JP2002505846A - シグナル増幅およびプロセッシングのための多重逐次的ポリヌクレオチド置換反応 - Google Patents
シグナル増幅およびプロセッシングのための多重逐次的ポリヌクレオチド置換反応Info
- Publication number
- JP2002505846A JP2002505846A JP2000519604A JP2000519604A JP2002505846A JP 2002505846 A JP2002505846 A JP 2002505846A JP 2000519604 A JP2000519604 A JP 2000519604A JP 2000519604 A JP2000519604 A JP 2000519604A JP 2002505846 A JP2002505846 A JP 2002505846A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide sequence
- complex
- polynucleotide
- sequence
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 702
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 702
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 702
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 title claims abstract description 92
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title description 22
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title description 22
- 238000012545 processing Methods 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 181
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 102
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 96
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 82
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 55
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 51
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 50
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 49
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 49
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 28
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 23
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 19
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 19
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 17
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 16
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 14
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 14
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical group NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 8
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 7
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 7
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims description 7
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 claims description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 6
- 238000009736 wetting Methods 0.000 claims description 6
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 4
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 claims description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 claims description 2
- 238000001739 density measurement Methods 0.000 claims 6
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 claims 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 claims 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 17
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 15
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 15
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 235000019878 cocoa butter replacer Nutrition 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- -1 morpholino nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000000123 temperature gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- IPVPURUWKGWQQV-UHFFFAOYSA-N aminophosphonous acid;prop-2-enamide Chemical compound NP(O)O.NC(=O)C=C IPVPURUWKGWQQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical group 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- DSYBJJPCWALMGQ-UHFFFAOYSA-N 3-(iminomethylideneamino)-1-n,1-n'-dimethylpentane-1,1-diamine Chemical compound N=C=NC(CC)CC(NC)NC DSYBJJPCWALMGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033029 Carbonic anhydrase-related protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 241001212789 Dynamis Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000867841 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101001075218 Homo sapiens Gastrokine-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000948268 Meda Species 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000010621 bar drawing Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- ZIODNPFQZIHCOE-UHFFFAOYSA-N hydron;3-[2-[4-(2-methylphenyl)piperazin-1-yl]ethyl]-5,6,7,8-tetrahydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridine;chloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC=C1N1CCN(CCC=2N3CCCCC3=NN=2)CC1 ZIODNPFQZIHCOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N methyl dihydrogen phosphate Chemical compound COP(O)(O)=O CAAULPUQFIIOTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L methylphosphonate(2-) Chemical compound CP([O-])([O-])=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6823—Release of bound markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
逐次的プローブでの化学的ハイブリダイゼーションと、検出に先立つシグナル獲得の可能性を有する置換複合体形成とを用いる、標的ポリヌクレオチド配列の存在の決定方法が開示される。
Description
【０００１】 関連出願 本出願は１９９７年１１月６日出願の暫定出願第６０／０６４，６６７号に対
する優先権を主張するものである。前記出願の全ての教示は参考のために本明細
書に取り込まれる。
する優先権を主張するものである。前記出願の全ての教示は参考のために本明細
書に取り込まれる。
【０００２】 発明の背景 ハイブリダイゼーションの原理は核酸検出方法が基づく根拠として利用される
。特定の核酸配列の存在を検出するための従来の方法では、相補配列、通常は標
識されたプローブ配列を用い、そしてこの標識配列を対象となる試料を含有する
と考えられる試料と共にインキュベートする。標的核酸のポリヌクレオチド配列
がプローブのポリヌクレオチド配列に相補的である場合、両者は（適当な条件下
で）ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションが起こる場合、ハイブリダイ
ゼーション複合体を検出することができる。この一般的なプロトコールのバリエ
ーションが長期にわたり開発されている。検出アッセイの感度は低濃度の核酸の
存在を検出する場合に特に重要となる。
。特定の核酸配列の存在を検出するための従来の方法では、相補配列、通常は標
識されたプローブ配列を用い、そしてこの標識配列を対象となる試料を含有する
と考えられる試料と共にインキュベートする。標的核酸のポリヌクレオチド配列
がプローブのポリヌクレオチド配列に相補的である場合、両者は（適当な条件下
で）ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションが起こる場合、ハイブリダイ
ゼーション複合体を検出することができる。この一般的なプロトコールのバリエ
ーションが長期にわたり開発されている。検出アッセイの感度は低濃度の核酸の
存在を検出する場合に特に重要となる。
【０００３】 核酸アッセイの感度を改善するために、種々の増幅方法が開発されている。１
つのアプローチは標的分子の数を増幅することである。ポリメラーゼ連鎖反応即
ちＰＣＲは標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を増やすために用いられる方法
であり、これにより、元の標的配列が増幅される。オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ
），Ｆ．Ｍ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第５版、（１９９
１）、第２巻、１５．１．１−１５．３．８．頁；１５．４．１−１５．４．６
頁。鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写媒介増幅（ＴＭＡ）は標的ポリヌクレオチ
ド配列を増大または増幅させるために用いられる方法の他の２つの例である。こ
れらの方法は全て、蛋白、例えば、必要な反応を触媒するためのこれらの操作法
において用いられる酵素を必要とし、このことはアッセイを行うことのできる条
件を制約する。これらの特定のアッセイではこれらの酵素の存在が必要なため、
これらの記載の方法の有効性を確保するためには臨界的（ｃｒｉｔｉｃａｌ）で
厳密な反応を確立し、維持しなければならない。
つのアプローチは標的分子の数を増幅することである。ポリメラーゼ連鎖反応即
ちＰＣＲは標的ポリヌクレオチド配列のコピー数を増やすために用いられる方法
であり、これにより、元の標的配列が増幅される。オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ
），Ｆ．Ｍ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第５版、（１９９
１）、第２巻、１５．１．１−１５．３．８．頁；１５．４．１−１５．４．６
頁。鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写媒介増幅（ＴＭＡ）は標的ポリヌクレオチ
ド配列を増大または増幅させるために用いられる方法の他の２つの例である。こ
れらの方法は全て、蛋白、例えば、必要な反応を触媒するためのこれらの操作法
において用いられる酵素を必要とし、このことはアッセイを行うことのできる条
件を制約する。これらの特定のアッセイではこれらの酵素の存在が必要なため、
これらの記載の方法の有効性を確保するためには臨界的（ｃｒｉｔｉｃａｌ）で
厳密な反応を確立し、維持しなければならない。
【０００４】 標的配列そのものよりも、むしろハイブリダイゼーション−置換アッセイ中に
発生するシグナルを増幅するのに十分な感度を有するが、上記した煩雑さを回避
するような核酸ハイブリダイゼーションアッセイが望ましいであろう。
発生するシグナルを増幅するのに十分な感度を有するが、上記した煩雑さを回避
するような核酸ハイブリダイゼーションアッセイが望ましいであろう。
【０００５】 発明の概要 本発明は新規で商業的に有用な核酸分析方法に関する。本発明は検出可能なシ
グナルの振幅利得または増幅をもたらす多重逐次的ポリヌクレオチド置換反応を
用いた高度に特異的な、ハイブリダイゼーションに基づく核酸同定システムを提
供する。
グナルの振幅利得または増幅をもたらす多重逐次的ポリヌクレオチド置換反応を
用いた高度に特異的な、ハイブリダイゼーションに基づく核酸同定システムを提
供する。
【０００６】 本発明の核心は、先行する置換反応の置換されたポリヌクレオチドが移動して
次のプローブ複合体に接触し、ここでこれが新しい置換サイクルの標的となる、
多重ポリヌクレオチド置換を提供する。
次のプローブ複合体に接触し、ここでこれが新しい置換サイクルの標的となる、
多重ポリヌクレオチド置換を提供する。
【０００７】 本発明の一態様においては、生物学的試料中の標的ポリヌクレオチド配列を検
出する方法を開示する。この検出方法は一連の逐次ハイブリダイゼーションおよ
び置換反応を含み、これらは相互にハイブリダイズしてプローブ複合体を形成す
る相補ポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションにより形成されるプロ
ーブ複合体を利用している。このハイブリダイゼーション複合体は続いて、複合
体の構成ポリヌクレオチド配列の１つと競合するポリヌクレオチド配列と接触す
る。標的ヌクレオチド配列は、プローブ複合体、一般的には形成される最初のプ
ローブ複合体内で構成配列が発見した配列を競合的に排除するような配列の１つ
である。この競合により置換されたポリヌクレオチド配列が生じる。親和性の物
理化学的原理に基づいて、競合するポリヌクレオチド配列は、プローブ複合体を
有する２つのポリヌクレオチド配列の１つを置換する。置換されたポリヌクレオ
チド配列はその後、種々の方法で検出することのできる、または、異なるプロー
ブ複合体内の別の構成ポリヌクレオチド配列を競合的に排除するために使用でき
る、シグナルとして機能する。多重置換とは、各置換工程においてシグナルの振
幅利得を伴う、または、伴わないで行われる最低１つ以上の置換事象であること
ができる。
出する方法を開示する。この検出方法は一連の逐次ハイブリダイゼーションおよ
び置換反応を含み、これらは相互にハイブリダイズしてプローブ複合体を形成す
る相補ポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションにより形成されるプロ
ーブ複合体を利用している。このハイブリダイゼーション複合体は続いて、複合
体の構成ポリヌクレオチド配列の１つと競合するポリヌクレオチド配列と接触す
る。標的ヌクレオチド配列は、プローブ複合体、一般的には形成される最初のプ
ローブ複合体内で構成配列が発見した配列を競合的に排除するような配列の１つ
である。この競合により置換されたポリヌクレオチド配列が生じる。親和性の物
理化学的原理に基づいて、競合するポリヌクレオチド配列は、プローブ複合体を
有する２つのポリヌクレオチド配列の１つを置換する。置換されたポリヌクレオ
チド配列はその後、種々の方法で検出することのできる、または、異なるプロー
ブ複合体内の別の構成ポリヌクレオチド配列を競合的に排除するために使用でき
る、シグナルとして機能する。多重置換とは、各置換工程においてシグナルの振
幅利得を伴う、または、伴わないで行われる最低１つ以上の置換事象であること
ができる。
【０００８】 別の態様においては、本発明は反復サイクルを用いた生物学的試験試料中の標
的ポリヌクレオチド配列を検出する方法に関する。プローブおよび置換複合体が
数回のサイクルで形成されることにより、これらの置換されたポリヌクレオチド
配列の１つが元の標的ポリヌクレオチド配列と同一であるような多重置換ポリヌ
クレオチド配列が生じ、それにより最初の置換複合体への再循環（ｃｙｃｌｉｎ
ｇ ｂａｃｋ）及び逐次的ハイブリダイゼーションの進行が容易になり、置換サ
イクルが再び行なわれる。プローブおよび置換複合体の形成を経るリサイクルの
この過程により、検出前のアッセイシグナルの増幅が提供される。
的ポリヌクレオチド配列を検出する方法に関する。プローブおよび置換複合体が
数回のサイクルで形成されることにより、これらの置換されたポリヌクレオチド
配列の１つが元の標的ポリヌクレオチド配列と同一であるような多重置換ポリヌ
クレオチド配列が生じ、それにより最初の置換複合体への再循環（ｃｙｃｌｉｎ
ｇ ｂａｃｋ）及び逐次的ハイブリダイゼーションの進行が容易になり、置換サ
イクルが再び行なわれる。プローブおよび置換複合体の形成を経るリサイクルの
この過程により、検出前のアッセイシグナルの増幅が提供される。
【０００９】 本発明の別の態様においては、１セットの異種シグナルを用い、試料中の核酸
分子中の標的ポリヌクレオチド配列の検出方法を記載する。この態様においては
、分岐（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ）事象が生じるハイブリダイゼーションおよび
置換のサイクルが起こり、多数の異なるハイブリダイゼーション／置換サイクル
が生じ、これにより１つの特定の標的ポリヌクレオチド配列に対して多数の異種
シグナルが生じる。
分子中の標的ポリヌクレオチド配列の検出方法を記載する。この態様においては
、分岐（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ）事象が生じるハイブリダイゼーションおよび
置換のサイクルが起こり、多数の異なるハイブリダイゼーション／置換サイクル
が生じ、これにより１つの特定の標的ポリヌクレオチド配列に対して多数の異種
シグナルが生じる。
【００１０】 更に別の態様においては、本発明は同種シグナルを生じさせることにより１つ
の試料中において異なる標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法に関する。プ
ローブ複合体は、標的ポリヌクレオチド配列と部分的または完全に相補的である
第１のポリヌクレオチド配列を第２のポリヌクレオチド配列（標的配列とは別で
異なる）とハイブリダイズすることにより形成される。このプローブ複合体の形
成は試料中の分析される標的ポリヌクレオチド配列の全てに対して起こる。ハイ
ブリダイゼーションおよび置換サイクルは、分析対象とされる異なる標的ポリヌ
クレオチド配列を用い、独立して起こる。しかしながらアッセイは分析される標
的ポリヌクレオチド配列の全てに対応する同種ポリヌクレオチド配列シグナルを
生じるように構成される。
の試料中において異なる標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法に関する。プ
ローブ複合体は、標的ポリヌクレオチド配列と部分的または完全に相補的である
第１のポリヌクレオチド配列を第２のポリヌクレオチド配列（標的配列とは別で
異なる）とハイブリダイズすることにより形成される。このプローブ複合体の形
成は試料中の分析される標的ポリヌクレオチド配列の全てに対して起こる。ハイ
ブリダイゼーションおよび置換サイクルは、分析対象とされる異なる標的ポリヌ
クレオチド配列を用い、独立して起こる。しかしながらアッセイは分析される標
的ポリヌクレオチド配列の全てに対応する同種ポリヌクレオチド配列シグナルを
生じるように構成される。
【００１１】 別の態様においては、本発明は固定化表面を用い、核酸分子中の標的ポリヌク
レオチド配列を検出する方法に関する。ハイブリダイゼーションおよび置換のサ
イクルはこの方法全体を通して起こる。しかしながら、ハイブリダイゼーション
複合体は表面に固定化され、置換されたポリヌクレオチド配列は溶液中で遊離し
ている。複合体のポリヌクレオチド配列の一部を置換するために競合するポリヌ
クレオチド配列を用いることによりハイブリダイゼーション複合体、特に、置換
複合体から遊離した置換されたポリヌクレオチド配列は、反応サイクルを継続す
るために別の表面、例えば別の置換複合体に移すことができる。関与する表面は
同一平面上であってもよく、あるいは、例えばサイズ排除膜により相互に分離さ
れていてもよい。あるいは、たとえば異なる表面を提示する異なるコニカルチュ
ーブを用いることで例示されるように、表面を空間的に分離することもできる。
この態様はまた反応ステーション（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｉｏｎ）がマト
リックス自体と一体化された固体支持体マトリックスの使用も包含している。プ
ローブ複合体または置換複合体の形成のような特定の事象のための反応体をこれ
らの反応ステーションに添加することができ、それによりこれらの個々の反応事
象を孤立化させる。１つのステーションから次への反応基質または生成物の移動
は、支援的または非支援的なマトリックスを通る移動を介して、または例えばピ
ペットを用いた機械的移送により行うことができる。
レオチド配列を検出する方法に関する。ハイブリダイゼーションおよび置換のサ
イクルはこの方法全体を通して起こる。しかしながら、ハイブリダイゼーション
複合体は表面に固定化され、置換されたポリヌクレオチド配列は溶液中で遊離し
ている。複合体のポリヌクレオチド配列の一部を置換するために競合するポリヌ
クレオチド配列を用いることによりハイブリダイゼーション複合体、特に、置換
複合体から遊離した置換されたポリヌクレオチド配列は、反応サイクルを継続す
るために別の表面、例えば別の置換複合体に移すことができる。関与する表面は
同一平面上であってもよく、あるいは、例えばサイズ排除膜により相互に分離さ
れていてもよい。あるいは、たとえば異なる表面を提示する異なるコニカルチュ
ーブを用いることで例示されるように、表面を空間的に分離することもできる。
この態様はまた反応ステーション（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｉｏｎ）がマト
リックス自体と一体化された固体支持体マトリックスの使用も包含している。プ
ローブ複合体または置換複合体の形成のような特定の事象のための反応体をこれ
らの反応ステーションに添加することができ、それによりこれらの個々の反応事
象を孤立化させる。１つのステーションから次への反応基質または生成物の移動
は、支援的または非支援的なマトリックスを通る移動を介して、または例えばピ
ペットを用いた機械的移送により行うことができる。
【００１２】 生物学的試料中の標的ポリヌクレオチド配列の存在を測定するための診断用キ
ットもまた本発明において開示される。キットは第１のプローブ複合体および少
なくとも１つの第２のプローブ複合体を含む。第１のプローブ複合体は、第２の
ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる標的ポリヌクレオチド配列に相補
的な配列を有する第１のポリヌクレオチド配列を有する。第２のプローブ複合体
は、標識された第４のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる、第１のプ
ローブ複合体の第２のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する第３のポリ
ヌクレオチド配列を有する。
ットもまた本発明において開示される。キットは第１のプローブ複合体および少
なくとも１つの第２のプローブ複合体を含む。第１のプローブ複合体は、第２の
ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる標的ポリヌクレオチド配列に相補
的な配列を有する第１のポリヌクレオチド配列を有する。第２のプローブ複合体
は、標識された第４のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされる、第１のプ
ローブ複合体の第２のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する第３のポリ
ヌクレオチド配列を有する。
【００１３】 このように、本明細書に記載した置換反応に基づき、今回、生物学的試料中に
存在する少量のポリヌクレオチド配列の存在を正確で高感度に検出するための新
規な方法が得られた。ハイブリダイゼーションに基づいたアッセイは極めて特異
的でありかなり容易に行なえる。また、比較的広範な実験条件下で安定して進行
する。シグナルの発生のために用いられる置換されたポリヌクレオチド配列をハ
イブリダイズされていないプローブ複合体から効率的に分離することにより、置
換はより簡便でかつ高感度なハイブリダイゼーション反応の検出を可能とする。
酵素的アッセイは極めて高感度であるが、これらのアッセイは、適切な酵素活性
を確保するためにアッセイ条件の極めて厳密な管理を必要とする。
存在する少量のポリヌクレオチド配列の存在を正確で高感度に検出するための新
規な方法が得られた。ハイブリダイゼーションに基づいたアッセイは極めて特異
的でありかなり容易に行なえる。また、比較的広範な実験条件下で安定して進行
する。シグナルの発生のために用いられる置換されたポリヌクレオチド配列をハ
イブリダイズされていないプローブ複合体から効率的に分離することにより、置
換はより簡便でかつ高感度なハイブリダイゼーション反応の検出を可能とする。
酵素的アッセイは極めて高感度であるが、これらのアッセイは、適切な酵素活性
を確保するためにアッセイ条件の極めて厳密な管理を必要とする。
【００１４】 本発明は酵素的アッセイによりもたらされる制約を克服する。本発明には他に
も実用上の利点がある。本発明は、ハイブリダイゼーションに依存するが酵素触
媒作用には依存しないシグナルの発生および増幅の方法を提供する。本発明は１
つの標的ポリヌクレオチド配列が複数の空間的または化学的に異なるシグナルを
発生させるために、ハイブリダイゼーション反応から生じるシグナルの処理方法
を提供する。同様に、本発明は異なる標的ポリヌクレオチド配列のハイブリダイ
ゼーションにより生じるシグナルを共通の同種シグナルに変換する方法も提供す
る。
も実用上の利点がある。本発明は、ハイブリダイゼーションに依存するが酵素触
媒作用には依存しないシグナルの発生および増幅の方法を提供する。本発明は１
つの標的ポリヌクレオチド配列が複数の空間的または化学的に異なるシグナルを
発生させるために、ハイブリダイゼーション反応から生じるシグナルの処理方法
を提供する。同様に、本発明は異なる標的ポリヌクレオチド配列のハイブリダイ
ゼーションにより生じるシグナルを共通の同種シグナルに変換する方法も提供す
る。
【００１５】 発明の詳細な説明 本発明は生物学的試料中の核酸を分析するための新しい方法に関する。本明細
書に記載した方法は検出の前に化学的シグナルの獲得または増幅を伴う高度に特
異的な、ハイブリダイゼーションに基づく核酸の同定システムを提供する。この
化学的シグナルは本明細書に記載したような数多くの方法により検出できる。本
明細書に開示した方法は、アッセイにおいて酵素が関与しない、核酸またはポリ
ヌクレオチド配列含有分子の間のハイブリダイゼーションの物理化学に基づいた
ものである。このことは全ての標的ポリヌクレオチド配列および置換されたポリ
ヌクレオチド配列が、それらが反応するプローブ複合体から１つより多いポリヌ
クレオチド配列を置換するようにプローブ複合体を設計することにより達成され
る。したがって、１置換サイクル当たり実質的にどのような（２、３、４倍等）
シグナルの獲得も可能な指数関数的シグナル増幅系を構築することができる。直
線的な増幅も本発明に包含される。置換サイクルを繰り返すことにより、発生す
るアッセイシグナルはアッセイサイクルの通過ごとに再生される。
書に記載した方法は検出の前に化学的シグナルの獲得または増幅を伴う高度に特
異的な、ハイブリダイゼーションに基づく核酸の同定システムを提供する。この
化学的シグナルは本明細書に記載したような数多くの方法により検出できる。本
明細書に開示した方法は、アッセイにおいて酵素が関与しない、核酸またはポリ
ヌクレオチド配列含有分子の間のハイブリダイゼーションの物理化学に基づいた
ものである。このことは全ての標的ポリヌクレオチド配列および置換されたポリ
ヌクレオチド配列が、それらが反応するプローブ複合体から１つより多いポリヌ
クレオチド配列を置換するようにプローブ複合体を設計することにより達成され
る。したがって、１置換サイクル当たり実質的にどのような（２、３、４倍等）
シグナルの獲得も可能な指数関数的シグナル増幅系を構築することができる。直
線的な増幅も本発明に包含される。置換サイクルを繰り返すことにより、発生す
るアッセイシグナルはアッセイサイクルの通過ごとに再生される。
【００１６】 本明細書において使用される「生物学的試料」とは核酸を含有するいかなる試
料も包含する。例えば、血液、尿、他の体液、細胞（植物および動物の両方）、
細胞抽出物、組織および組織抽出物が本発明の範囲に包含される。
料も包含する。例えば、血液、尿、他の体液、細胞（植物および動物の両方）、
細胞抽出物、組織および組織抽出物が本発明の範囲に包含される。
【００１７】 本発明の核酸はデオキシリボ核酸（以下、「ＤＮＡ」）、リボ核酸（以下、「
ＲＮＡ」）、修飾された核酸およびペプチド核酸（「ＰＮＡ」）やモルホリノ核
酸等の核酸アナログを含む。一本鎖および二本鎖の核酸の両方が本発明に含まれ
る。より高次元の構造の核酸、例えば、その線状鎖において折れ曲がって二次的
なループ構造を形成しているＲＮＡも本発明の範囲に包含される。本明細書にお
いて使用されるポリヌクレオチド配列とは約５〜約５０，０００ヌクレオチド長
のヌクレオチド配列を指す。関与する標的ポリヌクレオチド配列に絶対的な長さ
の条件は無いが、好ましい範囲は約５〜約１０００である。好ましくは、プロー
ブおよび置換性ポリヌクレオチド配列はヌクレオチド長が約５〜約１０００であ
る。最も好ましくは、プローブおよび置換性ヌクレオチド配列はヌクレオチド長
が約５〜約１００である。当業者は本発明のポリヌクレオチドのために用いるヌ
クレオチド配列の適切な長さを決定することができるだろう。また、本発明のポ
リヌクレオチド配列はより長い鎖の核酸内部に組み込まれていたり、または、他
の分子と会合していてもよいことを理解されたい。
ＲＮＡ」）、修飾された核酸およびペプチド核酸（「ＰＮＡ」）やモルホリノ核
酸等の核酸アナログを含む。一本鎖および二本鎖の核酸の両方が本発明に含まれ
る。より高次元の構造の核酸、例えば、その線状鎖において折れ曲がって二次的
なループ構造を形成しているＲＮＡも本発明の範囲に包含される。本明細書にお
いて使用されるポリヌクレオチド配列とは約５〜約５０，０００ヌクレオチド長
のヌクレオチド配列を指す。関与する標的ポリヌクレオチド配列に絶対的な長さ
の条件は無いが、好ましい範囲は約５〜約１０００である。好ましくは、プロー
ブおよび置換性ポリヌクレオチド配列はヌクレオチド長が約５〜約１０００であ
る。最も好ましくは、プローブおよび置換性ヌクレオチド配列はヌクレオチド長
が約５〜約１００である。当業者は本発明のポリヌクレオチドのために用いるヌ
クレオチド配列の適切な長さを決定することができるだろう。また、本発明のポ
リヌクレオチド配列はより長い鎖の核酸内部に組み込まれていたり、または、他
の分子と会合していてもよいことを理解されたい。
【００１８】 塩基対形成は通常は逆平行で起こると考えられるが、塩基対形成が平行に起こ
る場合もあり、この配置もまた本発明に包含される。塩基対形成自体は本質的に
プリンが水素結合を介してピリミジンと対になるという相補様式に従うと考えら
れる。より詳しくは、個々の塩基対の相補塩基対形成は一般的に、アデニンがチ
ミジン（またはウラシル）と対になり、グアニンがシトシンと対になるというシ
ャルガフ（Ｃｈａｒｇａｆｆ）の法則に従うと考えられる。しかしながら、通常
と異なる塩基対の形成を説明する修飾塩基が存在する。修飾核酸は本明細書では
化学的に修飾されたヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子を意味す
るものとする。「核酸アナログ」という用語は、本明細書では従来の核酸との塩
基対形成の相互作用に関与することのできる「ＰＮＡ」およびモルホリノ等の非
核酸分子を指すものとする。これらの修飾された塩基および核酸アナログも本発
明に包含されるものとみなす。例えば、ハイブリダイズされたプローブの熱安定
性を低下させるために、デアザグアイン（ｄｅａｚａｇｕａｉｎｅ）およびウラ
シル塩基を含むヌクレオチドをそれぞれグアニンおよびチミンの変わりに用いる
ことができる。同様に、高い熱安定性が望まれる場合は、５−メチルシトシンを
ハイブリッドにおけるシトシンに置き換えることができる。糖部分の修飾があっ
てもよく、本発明に包含される。例えば、ＲＮＡ分子のヌクレアーゼ感受性を低
減するために用いることのできる２’−Ｏ−メチル基の付加によるリボース糖部
分の修飾が挙げられる。核酸骨格の異なる部分で起こる修飾もまた本発明の範囲
に包含される。例えば、ホスホジエステル骨格から負電荷を除去するためのリン
酸メチル、ホスホン酸メチルまたはホスホロチオエート結合の用法が用いられう
る。
る場合もあり、この配置もまた本発明に包含される。塩基対形成自体は本質的に
プリンが水素結合を介してピリミジンと対になるという相補様式に従うと考えら
れる。より詳しくは、個々の塩基対の相補塩基対形成は一般的に、アデニンがチ
ミジン（またはウラシル）と対になり、グアニンがシトシンと対になるというシ
ャルガフ（Ｃｈａｒｇａｆｆ）の法則に従うと考えられる。しかしながら、通常
と異なる塩基対の形成を説明する修飾塩基が存在する。修飾核酸は本明細書では
化学的に修飾されたヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子を意味す
るものとする。「核酸アナログ」という用語は、本明細書では従来の核酸との塩
基対形成の相互作用に関与することのできる「ＰＮＡ」およびモルホリノ等の非
核酸分子を指すものとする。これらの修飾された塩基および核酸アナログも本発
明に包含されるものとみなす。例えば、ハイブリダイズされたプローブの熱安定
性を低下させるために、デアザグアイン（ｄｅａｚａｇｕａｉｎｅ）およびウラ
シル塩基を含むヌクレオチドをそれぞれグアニンおよびチミンの変わりに用いる
ことができる。同様に、高い熱安定性が望まれる場合は、５−メチルシトシンを
ハイブリッドにおけるシトシンに置き換えることができる。糖部分の修飾があっ
てもよく、本発明に包含される。例えば、ＲＮＡ分子のヌクレアーゼ感受性を低
減するために用いることのできる２’−Ｏ−メチル基の付加によるリボース糖部
分の修飾が挙げられる。核酸骨格の異なる部分で起こる修飾もまた本発明の範囲
に包含される。例えば、ホスホジエステル骨格から負電荷を除去するためのリン
酸メチル、ホスホン酸メチルまたはホスホロチオエート結合の用法が用いられう
る。
【００１９】 本明細書においてはハイブリダイゼーションとは少なくとも２個の相補的なポ
リヌクレオチド配列が存在する場合に、それらが塩基対形成を介して二本鎖構造
を形成するような適当な条件下で少なくとも２個のポリヌクレオチド配列を混合
することを意味するものとする。本発明ではミスマッチは許容される。ヌクレオ
チドのミスマッチはポリヌクレオチド配列間の親和性に影響する場合がある。ポ
リヌクレオチド配列間のミスマッチが大きいほど、一般的にそれらの間の親和性
は完全にマッチしたポリヌクレオチド配列と比較して低くなる。一般的に、ポリ
ヌクレオチド配列間のミスマッチが大きいほどそれらの間に存在する任意のハイ
ブリダイゼーションを崩壊することが容易となる。塩基対間にミスマッチが存在
する場合、それらは一般的に塩基対形成の領域の５％以下である。好ましくはハ
イブリダイゼーションパートナー間の相補性の程度は約１００％〜約９５％であ
る。ミスマッチを含むハイブリダイゼーション複合体の融点（Ｔｍ）を測定し、
そのＴｍをより短い長さの完全にマッチしたヌクレオチドとの複合体のＴｍと比
較すると、ミスマッチを有する複合体の有効な対形成の長さが求められ、これを
本発明に適用できる。
リヌクレオチド配列が存在する場合に、それらが塩基対形成を介して二本鎖構造
を形成するような適当な条件下で少なくとも２個のポリヌクレオチド配列を混合
することを意味するものとする。本発明ではミスマッチは許容される。ヌクレオ
チドのミスマッチはポリヌクレオチド配列間の親和性に影響する場合がある。ポ
リヌクレオチド配列間のミスマッチが大きいほど、一般的にそれらの間の親和性
は完全にマッチしたポリヌクレオチド配列と比較して低くなる。一般的に、ポリ
ヌクレオチド配列間のミスマッチが大きいほどそれらの間に存在する任意のハイ
ブリダイゼーションを崩壊することが容易となる。塩基対間にミスマッチが存在
する場合、それらは一般的に塩基対形成の領域の５％以下である。好ましくはハ
イブリダイゼーションパートナー間の相補性の程度は約１００％〜約９５％であ
る。ミスマッチを含むハイブリダイゼーション複合体の融点（Ｔｍ）を測定し、
そのＴｍをより短い長さの完全にマッチしたヌクレオチドとの複合体のＴｍと比
較すると、ミスマッチを有する複合体の有効な対形成の長さが求められ、これを
本発明に適用できる。
【００２０】 本明細書に記載する方法はハイブリダイゼーション複合体の形成およびポリヌ
クレオチド配列の置換を含む逐次的工程を有する。一般的にアッセイはポリヌク
レオチド配列同士、例えば第１および第２のポリヌクレオチド配列をハイブリダ
イズすることによる第１のプローブ複合体の形成を含む。次にこの複合体を、競
合的ポリヌクレオチド配列、例えば第３のポリヌクレオチド配列と接触させると
置換複合体が形成される。標的ポリヌクレオチド配列は競合的ポリヌクレオチド
配列の一例である。プローブ複合体のポリヌクレオチド配列構成の一部、例えば
、第１のポリヌクレオチド配列は、そのハイブリダイゼーションパートナー、例
えば第２のポリヌクレオチド配列と比較して第３のポリヌクレオチド配列に対し
てより高い親和性を有する。この親和性の差に基づき、第３のポリヌクレオチド
配列は第２のポリヌクレオチド配列を置換して第１のポリヌクレオチド配列と結
合する。置換されたポリヌクレオチド配列、例えば第２のポリヌクレオチド配列
は次に、後続の置換反応における競合的ポリヌクレオチド配列として使用するこ
とができる。一連のハイブリダイゼーション−置換事象の数により、何種類のそ
して何個のポリヌクレオチド配列が置換され、ハイブリダイゼーション複合体か
ら遊離するかが決定される。第２の置換反応からの置換されたポリヌクレオチド
は次に、後続の第３の置換反応における相補ポリヌクレオチド配列として用いる
ことができ、反復される。更に、これらの遊離のポリヌクレオチド配列は、本明
細書では置換されたポリヌクレオチド配列と称し、標的ポリヌクレオチド配列の
存在を示すシグナルを発生させるために使用することができる。これらの置換さ
れたポリヌクレオチドは検出されうる標識を自身に結合した状態で有することが
できる。標識はイオン結合、共有結合、または、吸着により結合させることがで
きる。好ましくは、標識は、ハイブリダイゼーションを妨害しない目的のポリヌ
クレオチド配列を有する核酸の何れかの領域に共有結合される。標識には放射性
リン原子等の放射性同位元素、ビオチン等の親和性試薬、インターカレーティン
グ蛍光染料、またはポリヌクレオチド、ペプチド、酵素、りん光染料またはキレ
ートに結合した蛍光部分、質量分析法による検出用の電子団（ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｈｏｒｅｓ）、強力な吸光度を示す化学発光部分の発色団などが包含されるが、
これらに限定されない。
クレオチド配列の置換を含む逐次的工程を有する。一般的にアッセイはポリヌク
レオチド配列同士、例えば第１および第２のポリヌクレオチド配列をハイブリダ
イズすることによる第１のプローブ複合体の形成を含む。次にこの複合体を、競
合的ポリヌクレオチド配列、例えば第３のポリヌクレオチド配列と接触させると
置換複合体が形成される。標的ポリヌクレオチド配列は競合的ポリヌクレオチド
配列の一例である。プローブ複合体のポリヌクレオチド配列構成の一部、例えば
、第１のポリヌクレオチド配列は、そのハイブリダイゼーションパートナー、例
えば第２のポリヌクレオチド配列と比較して第３のポリヌクレオチド配列に対し
てより高い親和性を有する。この親和性の差に基づき、第３のポリヌクレオチド
配列は第２のポリヌクレオチド配列を置換して第１のポリヌクレオチド配列と結
合する。置換されたポリヌクレオチド配列、例えば第２のポリヌクレオチド配列
は次に、後続の置換反応における競合的ポリヌクレオチド配列として使用するこ
とができる。一連のハイブリダイゼーション−置換事象の数により、何種類のそ
して何個のポリヌクレオチド配列が置換され、ハイブリダイゼーション複合体か
ら遊離するかが決定される。第２の置換反応からの置換されたポリヌクレオチド
は次に、後続の第３の置換反応における相補ポリヌクレオチド配列として用いる
ことができ、反復される。更に、これらの遊離のポリヌクレオチド配列は、本明
細書では置換されたポリヌクレオチド配列と称し、標的ポリヌクレオチド配列の
存在を示すシグナルを発生させるために使用することができる。これらの置換さ
れたポリヌクレオチドは検出されうる標識を自身に結合した状態で有することが
できる。標識はイオン結合、共有結合、または、吸着により結合させることがで
きる。好ましくは、標識は、ハイブリダイゼーションを妨害しない目的のポリヌ
クレオチド配列を有する核酸の何れかの領域に共有結合される。標識には放射性
リン原子等の放射性同位元素、ビオチン等の親和性試薬、インターカレーティン
グ蛍光染料、またはポリヌクレオチド、ペプチド、酵素、りん光染料またはキレ
ートに結合した蛍光部分、質量分析法による検出用の電子団（ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｈｏｒｅｓ）、強力な吸光度を示す化学発光部分の発色団などが包含されるが、
これらに限定されない。
【００２１】 フォトダイオードアレー（ＰＤＡ）検出器を用いることにより、いかなる標識
自体をも用いることなく分光分析を行うことができる。標的ポリヌクレオチド配
列の存在を示すために用いている１又は複数のポリヌクレオチド配列をその独特
のスペクトル画像によりモニターし、かつ検出することができる。本発明で使用
できるＰＤＡ検出器の一例は、ウォーターズ社製〔Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ （Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）〕のＰＤＡ検出器である。ＰＤＡまたは
質量スペクトル分析を用いる場合は、置換されたポリヌクレオチドそのものがシ
グナルとなる。従って、検出のためにポリヌクレオチドに標識を結合させる必要
がなくなる。
自体をも用いることなく分光分析を行うことができる。標的ポリヌクレオチド配
列の存在を示すために用いている１又は複数のポリヌクレオチド配列をその独特
のスペクトル画像によりモニターし、かつ検出することができる。本発明で使用
できるＰＤＡ検出器の一例は、ウォーターズ社製〔Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ （Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）〕のＰＤＡ検出器である。ＰＤＡまたは
質量スペクトル分析を用いる場合は、置換されたポリヌクレオチドそのものがシ
グナルとなる。従って、検出のためにポリヌクレオチドに標識を結合させる必要
がなくなる。
【００２２】 本発明においては、２種類のハイブリダイゼーション複合体、（ｉ）プローブ
複合体および（ｉｉ）置換複合体がある。プローブ複合体は、本明細書において
第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼー
ション反応の生成物を意味すると解される。「第１のポリヌクレオチド」という
用語は本明細書を通じて用いるが、実施例で示すとおり、「第１」とは、またア
ッセイ方法におけるポリヌクレオチド配列の順番をも示すものであり、かつ１を
超えるポリヌクレオチド配列をも意味しうることを表わすことも重要である。こ
のアッセイのために選択されるポリヌクレオチド配列は、他のポリヌクレオチド
配列へのハイブリダイズ能に基づいて選択される。関与する核酸への絶対的な長
さの必要条件は無いが、好ましい範囲は約５〜約１０００である。好ましくは、
ハイブリダイゼーションを行ってプローブ複合体を形成するポリヌクレオチド配
列間の結合領域は、約５〜約１０００ヌクレオチド長である。第１のプローブ複
合体においては、第１のポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチド配列との
９５〜１００％の相補制の程度を有するであろうし、一方、第２のポリヌクレオ
チド配列は、二者の間の化学的ハイブリダイゼーションが容易にするに十分な第
１のポリヌクレオチド配列との相補性９５〜１００％を有する。その他のプロー
ブ複合体は、相互に相補性を共有する（即ち９５％〜１００％）他のポリヌクレ
オチド配列をハイブリダイズすることにより形成されうる。一般的に、プローブ
複合体の少なくとも１つの構成ポリヌクレオチド配列は、予め置換された複合体
から発生した前に置換されたポリヌクレオチド配列に相補的な全配列または部分
配列であるか、または、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な全配列または部分
配列である。プローブ複合体の設計に用いるポリヌクレオチド配列は、一般的に
文献既知であるか過去の配列決定実験より既知となっている標的の配列により決
定される。プローブ複合体を形成するための条件は、使用した成分ポリヌクレオ
チドの種類に基づいて変化する。標準的なホスホジエステル骨格を有するポリヌ
クレオチドの場合は、２つのポリヌクレオチドを、好ましくは０．１Ｍ〜１．０
Ｍの１価の陽イオンを有し、任意に０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の２価の陽イオ
ンを含有する緩衝液（好ましくはｐＨ６〜９）中で混合する。好ましくは、第１
および第２のポリヌクレオチドの濃度は、少なくとも０．１μＭである。より低
い濃度が使用されうるが、ハイブリダイゼーションが遅くなるであろう。好まし
くは、第１のポリヌクレオチドの全てが確実に第２のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズするために、第２のポリヌクレオチドがより高い濃度で存在する。好ま
しくは、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドより２〜４倍過剰
量で存在する。混合物をプローブ複合体のＴｍより高い温度まで加熱し、次に、
ハイブリダイゼーション反応が完了するのに十分遅い速度でプローブ複合体のＴ
ｍより低い温度まで徐々に冷却する。例えば、酵素のような熱に不安定な修飾が
成されていない大部分のポリヌクレオチドの場合は、混合物を９０〜９５℃まで
加熱し、１〜２時間かけて徐々に室温（約２５℃）まで冷却することができる。
複合体および（ｉｉ）置換複合体がある。プローブ複合体は、本明細書において
第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼー
ション反応の生成物を意味すると解される。「第１のポリヌクレオチド」という
用語は本明細書を通じて用いるが、実施例で示すとおり、「第１」とは、またア
ッセイ方法におけるポリヌクレオチド配列の順番をも示すものであり、かつ１を
超えるポリヌクレオチド配列をも意味しうることを表わすことも重要である。こ
のアッセイのために選択されるポリヌクレオチド配列は、他のポリヌクレオチド
配列へのハイブリダイズ能に基づいて選択される。関与する核酸への絶対的な長
さの必要条件は無いが、好ましい範囲は約５〜約１０００である。好ましくは、
ハイブリダイゼーションを行ってプローブ複合体を形成するポリヌクレオチド配
列間の結合領域は、約５〜約１０００ヌクレオチド長である。第１のプローブ複
合体においては、第１のポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオチド配列との
９５〜１００％の相補制の程度を有するであろうし、一方、第２のポリヌクレオ
チド配列は、二者の間の化学的ハイブリダイゼーションが容易にするに十分な第
１のポリヌクレオチド配列との相補性９５〜１００％を有する。その他のプロー
ブ複合体は、相互に相補性を共有する（即ち９５％〜１００％）他のポリヌクレ
オチド配列をハイブリダイズすることにより形成されうる。一般的に、プローブ
複合体の少なくとも１つの構成ポリヌクレオチド配列は、予め置換された複合体
から発生した前に置換されたポリヌクレオチド配列に相補的な全配列または部分
配列であるか、または、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な全配列または部分
配列である。プローブ複合体の設計に用いるポリヌクレオチド配列は、一般的に
文献既知であるか過去の配列決定実験より既知となっている標的の配列により決
定される。プローブ複合体を形成するための条件は、使用した成分ポリヌクレオ
チドの種類に基づいて変化する。標準的なホスホジエステル骨格を有するポリヌ
クレオチドの場合は、２つのポリヌクレオチドを、好ましくは０．１Ｍ〜１．０
Ｍの１価の陽イオンを有し、任意に０．１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度の２価の陽イオ
ンを含有する緩衝液（好ましくはｐＨ６〜９）中で混合する。好ましくは、第１
および第２のポリヌクレオチドの濃度は、少なくとも０．１μＭである。より低
い濃度が使用されうるが、ハイブリダイゼーションが遅くなるであろう。好まし
くは、第１のポリヌクレオチドの全てが確実に第２のポリヌクレオチドにハイブ
リダイズするために、第２のポリヌクレオチドがより高い濃度で存在する。好ま
しくは、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドより２〜４倍過剰
量で存在する。混合物をプローブ複合体のＴｍより高い温度まで加熱し、次に、
ハイブリダイゼーション反応が完了するのに十分遅い速度でプローブ複合体のＴ
ｍより低い温度まで徐々に冷却する。例えば、酵素のような熱に不安定な修飾が
成されていない大部分のポリヌクレオチドの場合は、混合物を９０〜９５℃まで
加熱し、１〜２時間かけて徐々に室温（約２５℃）まで冷却することができる。
【００２３】 標的ポリヌクレオチド配列、または、時には本明細書においては「標的の第３
のポリヌクレオチド配列」と記載するものは、本明細書においては、特定の試験
の焦点である生物学的試験試料中に存在する標的ポリヌクレオチド配列を意味す
るものとする。本発明においては、試料は標的ポリヌクレオチド配列の異種の集
団または同種の集団を試料中に有することができる。
のポリヌクレオチド配列」と記載するものは、本明細書においては、特定の試験
の焦点である生物学的試験試料中に存在する標的ポリヌクレオチド配列を意味す
るものとする。本発明においては、試料は標的ポリヌクレオチド配列の異種の集
団または同種の集団を試料中に有することができる。
【００２４】 置換複合体は、本明細書においては、少なくとも１つのポリヌクレオチド配列
のハイブリダイゼーション複合体からの置換または除去が生じた後の反応生成物
を指すものと定義する。この複合体は、２つ以上のポリヌクレオチド配列のハイ
ブリダイゼーションにより形成される。関与する核酸に対して絶対的な長さの条
件は無いが、ＤＮＡ分子の好ましい範囲は約９〜約５０ヌクレオチド長である。
他の種類の核酸の場合は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に対する相対的なそれらの安定
性に応じて、大きさの範囲がより小さくなるか大きくなることができる。所望の
水準の安定性を達成するために必要な二本鎖領域の大きさは半実験的に求めるこ
とができる（後述）。好ましくは、置換複合体を形成するためにハイブリダイゼ
ーションを行なうポリヌクレオチド配列間の結合領域は、その長さが約５〜約１
０００ヌクレオチド長である。置換複合体は、前のプローブ複合体が競合的ポリ
ヌクレオチド配列と接触することの結果として形成される。この競合的ポリヌク
レオチド配列は、複合体に固有の少なくとも１つの構成ポリヌクレオチド配列を
競合的に排除する。競合的に排除されたポリヌクレオチド配列のパートナーポリ
ヌクレオチド配列は、競合的ポリヌクレオチド配列に対してより高い親和性を有
し、このため、複合体からの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の置換事象
が起こるのである。一般的に、競合的ポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオ
チド配列であるか、または、前の置換複合体の反応において置換された置換ポリ
ヌクレオチド配列の何れかである。しかしながら、第１のプローブ複合体は、常
に標的ポリヌクレオチド配列と接触し第１の置換複合体を形成し、つづくハイブ
リダイゼーションおよび置換は、他の置換ポリヌクレオチド配列が関与しうる。
置換反応は、プローブ複合体の自発的融解が起こらないように、プローブ複合体
のＴｍより実質的に低い温度で行う。この温度を測定する方法は当業者によく知
られる。
のハイブリダイゼーション複合体からの置換または除去が生じた後の反応生成物
を指すものと定義する。この複合体は、２つ以上のポリヌクレオチド配列のハイ
ブリダイゼーションにより形成される。関与する核酸に対して絶対的な長さの条
件は無いが、ＤＮＡ分子の好ましい範囲は約９〜約５０ヌクレオチド長である。
他の種類の核酸の場合は、ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖に対する相対的なそれらの安定
性に応じて、大きさの範囲がより小さくなるか大きくなることができる。所望の
水準の安定性を達成するために必要な二本鎖領域の大きさは半実験的に求めるこ
とができる（後述）。好ましくは、置換複合体を形成するためにハイブリダイゼ
ーションを行なうポリヌクレオチド配列間の結合領域は、その長さが約５〜約１
０００ヌクレオチド長である。置換複合体は、前のプローブ複合体が競合的ポリ
ヌクレオチド配列と接触することの結果として形成される。この競合的ポリヌク
レオチド配列は、複合体に固有の少なくとも１つの構成ポリヌクレオチド配列を
競合的に排除する。競合的に排除されたポリヌクレオチド配列のパートナーポリ
ヌクレオチド配列は、競合的ポリヌクレオチド配列に対してより高い親和性を有
し、このため、複合体からの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列の置換事象
が起こるのである。一般的に、競合的ポリヌクレオチド配列は標的ポリヌクレオ
チド配列であるか、または、前の置換複合体の反応において置換された置換ポリ
ヌクレオチド配列の何れかである。しかしながら、第１のプローブ複合体は、常
に標的ポリヌクレオチド配列と接触し第１の置換複合体を形成し、つづくハイブ
リダイゼーションおよび置換は、他の置換ポリヌクレオチド配列が関与しうる。
置換反応は、プローブ複合体の自発的融解が起こらないように、プローブ複合体
のＴｍより実質的に低い温度で行う。この温度を測定する方法は当業者によく知
られる。
【００２５】 一般的に、室温で標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、置換を起こしう
るプローブ複合体を設計するのが好ましい。一般的に、多くの一本鎖ＤＮＡおよ
びＲＮＡの標的が１価の陽イオン０．０１Ｍ〜１．０Ｍを有し、任意に２価の陽
イオン０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、任意に洗剤、界面活性剤またはカオトロープ（ｃ
ｈａｏｔｒｏｐｅ）などのヌクレアーゼ活性を阻害する添加剤を含む緩衝液（好
ましくはｐＨ６〜９）中室温でＤＮＡまたはＲＮＡからなるプローブ複合体と反
応することができる。
るプローブ複合体を設計するのが好ましい。一般的に、多くの一本鎖ＤＮＡおよ
びＲＮＡの標的が１価の陽イオン０．０１Ｍ〜１．０Ｍを有し、任意に２価の陽
イオン０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、任意に洗剤、界面活性剤またはカオトロープ（ｃ
ｈａｏｔｒｏｐｅ）などのヌクレアーゼ活性を阻害する添加剤を含む緩衝液（好
ましくはｐＨ６〜９）中室温でＤＮＡまたはＲＮＡからなるプローブ複合体と反
応することができる。
【００２６】 場合により、分子内塩基対形成を呈する標的は、プローブ複合体と生産的に反
応しないかもしれない。このような場合は、プローブ複合体との生産的なハイブ
リダイゼーションを妨げる分子内塩基対形成を解除するために室温より高温であ
るがプローブ複合体のＴｍより実質的に低温である温度で置換反応を行うことが
有効である。この事象の生成物は、新しいハイブリダイゼーション複合体である
のみならず、次に試験におけるシグナルとして機能することのできる、あるいは
、後の置換複合体中の別の構成ポリヌクレオチド配列を置換するために使用でき
る、置換されたポリヌクレオチド配列でもある。
応しないかもしれない。このような場合は、プローブ複合体との生産的なハイブ
リダイゼーションを妨げる分子内塩基対形成を解除するために室温より高温であ
るがプローブ複合体のＴｍより実質的に低温である温度で置換反応を行うことが
有効である。この事象の生成物は、新しいハイブリダイゼーション複合体である
のみならず、次に試験におけるシグナルとして機能することのできる、あるいは
、後の置換複合体中の別の構成ポリヌクレオチド配列を置換するために使用でき
る、置換されたポリヌクレオチド配列でもある。
【００２７】 置換反応を行うための適切な温度は、ハイブリダイゼーション複合体内に存在
するハイブリッドの熱安定性に依存する。置換されたポリヌクレオチド配列のい
かなる自発的解離も、後のハイブリダイゼーション置換事象におけるシグナルの
発生を開始させ、標的非依存性のシグナル（ノイズ）を生じさせる。このバック
グラウンドノイズは例えば、多重逐次的置換反応のカスケードを引き起こす標的
ポリヌクレオチド配列を用いることなく、標準的なアッセイを実施することによ
り最終的な分析において単に差し引くことができる。標準的なアッセイの実施中
、ベースラインを測定し、これを後に標的ポリヌクレオチド配列を用いた実際の
アッセイに関わるデータ分析の際に用いてデータを規格化することができる。
するハイブリッドの熱安定性に依存する。置換されたポリヌクレオチド配列のい
かなる自発的解離も、後のハイブリダイゼーション置換事象におけるシグナルの
発生を開始させ、標的非依存性のシグナル（ノイズ）を生じさせる。このバック
グラウンドノイズは例えば、多重逐次的置換反応のカスケードを引き起こす標的
ポリヌクレオチド配列を用いることなく、標準的なアッセイを実施することによ
り最終的な分析において単に差し引くことができる。標準的なアッセイの実施中
、ベースラインを測定し、これを後に標的ポリヌクレオチド配列を用いた実際の
アッセイに関わるデータ分析の際に用いてデータを規格化することができる。
【００２８】 本発明のポリヌクレオチド配列は２つの考え方に基づいて設計される。それら
の第１番目は標的ポリヌクレオチド配列であり、第２には多重逐次的置換反応を
促進するであろうカスケードの成分を含有するであろうポリヌクレオチド配列で
ある。
の第１番目は標的ポリヌクレオチド配列であり、第２には多重逐次的置換反応を
促進するであろうカスケードの成分を含有するであろうポリヌクレオチド配列で
ある。
【００２９】 標的ポリヌクレオチド配列は、設計されたポリヌクレオチド配列（本明細書で
は第１のポリヌクレオチド配列と称する）が結合するであろう領域を有する。こ
の領域は本明細書では「標的結合領域」または「ＴＢＲ」と称する（Figure １ 参照）。好ましくは、このＴＢＲは長さが約５〜約１０００ヌクレオチドであり
、より好ましくは１５〜約２００である。一般的に、この領域を含有するヌクレ
オチド配列は、アッセイ開始前に既知である。ＴＢＲ配列のこのような理解に基
づき、第１のポリヌクレオチド配列を例えば核酸合成装置を用いて設計し、製造
することができる。ＴＢＲに結合する第１のポリヌクレオチド配列の領域は本明
細書では「相補標的結合領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔａｒｇｅｔ ｂ
ｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」を表すＣＴＢＲと称する（Figure １参照）。 ＣＴＢＲはＴＢＲに相補的なヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ＣＴＢＲと
ＴＢＲとの間の相補制の度合いは、相いに約９５〜約１００％相補的である。第
１のポリヌクレオチド配列は、ＣＴＢＲの外部にシスヌクレオチド配列を含むこ
とができ、ここでＣＴＢＲは第１のポリヌクレオチドの他のヌクレオチド配列内
部に包埋されるか、または、第１のポリヌクレオチドの５’末端または３’末端
の何れかに位置する。
は第１のポリヌクレオチド配列と称する）が結合するであろう領域を有する。こ
の領域は本明細書では「標的結合領域」または「ＴＢＲ」と称する（Figure １ 参照）。好ましくは、このＴＢＲは長さが約５〜約１０００ヌクレオチドであり
、より好ましくは１５〜約２００である。一般的に、この領域を含有するヌクレ
オチド配列は、アッセイ開始前に既知である。ＴＢＲ配列のこのような理解に基
づき、第１のポリヌクレオチド配列を例えば核酸合成装置を用いて設計し、製造
することができる。ＴＢＲに結合する第１のポリヌクレオチド配列の領域は本明
細書では「相補標的結合領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔａｒｇｅｔ ｂ
ｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」を表すＣＴＢＲと称する（Figure １参照）。 ＣＴＢＲはＴＢＲに相補的なヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ＣＴＢＲと
ＴＢＲとの間の相補制の度合いは、相いに約９５〜約１００％相補的である。第
１のポリヌクレオチド配列は、ＣＴＢＲの外部にシスヌクレオチド配列を含むこ
とができ、ここでＣＴＢＲは第１のポリヌクレオチドの他のヌクレオチド配列内
部に包埋されるか、または、第１のポリヌクレオチドの５’末端または３’末端
の何れかに位置する。
【００３０】 本発明で使用する第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つの領域に含
まれる。第１の領域は、部分的ＴＢＲであり、即ち、標的ポリヌクレオチドのＴ
ＢＲ（ＰＴＢＲ）と部分的実質的な同一性を共有する（Figure １参照）。好ま しくは、この部分的実質的同一性は、ＴＢＲに関して相互に約９５％〜約１００
％の実質的な同一性である。第２の領域は、次のプローブ複合体において別のポ
リヌクレオチド配列と相互作用を示してハイブリダイズするヌクレオチド配列領
域である。しかしながら、この第２の領域は、第１のポリヌクレオチドとの相補
性を欠いており、この第２の領域と第１のポリヌクレオチドとの間のいかなる相
互作用も排除している。この第２の領域は、本明細書では「カスケード結合領域
」略して「ＣＢＲ」と称する（Figure １参照）。
まれる。第１の領域は、部分的ＴＢＲであり、即ち、標的ポリヌクレオチドのＴ
ＢＲ（ＰＴＢＲ）と部分的実質的な同一性を共有する（Figure １参照）。好ま しくは、この部分的実質的同一性は、ＴＢＲに関して相互に約９５％〜約１００
％の実質的な同一性である。第２の領域は、次のプローブ複合体において別のポ
リヌクレオチド配列と相互作用を示してハイブリダイズするヌクレオチド配列領
域である。しかしながら、この第２の領域は、第１のポリヌクレオチドとの相補
性を欠いており、この第２の領域と第１のポリヌクレオチドとの間のいかなる相
互作用も排除している。この第２の領域は、本明細書では「カスケード結合領域
」略して「ＣＢＲ」と称する（Figure １参照）。
【００３１】 第１のポリヌクレオチドのＣＢＲ配列と次のプローブ複合体の相補領域との間
の会合（ｃＣＢＲ、Figure １ｃ）は、第４のポリヌクレオチドとのその複合体 からの第５のポリヌクレオチドの置換を引き起こす（Figure ２参照）。従って 、置換可能なポリヌクレオチド中のＣＢＲ配列の存在は、多数のプローブ複合体
の関与する逐次的置換反応のカスケードの増殖を可能にする。一般的に、置換可
能なポリヌクレオチドの各々は少なくとも１つのＣＢＲを有する。シグナルの獲
得が各置換反応ごとに生じる場合、置換可能なポリヌクレオチドの各々は、各Ｃ
ＢＲはそれが接触する次のプローブ複合体中の別の置換可能なポリヌクレオチド
の置換を起こす多数のＣＢＲを有するであろう。シグナルの獲得が望まれるよう
な好ましい態様においては、多数のＣＢＲが同一の配列反復である場合が最も好
都合である。これにより全ての置換されたポリヌクレオチドがつづく置換反応に
おいて単一の種類のプローブ複合体と生産的に反応することが可能となる。
の会合（ｃＣＢＲ、Figure １ｃ）は、第４のポリヌクレオチドとのその複合体 からの第５のポリヌクレオチドの置換を引き起こす（Figure ２参照）。従って 、置換可能なポリヌクレオチド中のＣＢＲ配列の存在は、多数のプローブ複合体
の関与する逐次的置換反応のカスケードの増殖を可能にする。一般的に、置換可
能なポリヌクレオチドの各々は少なくとも１つのＣＢＲを有する。シグナルの獲
得が各置換反応ごとに生じる場合、置換可能なポリヌクレオチドの各々は、各Ｃ
ＢＲはそれが接触する次のプローブ複合体中の別の置換可能なポリヌクレオチド
の置換を起こす多数のＣＢＲを有するであろう。シグナルの獲得が望まれるよう
な好ましい態様においては、多数のＣＢＲが同一の配列反復である場合が最も好
都合である。これにより全ての置換されたポリヌクレオチドがつづく置換反応に
おいて単一の種類のプローブ複合体と生産的に反応することが可能となる。
【００３２】 本発明のポリヌクレオチド配列は、相補的ＣＢＲの設計を介して多重逐次的置
換カスケードを構築するために、部分的または完全なハイブリダイゼーションパ
ターンを設計することに基づいて構築される。単なる例示であるが、部分ハイブ
リダイゼーションのポリヌクレオチドパートナーは、全ハイブリダイゼーション
複合体のポリヌクレオチドパートナーよりも低い相補性のＣＢＲを共有する。一
般的に、置換複合体から置換されたポリヌクレオチド配列は、つづく置換複合体
における構成ポリヌクレオチド配列に対する相補的ＣＢＲを有する。更に、複合
体の少なくとも１つのパートナーは、設計によりその間のＣＢＲの相補性がより
高度であることに基づいて置換されたポリヌクレオチド配列に対しより高い親和
性を有し、このため、より相補性の低いポリヌクレオチド配列の置換がもたらさ
れる。置換サイクルは、前に置換されたポリヌクレオチド配列との相互作用に付
される置換複合体が無くなるまで継続する（Figure １参照）。
換カスケードを構築するために、部分的または完全なハイブリダイゼーションパ
ターンを設計することに基づいて構築される。単なる例示であるが、部分ハイブ
リダイゼーションのポリヌクレオチドパートナーは、全ハイブリダイゼーション
複合体のポリヌクレオチドパートナーよりも低い相補性のＣＢＲを共有する。一
般的に、置換複合体から置換されたポリヌクレオチド配列は、つづく置換複合体
における構成ポリヌクレオチド配列に対する相補的ＣＢＲを有する。更に、複合
体の少なくとも１つのパートナーは、設計によりその間のＣＢＲの相補性がより
高度であることに基づいて置換されたポリヌクレオチド配列に対しより高い親和
性を有し、このため、より相補性の低いポリヌクレオチド配列の置換がもたらさ
れる。置換サイクルは、前に置換されたポリヌクレオチド配列との相互作用に付
される置換複合体が無くなるまで継続する（Figure １参照）。
【００３３】 好ましい態様において、プローブ複合体は、周囲温度、約２５℃において操作
を実施できるのに十分な二本鎖安定性を有する。
を実施できるのに十分な二本鎖安定性を有する。
【００３４】 ハイブリダイゼーション複合体の熱安定性の決定方法は、文献により既知であ
る。Ｗｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−
２５９（１９９１）；Ｑｕａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｗｅｔｍｕｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，２８：１０４０−１０４７（１９８９）。これらの方法を置換複合
体の安定性の推定への応用には以下の反応：
る。Ｗｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−
２５９（１９９１）；Ｑｕａｒｔｉｎ ａｎｄ Ｗｅｔｍｕｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，２８：１０４０−１０４７（１９８９）。これらの方法を置換複合
体の安定性の推定への応用には以下の反応：
【００３５】
【数１】
【００３６】 （式中ＤおよびＤ’は相補ポリヌクレオチド配列であり、Ｂは置換複合体生成物
であり、ｋ2 およびｋr はそれぞれ置換複合体の形成および解離の速度定数であ
る） が関与する。このスキームにおいて、置換複合体の自発的解離の理由に対して逆
反応が最も関連性を有し、解離速度定数ｋr は自発的バックグラウンドを低減す
るには最小限にとどまるべき重要な変数である。ある特定の置換複合体において
、自発的解離は、アッセイ温度を低下させることにより低減することができる；
これにより解離定数が減少するであろう。
であり、ｋ2 およびｋr はそれぞれ置換複合体の形成および解離の速度定数であ
る） が関与する。このスキームにおいて、置換複合体の自発的解離の理由に対して逆
反応が最も関連性を有し、解離速度定数ｋr は自発的バックグラウンドを低減す
るには最小限にとどまるべき重要な変数である。ある特定の置換複合体において
、自発的解離は、アッセイ温度を低下させることにより低減することができる；
これにより解離定数が減少するであろう。
【００３７】 ある実験温度について解離定数の測定が行われた後、以下の通りアレニウスの
式（２）を再整理して他の温度に関するｋr を計算することができる。
式（２）を再整理して他の温度に関するｋr を計算することができる。
【００３８】
【数２】
【００３９】
【数３】
【００４０】 （式中ｋr1およびｋr2は温度Ｔ1 およびＴ2 における置換複合体解離速度定数で
あり、Ｅａは解離のための活性化エネルギーであり、そしてＲは気体定数である
）。Ｅａの語は、置換複合体を形成するために用いたポリヌクレオチド配列の塩
基配列から計算することができる。Ｗｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）。この計算にアレニウスの式
を用いることはＴｉｎｏｃｃｏ等、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ （ｐｕｂ．）
， Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ， ｐｐ．２９０−２９４（１９
７８）により述べられている。
あり、Ｅａは解離のための活性化エネルギーであり、そしてＲは気体定数である
）。Ｅａの語は、置換複合体を形成するために用いたポリヌクレオチド配列の塩
基配列から計算することができる。Ｗｅｔｍｕｒ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）。この計算にアレニウスの式
を用いることはＴｉｎｏｃｃｏ等、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ （ｐｕｂ．）
， Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，ＮＪ， ｐｐ．２９０−２９４（１９
７８）により述べられている。
【００４１】 ハイブリダイゼーション置換反応が固体支持体マトリックス、例えば電気泳動
マトリックスの空間的に分離された領域において起こる場合は、有効な解離定数
は温度勾配法を用いて推定することができる。これは実施例２を参照のこと。電
気泳動ゲル内部の固定化された置換複合体の融解挙動はゲルを横切りながら上昇
する温度勾配を用いて測定することができる。電気泳動の時間ｔａ中、複合体の
５０％が解離しているような温度Ｔｄを用いて解離定数を推定することができる
。
マトリックスの空間的に分離された領域において起こる場合は、有効な解離定数
は温度勾配法を用いて推定することができる。これは実施例２を参照のこと。電
気泳動ゲル内部の固定化された置換複合体の融解挙動はゲルを横切りながら上昇
する温度勾配を用いて測定することができる。電気泳動の時間ｔａ中、複合体の
５０％が解離しているような温度Ｔｄを用いて解離定数を推定することができる
。
【００４２】 解離を速度定数ｋr の一次反応とした場合、これはＴｄ：
【００４３】
【数４】
【００４４】
【数５】
【００４５】 において以下に従う。
【００４６】 即ち、温度勾配ゲルを用いることによりｋr 、Ｔｄおよびｔａの有効値の測定
が可能になる。Ｔｄにおいてｋr が評価された後、式（３）を用いて置換アッセ
イに適するであろう他のより低い温度におけるｋr を計算することができる。こ
れらの計算されたｋr 値は、ついで一次速度規則により用いることにより、所定
のアッセイ温度ｔａおよび電気泳動時間ｔａ：
が可能になる。Ｔｄにおいてｋr が評価された後、式（３）を用いて置換アッセ
イに適するであろう他のより低い温度におけるｋr を計算することができる。こ
れらの計算されたｋr 値は、ついで一次速度規則により用いることにより、所定
のアッセイ温度ｔａおよび電気泳動時間ｔａ：
【００４７】
【数６】
【００４８】 （式中Ｂは時間ｔａにおいて残存している置換複合体の濃度であり、Ｂｏは複合
体の初期濃度である） において残存する置換複合体の画分を計算することができる。式（６）は、いか
なる量でもＢ／Ｂｏを増大させる（置換複合体解離を減少させる）ために必要な
ｋr の変化を推定するために用いることができる。ｋr の所望の値が得られた後
、式（３）を用いてｋr 値を得るために必要な温度の変化を計算することができ
る。
体の初期濃度である） において残存する置換複合体の画分を計算することができる。式（６）は、いか
なる量でもＢ／Ｂｏを増大させる（置換複合体解離を減少させる）ために必要な
ｋr の変化を推定するために用いることができる。ｋr の所望の値が得られた後
、式（３）を用いてｋr 値を得るために必要な温度の変化を計算することができ
る。
【００４９】 置換されたポリヌクレオチドは、それらが置換層を通りぬけるまで未ハイブリ
ダイズ状態の一本鎖固定化ポリヌクレオチド配列に再ハイブリダイズすることが
できるので、勾配ゲル法は、実際の置換複合体のＴｄおよびｋr の推定値を与え
るのみである。一般的に、実験的に得られた数値は、不可逆の微視的な置換複合
体の解離反応に関して、実際のＴｄ値は過大評価し、実際のｋr を過小評価する
傾向がある。それでもなお、式（１）〜（６）において与えられる定量的関係は
置換複合体の安定性の推定および多重置換プロトコールの設計のための根拠のあ
る現実的な枠組みを与えるものである。
ダイズ状態の一本鎖固定化ポリヌクレオチド配列に再ハイブリダイズすることが
できるので、勾配ゲル法は、実際の置換複合体のＴｄおよびｋr の推定値を与え
るのみである。一般的に、実験的に得られた数値は、不可逆の微視的な置換複合
体の解離反応に関して、実際のＴｄ値は過大評価し、実際のｋr を過小評価する
傾向がある。それでもなお、式（１）〜（６）において与えられる定量的関係は
置換複合体の安定性の推定および多重置換プロトコールの設計のための根拠のあ
る現実的な枠組みを与えるものである。
【００５０】 本方法での置換されたポリヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーション複合
体から分離することができる。例えば、置換されたポリヌクレオチド配列は、置
換されたポリヌクレオチド配列と複合体との間の大きさの相違に基づいて分離す
ることができる。一般的に、本明細書の方法で生じた置換されたポリヌクレオチ
ドは、置換複合体から遊離したポリヌクレオチド配列からなる。サイズの分離は
、サイズ排除クロマトグラフィー；濾過；遠心分離；サイズ感受性膜を用いたサ
イズ分配：ポリアクリルアミドゲル：スターチゲル：アガロースゲル等の固体支
持体を介した移動により行うことができる。当業者は、本発明において用いられ
うるサイズ分離法を行なうための種々の技術に精通するであろう。複合体からの
シグナルの分離は、シグナルを溶液中に遊離状態としたままの複合体の固定化に
基づいてもよい。置換されたポリヌクレオチド配列を溶液中に遊離させたままハ
イブリダイゼーション複合体を表面に固定化する場合、例えばピペットを用いる
等の機械的移送または種々の方法によるシグナルの移動により、複合体からシグ
ナルを分離することが可能である。これらの方法の一部は、ゲルなどのマトリッ
クスを介した移動を含み、その例としては電気泳動、電気的に誘導された内部浸
透圧流動、湿潤化、毛管作用および送液流動などがあるがこれらに限定されない
。
体から分離することができる。例えば、置換されたポリヌクレオチド配列は、置
換されたポリヌクレオチド配列と複合体との間の大きさの相違に基づいて分離す
ることができる。一般的に、本明細書の方法で生じた置換されたポリヌクレオチ
ドは、置換複合体から遊離したポリヌクレオチド配列からなる。サイズの分離は
、サイズ排除クロマトグラフィー；濾過；遠心分離；サイズ感受性膜を用いたサ
イズ分配：ポリアクリルアミドゲル：スターチゲル：アガロースゲル等の固体支
持体を介した移動により行うことができる。当業者は、本発明において用いられ
うるサイズ分離法を行なうための種々の技術に精通するであろう。複合体からの
シグナルの分離は、シグナルを溶液中に遊離状態としたままの複合体の固定化に
基づいてもよい。置換されたポリヌクレオチド配列を溶液中に遊離させたままハ
イブリダイゼーション複合体を表面に固定化する場合、例えばピペットを用いる
等の機械的移送または種々の方法によるシグナルの移動により、複合体からシグ
ナルを分離することが可能である。これらの方法の一部は、ゲルなどのマトリッ
クスを介した移動を含み、その例としては電気泳動、電気的に誘導された内部浸
透圧流動、湿潤化、毛管作用および送液流動などがあるがこれらに限定されない
。
【００５１】 例えば置換複合体反応の間に置換されたポリヌクレオチド配列から発生した検
出されたシグナルは、いかなる現実的な手段により測定、記録、プロットおよび
処理することができる。検出されたシグナルの品質およびその後の分析で使用で
きる可能性は、いかなる現実的な手段により改善してもよい。検出されたシグナ
ルは、アッセイ開始前より、また、アッセイ中の何れの時点からも、モニターし
、測定してよい。シグナルの検出方法としては、限定されないが、例えば、質量
または密度の測定、質量分析、プラスモン共鳴、光学的な発光または吸光、蛍光
、リン光、発光、化学発光、分極、屈折率の変化、電気伝導度、放射能、粘度、
濁度、旋光度などが挙げられる。シグナルの例としては、限定されないが、ポリ
ヌクレオチド配列に付着された放射性同位体、ポリヌクレオチド配列に付着され
たビオチンなどの親和性試薬、または、ポリヌクレオチド配列もしくはハイブリ
ダイゼーション複合体と相互作用するインターカレートティング蛍光色素が挙げ
られる。当業者は、本発明に用いられるこれらの種々の技術に精通するであろう
。
出されたシグナルは、いかなる現実的な手段により測定、記録、プロットおよび
処理することができる。検出されたシグナルの品質およびその後の分析で使用で
きる可能性は、いかなる現実的な手段により改善してもよい。検出されたシグナ
ルは、アッセイ開始前より、また、アッセイ中の何れの時点からも、モニターし
、測定してよい。シグナルの検出方法としては、限定されないが、例えば、質量
または密度の測定、質量分析、プラスモン共鳴、光学的な発光または吸光、蛍光
、リン光、発光、化学発光、分極、屈折率の変化、電気伝導度、放射能、粘度、
濁度、旋光度などが挙げられる。シグナルの例としては、限定されないが、ポリ
ヌクレオチド配列に付着された放射性同位体、ポリヌクレオチド配列に付着され
たビオチンなどの親和性試薬、または、ポリヌクレオチド配列もしくはハイブリ
ダイゼーション複合体と相互作用するインターカレートティング蛍光色素が挙げ
られる。当業者は、本発明に用いられるこれらの種々の技術に精通するであろう
。
【００５２】 本発明の基本的な態様は、生物学的試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検出
方法に関する。この方法は、逐次的な一連のプローブおよび置換複合体の形成を
含んでいる。
方法に関する。この方法は、逐次的な一連のプローブおよび置換複合体の形成を
含んでいる。
【００５３】 第１のプローブ複合体は、第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオ
チド配列とを、第１および第２のポリヌクレオチド配列の間の化学的ハイブリダ
イゼーションを促進するであろう適当な条件下に接触させることにより形成され
る。好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列は、９５〜１００％の第２のポリ
ヌクレオチド配列と比較して標的ポリヌクレオチド配列に対し、より高度な相補
性、従ってより高い親和性を有する。
チド配列とを、第１および第２のポリヌクレオチド配列の間の化学的ハイブリダ
イゼーションを促進するであろう適当な条件下に接触させることにより形成され
る。好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列は、９５〜１００％の第２のポリ
ヌクレオチド配列と比較して標的ポリヌクレオチド配列に対し、より高度な相補
性、従ってより高い親和性を有する。
【００５４】 第１の置換複合体は、標的の第３のポリヌクレオチド配列による置換およびそ
のハイブリダイゼーションを促進するのに適当な条件下に、第１のプローブ複合
体と標的ポリヌクレオチド配列（本明細書では標的第３ポリヌクレオチド配列と
称する）とを接触させることにより形成される。好ましくは、複合体の第１のポ
リヌクレオチド配列はその第２のポリヌクレオチド配列複合体パートナーよりも
、標的の第３のポリヌクレオチド配列に対してより高い親和性を有する。この親
和性の相違に基づき、標的ポリヌクレオチド配列は第１のプローブ複合体から少
なくとも１つの第２のポリヌクレオチド配列を競合的に排除する。塩基対形成を
介してハイブリダイズされた第１と標的のポリヌクレオチド配列とを有する新し
い複合体が形成され、一方、第２のポリヌクレオチド配列が置換される。
のハイブリダイゼーションを促進するのに適当な条件下に、第１のプローブ複合
体と標的ポリヌクレオチド配列（本明細書では標的第３ポリヌクレオチド配列と
称する）とを接触させることにより形成される。好ましくは、複合体の第１のポ
リヌクレオチド配列はその第２のポリヌクレオチド配列複合体パートナーよりも
、標的の第３のポリヌクレオチド配列に対してより高い親和性を有する。この親
和性の相違に基づき、標的ポリヌクレオチド配列は第１のプローブ複合体から少
なくとも１つの第２のポリヌクレオチド配列を競合的に排除する。塩基対形成を
介してハイブリダイズされた第１と標的のポリヌクレオチド配列とを有する新し
い複合体が形成され、一方、第２のポリヌクレオチド配列が置換される。
【００５５】 このプローブおよび置換複合体のサイクルに引き続き、第２のサイクルのプロ
ーブおよび置換複合体の形成が行われる。第２のプローブ複合体はハイブリダイ
ゼーションに適する条件下で第４と第５のポリヌクレオチド配列を接触させるこ
とにより形成する。好ましくは、第４のポリヌクレオチド配列は第５のポリヌク
レオチド配列複合体のパートナーよりも置換された第２のポリヌクレオチド配列
に対しより高い親和性を有する。第２の置換複合体は第１の置換反応の生成物で
ある置換された第２のポリヌクレオチド配列に第２のプローブ複合体を接触させ
ることにより形成する。第４のポリヌクレオチド配列がその第５のポリヌクレオ
チド配列パ−トナーよりも置換された第２のポリヌクレオチド配列に対してより
大きい親和性を有すると仮定すれば、少なくとも１つの第５のポリヌクレオチド
配列は置換された第２のポリヌクレオチド配列により第２のプローブ複合体から
競合的に排除される。この置換事象の結果、新しい複合体が第４と第２のポリヌ
クレオチド配列の間に形成され、第５のポリヌクレオチド配列は遊離したままと
なる。この第５のポリヌクレオチド配列はこの時点で検出対象となるシグナルを
発生することができる。例えば、この第５のポリヌクレオチド配列は検出可能な
放射性リン原子で標識した核酸内に包埋することができる。あるいは、これより
大きいサイクルを想定する場合は、この第５のポリヌクレオチド配列が次の置換
複合体における置換ポリヌクレオチド配列として機能することができる。サイク
ルを継続することにより、シグナルの増幅が実施される。更にまた、複数のポリ
ヌクレオチド配列を使用する場合、例えば複合体形成において使用する２つ以上
の第５のポリヌクレオチド配列を使用する場合、この増加はアッセイシグナルを
増幅するアッセイ全体を通じて継続する。
ーブおよび置換複合体の形成が行われる。第２のプローブ複合体はハイブリダイ
ゼーションに適する条件下で第４と第５のポリヌクレオチド配列を接触させるこ
とにより形成する。好ましくは、第４のポリヌクレオチド配列は第５のポリヌク
レオチド配列複合体のパートナーよりも置換された第２のポリヌクレオチド配列
に対しより高い親和性を有する。第２の置換複合体は第１の置換反応の生成物で
ある置換された第２のポリヌクレオチド配列に第２のプローブ複合体を接触させ
ることにより形成する。第４のポリヌクレオチド配列がその第５のポリヌクレオ
チド配列パ−トナーよりも置換された第２のポリヌクレオチド配列に対してより
大きい親和性を有すると仮定すれば、少なくとも１つの第５のポリヌクレオチド
配列は置換された第２のポリヌクレオチド配列により第２のプローブ複合体から
競合的に排除される。この置換事象の結果、新しい複合体が第４と第２のポリヌ
クレオチド配列の間に形成され、第５のポリヌクレオチド配列は遊離したままと
なる。この第５のポリヌクレオチド配列はこの時点で検出対象となるシグナルを
発生することができる。例えば、この第５のポリヌクレオチド配列は検出可能な
放射性リン原子で標識した核酸内に包埋することができる。あるいは、これより
大きいサイクルを想定する場合は、この第５のポリヌクレオチド配列が次の置換
複合体における置換ポリヌクレオチド配列として機能することができる。サイク
ルを継続することにより、シグナルの増幅が実施される。更にまた、複数のポリ
ヌクレオチド配列を使用する場合、例えば複合体形成において使用する２つ以上
の第５のポリヌクレオチド配列を使用する場合、この増加はアッセイシグナルを
増幅するアッセイ全体を通じて継続する。
【００５６】 更にプローブ複合体および置換複合体形成のサイクルも、発生したシグナルを
増幅するための本態様において想定される。プローブ複合体は前記プローブ複合
体の形成に関して記載したハイブリダイゼーションに適する条件下で連続するポ
リヌクレオチド配列により形成される。好ましくは、複合体の少なくとも１つの
メンバーはその現ハイブリダイゼーションパートナーよりも、前のサイクルの置
換の際に発生した置換されたヌクレオチドに対してより高い親和性を有する。置
換されたポリヌクレオチド配列に対して高い親和性を有する複合体のメンバーは
、本明細書では同族のポリヌクレオチド配列と称する。同族のポリヌクレオチド
配列は好ましくは第２のポリヌクレオチド配列に対して約９５〜約１００％の相
補性を有し、当該分野でよく知られた中程度ないしは高度に厳密な条件下、第２
のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするような配列である。このプローブ
複合体の形成に引き続き、一回の置換複合体形成が起こる。この回では、生成し
た直後のプローブ複合体を、以前のサイクルで、好ましくは直前のサイクルで発
生した置換されたポリヌクレオチド配列と接触させる。好ましくは、複合体の少
なくとも１つのメンバーは、複合体内のいずれかの構成ポリヌクレオチド配列よ
りも置換されたポリヌクレオチド配列に対し、より高い親和性を有する。親和性
の相違に基づき、置換されたポリヌクレオチド配列はプローブ複合体においてハ
イブリダイズされた少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を置換し、その同族
ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズして新しい複合体を形成する。新しく置
換されたポリヌクレオチド配列は次に現アッセイにおいて検出することのできる
シグナル（例えば検出可能に標識されたポリヌクレオチド）を発生する（Ｆｉｇ
ｕｒｅ ２参照）。
増幅するための本態様において想定される。プローブ複合体は前記プローブ複合
体の形成に関して記載したハイブリダイゼーションに適する条件下で連続するポ
リヌクレオチド配列により形成される。好ましくは、複合体の少なくとも１つの
メンバーはその現ハイブリダイゼーションパートナーよりも、前のサイクルの置
換の際に発生した置換されたヌクレオチドに対してより高い親和性を有する。置
換されたポリヌクレオチド配列に対して高い親和性を有する複合体のメンバーは
、本明細書では同族のポリヌクレオチド配列と称する。同族のポリヌクレオチド
配列は好ましくは第２のポリヌクレオチド配列に対して約９５〜約１００％の相
補性を有し、当該分野でよく知られた中程度ないしは高度に厳密な条件下、第２
のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするような配列である。このプローブ
複合体の形成に引き続き、一回の置換複合体形成が起こる。この回では、生成し
た直後のプローブ複合体を、以前のサイクルで、好ましくは直前のサイクルで発
生した置換されたポリヌクレオチド配列と接触させる。好ましくは、複合体の少
なくとも１つのメンバーは、複合体内のいずれかの構成ポリヌクレオチド配列よ
りも置換されたポリヌクレオチド配列に対し、より高い親和性を有する。親和性
の相違に基づき、置換されたポリヌクレオチド配列はプローブ複合体においてハ
イブリダイズされた少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を置換し、その同族
ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズして新しい複合体を形成する。新しく置
換されたポリヌクレオチド配列は次に現アッセイにおいて検出することのできる
シグナル（例えば検出可能に標識されたポリヌクレオチド）を発生する（Ｆｉｇ
ｕｒｅ ２参照）。
【００５７】 この態様はまたアッセイシグナルの増幅のためのポリヌクレオチド配列の複数
の反復単位の使用に関する。態様のこの特徴において、第２および第４のポリヌ
クレオチド配列は単位当たり同じ配列の複数の反復単位を含んでおり、これにお
いて、これらの反復単位は第２および第４のポリヌクレオチド配列の間と同様に
相補性を有する。第２および第４のポリヌクレオチド配列の間の関係は、それら
がそれらの対応する反復単位に関して塩基対形成可能であることである。第５の
ポリヌクレオチド配列、または、少なくともその一部分は第２のポリヌクレオチ
ド配列の少なくとも１つの反復単位と実質的に同一（約９５〜約１００％）であ
る。第１のプローブ複合体からアッセイ反応サイクルが進行するに従い、アッセ
イ標的ポリヌクレオチド配列当たり複数の第５のポリヌクレオチド配列が発生し
、これにより、複数のシグナルが発生する（Ｆｉｇｕｒｅ ３参照）。
の反復単位の使用に関する。態様のこの特徴において、第２および第４のポリヌ
クレオチド配列は単位当たり同じ配列の複数の反復単位を含んでおり、これにお
いて、これらの反復単位は第２および第４のポリヌクレオチド配列の間と同様に
相補性を有する。第２および第４のポリヌクレオチド配列の間の関係は、それら
がそれらの対応する反復単位に関して塩基対形成可能であることである。第５の
ポリヌクレオチド配列、または、少なくともその一部分は第２のポリヌクレオチ
ド配列の少なくとも１つの反復単位と実質的に同一（約９５〜約１００％）であ
る。第１のプローブ複合体からアッセイ反応サイクルが進行するに従い、アッセ
イ標的ポリヌクレオチド配列当たり複数の第５のポリヌクレオチド配列が発生し
、これにより、複数のシグナルが発生する（Ｆｉｇｕｒｅ ３参照）。
【００５８】 更に、この態様はこのアッセイを平行して実施することも包含する。１セット
の条件には仮の標的ポリヌクレオチド配列が含まれ、平行するアッセイは標的ポ
リヌクレオチド配列を用いることなく実施する。この第２の、あるいは平行する
アッセイにおいては、アッセイの他の要素は全て同じままとする。標的ポリヌク
レオチド配列を用いないアッセイで検出されるシグナルはバックグラウンドまた
はノイズを示すものとすることができる。このノイズを用いて標的ポリヌクレオ
チド配列を用いたアッセイで得られたシグナル応答を規格化することができる。
の条件には仮の標的ポリヌクレオチド配列が含まれ、平行するアッセイは標的ポ
リヌクレオチド配列を用いることなく実施する。この第２の、あるいは平行する
アッセイにおいては、アッセイの他の要素は全て同じままとする。標的ポリヌク
レオチド配列を用いないアッセイで検出されるシグナルはバックグラウンドまた
はノイズを示すものとすることができる。このノイズを用いて標的ポリヌクレオ
チド配列を用いたアッセイで得られたシグナル応答を規格化することができる。
【００５９】 本発明の別の態様においては、多重逐次的ポリヌクレオチド置換を含む反復（
ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）サイクルを用いて試料内の核酸分子中の標的ポリヌクレオ
チド配列を検出するための方法を開示する。この特定の態様においては、プロー
ブ複合体および置換複合体の形成のサイクルが行われるが、それにおいて、アッ
セイの再使用が可能となるような複合体反応体が生成し、これにより、複数のシ
グナルが発生する。
ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）サイクルを用いて試料内の核酸分子中の標的ポリヌクレオ
チド配列を検出するための方法を開示する。この特定の態様においては、プロー
ブ複合体および置換複合体の形成のサイクルが行われるが、それにおいて、アッ
セイの再使用が可能となるような複合体反応体が生成し、これにより、複数のシ
グナルが発生する。
【００６０】 第１のプローブ形成複合体は第１のポリヌクレオチド配列を第２のポリヌクレ
オチド配列にハイブリダイゼーションに適する条件下で接触させることにより発
生させる。好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列はその第２のポリヌクレオ
チド配列複合体パートナーよりも標的第３ポリヌクレオチド配列に対してより高
度の親和性を有する。第１の置換複合体は第１のプローブ複合体を標的第３ポリ
ヌクレオチド配列に接触させることにより形成する。この標的ポリヌクレオチド
配列は標的と第１のポリヌクレオチド配列の間の親和性により、第２のポリヌク
レオチド配列を置換し、第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。第
２のポリヌクレオチド配列は置換され、この時点では第１と標的のポリヌクレオ
チド配列の間に形成されている複合体から遊離した状態で残る。
オチド配列にハイブリダイゼーションに適する条件下で接触させることにより発
生させる。好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列はその第２のポリヌクレオ
チド配列複合体パートナーよりも標的第３ポリヌクレオチド配列に対してより高
度の親和性を有する。第１の置換複合体は第１のプローブ複合体を標的第３ポリ
ヌクレオチド配列に接触させることにより形成する。この標的ポリヌクレオチド
配列は標的と第１のポリヌクレオチド配列の間の親和性により、第２のポリヌク
レオチド配列を置換し、第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。第
２のポリヌクレオチド配列は置換され、この時点では第１と標的のポリヌクレオ
チド配列の間に形成されている複合体から遊離した状態で残る。
【００６１】 このプローブおよび置換複合体のサイクルに引き続き、第２のサイクルのプロ
ーブおよび置換複合体の形成が起こる。第２のプローブ複合体は、ハイブリダイ
ゼーションに適する条件下、第４と第５のポリヌクレオチド配列を接触させるこ
とにより形成する。好ましくは、第４のポリヌクレオチド配列はその第５のポリ
ヌクレオチド配列複合体パートナーよりも置換された第２のポリヌクレオチド配
列に対してより高い親和性を有する。好ましくは、第５のポリヌクレオチド配列
は標的ポリヌクレオチド配列と部分的に同一（約３０〜約９５％）である。第２
の置換複合体は第１の置換複合体の生成物である置換された第２のポリヌクレオ
チド配列に第２のプローブ複合体を接触させることにより形成する。第４のポリ
ヌクレオチド配列がその第５のポリヌクレオチド配列パートナーよりも置換され
た第２のポリヌクレオチド配列に対してより大きい親和性を有すると仮定すれば
、少なくとも１つの第５のポリヌクレオチド配列は置換された第２のポリヌクレ
オチド配列により第２のプローブ複合体から競合的に排除される。この置換事象
の結果、新しい複合体が第４と第２のポリヌクレオチド配列の間に形成され、第
５のポリヌクレオチド配列は遊離したままとなる。この第５のポリヌクレオチド
配列はこの時点で検出対象となるシグナルを発生することができる。例えば、こ
の第５のポリヌクレオチド配列は検出可能な放射性リン原子で標識した核酸内に
包埋することができる。あるいは、この第５のポリヌクレオチド配列が次の置換
複合体における置換ポリヌクレオチド配列として機能することができる。
ーブおよび置換複合体の形成が起こる。第２のプローブ複合体は、ハイブリダイ
ゼーションに適する条件下、第４と第５のポリヌクレオチド配列を接触させるこ
とにより形成する。好ましくは、第４のポリヌクレオチド配列はその第５のポリ
ヌクレオチド配列複合体パートナーよりも置換された第２のポリヌクレオチド配
列に対してより高い親和性を有する。好ましくは、第５のポリヌクレオチド配列
は標的ポリヌクレオチド配列と部分的に同一（約３０〜約９５％）である。第２
の置換複合体は第１の置換複合体の生成物である置換された第２のポリヌクレオ
チド配列に第２のプローブ複合体を接触させることにより形成する。第４のポリ
ヌクレオチド配列がその第５のポリヌクレオチド配列パートナーよりも置換され
た第２のポリヌクレオチド配列に対してより大きい親和性を有すると仮定すれば
、少なくとも１つの第５のポリヌクレオチド配列は置換された第２のポリヌクレ
オチド配列により第２のプローブ複合体から競合的に排除される。この置換事象
の結果、新しい複合体が第４と第２のポリヌクレオチド配列の間に形成され、第
５のポリヌクレオチド配列は遊離したままとなる。この第５のポリヌクレオチド
配列はこの時点で検出対象となるシグナルを発生することができる。例えば、こ
の第５のポリヌクレオチド配列は検出可能な放射性リン原子で標識した核酸内に
包埋することができる。あるいは、この第５のポリヌクレオチド配列が次の置換
複合体における置換ポリヌクレオチド配列として機能することができる。
【００６２】 第３のプローブ複合体は第６のポリヌクレオチド配列を第７のポリヌクレオチ
ド配列と、第６および第７のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーショ
ンのための水性媒体中、適する条件下で、接触させることにより形成する。好ま
しくは、第７のポリヌクレオチド配列と標的ポリヌクレオチド配列との間の相同
性の程度は約９５％〜約１００％である。最も好ましくは、第７のポリヌクレオ
チド配列は標的第３ポリヌクレオチド配列である。第６のポリヌクレオチド配列
は好ましくは、そのハイブリダイゼーションパートナーよりも置換された第５の
ポリヌクレオチド配列に対してより高い親和性を有する。
ド配列と、第６および第７のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーショ
ンのための水性媒体中、適する条件下で、接触させることにより形成する。好ま
しくは、第７のポリヌクレオチド配列と標的ポリヌクレオチド配列との間の相同
性の程度は約９５％〜約１００％である。最も好ましくは、第７のポリヌクレオ
チド配列は標的第３ポリヌクレオチド配列である。第６のポリヌクレオチド配列
は好ましくは、そのハイブリダイゼーションパートナーよりも置換された第５の
ポリヌクレオチド配列に対してより高い親和性を有する。
【００６３】 第３の置換複合体は、第３のプローブ複合体を置換された第５のポリヌクレオ
チド配列と、プローブ複合体からの少なくとも１つの第７のポリヌクレオチド配
列の置換および第５のポリヌクレオチド配列による第６のポリヌクレオチド配列
へのハイブリダイゼーションに適する条件下で、接触させることにより形成する
。置換された第７のポリヌクレオチド配列はこの時点で第１の置換複合体にサイ
クルバックされ、これにより、サイクルの全過程を最初から再開することができ
る。第７のポリヌクレオチド配列並びに他の何れかの複数置換されたポリヌクレ
オチド配列がこのように発生することにより、シグナルが発生できるのである（
Ｆｉｇｕｒｅ ４参照）。
チド配列と、プローブ複合体からの少なくとも１つの第７のポリヌクレオチド配
列の置換および第５のポリヌクレオチド配列による第６のポリヌクレオチド配列
へのハイブリダイゼーションに適する条件下で、接触させることにより形成する
。置換された第７のポリヌクレオチド配列はこの時点で第１の置換複合体にサイ
クルバックされ、これにより、サイクルの全過程を最初から再開することができ
る。第７のポリヌクレオチド配列並びに他の何れかの複数置換されたポリヌクレ
オチド配列がこのように発生することにより、シグナルが発生できるのである（
Ｆｉｇｕｒｅ ４参照）。
【００６４】 個々の置換反応の各々においてシグナルの獲得を伴う置換反応の反復（ｒｅｃ
ｕｒｓｉｖｅ）カスケードを用いてＦｉｇｕｒｅ ５に示す高水準の増幅を達成
することができる。図示したプローブ複合体は各置換反応につき２倍のシグナル
獲得が得られるように設計されている。Ｆｉｇｕｒｅ ５に示す増大ファクター
はこの態様における個々の置換反応の各々の化学量論的特徴を示している。各工
程で２倍のシグナル獲得を伴う３置換のサイクル１回で達成される総増幅は８倍
である。３置換のサイクルを追加するごとにシグナルは更に８倍増大する。
ｕｒｓｉｖｅ）カスケードを用いてＦｉｇｕｒｅ ５に示す高水準の増幅を達成
することができる。図示したプローブ複合体は各置換反応につき２倍のシグナル
獲得が得られるように設計されている。Ｆｉｇｕｒｅ ５に示す増大ファクター
はこの態様における個々の置換反応の各々の化学量論的特徴を示している。各工
程で２倍のシグナル獲得を伴う３置換のサイクル１回で達成される総増幅は８倍
である。３置換のサイクルを追加するごとにシグナルは更に８倍増大する。
【００６５】 本発明の別の態様においては、シグナル増幅のための多重逐次的ポリヌクレオ
チド置換を含む、複数のシグナルを発生させるために異種のポリヌクレオチド配
列を用いる生物学的試料内の核酸分子中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する
ための方法を開示する。この態様においては、プローブおよび置換複合体の形成
のサイクルが起こるが、これにおいて、分岐事象が起こり、その結果複数の異な
るサイクルが生じ、これにより複数のシグナルが発生する。
チド置換を含む、複数のシグナルを発生させるために異種のポリヌクレオチド配
列を用いる生物学的試料内の核酸分子中の標的ポリヌクレオチド配列を検出する
ための方法を開示する。この態様においては、プローブおよび置換複合体の形成
のサイクルが起こるが、これにおいて、分岐事象が起こり、その結果複数の異な
るサイクルが生じ、これにより複数のシグナルが発生する。
【００６６】 第１のプローブ形成複合体は第１のポリヌクレオチド配列を第２のポリヌクレ
オチド配列にハイブリダイゼーションに適する条件下で接触させることにより発
生させる。好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列は第２のポリヌクレオチド
配列よりも標的第３ポリヌクレオチド配列に対してより高度の親和性を有する。
第１の置換複合体は第１のプローブ複合体を標的第３ポリヌクレオチド配列に接
触させることにより形成する。この標的ポリヌクレオチド配列は標的と第１のポ
リヌクレオチド配列の間の親和性により、少なくとも１つの第２のポリヌクレオ
チド配列を置換し、第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。第２の
ポリヌクレオチド配列は置換され、この時点では第１と標的のポリヌクレオチド
配列の間に形成されている複合体から遊離した状態で残る。
オチド配列にハイブリダイゼーションに適する条件下で接触させることにより発
生させる。好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列は第２のポリヌクレオチド
配列よりも標的第３ポリヌクレオチド配列に対してより高度の親和性を有する。
第１の置換複合体は第１のプローブ複合体を標的第３ポリヌクレオチド配列に接
触させることにより形成する。この標的ポリヌクレオチド配列は標的と第１のポ
リヌクレオチド配列の間の親和性により、少なくとも１つの第２のポリヌクレオ
チド配列を置換し、第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。第２の
ポリヌクレオチド配列は置換され、この時点では第１と標的のポリヌクレオチド
配列の間に形成されている複合体から遊離した状態で残る。
【００６７】 異種プローブ複合体は第４のポリヌクレオチド配列を第５および第６のポリヌ
クレオチド配列と、第４および第５と第６のポリヌクレオチド配列との間、ある
いは、アッセイに使用される全てのハイブリダイゼーションに適する条件下で、
接触させることにより形成する。第５および第６のポリヌクレオチド配列は異種
ポリヌクレオチド配列と称するのに十分相互に異なっている（即ちアッセイ条件
下でお互いの相補体にはハイブリダイズできない）が、これらは共に、第４のポ
リヌクレオチド配列の異なる部位を用いて塩基対形成を行うことにより第４のポ
リヌクレオチド配列に結合することができる。
クレオチド配列と、第４および第５と第６のポリヌクレオチド配列との間、ある
いは、アッセイに使用される全てのハイブリダイゼーションに適する条件下で、
接触させることにより形成する。第５および第６のポリヌクレオチド配列は異種
ポリヌクレオチド配列と称するのに十分相互に異なっている（即ちアッセイ条件
下でお互いの相補体にはハイブリダイズできない）が、これらは共に、第４のポ
リヌクレオチド配列の異なる部位を用いて塩基対形成を行うことにより第４のポ
リヌクレオチド配列に結合することができる。
【００６８】 異種置換複合体は前の置換複合体事象による置換された生成物、この例では置
換された第２のポリヌクレオチド配列を異種プローブ複合体と、置換およびハイ
ブリダイゼーションに適する条件下で接触させることにより形成する。好ましく
は、第２のポリヌクレオチド配列は少なくとも１つの第５および少なくとも１つ
の第６のポリヌクレオチド配列（および第４のポリヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズする他の何れのポリヌクレオチド配列）を置換して第４のポリヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズする。この置換およびハイブリダイゼーションの事象は
存在する他の何れのポリヌクレオチド配列よりも第２のポリヌクレオチド配列に
対してより高い親和性を第４のポリヌクレオチド配列が有することに基づいてい
る。異種のプローブおよび置換複合体のサイクルにおけるこの最後の事象は、第
５および第６のポリヌクレオチド配列から少なくとも２つのシグナルを発生させ
る。発生する異なる潜在的シグナルの数は、異種プローブ形成工程の間、どの程
度多種の実質的に同一ではないポリヌクレオチド配列を使用して第４のポリヌク
レオチド配列とハイブリダイズするかによる。実質的に同一ではないとは、本明
細書においては、異なるポリヌクレオチド配列が、アッセイの条件下で第４のポ
リヌクレオチド配列を含む存在するいかなる他のポリヌクレオチド配列ともハイ
ブリダイズしないことを指す。しかしながら、第４のポリヌクレオチド配列とハ
イブリダイズするために用いるポリヌクレオチド配列は標的第３ポリヌクレオチ
ド配列と完全または部分的に実質的に同一であることができる（Ｆｉｇｕｒｅ
６参照）。
換された第２のポリヌクレオチド配列を異種プローブ複合体と、置換およびハイ
ブリダイゼーションに適する条件下で接触させることにより形成する。好ましく
は、第２のポリヌクレオチド配列は少なくとも１つの第５および少なくとも１つ
の第６のポリヌクレオチド配列（および第４のポリヌクレオチド配列とハイブリ
ダイズする他の何れのポリヌクレオチド配列）を置換して第４のポリヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズする。この置換およびハイブリダイゼーションの事象は
存在する他の何れのポリヌクレオチド配列よりも第２のポリヌクレオチド配列に
対してより高い親和性を第４のポリヌクレオチド配列が有することに基づいてい
る。異種のプローブおよび置換複合体のサイクルにおけるこの最後の事象は、第
５および第６のポリヌクレオチド配列から少なくとも２つのシグナルを発生させ
る。発生する異なる潜在的シグナルの数は、異種プローブ形成工程の間、どの程
度多種の実質的に同一ではないポリヌクレオチド配列を使用して第４のポリヌク
レオチド配列とハイブリダイズするかによる。実質的に同一ではないとは、本明
細書においては、異なるポリヌクレオチド配列が、アッセイの条件下で第４のポ
リヌクレオチド配列を含む存在するいかなる他のポリヌクレオチド配列ともハイ
ブリダイズしないことを指す。しかしながら、第４のポリヌクレオチド配列とハ
イブリダイズするために用いるポリヌクレオチド配列は標的第３ポリヌクレオチ
ド配列と完全または部分的に実質的に同一であることができる（Ｆｉｇｕｒｅ
６参照）。
【００６９】 複数のプローブ複合体を更に形成することにより、更に増幅されたアッセイシ
グナルを発生することができる。新しいプローブ複合体は異種の置換複合体から
発生した置換されたポリヌクレオチド配列の同族ポリヌクレオチド配列を利用す
る。これらの複合体は、同族ポリヌクレオチド配列を、対応する同族ポリヌクレ
オチド配列と部分的に相補性を有するポリヌクレオチド配列と、ハイブリダイゼ
ーションに適する条件下、接触させることにより形成する。
グナルを発生することができる。新しいプローブ複合体は異種の置換複合体から
発生した置換されたポリヌクレオチド配列の同族ポリヌクレオチド配列を利用す
る。これらの複合体は、同族ポリヌクレオチド配列を、対応する同族ポリヌクレ
オチド配列と部分的に相補性を有するポリヌクレオチド配列と、ハイブリダイゼ
ーションに適する条件下、接触させることにより形成する。
【００７０】 次に複数の置換複合体が形成される。これらの複合体は複数のプローブ複合体
を置換されたポリヌクレオチド配列（前の異種置換複合体事象の間に発生したも
の）と、置換およびハイブリダイゼーションに適する条件下、接触させることに
より生成する。同族のポリヌクレオチド配列はその対応する相補的な置換された
ポリヌクレオチド配列に結合し、それらの間の親和性に応じて、同族ポリヌクレ
オチド配列のハイブリダイゼーションパートナーが複合体から置換される。新し
く置換されたポリヌクレオチド配列はこの時点で検出対象となる少なくとも１つ
のシグナルを発生することができる（Ｆｉｇｕｒｅ ６参照）。
を置換されたポリヌクレオチド配列（前の異種置換複合体事象の間に発生したも
の）と、置換およびハイブリダイゼーションに適する条件下、接触させることに
より生成する。同族のポリヌクレオチド配列はその対応する相補的な置換された
ポリヌクレオチド配列に結合し、それらの間の親和性に応じて、同族ポリヌクレ
オチド配列のハイブリダイゼーションパートナーが複合体から置換される。新し
く置換されたポリヌクレオチド配列はこの時点で検出対象となる少なくとも１つ
のシグナルを発生することができる（Ｆｉｇｕｒｅ ６参照）。
【００７１】 本発明はシグナル増幅のための複数の逐次的ポリヌクレオチド置換を含む、検
出可能な均質なシグナルを用いた生物学的試料中の２つ以上の異種標的ポリヌク
レオチド配列を検出するための方法に関する。
出可能な均質なシグナルを用いた生物学的試料中の２つ以上の異種標的ポリヌク
レオチド配列を検出するための方法に関する。
【００７２】 第１の異種プローブ複合体の形成は、１セットの異種の第１のポリヌクレオチ
ド配列を１セットの異種の第２のポリヌクレオチド配列に、ハイブリダイゼーシ
ョンに適する条件下、接触させることにより行う。好ましくは、異種の第１のポ
リヌクレオチド配列はその対応する標的第３ポリヌクレオチド配列と完全に、ま
たは、部分的に相補的な配列である。異種という用語は、形成されたプローブ複
合体の集団がその複合体パートナーにハイブリダイズした異なる第１のポリヌク
レオチド配列の混合物であること、また、第２のポリヌクレオチド配列もまた多
様であるためにプローブ複合体の異種性に寄与することを指すために使用する。
第１および第２のポリヌクレオチド配列はアッセイの対象となる標的第３ポリヌ
クレオチド配列の異種の集団に基づいて決定する。第２のポリヌクレオチド配列
の全ては、相補性がないために第１または第３のポリヌクレオチド配列とは結合
しない少なくとも１つの共通なポリヌクレオチド配列領域（以後ＣＮＳＲと称す
る）を共有している。これらのＣＮＳＲはＣＢＲとは異なることができる。より
好ましい態様においては、第２のポリヌクレオチド配列の全てが少なくとも２つ
のＣＮＳＲ、即ちＣＮＳＲ（１）およびＣＮＳＲ（２）を有する。
ド配列を１セットの異種の第２のポリヌクレオチド配列に、ハイブリダイゼーシ
ョンに適する条件下、接触させることにより行う。好ましくは、異種の第１のポ
リヌクレオチド配列はその対応する標的第３ポリヌクレオチド配列と完全に、ま
たは、部分的に相補的な配列である。異種という用語は、形成されたプローブ複
合体の集団がその複合体パートナーにハイブリダイズした異なる第１のポリヌク
レオチド配列の混合物であること、また、第２のポリヌクレオチド配列もまた多
様であるためにプローブ複合体の異種性に寄与することを指すために使用する。
第１および第２のポリヌクレオチド配列はアッセイの対象となる標的第３ポリヌ
クレオチド配列の異種の集団に基づいて決定する。第２のポリヌクレオチド配列
の全ては、相補性がないために第１または第３のポリヌクレオチド配列とは結合
しない少なくとも１つの共通なポリヌクレオチド配列領域（以後ＣＮＳＲと称す
る）を共有している。これらのＣＮＳＲはＣＢＲとは異なることができる。より
好ましい態様においては、第２のポリヌクレオチド配列の全てが少なくとも２つ
のＣＮＳＲ、即ちＣＮＳＲ（１）およびＣＮＳＲ（２）を有する。
【００７３】 第１の異種置換複合体の形成は、第１の異種プローブ複合体をその対応する標
的第３ポリヌクレオチド配列（形成された各異種プローブ複合体につき相当する
標的ポリヌクレオチド配列が存在する）と、標的第３ポリヌクレオチド配列が親
和性の相違に基づいて少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド配列を置換して
その同族の第１のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに適する条件下
、接触させることにより行う。好ましくは、複合体の第１のポリヌクレオチド配
列はその対応する標的第３ポリヌクレオチド配列に対し、より大きい親和性を有
する。この反応は分析対象となる標的第３ポリヌクレオチド配列の全てに渡り反
復される。この場合に用いる異種という用語は形成した置換複合体の集団が異種
のプローブ複合体から形成された混合群であることを指す。これらの置換複合体
は置換された第２のポリヌクレオチド配列の多様な集団を発生させる。
的第３ポリヌクレオチド配列（形成された各異種プローブ複合体につき相当する
標的ポリヌクレオチド配列が存在する）と、標的第３ポリヌクレオチド配列が親
和性の相違に基づいて少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド配列を置換して
その同族の第１のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに適する条件下
、接触させることにより行う。好ましくは、複合体の第１のポリヌクレオチド配
列はその対応する標的第３ポリヌクレオチド配列に対し、より大きい親和性を有
する。この反応は分析対象となる標的第３ポリヌクレオチド配列の全てに渡り反
復される。この場合に用いる異種という用語は形成した置換複合体の集団が異種
のプローブ複合体から形成された混合群であることを指す。これらの置換複合体
は置換された第２のポリヌクレオチド配列の多様な集団を発生させる。
【００７４】 第２のプローブ複合体は第４のポリヌクレオチド配列を第５のポリヌクレオチ
ド配列と、第４および第５のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーショ
ンに適する条件下、接触させることにより形成する。好ましい態様においては、
第５のポリヌクレオチド配列は、第２のポリヌクレオチド配列のＣＮＳＲと実質
的に同一の領域を有する。好ましくは、第４のポリヌクレオチド配列は少なくと
も２つのＣＮＳＲ相補領域を有し、そのうちの１つが第５のポリヌクレオチド配
列のＣＮＳＲと相互作用を示す。最も好ましくは、第５のポリヌクレオチド配列
は第４のポリヌクレオチド配列に結合するために使用することのできる第２のポ
リヌクレオチド配列の１つのみのＣＮＳＲと実質的に同一の領域を有する。好ま
しくは、第５のポリヌクレオチド配列はこのＣＮＳＲを介して第４のヌクレオチ
ドに結合する。
ド配列と、第４および第５のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイゼーショ
ンに適する条件下、接触させることにより形成する。好ましい態様においては、
第５のポリヌクレオチド配列は、第２のポリヌクレオチド配列のＣＮＳＲと実質
的に同一の領域を有する。好ましくは、第４のポリヌクレオチド配列は少なくと
も２つのＣＮＳＲ相補領域を有し、そのうちの１つが第５のポリヌクレオチド配
列のＣＮＳＲと相互作用を示す。最も好ましくは、第５のポリヌクレオチド配列
は第４のポリヌクレオチド配列に結合するために使用することのできる第２のポ
リヌクレオチド配列の１つのみのＣＮＳＲと実質的に同一の領域を有する。好ま
しくは、第５のポリヌクレオチド配列はこのＣＮＳＲを介して第４のヌクレオチ
ドに結合する。
【００７５】 第２の置換複合体は第１の異種置換複合体から発生した置換された第２のポリ
ヌクレオチド配列を、第２のプローブ複合体と、（ｉ）第２のポリヌクレオチド
配列による第２のプローブ複合体から生じた少なくとも１つの第５のポリヌクレ
オチド配列の置換；および、（ｉｉ）第２のプローブ複合体の第４のポリヌクレ
オチド配列への第２のポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション、に適す
る条件下、接触させることにより形成する。好ましくは、第２のポリヌクレオチ
ド配列の第４のポリヌクレオチド配列とのこのハイブリダイゼーションは、少な
くとも双方のＣＮＳＲを介して行われる。その結果、少なくとも１つの第５のポ
リヌクレオチド配列が置換され複合体より遊離するため、これは分析する標的ポ
リヌクレオチド配列の多様な集団について同種のアッセイシグナルを発生させる
ことができる（Ｆｉｇｕｒｅ ７参照）。
ヌクレオチド配列を、第２のプローブ複合体と、（ｉ）第２のポリヌクレオチド
配列による第２のプローブ複合体から生じた少なくとも１つの第５のポリヌクレ
オチド配列の置換；および、（ｉｉ）第２のプローブ複合体の第４のポリヌクレ
オチド配列への第２のポリヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション、に適す
る条件下、接触させることにより形成する。好ましくは、第２のポリヌクレオチ
ド配列の第４のポリヌクレオチド配列とのこのハイブリダイゼーションは、少な
くとも双方のＣＮＳＲを介して行われる。その結果、少なくとも１つの第５のポ
リヌクレオチド配列が置換され複合体より遊離するため、これは分析する標的ポ
リヌクレオチド配列の多様な集団について同種のアッセイシグナルを発生させる
ことができる（Ｆｉｇｕｒｅ ７参照）。
【００７６】 本発明はシグナル増幅のための多重逐次的ポリヌクレオチドの置換を含む、固
定化プローブを用いた生物学的試料内の核酸分子における標的ポリヌクレオチド
配列を検出するための方法に関する。
定化プローブを用いた生物学的試料内の核酸分子における標的ポリヌクレオチド
配列を検出するための方法に関する。
【００７７】 固定化されたプローブ複合体は、第１のポリヌクレオチド配列を第２のポリヌ
クレオチド配列と、第１および第２のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイ
ゼーションに適する条件下、接触させることにより形成する。米国特許出願第０
８／９７１，８４５号明細書；第０６／０４６，７０８号明細書；および第０８
／８１２，１０５号明細書を参考にでき、これらの記載内容は全て、参考のため
に本明細書に組み込まれる。第１のポリヌクレオチド配列は第１の表面に固定化
される。本発明の表面はゲル、（例えばポリアクリルアミド、澱粉またはアガロ
ース）、ガラス、プラスチックおよびワックス系材料のような固体支持体上の表
面であることができる。
クレオチド配列と、第１および第２のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイ
ゼーションに適する条件下、接触させることにより形成する。米国特許出願第０
８／９７１，８４５号明細書；第０６／０４６，７０８号明細書；および第０８
／８１２，１０５号明細書を参考にでき、これらの記載内容は全て、参考のため
に本明細書に組み込まれる。第１のポリヌクレオチド配列は第１の表面に固定化
される。本発明の表面はゲル、（例えばポリアクリルアミド、澱粉またはアガロ
ース）、ガラス、プラスチックおよびワックス系材料のような固体支持体上の表
面であることができる。
【００７８】 固体支持体表面のような表面への核酸の付着手段は単純な吸着によることがで
きる。好ましくは、付着は核酸と表面に結合したいくつかの化学的部分、例えば
アミンまたはカルボキシル基との間の共有結合、または核酸の何れかの領域に結
合したアクリルアミドを介して行う。化学的クロスリンカーを用いて表面に核酸
を固定化することができる。このような化学的クロスリンカーの例は、表面のア
ミン基に核酸の５’末端のホスフェート基を連結するために用いることができる
カルボジイミド（例えば１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジ
イミド）である。更にイオンの相互作用で核酸の固定化を促進することもできる
。結合は核酸と表面との間のように直接的に、または、核酸と表面との間に中間
分子を置くなどして間接的に行うことができる。この中間分子の長さは厳密でな
くともよい。
きる。好ましくは、付着は核酸と表面に結合したいくつかの化学的部分、例えば
アミンまたはカルボキシル基との間の共有結合、または核酸の何れかの領域に結
合したアクリルアミドを介して行う。化学的クロスリンカーを用いて表面に核酸
を固定化することができる。このような化学的クロスリンカーの例は、表面のア
ミン基に核酸の５’末端のホスフェート基を連結するために用いることができる
カルボジイミド（例えば１−エチル−３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジ
イミド）である。更にイオンの相互作用で核酸の固定化を促進することもできる
。結合は核酸と表面との間のように直接的に、または、核酸と表面との間に中間
分子を置くなどして間接的に行うことができる。この中間分子の長さは厳密でな
くともよい。
【００７９】 親和性試薬もまた表面に核酸を固定化するための手段として用いることができ
る。例えば、ビオチンまたはアビジン部分を有する表面にアビジンまたはビオチ
ン部分をそれぞれ媒介する核酸により、核酸と表面とが結合する。親和性系固定
化技術を用いる別の例は、目的の核酸を親和性リガンドに同一平面的に（ｃｏｅ
ｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）で連結させるものであり、ここでもアビジンまたはビオ
チンが有用な例となる。リガンドに対する同族受容体は、例えば、ビオチンがリ
ガンドである場合は、アビジンが同族受容体であるが、磁性粒子を付帯している
。表面に磁場が適用されると、磁性粒子はそれに結合しているものと共に、表面
に固定化される。
る。例えば、ビオチンまたはアビジン部分を有する表面にアビジンまたはビオチ
ン部分をそれぞれ媒介する核酸により、核酸と表面とが結合する。親和性系固定
化技術を用いる別の例は、目的の核酸を親和性リガンドに同一平面的に（ｃｏｅ
ｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）で連結させるものであり、ここでもアビジンまたはビオ
チンが有用な例となる。リガンドに対する同族受容体は、例えば、ビオチンがリ
ガンドである場合は、アビジンが同族受容体であるが、磁性粒子を付帯している
。表面に磁場が適用されると、磁性粒子はそれに結合しているものと共に、表面
に固定化される。
【００８０】 置換複合体は、固定化されたプローブ複合体を標的第３ポリヌクレオチド配列
に、標的ポリヌクレオチド配列が、固定化された複合体の少なくとも１つの第２
のポリヌクレオチド配列を置換し、標的ポリヌクレオチド配列を複合体のその同
族の第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするのに適する条件下で接触
させることにより形成される。好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列は第２
のポリヌクレオチド配列よりも標的第３ポリヌクレオチド配列に対し、より高度
な親和性を有する。
に、標的ポリヌクレオチド配列が、固定化された複合体の少なくとも１つの第２
のポリヌクレオチド配列を置換し、標的ポリヌクレオチド配列を複合体のその同
族の第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするのに適する条件下で接触
させることにより形成される。好ましくは、第１のポリヌクレオチド配列は第２
のポリヌクレオチド配列よりも標的第３ポリヌクレオチド配列に対し、より高度
な親和性を有する。
【００８１】 少なくとも１つの置換された第２のポリヌクレオチド配列は、第１の固定化表
面から、第２の固定化表面に移送される。置換された第２のポリヌクレオチド配
列（または何れかの置換されたポリヌクレオチド配列）を含む相、例えば、液相
は、クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、デカンテーションまたはピペット操
作のような方法により固定化複合体から分離することができる。更に、移動は対
流分散、重力流動、電気的に誘導された内浸透圧流動、湿潤化、毛管作用、送液
媒介流動または電気泳動により行うこともできる。
面から、第２の固定化表面に移送される。置換された第２のポリヌクレオチド配
列（または何れかの置換されたポリヌクレオチド配列）を含む相、例えば、液相
は、クロマトグラフィー、濾過、遠心分離、デカンテーションまたはピペット操
作のような方法により固定化複合体から分離することができる。更に、移動は対
流分散、重力流動、電気的に誘導された内浸透圧流動、湿潤化、毛管作用、送液
媒介流動または電気泳動により行うこともできる。
【００８２】 第２の固定化プローブ複合体は、第４のポリヌクレオチド配列を第５のポリヌ
クレオチド配列と、第４および第５のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイ
ゼーションに適する条件下で接触させることにより形成される。第４のポリヌク
レオチド配列は第２の表面に固定化される。
クレオチド配列と、第４および第５のポリヌクレオチド配列の間のハイブリダイ
ゼーションに適する条件下で接触させることにより形成される。第４のポリヌク
レオチド配列は第２の表面に固定化される。
【００８３】 第２の固定化置換複合体が形成される。固定化された第２のプローブ複合体を
、第１の置換複合体事象の間に置換された移送された第２のポリヌクレオチド配
列と、第２のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの第５のポリヌクレオチド
配列を置換し、その同族の第４のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするの
に適する条件下で接触させる。好ましくは、第４のポリヌクレオチド配列はその
第５のポリヌクレオチド配列複合体パートナーよりも第２のポリヌクレオチド配
列に対し、より高い親和性を有する。この第２の置換複合体事象は後の表面に移
送することのできる、あるいは、検出のためのシグナルを発生するために使用で
きる、第５のポリヌクレオチド配列を発生させる。
、第１の置換複合体事象の間に置換された移送された第２のポリヌクレオチド配
列と、第２のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの第５のポリヌクレオチド
配列を置換し、その同族の第４のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズするの
に適する条件下で接触させる。好ましくは、第４のポリヌクレオチド配列はその
第５のポリヌクレオチド配列複合体パートナーよりも第２のポリヌクレオチド配
列に対し、より高い親和性を有する。この第２の置換複合体事象は後の表面に移
送することのできる、あるいは、検出のためのシグナルを発生するために使用で
きる、第５のポリヌクレオチド配列を発生させる。
【００８４】 プローブおよび置換複合体の形成に引き続き置換されたポリヌクレオチド配列
の移送を行うサイクルは反復され、その結果としてアッセイシグナルを増幅する
ことができる。複数のサイクルには複数の表面が関与できる。これらの表面は同
一平面上で、または、空間的に相互に隔たっていることができ、例えば２個の５
０ｍＬ容の円錐型管が空間的に隔たった２つの表面を示す。表面が同一平面上に
ある場合は、それらは隔壁、例えば、特定の表面内の複合体（恐らくは固定化さ
れていないもの）の保持を完了するように置換されたポリヌクレオチド配列を含
有する分子の運動のみ可能な同一平面を分離することのできるサイズ選択的透過
膜により分離することができる（Figure ８参照）。
の移送を行うサイクルは反復され、その結果としてアッセイシグナルを増幅する
ことができる。複数のサイクルには複数の表面が関与できる。これらの表面は同
一平面上で、または、空間的に相互に隔たっていることができ、例えば２個の５
０ｍＬ容の円錐型管が空間的に隔たった２つの表面を示す。表面が同一平面上に
ある場合は、それらは隔壁、例えば、特定の表面内の複合体（恐らくは固定化さ
れていないもの）の保持を完了するように置換されたポリヌクレオチド配列を含
有する分子の運動のみ可能な同一平面を分離することのできるサイズ選択的透過
膜により分離することができる（Figure ８参照）。
【００８５】 本態様はまたマトリックス全体に渡り複数の反応ステーションがあり；何れの
複合体の固定化も必要としない、固体支持体マトリックスを包含する（Figure ９参照）。これらの反応ステーションは、反応体をポケットに添加してそこに拘
束することにより反応ステーションが形成されるように、マトリックスそのもの
の内部にポケットを有するマトリックスに沿って配置されている。プローブ複合
体および置換複合体の形成はこれらのステーションにおいて行うことができる。
これらの複合体は異なる反応ステーション内に存在することにより物理的に分離
されることができる。１つのステーションから次への移送は、例えばピペットを
用いた機械的な移送により行うことができる。移送はまた、重力流動、電気的に
誘導された内浸透圧流動、湿潤化、毛管作用、送液流動または電気的に誘導され
た電気泳動による流動によりマトリックスを通じて行うこともできる。支持体マ
トリックスそのものはビーズまたは粒子、薄層プレート、膜、ポリアクリルアミ
ドゲル、澱粉ゲル、アガロースゲルおよび他の重合体ゲルの形態のクロマトグラ
フィー支持体であることができる。
複合体の固定化も必要としない、固体支持体マトリックスを包含する（Figure ９参照）。これらの反応ステーションは、反応体をポケットに添加してそこに拘
束することにより反応ステーションが形成されるように、マトリックスそのもの
の内部にポケットを有するマトリックスに沿って配置されている。プローブ複合
体および置換複合体の形成はこれらのステーションにおいて行うことができる。
これらの複合体は異なる反応ステーション内に存在することにより物理的に分離
されることができる。１つのステーションから次への移送は、例えばピペットを
用いた機械的な移送により行うことができる。移送はまた、重力流動、電気的に
誘導された内浸透圧流動、湿潤化、毛管作用、送液流動または電気的に誘導され
た電気泳動による流動によりマトリックスを通じて行うこともできる。支持体マ
トリックスそのものはビーズまたは粒子、薄層プレート、膜、ポリアクリルアミ
ドゲル、澱粉ゲル、アガロースゲルおよび他の重合体ゲルの形態のクロマトグラ
フィー支持体であることができる。
【００８６】 本明細書に記載された多重逐次的ポリヌクレオチドの置換反応は、例えば、生
物製剤中の細菌、ウイルス、カビおよび植物材料に代表されるポリヌクレオチド
配列の有無を検出するための診断方法として使用することができる。既知ヌクレ
オチド配列の何れかのポリヌクレオチドに関し、本明細書に記載する通り、ポリ
ヌクレオチドプローブを設計できる。本明細書に記載した方法を用いて、病原性
または汚染物である生物学的材料に代表される１つ以上のポリヌクレオチドを検
出できる。例えば、血液試料中のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の存在を検出
するためには、ＨＩＶを示すポリヌクレオチド配列に対して相補的であり、これ
とハイブリダイズし、これにより生物学的被験試料中のＨＩＶの存在を検出する
ようなポリヌクレオチドを、本明細書の記載に従って設計することができる。生
物学的被験試料は本明細書に記載の方法において直接使用するか、または、当業
者によく知られた方法（例えば被験試料中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡを得る
ために細胞を融解するか、または、被験試料を濾過または遠心分離する方法）を
用いてアッセイするために「調製」することができる。別の例では個体（または
動物もしくは植物）のゲノム内の特異的な突然変異領域を検出することが望まれ
る。一部の遺伝子の突然変異は宿主ゲノムへのヌクレオチド配列の挿入により起
こる。挿入配列を示すヌクレオチド配列に相補的であり、これとハイブリダイズ
し、これにより宿主ゲノム内の挿入配列を検出するようなポリヌクレオチドを本
明細書の記載に従って設計できる。このような分析のための生物学的被験試料の
調製は当業者の良く知るとおりである。
物製剤中の細菌、ウイルス、カビおよび植物材料に代表されるポリヌクレオチド
配列の有無を検出するための診断方法として使用することができる。既知ヌクレ
オチド配列の何れかのポリヌクレオチドに関し、本明細書に記載する通り、ポリ
ヌクレオチドプローブを設計できる。本明細書に記載した方法を用いて、病原性
または汚染物である生物学的材料に代表される１つ以上のポリヌクレオチドを検
出できる。例えば、血液試料中のヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の存在を検出
するためには、ＨＩＶを示すポリヌクレオチド配列に対して相補的であり、これ
とハイブリダイズし、これにより生物学的被験試料中のＨＩＶの存在を検出する
ようなポリヌクレオチドを、本明細書の記載に従って設計することができる。生
物学的被験試料は本明細書に記載の方法において直接使用するか、または、当業
者によく知られた方法（例えば被験試料中に存在するＤＮＡまたはＲＮＡを得る
ために細胞を融解するか、または、被験試料を濾過または遠心分離する方法）を
用いてアッセイするために「調製」することができる。別の例では個体（または
動物もしくは植物）のゲノム内の特異的な突然変異領域を検出することが望まれ
る。一部の遺伝子の突然変異は宿主ゲノムへのヌクレオチド配列の挿入により起
こる。挿入配列を示すヌクレオチド配列に相補的であり、これとハイブリダイズ
し、これにより宿主ゲノム内の挿入配列を検出するようなポリヌクレオチドを本
明細書の記載に従って設計できる。このような分析のための生物学的被験試料の
調製は当業者の良く知るとおりである。
【００８７】 本発明は更に、生物学的試料中の標的ポリヌクレオチド配列の有無を判定する
ために用いる診断キットに関する。
ために用いる診断キットに関する。
【００８８】 キットは第１のプローブ複合体および第２のプローブ複合体を包含する。第１
のプローブ複合体は第２のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされた、標的
ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する第１のポリヌクレオチド配列を有
する。第２のプローブ複合体は標識された第４のポリヌクレオチド配列にハイブ
リダイズされた、第１のプローブ複合体の第２のポリヌクレオチド配列に相補的
な配列を有する第３のポリヌクレオチド配列を有する。
のプローブ複合体は第２のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズされた、標的
ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する第１のポリヌクレオチド配列を有
する。第２のプローブ複合体は標識された第４のポリヌクレオチド配列にハイブ
リダイズされた、第１のプローブ複合体の第２のポリヌクレオチド配列に相補的
な配列を有する第３のポリヌクレオチド配列を有する。
【００８９】 第１の置換複合体は第１のプローブ複合体を標的第３ポリヌクレオチド配列に
接触させることにより形成される。この標的ポリヌクレオチド配列は標的と第１
のポリヌクレオチド配列との間の親和性により、少なくとも１つの第２のポリヌ
クレオチド配列を置換し、第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
第２のポリヌクレオチド配列は置換され、この時点で第１および標的ポリヌクレ
オチド配列との間に形成された複合体から遊離した状態で残る。
接触させることにより形成される。この標的ポリヌクレオチド配列は標的と第１
のポリヌクレオチド配列との間の親和性により、少なくとも１つの第２のポリヌ
クレオチド配列を置換し、第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする。
第２のポリヌクレオチド配列は置換され、この時点で第１および標的ポリヌクレ
オチド配列との間に形成された複合体から遊離した状態で残る。
【００９０】 この置換複合体に引き続き第２の置換複合体の形成が起こる。第２の置換複合
体は、第１の置換反応の生成物である置換された第２のポリヌクレオチド配列に
第２のプローブ複合体を接触させることにより形成される。第３のポリヌクレオ
チド配列がその第４のポリヌクレオチド配列パートナーよりも置換された第２の
ポリヌクレオチド配列に対してより大きな親和性を有すると仮定すれば、少なく
とも１つの第４のポリヌクレオチド配列は置換された第２のポリヌクレオチド配
列により第２のプローブ複合体から競合的に排除される。この置換事象の結果、
新しい複合体が第３と第２のポリヌクレオチド配列の間に形成され、標識された
第４のポリヌクレオチド配列は遊離の状態で残る。この標識された第４のポリヌ
クレオチド配列はこの時点で検出対象となる。
体は、第１の置換反応の生成物である置換された第２のポリヌクレオチド配列に
第２のプローブ複合体を接触させることにより形成される。第３のポリヌクレオ
チド配列がその第４のポリヌクレオチド配列パートナーよりも置換された第２の
ポリヌクレオチド配列に対してより大きな親和性を有すると仮定すれば、少なく
とも１つの第４のポリヌクレオチド配列は置換された第２のポリヌクレオチド配
列により第２のプローブ複合体から競合的に排除される。この置換事象の結果、
新しい複合体が第３と第２のポリヌクレオチド配列の間に形成され、標識された
第４のポリヌクレオチド配列は遊離の状態で残る。この標識された第４のポリヌ
クレオチド配列はこの時点で検出対象となる。
【００９１】 使用される標識は放射性、例えば放射性リン原子でありうる。標識は、またロ
ーダミンのような蛍光標識でありうる。あるいは、ポリヌクレオチドの何れかの
領域において第４のポリヌクレオチド配列に共有結合したビオチンのような親和
性試薬であってもよい。当業者に知られた他の標識物質も同様である。
ーダミンのような蛍光標識でありうる。あるいは、ポリヌクレオチドの何れかの
領域において第４のポリヌクレオチド配列に共有結合したビオチンのような親和
性試薬であってもよい。当業者に知られた他の標識物質も同様である。
【００９２】 本発明の特徴および他の詳細事項は、実施例においてより具体的に記載され、
示されるだろう。本発明の特定の態様を実例によって示すが、本発明を限定する
ものではないことが理解されるだろう。本発明の本質的特徴は本発明の範囲から
逸脱することなく種々の態様において使用することができる。
示されるだろう。本発明の特定の態様を実例によって示すが、本発明を限定する
ものではないことが理解されるだろう。本発明の本質的特徴は本発明の範囲から
逸脱することなく種々の態様において使用することができる。
【００９３】 実施例 実施例１：多重逐次的置換反応によるシグナル増幅 ６個の６０量体ポリヌクレオチド配列を設計して合成した。各ポリヌクレオチ
ド配列は、３個の２０ヌクレオチド配列モチーフの連鎖物（ｃｏｎｃａｔｅｍｅ
ｒ）を形成する３分岐体（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）構造を有する。本実施例の配
列モチーフはＤ，Ｅ，Ｆ，ｃＤ，ｃＥおよびｃＦで表わし、ここで「ｃＸ」とは
「Ｘ」に相補的な配列を指すものとする。表１を参照されたい。６個の６０量体
のうち３個（ポリヌクレオチド配列の５’−アクリルアミド修飾物を示す「Ａｃ
」で表わす）を５’−アクリルアミド修飾物と共に合成し、アクリルアミド単量
体との共重合によりポリアクリルアミドゲル内にポリヌクレオチド配列が固定化
されるようにした。５’−アクリルアミド修飾物はアクリルアミドホスホルアミ
ダイト（ＡｃｒｙｄｉｔｅTMホスホルアミダイト、Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて自動合成の間に添加した。固定化
可能なポリヌクレオチド配列と相補置換（またはシグナル）ポリヌクレオチド配
列は溶液中でハイブリダイズした。これらの置換ポリヌクレオチド配列は置換さ
れた場合、検出することができ、そして、少なくとも１つの試料標的ポリヌクレ
オチド配列を示すシグナルポリヌクレオチド配列（Ｅ−ＣＹ３）を最後に置換す
るのに役立つ。シグナルポリヌクレオチド配列はＣＹ３を用いて標識される。
ド配列は、３個の２０ヌクレオチド配列モチーフの連鎖物（ｃｏｎｃａｔｅｍｅ
ｒ）を形成する３分岐体（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）構造を有する。本実施例の配
列モチーフはＤ，Ｅ，Ｆ，ｃＤ，ｃＥおよびｃＦで表わし、ここで「ｃＸ」とは
「Ｘ」に相補的な配列を指すものとする。表１を参照されたい。６個の６０量体
のうち３個（ポリヌクレオチド配列の５’−アクリルアミド修飾物を示す「Ａｃ
」で表わす）を５’−アクリルアミド修飾物と共に合成し、アクリルアミド単量
体との共重合によりポリアクリルアミドゲル内にポリヌクレオチド配列が固定化
されるようにした。５’−アクリルアミド修飾物はアクリルアミドホスホルアミ
ダイト（ＡｃｒｙｄｉｔｅTMホスホルアミダイト、Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて自動合成の間に添加した。固定化
可能なポリヌクレオチド配列と相補置換（またはシグナル）ポリヌクレオチド配
列は溶液中でハイブリダイズした。これらの置換ポリヌクレオチド配列は置換さ
れた場合、検出することができ、そして、少なくとも１つの試料標的ポリヌクレ
オチド配列を示すシグナルポリヌクレオチド配列（Ｅ−ＣＹ３）を最後に置換す
るのに役立つ。シグナルポリヌクレオチド配列はＣＹ３を用いて標識される。
【００９４】
【表１】
【００９５】 置換（またはシグナル）ポリヌクレオチド配列は、固定化可能なポリヌクレオ
チド配列の配列内部に含まれる全ての利用可能な相補部位の飽和を確実にするよ
うに、ハイブリダイゼーション反応の間に４倍過剰の濃度で存在させた。次に、
個々のスロットに個別に各共重合体を注ぎ込むことにより、前記ポリヌクレオチ
ド配列ハイブリッドをポリアクリルアミドスラブゲル内の層に共重合させた。固
定化された置換複合体の配置をFigure ８ａに示す。本実施例で使用したポリヌ クレオチド配列を表２に列挙する。
チド配列の配列内部に含まれる全ての利用可能な相補部位の飽和を確実にするよ
うに、ハイブリダイゼーション反応の間に４倍過剰の濃度で存在させた。次に、
個々のスロットに個別に各共重合体を注ぎ込むことにより、前記ポリヌクレオチ
ド配列ハイブリッドをポリアクリルアミドスラブゲル内の層に共重合させた。固
定化された置換複合体の配置をFigure ８ａに示す。本実施例で使用したポリヌ クレオチド配列を表２に列挙する。
【００９６】
【表２】
【００９７】 ハイブリダイゼーションは２ｘＴＢＥ（１ｘＴＢＥは８９ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホ
ウ酸塩，ｐＨ８．３，２ｍＭ ＥＤＴＡである）中で２μＭ固定化可能なポリヌ
クレオチド配列および８μＭ置換（またはシグナル）ポリヌクレオチド配列を用
いて実施した。ハイブリダイゼーション反応液を９０℃とし、その後ゆっくり冷
却して４０℃とし、この温度でハイブリダイゼーション反応を更に２時間実施し
た。ハイブリダイゼーションの後、ポリヌクレオチド配列混合物を水中に溶解し
た２４％アクリルアミドと１：１で混合した。過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭ
ＥＤをそれぞれ０．１重量／体積％および０．１体積／体積％となるように添加
した。混合物を予め成形された１２％，１ｘＴＢＥ重合用ポリアクリルアミドゲ
ル内の水平スロット（幅約５ｍｍ、厚さ０．８ｍｍ）中に注ぎ込んだ。
ウ酸塩，ｐＨ８．３，２ｍＭ ＥＤＴＡである）中で２μＭ固定化可能なポリヌ
クレオチド配列および８μＭ置換（またはシグナル）ポリヌクレオチド配列を用
いて実施した。ハイブリダイゼーション反応液を９０℃とし、その後ゆっくり冷
却して４０℃とし、この温度でハイブリダイゼーション反応を更に２時間実施し
た。ハイブリダイゼーションの後、ポリヌクレオチド配列混合物を水中に溶解し
た２４％アクリルアミドと１：１で混合した。過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭ
ＥＤをそれぞれ０．１重量／体積％および０．１体積／体積％となるように添加
した。混合物を予め成形された１２％，１ｘＴＢＥ重合用ポリアクリルアミドゲ
ル内の水平スロット（幅約５ｍｍ、厚さ０．８ｍｍ）中に注ぎ込んだ。
【００９８】 置換層の重合の後、非固定の過剰なシグナルおよび置換ポリヌクレオチド配列
並びに非固定の置換複合体を除去する役割を有する層の長軸に平行な方向に約２
〜５Ｖ／ｃｍの電場勾配で、一晩ゲルを電気泳動に付した。この工程の後、試料
が層の長軸に対して垂直に添加され、それらが逐次的に電気泳動に付すことがで
きるように、ゲルを装置内で再配列した。
並びに非固定の置換複合体を除去する役割を有する層の長軸に平行な方向に約２
〜５Ｖ／ｃｍの電場勾配で、一晩ゲルを電気泳動に付した。この工程の後、試料
が層の長軸に対して垂直に添加され、それらが逐次的に電気泳動に付すことがで
きるように、ゲルを装置内で再配列した。
【００９９】 ゲルは２つのプローブ層の増幅（層１および２）、標識された置換ポリヌクレ
オチド層の発生のためのプローブ（層３）および濃縮されたバンドに標識された
置換ポリヌクレオチドを濃縮するための捕捉層（層４）を含んでいた。（Figure １０ａ参照）。次に３種類の異なるモデル標的ポリヌクレオチド配列、ＥＦＦ 、ＦＤＤおよびＤＥＥの各々２ｐｍｏｌｅをゲルの個別のレーンに添加し、電気
泳動に付した。
オチド層の発生のためのプローブ（層３）および濃縮されたバンドに標識された
置換ポリヌクレオチドを濃縮するための捕捉層（層４）を含んでいた。（Figure １０ａ参照）。次に３種類の異なるモデル標的ポリヌクレオチド配列、ＥＦＦ 、ＦＤＤおよびＤＥＥの各々２ｐｍｏｌｅをゲルの個別のレーンに添加し、電気
泳動に付した。
【０１００】 ポリヌクレオチド配列ＤＥＥ（レーン３）はシグナル変換層（層３）において
のみ相互作用し、これにより標的ポリヌクレオチド配列当たり置換シグナルポリ
ヌクレオチド配列を２つだけ生成した。ＦＤＤポリヌクレオチド配列（レーン２
）は親和性の優先度にもとづき、第２の増幅層（層２）において２分子のＤＥＥ
を置換することが予測され、これは最終的には最初の標的ポリヌクレオチド配列
当たり４つのシグナルポリヌクレオチド配列を置換するだろう。各ＥＦＦポリヌ
クレオチド配列（レーン１）は最初の層から２分子を置換するはずであり、これ
が次に第２の層から４分子を置換し、そしてその後、シグナル変換層から８分子
を置換するだろう。Figure １０ａにおいて、シグナルは最下層（層４）におい てはポジ画像で、その前の層（層３）ではネガ画像で見ることができる。最終層
で得られる実際のシグナルは蛍光スキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃ Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いて定量した。３試料、即ち、ＥＦＦ、ＦＤ
ＤおよびＤＥＥについて捕捉層（層４）から得られた積分蛍光シグナルはそれぞ
れ、１０，４００，０００、２，８００，０００および６１５，０００蛍光単位
であった。ＤＥＥシグナルとの相対値として、観測されたシグナルは１６．９（
ＥＦＦ）：４．５（ＦＤＤ）：１（ＤＥＥ）の比を示し、それぞれ予測された概
略値である４：２：１と量的に合致していた。
のみ相互作用し、これにより標的ポリヌクレオチド配列当たり置換シグナルポリ
ヌクレオチド配列を２つだけ生成した。ＦＤＤポリヌクレオチド配列（レーン２
）は親和性の優先度にもとづき、第２の増幅層（層２）において２分子のＤＥＥ
を置換することが予測され、これは最終的には最初の標的ポリヌクレオチド配列
当たり４つのシグナルポリヌクレオチド配列を置換するだろう。各ＥＦＦポリヌ
クレオチド配列（レーン１）は最初の層から２分子を置換するはずであり、これ
が次に第２の層から４分子を置換し、そしてその後、シグナル変換層から８分子
を置換するだろう。Figure １０ａにおいて、シグナルは最下層（層４）におい てはポジ画像で、その前の層（層３）ではネガ画像で見ることができる。最終層
で得られる実際のシグナルは蛍光スキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃ Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いて定量した。３試料、即ち、ＥＦＦ、ＦＤ
ＤおよびＤＥＥについて捕捉層（層４）から得られた積分蛍光シグナルはそれぞ
れ、１０，４００，０００、２，８００，０００および６１５，０００蛍光単位
であった。ＤＥＥシグナルとの相対値として、観測されたシグナルは１６．９（
ＥＦＦ）：４．５（ＦＤＤ）：１（ＤＥＥ）の比を示し、それぞれ予測された概
略値である４：２：１と量的に合致していた。
【０１０１】 Figure １０ｂは比較分析を行なうことができるように棒グラフの形式で得た データを示す。標的ポリヌクレオチド配列ＥＥＦは実験で最も大きなシグナル応
答を示した。この応答はシグナルの増幅を促進する多重逐次的置換反応の内容と
合致する。ポリヌクレオチド配列ＤＥＥにより示された応答は試験した標的ポリ
ヌクレオチド配列の全てのうちで最も小さかった。ＤＥＥ標的の応答は一段階置
換反応の典型的なものであり、縮小された応答となる。一段階置換事象を用いた
方法は米国特許第４，７６６，０６２号および４，７６６，０６４号に記載され
た。この一段階置換サイクルは、本発明の要件である標的ポリヌクレオチド配列
ＥＦＦおよびＦＤＤに関して観察された多重置換サイクルとは明らかに相違して
いる。
答を示した。この応答はシグナルの増幅を促進する多重逐次的置換反応の内容と
合致する。ポリヌクレオチド配列ＤＥＥにより示された応答は試験した標的ポリ
ヌクレオチド配列の全てのうちで最も小さかった。ＤＥＥ標的の応答は一段階置
換反応の典型的なものであり、縮小された応答となる。一段階置換事象を用いた
方法は米国特許第４，７６６，０６２号および４，７６６，０６４号に記載され
た。この一段階置換サイクルは、本発明の要件である標的ポリヌクレオチド配列
ＥＦＦおよびＦＤＤに関して観察された多重置換サイクルとは明らかに相違して
いる。
【０１０２】 実施例２：電気泳動の間にポリヌクレオチド配列のＴｄを評価するための温度勾
配ゲル電気泳動の使用 以下の実施例は電気泳動条件下の特定の固定化二本鎖（２個のポリヌクレオチ
ド配列よりなるハイブリダイゼーション複合体）のＴｄ（電気泳動時間の間にハ
イブリダイゼーション複合体の５０％が解離する温度）を推定するための温度勾
配ゲルの一般的使用について説明する。デオキシリボ核酸ポリヌクレオチド配列
をホスホルアミダイト合成法により調製し、サイズ排除および／またはイオン交
換クロマトグラフィー、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｏ
ｐｅｒｏｎ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｌ
ｍｅｄａ，ＣＡ）を用いて精製した。使用した固定化されたＤＮＡポリヌクレオ
チド配列の配列は５’−アクリルアミド−ＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＡＴＣＧＴＴ
ＴＴＴＧ−３’（配列番号１４）であった。５’アクリルアミド部分はアクリル
アミドホスホルアミダイト（ＡｃｒｙｄｉｔｅTM、Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて自動合成の間に添加した。標識さ
れた相補ポリヌクレオチド配列は５’−ＣＹ３−ＣＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＡＣ
ＣＡＡＣＣＡ−３’（配列番号１５）であった。
配ゲル電気泳動の使用 以下の実施例は電気泳動条件下の特定の固定化二本鎖（２個のポリヌクレオチ
ド配列よりなるハイブリダイゼーション複合体）のＴｄ（電気泳動時間の間にハ
イブリダイゼーション複合体の５０％が解離する温度）を推定するための温度勾
配ゲルの一般的使用について説明する。デオキシリボ核酸ポリヌクレオチド配列
をホスホルアミダイト合成法により調製し、サイズ排除および／またはイオン交
換クロマトグラフィー、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｏ
ｐｅｒｏｎ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｌ
ｍｅｄａ，ＣＡ）を用いて精製した。使用した固定化されたＤＮＡポリヌクレオ
チド配列の配列は５’−アクリルアミド−ＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＡＴＣＧＴＴ
ＴＴＴＧ−３’（配列番号１４）であった。５’アクリルアミド部分はアクリル
アミドホスホルアミダイト（ＡｃｒｙｄｉｔｅTM、Ｍｏｓａｉｃ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて自動合成の間に添加した。標識さ
れた相補ポリヌクレオチド配列は５’−ＣＹ３−ＣＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＡＣ
ＣＡＡＣＣＡ−３’（配列番号１５）であった。
【０１０３】 ポリアクリルアミドゲル（２２ｃｍ×１６．５ｃｍ×０．７５ｃｍ）を調製し
、全て１ｘＴＢＥの入った３セクションに注ぎ込んだ。アクリルアミド（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）の濃度は１２％（単量体：ビス体の重量比＝２９：１）であった。上部
および底部セクションはポリヌクレオチド配列を含まず、中央のセクション（総
量１ｍＬ）は３μＭの固定化ポリヌクレオチド配列を含有した。１／１００倍容
量の１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）および１／１０００倍容量のＴＥＭＥ
Ｄを添加することにより重合を触媒した。平滑な層を確実にするように、重合中
、底部および中央の層に１００％エタノールを積層した。シングルアップライト
型の電気泳動装置（ＣＢＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にゲルを組み込んだ。
、全て１ｘＴＢＥの入った３セクションに注ぎ込んだ。アクリルアミド（Ｂｉｏ
Ｒａｄ）の濃度は１２％（単量体：ビス体の重量比＝２９：１）であった。上部
および底部セクションはポリヌクレオチド配列を含まず、中央のセクション（総
量１ｍＬ）は３μＭの固定化ポリヌクレオチド配列を含有した。１／１００倍容
量の１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）および１／１０００倍容量のＴＥＭＥ
Ｄを添加することにより重合を触媒した。平滑な層を確実にするように、重合中
、底部および中央の層に１００％エタノールを積層した。シングルアップライト
型の電気泳動装置（ＣＢＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にゲルを組み込んだ。
【０１０４】 アルミニウムブロックをガラスプレートにクランプし、それを介して低温と高
温の水を両末端に循環させることにより、ゲルを横切る３５℃から６５℃までの
温度勾配を確立した。次いで、得られた温度勾配は、サーミスタでゲルの各ウエ
ルにおける温度を読み取ることにより測定し、ゲルの中央部まで直線状であるこ
とが解かった（Figure １１ａ参照）。
温の水を両末端に循環させることにより、ゲルを横切る３５℃から６５℃までの
温度勾配を確立した。次いで、得られた温度勾配は、サーミスタでゲルの各ウエ
ルにおける温度を読み取ることにより測定し、ゲルの中央部まで直線状であるこ
とが解かった（Figure １１ａ参照）。
【０１０５】 標的ポリヌクレオチド配列をゲル添加緩衝液（８％スクロース、１ｘＴＢＥ、
ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）中に希釈し、等量（約５ｐ
ｍｏｌ）を各レーンに添加した。電気泳動は約１時間１５０Ｖで実施した。
ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）中に希釈し、等量（約５ｐ
ｍｏｌ）を各レーンに添加した。電気泳動は約１時間１５０Ｖで実施した。
【０１０６】 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ上でゲルを
走査することにより画像を得た。画像を蛍光分析することにより、位置、即ち標
識ポリヌクレオチド配列の５０％が捕捉層から失われる温度が測定できる。この
温度がｔａ即ち電気泳動に用いた時間におけるポリヌクレオチド配列ハイブリッ
ドのＴｄを示す。（Ｆｉｇｕｒｅ １１ｂ参照）。
走査することにより画像を得た。画像を蛍光分析することにより、位置、即ち標
識ポリヌクレオチド配列の５０％が捕捉層から失われる温度が測定できる。この
温度がｔａ即ち電気泳動に用いた時間におけるポリヌクレオチド配列ハイブリッ
ドのＴｄを示す。（Ｆｉｇｕｒｅ １１ｂ参照）。
【０１０７】 均等物 本発明を具体的に示し、その好ましい態様を参照して記述したが、添付の請求
項に規定された本発明の意図と範囲からはずれることなく、形態や詳細事項にお
いて種々の変更がなしうることを、当業者は理解するだろう。
項に規定された本発明の意図と範囲からはずれることなく、形態や詳細事項にお
いて種々の変更がなしうることを、当業者は理解するだろう。
【図１】 ＦＩＧ．１ａは本発明で使用されるポリヌクレオチドの模式図である。
【図２】 ＦＩＧ．１ｂは本発明で使用されるポリヌクレオチドの模式図である。
【図３】 ＦＩＧ．１ｃは本発明で使用されるポリヌクレオチドの模式図である。
【図４】 ＦＩＧ．２は置換ポリヌクレオチド配列の発生を伴う逐次的プローブおよび置
換複合体の形成の図である。
換複合体の形成の図である。
【図５】 ＦＩＧ．３はアッセイシグナルの増幅を伴う逐次的プローブおよび置換複合体
の形成の図である。
の形成の図である。
【図６】 ＦＩＧ．４は標的ポリヌクレオチド配列の発生を伴う逐次的プローブおよび置
換複合体の形成を用いた反復サイクルの図である。
換複合体の形成を用いた反復サイクルの図である。
【図７】 ＦＩＧ．５は標的ポリヌクレオチド配列の発生を伴う逐次的プローブおよび置
換複合体の形成を用いたアッセイシグナルの獲得および増幅を伴う反復サイクル
の図である。
換複合体の形成を用いたアッセイシグナルの獲得および増幅を伴う反復サイクル
の図である。
【図８】 ＦＩＧ．６は異種アッセイシグナルを発生させる逐次的プローブおよび置換複
合体の形成の図である。
合体の形成の図である。
【図９】 ＦＩＧ．７は逐次的プローブおよび置換複合体の形成を用いた１セットの多数
の異種標的ポリヌクレオチド配列が、同種アッセイシグナルを発生させる分析の
図である。
の異種標的ポリヌクレオチド配列が、同種アッセイシグナルを発生させる分析の
図である。
【図１０】 ＦＩＧ．８は固定化されたポリヌクレオチド配列を用いた多重逐次的置換反応
の模式図である。
の模式図である。
【図１１】 ＦＩＧ．９はゲル等の固体支持体マトリックスを用いた多重逐次的置換反応の
模式図である。
模式図である。
【図１２】 ＦＩＧ．１０ａは多重逐次的置換反応の結果を示すポリアクリルアミドゲルで
あり、ポリヌクレオチド配列複合体を示す棒線画も示している。
あり、ポリヌクレオチド配列複合体を示す棒線画も示している。
【図１３】 ＦＩＧ．１０ｂは多重逐次的置換反応について得られたデータの棒グラフであ
る。
る。
【図１４】 ＦＩＧ．１１ａは温度勾配ゲル電気泳動装置の模式図である。
【図１５】 ＦＩＧ．１１ｂは温度勾配ゲル電気泳動を行うことにより得られた蛍光走査図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ボールズ，ティー．，クリスチャン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02451 ワルタム，ジュディス レーン ナンバーシックス ５ (72)発明者 ミュア，アンドリュー，アール． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02025 コーハセット，イェルサレム ロ ード 481 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA14 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ08 QQ42 QQ52 QR32 QR56 QR82 QS11 QS16 QS34 QS36 QX01 QX02 QX04 QX07 QX10
Claims (46)
- 【請求項１】 （ａ）第１及び第２のポリヌクレオチド配列間のハイブリダ
イゼーションに適した条件下に、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含
有した第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列とを接触させ
ることにより、第１のプローブ複合体を形成させ、それにより第１のプローブ複
合体を形成するステップ； （ｂ）標的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド配
列と置換し、かつ第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするのに適した
条件下に、（ａ）の複合体と第１のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有
した標的ポリヌクレオチド配列とを接触させることにより第１の置換複合体を形
成させ、それにより第１の置換複合体を形成するステップ； （ｃ）第４及び第５のポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションに適し
た条件下に、置換された第２のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有した
第４のポリヌクレオチド配列と第５のポリヌクレオチド配列とを接触させること
により第２のプローブ複合体を形成させ、それにより第２のプローブ複合体を形
成するステップ； （ｄ）（ｂ）の置換された第２のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの（ｃ
）の第５のポリヌクレオチド配列と置換し、かつ（ｃ）の第４のポリヌクレオチ
ド配列にハイブリダイズするのに適した条件下に、（ｂ）の置換された第２のポ
リヌクレオチド配列と（ｃ）の第２のプローブ複合体とを接触させることにより
、第２の置換複合体を形成するステップ； を含み、それにより少なくとも１つのシグナルを生成する、遊離した第５のポリ
ヌクレオチド配列を生産し、ここでシグナルの検出が生体試料中における標的ポ
リヌクレオチド配列の存在の指標である、 シグナル生成のための多重逐次的ポリヌクレオチド置換を含有した生体試料中の
標的ポリヌクレオチド配列の検出方法。 - 【請求項２】 該第２及び第４のポリヌクレオチド配列が、同じ配列を有す
る多数の繰り返し単位を含み、該多数の繰り返し単位が該第２及び第４のポリヌ
クレオチド配列間で相補的であり、かつ該第５のポリヌクレオチド配列が該第２
のポリヌクレオチド配列の繰り返し単位の少なくとも１つと実質的に同一であり
、それにより試料内の標的ポリヌクレオチド配列あたりの多数の遊離した第５の
ポリヌクレオチド配列を介して多数のシグナルを生成する、請求項１記載の方法
。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの領域が
約５〜約１０００ヌクレオチド長である、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 該シグナルを検出するモードが、質量または密度測定、質量
分析、プラズモン吸収、光学発光または吸収、蛍光、リン光、ルミネセンス、ケ
ミルミネセンス、分極、屈折率変化、電気伝導率、放射活性、粘度、濁度および
旋光度からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 アッセイが並行して行なわれ、１つのアッセイにおいて、標
的ポリヌクレオチド配列が存在せず、第２の並行アッセイにおいて、標的ポリヌ
クレオチド配列が存在し、標的ポリヌクレオチド配列無しのアッセイで得られた
シグナルが、標的ポリヌクレオチド配列を含むアッセイから得られたシグナルデ
ータを標準化するために用いられうる、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 （ａ）第１及び第２のポリヌクレオチド配列間のハイブリダ
イゼーションに適した条件下に、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含
有した第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列とを接触させ
ることにより第１のプローブ複合体を形成させ、それにより第１のプローブ複合
体を形成するステップ； （ｂ）標的の第３のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの第２のポリヌクレ
オチド配列を置換し、かつ該第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする
のに適した条件下に、（ａ）の産物と標的の第３のポリヌクレオチド配列とを接
触させることにより第１の置換複合体を形成させ、それにより第１の置換複合体
を形成するステップ； （ｃ）第４及び第５のポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションに適し
た条件下に、第２のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有した第４のポリ
ヌクレオチド配列と該標的の第３のポリヌクレオチド配列に部分的に同一な配列
を含有した第５のポリヌクレオチド配列とを接触させることにより第２のプロー
ブ複合体を形成させ、それにより第２のプローブ複合体を形成するステップ； （ｄ）（ｂ）の置換された第２のポリヌクレオチド配列と（ｃ）の産物とを、（
ｂ）の置換された第２のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの（ｃ）の第５
のポリヌクレオチド配列を置換し、かつ（ｃ）の該第４のポリヌクレオチド配列
にハイブリダイズするのに適した条件下に接触させることにより、第２の置換複
合体を形成させ、それにより第２の置換複合体を形成するステップ； （ｅ）置換された第５のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有した第６の
ポリヌクレオチド配列と標的ポリヌクレオチド配列に実質的に同一な配列を含有
した第７ポリヌクレオチド配列とを、該第６及び第７のポリヌクレオチド配列間
のハイブリダイゼーションに適した条件下に接触させることにより第３のプロー
ブ複合体を形成させ、それにより第３のプローブ複合体を形成するステップ；並
びに （ｆ）（ｄ）の置換された第５のポリヌクレオチド配列と（ｅ）の産物とを、（
ｄ）の該置換された第５のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの（ｅ）の該
第７のポリヌクレオチド配列を置換し、かつ（ｅ）の該第６のポリヌクレオチド
配列にハイブリダイズするのに適した条件下に接触させることにより第３の置換
複合体を形成させるステップ を含み、それにより少なくとも１つのシグナルを生成する第７のポリヌクレオチ
ド配列を遊離し、かつシグナルの検出が生体試料中の標的ポリヌクレオチド配列
の存在の指標である、 シグナル生成のための多重逐次的ポリヌクレオチド置換を含有した循環サイクル
を用いる、生体試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検出方法。 - 【請求項７】 ポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの領域が
約５〜約１０００ヌクレオチド長である、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 該シグナルの検出のモードが、質量または密度測定、質量分
析、プラズモン吸収、光学発光または吸収、蛍光、リン光、ルミネセンス、ケミ
ルミネセンス、分極、屈折率変化、電気伝導率、放射活性、粘度、濁度および旋
光度からなる群より選ばれる、請求項６記載の方法。 - 【請求項９】 （ａ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有した
第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド配列とを、ハイブリダイ
ゼーションに適した条件下に接触させることによりプローブ複合体を形成させ、
それによりプローブ複合体を形成するステップ； （ｂ）標的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド配
列を置換し、かつ第１のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするのに適した
条件下に、（ａ）の複合体と第１のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有
した標的ポリヌクレオチド配列とを接触させることにより置換複合体を形成させ
、それにより置換複合体を形成するステップ； （ｃ）第４のポリヌクレオチド配列と第５及び第６のポリヌクレオチド配列との
間のハイブリダイゼーションに適した条件下に、置換された第２のポリヌクレオ
チド配列に相補的な配列を含有した第４のポリヌクレオチド配列と第５及び第６
のポリヌクレオチド配列を含有した異質のポリヌクレオチド配列のセットとを接
触させることにより異質のプローブ複合体を形成させ、それにより異質のプロー
ブ複合体を形成するステップ；並びに （ｄ）（ｂ）の置換された第２のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの（ｃ
）の該第５のポリヌクレオチド配列および少なくとも１つの（ｃ）の第６のポリ
ヌクレオチド配列を置換し、かつ（ｃ）の該第４のポリヌクレオチド配列にハイ
ブリダイズするのに適した条件下に、（ｂ）の置換された第２のポリヌクレオチ
ド配列と（ｃ）の複合体とを接触させることにより異質の置換複合体を形成させ
るステップ を含み、それにより検出に供する少なくとも２つのシグナルを生成する第５及び
第６のポリヌクレオチド配列を遊離し、かつ該シグナルの少なくとも１つの検出
が生体試料における標的ポリヌクレオチド配列の存在の指標である、 多重逐次的ポリヌクレオチド置換を含有した多数のシグナルを生成するための異
質なポリヌクレオチド配列を用いる生体試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検
出方法。 - 【請求項１０】 （ｅ）ハイブリダイゼーションに適した条件下に、ステッ
プ（ｄ）の第５及び第６の置換されたポリヌクレオチド配列に相補的な配列と該
第５及び第６のポリヌクレオチド配列の相補的な配列に部分的に相補的な配列を
含有したポリヌクレオチド配列とを接触させることにより多数のプローブ複合体
を形成させ、それにより多数の置換複合体を形成するステップ；並びに （ｆ）置換及びハイブリダイゼーションに適した条件下に、（ｅ）の多数のプロ
ーブ複合体と（ｄ）の該第５及び第６の置換されたポリヌクレオチド配列とを接
触させることにより多数の置換複合体を形成させるステップ をさらに含み、それにより検出に供する多数のシグナルを生成する２以上の置換
ポリヌクレオチド配列を遊離し、かつこれらの少なくとも１つの検出が生体試料
中の標的ポリヌクレオチド配列の存在の指標である、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 ステップ（ｃ）において、該第４のポリヌクレオチド配列
の別の部位で該第４のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする３以上の異質
なポリヌクレオチド配列のセットが存在し、かつ該第４のポリヌクレオチド配列
にハイブリダイズしたこれらの異質なポリヌクレオチド配列が、ステップ（ｂ）
の該第２のポリヌクレオチド配列により続いて置換されるものであり、それによ
り第４のポリヌクレオチド配列からのこれらの異質なポリヌクレオチド配列の置
換から生じたアッセイシグナルを増幅させ、かつこれらのシグナルの少なくとも
１つの検出が生体試料中の標的ポリヌクレオチド配列の存在の指標である、請求
項９記載の方法。 - 【請求項１２】 ポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの領域
が、約５〜約１０００ヌクレオチド長である、請求項９記載の方法。 - 【請求項１３】 該シグナルの検出のモードが、質量または密度測定、質量
分析、プラズモン吸収、光学発光または吸収、蛍光、リン光、ルミネセンス、ケ
ミルミネセンス、分極、屈折率変化、電気伝導率、放射活性、粘度、濁度および
旋光度からなる群より選ばれる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１４】 （ａ）（ｉ）ハイブリダイゼーションに適した条件下に、
標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有した第１のポリヌクレオチド配
列と第２のポリヌクレオチド配列とを接触させ、それにより第１のプローブ複合
体を形成するステップ； （ii）全数または所望の数のプローブ複合体が試料中の所定の標的ポリヌクレオ
チド配列の全数または所望の数に対して形成されるまで（ｉ）を繰り返し、それ
により第１のプローブ複合体のセットを形成するステップ、ここで使用されるこ
とが望まれる第２のポリヌクレオチド配列の全てが、それらの間で、少なくとも
１つの実質的に同一のポリヌクレオチド配列領域を有するものである を含む、第１のプローブ複合体のセットを形成するステップ； （ｂ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの（ａ）の第２のポリ
ヌクレオチド配列を置換し、かつ（ａ）の該第１のポリヌクレオチド配列にハイ
ブリダイズするのに適した条件下に、（ａ）の複合体とそれらの各標的ポリヌク
レオチド配列とを接触させ、それにより第１の置換複合体を形成するステップ；
及び （ii）全ての置換複合体が形成されるまで、（ｉ）を繰り返し、それにより第１
の置換複合体のセットを形成させるステップ； （ｃ）第４及び第５のポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションに適し
た条件下に、第２のポリヌクレオチド配列内の配列領域に部分的にまたは完全に
相補的な配列を含有した第４のポリヌクレオチド配列と第５のポリヌクレオチド
配列とを接触させることにより第２のプローブ複合体を形成させ、それにより第
２のプローブ複合体を形成するステップ；ならびに （ｄ）（ｂ）の置換された第２のポリヌクレオチド配列が少なくとも１つの（ｃ
）の第５のポリヌクレオチド配列を置換し、（ｃ）の第４のポリヌクレオチド配
列にハイブリダイズするのに適した条件下に、（ｂ）の置換された第２のポリヌ
クレオチド配列と（ｃ）の複合体とを接触させることにより第２の置換複合体を
形成させ、それにより第２の置換複合体を形成するステップ； を含み、それにより２以上の異質な標的ポリヌクレオチド配列に対する少なくと
も１つのシグナルを生成する均質な第５のポリヌクレオチド配列を遊離し、かつ
該シグナルの検出が生体試料中の少なくとも１つの異質な標的ポリヌクレオチド
配列の存在の指標である、 シグナル生成のための多重逐次的ポリヌクレオチド置換を含有した、生体試料中
の２以上の異質な標的ポリヌクレオチド配列の検出方法。 - 【請求項１５】 ポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの領域
が約５〜約１０００ヌクレオチド長である、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 該シグナルの検出のモードが、質量または密度測定、質量
分析、プラズモン吸収、光学発光または吸収、蛍光、リン光、ルミネセンス、ケ
ミルミネセンス、分極、屈折率変化、電気伝導率、放射活性、粘度、濁度および
旋光度からなる群より選ばれる、請求項１４記載の方法。 - 【請求項１７】 （ａ）標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有し
たポリヌクレオチド配列を含有した第１のポリヌクレオチドプローブを第１の表
面に固定化するステップ； （ｂ）第１及び第２のポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションに適し
た条件下に、第２のヌクレオチドと固定化プローブとを接触させ、それにより固
定化プローブ複合体を形成させる、第１及び第２のポリヌクレオチド配列のハイ
ブリダイゼーションにより形成された複合体が固定化されたものである第１の固
定化プローブ複合体を形成するステップ； （ｃ）（ａ）の該固定化複合体と標的ポリヌクレオチド配列とを、該標的ポリヌ
クレオチド配列が（ａ）の該固定化複合体由来の少なくとも１つの第２のポリヌ
クレオチド配列を置換し、かつ（ａ）の該固定化複合体の該第１のポリヌクレオ
チド配列にハイブリダイズするのに適した条件下に接触させ、それにより第１の
固定化置換複合体を形成する、第１の固定化置換複合体を形成するステップ； （ｄ）該第１の表面から該置換された第２のポリヌクレオチド配列を第２の表面
に移送させるステップ； （ｅ）第４及び第５のポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションに適し
た条件下に、該第２のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有した第４のポ
リヌクレオチド配列と第５のヌクレオチドとを接触させ、それにより第２の固定
化置換複合体を形成させる、第４及び第５のポリヌクレオチド配列のハイブリダ
イゼーションにより形成された複合体が、第４のポリヌクレオチド配列を含む分
子を介して（ｃ）の該第２の表面に固定化されたものである第２の固定化プロー
ブ複合体を形成するステップ；ならびに （ｆ）第２のポリヌクレオチド配列が（ｄ）の該固定化複合体由来の少なくとも
１つの該第５のポリヌクレオチド配列を置換し、かつ（ｄ）の該固定化複合体の
該第４のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするのに適した条件下に、（ｄ
）の該固定化複合体と該第２のポリヌクレオチド配列とを接触させることにより
第２の固定化置換複合体を形成するステップ を含み、それにより少なくとも１つのシグナルを生成する第５のポリヌクレオチ
ド配列を遊離し、ここで、シグナルの検出が固定化プローブを用いる生体試料中
の標的ポリヌクレオチド配列の存在の指標である、 シグナル生成のための多重逐次的ポリヌクレオチド置換を含有した、固定化プロ
ーブを用いる、生体試料中の標的ポリヌクレオチド配列の検出方法。 - 【請求項１８】 ポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの領域
が約５〜約１０００ヌクレオチド長である、請求項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 該シグナルの検出のモードが、質量または密度測定、質量
分析、プラズモン吸収、光学発光または吸収、蛍光、リン光、ルミネセンス、ケ
ミルミネセンス、分極、屈折率変化、電気伝導率、放射活性、粘度、濁度および
旋光度からなる群より選ばれる、請求項１７記載の方法。 - 【請求項２０】 ３つ以上の表面がある、請求項１７記載の方法。
- 【請求項２１】 （ｆ）ステップ（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返し、
ここで、適切なポリヌクレオチド配列を用いて、置換および移送のさらなるサイ
クルを行うステップ をさらに含む、請求項２０記載の方法。 - 【請求項２２】 第１の表面から第２の表面への該移送のための手段が、ピ
ペッティング、向流分配、重力流動、電気誘導内方浸透流動、湿潤、毛細管作用
、送液媒介流動、電気泳動、クロマトグラフィー、濾過、遠心分離およびデカン
テーションからなる群より選択される、請求項１７記載の方法。 - 【請求項２３】 ポリヌクレオチド配列複合体の固定化手段が、吸着、共有
結合、イオン結合および／またはアフィニティーリガンド複合体を含む、請求項
１７記載の方法。 - 【請求項２４】 該固定化ポリヌクレオチド配列が共有結合的にそのアクリ
ルアミド部分に付着してなる、請求項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 該固定化プローブ複合体のポリヌクレオチド配列が同一平
面的に（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）アフィニティーリガンドに連結され、該
アフィニティーリガンドが、それ自身が同一平面的に（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ
ｌｙ）磁性粒子複合体を形成する磁性粒子に連結されるその同族受容体と相互作
用するものであり、該磁性粒子複合体を含む表面に磁場を適用する場合、該磁性
粒子が、該表面に固定化され、それにより全磁性粒子複合体を固定化する、請求
項２３記載の方法。 - 【請求項２６】 該表面が、同一平面的に、かつサイズ選択的隔壁または膜
により分離される、請求項２０記載の方法。 - 【請求項２７】 該サイズ選択的隔壁または膜が、適切なサイズを有する置
換ポリヌクレオチド配列の、該サイズ選択的隔壁または膜を介した一方の表面か
ら隣接した表面への移送のみをさせる、請求項２６記載の方法。 - 【請求項２８】 該移送が、拡散、送液媒介流動、重力流動、電気誘導内方
浸透流動、湿潤、毛細管作用および電気泳動からなる群から選択されたいずれか
の手段により達成される、請求項２７記載の方法。 - 【請求項２９】 該表面が、固体支持体マトリックスを含有する、請求項１
７記載の方法。 - 【請求項３０】 多数の反応ステーションがマトリックス内に空間的に配置
され、かつ１つの反応ステーション中の置換複合体由来の生成した置換ポリヌク
レオチド配列がマトリックスを介して移動するか、または機械的な手段により移
送され、それにより１つのステーションから次のステーションへの置換産物の移
送を行なう、請求項２９記載の方法。 - 【請求項３１】 マトリックスを介した該移動が、重力流動、電気泳動、電
気誘導内方浸透流動、湿潤、毛細管作用および送液流動により促進される、請求
項３０記載の方法。 - 【請求項３２】 該機械的移送が、ピペッティングにより促進される、請求
項３０記載の方法。 - 【請求項３３】 固体支持体が、クロマトグラフィー支持体、薄層プレート
および膜、ポリアクリルアミドゲル、スターチゲル、アガロースゲルおよび他の
重合ゲルからなる群より選択される、請求項３０記載の方法。 - 【請求項３４】 （ａ）第１及び第２のポリヌクレオチド配列間のハイブリ
ダイゼーションに適した条件下に、標的ポリヌクレオチド配列に部分的にまたは
全体的に相補的な配列を含有した第１のポリヌクレオチド配列に結合したアクリ
ルアミド部分を含有した第１のポリヌクレオチド配列と第２のポリヌクレオチド
配列とを接触させ、それにより第１のプローブ複合体を形成するステップを含む
、第１のプローブ複合体を形成するステップ；ならびに （ｂ）（ａ）の該第２のポリヌクレオチド配列に部分的にまたは全体的に相補的
な配列を含有した第３のポリヌクレオチド配列に結合したアクリルアミド部分を
含有した第３のポリヌクレオチド配列と第４のポリヌクレオチド配列とを、該第
３及び第４のポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションに適した条件下
に接触させ、それにより第２の置換複合体を形成するステップを含む、第２のプ
ローブ複合体を形成するステップ；ならびに （ｃ）第４のポリヌクレオチド配列に部分的にまたは全体的に相補的な配列を含
有した第５のポリヌクレオチド配列に結合したアクリルアミド部分を含有した第
５のポリヌクレオチド配列と標識化第６のポリヌクレオチド配列とを、該第５及
び標識化第６のポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションに適した条件
下に接触させ、それにより第３の置換複合体を形成するステップを含む、第３の
プローブ複合体を形成するステップ；ならびに （ｄ）共重合に適した条件下に、（ａ）〜（ｃ）の独立した複合体を個々にポリ
アクリルアミドと接触させることによりポリアクリルアミド固体支持体マトリッ
クスを用いて固定化プローブ複合体層を形成するステップ、ここで、共重合は、
該アクリルアミド部分とポリアクリルアミドとを含有した置換複合体の１方の種
間に起こり、共重合産物が、ついで予め成型されたポリアクリルアミドゲル内の
各水平スロットに注がれる、それにより共重合複合体の独立した層を形成させ、
標的試料ウェルに最も近接した複合体である（ａ）からポリアクリルアミド支持
体マトリックス内の最も遠位にある（ｃ）の順に形成される、 （ｅ）電場グラジェントをポリアクリルアミドゲルにかけ、電気泳動を行ない、
それによりポリアクリルアミド固体支持体マトリックスからポリヌクレオチド配
列の全ての非固定化種を除去することにより、非固定化第１のポリヌクレオチド
配列と過剰の第２のポリヌクレオチド配列とを除去するステップ； （ｆ）試料標的ポリヌクレオチド配列が置換複合体層の長軸に垂直にかけられる
よう、ポリアクリルアミドゲルを再配置し、電場グラジェントを該ポリアクリル
アミドゲルにかけ、それにより置換層を順に介して該試料標的ポリヌクレオチド
配列の縦軸での電気泳動を促進することにより、標的ポリヌクレオチド配列また
は標的ポリヌクレオチド配列のセットの解析を行なうステップ を含み、それにより多重逐次的ポリヌクレオチド置換を生成する、ここで、遊離
した標識化第６のポリヌクレオチド配列からの少なくとも１つのシグナルを検出
に供し、かつ少なくとも１つのシグナルがアッセイされた少なくとも１つの標的
ポリヌクレオチド配列の指標である、 シグナル生成のための多重逐次的ポリヌクレオチド置換を含有した固定化ポリヌ
クレオチド配列を用いる多重逐次的置換反応によるシグナル生成方法。 - 【請求項３５】 該アクリルアミド部分が、修飾ポリヌクレオチド配列の５
’末端に共有結合的に付着される、請求項３４記載の方法。 - 【請求項３６】 該アクリルアミド部分が、修飾ポリヌクレオチド配列のい
かなる領域にも共有結合的に付着される、請求項３４記載の方法。 - 【請求項３７】 第６のポリヌクレオチド配列から生成した該シグナルを蛍
光スキャナーを用いて検出する、請求項３４記載の方法。 - 【請求項３８】 （ｉ）第２のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズした
、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有した第１のポリヌクレオチド
配列を含有した第１のプローブ複合体、ならびに （ii）（ｉ）の該第２のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を含有し、標識化
第４のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズした、第３のポリヌクレオチド配
列を含有した第２のプローブ複合体 を含有してなる、生体試料内の標的ポリヌクレオチド配列の有無を決定するため
の診断用キット。 - 【請求項３９】 ポリヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションの領域
が、約５〜約１０００ヌクレオチド長である、請求項３８記載の診断用キット。 - 【請求項４０】 シグナルの検出モードが、質量または密度測定、質量分析
、プラズモン吸収、光学発光または吸収、蛍光、リン光、ルミネセンス、ケミル
ミネセンス、分極、屈折率変化、電気伝導率、放射活性、粘度、濁度および旋光
度からなる群より選ばれるものである、請求項３８記載の診断用キット。 - 【請求項４１】 該標識化第４のポリヌクレオチド配列が、光発光または吸
収により検出可能である部分に結合されてなる、請求項３８記載の診断用キット
。 - 【請求項４２】 該標識が、放射活性標識である、請求項３８記載の診断用
キット。 - 【請求項４３】 該標識が、蛍光標識である、請求項３８記載の診断用キッ
ト。 - 【請求項４４】 該第４のポリヌクレオチド配列が、アフィニティー試薬標
識に結合されてなる、請求項３８記載の診断用キット。 - 【請求項４５】 アフィニティー試薬が、ビオチンである、請求項４４記載
の診断用キット。 - 【請求項４６】 配列番号：１〜１５およびその組み合わせからなる群より
選択されたヌクレオチド配列を含有してなる単離核酸分子であって、該核酸分子
のいかなる領域にも共有結合的に結合したアクリルアミド部分を有してなる単離
核酸分子。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6466797P | 1997-11-06 | 1997-11-06 | |
| US60/064,667 | 1997-11-06 | ||
| PCT/US1998/023634 WO1999024612A2 (en) | 1997-11-06 | 1998-11-06 | Multiple sequential polynucleotide displacement reactions for signal amplification and processing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002505846A true JP2002505846A (ja) | 2002-02-26 |
Family
ID=22057494
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000519604A Pending JP2002505846A (ja) | 1997-11-06 | 1998-11-06 | シグナル増幅およびプロセッシングのための多重逐次的ポリヌクレオチド置換反応 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6255051B1 (ja) |
| EP (1) | EP1027458A2 (ja) |
| JP (1) | JP2002505846A (ja) |
| AU (1) | AU1384299A (ja) |
| CA (1) | CA2309384A1 (ja) |
| WO (1) | WO1999024612A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022529247A (ja) * | 2019-03-26 | 2022-06-20 | ナノベリー リミテッド | 装置、システム及び方法 |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6412799A (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-26 | Mosaic Technologies | Reverse displacement assay for detection of nucleic acid sequences |
| WO2001006008A2 (en) * | 1999-07-16 | 2001-01-25 | Aclara Biosciences, Inc. | Multiplexed strand displacement for nucleic acid determinations |
| US7407746B2 (en) * | 2001-02-08 | 2008-08-05 | Ngk Insulators, Ltd. | Biochip and method for producing the same |
| AU2003206401A1 (en) * | 2002-01-08 | 2003-07-24 | Integrated Nano-Technologies, Llc | Method for detecting nucleic acid molecules based on the relative movement of surfaces |
| US7514270B2 (en) | 2002-04-12 | 2009-04-07 | Instrumentation Laboratory Company | Immunoassay probe |
| US7005265B1 (en) | 2002-06-20 | 2006-02-28 | Wenhong Fan | Nonenzymatic catalytic signal amplification for nucleic acid hybridization assays |
| WO2005106031A1 (ja) * | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | ハイブリダイゼーション方法 |
| US8211386B2 (en) | 2004-06-08 | 2012-07-03 | Biokit, S.A. | Tapered cuvette and method of collecting magnetic particles |
| WO2008007359A2 (en) * | 2006-07-09 | 2008-01-17 | Infigo Diagnostics Ltd. | Rapid diagnostic devices based on molecular imprinted polymers |
| GB201510850D0 (en) | 2015-06-19 | 2015-08-05 | Cambridge Molecular Diagnositcs Ltd | Nucleic acid amplification and detection assays |
| JOP20190104A1 (ar) * | 2016-11-10 | 2019-05-07 | Ionis Pharmaceuticals Inc | مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3 |
| KR20180072480A (ko) * | 2016-12-21 | 2018-06-29 | 한국생명공학연구원 | 자가 형광 신호 증폭이 가능한 마이크로 rna 검출용 바이오 프로브 세트 및 이의 용도 |
| CN112189053B (zh) | 2018-05-09 | 2024-05-14 | Ionis制药公司 | 用于减少atxn3表达的化合物和方法 |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4766062A (en) | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor |
| US4766064A (en) | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit |
| US4725536A (en) * | 1985-09-19 | 1988-02-16 | Genetics Institute, Inc. | Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods |
| AU6834187A (en) | 1985-12-17 | 1987-07-15 | Genetics Institute Inc. | Displacement polynucleotide method and reagent complex |
| US5034428A (en) | 1986-06-19 | 1991-07-23 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Immobilized biomolecules and method of making same |
| US4829098A (en) | 1986-06-19 | 1989-05-09 | Washington Research Foundation | Immobilized biomolecules and method of making same |
| US5310650A (en) | 1986-09-29 | 1994-05-10 | Abbott Laboratoires | Method and device for improved reaction kinetics in nucleic acid hybridizations |
| EP0269764B1 (en) * | 1986-12-01 | 1991-08-28 | Molecular Biosystems, Inc. | Method for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays |
| ATE95246T1 (de) | 1988-02-26 | 1993-10-15 | Profile Diagnostic Sciences | Methode zur bestimmung genetischer sequenzen und testsatz hierfuer. |
| DE3856224T2 (de) | 1988-09-29 | 1998-12-03 | Chiron Corp., Emeryville, Calif. | Nachweis eines Polynukleotids durch Ersätzung einer Kette an einer Fangsonde |
| CA2006845C (en) | 1988-12-29 | 1998-08-25 | Joong M. Cho | Expression of proteinaceous sweeteners in yeast |
| US5237016A (en) | 1989-01-05 | 1993-08-17 | Siska Diagnostics, Inc. | End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids |
| JPH0347097A (ja) | 1989-07-13 | 1991-02-28 | Hitachi Ltd | ハイブリダイゼーション方法、これを用いた遺伝子変異検出方法及びその装置 |
| US5215882A (en) | 1989-11-30 | 1993-06-01 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Method of immobilizing nucleic acid on a solid surface for use in nucleic acid hybridization assays |
| DE69030672T2 (de) | 1989-12-04 | 1997-11-13 | Microprobe Corp | Verstärkter einfang von ziel-nukleinsäuren mittels verwendung von oligonukleotiden, die kovalent an polymere gebunden sind |
| CA2037349C (en) * | 1990-03-26 | 2008-06-17 | James G. Wetmur | Branch migration of nucleotides |
| CA2039517C (en) | 1990-04-03 | 2006-11-07 | David Segev | Dna probe signal amplification |
| US6004744A (en) | 1991-03-05 | 1999-12-21 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer |
| US5445933A (en) * | 1992-09-15 | 1995-08-29 | Boehringer Mannheim Corporation | Strand displacement assay and complex useful therefor |
| EP0672187A4 (en) | 1992-10-08 | 1999-11-17 | Univ California | PCR TEST METHOD FOR DETERMINING PRESENCE AND CONCENTRATING A TARGET SUBSTANCE. |
| US5482836A (en) | 1993-01-14 | 1996-01-09 | The Regents Of The University Of California | DNA purification by triplex-affinity capture and affinity capture electrophoresis |
| WO1994016108A1 (en) | 1993-01-15 | 1994-07-21 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Sensitive nucleic acid sandwich hybridization assays and kits |
| US5610287A (en) | 1993-12-06 | 1997-03-11 | Molecular Tool, Inc. | Method for immobilizing nucleic acid molecules |
| EP0754240B1 (en) | 1994-02-07 | 2003-08-20 | Beckman Coulter, Inc. | Ligase/polymerase-mediated genetic bit analysis of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis |
| EP0671626B1 (en) | 1994-03-08 | 2000-01-12 | Zeptosens AG | Device and method for combined bioaffinity assay and electrophoretic separation |
| CA2126952C (en) * | 1994-06-28 | 2010-12-14 | Sithian Pandian | Probe, kit, and method of amplification for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays |
| ATE187501T1 (de) | 1996-01-23 | 1999-12-15 | Rapigene Inc | Verfahren zur erkennung von ligandenpaar bindung mit erhöter empfindlichkeit |
| AU2320597A (en) | 1996-03-19 | 1997-10-10 | Molecular Tool, Inc. | Method for determining the nucleotide sequence of a polynucleotide |
| US5955268A (en) | 1996-04-26 | 1999-09-21 | Abbott Laboratories | Method and reagent for detecting multiple nucleic acid sequences in a test sample |
| DE69729726T2 (de) | 1996-05-24 | 2005-07-07 | Zeptosens Ag | Verfahren zur trennung von wirkstoffgemischen mit kapillaraffinity-gelelektrophorese |
| US6203978B1 (en) | 1996-05-31 | 2001-03-20 | Du Vergier Ltd. | Capture of single stranded nucleic acids |
-
1998
- 1998-11-06 EP EP98957625A patent/EP1027458A2/en not_active Withdrawn
- 1998-11-06 CA CA002309384A patent/CA2309384A1/en not_active Abandoned
- 1998-11-06 AU AU13842/99A patent/AU1384299A/en not_active Abandoned
- 1998-11-06 JP JP2000519604A patent/JP2002505846A/ja active Pending
- 1998-11-06 WO PCT/US1998/023634 patent/WO1999024612A2/en not_active Application Discontinuation
- 1998-11-06 US US09/188,086 patent/US6255051B1/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022529247A (ja) * | 2019-03-26 | 2022-06-20 | ナノベリー リミテッド | 装置、システム及び方法 |
| JP7553465B2 (ja) | 2019-03-26 | 2024-09-18 | ナノベリー リミテッド | 装置、システム及び方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999024612A2 (en) | 1999-05-20 |
| US6255051B1 (en) | 2001-07-03 |
| AU1384299A (en) | 1999-05-31 |
| EP1027458A2 (en) | 2000-08-16 |
| WO1999024612A3 (en) | 1999-07-15 |
| CA2309384A1 (en) | 1999-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6959378B2 (ja) | 酵素不要及び増幅不要の配列決定 | |
| US9938573B2 (en) | Methods and kits for nucleic acid sequencing | |
| CA2366231C (en) | One step sample preparation and detection of nucleic acids in complex biological samples | |
| EP1141399B1 (en) | Sequencing method using magnifying tags | |
| JP7379418B2 (ja) | 腫瘍のディープシークエンシングプロファイリング | |
| JP2002537781A (ja) | 固定化捕捉プローブを有する生化学的精製装置およびその使用 | |
| JP2002508191A5 (ja) | ||
| JP2007506429A (ja) | ポリマー核酸のハイブリダイゼーションプローブ | |
| JP2002505846A (ja) | シグナル増幅およびプロセッシングのための多重逐次的ポリヌクレオチド置換反応 | |
| EP1243659B1 (en) | Method for detecting target nucleotide sequences | |
| CA3104041A1 (en) | Improved proteomic multiplex assays | |
| AU2003220055A1 (en) | Selective elution of immobilized multiplexed primer extension products | |
| US20030073091A1 (en) | Use of generic oligonucleotide microchips to detect protein-nucleic acid interactions | |
| EP0958378A2 (en) | Compositions and methods for enhancing hybridization specificity | |
| US20110003703A1 (en) | Nucleic Acid Hybridization and Detection Using Enzymatic Reactions on a Microarray | |
| EP0462224B1 (en) | Sequencing nucleic acids using chemiluminescent detection | |
| JP2001136972A (ja) | 核酸固定化高分子ゲル及びその製造方法 | |
| CN119452097A (zh) | 适体检测技术 | |
| WO2000029619A2 (en) | Multielement analytical device for assay of nucleic acid sequences and uses therefore | |
| JP2023524129A (ja) | 反応混合物からの過剰なオリゴヌクレオチドの除去 | |
| JPH11113571A (ja) | オリゴヌクレオチド及びその利用 | |
| JP2004069489A (ja) | プローブ担体及びその製造方法 |