実施の形態
において、その応答性は、本発明のキメラタンパク質のDNA-結合ドメイン（すな
わちキメラタンパク質が結合するDNA配列）によって認識された１またはそれ以上のDNA配列の標的遺伝子構成の存在により達成し得る。転写の間接活性を伴う実施の形態において、その応答性は、キメラタンパク質のマルチマー化により発
生した細胞内信号により活性されるプロモータおよび／またはエンハンサーの標
的遺伝子構成の存在により達成し得る。例えば、キメラタンパク質がTCRゼータ鎖細胞内ドメインを含有する場合、標的遺伝子がIL-2プロモータ領域の発現制御
下で結合する。

【０１８１】本発明は、また(a)同族遺伝子配列、例えば本発明のDNA-結合キメラタンパク質が結合できる（または、上記の間接活性化に感受性である）DNA-結合および(b
)宿主細胞に対して内印性の所望の標的遺伝子の遺伝子座からの側面に接するDNA
配列を含む標的DNA構成も提供する。これらの構成は、内因性の標的遺伝子と結合した宿主内の同族DNA配列の異種同形組替えを認める。他の実施の形態において、構成は、同族DNA配列を含んでよくあるいは同族DNA配列は、遺伝子座により
提供し得る。

【０１８２】上記実施の形態のいずれかの標的遺伝子は、例えば表面膜タンパク質（例えば
レセプタータンパク質）、分泌タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、
リコンビナーゼ例えばCre、リボザイムまたはアンチセンスRNAをコード化し得る
。一般的構成および設計の詳細に関しておよび遺伝子治療を含む種々の用途に関
してはPCT/US94/01617を、そして疾病の動物モデルへの適用に関してはPCT/IS95
/10591を参照のこと。

【０１８３】本発明は、キメラタンパク質に関する種々の構成を包含する。しかしながら、
標的遺伝子転写の活性化を伴う全ての場合において、キメラタンパク質は、キメ
ラおよび標的遺伝子構造をコード化する構造を含む重要な特徴的細胞を分割し、
その不存在の場合よりマルチマー化リガンドの存在下に１倍以上、好ましくは２
倍以上より好ましくは３または４倍以上の多量のオーダーを発現する。細胞がマ
ルチマー化リガンドに曝されないあるいは曝されていない限り、選択された遺伝
子が観察されないのが最も望ましい。

【０１８４】再生するために、キメラタンパク質は、細胞が改良されたラパログ、すなわち
キメラのマルチマー化に続いて遺伝子操作された細胞内で検出可能レベルの標的
遺伝子を転写を開始することができる。従って、標的遺伝子の転写は、キメラタ
ンパク質をマルチマー化することができる改良されたラパログへの細胞の曝露に
続いて本発明の遺伝子工学操作された細胞内で活性化する。本発明の前記特異な
遺伝子工学操作された細胞は、前述の通りキメラタンパク質を含み、そしてこれ
らのキメラタンパク質分子をマルチマー化することができる改良されたラパログ
の存在および／または濃度に応答性である。その応答性は、標的遺伝子の転写の
活性により表される。かかる転写活性は、標的遺伝子の転写に関する従来の検定
法により容易に検出される。他の実施の形態において、キメラのリガンド−媒介
マルチマー化に対する生物学的応答は、標的遺伝子の転写の直接活性化というよ
りも細胞死または他の生物学的出来事である。ＤＮＡ構成の設計および組み立て構成は、原理、すなわち本明細書に記載の特許明細書および科学文献に開示さ
れた代表例および材料および方法に従って設計することができ、これらの明細書
および文献は変更および更なる実例をもって参考文献として本明細書に取り込ま
れている。構成の成分は、従来法により調製することができ、その際にコード化
配列および制御領域は、所望により適当なクローニング宿主中で結紮されクロー
ニングされ、制限または配列化またはその他の便利な方法により分析される。特
に、ＰＣＲを用いて、全部または一部の官能単位を含む個々のフラグメントを単
離死，その際に所望に応じて１またはそれ以上の突然変異を、「プライマー補修
」、結紮、生体外突然変異誘発等を用いて導入することができる。融合タンパク
質をコード化するDNA構成の場合、個々のドメインおよびサブドメインをコード化するDNA配列を、これらを細胞または細胞リセート(lysates)において全ての成
分ドメインを隠す単一ポリペプチドに翻訳できる融合タンパク質をコード化する
開いた読み枠を構成する。融合タンパク質をコード化するDNA構成は、次いで適当な細胞タイプ中のタンパク質の発現を導くベクター中に配置することができる
。コード化されたキメラの生物学的分析のために、微生物中のタンパク質または
リシクロサイト（reticulocyte）- リセートシステムにおけるタンパク質の発現
を導くプラスミドを構成するのが望ましい。哺乳類細胞におけるタンパク質の製
造に使用するため、タンパク質−コード化配列は、これらの細胞における発現を
導く発現ベクター中に導入される。このような用途に好適な発現ベクターは、当
該技術分野に周知である。種々の種類のかかるベクターが市販されている。

【０１８５】本発明のキメラタンパク質および標的遺伝子をコード化する構成は、１または
それ以上のDNA分子または構成として細胞中に導入することができ、そして数多くの場合において１またはそれ以上のマーカーと結合して構成を含む細胞宿主を
選択する。完了しそして適当な配列を持つことが示されたら、ついで構成は、い
ずれかの便利な方法によって導入される。構成は、エピゾーム複写することがで
きるベクター（例えばBPVまたはEBVベクター）中にあるいは宿主細胞の染色体に
統合するように設計されたベクター中に導入することができる。構成は、感染ま
たは修正のためにレトロウイルスベクターを含むアデノウイルス、アデノ関連ウ
イルス（AAV）または単純ヘルペスウイルス（HSV）等の非複製欠陥ウイルスゲノ
ム中に統合しパックすることができる。ウイルス輸送システムを以下に詳細に議
論する。代わりに、構成をDNA等の原形質融合、電気穿孔、バイオリスティッス(
biolistics)、燐酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、マイクロインジャクションにより導入することができる。宿主細胞を、数例において
構成を導入する前に成長させそして拡張し、次いで構成の導入に適当な処理を行
いそして宿主の統合を行う。首尾よく使用できる種々のマーカーは、hprt、ネオ
マイシンレジスタンス、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンレジスタンス等を
含み、そして種々の細胞表面マーカー、例えばTac、CD8、CD3、Thy1およびNGFレ
セプターを含む。

【０１８６】数例において、異種同形組替えのための標的部位を有することができ、その際
、構成が特定の遺伝子座で統合されているのが望ましい。例えば、本発明の組替
え標的構成による異質同形遺伝子（同一遺伝子座または他の場所で）削除および
／または置換することができる。異質同形組替えのために、一般にΩまたはO− ヴェクターを使用することができる。例えば、Thomas and Capecchi, Cell (198
7) 51, 503-212; Mansour, et al., Nature (1988) 336, 348-352およびJoyner
el al., Nature (1989) 338, 153-156を参照のこと。

【０１８７】構成は、全ての遺伝子をコード化する単一DNA分子または１種またはそれ以上の遺伝子を有している異なる遺伝子として導入することができる。構成は、同時
にまたは連続して各々同一または異なるマーカーを用いて導入することができる
。

【０１８８】有効因子を含有するベクター、例えば構成DNAのストックを製造しトランスフェクションを実施するための微生物または酵母器官の複製、プロカリトス(proca
rytos)または真核生物における発現のための選択可能および／または拡大可能な
マーカー、プロモータ／エンハンサー因子および哺乳類発現制御因子等は、当該
技術分野に周知であり、市販されている。核酸の輸送：生体外および生体内異質同形核酸を宿主細胞、特に真核細胞、動物細胞、好ましくはヒトまたは非
ヒト哺乳類細胞に導入するいかなる手段を本発明の実施に適用することができる
。この議論の目的のために、本明細書に記載される種々の核酸構成を遺伝形質転
換体という。DNA輸送の生体外研究法は、燐酸カルシウム沈降、電気泳動、リポフェクションおよびウイルスベクターを介する感染を含む。二種類の一般的生体
内遺伝子治療研究法は、（ａ）「裸の」脂質複合またはリポゾーム配合あるいは
その他の配合されたDNAの輸送および（ｂ）異質同形核酸のウイルスベクターを介する輸送を含む。最初の研究法において、DNAの配合、例えば脂質による配合に先立って、所望のDNA構造を運ぶ遺伝形質転換体を有するプラスミドをまず発現に実験的に最適化することができる（例えば5’未翻訳領域へのイントロンの取り込みおよび不要配列の削除（Felgner, et al., Ann NY Acad Sci 126-139,
1995）。次いでDNAの例えば種々の脂質またはリポゾーム材料による配合を公知の方法および材料を用いて行い、そして受取哺乳類に輸送することができる。

【０１８９】種々のウイルスベクターを本発明の実施に使用することができるが、レトロウ
イルスAAV-およびアデノウイルスに基づく研究法が特に興味深い。例えば、Dunb
ensky et al., (1984) Proc Natl Acad Sci. USA 81, 7529-7533; Kaneda et al
., (1989) Science 243, 375-378; Hiebert et al., (1989) Proc Natl Acad Sc
i. USA 86, 3584-3598; Hatzoglu et al., (1990) J. Biol. Chem. 265, 17285-
17293およびFerry et al., (1991) Proc Natl Acad Sci. USA 88, 8377-8381を参照のこと。ウイルスベクターの選択および使用に対する以下の付加的案内は、
専門家に有用である。

【０１９０】レトロウイルスベクターレトロウイルスは、RNAゲノムが感染細胞におけるDNAに逆転写された種類のRN
Aウイルスである。レトロウイルスゲノムは、宿主細胞ゲノムに統合することができ、そして３個のウイルス遺伝子、gag、polおよびenv並びにウイルス長末端繰り返し（LTR）を要する。ウイルス（ψ）のパッケージング配列は、ウイルスR
NAを細胞内で他のRNAと区別させる（Verma et al., Nature 389: 239-242, 1997
）。異質遺伝子の発現のため、ウイルスタンパク質をウイルスベクター中の興味
深い遺伝子で置き換え、次いでこれを、ウイルスパッケージング成分を含むパッ
ケージングラインにトランスフェクションする。パーケージされたウイルスをパ
ッケージングラインから培養培地に分泌させ、ついでこれを培養液中の細胞に感
染させるのに使用することができる。レトロウイルスが非分割細胞を感染するこ
とができないので、これらは、生体外遺伝子治療に最初に使用されている。

【０１９１】 AA ベクターアデノ−関連ウイルス（AAV）に基づくベクターは、筋肉および肺を含む種々の組織への運搬媒体として興味深い。AAVベクターは、細胞を感染し、そして細胞質ゲノムと高い頻度で安定して統合する。AAVは、感染してそして成長−抑制細胞（例えば肺上皮）に統合することができ、そして非毒性である。

【０１９２】代表的に使用されるAAVに基づく発現ベクターは、有効制限部位を直接使用してあるいは制限酵素による遺伝形質転換体の摘出に続いて末端の鈍化、適当なDN
Aリンカーの結紮、制限消化およびITR間の部位への結紮のいずれかにより遺伝形
質転換体のサブクローニングに使用することができる制限部分を側面に接する14
5ヌクレオチドAAV反転末端繰り返し（ITP）を含んでいる。AAVベクターの容量は
、約4.4kbである。種々のAAVに基づくベクターおよび種々のプロモータ／エンハ
ンサーを使用して以下のタンパク質が発現されている。すなわち、ネオマイシン
ホスフォトランスファーゼ、クロランフェニコールアセチルトランスファーゼ、
ファンコニー貧血遺伝子、小嚢繊維症透膜コンダクタンスレギュレータおよび顆
粒球マクロファージコロニーー刺激因子である(Kotin, R. M. Human Gene Thera
py 5: 793-801, 1994,表I)。本発明の種々のDNA構造を導入する遺伝形質転換体は、同様にしてAAVに基づくベクター中に包含される。融合タンパク質をコード化する組替えDNAの発現を誘導する構成プロモータ、例えばCMVの取り込みに代え
て、AAVプロモータを使用することができる（ITRそれ自身またはAAV p5(Flotte
, et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993)）。

【０１９３】かかるベクターをAAVビリオン中に報告された方法によりパッケージすることができる。例えば、ヒト細胞ライン、例えば２９３を、内因性AAVプロモータまたは異種同形プロモータの制御下でAAVに基づく発現ベクターおよびAAVrepおよびcapをコード化する開いた読み枠を有する他のプラスミドとともにトランスフェクションすることができる。ヘルパーウイルスの不存在下に、repタンパク質R
ep68およびRep78は、複製形態の蓄積を防ぐがアデノウイルスまたはヘルペスウイルスでの超感染すると、これらのタンパク質は、ITR（遺伝形質転換体を含む構成中にのみ存在）からの複製を認め、そしてウイルスカプサイドタンパク質の
発現を認める。このシステムは、遺伝形質転換体DNAをAAVビリオン中にパッケー
ジする(Carter, B. J. Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539, 1992;
Kotin, R. M, Human Gene Therapy 5: 793-801, 1994)。AAVの力価を改良する方
法を使用してAAVビリオン中に遺伝形質転換体を発現することができる。かかる戦略は、、細胞ライン中でのITR側面が接する遺伝形質転換体の安定発現に続いて第二プラスミドでのトランスフェクションによりウイルスパッケージを導く方
法；AAVタンパク質を誘導して発現する細胞ライン、例えば温度感受性誘導発現または薬学誘導発現の使用を含むがこれに限定されるものではない。付加的に、
AAV形質導入の効率を、Wiloson et al,mWO96/39530に開示されているような一本
鎖形態の二本鎖形態への転換を促進する薬剤で細胞を処理することによって増加
することができる。

【０１９４】ウイルスの濃縮および純化は、報告された方法、例えば生体内AAVベクターの初期報告に使用されていたような塩化セシウム傾斜におけるバンディング（Flot
te et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993）またはO’Riordan et al., によるWO97/08298公報により達成することができる。

【０１９５】遺伝形質転換体の導入方法および材料、遺伝形質転換体を含むAAVベクターの遺伝および純化およびその細胞および哺乳動物をトランスフェクションする用途
を含む本発明の対象の実施に有効なAAV技術における付加的な詳細な案内に関して、例えばCarter et al., 米国特許第4,797,368号明細書（1989年1月10日）、M
uzyczka et al., 米国特許第5,139,941号明細書（1992年8月18日）、Lebkowski
et al.,米国特許第5,173,414号明細書（1992年12月22日）、Strivastava,米国特
許第5,252,479号明細書（1993年10月12日）、Lebkowski et al., 米国特許第5,3
54,678号明細書（1994年10月11日）、Shenk et al., 米国特許第5,436,146号明細書（1995年7月25日）、Chatterjee et al., 米国特許第5,454,935号明細書（1
995年12月12日）、Carter et al., WO93/24641号公報（1993年12月9日公開）およびFlotte et al., 米国特許第5,658,776号明細書（1997年8月19日）を参照のこと。

【０１９６】アデノウイルスベクター種々のアデノウイルスベクターが遺伝子をヒトを含む哺乳類に運ぶのに有効で
あることが示されている。複写欠如アデノウイルスベクターを使用して肺上皮に
おけるマーカータンパク質およびCFTRを発現している。第一の発生E1a削除アデノウイルスベクターがウイルスタンパク質をほとんど発現しず従って免疫システ
ムに対する標的のウイルス感染細胞を少なくする温度感受性E2aタンパク質を誘導する第二の発生により改良されている(Goldman et al., Human Gene Therapy
6:839-851, 1995)。より最近になって、全てのウイルスの開いた読み枠が削除さ
れたウイルスベクターが報告されている(Fisher et al., Virology 217:11-12,1
996)。さらにウイルスIL-10の発現がアデノウイルス抗原に対する免疫応答性を阻害することが報告されている(Qin et al., Human Gene Therapy 8:1356-1374)
。

【０１９７】数多くのアデノウイルス型のDNA配列が遺伝子バンクから入手できる。アデノウイルスDNA配列は、現在同定されている41ヒトアデノウイルス型のいずれかから得ることができる。種々のアデノウイルス株がアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(Rockville, Maryland)からあるいは市販またが学術源からの要求によって入手可能である。本明細書に記載される遺伝形質転換体は、アデノ
ウイルスベクターおよび輸送プロトコルにCFTRまたは他の遺伝子をベクターに挿
入するのに使用されているのと同一の方法 (制限消化、リンカー結紮または末端
の充填および結紮) で導入することができる。選択された部分のアデノウイルス
配列すなわち遺伝形質転換体または他の従来のベクター制御因子を側面に接する
5’および3’AAV ITR配列を含有するハイブリッドアデノウイルス-AAVベクター
カプシドも使用することができる。例えば、Wilson1 et al.,国際特許出願公開W
O96/13598を参照のこと。本発明の対象を実行するのに有効なアデノウイルスおよびハイブリッドアデノウイルス-AAV技術に対する付加的詳細な案内について、
Wilson1 et al.,WO94/28938、WO96/13597およびWO96/26285並びにこれらに引用されている文献を参照のこと。

【０１９８】一般に、DNAまたはウイルス粒子は、生物学的相溶性溶液または薬学的許容し得うる輸送媒介、例えば滅菌食塩水または他の水性あるいは非水性等張滅菌注入
溶液または懸濁液に移されるが、リンガー燐酸緩衝液または他の同様の媒介を含
むこれらの例は当該技術分野に周知である。

【０１９９】好ましくは、遺伝子治療用途において、DNAまたは組替えウイルスを十分な量で投与して細胞を悪影響なしに治療効果をもたらすレベルでトランスフェクショ
ンする。DNAおよびウイルスの最適投与量は、他に記載したように種々の因子に依存し、そして患者によりいくぶん変化することができる、再び、ウイルスの治
療有効投与量は、約１×10₇〜約１×10₁₀pfuウイルス／ｍｇ、例えば約１×10₈ 〜約１×10₉pfuウイルス／ｍｇを含有する生理食塩水溶液約20〜約50ｍｌの範囲
で考慮される。宿主細胞本発明は、動物細胞の操作およびかかる操作された動物細胞の使用を伴う用途
に非常に有効である。動物細胞は、昆虫、虫または哺乳動物であることができる
。例えばウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミおよび非ヒト霊長類細胞を含
む種々の動物細胞を使用することができるが、ヒト細胞が特に興味深い。種々の
種のうち、例えば細網内皮、神経、膠(glial)、間充繊、皮膚、筋肉（平滑筋細胞を含む）、脾臓、造血組織、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸管、肺、繊維芽細
胞およびその他の型の細胞等の種々の型の細胞を使用することができる。特に興
味深いのは、エリトロイド、リンパまたは骨髄性単核球結合並びに筋芽細胞およ
び繊維芽細胞を伴ってもよい核化細胞のいずれかを含む細網内皮系細胞である。
血統および先祖細胞、例えば造血組織、神経、間質(stromal)、筋肉、肝臓、肺、胃腸管および間充填繊茎細胞である。

【０２００】細胞は、自己細胞、合着細胞、異地性(allogenic)細胞であることができ、数例においては目的とする宿主器官に対して異種細胞であってもよい。細胞は、主
要組織適合性複合体（「MHC」）プロファイルを変化させることによって、官能性クラスIMHC分子の形成を防ぐためにβ２−マイクログロブリンを不活性化する
ことによって変性することができ、クラスIIの不活性化は１またはそれ以上のMH
C分子の発現をもたらし、細胞毒性活性に関連する遺伝子の発現を増加または不活性化することによって細胞毒性能を増加または不活性する。

【０２０１】いくつかの例において、細胞が特定の特異性、例えば特定の抗原特異性または
帰着標的部分特異性を有するT細胞およびB細胞を有する場合特異性クローンまた
はオリゴクローンが興味深い。構造の動物への導入 DNA構造で生体外変性された細胞を選択的条件下で培養液中で成長させ、そして所望の構造を有するものとして選択された細胞を次いで、拡張しそして例えば
宿主細胞中の構造の存在を測定するポリマラーゼ鎖反応および／または所望の遺
伝子生成物の製造の検定を用いてさらに分析することができる。変性宿主細胞が
同定されたら、次いでこれらを計画にあわせて例えば培養液中での成長あるいは
宿主器官への導入に使用することができる。

【０２０２】細胞の性質に依存して、細胞を宿主器官、例えば哺乳動物に種々の方法で導入
することができる。造血組織細胞を、管系への接種により投与することができ、
通常細胞約10₄以上、および一般的には細胞10₉以下存在する。利用する細胞の数
は、状況の数、導入の目的、細胞の寿命、使用プロトコル、例えば投与の回数、
細胞の増殖能力、治療剤の安定性、治療剤の生理的要求等に依存するであろう。
一般に、筋芽細胞または繊維芽細胞について、例えば細胞の数は、104以上で109
以下であり、分散液として一般には興味深い部位またはその近傍に注入される。
細胞は、生理学的適用媒体中にある。

【０２０３】本発明により操作された細胞も、宿主器官または治療タンパク質の製造のため
の患者に移植される前に、たとえば従来の生体適合性材料および方法を使用して
カプセル化することができる。Hguyen et al., Tissue Implant System and Met
hods for Sustaining viable High Cell Densities within a Host、米国特許第
5,314,471号明細書(Baxter International, Inc); Uludag and Sefton, 1993, J
. Biomed. Nater. Res. 27 (10):1213-14 (HepG2 cells/hydroxyethyl methacry
late-methyl methacrylate membranes); Chang et al., 1993, Hum Gene Ther 4
(4): 433-40 (mouse Ltk-cell expressing hGH/immunoprotective perm-select
ive alginate microcapsules; Reddy et al., 1993, J Infect Dis 168 (4): 10
82-3 (alginate); Tai and Sun, 1993, FASEB J 7 (11):106-9 (mouse fibrobla
st expressing hGH/alginate-poly-L-lysibe-alginate membrane); Ao et al.,
1995, Transplantation Proc. 27 (6): 3349, 3350 (alginate); Rajotte et al
., 1995, Transplantation Proc. 27 (6): 3389 (alginate); Lakey et al., 19
95, Transplantation Proc. 27 (6): 3266 (alginate); Korbett et al., 1995,
Transplantation Proc. 27 (6): 3212 (alginate); Dorian et al., 米国特許第5,429,821号明細書(alginate); Emerich et al., 1993, Exp Neurol 122 (1):
37-47 (polymer-encapsulated PC12 cells); Sagen et al., 1993, J. Neeuros
ci 13(6):2415-23 (bovine chromaffin celss encapsulated in semipermeable
polymer membrane and implanted into rat spinal subarachnoid soace); Aebi
scher et al., 1994, Exp Neurol 126 (2): 151-8 (polymer-encapsulated rat
PC12 cells implanted into monkeys; (Aebischer et al.のＷＯ92/19595も参照
); Savelkoul et al., 1994, J Immunol Methods 170(2):185-96 (encapsulated
hybdridomas producing antibodies; encapsulated transfected cell lines e
xpressing various cytokines); Winn et al., 1994, PNAS USA 91(6): 2324-8
(engineered BHK cells expressing human nerve growth factor encapsulated
in an immunoisolation polymeric device and transplanted into rats); Emer
ich et al., 1994, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 18 (5): 935-
46 (polymer-encapsulated engineered BHK cells implanted into rats); Kord
ower et al., 1994, PNAS USA 91(23); 10898-902 (polymer-encapsulated engi
neered BHK cells expressing hNGF implanted into monkeys)およびBulter et
al WO95/04521(encapsulated device)を参照のこと。次いで細胞は、カプセル化
された形態で動物宿主に、好ましくは哺乳類およびより好ましくはヒト被験者に
その要求において導入される。カプセル化材料は、カプセル化された細胞により
製造された分泌タンパク質の宿主に放出させる半透過性であることが好ましい。
数多くの実施の形態において、半透過性カプセル化は、カプセル化細胞を導入す
る宿主器官から免疫学的に単離されたカプセル化を与える。これらの実施の形態
において、カプセル化すべき細胞は、宿主種のタンパク質および／またはウイル
スタンパク質または宿主種とは異なる種からのタンパク質から誘導された成分ド
メインを有する１またはそれ以上のキメラタンパク質を発現する。例えば、この
ような場合において、キメラは、GAL4およびVP16から誘導された要素を含むこと
ができる。細胞は、受容者とは異なる１またはそれ以上の個体から誘導すること
ができ、そして受容者器官または患者と異なる種から誘導することができる。

【０２０４】細胞の生体外変性の代わりに、数多くの状況においては生体内で変性すること
が望まれる。この目的のために、標的組織および細胞を生体内で変性する種々の
技術が開発されている。トランスフェクションを認めそして数例においてはウイ
ルスを宿主に統合させる数多くのウイルスベクター、例えば前述の通りアデノウ
イルス、アデノ関連ウイルスおよびレトロウイルスが開発されている。例えば、
Dunbensky et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7529-7533; Kaneda
et al., (1989) Science 243, 375-378; Hiebert et al., (1989) Proc Natl A
cad Sci. USA 86, 3584-3598; Hatzoglu et al., (1990) J. Biol. Chem. 265,
17285-17293およびFerry et al., (1991) Proc Natl Acad Sci. USA 88, 8377-8
381を参照のこと。ベクターは、注入、例えば静脈内または筋肉内、吸入または他の非経口モードにより投与することができる。非ウイルス輸送法、例えばリポ
ゾームとの複合体を介したDNAの投与または注入、カテーテルまたはバイオリスティック(biolistics)も使用することができる。

【０２０５】生体内遺伝子変性によると、変性の方法は、組織の性質、必要とされる細胞変
性の効率、細胞の導入すべきDNA組成物への到達可能性等に依存する。標的翻訳開始領域を持つ、弱められたあるいは変性されたレトロウイルスを利用すること
によって、ウイルスを製造しそして近傍細胞をトランスフェクションする目的で
所望により対象とする翻訳因子構造の一つを使用してウイルスを活性化すること
ができる。

【０２０６】 DNA導入は、全ての場合統合の必要はない。いくつかの状況において、導入された一時的保持で十分である。この方法において、細胞が宿主に導入され次いで
所定期間後、例えば細胞が特定の部位へ帰着した後に定まる短時間効果でよい。
結合性、検出ラパマイシンは、ヒトタンパク質、FKBP12と結合し、そしてhFKBP12およびFRA
P、酵母タンパク質TOR1およびTOR２に対するヒト写しと３部分複合体を形成する
ことが知られている。ラパログは、ヒトタンパク質、FKBP12（または融合タンパ
ク質またはFRBドメインを含むフラグメント）と結合しおよび／またはヒトFKBP1
2およびヒトFRAPと３部分複合体を形成する能力に関して特徴付け、そしてラパマイシンと比較することができる。WO96/41865(Clackson et al.)参照のこと。その明細書は、ヒトFKBP12に結合しあるいは各々ヒトFRAPのヒトFKBP12およびFR
Bドメインを含むタンパク質との三部複合体を形成する(即ち「ヘテロダイマー化
」)ことができる種々の材料および方法を開示している。かかる検定は、結合を測定する蛍光極性検定を含む。さらに、化合物の三部複合体を形成する能力を、
化合物の存在下に遺伝子操作された哺乳動物細胞により製造されたレセプター遺
伝子生成物の観察レベルにより間接的に測定する細胞に基づく翻訳検定も含まれ
る。対応する細胞に基づく検定は、遺伝子操作された酵母細胞中で行うこともで
きる。例えばWO95/33052（Berlin et al.）参照のこと。

【０２０７】本発明のラパログを生理学的適合性とし（例えば使用すべき細胞または器官に
対する不適当な毒性を欠如させる）、動物により経口投与可能とし（即ち、治療
を含む全ての動物における用途に経口活性である）、および／または特定の用途
に必要であるように細胞または他の膜間を横切ることができることがしばしば好
ましい。

【０２０８】加えて、好ましいラパログは、原生または自然発生イムノフィリンに渡って突然変異種イムノフィリン（限定しないが、Phe36が異なるアミノ酸、好ましくは嵩張るR基が少ないアミノ酸、例えばバリンまたはアラニンにより置換されたヒトFKBP）に優位に結合するものである。例えば、かかる化合物は、科学的に正
当なあるいは当該技術分野に認められた検定方法により測定してヒトFKBP12に結
合するより良好な度合い以上で突然変異FKBPに優位に結合することができ、数例
においてはヒトFKBP12に結合するより２または３倍以上の度合いで突然変異FKBP
に優位に結合することができる。

【０２０９】ヒトFKBP12、その変種あるいはその他のイムノフィリンに対する本発明の種々
のラパログの結合親和性は、FKBPの場合において使用された公知の方法の適用に
より測定することができる。例えば、当業者は、興味あるタンパク質への公知の
リガンドの結合と競合する本発明の化合物の能力を測定することができる。例え
ば、Sierkierka et al., 1989, Nature 341, 755-757(test compound competes
with binding of labeled FK506 derivative to FKBP)を参照のこと。

【０２１０】本発明の一組の好ましいラパログは、直接結合測定(例えば、蛍光消去)、競合
結合測定（例えば、対FK506）、FKBK酵素活性の抑制（ロタマーゼ）あるいはその他の検定法で測定してKd値約200ｎM未満、より好ましくは約50ｎM未満、より一層好ましくは約10ｎM未満、さらに一層好ましくは約１ｎM未満でヒトFKBP12、
上記の突然変異種あるいはかかるFKBPドメインを含む融合タンパク質と結合する
。かかる化合物の一サブセットにおいて、FKBPドメインは、36位置でのふぇにる
アラニンが嵩張りの少ない側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン、バリン、メ
チオニンまたはセリンで置換されたものである。

【０２１１】競合結合FP検定を、以下の実施例に詳細に記載する。その検定は、標識FKBPリ
ガンドとの競合においてFKBPタンパク質へのその結合能力を反映する化合物、例
えばFK506に対するIC50値の生体内測定を認める。

【０２１２】本発明の化合物の好ましい群は、競合結合FP検定において、所定のFKBPドメイ
ンおよびリガンド対、例えばヒトFKBP12または蛍光化されたFK506により10個まで、好ましくは５個までのアミノ酸置換を有するその変種に対して1000nM以上、
好ましくは300nM以上、より一層好ましくは10nM以上良好なIC50値を有しているラパログである。その群のあるサブセットにおいて、FKBPドメインは、36位にお
いて上記のいずれかの変性を有している。

【０２１３】ラパログのキメラタンパク質をマルチマー化する能力は、かかるマルチマー化
が引き起こされた出来事の発生を測定することによって細胞に基づく検定におい
て測定することができる。例えば、1種またはそれ以上のFKBPドメインおよび１種またはそれ以上のエフェクタードメインを含む第一のキメラタンパク質をコー
ド化する発現DNA並びにFRBドメインおよびマルチマー化の際に生物学的応答を動
機付けることができる1種またはそれ以上のエフェクターを含む第二のキメラタンパク質を含有し発現することができる細胞を使用する。さらにキメラタンパク
質のマルチマー化に応答性のある制御要素（すなわちプロモータ）の転写制御下
でレセプターをさらに含有する細胞を使用することが好ましい。代表的化合物の
設計および調製ならびにこれを操作された細胞に使用することは、WO96/ 41865
およびこのセクションおよび上記のセクションに引用された他の国際特許出願に
記載されている。細胞を細胞中で成長させるかあるいは保持する。ラパログを培
養培地に添加しそして好適な温置時間後（遺伝子発現および分泌させるために、
例えば数時間または一晩）、レセプター遺伝子生成物の存在を測定する。陽性の
結果が得られる。すなわち、マルチマー化はレセプター遺伝子生成物の出現によ
り観察されるレセプター遺伝子の転写と関連する。レセプター遺伝子生成物は、
便利に検出可能なタンパク質（例えばELISAにより）であり、あるいは便利に検出可能な生成物（例えば発色）の生成を触媒することができる。かかる検定を行
うための適当な細胞ラインを製造するための材料および方法は、このセクション
における上記国際特許出願に開示されている。代表的に使用される標的遺伝子を
例示すると、SEAP、ｈGH、ベーターガラクトシダーゼ、グリーン・フルオレセン
ト・プロテインおよびルシファーゼが挙げられ、便利な検定が市販されている。

【０２１４】本発明の別の好ましい群は、FKBPドメインを含む融合タンパク質に基づく２−
ハイブリッド転写検定における検出信号を含むことができるものである。FKBPド
メインが野生種ヒトFKBP12以外のFKBPドメインであることが好ましい。

【０２１５】 FKBPに基づく転写検定のようなキメラタンパク質をマルチマー化するラパログ
の能力を測定する他の検定は、かかるマルチマー化により誘発された出来事の発
生を測定する細胞に基づく検定である。この場合、検出可能な生成物を構造上発
現する細胞を使用する。この細胞は、１種類またはそれ以上のイムノフィリン誘
導リガンド結合ドメインおよびマルチマー化の際に細胞死を誘発することができ
る１種類またはそれ以上のエフェクタードメイン、例えばFAS細胞内ドメインを含むキメラタンパク質をコード化する発現DNAを含み、そしてこれを発現することがきる。かかる遺伝子操作された細胞に代表的に使用される設計および調製は
、WO95/02684号公報に記載されている。また、WO96/41865号公報も参照のこと。
細胞を細胞成長または連続生存可能な培養培地中で維持しそして培養する。この
細胞または培地を、構造的繊維生成物の存在について検定し、従ってレセプター
のベースラインレベルが確立される。HGHの構造生成物またはレセプターとして作用する他の便利な検出可能な生成物に関して遺伝子操作された細胞を使用する
ことができる。供試化合物を培地に添加し、細胞を温置して、そして細胞溶解産
物または培地を１回またはそれ以上の時間点においてレセプターの存在について
試験する。レセプター製造が減少することは、細胞死を表し、融合タンパク質の
マルチマー化の間接測定となる。

【０２１６】本発明の別の好ましい群は、かかるFKBP/FRBに基づいたアポプトシス検定にお
ける検出信号を誘発することができるものである。FKBPドメインが野生型ヒトFK
BP12以外のFKBPドメインであることが好ましい。いくつかの場合において、FKBP
ドメインを上述の通り変性する。また、FRBドメインも、ヒトFRAPからの野生型F
RB以外のFRBドメインであることが好ましい。いくつかの例において、FRBドメイ
ンを、上述の通り2098位において変性する。

【０２１７】かかる検定を行うと、当業者は、所望のIC50値および／または野生方ヒトFKBP
12にわたる突然変異FKBPに対する結合優位性を有するラパログを選択することが
可能となる。競合結合FP検定によると、所望のIC50値および／または対照、例え
ばFK506に対して突然変異FKBPまたは野生型FKBPの結合優位性を有するモノマーまたはラパログを選択することが可能となる。用途ラパログは、WO94/18317、WO95/02684、WO96/20951、WO95/41865公報に記載の
通りに、例えば所望の遺伝子の転写を制御下に活性化し、標的遺伝子を削除し、
アポトシスを動機付けし、あるいは遺伝子治療用途を含む培養液中または全器官
中での操作された細胞を成長させるその他の生物学的事項を誘発するのに使用す
ることができる。以下に本発明の対象の用途の例示を行うがこれに限定されるも
のではない。１．制御遺伝子治療数多くの例において、所望に応じて治療遺伝子のスイッ
チオン／オフする能力または正確に発現を滴定する能力は治療効率に重要である
。本発明は、ヒト遺伝子治療に関する治療標的遺伝子の制御下での発現を達成す
るのに非常に適合している。一例は、一対のキメラタンパク質（一方は少なくと
もFRBドメインを含有し、他方は少なくともFKBPドメインを含有している）を使用することであり、本発明の改良されたラパログはキメラおよび発現すべき標的
遺伝子構成を二量化することができる。キメラタンパク質の一つは、DNA−結合ドメイン、好ましくは上述のPomerantz et alに記載の通り複合DNA-結合ドメインを異種同形エフェクタードメインとして含む。第二のキメラタンパク質は、転
写活性ドメインを異種同形エフェクタードメインとして含む。改良されたラパロ
グは、両キメラに結合することができ、従ってキメラを効率的に架橋することが
できる。コード化しそしてこれらのキメラタンパク質の発現を導くことができる
DNA分子を遺伝子操作すべき細胞に導入する。遺伝子操作された細胞またはその子孫を改良されたラパログと接触させると（これを動物または患者に投与するこ
とによって）、転写因子複合体を組み立て、従って標的遺伝子が発現する。同様
な成分の設計および使用は、PCT/US93/01617号明細書およびWO96/41865公報(Cla
ckson et al)に記載されている。実際に、標的遺伝子発現のレベルは、キメラ転
写因子複合体の数および濃度の関数であるべきであり、順に改良されたラパログ
の濃度の関数であるべきである。（改良されたラパログの）応答遺伝子発現の投
与量が代表的に観察される。

【０２１８】改良されたラパログを、標的遺伝子の転写を活性化させるのに望まれるように
患者の投与することができる。改良されたラパログの結合親和性、所望とされる
応答、投与の方法、ラパログの生物学的半減期および／または標的遺伝子mRNA、
遺伝子操作された細胞の存在数に依存して、種々のプロトコルを利用することが
できる。改良されたラパログは、非経口的にあるいは経口的に種々の経路により
投与することができる。投与の回数は、上記の因子に依存するであろう。改良さ
れたラパログは、錠剤、粉末または分散剤として経口接種、口腔、舌下、静脈内
、腹腔内，筋肉内、皮下注射により、吸気等により接種することができる。種々
の経路の投与のための当該技術分野に周知の従来の方法および材料を用いて改良
されたラパログ（およびモノマーアンタゴニスト化合物）を配合することができ
る。正確な服用量および投与の特定の方法は、前述の因子に依存し、しして主治
医またはヒトまたは動物ヘルスケア提供者により決定することができる。大部分
については、投与の方法は経験により決定されるであろう。

【０２１９】改良されたラパログによる転写活性を補うか終了するかの事項において、改良
されたラパログに競合するモノマー化合物を投与してもよい。従って、逆反応ま
たは治療効果を終了させる要求の場合において、迅速な逆転が要求される場合に
はダイマー化剤に対するアンタゴニストを便利な方法で、特に静脈内接種により
投与することができる。代わりに、不活性化ドメイン（または転写サイレンサー
）をリガンド結合ドメインとともに存在させることができる。別の研究法におい
て、上記の通りFasまたはTNFを通じた信号化を介してアポトシスにより除去する
ことができる。国際特許出願PCT/US94/01617およびPCT/US94/08008号明細書を参
照のこと。

【０２２０】いずからの用途のための改良されたラパログの特定の服用量は、治療服用量監
視に使用される方法に従って決定することができ、その際に特定のレベルの発現
が長期間に渡って、例えば２週間以上にわたって必要とされる場合あるいは反復
治療がある場合、改良されたラパログの個々のまたは反復服用量は、間隔を延長
して、例えば2週間以上短時間にわたって服用する。時間発現レベルを与えそして治療応答を観察するように所定範囲内の改良されたラパログの服用量が与えら
れそして応答について監視される。時間間隔および治療応答の際に観察されたレ
ベルに依存して、応答に従って時間により多くまたはより少ない服用量が提供さ
れる。この方法は、治療範囲の服用量が得られるまで対話式に繰り返される。改
良されたラパログを長期間投与した場合、改良されたラパログの維持服用量を決
定すると間隔を伸ばして検出を行い細胞システムが適当な応答および発現生成物
のレベルを提供することを確認する。

【０２２１】システムは、多くの変数、例えば改良されたラパログに対する細胞応答、発現
の効率および所望により分泌のレベル、発現生成物の活性、時間および環境によ
り変わり得る患者の特定の要求、個々の細胞または発現活性の損失の結果生じる
細胞活性の損失率等に左右される。２．組替えタンパク質およびウイルスの製造市販および研究目的の組替え治
療タンパク質の製造は、しばしばタンパク質を高れ別で発現するために遺伝子操
作された哺乳類細胞ラインの使用を介して達成される。微生物または酵母という
よりむしろ哺乳類細胞を使用することは、適当な機能jのタンパク質が同形異種細胞では一般に行われない後翻訳変性を要求する場合に示される。この方法で工
業的に製造されるタンパク質の例は、赤血球タンパク質、組織プラスミノーゲン
アクチベーター、凝固因子、例えばファクターVIIIc、抗原等が挙げられる。この方法でタンパク質を製造するコストは、遺伝子操作された細胞において達成さ
れる発現のレベルに直接関連する。かかるタンパク質の製造に当たっての第二の
制限は、宿主細胞に対する毒性である。すなわち、タンパク質発現は、細胞を高
密度で成長するのを防ぎ、制御された遺伝子治療に関して記載した通り製造レベ
ルが著しく減少する。従って、タンパク質発現を厳密に制御する能力がタンパク
質製造の不存在下で高密度で細胞を成長させる。最適細胞密度に達した後にだけ
、遺伝子の発現が活性化されそしてタンパク質生成物が引き続いて収穫される。

【０２２２】同様な問題点は、工業的に組替えウイルスの製造（例えば遺伝子治療）または
実験的使用のための「パッケージングライン」の構成および使用においても遭遇
する。これらの細胞ラインは、遺伝子操作されて欠損組替えゲノムを隠す感染性
ウイルス粒子の組み立てに必要とされるウイルスタンパク質を製造する。かかる
パッケージングラインに依存するウイルスベクターとして、レトロウイルス、ア
デノウイルス、アデノ関連ウイルスが挙げられる。後者の場合において、パッケ
ージングラインから得られるウイルスストックの力価は、ウイルスレップまたは
核タンパク質の製造のレベルに直接関連する。しかしながら、これらのタンパク
質は、宿主細胞に対して非常に毒性である。従って、高い力価の組替えAAVウイルスを発生するのが困難であることが判った。本発明は、レップおよび核遺伝子
をここに記載する設計の制御可能な転写因子の制御下で配置するパッケージング
ラインを構成することによって、この問題の解決手段を提供する。パッケージン
グ細胞を高密度で成長させ、ヘルパーウイルスで感染させ、そして組替えウイル
スゲノムによりトランスフェクションすることができる。次いで、パッケージン
グ細胞によりコード化されたウイルスタンパク質の発現を、ダイマー化剤の添加
により誘導してウイルスを高力価で製造させる。３．生物学的研究本発明は、標的遺伝子にわたる正確な制御が望まれる幅広
い範囲の生物学的実験に適用可能である。これらは、（１）生化学的純化に興味
深いタンパク質またはRNAの発現；（２）その生物学的機能を評価する目的で組織培養細胞（または遺伝子操作細胞を介した生体内）中での興味深いタンパク質
またはRNAの制御した発現；（３）その生物学的機能を評価する目的で動物遺伝形質転換体動物における興味深いタンパク質またはRNAの制御した発現；（４）その遺伝子の生物学的機能を評価する目的で遺伝形質転換体に対して作用する他
の制御タンパク質、リボゾームまたはアシスタンス分子をコード化する遺伝子の
発現を制御することを含む。本発明の成分が適用される遺伝形質転換体動物モデ
ルおよび他の用途は、PCT/US95/10591号明細書に記載したものを含む。

【０２２３】本発明は、さらに上記用途に有効なキットを提供する。かかるキットは、本発
明のキメラタンパク質をコード化しキメラタンパク質の発現を導くことができる
（および上述の通りの付加的成分を含んでよい）DNA構造を含み、そして遺伝子転写の制御を伴う実施の形態においては、キメラタンパク質のマルチマー化によ
って活性化される1種またはそれ以上の転写制御因子に結合した標的遺伝子を含む標的遺伝子構成を含む。代わりに、標的遺伝子構成は、所望の標的遺伝子を当
業者によって導入するためのクローニング部位を含んでもよい。かかるキットは
、二つの組替えタンパク質をダイマー化し、そして標的遺伝子の転写を活性化す
るダイマー化剤のサンプルを含んでもよい。配合、服用量および投与タンパク質−タンパク質相互反応を促進する能力により、本発明のラパログを
、薬学的組成物、本発明の遺伝子操作された細胞を含有するヒトおよび非ヒト哺
乳類における本発明のキメラタンパク質の複合体の配合を促進する方法に使用し
てもよい。

【０２２４】かかる処置または予防の好ましい方法は、哺乳類に本発明の遺伝子操作された
細胞中のかかる複合体の著しい配合を促進するあるいは好ましくはかかる複合化
により誘発された所望の生物学的出来事の著しい動機付け、例えば標的遺伝子の
転写、遺伝子操作された細胞のアポトシス等の出来事の動機付けを促進する有効
量の化合物を投与することによるものである。治療／予防投与および薬学的組成物ラパログは、遊離形態で存在することができ、あるいは所望により塩の形態で
存在することができる。数多くの種類の化合物の薬学的適合塩およびその調製は
、当該技術分野に周知である。本発明の化合物の薬学的適合塩は、例えば無機ま
たは有機塩基から形成された本発明の化合物の従来の非毒性塩または四級アンモ
ニウム塩を含む。

【０２２５】本発明の化合物は、ヒドレートまたはソルベートを形成することができる。帯
電した化合物が、水で脂質化された場合ヒドレート化種を形成し、あるいは適当
な有機溶剤で溶液中に濃縮化された場合ソルベート種を形成することは当業者に
公知である。

【０２２６】本発明はまた、治療的（あるいは予防的）有効量の化合物および１種またはそ
れ以上の薬学的適合キャリヤーおよび／または賦形助剤を含む薬学的組成物に関
する。キャリヤーとして、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストローゼ
、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの混合物が挙げられ、以下に詳細
に説明する。所望により組成物は、少量の湿潤または乳化剤またはｐH緩衝剤を含むことができる。組成物は、液体溶液、懸濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル
、放出維持配合物または粉末であることができる。組成物は、従来のバインダー
およびキャリヤー、例えばトリグリセライドとともに座薬として配合することが
できる。経口処方配合物は、標準キャリヤー、例えば試薬級のマンにトール、ラ
クトーゼ、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セル
ロース、炭酸マグネシウム等を含むことができる。配合物は、所望の調製に適す
るように成分の混合、顆粒化、および圧縮または溶解を伴う。

【０２２７】利用される薬学的キャリヤーは、例えば固体であっても液体であってもよい。代表的固体キャリヤーは、ラクトーセ、白土、蔗糖、タルク、ゼラチン、寒天
、ペクチン、アラビアゴム、燐酸マグネシウム、ステアリン酸等が挙げられる。
個体キャリヤーは、風味料、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、充填材、滑剤、圧縮助
剤、バインダーまたは錠剤分解剤を含むことができ、カプセル化剤であってもよ
い。粉末において、キャリヤーは微細活性成分との混合物の形態である微細固体
である。錠剤において、活性成分を、好適な割合で必要な圧縮性質を有するキャ
リヤーと混合し、所望の形状および寸法に緻密化する。粉末および錠剤は、99％
までの活性成分を含有するのが好ましい。好適な固体キャリヤーは、例えば燐酸
カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトーセ、デキスト
リン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボ
キシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交
換樹脂を含む。

【０２２８】代表的液体キャリヤーとして、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、水等が
挙げられる。液体キャリヤーは、溶液、懸濁液、乳液、シロップ、エリキシルお
よび圧縮組成物を調製するのに使用される。活性成分を、薬学的適合液体キャリ
ヤー、例えば水、有機溶剤、両者の混合物あるいは薬学的適合可能油あるいは脂
肪中に溶解または懸濁させる。液体キャリヤーは、他の好適な薬学的適合添加剤
、例えば可溶化剤、乳化剤、緩衝液、保存剤、甘味料、風味料、懸濁剤、増粘剤
、着色料、粘度調整剤、安定剤、または浸透圧調整剤を含むことができる。経口
または非経口投与に好適な液体キャリヤーの例として、水（上記の添加剤、例え
ばセルロース誘導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液を
部分的に含む）アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリ
コールを含む）およびその誘導体、油（例えば分留したココナッツ油およびピー
ナッツ油）が挙げられる。非経口投与について、キャリヤーは油状のエステル例
えばオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルであることもできる。滅
菌液体キャリヤーは、非経口投与に滅菌した液体の形態で有効である。圧縮組成
物用の液体キャリヤーは、ハロゲン化炭化水素またはその他の薬学的適合噴射剤
であることができる。滅菌した溶液または懸濁液である液体薬学的組成物は、例
えば筋肉内、腹腔内または皮下接種により使用することができる。滅菌した溶液
はまた、静脈投与することもできる。化合物は、液体または固体組成物形態のい
ずれかで経口投与することができる。

【０２２９】キャリヤーまたはエリキシルは、当該技術分野に周知の遅効性材料、例えばグ
リセリルモノステアレートまたはゲリセリルジステアレートを単独であるいはワ
ックス、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタ
クリレート等とともに含んでもよい。経口投与用に配合された場合、PHOSAL PG
-50中の0.001％Tween80（1,2-プロピレングリコールAを有する燐脂質濃縮物 Na
ttermann ＆ Cie. GmbH）を、他の化合物の適合性経口配合を製造するものとして認められており、そして本発明の種々の化合物の配合に適合することができる
。

【０２３０】種々の薬学形態を利用することができる。固体キャリヤーを使用する場合、調
製は、錠剤化、硬質ゼラチンカプセル上に粉末または錠剤形態であるいはトロー
チまたはドロップ形態で配置することができる。固体キャリヤーの量は、広い範
囲で可変であるが、好ましくは約25mgから約１ｇである。液体キャリヤーを使用
する場合、調製は、シロップ、乳液、軟質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液また
はアンプルまたは薬ビン中の懸濁液あるいは非水性懸濁液の形態である。

【０２３１】好適な水溶性投与形態を得るために、マルチマー化剤の薬学的適合塩を有機ま
たは無機酸の水溶液、例えば琥珀酸またはクエン酸の0.3M溶液に溶解することが
できる。代わりに、酸誘導体を好適な塩基性溶液に溶解することができる。可溶
性塩の形態が利用できない場合には、化合物を好適な共溶媒またはこれらの組み
合わせに溶解することができる。かかる好適な共溶媒として、全容量の0〜60％の範囲の濃度でのアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール
300、ポリソルベート80、グリセリンポリオキシエチル化脂肪酸、脂肪アルコールまたはグリセリンヒドロキシ脂肪酸エステル等が挙げられるがこれらに限定さ
るものではない。

【０２３２】種々の輸送システムが公知であり、マルチマー化剤あるいは錠剤、カプセル、
注射溶液、リポゾーム中へのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル等を含むこ
れらの配合物、を投与するのに使用することができる。導入法として皮膚、内皮
、筋肉内、皮膚内、静脈内、皮下、鼻腔内、肺、表皮、眼および（通常は好まし
くは）経口経路が挙げられるがこれらに限定されるものではない。化合物を、便
利なあるいは適当な経路、例えば注入あるいは丸薬接種により、上皮または粘膜
皮膚（例えば口内粘膜、直腸または腸粘膜等）を介する吸収により投与すること
ができ、そして他の生物学的活性剤とともに投与することができる。投与は、系
統立ててあるいは局所的に行うことができる。鼻、気管支または肺病の治療また
は予防のために、投与の好ましい経路は、経口、鼻腔または気管支を介するエア
炉ゾルまたはネブライザーである。

【０２３３】所定の実施の形態において、化合物を局所的に治療の必要な領域に投与するの
が望ましく、これは例えば外科手術の際の局所注入、局所適用、接種、カテーテ
ルによって、座薬によってあるいは皮膚の当て布または移植によって達成するこ
とができるがこれに限定されるものではなく、上記移植は膜、例えば繊維を含む
多孔質、非多孔質あるいはゼラチン状材料を有する。

【０２３４】特定の実施の形態において、組成物は、実際のヒトに対する静脈内投与の適す
る薬学的組成物として常套の方法に従って配合することができる。代表的には、
静脈内投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要の場合、組
成物は、可溶化剤および接種部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤を含むこと
ができる。一般には、これらの成分は、別個にあるいは単位投薬形態で例えば親
油化粉末または密封容器、例えば活性剤の量を示したアンプルまたは香料袋中の
水不含濃縮物として供給される。注入により組成物を投与する場合、滅菌試薬級
水または食塩水を含有する注入ビンで施すことができる。組成物を接種により投
与する場合、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを、成分が投与前に混合でき
るように提供することができる。

【０２３５】有効量の化合物の個体への投与は、化合物を直接個体の感染領域に局所的に投
与することによっても達成することができる。この目的のため、化合物を薬学的
適合局所キャリヤー、例えば限定されるものではないが水、グリセロール、アル
コール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセライド、脂肪酸エ
ステルまたは鉱物油のようなキャリヤーを含むゲル、軟膏、ローションまたはク
リームを含む組成物で投与または塗布する。

【０２３６】他の局所的キャリヤーとして、液体石油、パルチミン酸イソプロピル、ポリエ
チレングリコール、エタノール(95%)、水中のポリオキシエチレンモノラウレート(5%)、水中のラウリル硫酸ナトリウム(5%)が挙げられる。他の材料、例えば酸
化防止剤、保湿剤、粘度安定剤および同様の薬剤を必要に応じて添加してもよい
。皮膚浸透エンハンサー(percutaneous penetration enhancer)、例えばアゾン（Azone）を含めてもよい。

【０２３７】加えて、所定の例において、化合物が皮膚上、中または下に配置される装置内
に配置されてもよい。かかる装置は、受動的あるいは能動的放出機構による当て
布、移植、化合物を皮膚に放出する注射を含む。

【０２３８】種々の配合物を製造するための材料および方法は、当該技術分野において周知
であり、そして本発明の対象を実行するのに適合する。例えば、米国特許第5,18
2,293号明細書および同第4,837,311号明細書（錠剤、カプセルおよびその他の経
口配合物並びに静脈内配合物）および欧州特許出願公開第0 649 959号明細書(19
95年4月25日公開；IV投与に関する代表的投与)および同第0 648 494号明細書(19
95年4月25日公開；経口投与に関する代表的投与)を参照のこと。

【０２３９】有効服用量の化合物は、代表的には一回または複数回の服用で哺乳類体重に対して約0.01〜約50mg／kg、好ましくは好ましくは約0.1〜約10mg/
kgの範囲である。一般には、化合物は、かかる処理を必要とする患者に一日当た
り患者に対して約１ないし200mgである。

【０２４０】特定の疾患または兆候の治療または予防に有効である量の化合物は、マルチマ
ー化すべき融合タンパク質の特徴、遺伝子操作された細胞の特徴および場所に一
部依存し、そして標準治療技術により決定することができる疾患または兆候の性
質に依存する。加えて、生体内または生体外検定を場合より利用して最適服用量
範囲の同定を補助することができる。有効服用量は、生体外または動物モデル試
験システムから導かれた服用量応答曲線から推論することができる。正確な服用
レベルは、主治医またはその他ヘルスケア提供者によって決定すべきであり、投
与の経路および年齢、体重、性別および個体の一般的健康状態、共存治療の使用
（または不使用）および患者における細胞の遺伝子操作の性質および範囲を含む
周知の因子に依存する。

【０２４１】本発明はまた、1種類またはそれ以上の本発明の薬学的組成物の成分を含む1ま
たはそれ以上の容器を含む薬学パックまたはキットも提供する。必要に応じて、
かかる容器に関連して、薬学的または生物学的製品の製造、使用または販売に関
する行政機関により定められた形式の注意書であることができ、この注意書は、
ヒト投与に関する製造、使用または販売の行政機関による承認を反映している。
注意書またはパッケージ挿入は、本明細書の開示と一致した本発明の改良された
ラパログの使用上の注意を含む。

【０２４２】実施例実施例１：代表的C-24変性ラパログ 1.1．ラパマイシン精製ラパマイシンを発酵により得た。ラパマイシン製造器官であるStreptomyces hygroscopicus(ATCC#29253)を15Lまたは30L供給バッチ
発酵装置中の複合内地上で培養した。バイオマスを遠心分離により9から14日後に収穫した。上澄みを１〜２時間非イオン性高分子吸収樹脂、XAD-16（Rhom and
Hass）と接触させた。吸着剤を遠心分離により回収し、バイオマスと一緒にし、塩化眼メチレンで繰り返し抽出した。溶剤を減圧除去し、そして得られた残渣
をアセトニトリルで抽出し、これを同様の方法で凝集した。粗性ラパマイシンの
クロマトグラフィー精製を、シリカゲル(40％アセトン／ヘキサン)上のフラッシ
ュクロマトグラフィーにより達成し、次いでC-18逆相HPLC（70％CH３CN/H2O）を
行った。得られたラパマイシンは、ラパマイシンの信用できるサンプルと同一の
HPLCスペクトルおよび生物学的特徴を示した。 1.2. ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-メチルオキシム）(5,６)(一般的方法) MeOH（２ｍL）中のラパマイシン(60mg 65.6mモル)の溶液をNaOAc(22mg 262m モル、4.0等量)で処理し、次いで塩酸メトキシルアミン(22mg 262mモル、4.0等量)で処理し、そして室温で48時間攪拌した。この時間の後、反応混合物をH2O(1
0mL)で急冷しそしてEtOAC(3x10mL)で抽出した。一緒にした有機抽出物を飽和NaC
ll溶液(2x10mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そして溶液を減圧濃縮した
。得られた残渣にシリカゲル(10%MeOH/ジクロロメタン)上のフラッシュクロマト
グラフィーを施し異性体の混合物を得た。この異性体混合物をHPLC(Kromasi C-1
8 250x20mmカラム、12mL/分を通過させる35% AE 25％ H2O/MeCN)により分離して13mg(21%)の初期溶出Z異性体および7.6mg(12%)のE異性体を得た。Z異性体：
高解像度マススペクトル(FAB)m/z 965.579 [(M+Na)+ 計算値C52H82N2O13Na 965.
5710]。E異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 965.510 [(M+Na)+ 計算値C5
2H82N2O13Na 965.5710]。 1.3. ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-エチルオキシム）(7,8) ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-メチルオキシム）と同様の方法で調製した
。異性体混合物をHPLC(Kromasi C-18 250x20mmカラム、12mL/分を通過させる30% H2O/MeCN)により分離して7.7mg(25%)の初期溶出Z異性体および0.5mg(12%)のE 異性体を得た。Z異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 979.5902 [(M+Na)+
計算値C53H84N2O13Na 979.5871]。 1.4. ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-イソブチルオキシム）(9,10) ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-メチルオキシム）と同様の方法で調製した
。異性体混合物をHPLC(Kromasi C-18 250x20mmカラム、12mL/分を通過させる15% H2O/MeCN)により分離して28mg(65%)の初期溶出Z異性体および3.0mg(7%)のE異性体を得た。Z異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 1007.6146 [(M+Na)+
計算値C55H88N2O13Na 1007.6184]。E異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 1007.6157 [(M+Na)+ 計算値C55H88N2O13Na 1007.6184]。 1.5. ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-ベンジルオキシム）(11,12) ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-メチルオキシム）と同様の方法で調製した
。異性体混合物をHPLC(Kromasi C-18 250x20mmカラム、12mL/分を通過させる15% H2O/MeCN)により分離して19.6mg(44%)の初期溶出Z異性体および6.1mg(14%)のE
異性体を得た。Z異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 1041.6033 [(M+Na)
+ 計算値C58H86N2O13Na 1041.6028]。E異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/
z 1041.5988 [(M+Na)+ 計算値C58H86N2O13Na 1041.6028]。 1.6. ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-カルボキシメチルオキシム）(13,14 ) ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-メチルオキシム）と同様の方法で調製した
。異性体混合物をHPLC(Kromasi C-18 250x20mmカラム、12mL/分を通過させる45% H2O/MeCN)により分離して4.6mg(11%)の初期溶出Z異性体および1.0mg(2%)のE異
性体を得た。Z異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 1009.5664 [(M+Na)+
計算値C53H82N2O15Na 1009.5613]。E異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 1009.5604 [(M+Na)+ 計算値C53H82N2O15Na 1009.5613]。 1.7. ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-カルボキシアミドメチルオキシム） (15,16) ラパマイシン（EおよびZ）-24-（O-メチルオキシム）と同様の方法で調製した
。異性体混合物をHPLC(Kromasi C-18 250x20mmカラム、12mL/分を通過させる35% H2O/MeCN)により分離して6.2mg(10%)の初期溶出Z異性体および1.4mg(2%)のE異
性体を得た。Z異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 1008.5790 [(M+Na)+
計算値C53H83N3O14Na 1008.5768]。E異性体：高解像度マススペクトル(FAB)m/z 1008.5753 [(M+Na)+ 計算値C53H83N3O14Na 1008.5768]。実施例２ラパマイシンC24誘導体のFKBPけの結合の検定 FKBPに対するラパマイシンC24類縁体の親和性を、蛍光分極(FP)に基づく競合検定を用いて測定した。フルオレセイン標識FK506プローブ(AP1491)を合成し、その蛍光の分極をサブ飽和FKBPおよび競合物としての可変量のラパマイシン類縁
体を含有する平衡結合実験における結合したプローブの％の直接読出しとして使
用した。フルオレセイン標識FK506プローブ(AP1491)の合成

【０２４３】

【化２３】

【０２４４】 2.1. FK506の24,32-ビス(tert-ブチルジメチルシリル)エーテル tert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルフォネート（18μL, 470 μモル）を０℃でジクロロメチレン(3mL)中のFKB506（103mg 128μモル）および
2,6-ルチジン(89.5μL 768μモル)の攪拌した溶液に滴下した。得られた溶液を０℃で２時間攪拌し、次いでMeOH（0.5ｍL）およびエーテル(15mL)で処理した。
この混合物を10%NaHCO3（３mL）水溶液および塩水(3mL)で洗浄した。有機相をデ
カンテーションし、無水Na2SO4で乾燥し、黄色オイル分にまで濃縮した。カラム
クロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン-EtOAc 3:1）により表題の化合物が無色のオイル分として得られた(104mg)。 2.2．中間体１ THF(2.5ml)中のFK506の24,32-ビス(tert-ブチルジメチルシリル)エーテル(100
mg、97μモル)の溶液にモルフォリンN-オキシド(68mg, 580μモル)を添加し、次
いで水(60μL)および４%オスミウムテトロキシド(123μL、20μモル)の水溶液を
加えた。得られた混合物混合物を室温で4.5時間攪拌した。次いで、これを50％M
eOH水溶液(0.5mL)および過酸化ナトリウム(207mg, 970μモル)で処理し、そして
懸濁液をさらに１時間攪拌した。この混合物をエーテル(10mL)で希釈し、そして
飽和NaHCO3水溶液（2x4mL）で洗浄した。有機相をデカンテーションし、少量の亜硫酸ナトリウムを含有する無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、そして濃
縮した。残渣を無水THF(2.8mL)中に溶解し、窒素下で-78℃に冷却し、そしてTFT
(282μl)中のリチウムトリス[(3-エチル−３−フェニル)オキシ]アルミニウムヒ
ドリド 0.5M溶液で処理した。得られた溶液を-78℃で1.75時間攪拌し、次いでエーテル(
6mL) および飽和塩化アンモニウム溶液(250μL)の添加により急冷した。この混合物を室温まで冷却し、そして無水硫酸ナトリウムで処理した。減圧下で濾過お
よび濃縮をして淡黄色オイル分(97mg)を得て、これをカラムクロマトグラフィー
(シリカゲル、ヘキサン-EtOAc 3:1)により精製して無色オイル分として１を得た。 2.3. 中間体２アセトニトリル(10ｍL)中の上記アルコール(300mg, 290μモル)の溶液を2,6- ルチジン(338mg, 2.9μモル)およびN,N’-サクシンイミジルカーボネート(371mg
, 1.45 mモル)で処理した。得られた懸濁液を室温で14.5時間攪拌し、次いで減
圧下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン-EtOAc 2:1
から100％EtOAcへ傾斜)処理して淡黄色オイル分として混合カーボネート２(127m
g)を得た。 2.4. 中間体３アセトニトリル(1ｍL)中の上記カーボネート(30mg, 26μモル)およびトリエチ
ルアミン(36μL, 34μモル)を4’-(アミノメチル)フルオレセイン(371mg, 1.45m
モル)で処理した。得られた明るい橙色の懸濁液を室温で1時間攪拌し、次いで減
圧下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン-EtOAc 1:1 から100％EtOAcへそしてEtOAc 1:1へ傾斜)処理して明るい黄色の固体として３(2
0.5mg)を得た。 2.5. 化合物４アセトニトリル(1ｍL)中のビス−シリルエーテル(35mg, 25μモル)を水中の48
% (w/w)HFで処理した。得られた混合物を室温で5.5時間攪拌した。次いでこれをジクロロメタン(10mL)で希釈し、水(2x2mL)で洗浄した。有機相をデカンテーションし、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下に濃縮した。残渣をクロ
マトグラフィー(シリカゲル、100％EtOAc)処理して明るい黄色固体として４(13m
g)を得た。 2.6. FPを使用したラパログの結合親和性(IC50s)の測定各類縁体の一連の10-倍希釈物を、ガラスビン中の100%エタノール液中で調製し、氷上で保存した。その他の全ての操作は室温で行った。組替え純粋FKBP（標
準方法により調製。 Wiederrecht, G. et al. 1992. J. Biol. Chem. 26
7, 21753-21760）を、50mM燐酸カリウム pH 7.8/150mM NaCl/100μg/mlウシガン
マグロブリン(“FP”緩衝液：Panveraからの低蛍光試薬)中約nMに希釈し、そして98μアリコートをダイナテックマイクロ四つ口96ウェル蛍光プレートのウェル
に移した。次いでラパマイシン類縁体の2.0μlサンプルを攪拌しながらウェルへ
重ね合わせて移した。最後に、0.1%エタノール/FP緩衝液中の10nM AP149を含有するプローブ溶液を調製し、100μlを攪拌しながら各ウェルに添加した。二重対
照ウェルは、ラパマイシン類縁体の代わりにエタノールを含み (100%プローブ結
合に対する)またはラパマイシンの代わりにエタノールおよびFKBPの代わりにFP 緩衝液（0%結合）を含有していた。

【０２４５】プレートをカバーして暗所で約30分保存して平衡にし、次いで各ウェルのサン
プルの蛍光分極をJolly FPM-2 FPプレートリーダー(Jolly Consulting and Rese
arch, Inc., Grayslake, IL)上で製造者の推薦に従って読み出した。

【０２４６】

【表１１】

【０２４７】

【表１２】

【０２４８】各競争化合物の濃度に対する平均分極(mPユニット)を、対照標準値を参照するこ
とによって通常はトータル結合率(%)(% total binding)に変え、競争化合物の最
終モル濃度の対数(x)に対してプロットした(y)。非線形最小２乗解析法を使用し
て曲線を適合させ、下記の式にしたがってIC50を引き出した。

【０２４９】 y = M1+(M4-M1)/(1+exp(M2※(M3-x))) 上記式においてM3はIC50である。不完全な曲線の場合、IC50は内挿法によって求
めた。いずれの場合もラパマイシンとC14-デスオキソ-ラパマイシンを対照標準物質として含めた(C14-デスオキソ-ラパマイシンは、Luengo, J. I.らによる"19
94 Tet Lett. 35, 6469-6472"に記載のように製造した)。 2.7 ラパマイシンC24オキシムの結合解析の結果親和力は、IC50として及び親和力の低下倍率(= IC50/(ラパマイシンのIC50)) として記載されている。〔ヒトのFKBP12に対するC24ラパログ(rapalog)とラパマ
イシンとの、およびC24ラパログとデスオキソ-ラパマイシンとの比較結合データ
がPCT/US86/09848においてプロットされている。〕実施例3. C7ラパログの合成; C7ラパログ-FKBP錯体とFRAPとの結合アッセイ直鎖および枝分かれ鎖のアルコキシ、アリールアルキルオキシ、-NHCO-Oアルキル、-NHSO₂アルキル、置換アリール部分、ならびに置換ヘテロアリール部分か
ら選ばれる種々のC7置換基を有する一連のC7ラパログを、前記文献以外の文献中
に一般的に記載されている化学を使用して合成した(例えば、Luengoらによる"19
95, Chemistry and Biology 2, 471-481"およびさらなる背景を得るための表II に引用されている文献を参照)。さらにその後の表も参照のこと。

【０２５０】 3.1 化合物27, 28-(R^C7=Et)は、Luengoらによる"Chemistry & Biology July
1995, 2:471-481"に記載のように合成する。

【０２５１】 3.2 化合物29-(R^C7=iPr) 室温にてラパマイシン(60mg, 0.066ミリモル)を2-
プロパノール(3ml)中に溶解して得た溶液をp-トルエンスルホン酸(75mg, 0.394 ミリモル)で処理し、４時間撹拌した。その後に反応混合物を、NaHCO₃飽和水溶液(20ml)とEtOAc(30ml)との二相溶液に注ぎ込んだ。有機層をさらにNaHCO₃飽和水溶液(2×20ml)で、次いでNaCl飽和水溶液(2×10ml)で洗浄し、Na₂SO₄により乾
燥し、濾過し、そして溶媒を蒸発除去した。65%アセトニリル/水を溶離剤とし、
クロマシル(Kromasil)C-18カラム(20×250mm)を使用して55CにてHPLCにより精製
してAP1700(25mg)を得た。MS(FAB):(M+Na)⁺ 計算値: 964.5762, 実測値: 964.57
533. 3.3 化合物30-(R^C7=ベンジル)は"Chemistry & Biology July 1995, 2:47
1-481"に記載のように合成する。

【０２５２】 3.4 化合物31, 32-(R^C7=-NH-CO-OMe)は"Chemistry & Biology July 1995, 2:
471-481"に記載のように合成することができる。

【０２５３】 3.5 化合物33-(R^C7=-NH-SO₂-Me) −40℃にてラパマイシン(75mg, 0.082ミリ
モル)とメタンスルホンアミド(312mg, 3.282ミリモル)をジクロロメタン(3ml)中
に溶解して得た溶液にトリフルオロ酢酸(126μl, 1.636ミリモル)を滴下して処理し、３時間撹拌した。その後に反応混合物を、NaHCO₃飽和水溶液(20ml)とEtOA
c(10ml)との二相溶液に注ぎ込んだ。有機層をNaCl飽和水溶液(2×10ml)で洗浄し
、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去し、シリカゲル(ジクロロメタン:ヘ
キサン:EtOAc:MeOH, 200:50:42.5:7.5)を使用してフラッシュクロマトグラフィー処理した。こうして得られた半精製物質を、65%アセトニリル/水を溶離剤とし
、クロマシルC-18カラム(20×250mm)を使用して55CにてHPLCにより精製してAP17
05(24mg)を得た。MS(FAB):(M+Na)⁺ 計算値: 999.5246, 実測値: 999.5246 3.6 化合物34, 35-(R^C7=フラニル) これらの化合物は"Chemistry & Biology July 1995, 2:471-481"に記載のように合成することができる。

【０２５４】 3.7 化合物36, 37-(R^C7=メチルチオフェン) これらの化合物は"J. Org. Che
m. 1994, 59, 6512-6513"に記載のように合成することができる。

【０２５５】 3.8 化合物39, 38-(R^C7=エチルチオフェン) ラパマイシン(50mg, 0.055ミリ
モル)と2-エチルチオフェン(248μl, 2.188ミリモル)を−40℃にてジクロロメタ
ン(1.5ml)中に溶解して得た溶液にトリフルオロ酢酸(84μl, 1.094ミリモル)を滴下して処理し、3時間撹拌した。その後に反応混合物を、NaHCO₃飽和水溶液(15
ml)とEtOAc(10ml)との二相溶液に注ぎ込んだ。有機層をNaCl飽和水溶液(2×10ml
)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去し、シリカゲル(MeOH:ジクロロメタン, 2:98次いで5:95)を使用してフラッシュクロマトグラフィー処理した。こうして得られた半精製物質を、80%アセトニリル/水を溶離剤とし、クロ
マシルC-18カラム(20×250mm)を使用して55CにてHPLCにより精製してAP1859(28m
g)を得た。MS(ES+):(M+NH₄)⁺ 1016; MS(ES-):(M-H)^- 992

【０２５６】

【表１３】

【０２５７】 3.9 化合物40, 41-(R^C7=tert-ブチルチオフェン) ラパマイシン(50mg, 0.05
5ミリモル)と2-tert-ブチルチオフェン(276mg, 2.188ミリモル)を−40℃にてジクロロメタン(1.5ml)中に溶解して得た溶液にトリフルオロ酢酸(84μl, 1.094ミ
リモル)を滴下して処理し、3時間撹拌した。その後に反応混合物を、NaHCO₃飽和
水溶液(15ml)とEtOAc(10ml)との二相溶液に注ぎ込んだ。有機層をNaCl飽和水溶液(2×10ml)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去し、シリカゲル(MeOH:ジクロロメタン, 2:98次いで5:95)を使用してフラッシュクロマトグラフィー処理した。こうして得られた半精製物質を、80%アセトニリル/水を溶離剤
とし、クロマシルC-18カラム(20×250mm)を使用して55CにてHPLCにより精製して
AP1856(4mg)とAP1857(14mg)を得た。MS(ES+):(M+Na)⁺ 1045; MS(ES-):(M-H)^- 10
21 3.10 化合物43, 42-(R^C7=o,p-ジメトキシフェニル) これらの化合物は"Chem
istry & Biology July 1995, 2:471-481"中に見出すことができる。

【０２５８】 3.11 化合物44, 45-(R^C7=インドリル) ラパマイシン(50mg, 0.055ミリモル)
とインドール(64mg, 0.547ミリモル)を−40℃にてジクロロメタン(2.0ml)中に溶
解して得た溶液にトリフルオロ酢酸(84μl, 1.094ミリモル)を滴下して処理し、
3時間撹拌した。その後に反応混合物を、NaHCO₃飽和水溶液(15ml)とEtOAc(10ml)
との二相溶液に注ぎ込んだ。有機層をNaCl飽和水溶液(2×10ml)で洗浄し、Na₂SO ₄ で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去し、シリカゲル(ジクロロメタンH:ヘキサン
:EtOAc:MeOH, 200:50:42.5:7.5)を使用してフラッシュクロマトグラフィー処理した。こうして得られた半精製物質を、65%アセトニリル/水を溶離剤とし、クロ
マシルC-18カラム(20×250mm)を使用してHPLCにより精製してAP1701(12mg)とAP1
702(7.6mg)を得た。MS(FAB):(M+Na)⁺ 計算値: 1021.5765, 実測値: 1021.5788(A
P1701)および1021.5797(AP1702) 3.12 化合物46-(R^C7=o,p-ジエトキシフェニル) ラパマイシン(108mg, 0.118
ミリモル)と1,3-ジエトキシベンゼン(783mg, 4.72ミリモル)を−40℃にてジクロ
ロメタン(2.0ml)中に溶解して得た溶液にトリフルオロ酢酸(154μl, 2.01ミリモ
ル)を滴下して処理し、3時間撹拌した。その後に反応混合物を、NaHCO₃飽和水溶
液(15ml)とEtOAc(15ml)との二相溶液に注ぎ込んだ。有機層をNaCl飽和水溶液(2 ×10ml)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去し、シリカゲル(ジ
クロロメタン:ヘキサン:EtOAc:MeOH, 200:50:42.5:7.5)を使用してフラッシュク
ロマトグラフィー処理した。こうして得られた物質を、(ジクロロメタン:ヘキサ
ン:EtOAc:MeOH, 210:65:65:10)を溶離剤とし、ライニンシリカカラム(a Rainin
silica column)(20×250mm)を使用してHPLCにより精製してAP20808(20mg)を得た
。MS(ES+):(M+Na)⁺ 1065.95 3.13 化合物47-(R^C7=メチルチオフェン) ラパマイシン(105mg, 0.115ミリモ
ル)と3-メチルチオフェン(445μl, 4.60ミリモル)を−40℃にてジクロロメタン(
2.0ml)中に溶解して得た溶液にトリフルオロ酢酸(150μl, 1.96ミリモル)を滴下
して処理し、3時間撹拌した。その後に反応混合物を、NaHCO₃飽和水溶液(15ml) とEtOAc(15ml)との二相溶液に注ぎ込んだ。有機層をNaCl飽和水溶液(2×10ml)で
洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去し、シリカゲル(ジクロロメタン:ヘキサン:EtOAc:MeOH, 200:50:42.5:7.5)を使用してフラッシュクロマトグ
ラフィー処理した。こうして得られた物質を、(ジクロロメタン:ヘキサン:EtOAc
:MeOH, 210:65:65:10)を溶離剤とし、ライニンシリカカラム(20×250mm)を使用してHPLCにより精製してAP20809(60mg)を得た。MS(ES+):(M+Na)⁺ 1002.96 3.14 化合物48-(R^C7=N-メチルピロール) ラパマイシン(51mg, 0.056ミリモル)とN-メチルピロール(198μl, 2.23ミリモル)を0℃にてジクロロメタン(2.0ml
)中に溶解して得た溶液を塩化亜鉛(76mg, 0.557ミリモル)で処理し、一晩静置し
て室温に加温した。その後に反応混合物を、NaHCO₃飽和水溶液(15ml)とEtOAc(15
ml)との二相溶液に注ぎ込んだ。有機層をNaCl飽和水溶液(2×10ml)で洗浄し、Na ₂ SO₄で乾燥し、濾過し、溶媒を蒸発除去し、シリカゲル(ジクロロメタン:ヘキサ
ン:EtOAc:MeOH, 100:150:150:10)を使用してフラッシュクロマトグラフィー処理
した。こうして得られた物質を、(ジクロロメタン:ヘキサン:EtOAc:MeOH, 210:6
5:65:10)を溶離剤とし、ライニンシリカカラム(a Rainin silica column)(20×2
50mm)を使用してHPLCにより精製してAP20810(10mg)を得た。MS(ES+):(M+NH₄)⁺ 9
81.05; MS(ES-):(M-H)^- 961.69 C7ラパログは、正確な質量スペクトルとNMRスペクトルを有することを特徴とした。

【０２５９】 3.15 C7ラパログのFKBP結合親和力のアッセイ FKBPに対する種々のC7ラパログの親和力を、競争的なFPを使用して上記のC24 ラパログに関して記載のように評価した。ラパマイシンとC14-デスオキソ-ラパマイシン(Luengoらによる"1994. Tetrahedron Lett. 35, 6469-6472"に記載のよ
うに製造)を対照標準として組み込んだ。

【０２６０】親和力は、IC50および親和力の低下倍率(=IC50/(ラパマイシンのIC50))として
記載されている。下記の"例示的なC7ラパログ"表を参照。これらのデータは、大
きなC7置換基が、必ずしもヒトのFKBPに対するラパログの親和力の大きな低下を
引き起こすわけではないということを示している。

【０２６１】

【表１４】

【０２６２】実施例4 R^C24とR^C30が変性されたラパログ〔24(S),30(S)-テトラヒドロラパマイシン(53)〕の製造

【０２６３】

【化２４】

【０２６４】ラパマイシン(46mg, 0.050ミリモル)を2.0mlのメタノール中に溶解して−78℃
に冷却し、塩化セリウム(III)七水和物(46mg, 0.123ミリモル)を加えた。本溶液
を15分撹拌し、ホウ水素化ナトリウム(7.6mg, 0.20ミリモル)を加えた。30分後、反応混合物を酢酸エチル(15ml)と5%塩酸(2ml)とに分配した。有機相を水(2ml)
とブライン(1ml)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、そして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル, 15:75:50:200 メタノール:酢酸エチル:ヘキサン:ジクロロメタン)により、35mg(76%)の所望生成物を白色泡成物と
して得た。質量スペクトルデータ: (ES+/NaCl/NH₃)m/z 942.21(M+Na)+, 935.83(
M+NH₄)+; (ES-/NaCl)m/z 963.04(M+Cl)-, 917.34(M-H)- 文献: Luengo, J.I.; R
ozamus, L.W.;およびHolt, D.A.による"Tetrahedron Lett. 1994, 35, 6469-647
2"実施例5 C24, C30,およびC7が変性されたラパログの製造実施例4において製造した24(S),30(S)-テトラヒドロラパマイシン(53)は、前述のC7ラパログの実施例において示したアプローチを使用してC7にて変性を施す
ことができる。例えば: 5.1 7(S)-(2',4'-ジメトキシ)ベンジル-7-デメトキシ-24(S),30(S)-テトラヒ
ドロ-ラパマイシン

【０２６５】

【化２５】

【０２６６】 24(S),30(S)-テトラヒドロ-ラパマイシン(20mg, 0.022ミリモル)をジクロロメタ
ン(1.0ml)中に溶解した。1,3-ジメトキシベンゼン(0.20ml, 1.5ミリモル)を加え
、本溶液を−60℃に冷却した。トリフルオロ酢酸(0.030ml, 0.39ミリモル)を加え、反応混合物を−60℃で１時間撹拌し、次いで酢酸エチル(10ml)と重炭酸ナト
リウム飽和水溶液(1ml)とに分配した。有機相を水(2ml)とブライン(1ml)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮した。フラッシュクロ
マトグラフィー(シリカゲル, 15:75:50:200 メタノール:酢酸エチル:ヘキサン: ジクロロメタン)により、8mg(35%)の所望生成物を白色固体として得た。質量スペクトルデータ: (ES+/NaCl/NH₃)m/z 1046.96(M+Na)+, 1042.15(M+NH₄)+; (ES-/
NaCl)m/z 1069.09(M+Cl)- 文献: Luengo, J.I.; Konialian-Beck, A.; Rozamus
, L.W.;およびHolt, D.A.による"J. Org. Chem. 1994, 59, 6512-6513" 類似の方法によって、本明細書に記載の他のC7置換基(例えば、別の置換アリール基、ヘテロアリール基、-O-脂肪族基、チオエーテル基、あるいはR^C7aまたはR^C7bに関して前記した他のタイプの部分のいずれか)を有する24(S),30(S)-テトラヒドロ-ラパマイシンを製造することもできる。これらの化合物は、適切なC
7ラパログのC24およびC30での還元によって、あるいは適切なC24,C30-テトラヒドロラパログのC7での変換によって得ることができる。代表的な例を以下に示す
。

【０２６７】 C24, C30,およびC7にて変性されたラパログはさらに、本明細書に記載の種々の位置にて(例えば、R^C13, R^C43, R^C28, R^C29, R⁴, および"a"などの1つ以上に関して)ラパマイシンとは異なっていてもよい。例えば、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシンでスタートすると、化合物53-79の13-フルオロ類縁体が得られる。

【０２６８】 5.2 化合物54, 55-(R^C7=Et)は実施例4.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりにそれぞれ化合物27および28を使用する。

【０２６９】 5.3 化合物56-(R^C7=iPr)は実施例4.1に記載のように合成することができるが
、ラパマイシンの代わりに化合物29を使用する。

【０２７０】 5.4 化合物57-(R^C7=ベンジル)は実施例4.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに化合物30を使用する。

【０２７１】 5.5 化合物58, 59-(R^C7=-NH-CO-OMe)は実施例4.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりにそれぞれ化合物32と31を使用する。

【０２７２】 5.6 化合物60-(R^C7=-NH-SO₂-Me)は実施例4.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに化合物33を使用する。

【０２７３】 5.7 化合物61, 62-(R^C7=フラニル)は実施例4.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりにそれぞれ化合物34と35を使用する。

【０２７４】 5.8 化合物63, 64-(R^C7=メチルチオフェン)は実施例4.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりにそれぞれ化合物36と37を使用する
。

【０２７５】 5.9 化合物65, 66-(R^C7=エチルチオフェン)は実施例4.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりにそれぞれ化合物38と39を使用する
。

【０２７６】 5.10 化合物67, 68-(R^C7=tert-ブチルチオフェン)は実施例4.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりにそれぞれ化合物41と40を使
用する。

【０２７７】 5.11 化合物69, 70-(R^C7=o,p-ジメトキシフェニル)は実施例4.1に記載のよう
に合成することができるが、ラパマイシンの代わりにそれぞれ化合物43と42を使
用する。

【０２７８】 5.12 化合物71, 72-(R^C7=インドリル)は実施例4.1に記載のように合成するこ
とができるが、ラパマイシンの代わりにそれぞれ化合物45と44を使用する。

【０２７９】 5.13 化合物73-(R^C7=o,p-ジエトキシフェニル)は実施例4.1に記載のように合
成することができるが、ラパマイシンの代わりに化合物46を使用する。

【０２８０】 5.14 化合物74-(R^C7=メチルチオフェン)は実施例4.1に記載のように合成する
ことができるが、ラパマイシンの代わりに化合物47を使用する。

【０２８１】

【表１５】

【０２８２】 5.15 化合物75-(R^C7=N-メチルピロール)は実施例4.1に記載のように合成する
ことができるが、ラパマイシンの代わりに化合物48を使用する。

【０２８３】 5.16 化合物75, 76-(R^C7=2,4,6-トリメトキシフェニル)は実施例5.1に記載の
ように合成することができるが、1,3-ジメトキシベンゼンの代わりに1,3,5-トリ
メトキシベンゼンを使用する。実施例6 フルオロ-ラパログの製造 6.1 C13-フルオロ-ラパログ新たな種類のラパログであるC13-フルオロ-ラパログは下記の反応経路によって製造することができる。

【０２８４】

【化２６】

【０２８５】本実施例では、DASTで処理する前に位置28と43のヒドロキシル部分を保護する。
我々は、ビス-トリエチルシリル(上記にて示す)保護基とビス-トリイソプロピル
保護基を使用した。使用者の好み又は利便性に基づいて、また保護基を除去する
前の段階での、あるいは保護基の除去と同時的になされる変換の反応条件を考慮
して、これらに代わる種々の保護基も使用することができる。次いで、保護処理
した化合物をDAST試剤で処理して13-フルオロ置換基を導入する。DAST反応は、例えば上記のように−42℃で、あるいは0℃で行うことができる。

【０２８６】 R^C7aまたはR^C7bに関して前述した種々の部分のいずれかを有する13-フルオロ-
C7-ラパログの系列を製造すべく、13-フルオロラパマイシンの7位置に変性を施すことができる。例えば、7-(o,p-ジメトキシ)-13-フルオロ-ラパログ(96と97) は、78をC7にて変換させてから保護基を除去することにより、あるいは下記に示
すように、78から保護基を除去してからC7において変換させることによって製造
することができる(および必要であれば別々に回収することもできる)。

【０２８７】

【化２７】

【０２８８】対応する13-F類縁体を得るために、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシンに対して、本明細書に開示もしくは引用されているような他の種々の化学的変換
(例えば、C7における変性だけでなく、あるいはC7における変性に代わるものとして、C28におけるフッ素化、C24とC30における還元、C24とC30におけるフッ素化、およびC43における変性などを含めて)を施すこともできる。

【０２８９】 6.2 化合物81, 82-(R^C7=Et)は実施例3.1に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９０】 6.3 化合物83-(R^C7=iPr)は実施例3.2に記載のように合成することができるが
、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９１】 6.4 化合物84-(R^C7=ベンジル)は実施例3.3に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９２】 6.5 化合物85, 86-(R^C7=-NH-CO-OMe)は実施例3.4に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９３】

【表１６】

【０２９４】 6.6 化合物87-(R^C7=-NH-SO₂-Me)は実施例3.5に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９５】 6.7 化合物88, 89-(R^C7=フラニル)は実施例3.6に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９６】 6.8 化合物90, 91-(R^C7=メチルチオフェン)は実施例3.7に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９７】 6.9 化合物92, 93-(R^C7=エチルチオフェン)は実施例3.8に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９８】 6.10 化合物68, 69-(R^C7=tert-ブチルチオフェン)は実施例3.8に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０２９９】 6.11 化合物94, 95-(R^C7=o,p-ジメトキシフェニル)は実施例3.10に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79) を使用する。

【０３００】 6.12 化合物96, 97-(R^C7=インドリル)は実施例3.11に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０３０１】 6.13 化合物98-(R^C7=o,p-ジエトキシフェニル)は実施例3.12に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０３０２】 6.14 化合物99-(R^C7=メチルチオフェン)は実施例3.13に記載のように合成することができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０３０３】 6.15 化合物100-(R^C7=N-メチルピロール)は実施例3.14に記載のように合成す
ることができるが、ラパマイシンの代わりに13-F-ラパマイシン(79)を使用する。

【０３０４】 6.20 28-F-ラパマイシン(107)の製造 −78℃にてラパマイシン(71mg, 0.078ミリモル)を塩化メチレン(1ml)中に溶解
して得た溶液にDAST(21ml, 0.156ミリモル)を加え、反応混合物を２時間撹拌してから、反応をクエンチするためにMeOHを加えた。反応混合物を室温にまで加温
し、30分撹拌した。NaHCO₃飽和水溶液(20ml)とEtOAc(30ml)との二相溶液中に注ぎ込んだ。有機層をNaHCO₃飽和水溶液(2×20ml)で、次いでNaCl飽和水溶液(2×1
0ml)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、そして溶媒を蒸発除去した。得られた
物質をシリカゲル(ヘキサン:EtOAc, 1:1〜1:2)によりフラッシュクロマトグラフ
ィー処理した。MSとフッ素NMRにより、C28フッ素化ラパマイシンが形成されてい
ることがわかった。立体異性体は逆相クロマトグラフィー(C18カラム, MeOH:H₂O
, 80:20)によって分離することができ、種々のF-28ラパログの合成に対してラパ
マイシンの代わりに使用することができる。

【０３０５】

【化２８】

【０３０６】 6.21 化合物108-(13-F, 28-F-ラパマイシン)は28-F-ラパマイシンに関して前
述したように合成することができるが、より高温(−40℃)にて２倍の体積のDAST
(41ml)を使用する。実施例7: キメラ転写調節因子をコード化している構成(constructs) A. 特に明記しない限り、本実施例および他の実施例に記載のDNA操作はすべて標準的な方法〔例えば、F.M.Ausubelらによる"Eds., Current Protocols in M
olecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1994)"を参照〕を使用して行った。

【０３０７】 B. プラスミドヒトのFKBP12と、酵母GAL4 DNA結合ドメイン、HSV VP16活性化ドメイン、ヒト
T細胞CD3ゼータ鎖細胞内ドメイン、またはヒトFASの細胞内ドメインとの融合物をコード化している構成がPCT/US94/01617に開示されている。

【０３０８】本発明に関連した融合蛋白質の発現を指示するためのさらなるDNAベクターは、哺乳類の発現ベクターであるpCGNNから誘導した(Attar,R.M.およびGilman,M.Z
. 1992. MCB 12: 2432-2443)。Xbal-BamHIフラグメントとしてpCGNN中にクローニングされた挿入物を、ヒトCMVのプロモーター配列とエンハンサー配列の制御の下で転写し(キャップ部位に関してヌクレオチド −522〜＋72)、任意のエピト
ープタグ(モノクローナル抗体12CA5によって認識されているH.インフルエンザ赤
血球凝集素遺伝子の16アミノ酸部分)と共に、そして転写調節因子ドメインの場合には、N-末端の核局在化配列(NLS; SV40T抗原から)と共に発現させる。

【０３０９】特に明記しない限り、pCGNN中にクローニングされたフラグメントはいずれも、BamHI部位のすぐ上流にてSpeI部位を含んだXbaI-BamHIフラグメントとして挿入した。XbaIとSpeIは相容性のある末端を生成するので、これによってXbaI-Bam
HIフラグメントを初期挿入物の下流にさらに挿入することが可能となり、また複
数の成分を含んだ蛋白質の段階的な組み立てが容易になった。停止コドンをSpeI
部位とBamHI部位との間に挿入した。初期の構成に対してはベクターpCGNN-GAL4 をさらに使用し、このときXbaI部位がフラグメントの3'端部だけに再生されるよ
う、GAL4 DNA結合ドメインの遺伝子のコドン1〜94をpCGNNのXbaI部位にクローニ
ングした。このように、XbaI-BamHIフラグメントをベクター中にクローニングし
て、GAL4の融合を生起させ、その後に回収することができた。

【０３１０】 (a) GAL4 DNA結合ドメイン-FRAP融合物をコード化している構成ヒトのFRAP遺伝子の部分を得るために、MMLV逆転写酵素とランダムヘキサマー
プライマー(random hexamer primer)(クロンテック第1ストランド合成キット)を
使用して、ヒトの胸腺のトータルRNA〔クロンテック(Clontech)#64028-1〕を逆転写した。プライマー1と2およびPfuポリメラーゼ〔ストラタジーン(Stratagene
)〕を含有するPCR反応において、このcDNAを直接使用した。プライマーは、ヒト
のFRAP〔すなわち、チェンらによる"Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 4
947-4951"によってFKBP-ラパマイシン結合(以後FRBと呼ぶ)に対して必要且つ充分であるとして確認されている最小'FRB'ドメインに本質的に対応する89アミノ酸領域〕を含めたアミノ酸2025-2113に対するコード化配列を増幅するように設計した。サイズ順に適切に並べられたバンドを精製し、XbaIとSpeIで消化し、Xb
aIとSpeIで消化されたpCGNN-GAL4に連結した。この構成は制限解析(restriction
analysis)(正確な配向を確認するためのもの)とDNA塩基配列決定法によって確認され、pCGNN-GAL4-1FRBであることが示された。

【０３１１】 FRBマルチマーをコード化している構成は、FRB XbaI-BamHIフラグメントを単離し、次いでこのフラグメントを、SpeIとBamHIで消化されたpCGNN-GAL4-1FRBに
再び連結してpCGNN-GAL4-2FRB(制限解析によって確認)を生成させることによって得た。新たな構成に対してこの手順を同じように繰り返して、pCGNN-GAL4-3FR
BとpCGNN-GAL4-3FRBを得た。

【０３１２】 FLAPのより大きなフラグメント〔最小限のFRBドメイン(アミノ酸2025-2113)を
取り囲んでいるが、それを超えて広がっている〕をコード化しているベクターも
組み立てた。5'XbaI部位と3'SpeI部位によってフランキングされた種々のFLAP領
域を増幅するPCRプライマーを下記のように設計した。

【０３１３】

【表１７】

【０３１４】最初に、フラグメントFRAPiを上記のようにRT-PCRによって増幅し、XbaIとSpe
Iで消化し、そしてこれを連結してXbaI-SpeI消化pCGNN-GAL4とした。この構成(p
CGNN-GAL4-FRAPi)をPCRにより解析して挿入配向を確認し、DNA塩基配列決定法に
よって実証した。次いでPCR基質として使用し、表記のプライマーを使用して他のフラグメントを増幅した。新しいフラグメントを前述のようにGAL4融合物とし
てクローニングして、pCGNN-GAL4-FRAPaやpCGNN-GAL4-FRAPb等の構成(DNA塩基配
列決定法により確認)を得た。

【０３１５】 2つのより大きなFRAPフラグメント(FRAPdとFRAPe)の連結物(concatenates)をコード化しているベクターを、前記にて使用したのと同様の方法によって生成さ
せた。FRAPdとFRAPeをコード化しているXbaI-BamHIフラグメントをpCGNN-GAL4-F
RAPdとpCGNN-GAL4-FRAPeから単離し、SpeIとBamHIで消化された同じベクター中に再び連結して、pCGNN-GAL4-2FRAPdとpCGNN-GAL4-2FRAPeを生成させた。新たな
構成に対してこの手順を同じように繰り返して、pCGNN-GAL4-3FRAPd、pCGNN-GAL
4-3FRAPe、pCGNN-GAL4-4FRAPd、およびpCGNN-GAL4-4FRAPeを得た。構成はいずれ
も制限解析によって確認した。

【０３１６】 (b) FRB-VP16活性化ドメイン融合物をコード化している構成 FRBドメインと単純ヘルペスウイルス蛋白質VP16の活性化ドメインとのN-末端融合物を生成させるために、FRBの1、2、3、および4コピーをコード化しているX
baI-BamHIフラグメントをGAL4融合ベクターから回収し、XbaI-BamHIで消化されたpCGNNに連結してpCGNN-1FRBやpCGNN-2FRBなどを得た。ついでこれらのベクターをSpeIとBamHIで消化した。VP16のアミノ酸414-490をコード化しているXbaI-B
amHIフラグメントをプラスミドpCG-Gal4-VP16から単離し(Das,G.,Hinkley, C.S.
およびHerr,W.(1995) Nature 374, 657-660)、SpeI-BamHIで消化されたベクター
に連結してpCGNN-1FRB-VP16やpCGNN-2FRB-VP16などを生成させた。構成は、制限
解析および/またはDNA塩基配列決定法によって確認した。

【０３１７】 (c) ZFHD1 DNA結合ドメイン-FRB融合物をコード化している構成哺乳類細胞におけるZFHD1コード化配列の発現を指示するための発現ベクターを以下のように調製した。プライマー5'Xba/Zifと3'Zif+Gを使用して、PCRによってZif268配列をcDNAクローンから増幅した。プライマー5'NotOctHD およびSpe
/Bam3'Octを使用して、PCRによってOct1ホメオドメイン配列をcDNAクローンから
増幅した。Zif268PCRフラグメントをXbaIとNotIでカットした。OctIPCRフラグメ
ントをNotIとBamHIでカットした。両方のフラグメントを、pCGNNのXbaI部位とBa
mHI部位との間で3方向連結反応にて連結して(Attar and Gilman, 1992)pCGNNZFH
D1を製造した。pCGNNZFHD1においては、cDNA挿入物がヒトのCMVプロモーター配列とエンハンサー配列の転写調節を受けており、SV40T抗原からの核局在化配列に結合されている。プラスミドpCGNNはさらに、選択可能なマーカーとして機能しうるアンピシリン抗菌性のための遺伝子を含有する。pCGNNZFHD1のSpeI部位と
BamHI部位との間にXbaI-BamHIフラグメントとして連結されたヒトFKBP12の1つ又
は3つの並列繰り返しを含有する誘導体(pCGNNZFHD1-FKBP×1およびpCGNNZFHD1-F
KBP×3)を製造した。pCGNNZFHD1-FKBP×3のサンプルをATCC登録第97399号にてAm
erican Type Culture Collectionに寄託した。プライマーの配列はWO96/41865に
示されている。

【０３１８】 FRBドメインとキメラDNA結合蛋白質ZFHD1とのC-末端融合物を生成させるために、FRBの1、2、3および4コピーをコード化しているXbaI-BamHIフラグメントをG
AL4融合ベクターから回収し、Spe-BamHIで消化したpCGNN-ZFHD1に連結して、pCG
NN-ZFHD1-1FRBやpCGNN-ZFHD1-2FRBなどを得た。構成は、制限解析および/または
DNA塩基配列決定法によって確認した。

【０３１９】 ZFHD1とC-末端FRBドメインとの間にさらなる'リンカー'ポリペプチドを導入す
ることの効果を調べるために、付加的な配列であるN末端-FRBをコード化しているFRAPフラグメントをZFHD1融合物としてクローニングした。FRAPa、FRAPb、FRA
Pc、FRAPd、およびFRAPeをコード化しているXbaI-BamHIフラグメントを、pCGNN-
GAL4-FRAPaやpCGNN-GAL4-FRAPb等のベクターから切り取り、SpeI-BamHIで消化さ
れたpCGNN-ZFHD1に連結してpCGNN-ZFHD1-FRAPaやpCGNN-ZFHD1-FRAPb等のベクターを得た。さらに、pCGNN-GAL4-2FRAPe、pCGNN-GAL4-3FRAPe、およびpCGNN-GAL4
-4FRAPeから2FRAPe、3FRAPe、および4FRAPeをコード化しているXbaI-BamHIフラグメントを単離し、これらのフラグメントをSpeI-BamHIで消化されたpCGNN-ZFHD
1に連結してpCGNN-ZFHD1-2FRAPe、pCGNN-ZFHD1-3FRAPe、およびpCGNN-ZFHD1-4FR
APeを得ることによって、FRAPeの2, 3および4 C-末端コピーへのZFHD1の融合物をコード化しているベクターも組み立てた。構成はいずれも制限解析によって確
認した。

【０３２０】 FRBドメインとZFHD1とのN-末端融合物をコード化しているベクターも組み立て
た。FRAPeの1、2、3および4コピーをコード化しているXbaI-BamHIフラグメントをpCGNN-GAL4-1FRAPeやpCGNN-GAL4-2FRAPeなどから単離し、XbaI-BamHIで消化さ
れたpCGNNに連結してpCGNN-1FRAPeやpCGNN-2FRAPeなどのプラスミドを得た。次いでこれらのベクターをSpeIとBamHIで消化し、ZFHD1(pCGNN-ZFHD1から単離)をコード化しているXbaI-BamHIフラグメントに連結してpCGNN-1FRAPe-ZFHD1やpCGN
N-2FRAPe-ZFHD1などの構成を得た。これら構成はいずれも制限解析によって確認
した。

【０３２１】 (d) FRB-p65活性化ドメイン融合物をコード化している構成ヒトのNF-kB p65サブユニット(以後p65で示す)の活性化ドメインとFRBドメインとの融合物を生成させるために、2つのフラグメントをプラスミドpCG-p65から
PCRによって増幅した。プライマー9(p65/5'Xba)と11(p65 3'Spe/Bam)がアミノ酸
450-550に対するコード配列を増幅し、プライマー10(p65/361Xba)と11がアミノ酸361-550に対するコード配列を増幅し、いずれも5'XbaI部位と3'SpeI/BamHI部位によってフランキングされる。PCR生成物をXbaIとBamHIで消化し、XbaIとBamH
Iで消化したpCGNN中にクローニングしてpCGNN-p65(450-550)とpCGNN-p65(361-55
0)を得た。これらの構成は、制限解析とDNA塩基配列決定法によって確認した。

【０３２２】 100種のアミノ酸のp65転写活性化配列をコード化しているDNA配列、およびより拡大したp65転写活性化ドメイン(351-550)がWO96/41865に示されている。

【０３２３】 p65活性化ドメインの一部とFRBドメインとのN-末端融合物を生成させるために
、pCGNN-1FRBやpCGNN-2FRBなどのプラスミドをSpeIとBamHIで消化した。p65(450
-550)をコード化しているXbaI-BamHIフラグメントをpCGNN-p65(450-550)から単離し、これをSpeI-BamHIで消化したベクターに連結してpCGNN-1FRB-p65(450-550
)やpCGNN-2FRB-p65(450-550)などのプラスミドを得る。pCGNN-p65(361-550)から
単離したXbaI-BamHIフラグメントを使用して、同様にpCGNN-1FRB-p65(361-550) の組み立てを行った。これらの構成は制限解析によって確認した。

【０３２４】 p65活性化ドメインとN-末端FRBドメインとの間にさらなる'リンカー'ポリペプ
チドを導入することの効果を調べるために、付加的な配列であるC末端-FRBをコード化しているFRAPフラグメントをp65融合物としてクローニングした。FRAPa、
FRAPb、FRAPf、FRAPg、およびFRAPhをコード化しているXbaI-BamHIフラグメント
を、pCGNN-GAL4-FRAPaやpCGNN-GAL4-FRAPbなどのベクターから切り取り、XbaI-B
amHIで消化されたpCGNNに連結してpCGNN-FRAPaやpCGNN-FRAPbなどのベクターを得た。次いでこれらのプラスミドをSpeIとBamHIで消化し、p65(アミノ酸450-550
)をコード化しているXbaI-BamHIフラグメントと連結してpCGNN-FRAPa-p65やpCGN
N-FRAPb-p65などの5つのペクターを得た。これらは制限解析によって確認した。
FRAPeの1および3 N-末端コピーへのp65の融合物をコード化しているベクターを、pCGNN-1FRAPeとpCGNN-3FRAPeをSpeIとBamHIで消化することによって製造した。次いで、p65(450-550)とp65(361-550)〔pCGNN-p65(450-550)とpCGNN-p65(361-
550)から単離〕をコード化しているXbaI-BamHIフラグメントを連結して、pCGNN-
1FRAPe-p65(450-550)、pCGNN-3FRAPe-p65(450-550)、pCGNN-1FRAPe-p65(361-550
)、およびpCGNN-3FRAPe-p65(361-550)などのベクターを得た。構成はいずれも制
限解析によって確認した。

【０３２５】 p65活性化ドメインの一部とFRBドメインとのC-末端融合物をコード化している
ベクターも組み立てた。pCGNN-p65(450-550)やpCGNN-p65(361-550)などのプラス
ミドをSpeIとBamHIで消化し、FRAPe(pCGNN-GAL4-1FRAPeやpCGNN-GAL4-3FRAPeから単離)の1および3コピーならびにFRB(pCGNN-GAL4-1FRBから単離)の1コピーをコ
ード化しているXbaI-BamHIフラグメントと連結してpCGNN-p65(450-550)-1FRAPe 、pCGNN-p65(450-550)-3FRAPe、pCGNN-p65(361-550)-1FRAPe、pCGNN-p65(361-55
0)-3FRAPe、pCGNN-p65(450-550)-1FRB、およびpCGNN-p65(361-550)-1FRBなどのプラスミドを得た。構成はいずれも制限解析によって確認した。

【０３２６】 (e) さらに他の構成 FRAP配列の代替部分または変性を施したペプチド配列を含有するFRBドメインを使用して、上記の手順と同様に他の組み立てを行った。例えば、FRAPの全コー
ド領域を増幅するためにはプライマー12と13を使用する。プライマー1と13、6と
13、および5と13は、FRBドメインを取り囲んでいて、蛋白質のC-末端に伸びてい
る3つのフラグメント(脂質キナーゼ相同ドメインを含む)を増幅するのに使用される。3つのフラグメントは、FRBドメインに対して蛋白質N-末端の異なった部分
をコード化していることによって異なっている。いずれの場合においても、RT-P
CRを前述のように使用してヒトの胸腺RNAからの領域を増幅し、PCR生成物を精製
し、XbaIとSpeIで消化し、XbaI-SpeIで消化されたpCGNNに連結した。構成は、制
限解析とDNA塩基配列決定法によって確認した。

【０３２７】 (f) プライマーの配列 1 5'GCATGTCTAGAGAGATGTGGCATGAAGGCCTGGAAG 2 5'GCATCACTAGTCTTTGAGATTCGTCGGAACACATG 3 5'GCACATTCTAGAATTGATACGCCCAGACCCTTG 4 5'CGATCAACTAGTAAGTGTCAATTTCCGGGGCCT 5 5'GCACTATCTAGACTGAAGAACATGTGTGAGCACAGC 6 5'GCACTATCTAGAGTGAGCGAGGAGCTGATCCGAGTG 7 5'CGATCACCTAGTGGAAACATATTGCAGCTCTAAGGA 8 5'CGATCAACTAGTTGGCACAGCCAATTCAAGGTCCCG 9 5'ATGCTCTAGACTGGGGGCCTTGCTTGGCAAC 10 5'ATGCTCTAGAGATGAGTTTCCCACCATGGTG 11 5'GCATGGATCCGCTCAACTAGTGGAGCTGATCTTGACTCAG 12 5'ATGCTCTAGACTTGGAACCGGACCTGCCGCC 13 5'GCATCACTAGTCCAGAAAGGGCACCAGCCAATAT 制限部位に下線が引いてある(XbaI=TCTAGA, SpeI=ACGAGT, BamHI=GGATCC)。

【０３２８】（ｇ）代表的な最終構築物のＤＮＡ配列：１２ＣＡ５エピトープ−ＳＶ４０ＮＬＺ−ＺＦＨＤ１−ＦＲＢ融合物をコード
するｐＣＧＮＮ−ＺＦＨＤ１−１ＦＲＢはＷＯ９６／４１８６５に示される。

【０３２９】（ｈ）２シストロン性構築物エンセファロミオカルディティスウィルス由来の内部リボソーム移行配列（Ｉｎ
ｔｅｒｎａｌＲｉｂｏｓｏｍａｌＥｎｔｒｙＳｅｑｕｅｎｃｅ、ＩＲＥＳ）はｐＷＺＬ−ＢｌｅｏからＰＣＲにより増幅された。生じた断片は、ｐＢＳ−Ｓ
Ｋ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングされ、ＩＲＥＳ配列の上流および
下流にＸｂａＩ部位および終止コドンを含み、ＡＴＧを囲むＮｃｏＩ部位および
それに続くＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む。クローニングを可能にするた
めに、ＷＯ９６／４１８６５に示されたオリゴヌクレオチドを用いてｐＣＧＮＮ
−ＺＦＨＤ−３ＦＫＢＰの開始ＡＴＧがＮｃｏＩ部位に変異させられ、ＸｂａＩ
部位が、ＮｈｅＩ部位に変異させられた。ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰを含むＮｃｏ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片はｐＢＳ−ＩＲＥＳの下流にクローニングされ、ｐＢＳ−Ｉ
ＲＥＳ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰが作製された。このプラスミド由来のＸｂａＩ
−ＢａｍＨＩ断片は、次にＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＣＧＮＮ−１ＦＲＢ−ｐ
６５（３６１−５５０）にクローニングされ、ｐＣＧＮＮ−１ＦＲＢ−ｐ６５（
３６１−５５０）−ＩＲＥＳ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰが作製された。

【０３３０】Ｃ．キメラタンパク質の発現のためのレトロウィルスベクター安定に取り込まれた低コピー数の遺伝子由来の転写因子融合タンパク質を発現す
るために用いられたレトロウィルスベクターはｐＳＲａＭＳＶｔｋＮｅｏ（Ｍｕ
ｌｌｅｒｅｔａｌ．ＭＣＢ１１：１７８５−９２、１９９１）およびｐＳ
ＲａＭＳＶ（ＸｂａＩ）（Ｓｗｙｅｒｓｅｔａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
８１：３０７−３１３、１９９５）に由来する。両ベクターの単一のＢａｍＨＩ
部位は、ＢａｍＨＩにより消化し、Ｋｌｅｎｏｗにより平滑化し、再びライゲー
ションされて、それぞれｐＳＭＴＮ２およびｐＳＭＴＸ２が作製された。ｐＳＭ
ＴＮ２は内部のチミジンキナーゼプロモーターからＮｅｏ遺伝子を発現する。Ｚ
ｅｏｃｉｎ遺伝子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はＮｈｅＩ断片として、ｐＳＭＴＸ
２中の内部チミジンキナーゼプロモーターの下流の単一のＸｂａＩ部位にクロー
ニングされる。このＺｅｏｃｉｎ断片は以下のプライマーを用いてＺｅｏｃｉｎ
コード領域を取り囲むＮｈｅＩ部位を導入することで、ｐＺｅｏ／ＳＶ（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ）に変異導入することで作製された。プライマー１５’−ＧＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＴＡＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧプライマー２５’−ＧＧＣＧＧＴＧＴＴＧＧＣＴＡＧＣＧＴＣＧＧＴＣＡＧｐＳＭＴＮ２はＬＴＲの下流に単一のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を
含む。ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片として合成された転写因子融合タンパク質のク
ローニングを可能にするために、以下の配列がＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
部位の間に挿入され、ｐＳＭＴＮ３が作製された。

【０３３１】

【化２９】

【０３３２】等価な断片がｐＳＭＴＺの単一のＥｃｏＲＩ部位に挿入され、３’ＨｉｎｄＩ
ＩＩ部位がＥｃｏＲＩ部位に置き変わっているというだけの変更を持つｐＳＭＴ
Ｚ３が作製された。

【０３３３】ｐＳＭＴＮ３およびｐＳＭＴＺ３キメラ転写因子が５’ウィルスＬＴＲの下流
にＸｂａＩ−ＢａｍＨ１断片としてクローニングされることを可能にし、それぞ
れ抗生物質Ｇ４１８またはＺｅｏｃｉｎに対する抵抗性を与える能力によって安
定な取り込み体の選択を可能にする。

【０３３４】レトロウィルスベクターＳＭＴＮ−ＺＦＨＤＩ−３ＦＫＢＰを作製するために
、ｐＣＧＮＮ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰは、初め融合タンパク質の始めのアミノ
酸の上流のＥｃｏＲＩ部位を付加するように変異導入された。ＺＦＨＤ１−３Ｆ
ＫＢＰがレトロウィルスＬＴＲから発現されるようにＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ（
平滑化）断片は、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（平滑化）ｐＳＲａＭＳＶｔｋＮ
ｅｏにクローニングされた。

【０３３５】［実施例８］；ラパマイシン依存的な転写の活性化予備的な実験において、Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインまたは転写活性化ドメイ
ンに融合された３コピーのＦＫＢＰは、１つまたは２つだけのＦＫＢＰドメイン
を含む対応する融合タンパク質よりも強く安定に取り込まれたまたは一時的に形
質転換されたレポーター遺伝子を活性化した。ＦＲＢ融合タンパク質によりこの
パラメーターを評価するために、１つまたはそれ以上のコピー数のＦＲＢドメイ
ンに融合されたＧａｌ４ＤＮＡ結合を含むエフェクタープラスミドが、３つのＦ
ＫＢＰドメインおよびｐ６５活性化ドメインをコードするプラスミド（３ｘＦＫ
ＢＰ−ｐ６５）と共に、一時的な形質転換によって共形質転換された。この系に
おいてはＧａｌ４ＤＮＡ結合ドメインに融合された４コピーのＦＲＢドメインは
、より少ないＦＲＢドメインを持つ、対応する融合タンパク質よりも強く、安定
に取り込まれたレポーター遺伝子を活性化したことが分かった。

【０３３６】方法：ＨＴ１０８０Ｂ細胞は、１０％ウシ血清を添加されたＭＥＭ中で生育
させられた。６ウェルプレート中（Ｆａｌｃｏｎ）でウェルあたり約４ｘ１０５
細胞が販売者（ＧＩＢＣＯ，ＢＲＬ）の推奨により、リポフェクチン法によって
一時的に形質転換された。この実験に用いられたＤＮＡ：リポフェクタミン比は
１：６に対応する。各ウェルの細胞は５００ｎｇのｐＣＧＮＮＦ３−ｐ６５、担
体として１．９ｕｇのＰＵＣ１１８プラスミド、および以下のプラスミドのうち
のいずれかを１００ｎｇを受容した。ｐＣＧＮＮＧａｌ４−４ＦＲＢ、ｐＣＧＮ
ＮＧａｌ４−２ＦＲＢ、ｐＣＧＮＮＧａｌ４−３ＦＲＢまたはｐＣＧＮＮＧ
ａｌ４−４ＦＲＢ。形質転換に続いて、２ｍｌの新鮮な培養液が加えられ、示さ
れた濃度のラパマイシンが添加された。２４時間後に、１００ｕｌの培養液が記
載されたように（Ｓｐｅｎｃｅｒｅｔａｌ，１９９３）ＳＥＡＰ活性を試験
された。

【０３３７】ｐ６５活性化ドメインに融合された複数のＦＲＢドメインがレポーター遺伝子
の転写活性化の増大をもたらすかどうかを試験するために、ＨＴ１０８０Ｂ細
胞を、Ｇａｌ４−３ｘＦＫＢＰおよびｐ６５活性化ドメインに融合された１，２
，３，または４コピーのＦＲＢを発現するプラスミドにより共形質転換された。
驚いたことに、ＤＮＡ結合ドメイン−ＦＲＢ融合物とは異なり、ｐ６５活性化ド
メインに融合された１コピーのＦＲＢが、２つ以上のＦＲＢのコピーを持つ対応
する融合タンパク質よりも有意に強くレポーター遺伝子を活性化した。

【０３３８】方法：ＨＴ１０８０Ｂ細胞は、１０％ウシ血清を添加されたＭＥＭ中で生育
させられた。６ウェルプレート中（Ｆａｌｃｏｎ）でウェルあたり約４ｘ１０５
細胞がＧＩＢＣＯ，ＢＲＬの推奨により、リポフェクチン法によって一時的に形
質転換された。用いられたＤＮＡ：リポフェクタミン比は１：６に対応する。各
ウェルの細胞は担体として１．９ｕｇのＰＵＣ１１８プラスミド、１００ｎｇの
ｐＣＧＮＮＧａｌ４Ｆ３、および以下のプラスミドのうちのいずれかを５００ｎ
ｇを受容した。ｐＣＧＮＮ１、２、３または４ＦＲＢ−ｐ６５。形質転換に続い
て、２ｍｌの新鮮な培養液が加えられ、示された濃度のラパマイシンが添加され
た。２４時間後に、１００ｕｌの培養液が記載されたように（Ｓｐｅｎｃｅｒ
ｅｔａｌ，１９９３）ＳＥＡＰ活性を試験された。

【０３３９】５ｘＧａｌ４−ＩＬ２−ＳＥＡＰレポーター遺伝子および、Ｇａｌ４ＤＮＡ結
合ドメインおよび３コピーのＦＫＢＰを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ
配列を安定に取り込んで含む別の安定な細胞株（ＨＴ１０８０Ｂ１４）を用いて
同様の実験がまた指揮された。これらの細胞は１またはそれ以上のコピー数のＦ
ＲＢドメインに融合されたｐ６５活性化ドメインを発現するエフェクタープラス
ミドにより一時的に形質転換された。ＨＴ１０８０Ｂ細胞を用いた我々の観察
と同様に、これらの実験においては、１コピーのＦＲＢ−ｐ６５活性化ドメイン
融合タンパク質を発現するエフェクタープラスミドが、２つまたはそれ以上のコ
ピー数のＦＲＢを持つ他のもの達よりも強く、レポーター遺伝子を活性化した。

【０３４０】［実施例９］Ａ．一時的に形質転換された細胞におけるラパマイシン依存的な転写活性化：
ＺＦＨＤ１およびｐ６５融合物ＳＥＡＰ標的遺伝子および代表的なＺＦＨＤ−ＦＫＢＰ−およびＦＲＢ−ｐ６
５−を含む融合タンパク質をコードするプラスミドにより一時的に形質転換され
たヒト繊維肉腫細胞は、ラパマイシン依存的および投与量応答性のＳＥＡＰの細
胞培養液への分泌を示した。図４Ａを見よ。一つまたは両方の転写因子融合タン
パク質プラスミドが省かれた場合、細胞中にＳＥＡＰ生産は検出されず、ラパマ
イシンが加えられない場合も検出されなかった（図４B）。全ての成分が存在した場合、しかしながら、ラパマイシン濃度が０．５ｎＭまで少なくても、ＳＥＡ
Ｐ分泌が検出可能であった（図４Ａ）。ＳＥＡＰ分泌のピークは５ｎＭにおいて
観察された。同一の転写因子がｈＧＨレポーター遺伝子またはレトロウィルスベ
クターによる感染によって安定に取り込まれたＳＥＡＰレポーター遺伝子のラパ
マイシン依存的な活性化に用いられた場合にも、同様の結果がえられた。薬剤非
存在化でのＳＥＡＰ分泌が検出不可能なため、ラパマイシンに応答して何倍に活
性化しているかを決定することは難しいが、この系においてはラパマイシン非存
在時のバックグラウンドレベルの少なくとも１０００倍の増幅があることは明ら
かである。したがって、この系は、検出不能なバックグラウンド活性および高い
ダイナミックレンジを示す。

【０３４１】転写因子融合タンパク質のいくつかの異なる配置が試された（ＷＯ９６／４１
８６５、図５を見よ）。ＦＫＢＰドメインがＺＦＨＤ１に、ＦＲＢがｐ６５に融
合された場合、複数のＦＫＢＰがＺＦＨＤ１に融合され、少数のＦＲＢがｐ６５
に融合された場合、最適なレベルのラパマイシン誘導活性化が起きた。ＤＮＡ結
合タンパク質上の複数の薬剤結合ドメインに対する優先度は、これらのタンパク
質の、複数の活性化ドメインを補充し、より高いプロモーター活性を誘発する能
力を反映し得る。活性化ドメイン上に単一の薬剤結合ドメインが存在することは
、それぞれのＺＦＨＤ上のＦＫＢＰを一つのｐ６５に補給することを可能にし得
る。ｐ６５上のＦＲＢ数のいかなる増大も、より少ない活性化ドメインが、それ
ぞれが複数のＦＲＢ−ＦＫＢＰ相互作用で連結されたＺＦＨＤに補給され得る可
能性を増大させ得る。

【０３４２】方法：ヒト線維肉腫由来のＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１２１）は非必須アミ
ノ酸および１０％ウシ胎児血清を補給されたＭＥＭ中で生育させられた。２４−
ウェル培養皿（ｆａｌｃｏｎ，６ｘ１０４細胞／ウェル）はリポフェクタミンを
用いて、製造者（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）の推奨する条件で形質転換された。それ
ぞれのウェルに、合計で３００ｎｇの以下のＤＮＡが形質転換された：１００ｎ
ｇＺＦＨＤｘ１２−ＣＭＶ−ＳＥＡＰレポーター遺伝子、２．５ｎｇｐＣＧ
ＮＮ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰまたはその他のＤＮＡ結合ドメイン融合物、５ｎ
ｇｐＣＧＮＮ−１ＦＲＢ−ｐ６５（３６１−５５０）またはその他の活性化ド
メイン融合物および１９２．５ｎｇｐＵＣ１１８。ＤＮＡ結合ドメインまたは
活性化ドメインが省かれた場合、等価な量の空のｐＣＧＮＮ発現ベクターが置換
された。リポフェクション（５時間）に続いて示された量のラパマイシンを含む
５００ｕｌが、それぞれのウェルに加えられた。２４時間後に培養液が除かれ、
励起波長３５０ｎｍおよび放出波長４５０ｎｍで、ＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＳ
ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、記載されたよう
に（Ｓｐｅｎｃｅｒｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１０１９−２４，
１９９３）ＳＥＡＰ活性が試験された。偽形質転換細胞から測定されたバックグ
ラウンドＳＥＡＰ活性がそれぞれの値から差し引かれた。マウスへの注射用の一時的に形質転換されたＨＴ１０８０細胞を調整するために
（以下を見よ）、１００ｍｍ培養皿（２ｘ１０６細胞／培養皿）中の細胞が以下
のＤＮＡによりリン酸カルシウム沈殿によって１６時間形質転換された（Ｇａｔ
ｚ，Ｃ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ａ，＆Ｗｗｅｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｒ．，１９９１，Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７，２２９−２３７）：１０ｍｇのｐＺＨＷＴ
ｘ１２−ＣＭＶ−ｆＧＨ、１ｍｇｐＣＧＮＮ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰ、２ｍ
ｇｐＣＧＮＮ−１ＦＲＢ−ｐ６５（３６１−５５０）および７ｍｇｐＵＣ１
１８。形質転換された細胞はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）によりすすがれ、５時間
新鮮な培養液が与えられた。注射用に回収するために、細胞は培養皿から１０ｍ
ＭＥＤＴＡを含むＨｅｐｅｓ緩衝溶液中に移され、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／
０．１％グルコースにより洗浄され、２ｘ１０７細胞／ｍｌの濃度で同じものに
懸濁された。

【０３４３】プラスミド：転写因子融合プラスミドの構築は上に記載される。ｐＺＨＷＴｘ１２−ＣＭＶ−ＳＥＡＰ１２の並行するＺＦＨＤ１結合部位のコピー（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚｅｔａｌ
．，１９９５）および分泌されるアルカリホオスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現
を起こす、ヒトサイトメガロウィルス最初期遺伝子由来の基本プロモーターを含
む、このレポーター遺伝子はｐＳＥＡＰのプロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の
ＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＷＯ９６／４１８６５に示された１２このＺ
ＦＨＤ結合部位を含むＮｈｅＩ−ＸｂａＩおよび、ＷＯ９６／４１８６５に示
された最小ＣＭＶプロモーター（−５４から＋４５）を含むＸｂａＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片に置き換えられることで調整された。

【０３４４】ｐＺＨＷＴｘ１２−ＣＭＶ−ｈＧＨこのレポーター遺伝子の活性化はｈＧＨの生産をもたらす。これは、ｐＺＨＷＴ
ｘ１２−ＣＭＶ−ＳＥＡＰの（ＳＥＡＰコード配列を含む）ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂ
ａｍＨＩ(平滑)断片を、（ｈＧＨゲノムクローン；Ｓｅｌｄｅｎｅｔａｌ．
，ＭＣＢ６：３１７１−３１７９，１９８６；を含み、ＢａｍＨＩおよびＥｃ
ｏＲＩ部位が共に平滑化されている）ｐ０ＧＨ由来のＨｉｎｄＩＩＩ（平滑）−
ＥｃｏＲＩ断片によって置き換えることで構築された。

【０３４５】ｐＺＨＷＴｘ１２−ＩＬ２−ＳＥＡＰこのレポーター遺伝子は最小ＣＭＶプロモーターを含むＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片が、最小ＩＬ２遺伝子プロモーターを含む以下のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片（開始部位に対して−７２から+４５；Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔｅｔａｌ．，ＭＣＢ６：３０４２−３０４９，１９８６）により置き換えられてい
る以外はｐＺＨＷＴｘ１２−ＣＭＶ−ＳＥＡＰに同一のものである（ＷＯ９６
／４１８６５を見よ）。

【０３４６】ｐＬＨレポーター遺伝子の単一または低コピー数での安定な取り込みを可能にするため
に、以下のレトロウィルスベクターが構築された。モロニーマウス白血病ウィル
スＬＴＲに支配されるヒグロマイシンＢ耐性遺伝子および単一の内部ＣｌａＩ部
位を含むｐＬＨ（ＬＴＲ−ｈｐｈ）は以下のように構築された：ｐＢａｂｅＨ
ｙｇｒｏ（ＭｏｒｇａｎｓｔｅｒｎａｎｄＬａｎｄ，ＮＡＲ１８：３５８
７−９６，１９９０）由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩ断片として、ｈｐｈ遺伝
子はＢａｍＨＩ−ＣｌａＩ切断されたｐＢａｂｅＢｌｅｏ（ｂｌｅｏ遺伝子の
欠損がもたらされている：ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位は共に平滑化さ
れている）にクローニングされた。

【０３４７】ｐＬＨ−ＺＨＷＴｘ１２−ＩＬ２−ＳＥＡＰ１２個の並行コピーのＺＦＨＤ１結合部位およびＳＥＡＰ遺伝子の発現を支配す
るＩＬ２遺伝子由来の基本プロモーターを含むレポーター遺伝子のコピーをｐＬ
Ｈレトロウィルスベクターにクローニングするために、ｐＺＨＷＴｘ１２−ＩＬ
２−ＳＥＡＰ由来のＭｌｕＩ−ＣｌａＩ断片（ＣｌａＩリンカーが加えられてい
る）が、ｐＬＨのＣｌａＩ部位にクローニングされた。ウィルスＬＴＲおよび内
部ＺＦＨＤ−ＩＬ２プロモーターからの転写の方向が同一になるような向きであ
った。

【０３４８】ｐＬＨ−Ｇ５−ＩＬ２−ＳＥＡＰＳＥＡＰ遺伝子の発現を指示する最小ＩＬ２プロモーターに包埋された５つのＧ
ａｌ４部位を含むレトロウィルスベクターを構築するために、以下のものから成
るＣｌａＩ−ＢｓｔＢＩ断片が、ウィルスＬＴＲおよび内部Ｇａｌ４−ＩＬ２プ
ロモーターからの転写が同一になるように、ｐＬＨのＣｌａＩ部位に挿入された
：５つのＧａｌ４部位およびＩＬ２遺伝子の−３２４から−２９４および−７２
から＋４５領域（ＷＯ９６／４１８６５に示される）を含むＣｌａＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片および、終止コドンの直後にＢｓｔＢＩ部位を付加するように変異
導入された（ＷＯ９６／４１８６５に示される）ＳＥＡＰ遺伝子コード配列を
含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＢＩ断片（Ｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ６６：１−１０，１９８８）。

【０３４９】Ｂ．安定に形質転換された細胞におけるラパマイシン依存的な転写活性化以下の実験は、この系が安定に形質転換された細胞において同様の性質を示すこ
とを確認した。我々は、ＳＥＡＰ標的タンパク質および、それぞれＺＦＨＤ１− ３ＦＫＢＰおよび１ＦＲＢ−ｐ６５に対する発現ベクターによる一連の形質転換
により、安定な細胞株を作製した。最終的な形質転換の結果の数ダースの安定な
クローンはラパマイシン依存的なＳＥＡＰ生産を示した。このプールから我々は
、その多くがラパマイシンに応答して高レベルのＳＥＡＰを生産するような個別
のクローンをいくつか解析した。そのようなクローンの一つから得られた結果が
WO９６／４１８６５の図４Ｃに示される。このクローンは、プールの約４０倍多
いレベルのＳＥＡＰを生産し、これは一時的に形質転換された細胞よりも有意に
多かった。バックグラウンドのＳＥＡＰ生産量およびこのクローンでの誘導率を
明確に定量する試みにおいて、我々は、未処理細胞におけるいかなるＳＥＡＰ活
性も検出するためのに、ＳＥＡＰ試験の長さが、約５０の因子により増大させら
れた二つ目の一群の試験を行った。これらの条件かでは偽形質転換された細胞は
任意の蛍光単位で４７を示すのに対し、形質転換された細胞はラパマイシンがない場合５４単位、１００ｎＭラパマイシン存在下では９０，０００単位以上を示
した。したがって、この細胞株においては、バックグラウンド遺伝子発現は無視
可能であり、誘導率は４桁以上大きな規模であった。

【０３５０】安定形質転換の仕事を単純化するために、内部リボソーム移行配列（ＩＲＥＳ
）の使用を通して、ＺＦＨＤ１−３ＦＨＢＰおよび１ＦＲＢ−ｐ６５の生産を指
示する二シストロン性発現ベクターを用いた。この発現プラスミドは、ゼオシン
耐性マーカープラスミドと共に、レトロウィルスにより形質転換されたＳＥＡｐ
レポーター遺伝子に形質転換され、５０個の薬剤耐性クローンが選択され、増幅さ
れた。このクローンのプールはまた検出可能なバックグラウンドなしで、一時的
に形質転換された細胞において観察されたのと非常に類似した投与量依存性カー
ブを示すラパマイシン依存的ＳＥＡＰ生産を示した。このプールはＷＯ９６／４
１８６５の図４において研究されたクローンと同様の能力を持つ個々のクローン
を含むことが期待され得る。従って、ラパマイシン応答性遺伝子発現は、一時的
および安定に形質転換された細胞の両方において容易に得られ得る。どちらの場
合においても、調節能は、非常に低いバックグラウンドおよび高い誘導率によっ
て特徴づけられる。

【０３５１】安定した細胞株。レポーター遺伝子またはＤＮＡ結合領域融合物を含むヘルパ
ーフリーのレトロウイルスは、２９３Ｔ細胞への一過的共形質転換により作成さ
れ（ＰｅａｒＷ．Ｓ．，ＮｏｌａｎＧ．Ｐ．，ＳｃｏｔｔＭ．Ｌ．＆ＢａｌｔｉｍｏｒｅＤ．，１９９３，一過的形質転換による
高力価ヘルパーフリーレトロウイルスの生産。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，８３９２−８３９６）、これは各々、Ｐｓｉ
（−）広宿主性梱包ベクター及びレトロウイルスベクターｐＬＨ−ＺＨＷＴｘ１
２−ＩＬ２−ＳＥＡＰまたはＳＭＹＮ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰと共に行われた
。安定に組み込まれたレポーター遺伝子を含むクローン細胞株を作成するために
、レトロウイルスストックに感染したＨＴ１０８０細胞は、希釈され、３００ｍ
ｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ存在下で選択された。この及びその他の細胞株由
来の、下記に記載の各クローンは、失われた含有物の一時的形質転換の後、上記
記載の通りのラパマイシン添加によりスクリーニングされた。解析された１２ク
ローンの全てが誘導可能であり、基礎活性はほとんどまたは全くない。もっとも
応答性のクローンであるＨＴ１０８０Ｌはさらなる研究のために選択された。

【０３５２】安定に組み込まれたｐＬＨ−ＺＨＷＴｘ１２−ＩＬ２−ＳＥＡＰレポーター遺
伝子、ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰＤＮＡ結合領域及び１ＦＲＢ−ｐ６５（３６１
−５５０）活性化領域を有するＨＴ２０−６細胞は、まず最初にＨＴ１０８０Ｌ
細胞にＳＭＴＮ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰ梱包レトロウイルスを感染させ、５０
０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地において選択することにより作成された。強
い応答性クローンであるＨＴ１０８０Ｌ３は、線状化したｐＣＧＮＮ−１ＦＲＢ
−ｐ６５（３６１−５５０）及びｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン）を感染させ、
２５０ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地において選択した。各クローンはまず、
１ＦＲＢ−ｐ６５（３６１−５５０）の存在をウェスタンにより試験した。８つ
の陽性クローンはラパマイシンの添加により解析した。８つ全てが弱い基礎活性
を有しており、そのうち６つにおいては遺伝子発現が、強度において少なくとも
２オーダーまでは誘導された。もっとも強い応答を与えたクローンであるＨＴ２
０−６はさらなる解析のために選択された。

【０３５３】ＨＴ２３細胞は、ＨＴ１０８０Ｌ細胞に線状化したｐＣＧＮＮ−１ＦＲＢ−ｐ
６５（３６１−５５０）−ＩＲＥＳ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰ及びｐＺｅｏＳＶ
を共形質転換し、２５０ｍｇ／ｍｌのゼオシンを含む培地において選択すること
により作成された。約５０クローンは解析のために蓄えた。

【０３５４】解析のために、細胞は９６ウェルディッシュに撒き（１．５Ｘ１０４細胞
／ウェル）、指示された量のラパマイシン（または溶媒）を含む２００μｌの培
地を各ウェルに加えた。１８時間後、培地を除去しＳＥＡＰ活性を解析した。い
くつかの場合において、培地は解析の前に希釈され、倍数希釈により得られた相
対ＳＥＡＰ単位を多重化した。形質転換しないＨＴ１０８０細胞より計測された
背景ＳＥＡＰ活性は、各値より減算した。実施例１０：マウスにおけるラパマイシン依存ｈＧＨ生産インビボ方法：動物、畜産及び一般的手順。雄ｎｕ／ｎｕマウスはチャールズリ
バー研究室（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より得、実験に先立ち５日間気候
順化を行った。それらは無菌条件下で飼育し、実験の最中を通し滅菌食料と滅菌
水に自由に触れることができ、無菌技術を通して操作された。免疫無防備状態の
動物は、飼育、畜産技術、または実験技術の結果、外部感染または疾病を示すこ
とはなかった。

【０３５５】一過的形質転換細胞をマウスに移植するために、２ｘ１０６の形質転換さ
れたＨＴ１０８０細胞は、１００ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．１％グル
コース緩衝液に懸濁し、動物の臀部及び側部の４つの筋肉内場に注射（一つの場
に約２５ｍｌ）した。対照マウスは同じ量の緩衝液の導入だけを受けた。

【０３５６】ラパマイシンはインビボ投与のために、同じ分量のＮ，Ｎ−ジメチルアセトア
ミド及びポリエチレングリコール（平均分子量４００）及びポリオキシエチレン
ソルビタンモノオレエート９：１（ｖ：ｖ）混合物に溶解することによりカプセ
ル剤とした。完全なカプセルにおけるラパマイシンの濃度は、２．０ｍｌ／ｋｇ
導入量の適切な量のインビボ投与に十分であった。溶液量の正確性は、尾部血管
への血管注射に先立つＨＰＬＣ解析により確定した。いくつかの対照マウスは、
なにも形質転換されていないＨＴ１０８０細胞を有し、１０．０ｍｇ／ｋｇのラ
パマイシンを受けた。加えて、他の対照マウスは、形質転換された細胞を有し、
ラパマイシン溶媒のみを受けた。

【０３５７】血液はＣＯ２吸入によりマウスを麻酔または犠牲にし、集めた。麻酔されたマ
ウスは、心臓に穴をあけることにより１００ｍｌの血液を集めるために使用され
た。マウスは復活させて快復させ、続けて血液の回収を行った。犠牲になったマ
ウスは、即座に瀉血した。血液標本は、４℃で２４時間血餅を作り、血清はそれ
に続く１０００ｘｇで１５分の遠心分離を行い集めた。血清ｈＧＨはＢｏｅ
ｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ非同位体サンドイッチＥＬＩＳＡ（カタログ
ナンバー１５８５８７８）により測定した。解析は０．０１２５ｎｇ／ｍｌの最
低検出限界及び０．４ｎｇ／ｍｌに延長されるダイナミックレンジを有した。推
奨される解析の指示は以下の通り。吸収は４０５ｎｍを４９０ｎｍの参照波長で
、ＭｏｌｅｃｌａｒＤｅｖｉｃｅミクロタイタープレートリーダーで読んだ。
ＥＬＩＳＡにおける抗体試薬は、希釈血清または非変性標本において内生のマウ
スｈＧＨと交差反応を示さなかった。インビボにおけるｈＧＨ発現。用量依存性ラパマイシン誘導性ｈＧＨ発現刺激の
試験のために、ラパマイシンは、ＨＴ１０８０細胞の注射に続き約一時間後マウ
スに投与した。ラパマイシン用量は、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１
．０、３．０、または１０．０ｍｇ／ｋｇのいずれかである。ラパマイシン投与
から１７時間後、マウスは血液を集めるために犠牲にした。

【０３５８】インビボｈＧＨ発現の経時変化を示すために、マウスは細胞の注射後１時間に
１０．０ｍｇ／ｍｌのラパマイシンを受けた。マウスはラパマイシン投与後４、
８、１７、２４及び４２時間後に犠牲になった。

【０３５９】ラパマイシンが、移植されたＨＴ１０８０からｈＧＨを持続発現させる能力は
、ラパマイシンの反復投与により試験された。マウスは形質転換されたＨＴ１０
８０細胞を上記記載の通りに投与された。細胞の注射から約１時間後、マウスは
、５回の１０ｍｇ／ｋｇ量のラパマイシン血管投与のうちの一回目を受けた。残
った４回の投与は、１６、３２、４８及び６４時間後に、麻酔条件で即座に続け
て血液を集められる状態で与えられた。最初のラパマイシン投与から７２、８０
、８８及び９６時間後に追加の血液採集も行った。対照マウスは、細胞を投与さ
れたが、ラパマイシン投与の様々な時間に溶媒だけを受けた。実験動物及びその
対照は、各々２つの集団の１つとして割り当てた。二つの実験集団の各々、及び
二つの対照集団は同一の薬剤または溶媒処理をそれぞれ受けた。血液最終時間に
おいて異なる二つの集団は、各動物の血液採集頻度を減少させるために二つの集
団間で交互に行った。結果ラパマイシンは、これらの動物において用量依存的ｈＧＨ生産を誘発した（Ｗ
Ｏ９６／４１８６５の図６）。ラパマイシン処理された動物におけるｈＧＨ濃度
は、ヒトにおける通常循環程度（０．２−０．３ｎｇ／ｍｌ）と好意的に比較さ
れる。これらの実験において、ｈＧＨ生産におけるプラトーが観察されないこと
から、形質転換された細胞のｈＧＨ生産能力の最大値に達していないことが示唆
される。形質転換された細胞を受けたがラパマイシンを受けていない、及びラパ
マイシンを受けたが細胞を受けていない、対照動物は血清に検出可能なｈＧＨを
示さなかった。つまり、これらの動物におけるｈＧＨ生産は完全に、設計された
細胞及びラパマイシンの両者の存在に依存した。

【０３６０】ラパマイシン投与１７時間後の血清におけるｈＧＨの顕著な程度の存在は重要
である、なぜならｈＧＨはこれら動物における４分以下の半減期の循環により除
去されるからである。この観察は、設計された細胞がラパマイシン処理の後、長
時間ｈＧＨを分泌し続けることを示唆する。ｈＧＨ生産のラパマイシン制御の速
度論を確認するため、我々は動物を一回のラパマイシン投与処理し、その後異な
る時間におけるｈＧＨ量を測定した。血清ｈＧＨは、ラパマイシン処理の後４時
間以内に観察され、ピークは８時間後にあり（ｈＧＨＥＬＩＳＡの検出限界の
１００倍以上）、処理の後４２時間は検出可能であり続けた。ｈＧＨ濃度はその
ピークから約１１時間の半減期で減衰した。これらの動物において、この半減期
はｈＧＨ自身の半減期の数百倍長く、ラパマイシンの半減期（４．６時間）の約
２倍である。ラパマイシンに比べ血清ｈＧＨがゆっくり減衰するのは、移植され
た細胞の周辺においてより高い組織ラパマイシン濃度が存在することを反映する
可能性があった。あるいは、設計された細胞由来のｈＧＨ生産の持続性が、ｈＧ
ＨｍＲＮＡの安定性を増強している可能性もある。

【０３６１】興味深いことに、４２時間後におけるこれらの動物に対するラパマイシンの二
度目の投与は、血清ｈＧＨの二度目のピークを引き起こし、これが同様の速度論
で減衰した事は設計された細胞がラパマイシンに対し反応する能力を少なくとも
２日間保持していることを示した。そのため、このシステムが循環ｈＧＨ濃度を
上昇及び維持する能力を確かめるため、我々は１６時間の間隔でラパマイシンを
多重投与を受けた動物において実験を行った。この間隔は、ｈＧＨレベルがピー
クに達しその後約半分に減衰するのに必要な時間に対応する。この計画に従い、
ラパマイシン濃度は２回の投与の後、１．７μｇ／ｍｌの濃度を通した定常状態
に達するよう計画された（ＷＯ９６／４１８６５の図８におけるドットラインに
示されるように）。ｈＧＨレベルも二回目の投与の後、濃度において定常状態に
達した。処理された動物は、実際繰り返し投与されるラパマイシンに反応し、循
環ｈＧＨの比較的安定したレベルに保持された。最後の投与の後、ｈＧＨレベル
は１６時間一定に残り、ラパマイシンと同様の半減期で減衰した（ｈＧＨは６．
８時間であるのに対し、ラパマイシンは４．６時間）。これらのデータは、多重
投与において、循環するラパマイシンがインビボにおいて移植された細胞より分
泌されるｈＧＨを厳密に制御していることを示唆する。特に、薬剤を与えなくな
ると急速にタンパク質生産が終了するのは明らかである。考察これらの実験は、低分子量薬剤を用い遺伝的に設計された細胞より分泌された
、治療タンパク質の生産を制御する可能性について行われる。このシステムは、
ヒト遺伝子及び細胞療法における使用のために必要とされる、多くの特徴を有し
ている。これは、非常に低い背景活性及び高い誘導率により特徴づけられる。こ
れは宿主の生理または細胞種特異的因子に依存せず機能する。これは完全にヒト
タンパク質から構成される。制御薬は、インビボ及び経口生物利用が可能な良い
状態である。

【０３６２】この遺伝的に計画されたシステムによれば、インビボにおいて安定で正確な力
価量の、設計された細胞由来の治療タンパク質を生産することが可能である。断
片的及び周期的投与もまた実行可能である。小分子制御下での設計された細胞由
来のタンパク質分配の相当な利点は、いかなる与えられた時間におけるタンパク
質生産速度も小分子薬剤の循環濃度の機能となるということである。そのため、
ｈＧＨ等の治療タンパク質の明らかな薬理学的速度論は劇的に高められる。我々
の実験において、例えば、ラパマイシンの一回の投与の後の設計された細胞より
分配された循環するｈＧＨの速度論は、組み替えタンパク質の一回の投与の後に
観察されるものとは大幅に異なる。マウスに血管注射されたｈＧＨは数分の半減
期で消滅する、一方、ラパマイシンにより誘導された設計された細胞由来のｈＧ
Ｈレベルは約１１時間の半減期で減衰した。ｈＧＨ消滅の半減期が２０分である
ヒトにおいてでさえ、注射は一日おきに行わねばならず、血清ｈＧＨレベルは劇
的に変動する。正確な薬理学的制御下で、設計された細胞より分配されたタンパ
ク質がより効果的な療法を、特に乏しい薬理学的速度論または低い治療効果のタ
ンパク質において導くということはありそうである。

【０３６３】ＤＮＡ結合領域及び活性化領域と結合した小分子薬剤の使用が、インビボにお
ける遺伝子発現制御のための効果的な戦略である。一つの特に魅力的な特徴は、
システムは全くモジュールであり、各要素は最大限利用し独立に設計することが
可能である。比較的微妙なアロステリック分子間相互作用に依存しＤＮＡ結合活
性を制御する細菌抑圧因子とは対照的に、二量体化戦略は事実上全てのＤＮＡ結
合及び活性化領域に適応することが可能である。我々はここでは、ＤＮＡ結合親
性及び新規認識特性の合理的設計を簡単に指示する、定義された構造のＤＮＡ結
合領域を使用した。同様に、活性化領域は最大の潜在力及び他の適した特徴の設
計が可能である。実際、これらの実験において使用された、設計された転写因子
は、平凡なプロモーター／エンハンサーシステムと比較して非常に高レベルの遺
伝子発現を誘発し、いずれかの領域においてさらなる増強が簡単に導入できる。
一つの標的遺伝子の転写に捧げる設計された転写因子を導入する能力は、平凡な
発現ベクターより、低い背景及び実質的に高い遺伝子発現を可能とする機会を提
供する。

【０３６４】我々はまた、免疫系により認識される能力を最低にしたヒトタンパク質由来の
、我々の制御された転写因子を選択した。細菌ハイグロマイシンリン酸基転移酵
素及びヘルペスウイルスチミジンリン酸化酵素の融合タンパク質を発現する自己
Ｔ細胞は、免疫システムが衰弱したＡＩＤＳ患者においてでさえ、効果的に宿主
細胞毒性Ｔ細胞により認識及び除去されると報告された（Ｒｉｄｄｅｌｌ，Ｓ
．Ｒ．，ｅｔａｌ．ＨＩＶ感染患者における、Ｔ細胞を介した遺伝子修
飾ＨＩＶ特異的細胞毒性Ｔ細胞の除去。ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．２，２１６
−２２３（１９９６））。この観察は、設計された細胞におけるヘテロタンパク
質の免疫認識の危険性が現実のものであり、それゆえヒト細胞における制御機能
を行うためのヒトタンパク質の使用は慎重に行うということを示唆する。我々の
転写因子融合タンパク質の個々の要素は配列においてヒトであるが、各タンパク
質は潜在的に外来として認識される結合ペプチドを含む。しかし、これらの結合
物は、以前に考察されたとおり、免疫系への提示が最小となるように設計され選
択される。

【０３６５】ラパマイシンに依存したシステムの原理的な限界は、ＦＲＡＰ活性の阻害を通
じて、インビボにおける免疫抑制へと導かれる細胞周期の進行をブロックするラ
パマイシンの天然の生物活性である。しかし、置換基を導入する、またはラパマ
イシンの構造を修飾しＦＫＢＰ及び／またはＦＲＡＰへの結合を現象または消失
させることは、非依存免疫抑制活性を欠損したラパログへの接触を提供する。こ
のようなラパログ、特に本発明の進歩したラパログの使用は、対応した設計され
たＦＫＢＰ及び／またはＦＰＢ領域と共に、実験動物及びヒト遺伝子治療におけ
る、設計されたタンパク質の生産の制御同様、その他の広範な生物的過程の制御
に広く有用であると証明される。実施例１１：ＦＫＢＰに結合するラパログのＦＲ解析ラパログのＦＫＢＰタンパク質への親性は、蛍光極性（ＦＰ）に基づく競合解
析を用いて決定されることができる。蛍光ラベルしたＦＫ５０６プローブ（ＡＰ
１９４１）はＷＯ９６／４１８６５において記載されたとおりに（その明細書の
実施例６を見よ）合成され、その蛍光の極性における増加は、準飽和ＦＫＢＰ及
び様々な量の競合剤としてのラパマイシンアナログを含む平衡結合実験において
結合したプローブの％の直接読み出しとして使用した。ＦＰを利用したラパログの結合親性（ＩＣ５０ｓ）の決定各アナログの１０倍希釈系列はガラスバイアルにおいて１００％エタノール中
に調製し、氷上に保存する。全ての他の操作は室温において行う。純粋な組み替
えＦＫＢＰのストック（標準的な方法により精製、Ｗｉｅｄｅｒｒｅｃｈｔ，
Ｇ．ｅｔａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２
１７５３−２１７６０を見よ）は、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．８／１５
０ｍＭＮａＣｌ／１００μｇ／ｍｌウシガンマグロブリン（”ＦＰ緩衝液”
：Ｐａｎｖｅｒａ由来の低蛍光試薬のみを用いて調製された）において１１．２
５ｎＭに希釈し、９８μｌのアリコートをＤｙｎａｔｅｃｈマイクロフロー黒９
６ウェル蛍光プレートに移す。ラパログの２．０μｌ標本はその後、混合しなが
らウェルに繰り返し移す。最後に、プローブ溶液は、０．１％エタノール／ＦＰ
緩衝液中で１０ｎＭＡＰ１４９１を含むよう調製し、混合しながら各ウェルに
１００μｌ加える。複数の対照ウェルは、ラパログ（１００％プローブ結合のた
め）の代替のエタノールまたはラパログの代替のエタノール及びＦＫＢＰ（０％
プローブ結合のため）の代替のＦＰ緩衝液を含む。

【０３６６】プレートは平衡にするために約３０分暗条件で覆い保存し、各ウェルの蛍光極
性をＪｏｌｌｅｙＦＰＭ−２ＦＰプレートリーダー（ＪｏｌｌｅｙＣｏｎ
ｓｕｌｔｉｎｇ及びＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｙｓｌａｋｅ，
ＩＬ）で製造者の推奨に従って読む。各競合剤に対する平均極性（ｍＰ値）は通
常、対照値に参照した全結合％に変換しプロットされる（ｙ）、競合剤のｌｏｇ
最終モル濃度はこれに対応する（ｘ）。非線形最小二乗解析は曲線に対応させ、
以下の式を用いてＩＣ５０を引き出すために用いられた：ｙ＝Ｍ１＋（Ｍ４−Ｍ１）／（１＋ｅｘｐ（Ｍ２＊（Ｍ３−ｘ）））Ｍ３はＩＣ５０である。曲線が不完全なため、ＩＣ５０は内挿により決定される
。ラパマイシン及びＣ１４−デスオクソ−ラパマイシンは各場合において対照と
して含まれる（Ｃ１４−デオクソ−ラパマイシンは、Ｌｕｅｎｇｏ，Ｊ．Ｉ
．ｅｔａｌ．１９９４ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．３５，
６４６９−６４７２に記載の通りに調製した）。実施例１２：一過性形質転換細胞におけるラパログ依存転写活性化ラパログは、以下のとおりの転写読みだしを用い、ＦＫＢＰ及びＦＲＢ融合タ
ンパク質の二量体化能力を解析された。ラパログ依存転写因子融合タンパク質を
コードする構築物は、転写因子融合タンパク質のラパログ依存二量体化を伴う転
写制御ＤＮＡ許諾レポーター遺伝子発現に連動したレポーター遺伝子を含む、ま
たは含むように設計した、細胞に導入した。転写因子融合タンパク質は、（ａ）
ヘテロなエフェクター領域としてのＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）を含むＦＫＢＰ融
合タンパク質、及び（ｂ）ヘテロなエフェクター領域としての転写活性化領域を
含むＦＲＢ融合タンパク質を含む。ＦＫＢＰ及び／またはＦＲＢ領域は、自然に
起こるまたは自然には起こらないペプチド配列を含む可能性がある。二つの融合
タンパク質の二量体化を介する能力のあるラパログの存在は、レポーター遺伝子
の発現を導く。観察されるレポーターの程度は、ラパログの二量体化因子として
の活性を示す。レポーター遺伝子に代わる興味の標的遺伝子の利用は、これを培
地中で成長している細胞または個体の全てにおいて、制御された遺伝子発現シス
テムの使用をおこなう。

【０３６７】我々は、このシステムを以下のように使用した：ヒト線維肉腫由来のＨＴ１０
８０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１２１）は、非必須アミノ酸及び１０％ウシ胎児
血清を添加したＭＥＭ培地において生育させた。２４ウェルディッシュに撒いた
細胞（Ｆａｌｃｏｎ、６ｘ１０４細胞／ウェル）は製造者（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ
）により推奨される条件下でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて形質転換した
。以下の全量３００ｎｇのＤＮＡを各ウェルの細胞に形質転換した：（ａ）１００ｎｇのＺＥＨＤｘ１２−ＣＭＶ−ＳＥＡＰレポーター遺伝子（１
２回のＺＦＨＤ１ＤＮＡ結合領域の認識配列と連動したレポーター遺伝子）、（ｂ）２．５ｎｇのｐＣＧＮＮ−ＺＦＨＤ１−３ＦＫＢＰまたはその他のＤＮ
Ａ結合領域融合物（３つのＦＫＢＰ及び１つのＺＦＨＤ１領域からなる融合タン
パク質）、（ｃ）５ｎｇのｐＣＧＮＮ−１ＦＲＢ−ｐ６５（３６１−５５０）（ＦＲＢ領
域及びｐ６５転写活性化領域からなる融合タンパク質）及び（ｄ）１９２．５ｎｇのｐＵＣ１１８。いくつかの実験において、ｐＣＧＮＮ−１ＦＫＢ（Ｔ２０９８Ｌ）−ｐ６５（３
６１−５５０）はｐＣＧＭＭ−１ＦＫＲＢ−ｐ６５（３６１−５５０）の代わり
に、設計されたＦＲＢ領域を含むＦＲＢ融合タンパク質を生産するために使用さ
れた。ＤＮＡ結合領域または活性化領域を欠いた対照実験においては、同じ量の
空ｐＣＧＮＮ発現ベクターが代用された。本明細書において言及されるものを含
む構築物の集合及び使用に関する詳細な情報のためには、ＷＯ９６／４１８６５
（Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔａｌ）、特にその明細書における実施例（それらは
特に本明細書における参照により編入された）を見よ。リポフェクション（５時
間）に続き、指示された量のラパログを含む５００μｌの培地が各ウェルに加え
られた。２４時間後、培地は除去し、記載のとおり（Ｓｐｅｎｃｅｒｅｔａ
ｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：１０１９−２４，１９９３）ＳＥＡＰ活性を
測定した。ＳＥＡＰ標的遺伝子及び発現するＺＦＨＤ−ＦＫＢＰ−及びＦＲＢ−
ｐ６５含有融合タンパク質をコードするプラスミドを一過的形質転換したヒト線
維肉腫細胞は、ラパログ依存及び量反応性ＳＥＡＰの分泌を培地に行うことを示
した。ＳＥＡＰ生産は一つまたは両方の転写因子融合プラスミドを欠いた細胞に
おいても検出されず、ラパログ添加を行わなかった場合においても検出されなか
った。図１に示すように、野生型ＦＫＢＰ及びＦＲＢ境構築物を形質転換した細
胞は、二量体化因子の濃度が１ｎＭ程度に低い場合ＳＥＡＰの発現を示した。図
２は、野生型（図２Ａ、図２Ｃ）と比較した、変異型ＦＲＢ（Ｔ２０９８Ｌ、図
２Ｂ及び２Ｄ；Ｔ２０９８Ｆ、図２Ｅ）を発現する細胞におけるＳＥＡＰ発現の
優先的刺激を示す。同様の結果が、同一の転写因子をｈＧＨ標的遺伝子または、
レトロウイルスの感染により作成されたＳＥＡＰレポーター遺伝子の安定に組み
込まれた型の、ラパログ依存活性化誘導に使用したときに、観察された。実施例１３：多様なラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）に相補的な修飾リガンド結合ドメインを生成するための突然変異誘発およびファージディスプレーＡ．工学設計ＦＫＢＰおよびＦＲＢドメイン我々は、例示的な修飾リガンド結合ドメインを持つ、以下に要約された融合タ
ンパク質をコードする組換えＤＮＡ構築物を設計しそして調製した。他に明言さ
れない限り、突然変異体は、標準法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｂｅｂｅｎ
ｅｋ，Ｋ．およびＭｃＣｌａｒｙ，Ｊ．１９９１．ＭｅｔｈＥｎｚｙ
ｍｏｌ．２０４，２３５−１３９）にしたがったオリゴヌクレオチド仲介部
位特異的突然変異誘発を用い生成し、そしてジデオキシ配列決定により確認した
。

【０３６８】

【表１８】

【０３６９】我々はまた、以下のＦＲＢ融合タンパク質をコードする構築物も調製した：

【０３７０】

【表１９】

【０３７１】本明細書に論じられる修飾ｈＦＲＡＰＦＲＢドメインと同様に修飾されてい
る酵母およびカンジダＦＲＢもまた、そのＦＲＢドメインの各々の中の２つの保
存されているＰｈｅ残基および保存されているＡｓｐおよびＡｓｎ残基のうち１
つまたはそれ以上の代わりに、異なるアミノ酸コドンで置換することにより、調
製してもよい。例として、ＴＯＲ１およびＴＯＲ２由来の修飾ＦＲＢドメインに
は、以下のものが含まれる：

【０３７２】

【表２０】

【０３７３】Ｂ．ラパログへの結合に関する合理的設計ＦＫＢＰ突然変異体の試験標準法を用い、ヘキサヒスチジンタグ、およびモノクローナル抗体１２ＣＡ５
のエピトープであるインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）赤血球凝集
素タンパク質の一部が先行し、ＦＫＢＰを発現する、ｐＥＴ２０ｂ（Ｎｏｖａｇ
ｅｎ）に基づく発現ベクターを構築した。本ベクターにコードされるタンパク質
の配列は以下の通りである：

【０３７４】

【化３０】

【０３７５】ラパマイシン接触残基で突然変異しているＦＫＢＰの発現ベクターを生成する
ため、記載されるように（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｂｅｂｅｎｅｋ，Ｋ
．およびＭｃＣｌａｒｙ，Ｊ．１９９１．ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ．
２０４，２３５−１３９）、大腸菌ＣＪ２３６から調製したベクターの一本鎖
型に対し、オリゴヌクレオチド仲介部位特異的突然変異誘発を行った。突然変異
体はジデオキシ配列決定により確認した。記載されるように（Ｗｉｅｄｅｒｒｅ
ｃｈｔ，Ｇ．ら，１９９２．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，
２１７５３−２１７６０）、突然変異体タンパク質を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
（Ｎｏｖａｇｅｎ）で発現し、そして記載されるように（Ｃａｒｄｅｎａｓ，
Ｍ．Ｅ．ら，１９９４．ＥＭＢＯＪ．１３，５９４４−５９５７）均
質になるよう精製した。

【０３７６】本プロトコルを用い、示されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて（突然
変異塩基を大文字で示す；５'→３' ）以下の突然変異体ヒトＦＫＢＰ１２タンパク質を生成した：Ｃ２４ラパログに結合させるため設計された突然変異体

【０３７７】

【化３１】

【０３７８】Ｃ１３／Ｃ１４ラパログに結合させるため設計された突然変異体：

【０３７９】

【化３２】

【０３８０】Ｃ２８／Ｃ３０ラパログに結合させるため設計された突然変異体：

【０３８１】

【化３３】

【０３８２】ＦＫＢＰ突然変異体に対するラパマイシンおよびラパログの相対結合親和性を
アッセイするため、突然変異体によるＦＫ５０６（およびしたがってプローブ）
結合親和性の保持に頼る競合的蛍光偏光（ＦＰ）アッセイを用いる。該方法は、
直接結合アッセイをまず行い、亜飽和を得るため、競合反応に用いる突然変異体
ＦＫＢＰの希釈（濃度）を決定することを除き、実施例１２に記載されたものと
同一である。Ｄｙｎａｔｅｃｈ微量蛍光プレート中、１００μｌ体積においてＦ
Ｐ緩衝液（実施例１２）で突然変異体ＦＫＢＰの連続希釈を作成し、そしてその
後、[ＦＰ緩衝液＋２％エタノール]中の１０ｎＭＡＰ１４９１（プローブ）
１００μｌを各ウェルに添加する。平衡化およびプレート読み取りは、実施例１
２の通りである。ｍＰ単位対ＦＫＢＰ突然変異体濃度のプロットを、以下の等式
：

【０３８３】

【化３４】

【０３８４】に適合させ、そしてプローブの９０％が特異的に結合する最終突然変異体濃度／
希釈を、内挿により決定する。この最終濃度をその後、実施例１２のプロトコル
中の１１．２５ｎＭＦＫＢＰを２Ｘ突然変異体最終濃度で置き換え、実施例
１２におけるように行われる競合ＦＰアッセイで用いる。競合アッセイの感度を
より高くするため、９０％飽和の代わりに７５％を選択してもよい。ラパマイシ
ン類似体の連続希釈を競合剤として用い、そして各突然変異体に対する各ラパロ
グ結合に関し、結果をＩＣ５０として表す。

【０３８５】Ｃ．ＦＫＢＰ−ラパログ複合体への結合に関する合理的設計ＦＲＢ突然変異体の試験プライマー２８および２９（以下）を用いたＰＣＲにより、ヒトＦＲＡＰの残
基２０２１−２１１３（両端を含む）をコードするＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を
生成し、そしてＮｄｅＩ部位がＮｃｏＩに突然変異しているｐＥＴ２０ｂ（＋）
（Ｎｏｖａｇｅｎ）の誘導体にクローン化し、ｐＥＴ−ＦＲＡＰ（２０２１−２
１１３）を生成した。上述のように、部位特異的突然変異誘発法において、本ベ
クターの一本鎖ＤＮＡをテンプレートとして用い、ラパマイシン接触残基で突然
変異しているＦＲＡＰをコードするベクターを生成した。突然変異体はジデオキ
シ配列決定により確認した。その後、ＸｂａＩおよびＳｐｅＩ部位を付加するプ
ライマー（３０および３１）を用い、突然変異体をＰＣＲにより増幅し、そして
ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ消化ｐＣＧＮＮ−ＦＲＢ−ｐ６５（３６１−５５０）（実施
例７）にクローン化し、Ｅ−Ｎ−突然変異体ＦＲＡＰ（２０２１−２１１３）−
ｐ６５（３６１−５５０）の型のキメラタンパク質の哺乳動物発現を指示する一
連の構築物を生成した。ここでＥはＨＡエピトープタグを示し、そしてＮは核局
在化配列を示す。構築物は、制限消化およびジデオキシ配列決定により照合した
。

【０３８６】本方法を用い、各々ｐ６５（３６１−５５０）活性化ドメインに融合している
、Ｃ７ラパログに結合するための候補突然変異体ＦＲＡＰをコードする以下の構
築物を、示されるオリゴヌクレオチドプライマー（突然変異塩基を大文字で示す
；５'→３'）を用い、生成した：

【０３８７】

【化３５】

【０３８８】ＦＫＢＰとラパマイシンおよび多様なラパログの複合体に対するこれらの突然
変異体の相対結合親和性をアッセイするため、実施例８に記載されるように、各
構築物をヒトＨＴ１０８０Ｂ１４細胞に一過的に共トランスフェクションする。
トランスフェクション後、ラパマイシンまたはラパログの連続希釈を培地に添加
する。２４時間後、実施例８に記載されるように、ＳＥＡＰ活性を測定する；多
様なラパログ濃度でのＳＥＡＰ活性強度は、ＦＫＢＰおよびラパログの間の複合
体に対するＦＲＡＰ突然変異体の親和性に比例する。

【０３８９】ＰＣＲプライマー（制限部位を大文字で示す；５'→３'）：

【０３９０】

【化３６】

【０３９１】Ｄ．繊維状バクテリオファージ上のＦＫＢＰおよびＦＲＢドメインの機能的ディスプレー：修飾ドメインの合理的設計に対する代替物としての、選択のための１つのアプローチ突然変異体ＦＫＢＰおよびＦＲＢドメインのディスプレーおよび選択のための
ファージディスプレー系は、ベクター構築、Ｈｉｓ６−ｆｌａｇ−ＦＫＢＰの調
製、ｐＣＡＮＴＡＢ−ＡＰ−ＦＫＢＰ、結合濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）、プ
ライマー、ｐＣＡＮＴＡＢ−ＡＰ−ＦＲＡＰ（２０１５−２１１４）およびｐＣ
ＡＴＡＢ−ＡＰ−ＦＫＢＰの配列、親和性濃縮研究のためのビオチン化ＦＫ５０
６の合成、ビオチン化ＦＫ５０６を用いた競合ＥＬＩＳＡによる機能的ＦＫＢＰ
ディスプレー、ラパマイシンのＣ１３およびＣ１４位を標的とする、ファージ上
の突然変異体ＦＫＢＰライブラリーの生成、並びにライブラリー分類を含め、Ｗ
Ｏ９６／４１８６５（Ｃｌａｃｋｓｏｎら）に詳細に開示される。実施例１４：ラパマイシン依存情報伝達活性化多くの細胞受容体は、その生理学的リガンドまたは抗受容体抗体による凝集に
より活性化される可能性がある。さらに、２つの異なるタンパク質の凝集は、し
ばしば細胞内シグナルを誘発する可能性がある。ラパマイシンおよびその類似体
を用い、１つは、１つまたはそれ以上のＦＫＢＰおよびエフェクタードメインを
含み、そしてもう一方は、１つまたはそれ以上のＦＲＡＰおよびエフェクタード
メインを含む、キメラタンパク質のオリゴマー化により、受容体エフェクタード
メインの活性化を誘発することが可能である。本計画は、図Ｔ１（ａ）に例示さ
れる。どちらのタンパク質も膜に固定されて（ａｎｃｈｏｒｅｄ）示されるが、
１つが膜固定であって、そしてラパマイシンまたは類似体の添加により、二量体
化を介し、第二のタンパク質が膜に引き寄せられてもよい。膜固定は、膜貫通タ
ンパク質アンカーを通じ、またはミリストイル化などの、タンパク質の脂質修飾
を通じ、達成してもよい。同一のエフェクタードメインが両方のタンパク質に存
在してもよく、または、タンパク質キナーゼおよびタンパク質キナーゼ基質など
、機能的に相互作用する異なるタンパク質ドメインを用いてもよい。あるいは、
第二のエフェクターは、第一のエフェクターの活性を阻害するよう働いてもよい
。

【０３９２】我々は、先に論じられたように、いくつかの態様において、キメラタンパク質
が混合キメラであり、そしてＦＫＢＰおよびＦＲＡＰドメインと共に異種性エフ
ェクタードメインを含むことに注目する。単一の混合キメラのオリゴマー化もま
た、図Ｔ１（ｂ）に示されるように、情報伝達を活性化させるのに用いてもよい
。ＦＫＢＰおよびＦＲＡＰドメインの反復により、より多数のものが発生し、幾
何学的束縛にさらされる。

【０３９３】情報伝達においてラパマイシンを使用する２つの例は、受容体チロシンキナー
ゼ活性化を誘発することおよびＦａｓ活性化を介しアポトーシスを誘発すること
であり、これらはどちらも以下に論じられる。他に言及されない限り、ＤＮＡ操
作はすべて標準法（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら監修，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒ
ｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷ
ｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，１９９４）にしたがって行い、そし
てタンパク質プロトコルはすべて標準法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ
，Ｄ．１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，コールドスプリングハーバー）にしたがって行った。構築物を作成するのに
用いたＰＣＲ産物はすべて、配列決定により確認した。

【０３９４】Ａ．ラパマイシン誘導性受容体チロシンキナーゼ活性化１．ミリスチル化シグナルを含む発現ベクター、ｐＣＭの構築オリゴヌクレオチド１および２をアニーリングすることにより得られるＸｂａ
Ｉ−Ｍｙｒ−ＢａｍＨＩカセットをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＣ
Ｇ発現ベクター（Ｔａｎａｋａ，Ｍ．およびＨｅｒｒ，Ｗ．１９９０．
Ｃｅｌｌ６０：３７５−３８６）のＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローン化し
、ｐＣＧＭを生成した。（オリゴヌクレオチド配列に関しては、以下の（７）を
参照されたい）。本オリゴヌクレオチドカセットは、インフレームＸｂａＩ部位
に続き、ミリストイル化を可能にし、そして細胞膜にタンパク質を標的化するこ
とが示されているｃ−Ｓｒｃチロシンキナーゼの最初の１５アミノ酸残基をコー
ドする配列（Ｃｒｏｓｓら，１９８４．ＭＣＢ．４：１８３４−１８４２
）からなる。ミリストイル化ドメインに、インフレームＳｐｅＩ部位および停止
コドンが続く。ｐＣＧベクター中のＸｂａＩ部位は、該部位が開始Ｍｅｔおよび
クローンされる配列の間に２つのアミノ酸を添加するように配置される。開始Ｍ
ｅｔおよびミリスチル化Ｇｌｙの間の間隔がｃ−Ｓｒｃの膜局在化に重要である
（Ｐｅｌｌｍａｎら，１９８５．ＰＮＡＳ．８２：１６２３−１６２７）
ため、ｐＣＧＭ中のＡＴＧに続くＸｂａＩ部位は、製造者のプロトコルにしたが
い、部位特異的突然変異誘発（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ、ＢｉｏＲａｄ）により、欠
失させた。さらなるクローニング段階を容易にするため、ミリスチル化カセット
中のＳｐｅＩ部位をＸｂａＩに突然変異させた。ｐＣＧＭの一本鎖ウラシル−Ｄ
ＮＡを調製し、そしてオリゴヌクレオチド３（ＡＴＧに続くＸｂａＩ部位を欠失
させ、そしてＡＴＧの５'にＥｃｏＲＩを付加する）およびオリゴヌクレオチド４（ミリスチル化ドメインに続くＳｐｅＩ部位をＸｂａＩ部位に変える）両方を
用い、突然変異誘発を行った。生じたｐＣＭベクターのＡＴＧ周囲の配列を、オ
リゴヌクレオチド５（以下の（８）の配列１を参照されたい）を用いた配列決定
により、確認した。

【０３９５】２．ｐＣＭにＦＫＢＰおよびエピトープタグを添加し、ｐＣＭＦ１／２／３．ＨＡを生成する相補的オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６および７）をアニーリング
することにより、ＳｐｅＩ−ＨＡ−ＢａｍＨＩカセットを調製した。本カセット
は、インフレームＳｐｅＩ部位に続き、モノクローナル抗体１２ＣＡ５により認
識されるインフルエンザ菌赤血球凝集素遺伝子の９アミノ酸、停止コドンおよび
ＢａｍＨＩ部位を有する。ＳｐｅＩ−ＨＡ−ＢａｍＨＩカセットをｐＣＧＮＮＦ
１、ｐＣＧＮＮＦ２およびｐＣＧＮＮＦ３のＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にサブク
ローンした。続いて、ＨＡエピトープに融合している１／２／３コピーのＦＫＢ
ＰをＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片として、ｐＣＭにサブクローンした。生じたプラ
スミド（ｐＣＭＦ１／２／３．ＨＡ）は以下の特徴を有する：ミリスチル化ドメ
イン；インフレームＸｂａＩ部位；１／２／３コピーのＦＫＢＰ；インフレーム
ＳｐｅＩ部位；ＨＡエピトープタグ；および停止コドン。

【０３９６】３．ｐＣＭにＦＲＢおよびエピトープタグを添加し、ｐＣＭＦＲ１／２／３．Ｆｌａｇを生成する相補的オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８および９）をアニーリング
することにより、ＳｐｅＩ−Ｆｌａｇ−ＢａｍＨＩカセットを調製することが可
能である。本カセットは、インフレームＳｐｅＩ部位に、モノクローナル抗体で
ある抗ＦＬＡＧ．Ｍ２（ＫｏｄａｋＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｍａｇｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）に認識される、８つのアミノ酸（ＤＹＫＤＤＤＤＹ）（Ｈｏｐ
ｐら，１９８８．Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：１２０５−１２１０）をコードす
る配列が続く以外は、上述のＳｐｅＩ−ＨＡ−ＢａｍＨＩカセットと同じ特徴を
有する。ＳｐｅＩ−Ｆｌａｇ−ＢａｍＨＩカセットをｐＣＧＮＮ−１ＦＲＢ、ｐ
ＣＧＮＮ−２ＦＲＢ、およびｐＣＧＮＮ−３ＦＲＢのＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ部位
にサブクローンする。続いて、１／２／３コピーのＦＲＢドメイン−Ｆｌａｇエ
ピトープ融合体をＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ断片として、ｐＣＭにサブクローンする
。生じたプラスミド（ｐＣＭＦＲ１／２／３．Ｆｌａｇ）は以下の特徴を有する
：ミリスチル化ドメイン；インフレームＸｂａＩ部位；１／２／３コピーのＦＲ
Ｂ；インフレームＳｐｅＩ部位；Ｆｌａｇエピトープタグ；および停止コドン。

【０３９７】４．受容体チロシンキナーゼ細胞質ドメインへのＦＫＢＰおよびＦＲＢ構築物の融合選択した受容体チロシンキナーゼ（例えばＥＧＦＲ、ｅｒｂＢ−２、ＰＤＧＦ
Ｒ、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、Ｆｌｔ−１）の細胞質ドメインを、インフレーム５' ＸｂａＩおよび３'ＳｐｅＩ部位を持つようＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ産物は、ｐＣＭＦＲシリーズまたはｐＣＭＦシリーズベクター（上記を参照されたい）にお
いて、ＸｂａＩ部位が回復するようにインフレームＸｂａＩ部位にサブクローン
してもよいし、またはＳｐｅＩ部位が回復するようにインフレームＳｐｅＩ部位
にサブクローンしてもよい。その結果、ＦＫＢＰ／ＦＲＢドメインを、受容体チ
ロシンキナーゼの細胞質ドメインのＣ末端またはＮＨ２末端に配置してもよい。
ベクターは、（ｉ）既定の受容体の細胞質ドメインをＦＫＢＰおよびＦＲＢ両方
に融合させる（例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢいずれかに融合しているＥＧＦＲ
細胞質ドメイン）ように構築するか、または（ｉｉ）２つの異なる受容体の細胞
質ドメインをＦＫＢＰおよびＦＲＢに融合させる（例えば、ＦＫＢＰに融合して
いるＥＧＦＲ細胞質ドメインおよびＦＲＢに融合しているｅｒｂＢ−２細胞質ド
メイン）ように構築してもよい。前者（ｉ）の場合、薬剤、ラパマイシンの添加
は、ホモ二量体（例えばＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）の形成を誘導するであろうが、後
者（ｉｉ）の場合、薬剤の添加はヘテロ二量体（例えばＥＧＦＲ／ｅｒｂＢ−２
）を誘導し、そして情報伝達カスケードの活性化を生じるであろう。

【０３９８】５．構築物の試験ラパマイシンまたは類似体がＦＫＢＰおよびＦＲＢ受容体細胞質ドメイン融合
体の二量体化を誘導するか試験するため、選択した構築物（例えばｐＣＭＥＧＥ
Ｒ−ＦＲ１およびｐＣＭＥＧＦＲ−Ｆ１）をリポフェクション（ＧｉｂｃｏＢ
ＲＬ）によりＣｏｓ−１細胞に共トランスフェクションする。トランスフェクシ
ョン３日後、細胞をラパマイシンで誘導し、そして溶解緩衝液（１％Ｔｒｉｔ
ｏｎＸ−１００；５０ｍＭＴｒｉｓ．ＣｌｐＨ８．０；１５０
ｍＭＮａＣｌ；５ｍＭＮａＦ；１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム
；１０μｇ／ｍｌアプロチニン；１０μｇ／ｍｌロイペプチン）で溶解する
。ラパマイシン処理および未処理細胞溶解物由来の融合タンパク質を抗Ｆｌａｇ
および１２ＣＡ５抗体で免疫沈降し、そして抗ホスホチロシン抗体でイムノブロ
ットする。細胞種の選択；トランスフェクションするＤＮＡの量；使用するラパ
マイシン濃度および薬剤処理の時間は、最適の結果を達成するため多様である。

【０３９９】６．ラパマイシン誘導性細胞増殖選択した哺乳動物細胞株（例えばＮＩＨ３Ｔ３）をＦＲＢおよびＦＫＢＰ融合
タンパク質をコードする構築物（例えばｐＣＭＥＧＦＲ−ＦＲ１およびｐＣＭＥ
ＧＦＲ−Ｆ１）で共トランスフェクションし、そして該融合タンパク質を発現す
る安定細胞株を樹立する。ラパマイシン誘導性の受容体細胞質ドメイン活性化が
細胞増殖を誘導するであろうか決定するため、該融合タンパク質を発現する安定
細胞株を、ラパマイシンの存在下または非存在下で増殖させ、そして細胞増殖速
度の変化を日常的な方法により決定する（例えば細胞数をモニターすることによ
る；３Ｈチミジン取り込み速度を測定することによるなど）。受容体チロシンキ
ナーゼの選択；受容体活性化の種類（ホモ二量体対へテロ二量体）は、最適な結
果を得るため、選択することが可能である。

【０４００】７．オリゴヌクレオチド配列

【０４０１】

【化３７】

【０４０２】８．配列１：

【０４０３】

【化３８】

【０４０４】修飾配列は小文字の太字で表し、そして開始ＡＴＧは下線で示す。大文字の
配列は、親ｐＣＧ骨格由来である。

【０４０５】Ｂ．ラパマイシン誘導性アポトーシスＦａｓ活性化を調節しそして小分子を介しアポトーシスを誘発する能力は、選
択的に操作細胞を除くのに使用してもよい遺伝子治療、および実験的系両方にお
ける適用を有する。ここに記載されるタンパク質を、ｐ７５とも呼ばれる低親和
性ＮＧＦ受容体を介し膜に固定する。しかし、別のタンパク質アンカーで容易に
代用されうることを認識すべきである。ｐ７５は、その細胞外ドメインに対する
抗体が入手可能であり、そしていかなる同定されたリガンドとも高い親和性の相
互作用を欠いているため、実験的に有用である（Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ｍ．１
９９５．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：２２３−２５３
）。

【０４０６】１．２−タンパク質ラパマイシン制御Ｆａｓ活性化（ａ）ｐ７５ベクターの構築低親和性ＮＧＦ受容体（ｐ７５としても知られる）の細胞外および膜貫通ドメ
インを含むＦＲＡＰ−Ｆａｓ融合タンパク質の発現を指示するベクターを、標準
法を用い、元来のｐＢＲ骨格に対しｐＵＣ骨格を置換することにより修飾された
、哺乳動物ｐＪ７Ｗ（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ，Ｊ．Ｐ．およびＬａｎｄ，
Ｈ．１９９０．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：１０６８）
から得た。我々は本ベクターをｐＡ７Ｗと呼ぶ。本プラスミドのポリリンカー部
位にクローンされた挿入物は、サルＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー配列
の調節下に転写される。ポリリンカーはＣＭＶ配列に続き、ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓ
ａｌＩ−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ−ＳｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ−
ＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩを有する。適切なクローニング部位およびプロモーターを
含むいかなる哺乳動物発現ベクターで代用してもよい。

【０４０７】ｐ７５の配列（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．，Ｌａｎａｈａｎ，Ａ．，Ｂｕ
ｃｋ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｈｅｇａｌ，Ａ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｃ．，Ｍｅ
ｒｃｅｒ，Ｅ．，Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ｍ．，Ｃｈａｏ，Ｍ．１９８
６．Ｃｅｌｌ４７：５４５−５５４）に基づき、プライマーＪ１（５'）およびＪ２（３'）を用いて、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位が隣接するｐ７５の断片をコードする制限断片をＰＣＲにより生成した。ＰＣＲテンプレートの
元来の供給源は、Ｊ１およびＪ２と類似であるが異なる制限部位を持つプライマ
ーを用い、ヒト脳ライブラリーから得たクローンであった。生じた断片の５'端はＨｉｎｄＩＩＩ部位に続きＥｃｏＲＩ部位、コザック配列およびｐ７５コード
配列の開始（アミノ酸１）を含む。生成された３'端は、アミノ酸２７４を含むアミノ酸までの受容体配列、予測される膜貫通配列を過ぎた２アミノ酸に続きＸ
ｂａＩ部位をコードする。他の膜貫通受容体の類似の部分を、本断片に代用して
もよい。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ断片として、ＨｉｎｄＩＩＩ−
ＸｂａＩ切断ｐＡ７Ｗにサブクローンし、ｐＡ７Ｗｐ７５を生成した。該構築物
を制限解析およびＤＮＡ配列決定により照合した。

【０４０８】（ｂ）ｐＡ７Ｗｐ７５へのＦａｓの付加Ｆａｓアミノ酸２０６−３０４（ＦａｓＳ）およびＦａｓアミノ酸２０６−３
１９（ＦａｓＬ）をコードするＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片をＰＣＲにより作成し、
そして同じ酵素で切断したｐＡ７Ｗｐ７５にサブクローンした。使用したプライ
マーは、Ｊ３（５'）およびＪ４またはＪ５（３'）であった。Ｊ５は、終止コド
ンより先で終わるＦａｓ断片を生成し；ＳｐｅＩで切断すると、Ｆａｓの末端１
５ａａをコードするヌクレオチドが除かれ、ＦａｓＳと呼ばれる細胞内Ｆａｓの
一部切除型が得られる。これらの１５ａａの除去により、いくつかの細胞種でＦ
ａｓの活性が増加する（Ｉｔｏｈ，Ｎ．，およびＮａｇａｔａ，Ｓ．１９
９３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０９３２）。プライマーＪ
４は、Ｆａｓの天然終止コドンをＳｐｅＩ部位で置き換え、そしてまたＦａｓに
含まれる元来のＳｐｅＩ部位を突然変異させ、ＦａｓＬを生じる。これらの断片
をサブクローニングすることにより生成されるプラスミドはそれぞれ、ｐＡ７Ｗ
ｐ７５−ＦａｓＳおよびｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＬである。これらの構築物は、
制限解析およびＤＮＡ配列決定により照合した。これらの挿入物にエピトープタ
グを結合させるため、ＸｂａＩ−ＳｐｅＩＦａｓ断片を単離し、そしてＳｐｅ
Ｉ部位の３'にインフルエンザ菌赤血球凝集素タンパク質（Ｅ）由来の９アミノ酸のエピトープタグに続きＢａｍＨＩ部位をコードする、上述のプラスミドｐＣ
ＭＧ１／２／３．ＨＡのＸｂａＩ−ＳｐｅＩ切断骨格に連結した。生じたプラス
ミドをＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断することにより、Ｆａｓに続きエピトー
プタグ（これらの構築物をＥと称する）をコードする断片が生成された。

【０４０９】（ｃ）ｐ７５−ＦＲＡＰ−Ｆａｓ−エピトープ融合タンパク質：ｐ７５−ＦＲ
ＡＰｘ−ＦａｓＳまたはＬＥおよびｐ７５−ＦａｓＳまたはＬ−ＦＲＡＰｘＥを
生成するための、ｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＳＥおよびｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＬ
ＥへのＦＲＡＰ含有断片の付加ＦＲＡＰの一部を含むＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片は、本文書で先に記載されてい
る。これらのＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片を、ｐ７５−ＦＲＡＰｘ−ＦａｓＳまたは
ＬＥを生成するためｐ７５コード配列直後のＸｂａＩ部位、またはｐ７５−Ｆａ
ｓＳまたはＬ−ＦＲＡＰｘＥを生成するためＦａｓ断片直後のＳｐｅＩ部位のど
ちらかに挿入した。あるいは、ＦＲＡＰｎ断片として、あるいは第一のＦＲＡＰ
をＸｂａＩまたはＳｐｅＩにサブクローニングした後、利用可能となるＳｐｅＩ
部位にＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片を連続的にサブクローニングすることにより、１
つ以上のＦＲＡＰ断片をサブクローンしてもよい。したがって、一連の最終ベク
ターは、（ＮからＣ末端へ）ｐ７５細胞外および膜貫通配列、１つまたはそれ以
上のＦａｓ細胞内ドメインにＮまたはＣ末端で融合している１つまたはそれ以上
のＦＲＡＰ由来ドメイン、およびエピトープタグをコードする。

【０４１０】（ｄ）ｐ７５−ＦＫＢＰ−Ｆａｓ融合タンパク質：ｐ７５−ＦＫＢＰｎ−Ｆａ
ｓＳまたはＬまたはｐ７５−ＦａｓＳまたはＬ−ＦＫＢＰｎを生成するための、
ｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＳＥおよびｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＬＥへのＦＫＢＰ含
有断片の付加１つまたはそれ以上のＦＫＢＰを含むＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片は本文書で他に
記載されている。これらの断片を、ｐ７５−ＦＫＢＰｎ−ＦａｓＳまたはＬを生
成するためｐ７５コード配列直後のＸｂａＩ部位、またはｐ７５−ＦａｓＳまた
はＬ−ＦＫＢＰｎを生成するためＦａｓ断片直後のＳｐｅＩ部位のどちらかに挿
入した。したがって、一連の最終ベクターは、（ＮからＣ末端へ）ｐ７５細胞外
および膜貫通配列、１つまたはそれ以上のＦａｓ細胞内ドメインにＮまたはＣ末
端で融合している１つまたはそれ以上のＦＫＢＰ、およびエピトープタグをコー
ドする。

【０４１１】（ｅ）ラパマイシン仲介Ｆａｓ活性化アッセイＦａｓおよびＦＲＡＰドメインを含むタンパク質並びにＦａｓおよびＦＫＢＰ
ドメインを含むタンパク質の発現が、ラパマイシンの添加に際し、Ｆａｓを活性
化し、そして細胞死を誘発する能力は、一過性または安定トランスフェクション
細胞のいずれで試験してもよい。

【０４１２】一過性トランスフェクションでは、試験すべき２つのプラスミドを、リポフェ
クション、リン酸カルシウム沈澱またはエレクトロポレーションなどの標準法に
より、ＨＴ１０８０などの細胞株に共トランスフェクションする。トランスフェ
クションの１日以上後、細胞を、無添加あるいは１つまたはそれ以上の濃度のラ
パマイシン、あるいは１つまたはそれ以上の濃度のＦＫ１０１２などの二量体化
剤で処理する。ＦＫ１０１２はＦＫＢＰ−Ｆａｓ構築物が機能するという陽性コ
ントロールとして働く。数時間から１日後、いくつかの方法のうち１つにより、
反応に関し細胞をモニターする。慣用手段により細胞溶解物を調製し、そしてＨ
Ａに対しまたはｐ７５の細胞外ドメインに対して向けられる抗体で探査する（ｐ
ｒｏｂｅｄ）ウェスタンブロットを生成するのに用いる。あるいは、１０ｍＭＥＤＴＡを加えた等張液中に集め、抗ｐ７５モノクローナル抗体および標識さ
れた第二抗体で染色し、そして陽性細胞をＦＡＣＳにより測定することにより、
細胞をアッセイしてもよい。処理に際しウェスタンブロットシグナルまたはＦＡ
ＣＳシグナルが減少することは、細胞死の誘導（またはタンパク質発現の減少）
に成功したことを示す。さらに、商業的に入手可能なキットを用い、アポトーシ
スをモニターしてもよい。

【０４１３】安定トランスフェクション細胞には、ネオマイシン耐性などの選択可能マーカ
ーをコードするベクターを、記載されるプラスミドと共に共トランスフェクショ
ンする。トランスフェクション２または３日後、細胞をＧ４１８中に蒔き、そし
て耐性集団またはクローンを標準的手段により単離する。これらの集団をその後
、二量体化剤で処理した後、細胞計数または細胞生存度の他の測定により、アポ
トーシス誘導に関し、直接モニターしてもよい。

【０４１４】目的の構築物を発現する安定細胞株を生成する別の手段は、挿入物をレトロウ
イルスベクターにサブクローンすることである。本サブクローニングを容易にす
るため、挿入物はＥｃｏＲＩで切除可能である。その後、該ベクターを用い、慣
用的方法を用い、パッケージング細胞により形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ
）上清を作成する。

【０４１５】２．単一タンパク質ラパマイシン制御Ｆａｓ活性化（ａ）Ｆａｓ細胞内ドメインのラパマイシン依存ホモ二量体化のための、ＦＫ
ＢＰ−ＦＲＡＰキメラ断片ＦＫＢＰ−ＦＲＡＰ融合構築物の構築ｉ．構造補助設計ラパマイシン依存ホモ二量体化が可能である、ＦＲＡＰおよびＦＫＢＰドメイ
ンを両方含む分子を設計するため、ヒトＦＫＢＰ１２、ラパマイシン、および最
小ＦＲＢドメインを含むヒトＦＲＡＰの一部の間の三重複合体の三次構造を考慮
してもよい。ＦＲＡＰ、ＦＫＢＰおよびＦａｓ部分を含む融合タンパク質の２つ
の分子のホモ二量体化の必要条件には（ｉ）膜に束縛されている分子間でＦＲＡ
Ｐ−ＦＫＢＰ相互作用が起こるのに必要な歪み（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ）を提供
する一方、凝集Ｆａｓが情報を伝達する能力を保持するのに十分なポリペプチド
の長さおよび柔軟性；並びに（ｉｉ）キレート効果のためエントロピー的に非常
に好ましいと期待され、そしてしたがって望ましい分子間分子二量体化を妨げる
と期待される事象である、ラパマイシンによる分子内二量体化の防止または最小
化が含まれる。

【０４１６】構造を考慮することにより、融合構築物に関し、以下の設計優先が導かれる：
（ｉ）ＦＲＢおよびＦＫＢＰは、分子内二量体化が立体的に妨げられるのに十分
に短いポリペプチドリンカーで結合されるべきである。現在好ましい配置は、Ｆ
ＲＡＰのＣ末端およびＦＫＢＰのＮ末端が離れており、なお分子内二量体化を妨
げるが、柔軟性をもたらす長いリンカー（＞１０アミノ酸）を許すような、ＦＲ
ＡＰ−ＦＫＢＰである。（ｉｉ）本ＦＲＡＰ−ＦＫＢＰ「カセット」は、膜近位（すなわちＦａｓドメイ
ンをＣ末端に付加する）、または膜遠位（Ｆａｓドメインが膜近位であり、そし
てＦＲＡＰ−ＦＫＢＰカセットがＣ末端に付随する）に存在してもよい。（ｉｉｉ）膜での二量体化に伴う構造の歪みを可能にするため、またはＦＲＡＰ
−ＦＫＢＰドメインがＣ末端に付加される場合、ＦＲＡＰ−ＦＫＢＰドメインの
Ｎ末端に長いリンカーが存在するべきである。再び、ＦＲＡＰがＮ末端に位置す
ると、この長いリンカーがＦＲＢドメインのＮ末端領域由来の天然ＦＲＡＰ配列
を含むことが可能になり、キメラタンパク質の免疫原性を最小にするため、好ま
しい。（ｉｖ）既定のタンパク質の最適リンカー長および融合位置は、実験的に確認す
るべきである。

【０４１７】Ｔ１−Ｔ１２と称されるＦＫＢＰおよびＦＲＡＰの一連の１２の融合体を設計
した。９つはＮ−ＦＲＡＰ−ＦＫＢＰ−Ｃ融合体で、Ａｒｇ２０１８のＮ末端側
の１３、２３または３３アミノ酸（Ｎ末端リンカー）、および２つのタンパク質
を分離する４、７または１０残基の間を含む。残る３つはＮ−ＦＫＢＰ−ＦＲＡ
Ｐ−Ｃ融合体であり、ＦＫＢＰＧｌｕ１０７およびＦＲＡＰＡｒｇ２０１８
の間にＦＲＡＰ配列の３、０または−４残基が介在する。（ｉｉ）構築１２の融合体は、３プライマーＰＣＲスプライシング法（Ｙｏｎ，Ｊ．およ
びＦｒｉｅｄ，Ｍ．１９８９．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１７，４８９５）を用い、単一断片として直接クローン化することが可能であ
るＸｂａＩ−ＢａｍＨＩカセットとして作成した。この方法でクローニングする
ことにより、異質な配列をコードし、そしてリンカーの長さを改変するであろう
制限部位を、遺伝子の間に導入することを避けた。ｐＣＧＮＮ−１ＦＲＡＰｉお
よびｐＣＡＮＴＡＢ−ＡＰ−ＦＫＢＰ各１ｎｇの混合物を、望ましい融合を指
示する、両方の遺伝子に相補的な単一「スプライス」オリゴ（Ｂ）０．０１μＭ
の存在下で、２つの外部プライマー（ＡおよびＣ）各１μＭとＰｆｕポリメラー
ゼを用い、増幅した。用いたプライマーは以下に要約される：

【０４１８】

【表２１】

【０４１９】ＰＣＲ産物を精製し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＸｂａＩ−
ＢａｍＨＩ消化ｐＣＭに連結した。該構築物は制限解析およびＤＮＡ配列決定に
より照合した。

【０４２０】プライマー配列および代表的なＦＲＢ−ＦＫＢＰ構築物：ＦＲＡＰ（２００
５→）−ＦＫＢＰの融合体Ｔ６の配列はＷＯ９６／４１８６５（ｐ．１０９）
に開示される。

【０４２１】（ｂ）ｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＳＥおよびｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＬＥへのＦ
ＲＡＰ−ＦＫＢＰキメラ挿入物の付加Ｔ１からＴ１２をＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片として、ＸｂａＩで直線化したｐＡ
７Ｗｐ７５−ＦａｓＳＥおよびｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＬＥにサブクローニング
し、ｐ７５ＴＦａｓＳまたはＬＥを生成する。ＳｐｅＩで直線化したｐＡ７Ｗｐ
７５−ＦａｓＬＥにサブクローニングし、ｐ７５ＦａｓＳまたはＬＴ−Ｅを生成
する。これらの構築物は表（（ｄ）以下）に記載される。

【０４２２】（ｃ）代替ＦＲＡＰ−Ｆａｓ−ＦＫＢＰ構築物キメラ断片Ｔ１−Ｔ１２の形式の代わりに、単一鎖戦略は、最適活性のため異
なる配置のドメインを必要とする可能性がある。この目的のため、ＦＫＢＰおよ
びＦＲＢがＦａｓ断片により分離されている、別の一連の構築物を作成した。こ
れらの構築物の開始点はｐＣＭＦ１ＨＡ、ｐＣＭＦ２ＨＡ、およびｐＣＭＦ３Ｈ
Ａである。キメラ転写因子の構築に関し上述された戦略同様、ＦＫＢＰおよびＦ
ＲＢ断片（本文書で他に記載される）を、ＢａｍＨＩ部位のすぐ上流のＳｐｅＩ
部位を含むＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片として、ｐＣＭ骨格にクローンした。Ｘｂ
ａＩおよびＳｐｅＩは、適合末端を生じるため、これにより最初の挿入物の下流
に、さらなるＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片を挿入することが可能になる。さらに、
ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片のクローニングにより、構築物の５'端に断片が付加される。最終ｐ７５固定構築物は、表（（ｄ）以下）に示されるＸｂａＩ−Ｓ
ｐｅＩ断片をｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＳＥにサブクローニングすることにより作
成した。ｐＡ７Ｗｐ７５−ＦａｓＬＥにサブクローニングすることにより、同様
のシリーズを作成する。ＸｂａＩで切断したベクターへの挿入は、ｐ７５断片の
３'への挿入物の付加を生じた。ＳｐｅＩで切断した本ベクターへの挿入は、Ｆａｓ断片の３'への挿入物の付加を生じた。ＸｂａＩおよびＳｐｅＩで切断した本ベクターへの挿入は、ｐ７５断片の３'への付加および元来該ベクターにあったＦａｓ断片の除去を生じた。これらの３つのサブクローニング戦略を用いるこ
とにより、以下の一連の構築物を生成した。下付の数字は、該ドメインが反復さ
れた回数を定義する。

【０４２３】（ｄ）表略号：Ｎ＝ｐ７５ＮＧＦ受容体ａａ１−２７４Ｆａｓｓ＝Ｆａｓａａ２０６−３０４ＦａｓＬ＝Ｆａｓａａ２０６−３１９Ｋ＝ＦＫＢＰａａ２−１０８Ｒ＝ＦＲＡＰ２０１２−２１１３、しかし別の境界で代用してもよいＥ＝ｐＣＭＦ１／２／３．ＨＡに記載されるように、ＨＡエピトープに続き終止
コドン

【０４２４】

【表２２】

【０４２５】

【表２３】

【０４２６】（ｅ）ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩまたはＸｂａＩ−ＳｐｅＩ断片として、ミリスト
イル化シグナル配列の３'にクローンされた挿入物の構築に関する、断片の末端／接合部配列、オリゴおよび他の詳細は、ＷＯ９６／４１８６５に詳細に開示
される。（ｆ）培養中の安定トランスフェクション・ヒトＨＴ１０８０細胞のラパマイシ
ン制御アポトーシス構築物Ａ３０およびＡ３１（ｄ、表）由来のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片を
ｐＣＭにクローン化し、ＭＴ５ＦａｓＳＥおよびＭＴ６ＦａｓＳＥの発現を指示
する構築物、Ｍ３０およびＭ３１を生成した。ここでＭはミリストイル化ドメイ
ン（本実施例セクションＡ．１．およびＡ．８．を参照されたい）を示し、そし
て他の略語はｄ、表に記載される通りである。これらの発現カセットを含む
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をその後、レトロウイルスベクターｐＳＭＴＮ３（
実施例７）にクローン化した。該構築物およびＰｓｉ（−）広宿主性パッケージ
ングベクターを用い、２９３Ｔ細胞（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．ら，１９９３．
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８３９２
−８３９６）の一過性共トランスフェクションにより、本ＤＮＡを含むヘルパー
不含レトロウイルスを生成した。ＨＴ１０８０細胞をウイルスストックに感染さ
せ、そしてＧ４１８で選択した。

【０４２７】細胞の安定トランスフェクションプールの、ラパマイシンに反応したアポトー
シスをアッセイするため、細胞を１００００細胞／ウェルで９６ウェル培養プレ
ートに置いた。一晩インキュベーションした後、ラパマイシンの連続希釈を５０ｎｇ／ｍｌ（最終）アクチノマイシンＤと共に添加し、そして３７℃および５
％ＣＯ２でおよそ２０時間インキュベーションを続けた。培地を除き、１０％
アラマーブルー色素を含む培地１００μｌで置き換えた。プレートを前と同様イ
ンキュベーションし、そしてマイクロタイタープレートリーダー上で、５７０
ｎｍおよび６００ｎｍのＯＤの分光測定により、定期的に細胞生存度を評価し
た。典型的には、コントロール（未処理）ウェルがブランクを減じた後、ＯＤ０
．２−０．４になるまで、読み取りを続けた。

【０４２８】（ａ）Ｍ３０および（ｂ）Ｍ３１発現構築物で安定トランスフェクションされ
た細胞の生存は、用量依存方式で、ラパマイシンの存在下で強力に減少した。細
胞死の度合いは、合成ＦＫＢＰホモ二量体化剤ＡＰ１４２８で処理されたミリス
トイル化（ＦＫＢＰｘ２）−Ｆａｓ構築物（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０８００８
に開示されるようなもの）を発現している細胞のものに匹敵する。本系は、好ま
しくはＦＫＢＰおよび／またはＦＲＢドメインに１つまたはそれ以上の突然変異
を使用し、本発明の改善ラパログに使用するため適合させてもよい。

【０４２９】本明細書に引用される特許文書および科学論文各々の完全な開示が、本明細書
に援用される。これらの文書は、本発明の多様な側面における最新技術を例示す
るのに役立つ。本発明の多くの修飾および変動は、当業者に明白であるはずであ
る。こうした修飾および変動は、異種性作用ドメインを選択する際の設計選択、
改善ラパログ、融合タンパク質設計、ＤＮＡ処方、ウイルスベクターまたは他の
ＤＮＡ搬送手段、導入遺伝子投与の方式および経路などを含め、本発明および付
随する請求項の範囲に含まれることが意図される。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例７記載の方法に従って操作したＨＴ１０８０細胞内で分泌
型アルカリホスファターゼ(secreted alkaline phosphatase) （”ＳＥＡＰ”）
をコードするＤＮＡ配列の発現を強化するための、１３−Ｆ−ラパログ（それぞ
れ、実施例６．１および６．２１に記載の方法に従って合成された化合物７９お
よび１０８）の能力について、示している。

【図２】本明細書中に記載の方法に従って合成された、ダイマライザーと
してのラパログ４２、５３、６９および９６を用いた転写アッセイの結果を示し
ている。野生型ＦＲＢ（図２Ａおよび２Ｃ）を発現する細胞内、ならびに、Ｔｈ
ｒ２０９８を、Ｌｅｕ（図２Ｂおよび２Ｃ）で、またはＰｈｅ（図２Ｅ）で、置
き換えた変異型ＦＲＢを発現する細胞内、でラパログを試験した。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１２月１６日（１９９９．１２．１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】（式中nは１または２である１つ以上の置換基を有し、１ないし８位の炭素をつなぐ１つ以上の炭素−炭素結合において不飽和であってもよい）の構造を有する
。

【化２】（式中ａは

【化３】であり、Ｒ^C7aおよびＲ^C7bの一方は、Ｈであり、他方は、−Ｈ、ハロ、−Ｒ²、−ＯＲ¹ 、−ＳＲ¹、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ¹、−ＯＣ(Ｏ)ＮＨＲ¹、−ＮＨＲ¹、−ＮＲ¹Ｒ²、− ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ¹、または−ＮＨ−ＳＯ₂−Ｒ¹であり；式中、Ｒ²は、脂肪族、ヘテ
ロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、またはアルキルアリールであり；Ｒ^C30は、ハロ、−ＯＲ³または（＝Ｏ）であり；Ｒ^C24は、＝Ｏ、＝ＮＲ⁴、＝ＮＯＲ⁴、＝ＮＮＨＲ⁴、−ＮＨＯＲ⁴、−ＮＨＮＨＲ⁴、−ＯＲ⁴、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁴、−ＯＣ(Ｏ)ＮＲ⁴、ハロまたは−Ｈであり；Ｒ^C14は、＝Ｏ、−ＯＲ⁶、−ＮＲ⁶、−Ｈ、−ＮＣ(Ｏ)Ｒ⁶、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁶、または−ＯＣ(Ｏ)ＮＲ⁶であり；Ｒ³０は、Ｈ、−Ｒ⁷、−Ｃ(Ｏ)Ｒ⁷または−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ⁷またはＣ２８および
Ｃ３０を架橋する環状部分であり； R^C28はハロまたは−OR³であり； R^C29はH,OHまたはOMeであり；個々の置換基は、特に示さない限りにおいて、いずれかの立体化学方向で存在
することができ、Ｒ¹、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹のそれぞれは
、独立的に、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールおよびヘテロアリールから選
択され；Ｒ⁵は、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、＝Ｏ、−ＯＨ、−ＮＲ⁹Ｒ¹⁰、ＯＳＯ₂ＣＦ₃、ＯＳＯ ₂ Ｆ、ＯＳＯ₂Ｒ^4'、ＯＣＯＲ^4'、ＯＣＯＮＲ^4'Ｒ^5'、またはＯＣＯＮ(ＯＲ^4'）Ｒ ⁵ であり；ここで、R^C13およびR^C28の一方又は両方はハロ置換基であり；R^C24およびR^C30 の両方は=O以外であり；R^C7aおよびR^C7bの一方はHであって、他方はフェニル、ジーまたはトリ−置換フェニルまたはモノ−またはジ−置換複素環部分であり；
nは１であり；および／または部分"a"は

【化４】以外である）の構造を有する。

【請求項３１】改良されたラパログが経口投与される請求項２８−３０のいず
れかの方法。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年３月６日（２００１．３．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年３月１４日（２００１．３．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 19/00 (Ｃ０７Ｄ 498/18 //(Ｃ０７Ｄ 498/18 273:00 273:00 311:00 311:00 221:00） 221:00）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号６０／０７２，２１９ (32)優先日平成10年１月22日(1998．1．22) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／０１２，０９７ (32)優先日平成10年１月22日(1998．1．22) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ギルマン，マイケル・ズィーアメリカ合衆国マサチューセッツ州02168，ニュートン，チェスナット・ストリート 550 (72)発明者ホルト，デニス・エイアメリカ合衆国マサチューセッツ州01718，アクトン，タムブレイン・ホーク 516 (72)発明者キーナン，テレンス・ピーアメリカ合衆国マサチューセッツ州02141，ケンブリッジ，スプリング・ストリート 62，アパートメント１エル (72)発明者ラザムス，レナードアメリカ合衆国マサチューセッツ州01730，ベッドフォード，ミッチェル・グラント・ウェイ 39 (72)発明者ヤン，ウアメリカ合衆国マサチューセッツ州02167，チェスナット・ヒル，ハモンド・ポンド・パークウェイナンバー３，34

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】細胞中のキメラ蛋白質を多量体化する方法であって、下記段階か
ら成る方法：（a)下記を含む細胞を提供し： (i)ラパマイシンまたはその同族体に結合し、少なくとも１つのFKBPドメインおよびそれに対して非相同性の少なくとも１つの蛋白質ドメインを含む第１キ
メラ蛋白質をコードする第１組み換え核酸であって、該FKBPドメインは下記から
選択されるペプチド配列を含み： (1)天然FKBP (2)１０以下のアミノ酸残基が削除され、挿入されまたは代わりのアミノ酸で置換された、天然FKBPの変種 (3)(i)または(ii)のFKBPをコードするDNAに選択的にハイブリダイズできるDNA配列によってコード化されたFKBP; (ii)(a)ラパマイシンまたはその同族体および(b)第１キメラ蛋白質の両方と
複合体を形成し、少なくとも１つのFRBドメインおよびそれに対して非相同性の少なくとも１つのドメインを含む第２キメラ蛋白質をコードする第２組み換え核
酸であって、該FRBドメインは下記から選択されるペプチド配列を含み： (1)天然FRB (2)１０以下のアミノ酸残基が削除され、挿入されまたは代わりのアミノ酸で置換された、天然FRBドメインの変種 (3)(iv)または(v)のFRBをコードするDNAに選択的にハイブリダイズできる
DNA配列によってコード化されたFRBドメイン；そして (b)上記細胞を、それ自体と第１および第２キメラ蛋白質の各々の少なくとも１つの分子とを含む複合体を形成する改良されたラパログと接触させ、ここで、該
改良されたラパログは、実質的に純粋な立体異性体または立体異性体の混合物、
またはその医薬として許容される誘導体として、ラパマイシンの０．０１倍未満
の免疫抑制効果を有し、式I：【化１】（式中nは１または２である１つ以上の置換基を有し、１ないし８位の炭素をつなぐ１つ以上の炭素−炭素結合において不飽和であってもよい）の構造を有する
。【請求項２】細胞中のキメラ蛋白質を多量体化する方法であって、下記段階から
成る方法：（a)下記を含む細胞を提供し： (i)ラパマイシンまたはその同族体に結合し、少なくとも１つのFKBPドメインおよびそれに対して非相同性の少なくとも１つの蛋白質ドメインを含む第１キ
メラ蛋白質をコードする第１組み換え核酸であって、該FKBPドメインは下記から
選択されるペプチド配列を含み： (1)天然FKBP (2)１０以下のアミノ酸残基が削除され、挿入されまたは代わりのアミノ酸で置換された、天然FKBPの変種 (3)(i)または(ii)のFKBPをコードするDNAに選択的にハイブリダイズできるDNA配列によってコード化されたFKBP; (ii)(a)ラパマイシンまたはその同族体および(b)第１キメラ蛋白質の両方と
複合体を形成し、少なくとも１つのFRBドメインおよびそれに対して非相同性の少なくとも１つのドメインを含む第２キメラ蛋白質をコードする第２組み換え核
酸であって、該FRBドメインは下記から選択されるペプチド配列を含み： (1)天然FRB (2)１０以下のアミノ酸残基が削除され、挿入されまたは代わりのアミノ酸で置換された、天然FRBドメインの変種 (3)(iv)または(v)のFRBをコードするDNAに選択的にハイブリダイズできる
DNA配列によってコード化されたFRBドメイン；そして (b)上記細胞を、それ自体と第１および第２キメラ蛋白質の各々の少なくとも１つの分子とを含む複合体を形成する改良されたラパログと接触させ、ここで、該
改良されたラパログは、実質的に純粋な立体異性体または立体異性体の混合物、
またはその医薬として許容される誘導体として、下記式：【化２】（式中ａは【化３】であり、Ｒ^C7aおよびＲ^C7bの一方は、Ｈであり、他方は、−Ｈ、ハロ、−Ｒ²、−ＯＲ¹ 、−ＳＲ¹、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ¹、−ＯＣ(Ｏ)ＮＨＲ¹、−ＮＨＲ¹、−ＮＲ¹Ｒ²、− ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ¹、または−ＮＨ−ＳＯ₂−Ｒ¹であり；式中、Ｒ²は、脂肪族、ヘテ
ロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、またはアルキルアリールであり；Ｒ^C30は、ハロ、−ＯＲ³または（＝Ｏ）であり；Ｒ^C24は、＝Ｏ、＝ＮＲ⁴、＝ＮＯＲ⁴、＝ＮＮＨＲ⁴、−ＮＨＯＲ⁴、−ＮＨＮＨＲ⁴、−ＯＲ⁴、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁴、−ＯＣ(Ｏ)ＮＲ⁴、ハロまたは−Ｈであり；Ｒ^C14は、＝Ｏ、−ＯＲ⁶、−ＮＲ⁶、−Ｈ、−ＮＣ(Ｏ)Ｒ⁶、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ⁶、または−ＯＣ(Ｏ)ＮＲ⁶であり；Ｒ³０は、Ｈ、−Ｒ⁷、−Ｃ(Ｏ)Ｒ⁷または−Ｃ(Ｏ)ＮＨＲ⁷またはＣ２８および
Ｃ３０を架橋する環状部分であり； R^C28はハロまたは−OR³であり； R^C29はH,OHまたはOMeであり；個々の置換基は、特に示さない限りにおいて、いずれかの立体化学方向で存在
することができ、Ｒ¹、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹のそれぞれは
、独立的に、Ｈ、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールおよびヘテロアリールから選
択され；Ｒ⁵は、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、＝Ｏ、−ＯＨ、−ＮＲ⁹Ｒ¹⁰、ＯＳＯ₂ＣＦ₃、ＯＳＯ ₂ Ｆ、ＯＳＯ₂Ｒ^4'、ＯＣＯＲ^4'、ＯＣＯＮＲ^4'Ｒ^5'、またはＯＣＯＮ(ＯＲ^4'）Ｒ ⁵ であり；ここで、R^C13およびR^C28の一方又は両方はハロ置換基であり；R^C24およびR^C30 の両方は=O以外であり；R^C7aおよびR^C7bの一方はHであって、他方はフェニル、ジーまたはトリ−置換フェニルまたはモノ−またはジ−置換複素環部分であり；
nは１であり；および／または部分"a"は【化４】以外である）の構造を有する。【請求項３】 R^C13がハロである請求項２の方法。【請求項４】 R^C13がフルオルである請求項３の方法。【請求項５】 R^C28はハロである請求項２，３または４の方法。【請求項６】 R^C28はフルオルである請求項３の方法。【請求項７】 R^C24およびR^C30の両方は=O以外である請求項２ないし６のいずれ
かの方法。【請求項８】 R^C24およびR^C30の一方または両方は-OH,-OR¹またはハロである請
求項７の方法。【請求項９】 R^C7aおよびR^C7bの少なくとも一方は-OMe以外の部分である請求項
２ないし８のいずれかの方法。【請求項１０】 R^C7aおよびR^C7bの一方はHであり他方はフェニル、ジーまたはトリ−置換フェニルまたはモノ−またはジ−置換複素環部分である請求項９の方
法。【請求項１１】 R^C7aおよびR^C7bの一方はHであり他方はo,pージアルキルフェニ
ルまたはまたはトリ−アルキルフェニルである請求項９の方法。【請求項１２】 R^C7aおよびR^C7bの一方はHであり他方はo,pージメトキシフェニ
ル、o−メトキシ−p−エトキシフェニル、o−エトキシ−p−メトキシフェニル、
o,pージエトキシフェニル、トリメトキシフェニルまたはトリエトキシフェニルである請求項９の方法。【請求項１３】改良されたラパログは、ラパマイシンの０．０１倍未満の免疫
抑制効果を有する請求項１ないし１２のいずれかの方法。【請求項１４】第１組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFKBPドメインを含み、そのペプチド配列は天然FKBPペプチド配列に
比べて３つ以下のアミノ酸の置換を含む請求項１−４，６，８または１０−１３
のいずれかの方法。【請求項１５】第１組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFKBPドメインを含み、そのペプチド配列は天然FKBPペプチド配列に
比べて１つのアミノ酸の置換を含む請求項５の方法。【請求項１６】第１組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFKBPドメインを含み、そのペプチド配列は天然FKBPペプチド配列に
比べて１つのアミノ酸の置換を含む請求項７の方法。【請求項１７】第１組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少
なくとも１つのFKBPドメインを含み、そのペプチド配列は天然FKBPペプチド配列
に比べて１つのアミノ酸の置換を含む請求項９の方法。【請求項１８】第１組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFKBPドメインを含み、そのペプチド配列は天然FKBPペプチド配列の
フェニルアラニン−３６の代わりに１つのアミノ酸の置換を含む請求項１４の方
法。【請求項１９】第１組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFKBPドメインを含み、そのペプチド配列は天然FKBPペプチド配列の
フェニルアラニン−３６の代わりに１つのアミノ酸の置換を含む請求項１５−１
７のいずれかの方法。【請求項２０】第２組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFRBドメインを含み、そのペプチド配列は天然FRBペプチド配列に比
べて３つ以下のアミノ酸の置換を含む請求項１−４，６，８、１０−１３または
１５−１８のいずれかの方法。【請求項２１】第２組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFRBドメインを含み、そのペプチド配列は天然FRBペプチド配列に比
べて１つのアミノ酸の置換を含む請求項５の方法。【請求項２２】第２組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFRBドメインを含み、そのペプチド配列は天然FRBペプチド配列に比
べて１つのアミノ酸の置換を含む請求項７の方法。【請求項２３】第２組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFRBドメインを含み、そのペプチド配列は天然FRBペプチド配列に比
べて１つのアミノ酸の置換を含む請求項９の方法。【請求項２４】第２組み換え核酸によってコード化されたキメラ蛋白質が少な
くとも１つのFRBドメインを含み、そのペプチド配列は天然FRBペプチド配列中の
Tyr2038,Phe2039,Thr2098,Gln2099,Trp2101またはAsp2102の１つ以上の代わりに
１つのアミノ酸の置換を含む請求項１４の方法。【請求項２５】キメラ蛋白質の少なくとも１つが、DNA−結合ドメイン、転写活性化ドメイン、またはすくなくとも１つの下記のような信号ドメインを含む他
の蛋白質と二量体化すると成長、増殖、分化またはアポトーシスの引き金を引く
ための細胞信号ドメインである作用ドメインを含む請求項１−２４のいずれかの
方法。【請求項２７】細胞が培地で生育され、改良されたラパログとの接触が該改良
されたラパログを培地に添加することによって行われる請求項１−２５のいずれ
かの方法。【請求項２８】上記細胞がある生物の全身に存在し、改良されたラパログとの
接触が該改良されたラパログを該生物に投与することによって行われる請求項１
−２５のいずれかの方法。【請求項２９】細胞が哺乳動物のものであり、生物が哺乳動物である請求項２
８の方法。【請求項３０】細胞が霊長類のものであり、生物が霊長類である請求項２９の
方法。【請求項３１】霊長類がヒトである請求項３０の方法。【請求項３２】改良されたラパログが経口投与される請求項２９−３１のいず
れかの方法。