JP2002503459A

JP2002503459A - 繊維置換タンパク質を含有する修飾されたアデノウィルス

Info

Publication number: JP2002503459A
Application number: JP2000531540A
Authority: JP
Inventors: ティーカリエル，デイヴィッド; エヌクラスニフ，ヴィクター
Original assignee: ザユーエイビーリサーチファンデイション
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-16
Publication date: 2002-02-05
Also published as: ATE342350T1; BR9908018A; AU3294099A; CN1297479A; NZ506451A; NO20004563D0; IL137730A0; EP1070118A1; ZA200004208B; KR20010074429A; DE69933550D1; DE69933550T2; WO1999041359A1; NO20004563L; EP1070118A4; AU751542B2; CA2321135A1; US6210946B1; EP1070118B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝学的方法を使用して組換えアデノウィルスベクターの親和性を修飾し、天然三量体タンパク質の生合成特性を保有しながらアデノウィルス繊維細胞結合タンパク質を変化させる方法を提供する。本発明はさらに、遺伝学的方法を使用して特定の細胞系を特異的に組換えアデノウィルスベクターと感染させ、アデノウィルス繊維細胞結合タンパク質を変化させる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景関連出願の説明本出願は、現在は放棄された、1998年2月17日に出願された米国仮特許出願第6
0/074,844号の恩恵を主張する。

【０００２】連邦基金本発明は、国立衛生研究所からの自由準備金を使用して一部補助された。した
がって、連邦政府は本発明に特定の権利を有する。

【０００３】発明の背景本発明は、通常、ベクター生物学および遺伝子治療の分野に関する。さらに特
定すると、本発明は、内因性親和性除去を伴なう細胞特異的ターゲッティングの
ために繊維が置換された組換えアデノウィルスベクターの産生に関する。

【０００４】関連技術の説明二十面体のキャプシドの12の頂点のそれぞれから突き出す繊維タンパク質(21-
23)のこぶ部分中の領域の特異的なレセプター認識により、アデノウィルスは真核細胞と相互作用する。組換えアデノウィルスベクターは、多くの遺伝子治療用
途に使用される(21,35,38)。この事実は主に、インビトロおよびインビボの両方
におけるこのベクターアプローチにより達成可能な高レベルの遺伝子転移に由来
する。

【０００５】組換えアデノウィルスベクターは、様々の器官中の分化した標的細胞にインサ
イチュで遺伝子を供給できる独特の能力により、他のシステムと区別される(5,6
,9,10,12,20,25,27,29,31)。これにより、供給されたベクターが標的器官内に含
有される、膵胞性繊維症のような遺伝性遺伝子病を治療するためのアプローチと
して、組換えアデノウィルスベクターを利用することが可能になった(4-13)。さ
らに、アデノウィルスベクターがインサイチュで腫瘍形質導入できることにより
、移動局所病（loco-regional desease）のための様々な抗癌遺伝子治療アプローチが開発された(14-18)。

【０００６】アデノウィルスベクターは、静脈注射後様々な器官にインビボで遺伝子を供給
できる。これらの例において、遺伝子転移の頻度は、様々の免疫モデル中で遺伝
性代謝異常を治療するのに十分高い。したがって、アデノウィルスベクターは、
遺伝子治療のために静脈投与されるベクターの2つの必要条件を満たす：系統的安定性および高い効率の筋肉細胞の形質導入に続き長期間の遺伝子発現を達成す
る能力。

【０００７】しかしながら、アデノウィルスには、アデノウィルス細胞レセプターが広く分
布しているために、特定の細胞系のターゲッティングが妨げられるという不利な
点がある。アデノウィルスベクターのこの親和性の欠失により、標的細胞への供
給に利用できるウィルス粒子の数が非標的細胞による壊死巣分離により減少する
ので、形質導入の効率が減少するであろう。さらに、これにより、未知のおよび
おそらく有害な結果を伴って、供給された遺伝子が異所的に発現するであろう。
したがって、アデノウィルスベクターの親和性を標的細胞へ特異的に向け直し、
感染した器官へのみ遺伝子を供給する方法が開発されなければならない。

【０００８】この目的のために、いくつかのグループが、アデノウィルス繊維タンパク質の
こぶ領域への遺伝的修飾およびそのようなキメラ繊維のビリオン中への組み込み
を報告した。例えば、Stevenson等(35)および他(24)は、それぞれAd5繊維の尾部
およびシャフト領域とAd3のこぶ領域とから成る繊維を含有するAd5ビリオンの産
生に成功したことを報告した。さらに、Michael等(30)は、組換えAd5繊維のカル
ボキシ末端中へのガストリン放出ペプチドの組み込みを示した。この発見は、そ
のような繊維を含有する組換えアデノウィルスベクターの救出（rescue）を達成
したLegrand等(30a)により拡張された。Wickham等(41)は、カルボキシ末端ポリリシン配列を有する繊維を含有する組換えウィルスの産生を記載した。これらの
研究により、この遺伝的アプローチに関して重要な実行可能性の問題が確立され
たが、繊維タンパク質の正確なひだ形成を混乱させ得る、リガンドのサイズを含
む多くの制限因子もまた示された。

【０００９】従来技術は、新しいターゲッティングと天然の親和性の除去とを組み合わせて
組換えアデノウィルスベクターを産生する効果的な方法がない点で不十分なまま
である。本発明は、当該技術におけるこの長年の必要および要求を満たす。

【００１０】発明の概要本発明には、組換えの、細胞特異的アデノウィルスベクターの次の世代が記載
される。さらに特定すると、本発明の明細書には、アデノウィルスの親和性の修
飾において考慮すべき2つの態様があることが開示される：（１）内因性親和性の除去；および（２）新しい親和性の導入。遺伝子治療用途のための組換えアデ
ノウィルスの有用性を拡大するために、天然のベクターの親和性を変化させて細
胞特異的形質導入を達成する方法が必要である。そのようなターゲッティングを
達成するために、アデノウィルス繊維タンパク質中へリガンドを組み込み、細胞
表面レセプターへのアデノウィルスの一次結合を媒介させることができる。ここ
に記載されるように、本発明には、アデノウィルス繊維タンパク質の置換により
産生される標的化アデノウィルスの開発が開示される。本発明には、繊維尾部領
域、バクテリオファージT4からのフィブリチン(fibritin)遺伝子の一部およびリ
ガンド領域からなる繊維置換または置換タンパク質を含む組換えアデノウィルス
ベクターが開示される。組換えアデノウィルスベクターはまた、ガンシクロビル
の存在下で、治療遺伝子すなわち単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ遺伝子をコ
ードしてもよく、アデノウィルスは、標的化レセプターを発現する細胞の特異的
な殺害を媒介できる。したがって本発明により、非アデノウィルス細胞レセプタ
ーを媒介とする組換えアデノウィルスベクターの再ターゲッティングが証明され
る。

【００１１】本発明のある実施の形態において、内因性ウィルス親和性を欠失するが新しい
親和性を有する組換えアデノウィルスベクターであって、該アデノウィルスベク
ターがウィルス親和性を修飾するように修飾されて置換アデノウィルス繊維タン
パク質を産生し、該置換された繊維遺伝子が尾部領域、T4バクテリオファージフ
ィブリチンのカルボキシ末端部およびリガンドを含むアデノウィルス繊維遺伝子
のアミノ末端部を含み、前記置換されたアデノウィルス繊維が三量体化する能力
および天然生合成特性を保有し、前記リガンドが生理的リガンド、抗レセプター
抗体および細胞特異的ペプチドからなる群より選択され、前記アデノウィルスベ
クターがさらに治療遺伝子を含有し、該治療遺伝子が単純疱疹ウィルスチミジン
キナーゼ遺伝子である、組換えアデノウィルスベクターが提供される。

【００１２】本発明の別の実施の形態において、そのような治療が必要な個体中の腫瘍細胞
を殺す方法であって、有効な量の組換えアデノウィルスベクターで前記個体を前
処理し、前記個体にガンシクロビルを投与する、各工程を含む方法が提供される
。

【００１３】本発明の他のおよびさらなる態様、特徴、および利点は、開示の目的のために
与えられた本発明の目下好ましい実施の形態の以下の記載から明らかとなるであ
ろう。

【００１４】図面の簡単な説明上述された、並びにこれから明らかになるであろう本発明の特徴、利点および
目的が達成され詳細に理解されるように、添付の図面に示されるある実施の形態
を参照して上記で簡単に要約された本発明をより特定して記載する。これらの図
面は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい実
施の形態を示し、したがって本発明の範囲において制限するものと考慮すべきで
はないことに留意すべきである。

【００１５】図１は、繊維−フィブリチン−6−ヒスチジンキメラからなる置換繊維の図を示す。

【００１６】図２は、E.coli中で発現された繊維−フィブリチン−6ヒスチジンキメラタンパク質のSDSゲル電気泳動を示す。タンパク質を4-10%のSDS-PAAゲル上で分離し、次にクマシーブリリアントブルーで染色した。レーン1、煮沸により変成した繊維−フィブリチン−6ヒスチジン；レーン2、繊維−フィブリチン−6ヒスチジン天然三量体；レーン3、タンパク質分子量標準。

【００１７】発明の詳細な説明本発明は、繊維置換タンパク質でアデノウィルス繊維タンパク質を置換するこ
とにより修飾されたアデノウィルスに関する。好ましい実施の形態において、繊
維置換タンパク質は、a)アデノウィルス繊維尾部領域を含むアミノ末端部；b)キ
メラ繊維置換タンパク質；およびc)ターゲッティングリガンドを含むカルボキシ
末端部、を含む。

【００１８】以下の記載により、当業者は、推定の繊維置換タンパク質が本発明の組成物お
よび方法において所望なように機能するか否かを決定できる。通常、繊維置換タ
ンパク質は、アデノウィルスのペントンベースと結合する。構造的には、繊維置
換タンパク質は好ましくは、杖状の、三量体タンパク質である。杖状の、三量体
タンパク質の直径は、野生型アデノウィルスの天然繊維タンパク質に匹敵するこ
とが所望である。ターゲッティングリガンドをコードする配列をカルボキシ末端
に組み込む場合、繊維置換タンパク質が三量体性（trimerism）を維持することが重要である。好ましい態様において、繊維置換タンパク質の代表例は、T4バク
テリオファージフィブリチンタンパク質である。より一般的に、繊維置換タンパ
ク質は、三量体構造タンパク質、三量体ウィルスタンパク質および三量体転写因
子からなる群より選択できる。繊維置換タンパク質の他の代表例には、ヒトの肺
界面活性剤Dからのイソロイシン三量体化モチーフおよび頸領域ペプチドが含まれる。好ましくは、繊維置換タンパク質は、高次コイル二次構造を有する。二次
構造は、複合的な分子間鎖相互作用により安定性を提供する。

【００１９】繊維置換タンパク質は、天然タンパク質である必要はない。実際、当業者は、
人工タンパク質を作成することが可能であろう。好ましくは、そのような人工繊
維置換タンパク質は、高次コイル二次構造を有する。

【００２０】本発明のアデノウィルスにおいて、ターゲッティングリガンドは、生理的リガ
ンド、抗レセプター抗体、細胞特異的ペプチドおよび一本鎖抗体からなる群より
選択される。ある実施の形態において、アデノウィルスは、そのゲノム中で治療
遺伝子を運搬する。治療遺伝子の代表例は、単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ
遺伝子である。

【００２１】本発明はまた、そのような治療を必要とする個体中の腫瘍細胞を殺す方法であ
って、効果的な量の本発明のアデノウィルスで前記個体を前処理し；前記個体に
ガンシクロビルを投与する、各工程を含む方法に関する。

【００２２】 Ad5繊維の修飾により得られた従来の結果により、天然繊維タンパク質の三量体構造は、長いインサートを収容するのに十分安定ではなく、分子は大きいリガ
ンドの組み込みに耐えられないであろうということが示される。こぶは、分子の
残りの部分がこぶにより開始される三量体化過程に“受動的に”従う一方で、繊
維の三量体構造を維持する繊維の主要な（または唯一の）構造構成要素であると
考えられる。内因性繊維親和性を欠失し新しい親和性を有する組換えビリオンを
産生するために、通常、こぶを置換する2つの異なるタンパク質成分の間のこぶ領域により、アデノウィルス繊維の機能を“分離させる”ことができる。このこ
とは、こぶを体外三量体化モチーフで置換してこぶのない繊維の三量体化を維持
し、同時に新しいレセプターへビリオンを標的付けることができるリガンドを繊
維中に導入することにより、達成できる。

【００２３】繊維の役割はおそらく、ビリオンの表面から離れて細胞結合部位を配置するこ
とであるので、繊維は別の杖状三量体タンパク質で置換してもよい。三量体であ
ることに加えて、タンパク質は、アデノウィルスのペントンベースと結合しビリ
オン中に組み込まれる能力を有する必要がある。不適合性の問題を防ぐために、
キメラタンパク質のアミノ末端を、アデノウィルス繊維の尾部領域中に組み込ん
でもよい。さらに、推定繊維置換タンパク質は、ターゲッティングリガンドに対
応する（相対的に）大きい付加配列をカルボキシ末端中に組み込むことに耐えな
ければならない。

【００２４】バクテリオファージT4のフィブリチンは、ファージ粒子の“カラー”および“
ホイスカー(whiskers)”を形成し、上述の基準の多くを満たすタンパク質である
。フィブリチンの486アミノ酸配列は、アミノ末端領域(47残基)、大きい中心領域およびカルボキシ末端領域(29残基)からなる。中心領域は、様々の長さの12の
セグメントを有し、それぞれがα−らせん高次コイル構造を有する。広範囲の生
物物理学的および配列の分析により、フィブリチンは平行三本鎖α−らせん高次
コイルとして表された。フィブリチンの三量体は、65℃までの温度で安定である
。重大なことに、アミノ末端において残基が欠失しているフィブリチンおよびア
ミノ末端伸長を含有する組換えフィブリチンの両方が、正しく三量体を組み立て
る。フィブリチンのカルボキシ末端領域は、三量体化および安定な三量体を形成
するためのAd5繊維のこぶとのフィブリチンのカルボキシ末端融合に必要である。さらに、E.coli中で過発現された場合には、組換えフィブリチンおよびその誘
導体は可溶性である。繊維置換のための魅力ある候補になるフィブリチンの別の
特徴は、それが柔軟であるという事実である。したがって、繊維の性質により定
められる長さの必要条件は、ウシAd3およびCELOウィルスの柔軟な繊維に類似する、フィブリチンにより容易に満たされる。

【００２５】定義本発明によると、当該技術の範囲内で従来の分子生物学、微生物学および組換
えDNA技術を使用してもよい。そのような技術は、文献中で十分に説明されている。例えば、Maniatis,Fritsch & Sambrook,”Molecular Cloning:A Laboratory
Manual(1982);”DNA Cloning:A Practical Approach,”Volumes I and II(D.N.
Glover ed.1985);”Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait ed.1984);”Nuclei
c Acid Hybridization"[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)];"Transcription
and Translation"[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)];"Animal Cell Cultu
re"[R.I.Freshney,ed.(1986)];"Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press,(1
986)];B.Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984)参照。したがって、ここで使用される場合、以下の用語は以下に記載される定義を有するも
のとする。

【００２６】 “DNA分子”とは、一本鎖形態、または二本鎖へリックスにあるデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の重合形態を称
する。この用語は、分子の一次および二次構造のみをさし、いかなる特定の三次
形態にも制限されない。したがって、この用語には、とりわけ、線状DNA分子（例えば制限断片）、ウィルス、プラスミド、および染色体中で見られる二本鎖DN
Aが含まれる。ここで通常の慣例により構造について論ずると、DNAの非転写鎖に
沿う5’から3’方向への配列のみを与える（すなわち、この鎖はmRNAと相同の配
列を有する）。

【００２７】 “ベクター”とは、別のDNA断片がそれに結合されて、結合された断片を複製する、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。“レプ
リコン”とは、インビボにおけるDNA複製の自律単位として機能する；すなわち自分自身のコントロールのもとで複製可能な、任意の遺伝要素（例えば、プラス
ミド、染色体、ウィルス）である。“複製起点”とは、DNA合成に関係するDNA配
列を称する。“発現制御配列”とは、別のDNA配列の転写および翻訳を制御および調節するDNA配列である。コーディング配列は、RNAポリメラーゼがコーディン
グ配列をｍRNAに転写し、次にこれがコーディング配列によりコードされるタンパク質に翻訳される場合に、“機能できるように結合され”、細胞中の転写およ
び翻訳制御配列の“制御下”にある。

【００２８】通常、挿入されたDNA断片の有効な転写および翻訳を促進するプロモーター配列を含有する発現ベクターは、宿主とともに使用される。発現ベクターは通常、
複製起点、プロモーター、ターミネーター、並びに形質転換された細胞中で表現
型選択を提供できる特定遺伝子を含有する。形質転換された宿主は、当該技術に
おいて知られる方法により発酵させ、かつ培養し、最適の細胞増殖を達成できる
。

【００２９】 DNA“コーディング配列”とは、適切な調節配列の制御下に置かれると、インビボにおいて転写されポリペプチドに翻訳される二本鎖DNA配列である。コーディング配列の境界線は、5’（アミノ）末端における開始コドンおよび3’（カル
ボキシル）末端における翻訳停止コドンにより決定される。コーディング配列に
は、原核生物の配列、真核生物mRNAからのcDNA、真核生物（例えば哺乳類）DNA からのゲノムDNA配列、および合成DNA配列が含まれてもよいが、それに限定され
ない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は通常、コーディング配列の
3’側に位置する。“cDNA”は複製DNAまたは相補的DNAとして定義され、mRNA転写物からの逆転写反応の産物である。

【００３０】転写および翻訳制御配列は、宿主細胞中でコーディング配列を発現させる、プ
ロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のよう
なDNA調節配列である。“シス−エレメント”とは、ヌクレオチド配列であり、特定の遺伝子座の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートできる他
のタンパク質と相互作用する、“コンセンサス配列”または“モチーフ”とも称
される。“シグナル配列”もまたコーディング配列に含まれてもよい。この配列
は、宿主細胞に情報伝達しポリペプチドを適切な細胞位置に方向付ける、ポリペ
プチドのN末端側のシグナルペプチドをコードする。シグナル配列は、原核生物および真核生物に固有の様々のタンパク質と結合することもある。

【００３１】 “プロモーター配列”とは、細胞中でRNAポリメラーゼを結合させ、下流（3’
方向）コーディング配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。本発明を定義するために、プロモーター配列は、転写開始部位により3’末端に結合され、上流（5’方向）まで広がってバックグラウンド以上の検出できるレベルで転写を開始するのに必要な塩基またはエレメントの最小数を含む。プロモー
ター配列内には、転写開始部位、並びにRNAポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合領域（コンセンサス配列）が見られる。真核生物のプロモーターは
しばしば、”TATA”ボックスおよび”CAT”ボックスを含有するが、常にではない。原核生物のプロモーターは、-10および-35コンセンサス配列に加えて、シャ
イン−タルガーノ配列を含有する。

【００３２】 “オリゴヌクレオチド”という用語は、2つ以上、好ましくは3つ以上のデオキ
シリボヌクレオチドを含む分子として定義される。その正確なサイズは、オリゴ
ヌクレオチドの根本的な機能および用途に依存する、多くの要因に依存するであ
ろう。ここで用いたように、“プライマー”という用語は、精製された制限消化
物中で天然に発生するまたは合成により産生されたオリゴヌクレオチドであって
、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘発される条件下に、すなわち
ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼのような誘発物質の存在下および適切な温度とpHに置かれると合成の開始点として作用できる、オリゴヌクレオチドを称す
る。プライマーは、一本鎖または二本鎖のいずれでもよく、誘発物質の存在下で
所望の伸長産物の合成を開始するのに十分長くなければならない。プライマーの
正確な長さは、温度、プライマーの供給源および使用する方法を含む、多くの要
因に依存するであろう。例えば、診断の用途については、標的配列の複雑さに依
存して、オリゴヌクレオチドプライマーは通常、15-25またはそれより多くのヌクレオチドを含有するが、それより少ないヌクレオチドを含有してもよい。

【００３３】ここでプライマーは、特定の標的DNA配列の異なる鎖に“実質的に”相補的であるように選択される。このことは、プライマーが、それぞれの鎖とハイブリッ
ド形成するのに十分相補的でなければならないことを意味する。したがって、プ
ライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非
相補的なヌクレオチド断片は、鎖に相補的なプライマー配列の残りの部分により
、プライマーの5’端に結合されてもよい。あるいは、プライマー配列が配列と十分な相補性を有し、それとともにおよびそれによってハイブリッド形成して伸
長産物の合成のためのテンプレートを形成するならば、非相補的塩基またはより
長い配列を、プライマー中に散在させてもよい。

【００３４】ここで用いたように、“制限エンドヌクレアーゼ”および“制限酵素”という
用語は、特定のヌクレオチド配列においてまたはその近くで二本鎖DNAを切断する酵素を称する。

【００３５】 “組換えDNA技術”とは、通常、異なる生体からのDNAのインビトロにおけるラ
イゲーションの結果として、2つの異種DNA分子を結合する技術を称する。組換え
DNA分子は通常、遺伝子工学における実験により産生される。同義語には、“遺伝子スプライシング”、“分子クローニング”および“遺伝子工学”が含まれる
。これらの操作の産物は、“組換え体”または“組換え分子”となる。

【００３６】外因性または異種DNAを細胞内に導入すると、細胞はそのようなDNAにより“形
質転換される”または“形質移入される”。形質転換DNAは、細胞のゲノム中に組込ま（共有結合）れても組込まれなくてもよい。例えば原核細胞、酵母、およ
び哺乳類細胞において、形質転換DNAは、ベクターまたはプラスミドのようなエピソームエレメント上に維持されてもよい。真核細胞に関して、安定して形質転
換された細胞とは、形質転換DNAが染色体中に組込まれ、染色体複製を通して娘細胞により受け継がれる細胞である。この安定性は、形質転換DNAを含有する娘細胞の個体群からなる細胞系またはクローンを確立する真核細胞の能力により示
される。“クローン”とは、有糸分裂による単一の細胞または祖先に由来する細
胞の個体群である。“細胞系”とは、何世代にもわたりインビトロで安定して増
殖できる始原細胞のクローンである。外因性DNAにより形質転換された、植物または動物のような生体は、“トランスジェニック”と称される。

【００３７】ここで用いたように、“宿主”という用語には、原核細胞、並びに酵母、植物
および動物細胞のような真核細胞が含まれるものとする。原核細胞宿主には、E.
coli、ストレプトミセスチンフィムリウム(S.tymphimurium)、霊菌および枯草菌
が含まれてもよい。真核細胞宿主には、ピチアパストリス(Pichia pastoris)のような酵母、哺乳類細胞および昆虫細胞およびアラビドプシスタリアナ(Arabido
psis thaliana)とタバカムニコチアナ(Tobaccum nicotiana)のような植物細胞が
含まれる。

【００３８】 2つのDNA配列は、ヌクレオチドの少なくとも約75％（好ましくは少なくとも約
80％、および最も好ましくは少なくとも約90％または約95％）がDNA配列の限定した長さにおいて一致する場合、“実質的に相同”である。配列データバンク中
の利用可能な標準ソフトウェアを使用して配列を比較することにより、または例
えば特定のシステムについて定められるストリンジェントな条件下におけるサザ
ンハイブリダイゼーション実験において、実質的に相同な配列が同定できる。適
切なハイブリダイゼーション条件の決定は、当該技術の範囲内である。例えば、
Maniatis et al.,supra;DNA Cloning,Vols.I & II,supra;Nucleic Acid Hybridi
zation,supra参照。

【００３９】 DNA構成物の“異種”領域とは、大きいDNA分子に関しては天然では見られない
該分子内のDNAの同定可能なセグメントである。したがって、異種領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、通常、供給源の生体のゲノム中では哺乳類ゲノムDNA の側部に位置しないDNAが該遺伝子の側部に位置する。別の実施例において、コーディング配列は、天然ではコーディング配列自身が見られない構成物である（
例えば、ゲノムコーディング配列がイントロンを含有するcDNA、または天然の遺
伝子と異なるコドンを有する合成配列）。対立変異または天然発生突然変異イベ
ントでは、ここに定義されるDNAの異種領域は生じない。

【００４０】さらに、本発明には、繊維またはフィブリチン遺伝子の部分または断片が含ま
れてもよい。ここに用いたように、遺伝子またはポリペプチドに適用される“断
片”または“部分”は、普通少なくとも10残基であり、さらに通常は少なくとも
20残基であり、好ましくは少なくとも30（例えば50）残基の長さであるが、全体
の完全な配列よりは短い。これらの遺伝子の断片は、例えば、天然発生または組
換え繊維またはフィブリチン遺伝子の制限分解、繊維またはフィブリチン遺伝子
の限定された断片をコードするベクターを使用する組換えDNA技術、または化学的合成などの、当業者に知られる方法により、産生できる。

【００４１】ここに用いたように、“キメラ”または“キメラの”とは、必ずではないがし
ばしば異なる生体からの、複合的な成分を有する単一の転写単位を称する。ここ
で用いたように、“キメラの”は、遺伝的に処理されて個々のコーディング配列
の機能または活性に対応する領域を有するタンパク質になった、一列に整合され
たコーディング配列（この場合は、通常アデノウィルス繊維遺伝子をコードする
配列）を称するのに使用される。

【００４２】ここで用いたようにキメラの繊維タンパク質の“天然生合成特性”は、正確な
三量体化、アデノウィルスキャプシドとの適切な結合、標的に結合するリガンド
の能力等を示すものとして定義される。キメラの繊維−フィブリチン−リガンド
タンパク質断片の候補が“天然生合成特性”を示す能力は、ここに記載される方
法により評価できる。

【００４３】当業者に知られる従来のノザンハイブリダイゼーション技術により、細胞また
は組織中のmRNAの相対的な量を確かめるために、標準ノザンブロット分析を使用
できる。あるいは、等業者に知られる従来のサザンハイブリダイゼーション技術
により、関心のある遺伝子の存在およびコピー数を確かめるために、標準サザン
ブロット分析を使用してもよい。ノザンブロットおよびサザンブロットはどちら
も、例えば少なくとも20（好ましくは少なくとも30、より好ましくは少なくとも
50、および最も好ましくは少なくとも100の長さの連続的なヌクレオチド）の放射性同位元素標識されたcDNAまたはオリゴヌクレオチドのようなハイブリダイゼ
ーションプローブを使用する。DNAハイブリダイゼーションプローブは、当業者に知られる多くの異なる方法のいずれによっても標識できる。

【００４４】これらの研究に最も一般的に使用される標識は、紫外線にさらされると蛍光を
発する放射性元素、酵素、化学物質等である。多くの蛍光物質が知られており、
標識として利用できる。これらには、例えばフルオレセイン、ローダミン、オー
ラミン、テキサスレッド、AMCAブルーおよびLucifer Yellowが含まれる。特定の
検出物質は、ヤギの中で調製されイソチオシアネートによりフルオレセインと結
合された抗ウサギ抗体である。タンパク質もまた、放射性同位元素または酵素に
より標識できる。放射性標識は、現在利用可能な計数法のいずれによっても検出
できる。好ましいアイソトープは、³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸C
o、⁵⁹Fe、⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、および¹⁸⁶Reから選択されてもよい。

【００４５】酵素標識もまた有用であり、現在利用される比色分析技術、分光光度分析技術
、蛍光分光光度分析技術、電流滴定技術または気体定量技術のいずれによっても
検出できる。カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等のよう
な架橋分子との反応により、酵素を選択された粒子に結合する。これらの工程で
使用できる多くの酵素は、既知であり利用可能である。好ましいのは、ペルオキ
シダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、β−D−ガラクトシ
ダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼおよびアルカ
リ性ホスファターゼである。米国特許第3,654,090号、同第3,850,752号、および
同第4,016,043号には、実施例により代わりの標識物質および方法が開示されている。

【００４６】ここで用いたように、“繊維遺伝子”および“繊維”という用語は、アデノウ
ィルス繊維タンパク質をコードする遺伝子を称する。ここで用いたように、“キ
メラの繊維タンパク質”とは、上述のように定義された修飾された繊維遺伝子を
称する。

【００４７】ここで用いたように、“生理的リガンド”という用語は、細胞表面レセプター
に対するリガンドを称する。

【００４８】本発明は、投与後に予め定められた細胞系へインビボで遺伝子を供給するため
に、非常に有効で特異的なアデノウィルスベクターのターゲッティングを提供す
るベクター系に関する。本発明の組換えアデノウィルスベクターにおいて、繊維
−フィブリチン−リガンドを含む繊維置換タンパク質を使用して、アデノウィル
スベクターを遺伝子治療のために特定の細胞へ標的付ける。このことは、繊維−
フィブリチン−リガンドキメラを含有するアデノウィルスベクターの構造により
達成される。これらのアデノウィルスベクターは、繊維−フィブリチン−リガン
ドキメラのリガンド成分を認識するレセプターを発現する細胞に、高い効率およ
び特異性で遺伝子産物を供給することができる。例えば、標的とされる特定の細
胞系に独特の細胞表面タンパク質を特異的に認識するレセプターリガンドまたは
抗体フラグメントをコードする非常に様々の遺伝子を利用してもよいことを、当
業者は認識するであろう。

【００４９】 “繊維置換タンパク質”とは、繊維を置換し、3つの実質的な特徴：繊維のように三量体化し、アデノウィルス親和性を欠失し、新しい親和性を有する、を提
供するタンパク質である。

【００５０】以下の実施例は、本発明の様々の実施の形態を説明するために与えられたもの
であり、決して本発明を制限することを意図するものではない。

【００５１】実施例１実験の計画組換えAd5ビリオン中で繊維を置換するのにフィブリチンが使用できることを示すために、以下の実験方法を使用した。まず、繊維尾部、繊維シャフト領域の
第1および第2モチーフをコードするキメラの繊維−フィブリチン遺伝子、並びに
フィブリチンタンパク質のセグメントと融合した繊維こぶ領域を作成した。この
構成物において、フィブリチンコーディング配列が、繊維シャフトコーディング
配列の大部分を置換した。したがって、この組換え遺伝子によりコードされるキ
メラタンパク質は、シャフト領域のほとんど全てがフィブリチンで置換されたAd
5繊維タンパク質と類似するであろう。

【００５２】実施例２繊維−フィブリチンタンパク質を含有する組換えアデノウィルスベクターの構造その後、新しく作成された繊維遺伝子をAd5ゲノム中へ転移するのを容易にするために、遺伝子を、予め作成された繊維シャトルベクターpNEB.PK.RGD-4C中に
集めた。このために、pNEB.PK.RGD-4CをNaeIおよびNcoIで切断して、Gly-76から
始まりHis-363までの繊維シャフトコーディング配列の大部分を除去した。次にこのベクターを使用して、アミノ酸Ser-229からカルボキシ末端Ala-487までをコ
ードするT4フィブリチン遺伝子のセグメントをクローン化した。フィブリチン遺
伝子のセグメントを、プライマーF1(5’ GGG AAC TTG ACC TCA CAG AAC GTT TAT
AGT CGT TTA AAT G 3’)(配列番号1)およびプライマーR1(5’ AGG CCA TGG CCA
ATT TTT GCC GGC GAT AAA AAG GTA G 3’)(配列番号2)を使用してPCR増幅した。フィブリチン配列に加えて、PCR産物もまた、5’端において繊維Gly-79からTh
r-82までに対応する4つのコドンを含有し、3’端においては、繊維のLys-360からGly-362までに対応する3つのコドンが付加された。このように、PCRにより産生されたDNAフラグメントをNcoIで切断し、NaeI-NcoI切断されたpNEB.PK.RGD-4C
でライゲーションすると、pNEB.PK.FF_BBが生じた。

【００５３】 pNEB.PK.FF_BB中に集められた遺伝子は、完全な尾部領域、シャフトの第1および第2の（および小さい第3の）反復、並びに繊維の最後の222カルボキシ末端アミノ酸を含む繊維タンパク質のアミノ末端部をコードする。カルボキシ末端アミ
ノ酸には、反復20および反復22と21の大部分であるこぶ全体が含まれる。繊維タ
ンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端部は、フィブリチンオープンリーデ
ィングフレームのSer-229から始まるフィブリチンのカルボキシ末端セグメントにより、結合される。

【００５４】繊維−フィブリチン遺伝子を含有する組換えアデノウィルスゲノムを産生する
ために、プラスミドpNEB.PK.FF_BBを、pVK50との相同組換えに使用し、pVK510を産生した。関心のあるウィルスを回収するために、pVK510をPacIで切断し、293 細胞を形質移入するのに使用した。新しく産生されたウィルスである、Ad5FF_BB は、繊維−フィブリチンタンパク質を含有する。このウィルスの産生により、フ
ィブリチン配列と遺伝子融合した繊維タンパク質のアミノ末端部が、Ad5ペントンベースと有効に結合することができ、それにより成熟ビリオンが形成されるこ
とが示された。

【００５５】実施例３こぶのない繊維−フィブリチンタンパク質を含有する組換えアデノウィルスベク
ターの構造フィブリチン分子が、こぶの非存在下で繊維−フィブリチンキメラ全体の三量
体構造を維持できることを立証するために、キメラの3’末端部を、2つのアミノ
酸残基リンカーおよび6-Hisタグをコードする短い配列で置換した（図１）。新しく産生された遺伝子を使用して、E.coli中でこぶのない繊維−フィブリチンの
発現を管理した。まず、予めpNEB.PK.FF_BB（繊維尾部およびシャフトの開始部と
融合したフィブリチン配列をコードする）中に集めた繊維−フィブリチン遺伝子
の5’末端セグメントを、プライマーF2(5’ CCC CTC ATG AAG CGC GCA AGA CCG
TCT GAA GAT ACC 3’)(配列番号3)およびプライマーR2(5’ CCC CGG ATC CTG CC
G GCG ATA AAA AGG TAG AAA GCA ATA CCC 3’)(配列番号4)を使用してPCR増幅し
、BspHIおよびBamHIで切断し、NcoIおよびBamHIで切断された細菌発現ベクターp
QE60中にクローン化することにより、pQE.FF_BBを産生した。

【００５６】実施例４こぶのない繊維−フィブリチンキメラを含有する組換えアデノウィルスの効力上述のクローニングの結果として、繊維−フィブリチン−6Hisキメラをコード
する修飾された繊維遺伝子を含有する組換えアデノウィルスが得られた。このタ
ンパク質の三量体構造を確かめるために、pQE.FF_BBが宿るE.coli細胞からNi-NTA
-アガロースを使用してビリオンを精製し、次にSDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析した。この分析により、実際に繊維−フィブリチンキメラは三量
体のタンパク質であることが示され（図２）、したがって、こぶのない繊維の三
量体化にフィブリチンタンパク質を利用するという考えが強く支持された。これ
らの結果は、繊維分子の尾部領域内に位置するエピトープを認識する抗6-Hisタグモノクローナル抗体テトラ−Hisおよび抗繊維モノクローナル4D2を利用するキ
メラタンパク質のウェスタンブロット分析により支持された：両方のモノクロー
ナル抗体により、クマシー染色したゲル上で見られるバンドは、繊維−フィブリ
チン−6−Hisキメラと同定された（データは図示せず）。

【００５７】重大なことに、カルボキシ末端6−Hisタグを含有する繊維−フィブリチンキメ
ラはNi-NTA-アガロースに有効に結合するという事実により、6-Hisタグが繊維−
フィブリチンキメラ中の結合に利用できたことが示される。これらの結果により
、標的とされたリガンドによるこのタグの置換によりキメラ繊維−フィブリチン
−リガンドを運搬する組換えアデノウィルスとリガンド特異的細胞レセプターと
の間の有効な相互作用が生じることが示される。

【００５８】当業者によく知られるように、繊維置換タンパク質により、例えばターゲッテ
ィングリガンド、ターゲッティング抗体のような様々のターゲッティングモチー
フが組み込まれる。

【００５９】参考文献

【表１】本明細書中に記載される特許または刊行物は、いずれも本発明が関する当業者
のレベルを示すものである。これらの特許および刊行物は、それぞれの刊行物が
明確におよび個別的に引用されるのと同じ程度まで、ここで引用される。

【００６０】本発明を、目的を達成するためにおよび上述の目的および利点、並びにそれに
固有のものを得るために適合させることができることは、当業者にとって自明で
ある。ここに記載される方法、手順、処理、分子、特定の化合物とともに本発明
の実施例は、好ましい実施の形態の目下代表例であり、具体例であり、本発明の
範囲を制限することを意図するものではない。特許請求の範囲により定められる
本発明の意図に含まれる本発明の変化および他の用途を、当業者は思いつくであ
ろう。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】繊維−フィブリチン−6−ヒスチジンからなる置換繊維を示す図

【図２】 E.coli中で発現された繊維−フィブリチン−6ヒスチジンキメラタンパク質のS
DSゲル電気泳動を示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/45 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者クラスニフ，ヴィクターエヌアメリカ合衆国アラバマ州 35216 バーミンガムアーボリータムサークル 1832 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA02 EA02 GA11 HA08 HA12 HA15 HA17 4B065 AA93X AA95X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA13 AA17 CA53 NA14 ZA892 ZB332 4C087 AA01 AA02 BC83 NA14 ZA89 ZB33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノウィルス繊維タンパク質を繊維置換タンパク質で置換
することにより修飾されたアデノウィルス。
【請求項２】前記繊維置換タンパク質が、 a) アデノウィルス繊維尾部領域を含むアミノ末端部、 b) キメラ繊維置換タンパク質、および c) ターゲッティングリガンドを含むカルボキシ末端部、を含むことを特徴とする請求項１記載のアデノウィルス。
【請求項３】前記繊維置換タンパク質が、アデノウィルスのペントンベー
スと結合することを特徴とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項４】前記繊維置換タンパク質が、杖状の三量体タンパク質である
ことを特徴とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項５】前記杖状の三量体タンパク質が、野生型アデノウィルスの天
然繊維タンパク質に匹敵する直径を有することを特徴とする請求項４記載のアデ
ノウィルス。
【請求項６】前記繊維置換タンパク質が、ターゲッティングリガンドをコ
ードする配列が前記カルボキシ末端中に組み込まれる場合に三量体性を維持する
ことを特徴とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項７】前記繊維置換タンパク質が、可溶性であることを特徴とする
請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項８】前記繊維置換タンパク質が、T4バクテリオファージフィブリ
チンタンパク質であることを特徴とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項９】前記繊維置換タンパク質が、三量体構造タンパク質、三量体
ウィルスタンパク質および三量体転写因子からなる群より選択されることを特徴
とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項１０】前記繊維置換タンパク質が、イソロイシン三量体化モチー
フであることを特徴とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項１１】前記繊維置換タンパク質が、ヒト肺界面活性剤Dからの頸領域ペプチドであることを特徴とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項１２】前記繊維置換タンパク質が、高次コイル二次構造を有する
人工タンパク質であって、該二次構造が多数の分子間鎖相互作用のために安定で
あることを特徴とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項１３】前記ターゲッティングリガンドが、生理的リガンド、抗レ
セプター抗体、細胞特異的ペプチドおよび一本鎖抗体からなる群より選択される
ことを特徴とする請求項２記載のアデノウィルス。
【請求項１４】前記アデノウィルスが、ゲノム中で治療遺伝子を運搬する
ことを特徴とする請求項１記載のアデノウィルス。
【請求項１５】前記治療遺伝子が、単純疱疹ウィルスチミジンキナーゼ遺
伝子であることを特徴とする請求項１４記載のアデノウィルス。
【請求項１６】そのような治療が必要な個体中の腫瘍細胞を殺す方法であ
って、前記個体を効果的な量の請求項１５記載のアデノウィルスで前処理し、前記個体にガンシクロビルを投与する、各工程を含むことを特徴とする方法。