JP2002501749A

JP2002501749A - ヒトプロテインキナーゼ分子

Info

Publication number: JP2002501749A
Application number: JP2000529440A
Authority: JP
Inventors: バンドマン、オルガ; ヒルマン、ジェニファー・エル; ラル、プリーティ; エイカーブラム、イングリッド・イー; シャー、パルビ; コーレイ、ニール・シー; ゲグラー、カール・ジェイ
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1998-01-30
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2002-01-22
Also published as: WO1999038981A2; EP1051497A2; US5962232A; CA2317814A1; AU2113899A; WO1999038981A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトプロテインキナーゼ分子（ＨＰＫＭ）及びＨＰＫＭを同定かつコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクタ、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。また本発明はＨＰＫＭの発現に関連する障害を治療或いは予防するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】技術分野本発明はプロテインキナーゼ分子の核酸配列及びアミノ酸配列に関し、癌及び
免疫障害の診断、治療及び予防におけるこれらの配列の使用法に関する。

【０００２】背景技術キナーゼは、リン酸基にタンパク質を加えることにより多くの異なる細胞増殖
、分化及びシグナル伝達を調節する。シグナル伝達が制御されない場合、それは
炎症、癌、アテローム性硬化症及び乾癬を含む種々の疾患の状態を示している。
可逆的タンパク質リン酸化は、真核細胞の活性を制御するための主要な方策であ
る。典型的な哺乳動物細胞においては１００００のタンパク質活性のうちの１０
００以上がリン酸化されているものと推定される。活性化をもたらす高エネルギ
ーリン酸塩は一般にプロテインキナーゼによりアデノシン三リン酸分子（ＡＴＰ
）から特定のタンパク質まで移送され、プロテインホスファターゼによりそのタ
ンパク質から除去される。リン酸化は、細胞外シグナル（ホルモン、神経伝達物
質、成長及び分化因子等）、細胞サイクルチェックポイント及び環境或いは栄養
ストレスに応じて生じ、概ね分子スイッチをオンすることに類似である。スイッ
チがオンする場合、適当なプロテインキナーゼが代謝酵素、調節タンパク質、受
容体、細胞骨格タンパク質、イオンチャネル或いはポンプ、または転写因子を活
性化する。

【０００３】キナーゼは大きな既知のタンパク質群、すなわち幅広い機能及び特異性を有す
る酵素のスーパーファミリである。通常これらは、その基質、その調節分子或い
はいくつかの突然変異表現型に続いて命名される。基質に関しては、プロテイン
キナーゼは大きく２つのグループに分けられる。それはチロシン残基をリン酸化
するグループ（プロテインチロシンキナーゼ、ＰＴＫ）と、セリン或いはスレオ
ニン残基をリン酸化するグループ（セリン／スレオニンキナーゼ、ＳＴＫ）であ
る。いくつかのタンパク質は二重の特異性を有し、スレオニン及びチロシン残基
をリン酸化する。ほとんど全てのキナーゼは類似の２５０〜３００アミノ酸触媒
ドメインを含む。Ｎ末端ドメインは、サブドメインＩ−ＩＶを含み、一般にＡＴ
Ｐ（或いはＧＴＰ）ドナー分子を結合かつ配向する２つの浅裂（two-lobed）構造に折り畳まれる。より大きなＣ末端裂片は、サブドメインＶＩＡ−ＸＩを含
み、タンパク質基質を結合し、ＡＴＰからセリン、スレオニン或いはチロシン残
基の水酸基へのγリン酸塩の移送を実行する。

【０００４】キナーゼは、キナーゼドメインの片側に位置するか、或いはそのループ内に挿
入される種々のアミノ酸配列（概ね５〜１００残基）によりファミリに分類され
る。これらの加えられたアミノ酸配列により、それらがターゲットとなるタンパ
ク質を識別し、相互作用する際に、各キナーゼを調節することができる。キナー
ゼドメインの主な構造は保存され、さらに１１サブドメインに細分される。１１
サブドメインはそれぞれ特異な残基及びそのサブドメインを特徴付け、概ね保存
されるアミノ酸のモチーフ或いはパターンを含む（Hardie, G. and Hanks, S.(1
995) The Protein Kinase Facts Books, Vol I:7-20 Academic Press, San Dieg
o, CA）。詳細には、２つのプロテインキナーゼサイン配列がキナーゼドメインにおいて同定されており、１つはＡＴＰ結合に関係する活性部位リシン残基を、
もう１つは触媒活性のために重要なアスパラギン酸を含む。解析されたタンパク
質は２つのタンパク質キナーゼサインを含み、そのタンパク質がプロテインキナ
ーゼである確率は１００％に近い値である（MOTIFS search program, Genetics
Computer Group,Madison, WI; See e.g.,Bairoch, A., et al. (1996) Nucleic
Acids Research 24(1), 189-196）。

【０００５】二次メッセンジャー依存プロテインキナーゼは主に、サイクリックＡＭＰ（ｃ
ＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ、三リン酸イノシトール、ホスファチジルイノシ
トール、３，４，５−三リン酸、サイクリックＡＤＰリボース、アラキドン酸、
ジアシルグリセロール及びカルシウム−カルモジュリンのような二次メッセンジ
ャーの作用を媒介する。サイクリックＡＭＰ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）
は、ＳＴＫファミリの重要なメンバである。サイクリックＡＭＰは、研究されて
いる全ての原核及び動物細胞におけるホルモン活性の細胞内メディエータである
。そのようなホルモン誘発細胞反応は、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾル分泌、
プロゲステロン分泌、グリコーゲン破壊、骨吸収及び心拍数並びに心筋収縮力の
調節を含む。ＰＫＡは全ての動物細胞において見出されており、これらの細胞の
大部分においてサイクリックＡＭＰの作用を相殺すると考えられる。ＰＫＡの発
現が変更されることは、癌、甲状腺障害、糖尿病、アテローム性硬化症及び心血
管疾患を含む種々の障害及び疾患を意味している（Isselbacher, K.J. et al.(1
994) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York,
NY, pp. 416-431, 1887）。

【０００６】カルシウム−カルモジュリン（ＣａＭ）依存プロテインキナーゼもＳＴＫのメ
ンバである。カルモジュリンは、カルシウムの結合に応じてターゲットとなるタ
ンパク質に結合することにより、多くのカルシウム調節プロセスを媒介するカル
シウム受容体である。これらのプロセスにおける主なターゲットのタンパク質は
ＣａＭ依存プロテインキナーゼである。ＣａＭキナーゼは、平滑筋収縮の調節、
グリコーゲン破壊（ホスホリラーゼキナーゼ）及び神経伝達物質（ＣａＭキナー
ゼＩ及びＣａＭキナーゼＩＩ）に関係する。ＣａＭキナーゼＩは、神経伝達物質
関連プロテインシナプシンＩ及びＩＩ、遺伝子転写調節因子、ＣＲＥＢ並びに嚢
胞性繊維症コンダクタンス調節因子タンパク質、ＣＦＴＲを含む種々の基質をリ
ン酸化する（Haribabu, B. et al. (1995) EMBO Journal 14:3679-86）。ＣａＭ
ＩＩキナーゼも種々の部位においてシナプシンをリン酸化し、リン酸化及びチロ
シンヒドロキシラーゼを介して脳におけるカテコールアミンの合成を制御する。
ＣａＭキナーゼの多くは、ＣａＭに結合することに加えてリン酸化により活性化
される。キナーゼは自らを自己リン酸化するか、或いは「キナーゼカスケード」
の部分として別のキナーゼによりリン酸化される場合もある。

【０００７】別のリガンド活性化プロテインキナーゼは５´ＡＭＰ活性化プロテインキナー
ゼ（ＡＭＰＫ）である（Gao, G. et al. (1996) J. Biol Chem. 15:8675-81）。
哺乳動物ＡＭＰＫは、酵素アセチルコエンザイムＡカルボキシラーゼ及びヒドロ
キシメチルグルタリルコエンザイムＡ還元酵素による脂肪酸及びステロール合成
の調節因子であり、熱ショック及びグルコース並びにＡＴＰの枯渇のような細胞
ストレスに至るこれらの経路の反応を媒介する。ＡＭＰＫは、触媒αサブユニッ
ト及びαサブユニットの活性を調節するものと考えられる２つの非触媒β並びに
γサブユニットからなるヘテロ三量体複合体である。ＡＭＰＫのサブユニットは
、脳、心臓、脾臓及び肺のような非脂肪性組織において、予想より非常の大きい
分布を有している。この分布は、その役割が脂質代謝のみの調節以外にも広がる
ことを示唆する。

【０００８】マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰ）もＳＴＫファミリのメンバ
であり、細胞内シグナル経路を調節する。それらは、リン酸化カスケードを介し
て細胞表面から細胞核へのシグナル伝達を媒介する。いくつかのサブグループが
同定されており、それぞれ種々の基質特異性を明らかにし、個別の細胞外刺激に
反応する（Egan, S.E. and Weinberg, R.A. (1993) Nature 365:781-783）。ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路は哺乳動物細胞及び酵母に存在する。哺乳動物経
路を活性化する細胞外刺激は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、紫外光、高浸透圧性媒
体、熱ショック、内毒素性リポ多様体（ＬＰＳ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）
並びにインターロイキン−１（ＩＬ−１）のような炎症誘発性サイトカインを含
む。ＭＡＰキナーゼの発現が変更されることは、癌、炎症、免疫障害及び成長並
びに発生に影響する疾患を含む種々の疾患状態を意味している。

【０００９】ＰＲＫ（増殖関連キナーゼ）は、ヒト巨核球細胞内の細胞サイクル及び細胞増
殖の調節に関係する血清／サイトカイン誘発性ＳＴＫである（Li, B. et al. (1
996) J. Biol. Chem. 271:19402-8）。ＰＲＫは、細胞分裂に関係するＳＴＫのポロファミリ（polo family）である。ＰＲＫは、肺腫瘍組織において下方制御され、正常組織において調節解除された発現が発癌性の転換に導くプロトオンコ
ジーンである場合もある。サイクリン依存プロテインキナーゼは（ＣＤＫ）は、
細胞サイクルを介して細胞の進行を制御する別のＳＴＫのグループである。サイ
クリンは小さな調節タンパク質であり、有糸分裂プロセスに関係する選択された
タンパク質をリン酸化かつ活性化することにより細胞サイクルの種々の段階をト
リガするＣＤＫに結合し、かつ活性化することにより作用する。ＣＤＫは、活性
状態になるために多数の入力を必要とするという点で独特である。サイクリンの
結合に加えて、ＣＤＫ活性化は、特定のスレオニン残基のリン酸化及び特定のチ
ロシン残基の脱リン酸を必要とする。

【００１０】ＰＴＫは特にそのターゲットとなるタンパク質上のチロシン残基をリン酸化し
、膜貫通受容体ＰＴＫ及び非膜貫通非受容体ＰＴＫに分割される場合もある。膜
貫通プロテインチロシンキナーゼは、大部分の成長因子のための受容体である。
受容体に対する成長因子の結合は、ＡＴＰから、受容体或いは他の特異なタンパ
ク質のうちの選択されたチロシン側鎖までのリン酸基の移送を活性化する。受容
体ＰＴＫに関連する成長因子（ＧＦ）は、表皮ＧＦ、血小板由来ＧＦ、繊維芽細
胞ＧＦ、肝細胞ＧＦ，インスリン及びインスリン様ＧＦ、神経ＧＦ、血管内皮Ｇ
Ｆ、及びマクロファージコロニー刺激因子を含む。

【００１１】非受容体ＰＴＫは膜貫通領域が欠如するが、その代わりに細胞表面受容体の細
胞内領域との複合体を形成する。非受容体ＰＴＫを通して機能するそのような受
容体は、サイトカイン、ホルモン（成長ホルモン及びプロラクチン）及びＴ並び
にＢリンパ球上の抗原特異受容体のための受容体を含む。これらのＰＴＫの大部
分は、その活性がもはや正常な細胞制御を受けなかった癌細胞の突然変異オンコ
ジーンの生成物として同定される。実際に、既知のオンコジーンの約３分の１は
ＰＴＫをコードし、多くの場合に細胞転換（腫瘍形成）に続いて、チロシンリン
酸化活性が増加する（Carbonneau H and Tonks NK (1992) Annu Rev Cell Biol 8:463-93）。それゆえＰＴＫ活性の調節はいくつかの癌のタイプを制御する際に
重要な方策である。

【００１２】新規のプロテインキナーゼ分子及びそれらをコードするポリヌクレオチドの発
見は、癌及び免疫障害の診断、治療及び予防において有用な新規の組成物を提供
することができ、当分野における必要性を満足するものである。

【００１３】発明の概要本発明は、集合的に「ＨＰＫＭ」と呼ばれ、個別に「ＨＰＫＭ−１」、「ＨＰ
ＫＭ−２」、「ＨＰＫＭ−３」、「ＨＰＫＭ−４」、「ＨＰＫＭ−５」及び「Ｈ
ＰＫＭ−６」と呼ばれる実質的に精製されたポリペプチド、プロテインキナーゼ
分子を特徴とする。一態様では、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６、並びにそのフラグメントからなる群から選択
されるアミノ酸配列の含む、実質的に精製されたポリペプチド、ＨＰＫＭを提供
する。

【００１４】さらに本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、或いはこれらの任意の配列のフラグメントに少なくと
も９０％アミノ酸配列同一性を有するＨＰＫＭの実質的に精製された変異体を提
供する。また本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６、並びにそのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離され、精製されたポリヌクレオチドを提供
する。また本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤ
ＮＯ：６、並びにそのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも９０％ポリヌクレ
オチド同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列を含む。

【００１５】さらに本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６、並びにそのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。さらに
本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：
３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６、
並びにそのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズする単離さ
れ、精製されたポリヌクレオチド配列、並びにＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６、並びにそのフラグメントからなる群から選
択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド相補的
な単離され、精製されたポリヌクレオチド配列を提供する。

【００１６】また本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１及びＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離され、精
製されたポリヌクレオチドを提供する。さらに本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７
、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：１１及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２、並びにそのフラグメントか
らなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに少なく
とも９０％ポリヌクレオチド同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオ
チド変異配列と、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１及びＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１２、並びにそのフラグメントからなる群から選択されるポリヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドに相補的な単離され、精製されたポリヌクレオチ
ドとを提供する。

【００１７】さらに本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６、並びにそのフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを含む
発現ベクタを提供する。別の態様では、発現ベクタは宿主細胞に含まれる。

【００１８】また本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ
：６、並びにそのフラグメントからなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成
するための方法を提供し、その方法は、（ａ）ポリペプチドの発現に適した条件
下でＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチド配列の少なくともフラグメントを有
する発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）その宿主細胞培養株か
らポリペプチドを回収する過程とを有する。

【００１９】また本発明は、適当な医薬品担体とともに、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを有
する実質的に精製されたＨＰＫＭを含む医薬品組成物を提供する。

【００２０】さらに本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列或いはそのフラグメントを含むポリペプチドに結合する
精製された抗体、並びにそのポリペプチドに対する精製されたアゴニスト及び精
製されたアンタゴニストを提供する。

【００２１】また本発明は、ＨＰＫＭの発現或いは活性の増加に関連する癌を治療或いは予
防するための方法を提供し、その方法はＨＰＫＭのアンタゴニストの有効量を治
療を要する被検者に投与する過程を含む。

【００２２】また本発明は、ＨＰＫＭの発現或いは活性の増加に関連する免疫障害を治療或
いは予防するための方法を提供し、その方法はＨＰＫＭのアンタゴニストの有効
量を治療を要する被検者に投与する過程を含む。

【００２３】また本発明は、ＨＰＫＭの発現或いは活性の減少に関連する癌を治療或いは予
防するための方法を提供し、その方法はＨＰＫＭを含む医薬品組成物の有効量を
治療を要する被検者に投与する過程を含む。

【００２４】また本発明は、ＨＰＫＭの発現或いは活性の減少に関連する免疫障害を治療或
いは予防するための方法を提供し、その方法はＨＰＫＭを含む医薬品組成物の有
効量を治療を要する被検者に投与する過程を含む。

【００２５】また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおいてＨＰＫＭをコードするポ
リヌクレオチドを検出するための方法を提供し、その方法は、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：６或いはそのフラグメン
トを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の相補配列を生物学的
サンプルの核酸の少なくとも１つにハイブリダイズさせ、それよりハイブリダイ
ゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体
を検出する過程とを有し、ハイブリダイゼーション複合体の存在が生物学的サン
プルにおけるＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなしている
。一態様では、生物学的サンプルの核酸は、ハイブリダイズする前にポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅される。

【００２６】発明を実施するための形態本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され
る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され
る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定
の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを
意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること
を理解されたい。

【００２７】本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「
その（前記）」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の
指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの
は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の
１つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。

【００２８】異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で
記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証
に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載
される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場
合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示する
ために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本
発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを容
認するものと解釈されるべきではない。

【００２９】定義「ＨＰＫＭ」は自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意のソースか
らの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒトを含む
哺乳類から得られる実質的に精製されたＨＰＫＭのアミノ酸配列である。

【００３０】「アゴニスト」は、ＨＰＫＭに結合される際に、ＨＰＫＭの量を増加するか、
或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴニストはタンパク質、核酸
、炭水化物或いはＨＰＫＭに結合し、その作用を調節する任意の他の分子を含む
場合がある。

【００３１】「アレル」或いは「アレル配列」はＨＰＫＭをコードする遺伝子の代替形であ
る。アレルは、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ、変化した
ｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変化する場合もしな
い場合もある。任意の所与の遺伝子は、１つ或いは多くのアレル形を有する場合
もあれば、全く有さない場合もある。アレルを引き起こす通常の突然変異は一般
に、ヌクレオチドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これらの種類の変
化はそれぞれ単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配列において１
回或いは２回以上生じる場合がある。

【００３２】ＨＰＫＭをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは機能的に等価なＨ
ＰＫＭをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿
入或いは置換を含む。本定義には、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドのあ
る特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出することができる場合
もできない場合もある多形性及びＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチド配列に
対する通常の染色体位置とは異なる位置を有する、アレルへの不適当な或いは予
想外のハイブリダイゼーションが含まれる。またコードされたタンパク質は「変
化して」、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＨＰＫＭをもたらすアミノ
酸残基の欠失、挿入或いは置換も含む場合もある。故意のアミノ酸置換は、ＨＰ
ＫＭの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性
並びにまた両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に
帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミ
ノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電していない極性
頭基（polar head group）有するアミノ酸はロイシン、イソロイシン及びバリン
、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン
、フェニルアラニン及びチロシンを含む。

【００３３】「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペ
プチド或いはタンパク質配列及びそのフラグメント、並びに自然発生或いは合成
分子のことである。ＨＰＫＭのフラグメントは長さが約５〜約１５アミノ酸であ
り、ＨＰＫＭの生物学的活性或いは免疫学的活性を保持していることが好ましい
。「アミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を示すものとして
表されるが、アミノ酸配列等の用語は、示されるタンパク質分子に関連する完全
な自然アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定することを意味しない。

【００３４】「増幅」は、核酸配列のさらなる複製の生成のことであり、一般に当分野にお
いて周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて実行される（例えば、
Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Lab. oratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, pp. 1-5.を参照されたい）。

【００３５】「アンタゴニスト」は、ＨＰＫＭに結合される際にＨＰＫＭの生物学的或いは
免疫学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニストはタンパク質、核
酸、炭水化物或いはＨＰＫＭに結合し、ＨＰＫＭの作用を減少させる任意の他の
分子を含む場合がある。

【００３６】「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Ｆａ、Ｆ（ａｂ′） ₂ 及びＦｖのような無傷の分子及びそのフラグメントのことである。ＨＰＫＭポリペプチドを結合する抗体は、免疫性抗原として対象の小さなペプチドを含む無
傷のポリペプチド或いはフラグメントを用いて作製ことができる。動物（例えば
マウス、ラット或いはウサギ）を免疫するために用いられるポリペプチド或いは
オリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳に由来するか、或いは化学的に合成され、所望
により担体タンパク質に結合することができる。ペプチドに化学的に結合される
通常用いられる担体は、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホール
リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む。その後結合されたペプチドを用いて
動物を免疫する。

【００３７】「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分（すなわちエピトープ）
のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿主動物を免疫する
際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或いは三次元構造体
に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの領域或いは構造体
は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するために、無傷の抗原（
すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン）と競合する場合があ
る。

【００３８】「アンチセンス」は、特異なＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド
配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に相
補的な核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子はペプチド核酸を含み
、合成或いは転写を含む任意の方法により生成することができる。一度細胞内に
導入されれば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然配列と結合し、二
重鎖を形成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「負（マイナス）」
はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正（プラス）」はセンス
鎖を示す場合に用いられることがある。

【００３９】「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは生化学的機能を有
するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然、組換え或いは合
成ＨＰＫＭ、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞において
特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力のことである。

【００４０】「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度条件下でのポ
リヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」の場合、
相補配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のあ
るものだけが結合する「部分的」であるか、或いは完全な相補性が一本鎖分子間
に存在する場合には完全である場合もある。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸
鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。これは核酸鎖
間の結合に及びペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の設計及び使用に依存する増幅反応
において特に重要である。

【００４１】「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」或いは「所与のアミノ酸配列を
含む組成物」は、所与のポリヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列を含む任意の
組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態或いは水溶液状態を含む。Ｈ
ＰＫＭをコードするポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメントを含む組成物
はハイブリダイゼーションプローブとして用いることもできる。そのプローブは
凍結乾燥状態で保管され、炭水化物のような安定化剤と関連することもできる。
ハイブリダイゼーションでは、そのプローブは塩類（例えばＮａＣｌ）、界面活
性剤（例えばＳＤＳ）及び他の組成物（例えばデンハート液、粉乳、サケ精子Ｄ
ＮＡ等）を含む水溶液に分散される場合もある。

【００４２】「コンセンサス配列」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するために再配
列されているもの、或いは５´或いは３´方向にXL-PCR (Perkin Elmer, Norwal
k, CT)を用いて伸長され、再配列されているもの、或いはフラグメント構築用コ
ンピュータプログラム（例えばGELVIEW Fragment Assembly System、GCG, Madis
on WI）を用いて２つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築されているもののことである。ある配列は伸長及び構築のいずれもが施され、コンセンサ
ス配列を生成している。

【００４３】「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析によるＨＰＫＭを
コードするポリヌクレオチドに類似のリボ核酸の存在の検出が、サンプルにおい
てＨＰＫＭをコードするｍＲＮＡの存在を示しており、それによりそのタンパク
質をコードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関があることを示す。

【００４４】「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにおいて変化し、
１つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如することである。

【００４５】「誘導体」は、ＨＰＫＭをコードする核酸配列或いはＨＰＫＭ又はコードされ
たＨＰＫＭの相補配列の化学修飾体のことである。そのような修飾の例示は、水
素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換することである。核酸誘導体は
、自然分子の生物学的及び免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。
誘導体ポリペプチドは、グリコシレーション、ポリエチレングリコール形成（pe
gylation）或いは由来したポリペプチドの生物学的或いは免疫学的機能を保持す
る任意の類似のプロセスにより修飾されるポリペプチドである。

【００４６】「相同性」は相補性の度合いのことである。部分的相同性或いは完全相同性（
すなわち同一）がある。部分的相同性配列は、同一配列が標的核酸にハイブリダ
イズするのを少なくとも部分的に抑制する配列であり、実用的な用語「実質的に
相同性の」を用いることが好ましい。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブ
リダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下でハイブリダイゼーション検定
法（サザンブロット或いはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーション等）
を用いて検査することができる。実質的に相同的な配列或いはプローブは、低い
厳密性の条件下で完全に相同的な配列及びプローブの標的配列への結合と競合し
、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は非特異な結合が許容されるよう
な条件であることは言うまでもない。低い厳密な条件は、２つの配列の互いへの
結合が特異な（すなわち選択的な）相互作用であることを必要とする。非特異な
結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在しない（例えば約３０％同一性
より小さい）第２の標的配列の使用により検査される場合もある。非特異な結合
が存在しない場合、そのプローブは第２の非相補的標的配列にハイブリダイズし
ないであろう。

【００４７】「パーセント同一性」或いは「％同一性」という表現は、２以上のアミノ酸ま
たは核酸配列を比較する際の配列類似性のパーセンテージである。パーセント同
一性は、例えばMegAlignプログラム（DNASTAR, Inc., Madison WI）を用いることによって電子工学的に求めることができる。このMegAlign^TMプログラムは、異
なる方法、例えばクラスタ法（clustal method）（例えばHiggins, D.G.及びP.M
. Sharp (1988) Gene 73:237-244参照）に従って２以上の配列のアライメントを
作成することができる。このクラスタ法のアルゴリズムでは、配列群を、全ての
配列の対について両配列間の距離を調べることによってクラスタ（集団）にグル
ープ分けする。このクラスタ群について、一対毎にアライメントをとり、次にグ
ループにおいてアライメントをとる。２つのアミノ酸配列、例えば配列Ａと配列
Ｂの間のパーセント類似性は、（配列Ａの長さ−配列Ａにおけるギャップ残基の
数−配列Ｂにおけるギャップ残基の数）／（配列Ａと配列Ｂとの間の残基の一致
の総数）×１００で計算する。２つのアミノ酸配列の間の類似性の差が低いか無
いケースは、パーセント類似性の計算に含められない。核酸配列間のパーセント
同一性も、他の周知の方法、例えばJotun Hein法（例えばHein J. (1990) Metho
ds Enzymol. 183: 626-645参照）によってカウント即ち計算することができる。
配列間の同一性は、他の周知の方法、例えばハイブリダイゼーション条件を変え
ることによっても決定することができる。

【００４８】「ヒト人工染色体」（ＨＡＣ）は、大きさが６ｋｂから１０ＭｂのＤＮＡ配列
を含み、安定した有糸分裂染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含
む直鎖状の小染色体である(例えばHarrington, J.J. et al. (1997) Nat Genet.
15:345-355を参照されたい)。

【００４９】「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるために非抗原結合領域内においてア
ミノ酸が置換されているが、その一方で元の結合能力を保持している抗体分子の
ことである。

【００５０】「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する
任意のプロセスのことである。

【００５１】ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧとＣ塩基との間、並びに相補
的なＡとＴ塩基との間に水素結合を形成することにより２つの核酸配列間に形成
される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用に
よりさらに安定化する場合もある。２つの相補的核酸配列は、逆平行形状におい
て水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液（例えばＣ₀ｔ或いはＲ₀ｔ分析）内に、又は溶液中に存在する一方の核酸配列と固形支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、又は細胞或いはその
核酸が固定されている任意の他の適切な支持体）上に固定化される別の核酸配列
との間に形成することもできる。

【００５２】「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、１つ或いはそれ以上のア
ミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或いはヌクレオチ
ド配列における変化のことである。

【００５３】「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫疾患、又は感染症や遺伝病等と関連のある
状態を指すものである。これらの状態は、細胞や全身の防御系を活性化する様々
な因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の産生に
よって特徴付けることができる。

【００５４】「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ
、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持体上に配列さ
れる個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるアレイのことで
ある。

【００５５】「調節」は、ＨＰＫＭの生物学的活性の変更ことである。例えば調節により、
ＨＰＫＭのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的、機能的或いは免疫学的特
性が増減するようになる。

【００５６】「核酸」或いは「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリ
ヌクレオチド並びにそのフラグメント、一本鎖或いは二本鎖の場合があり、セン
ス鎖或いはアンチセンス鎖を表すゲノム或いは合成起源のＤＮＡ或いはＲＮＡ、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）或いは任意のＤＮＡ様或いはＲＮＡ様物質のことである
。「フラグメント」は、長さが６０ヌクレオチドより長い核酸配列であり、長さ
が少なくとも１００ヌクレオチド或いは少なくとも１０００ヌクレオチド、さら
に少なくとも１０，０００ヌクレオチドであるフラグメントを含むことが最も好
ましい。

【００５７】本明細書において、用語「機能的に関連する」又は「機能的に結び付いた」は
、機能的に関連する核酸配列を表す。プロモータは、そのプロモータがコードさ
れるポリペプチドの転写を調節している場合、コード配列の機能的に関連又は機
能的に結びついている。機能的に関連した、又は機能的に結びついた核酸配列は
近接して読み枠内に存在することができるが、ある種のゲノムの配列、例えばリ
プレッサー遺伝子は、コードされるポリペプチドに近接していないが、やはりそ
のポリペプチドの発現を調節するオペレーター配列に結合する。

【００５８】「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約６ヌクレオチドから６０ヌクレオチ
ドの核酸配列、好ましくは約１５−３０ヌクレオチドの核酸配列、より好ましく
は２０−２５ヌクレオチドの核酸配列であり、ＰＣＲ増幅或いはハイブリダイゼ
ーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、オリゴヌクレ
オチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アンプリマ」、「
プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価である。

【００５９】「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、リジンにおいて終端するアミノ酸残基のペプ
チドバックボーンに結合する、長さが少なくとも５ヌクレオチドからなるオリゴ
ヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子（anti-gene agent）ことである。ＰＮＡはポリエチレングリコール化され、細胞の寿命を延長し、その
中で相補一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡを優先的に結合し、転写延長を停止する（例え
ばNielsen PE 等(1993) Anticancer Drug Des 8:53-63を参照されたい）。

【００６０】「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ＨＰＫＭをコードする核酸或いはそ
のフラグメント又はＨＰＫＭ自体を含むと予想される生物学的サンプルは、溶液
中に存在するか、或いは固形支持体、組織、組織転写物（tissue print）等に結
合されている体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官或いは細胞から単離さ
れた膜、細胞、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ或いはｃＤＮＡを含む。

【００６１】「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或いはペプチドとア
ゴニスト、抗体とアンタゴニストとの間の相互作用のことである。その相互作用
は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造（すなわち抗原決定基或
いはエピトープ）の存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して
特異である場合には、標識された「Ａ」を含むある反応におけるエピトープＡ（
或いは遊離し、標識されないＡ）及びその抗体を含むタンパク質の存在が、その
抗体に結合される標識されたＡの量を減らすであろう。

【００６２】「厳密な条件」は、ポリヌクレオチド配列と、特許請求の範囲に記載されたポ
リヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを許容する条件のことであ
る。適切なレベルの厳密な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーション領域における塩又はホルムアミドの濃度、又はハイブリダ
イゼーション温度によって決定することができ、当分野でよく知られている。詳
述すると、厳密性は、塩の濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を上昇さ
せること、又はハイブリダイゼーション温度を高めることによって高めることが
できる。

【００６３】例えば、高い厳密な条件の下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃〜４２
℃における約５０％のホルムアミド濃度で生じるようになる。低い厳密な条件の
下でのハイブリダイゼーションは、約３０℃〜３５℃の温度での約３５％〜２５
％のホルムアミド濃度で生じるようになる。詳細には、高い厳密な条件の下での
ハイブリダイゼーションは、５０％のホルムアミド濃度、５ＸＳＳＰＥ、０．
３％ＳＤＳ、及び２００μｇ／ｍｌの剪断された変性サケ精子ＤＮＡを用いて４
２℃で生じるようになる。低い厳密な条件の下でのハイブリダイゼーションは、
上記の条件で、温度を３５℃に下げ、ホルムアミド濃度を３５％にする際に生じ
るようになる。特定のレベルの厳密性に対応する温度範囲は、目的の核酸のプリ
ン対ピリミジン比を計算し、それに従って温度を調節することによってさらに狭
めることができる。上記の温度範囲及び条件の変更については当分野で周知であ
る。

【００６４】「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単離されるか或いは
分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それらは自然に関連する
他の成分を少なくとも６０％、好適には７５％、最も好適には９０％含まないも
のである。

【００６５】「置換」は、１つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸が、それぞれ
異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。

【００６６】「形質転換」は、外来ＤＮＡが侵入し、受容体細胞を変化させるプロセスを意
味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或いは人工的条件
下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核或いは真核宿主
細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。その方法は形質転
換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイルス感染、電気穿
孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合がある。そのよ
うに「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含んでおり、その
細胞では挿入されたＤＮＡが、自動的に複製するプラスミド或いはその宿主染色
体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞は、限られた期
間だけ挿入されたＤＮＡ或いはＲＮＡを一時的に発現する細胞も含む。

【００６７】ここで用いるＨＰＫＭの「変異体」は、１つ或いはそれ以上のアミノ酸により
変更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合があ
り、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き換え
る場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではある
が、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保存的
に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入、
又はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなくア
ミノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを判定する際の指標は、当業者に周
知のコンピュータプログラム、例えばDNASTARソフトウエアを用いて見出すことができる。

【００６８】発明本発明は、新規のヒトプロテインキナーゼ分子（ＨＰＫＭ）、ＨＰＫＭをコー
ドするポリヌクレオチド及び癌並びに免疫障害の診断、治療及び予防のためのこ
れらの組成物の使用法に基づいている。表１はここで開示する各ヒトプロテイン
キナーゼ分子に対する配列識別番号、インサイト社クローン識別番号及びｃＤＮ
Ａライブラリを示す。

【００６９】

【表１】

【００７０】本発明のＨＰＫＭ−１をコードする核酸は最初にアミノ酸配列アライメントに
対するコンピュータ検索を用いてマスト細胞株ｃＤＮＡライブラリ（ＨＭＣ１Ｎ
ＯＴ０１）からのインサイト社クローン２９４０において同定された。コンセン
サス配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：７は重複並びにまた伸長した核酸配列、インサイ
ト社クローン００２９４０（ＨＭＣ１ＮＯＴ０１）、１６１２０７（ＡＤＥＮＩ
ＮＢ０１）、１２７２７０７（ＴＥＳＴＴＵＴ０２）、１６７９４８２（ＳＴＯ
ＭＦＥＴ０１）、３２７９０３１（ＳＴＯＭＦＥＴ０２）及び３９３３７１８（
ＰＲＯＳＴＵＴ０９）に由来した。

【００７１】一実施例では、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドを含む。ＨＰＫＭ−１は長さが３４７アミノ酸であり、Ｎ６０及びＮ２８
２に２つの潜在的なＮグリコシレーション部位及びＴ２３５においてｃＡＭＰ及
びｃＧＭＰ依存プロテインキナーゼのための、またＴ７３，Ｓ１１１、Ｔ１７１
及びＳ２８０においてカゼインキナーゼＩＩのための、またＴ１７９、Ｓ２３０
、Ｔ２８４、Ｓ３１６及びＳ３３４においてプロテインキナーゼＣのための潜在
的なリン酸化部位を有する。ＨＰＫＭ−１はプロテインキナーゼ触媒ドメインの
ための２つの潜在的なサイン配列を含む。第１の配列は、配列Ｌ８３〜Ｋ１０６
であり、Ｋ１０６がＡＴＰ結合に関係し、第２の配列は配列Ｖ１９９〜Ｌ２１１
であり、Ｄ２０３が酵素の触媒活性のために重要である。約ヌクレオチド２６７
〜約ヌクレオチド３２４のＳＥＱＩＤＮＯ：７のフラグメントはハイブリダイ
ゼーションプローブとして有用である。ノーザン分析は胎児、造血及び免疫系の
ｃＤＮＡライブラリにおいてこの配列の発現を示す。これらのライブラリの約４
１％は癌に関連し、その４１％は炎症及び免疫反応に関連する。

【００７２】本発明のＨＰＫＭ−２をコードする核酸は最初にアミノ酸配列アライメントに
対するコンピュータ検索を用いて心臓ｃＤＮＡライブラリ（ＨＥＡＲＮＯＴ０１
）からのインサイト社クローン３０７６２４において同定された。コンセンサス
配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：８は重複並びにまた伸長した核酸配列、インサイト社
クローン３０７６２４（ＨＥＡＲＮＯＴ０１）、３８６２９０（ＴＨＹＭＮＯＴ
０２）、５２９４５０（ＢＲＡＩＮＯＴ０３）及び３２４６４２６（ＢＲＡＩＮ
ＯＴ１９）に由来した。

【００７３】別の実施例では、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸を有するポリペプ
チドを含む。ＨＰＫＭ−２は長さが６８８アミノ酸であり、残基Ｎ３０５に潜在
的なＮグリコシレーション部位及び及びＳ７６７においてｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ
依存プロテインキナーゼのための、またＳ９、Ｔ４１、Ｓ５２、Ｔ１２１、Ｔ２
７８、Ｔ３２８、Ｔ３３８、Ｔ３７６、Ｓ４２９、Ｔ４７８、Ｓ４９７、Ｔ５６
３、Ｓ５８８、Ｓ５９３、Ｓ６４０及びＳ６７６においてカゼインキナーゼＩＩ
のための、またＳ５、Ｓ１１、Ｔ３３８、Ｓ３８０及びＳ６１６においてプロテ
インキナーゼＣのための潜在的なリン酸化部位を有する。ＨＰＫＭ−２はプロテ
インキナーゼ触媒ドメインのための２つの潜在的なサイン配列を含む。第１の配
列は、配列Ｌ８７〜Ｋ１１０であり、Ｋ１１０がＡＴＰ結合に関係し、第２の配
列は配列Ｉ２１０〜Ｍ２２２であり、Ｄ２１４が酵素の触媒活性のために重要で
ある。約ヌクレオチド５４２〜約ヌクレオチド６２０のＳＥＱＩＤＮＯ：８の
フラグメントはハイブリダイゼーションプローブとして有用である。ノーザン分
析は心臓血管、造血、免疫及び生殖ｃＤＮＡライブラリにおいてこの配列の発現
を示す。これらのライブラリの約４６％は癌に関連し、その２７％は炎症及び免
疫反応に関連する。

【００７４】本発明のＨＰＫＭ−３をコードする核酸は最初にアミノ酸配列アライメントに
対するコンピュータ検索を用いて末梢血顆粒球ｃＤＮＡライブラリ（ＮＥＵＴＦ
ＭＴ０１）からのインサイト社クローン３３９９６３において同定された。コン
センサス配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：９は重複並びにまた伸長した核酸配列、イン
サイト社クローン３３９９６３（ＮＥＵＴＦＭＴ０１）、４１２７９１（ＢＲＳ
ＴＮＯＴ０１）、１７５７０２３（ＰＩＴＵＮＯＴ０３）、２５４３７６８（Ｕ
ＴＲＳＮＯＴ１１）、２６６９８０８（ＥＳＯＧＴＵＴ０２）、２６９５３４９
（ＵＴＲＳＮＯＴ１２）及び２９３８０１６（ＴＨＹＭＦＥＴ０２）に由来した
。

【００７５】別の実施例では、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸を有するポリペプ
チドを含む。ＨＰＫＭ−２は長さが４５１アミノ酸であり、残基Ｎ１８２に潜在
的なＮグリコシレーション部位及び及びＳ３３及びＳ１１２においてｃＡＭＰ及
びｃＧＭＰ依存プロテインキナーゼのための、またＳ３６、Ｓ６１、Ｔ１３４、
Ｓ２１５、Ｔ２５３、Ｔ２９８及びＴ４３５においてカゼインキナーゼＩＩのた
めの、またＳ４、Ｓ２２、Ｓ２６、Ｓ１０５、Ｓ１０８、Ｓｌ１２、Ｓ１２８、
Ｔ２８３、Ｓ３０９、Ｔ３７４及びＴ４３１においてプロテインキナーゼＣのた
めの、またＹ５６及びＹ６７においてチロシンキナーゼのための潜在的なリン酸
化部位を有する。ＨＰＫＭ−３はプロテインキナーゼ触媒ドメインのための２つ
の潜在的なサイン配列を含む。第１の配列は、配列Ｌ１３５〜Ｋ１５９であり、
Ｋ１５９がＡＴＰ結合に関係し、第２の配列は配列Ｉ２５２〜Ｆ２６４であり、
Ｄ２５６が酵素の触媒活性のために重要である。約ヌクレオチド３７７〜約ヌク
レオチド４３４のＳＥＱＩＤＮＯ：９のフラグメントはハイブリダイゼーショ
ンプローブとして有用である。ノーザン分析は心臓血管、男女生殖、神経系、造
血及び免疫系ｃＤＮＡライブラリにおいてこの配列の発現を示す。これらのライ
ブラリの約５９％は癌に関連し、その３０％は炎症及び免疫反応に関連する。

【００７６】本発明のＨＰＫＭ−４をコードする核酸は最初にアミノ酸配列アライメントに
対するコンピュータ検索を用いて単核細胞ｃＤＮＡライブラリ（ＭＭＬＲ１ＤＴ
０１）からのインサイト社クローン４７２４８０において同定された。コンセン
サス配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０は重複並びにまた伸長した核酸配列、インサ
イト社クローン４７２４８０（ＭＭＬＲ１ＤＴ０１）、２１４９５７６（ＢＲＡ
ＩＮＯＴ０９）、２１９３８１２（ＴＨＹＲＴＵＴ０３）及び３１２３６５３（
ＬＮＯＤＮＯＴ０５）に由来した。

【００７７】別の実施例では、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸を有するポリペプ
チドを含む。ＨＰＫＭ−２は長さが５５６アミノ酸であり、残基Ｍ１及びＴ３１
との間に潜在的なシグナルペプチド配列を有する。また残基Ｎ５２０に潜在的な
Ｎグリコシレーション部位及びＴ３１、Ｔ５４、Ｔ１０４、Ｓ１３５、Ｔ１４８
、Ｓ１７６、Ｓ１９１、Ｓ３６６、Ｓ３９８、Ｓ４１０、Ｓ４３１及びＳ５４９
においてカゼインキナーゼＩＩのための、またＴ１０４、Ｔ２２６、Ｔ２５５及
びＴ３２２においてプロテインキナーゼＣのための、またＹ１７０においてチロ
シンキナーゼのための潜在的なリン酸化部位を有する。ＨＰＫＭ−４はプロテイ
ンキナーゼ触媒ドメインのための２つの潜在的なサイン配列を含む。第１の配列
は、配列８８〜Ｋ１１１であり、Ｋ１１１がＡＴＰ結合に関係し、第２の配列は
配列Ｉ２０１〜Ｌ２１３であり、Ｄ２０５が酵素の触媒活性のために重要である
。約ヌクレオチド３３８〜約ヌクレオチド４５１のＳＥＱＩＤＮＯ：１０のフ
ラグメントはハイブリダイゼーションプローブとして有用である。ノーザン分析
は造血、免疫系及び神経系ｃＤＮＡライブラリにおいてこの配列の発現を示す。
これらのライブラリの約２５％は癌に関連し、その５０％は炎症及び免疫反応に
関連する。

【００７８】本発明のＨＰＫＭ−５をコードする核酸は最初にアミノ酸配列アライメントに
対するコンピュータ検索を用いて結腸腫瘍ｃＤＮＡライブラリ（ＣＯＬＮＴＵＴ
０２）からのインサイト社クローン１２２２９８４において同定され、コンセン
サス配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１は、重複並びにまた伸長した核酸配列、イン
サイト社クローン３５０６２７（ＬＶＥＮＮＯＴ０１）、４５１１３６（ＴＬＹ
ＭＮＯＴ０２）、８７１５５６（ＬＵＮＧＡＳＴ０１）、１２２２９８４（ＣＯ
ＬＮＴＵＴ０２）及び２８２０４６４（ＢＲＳＴＮＯＴ１４）に由来した。

【００７９】別の実施例では、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを含む。ＨＰＫＭ−５は長さが６６２アミノ酸であり、Ｎ１０８、Ｎ１
７５、Ｎ２８２及びＮ４２４において潜在的なＮグリコシレーション部位を有す
る。またＳ１０７においてｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存プロテインキナーゼの
ための、Ｓ８５、Ｔ１１０、Ｓ１１１、Ｓ１２０、Ｔ１２４、Ｔ２５２、Ｔ３３
０、Ｓ４５６、Ｓ４８３、Ｓ５００、Ｔ５３０、Ｔ５８２及びＳ６３９において
カゼインキナーゼＩＩのための、またＴ５、Ｔ２６７、Ｓ２９２、Ｔ４００、Ｓ
４０４及びＳ６３９においてプロテインキナーゼＣのための、またＹ３４３及び
Ｙ６４６においてチロシンキナーゼのための潜在的なリン酸化部位を有する。Ｈ
ＰＫＭ−２はヒトＦＡＳＴキナーゼ（ＧＩ１００６６５９）と化学的及び構造
的に相同性がある。詳細にはＨＰＫＭ−２及びＦＡＳＴキナーゼは１８％相同性
を有する。ＨＰＫＭ−２及びＦＡＳＴキナーゼは、２つのタンパク質間の二次構
造において潜在的な類似性を示す７つのシステイン残基を共有する。約ヌクレオ
チド８４９〜約ヌクレオチド９００のＳＥＱＩＤＮＯ：１１のフラグメントは
、ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。ノーザン分析は心臓血管
、胃腸、及び男女生殖ｃＤＮＡライブラリにおいてこの配列の発現を示す。この
ライブラリの約５６％は癌に関連し、２５％は炎症及び免疫反応に関連する。

【００８０】本発明のＨＰＫＭ−６をコードする核酸は最初にアミノ酸配列アライメントに
対するコンピュータ検索を用いて卵巣ｃＤＮＡライブラリ（ＯＶＡＲＮＯＴ０３
）からのインサイト社クローン２０６１８４４において同定された。コンセンサ
ス配列、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２は重複並びにまた伸長した核酸配列、インサイ
ト社クローン０３２３４１（ＴＨＰ１ＮＯＢ０１）、１３８１１１７及び１３９
９８６５（ＢＲＡＩＴＵＴ０８）、１４７８５１５及び１４８５８８６（ＣＯ
ＲＰＮＯＴ０２）、１６７５３１０（ＢＬＡＤＮＯＴ０５）、２０６１８４４（
ＯＶＡＲＮＯＴ０３）、２２１３０７９（ＳＩＮＴＦＥＴ０３）、２５１６４５
３（ＬＩＶＲＴＵＴ０４）並びに３６８４９７６（ＨＥＡＡＮＯＴ０１）に由来
した。

【００８１】別の実施例では、本発明はＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを含む。ＨＰＫＭ−６は長さが２１４アミノ酸であり、残基Ｎ１３２に
おいて潜在的なＮグリコシレーション部位を有し、さらにＴ３７においてｃＡＭ
Ｐ−及びｃＧＭＰ−依存プロテインキナーゼのための、Ｔ６１、Ｓ１３４、Ｓ１
４６及びＳ１６５においてカゼインキナーゼＩＩのための、Ｔ１７及びＴ１０５
においてプロテインキナーゼＣのための潜在的なリン酸化部位を有する。ＨＰＫ
Ｍ−６はプロテインキナーゼ触媒ドメインのための２つの潜在的なサイン配列を
含む。第１の配列は、配列Ｌ２０〜Ｋ４４であり、Ｋ４４がＡＴＰ結合に関係し
、第２の配列は配列Ｉ１３３〜Ｌ１４５であり、Ｄ１３７が酵素の触媒活性のた
めに重要である。約ヌクレオチド２２４〜約ヌクレオチド３０５のＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１２のフラグメントはハイブリダイゼーションプローブとして有用である
。ノーザン分析は男女生殖、神経系系及び造血免疫ｃＤＮＡライブラリにおいて
この配列の発現を示す。これらのライブラリの約４８％は癌に関連し、その２９
％は炎症及び免疫反応に関連する。

【００８２】また本発明は、ＨＰＫＭ変異体を含む。好適なＨＰＫＭ変異体はＨＰＫＭアミ
ノ酸配列に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ま
しいＨＰＫＭ変異体はＨＰＫＭに少なくとも約９５％アミノ酸が同一である変異
体であり、ＨＰＫＭの少なくとも１つの機能的或いは構造的特徴を含むまた本発明はＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例で
は本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ
：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１及びＳＥＱＩＤＮＯ
：１２からなる群から選択される核酸配列からなるポリヌクレオチドを含む。

【００８３】また本発明は、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む
。詳細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、ＨＰＫＭをコードするポ
リヌクレオチド配列に少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％
、最も好ましくは少なくとも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有するで
あろう。本発明の特定の態様は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８
、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１及
びＳＥＱＩＤＮＯ：１２からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に少
なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なく
とも約９５％のポリヌクレオチド配列同一性を有するＳＥＱＩＤＮＯ：７、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１１及びＳＥＱＩＤＮＯ：１２からなる群から選択されるポリヌ
クレオチド配列の変異配列を含む。

【００８４】遺伝子コードの縮重の結果として、ＨＰＫＭをコードする多数のヌクレオチド
配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に
最低限の相同性を示すものもあることは当業者には理解されよう。このように本
発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成される
ようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異配列を考慮する。これらの組
み合わせは、自然発生ＨＰＫＭのヌクレオチド配列に適用されるような標準的な
トリプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変形形態が明確
に開示されているものと考慮されたい。

【００８５】ＨＰＫＭをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択され
た厳密な条件下で、自然発生ＨＰＫＭのヌクレオチド配列にハイブリダイズでき
ることが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するＨＰＫＭをコードす
るヌクレオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合もある。コド
ンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペプチド
の発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加してもよい。
コードされたアミノ酸配列を変更することなくＨＰＫＭをコードするヌクレオチ
ド配列及びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期のような
、自然発生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を
生成することを含む。

【００８６】また本発明は、合成化学的に完全に、ＨＰＫＭ及びその誘導体をコードするＤ
ＮＡ配列或いはそのフラグメントを生成することを含む。生成後、本特許出願の
出願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの入手
可能な発現ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に、Ｈ
ＰＫＭをコードする配列或いは任意のそのフラグメントに突然変異を導入するこ
ともできる。

【００８７】また本発明にはに教示されるような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレ
オチド配列、詳細にはＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤ
ＮＯ：６或いはそのフラグメントに示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列が含まれる（例えば、Wahl,G.M及びS.
L.Berger(1987;Methods Enzymol. Vol. 152:399-407)及びKimmel, A.R.(1987;Me
thods Enzymol. Vol 152: 507-511)を参照されたい）。

【００８８】当分野において周知で、一般に入手可能なＤＮＡ配列決定のための方法が本発
明の任意の実施例を実行するために用いられる。これらの方法はDNA polymerase
I, Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland OH))のKlenow fragment、Taq
polymerase (Perkin Elmer)、耐熱性T7 polymerase (Amersham, Chicago IL)或いはGibco BRL (Gaithersburg MD)により市販されているELONGASE Amplificatio
n Systemのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアー
ゼの組み合わせのような酵素を利用する。このプロセスはHamilton Micro Lab 2
200 (Hamilton, Reno NV), Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Wa
tertown MA) 及びABI Catalyst並びに373及び377 DNA sequencers (Perkin Elme
r)のような機器を用いて自動化することが好ましい。

【００８９】ＨＰＫＭをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつプ
ロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において
既知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、用いられる場合が
ある１つの方法、「制限部位」ＰＣＲは、汎用プライマを用いて既知の位置に隣
接する未知の配列を回収する（例えばSarkar. G (1993) PCR Methods Applic 2:
318-322を参照されたい）。詳細には、ゲノムＤＮＡがリンカー配列に対するプライマ及び既知の領域に特異なプライマの存在下で最初に増幅される。その後増
幅された配列は、同じリンカープライマ及び第１のプライマに内在する別の特異
なプライマを用いて第２巡目のＰＣＲにかけられる。各回のＰＣＲの生成物は、
適当なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定され
る。

【００９０】また逆ＰＣＲを利用して、既知領域に基づく多岐プライマを用いて配列を増幅
或いは伸長することもできる（Triglia T等(1988) Nucleic Acids Res 16:8186 ）。プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences I
nc, Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムのような市販のソフトウエアを用
いて、長さが２２−３０ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含量を有し、さ
らに約６８−７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計される。その方
法はいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知の領域に適当なフラグメントを
生成する。その際そのフラグメントは、分子内連結反応により環状にされ、ＰＣ
Ｒテンプレートとして用いられる。

【００９１】用いられる場合がある別の方法は、ヒト及び酵母人工染色体ＤＮＡの既知の配
列に隣接するＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅することを伴う捕獲ＰＣＲ（Lage
rstrom M 等(1991) PCR Methods Applic 1:111-19）である。この方法では、多数の制限酵素消化及び連結を用いて、ＰＣＲを実行する前に遺伝子操作された二
本鎖配列をＤＮＡ分子の未知のフラグメントに配置することができる。

【００９２】未知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は当分野で公知で
ある（例えばParker JD 等 (1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060を参照され
たい)。さらにある方法はＰＣＲ、入れ子状プライマ及びPromoterFinderライブラリを用いて、ゲノムＤＮＡを歩行することができる（Clontech, Palo Alto CA
）。このプロセスによりライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イン
トロン／エクソン接合部を見つける際に有用である。

【００９３】完全長ｃＤＮＡに対してスクリーニングする際に、より長いｃＤＮＡを含むよ
うに大きさを選択されたライブラリを用いることが好ましい。またランダムに初
回抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の５´及び上流領域を含むよ
り大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライ
ブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況
では特に好ましい。ゲノムライブラリは５´非転写制御領域に配列を伸長するた
めに有用な場合がある。

【００９４】市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはＰＣＲ生成物の大きさを解
析したり、或いはそのヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細
管配列決定法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化され
る（各ヌクレオチドに対して１種類の）４つの異なる蛍光性染料及びＣＣＤカメ
ラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力／光強度が適当なソフトウエ
ア（例えばGenotyper及びSequence Navigator 、Perkin Elmer）を用いて電気信
号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示までの
全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプルの
限定された量内に存在する場合があるＤＮＡの小片の配列決定に特に好ましい。

【００９５】本発明の別の実施例では、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチド配列或いは
そのフラグメントが、適当な宿主細胞においてＨＰＫＭ、そのフラグメント或い
はその機能的等価物の発現をもたらすために組換えＤＮＡ分子に用いられる場合
がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価なア
ミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が生成され、この配列を用いてＨＰＫＭ
をクローニングし、発現することもできる。

【００９６】非自然発生コドンを有するＨＰＫＭをコードするヌクレオチド配列を生成する
ことが有利な場合もあることは当業者には理解されよう。例えば、特定の原核或
いは真核宿主により選択されたコドンを選択して、タンパク質発現の割合を増加
したり、或いは自然発生配列から生成される転写物より長い半減期のような所望
の特性を有するＲＮＡ転写物を生成することもできる。

【００９７】本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング
、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりＨＰＫ
Ｍをコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺伝
子操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのラ
ンダムなフラグメント化及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡ混合を用いて、ヌクレオ
チド配列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用い
て、新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先度
の変更、スプライシング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うこともで
きる。

【００９８】本発明の別の実施例では、ＨＰＫＭをコードする自然、修飾或いは組換えポリ
ヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするために異種配列に結合されること
もできる。例えば、ＨＰＫＭ活性のインヒビタ用のペプチドライブラリをスクリ
ーニングするために、市販されている抗体により識別されるキメラＨＰＫＭタン
パク質をコードすることが有用な場合もある。また融合タンパク質は、ＨＰＫＭ
をコードする配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように
遺伝子操作されることもでき、それによりＨＰＫＭは切断され、異種部分から離
れて精製されるようになる。

【００９９】別の実施例では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ＨＰＫＭをコードする
配列を、全体的に或いは部分的に合成することができる（例えばCaruthers MH 等 (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T等(1980) Nuc Acids Res Sy
mp Ser 225-232を参照されたい）。別法では、タンパク質自体が、ＨＰＫＭのア
ミノ酸配列或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合があ
る。例えばペプチド合成は種々の固相技術（例えばRoberge JY 等(1995) Scienc
e 269:202-204を参照されたい）を用いて実行することができ、自動合成は、例えばABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を用いることにより実現することができる。さらにＨＰＫＭのアミノ酸配列或いはその任意の一部は、直接
合成中に変更されるか、並びにまた他のタンパク質或いはその任意の一部からの
配列を用いる化学的方法により結合され、変異体ポリペプチドを生成することも
できる。

【０１００】そのペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製される
ことができる（例えばChiez, R.M. and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol.
182:392-421を参照されたい）。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析或いは配列決定により確認することができる（例えばCreighton, T. (1983) Proteins,
Structures. and. Molecular Prop..erties, WH Freeman and Co., New York,
NYを参照されたい）。

【０１０１】生物学的に有効なＨＰＫＭを発現するために、ＨＰＫＭをコードするヌクレオ
チド配列或いはその機能的等価物が、適当な発現ベクタ、すなわち挿入されたコ
ード化配列の転写及び翻訳のために必要なエレメントを含むベクタ内に挿入され
てもよい。

【０１０２】当業者に周知の方法を用いて、ＨＰＫＭをコードする配列及び適当な転写或い
は翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを作製することができる。これらの方法
は、ｉｎｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術並びにｉｎｖｉｖｏゲノム
組換えを含む（例えば、Sambrook,等(1989) Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, ch. 4, 8, and 16-17;並びにAusubel, F.M.等(1995, and periodic supplements) current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch. 9, 13, and 16を
参照されたい）。

【０１０３】種々の発現ベクタ／宿主系を利用して、ＨＰＫＭをコードする配列を含有し、
発現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換えバクテリオファージ、
プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵母
発現ベクタと形質転換された酵母、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞系（
例えばバキュロウイルス）、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞系（
例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭ
Ｖ）或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系（例えば、Ｔｉ或
いはｐＢＲ３２２プラスミド）又は動物細胞系のような微生物を含む。本発明は
用いられる宿主細胞により制限されない。

【０１０４】「制御エレメント」或いは「調節配列」はベクタの非翻訳領域、すなわちエン
ハンサ、プロモータ並びに５´及び３´非翻訳領域であり、転写及び翻訳を実行
するために宿主細胞タンパク質と相互作用する。そのようなエレメントは強度及
び特異性において異なる場合がある。用いられるベクタ系及び宿主により、構成
的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適当な転写及び翻訳エレメントを用
いることができる。例えばバクテリア系においてクローニングする際に、Bluesc
ript ファージミド(Stratagene, LaJolla CA) のハイブリッドｌａｃＺプロモー
タ或いはpSport 1 プラスミド(Gibco BRL)等の誘導性プロモータを用いることが
できる。バキュロウイルスポリヘドリン（polyhedrin）プロモータは昆虫細胞に
用いられる。植物細胞のゲノムに由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えば
熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ及び貯蔵タンパク質遺伝子）或いは植物ウイルスに
由来するプロモータ或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリー
ダ配列）が、ベクタにクローニングされる場合もある。哺乳動物細胞系では、哺
乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルスに由来するプロモータが好ましい。ＨＰＫ
Ｍをコードする配列の多数の複製を含む細胞株を発生させる必要がある場合には
、ＳＶ４０或いはＥＢＶ系のベクタを適当な選択可能マーカと共に用いることが
できる。

【０１０５】バクテリア系では、いくつかの発現ベクタが、ＨＰＫＭのための使用に応じて
選択されてもよい。例えば大量のＨＰＫＭが抗体を誘導するために必要とされる
とき、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現させるベクタを用いる
ことができる。そのようなベクタは、限定するわけではないが、ＨＰＫＭをコー
ドする配列が、アミノ末端Ｍｅｔ及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基に対
する配列の枠内のベクタに結合されることができ、ハイブリッドタンパク質が生
成される、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及びBluescript(Stratagene)のよう
な発現ベクタ、並びにｐＩＮベクタ（Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Che
m 264:5503-5509）等を含む。またｐＧＥＸベクタ（Promega, Madison WI）を用
いて、外来のポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を
有する融合タンパク質として発現してもよい。一般にそのような融合タンパク質
は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビードへの吸収及びそれに後続する
遊離グルタチオンの存在時の溶出により分離した細胞から容易に精製することが
できる。そのような系内で形成されるタンパク質はヘパリン、トロンビン或いは
第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、対象のクローニングさ
れたポリペプチドが自由にＧＳＴ成分から遊離されるようにする。

【０１０６】酵母、サッカロミセス‐セレビジエでは、α因子、アルコールオキシダーゼ及
びＰＧＨのような構成的及び誘導性プロモータを含むいくつかのベクタを用いる
ことができる（例えば、Ausubel 等 (上記)及びGrant等(1987;Methods in Enzym
ology 153:516-544)を参照されたい）。

【０１０７】植物発現ベクタが用いられる場合には、ＨＰＫＭをコードする配列の発現は、
いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばＣａＭＶの３５Ｓ及
び１９Ｓプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはＴＭＶから
のω−リーダ配列と共に用いることができる（Takamatsu 等 (1987) EMBO J 6:3
07-311）。別法では、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモータ
或いは熱ショックプロモータ（Coruzzi 等 (1984) EMBO J 3:1671-1680; Brogli
e 等 (1984) Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM (1991) Resu
lts Probl Cell Differ 17:85-105）を用いる場合もある。これらの構成体は、直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入されるこ
とができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される（例えば
、Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology
(1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196を参照されたい）。

【０１０８】また昆虫系もＨＰＫＭを発現するために用いることができる。例えばある系で
は、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクタとして
用いて、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞或いはイクラサキンウワバ幼虫（Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現する。ＨＰＫＭをコードする配列は、ポリヘドリン（polyhedrin）遺伝子のようなウイルスの非必須領域
にクローニングし、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＨＰＫＭをコ
ードする配列を有効に挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は非活性になり
、コートタンパク質を欠如する組換えウイルスが生成される。その後組換えウイ
ルスを用いて、ＨＰＫＭが発現される、例えばヨトウガ細胞或いはイクラサキン
ウワバ幼虫を感染させる（例えば、Engelhard EK 等 (1994), Proc Nat Acad Sc
i 91:3224-3227を参照されたい）。

【０１０９】哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。
アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ＨＰＫＭをコードする
配列は、後期プロモータ及び３連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻
訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１或いはＥ３領域
内の挿入により、感染した宿主細胞においてＨＰＫＭを発現することができる生
ウイルスを得ることができる（例えば、Logan and Shenk (1984) Proc Natl Aca
d Sci 81:3655-3659を参照されたい）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エ
ンハンサのような転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加さ
せることができる。

【０１１０】またヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ
とができるＤＮＡのより大きなフラグメントを送達することもできる。治療のた
め、６〜１０ＭのＨＡＣが構成され、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオ
ンアミノポリマ或いはベシクル）を用いて送達される。

【０１１１】また特異な開始シグナルを用いて、ＨＰＫＭをコードする配列のより効率的な
転写を達成することもできる。そのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を
含む。ＨＰＫＭをコードする配列、その開始コドン及び上流配列が適当な発現ベ
クタ内に挿入される場合には、追加の転写或いは翻訳制御シグナルは不要である
。しかしながらコードする配列或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴ
Ｇ開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられるべきである。さらに開
始コドンは、全挿入物を確実に転写するために、正確な読み枠内に置かれなけれ
ばならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の種々の
起源からなることができる。発現の効率は、論文に記載されるように、使用され
る特定の細胞系に適したエンハンサを含有することにより高められる場合がある
（例えば、Scharf D 等 (1994) Results Probl Cell Differ 20: 125-162を参照
されたい）。

【０１１２】さらに宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節できるように、或いは所望の
ように発現したタンパク質を処理できるように選択することができる。そのよう
なポリペプチドの調節は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ
コシル化、リン酸化、脂質化或いはアシル化を含む。またタンパク質の「プレプ
ロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、折りたたみ並
びにまた機能を促進することができる。翻訳後活性のために特異な細胞機構及び
特性機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ
２９３及びＷＩ３８）がAmerican Type Culture Collection（ATTC; Bethesda,
MD）から市販されており、外来タンパク質の正確な調節及びプロセッシングを確
実にするように選択することができる。

【０１１３】長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、安定した発現が望ま
しい。例えば、ＨＰＫＭを安定して発現する細胞株は、複製或いは内性発現エレ
メントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選択可能マーカ遺伝子
を含む発現ベクタを用いて形質転換することができる。ベクタの導入に続いて、
細胞を強化培地内で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えるようにす
る。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることであり、その存在によ
り、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収されるようになる。安
定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに適した組織培養技術
を用いて増殖させることができる。

【０１１４】任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。
これらは、限定はしないが、それぞれｔｋ^-細胞或いはａｐｒｔ^-細胞において用
いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler,M等(1977) C
ell 11:223-32）及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子（Lowy I等(
1980) Cell 22:817-23）含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を
選択のための基準として用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメトトレキセ
ートへの耐性を与え（Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70）、ｎｐｔはアミノグリコシッドネオマイシン及びＧ−４１８への耐性を与え（Colber
e-Garapin F等(1981) J Mol Biol 150:1-14）、ａｌｓ或いはｐａｔはそれぞれクロルスルフロン及びホスフィノトリシン（phosphinotricin）アセチル基転移酵素への耐性を与える（Murry、前掲）。さらに選択可能遺伝子が記載されており、例えば、ｔｒｐＢにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようになり、ｈｉｓＤにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（
histinol）を利用できるようになる（Hartman S.C及びR.C Mulligan(1988)Proc
Natl Acad Sci 85:8047-51）。最近では、アントシアニン、β−グルクロニダー
ゼ及びその基質ＧＵＳ並びにルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリンのような
マーカと共に可視マーカを使用することが普及しており、転換体を同定するのみ
ならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現の量を
定量するために幅広く用いられる（Rhodes CA等(1995) Methods Mol Biol 55:12
1-131）。

【０１１５】マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その
存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ＨＰＫＭをコードする配列がマ
ーカ遺伝子配列内に挿入される場合には、ＨＰＫＭをコードする配列を含む組換
え細胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別法では、
マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でＨＰＫＭをコードする配列と直列
に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に直列型
遺伝子の発現を示す。

【０１１６】別法では、ＨＰＫＭをコードする核酸配列を含み、ＨＰＫＭを発現する宿主細
胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手順は
、限定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のための膜、
溶液或いはチップ系技術を含むＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダ
イゼーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含む。

【０１１７】ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、ＨＰＫＭをコードする
ポリヌクレオチドのプローブ或いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いは
ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは増幅により検出されることができ
る。核酸増幅系アッセイは、ＨＰＫＭをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形
質転換体を検出するために、ＨＰＫＭをコードする配列に基づくオリゴヌクレオ
チド或いはオリゴマを使用することを伴う。

【０１１８】ＨＰＫＭの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルは、そのタンパク
質に対して特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用
いており、当業者には周知である。例えば酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＥ）などである
。ＨＰＫＭにおける２つの非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を
用いる２部位のモノクローナル系イムノアッセイ（monoclonal-based immunoass
ay）が好ましいが、結合タンパク競合測定法が用いられてもよい（例えば、Hamp
ton R 等(1990, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St.
Paul MN)及びMaddox DE 等 (1983, J Exp'Med 158:1211-1216を参照されたい)。

【０１１９】幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸
検定法において用いることができる。ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドに
関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプロ
ーブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端
標識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅を含む。別法では、ＨＰＫ
Ｍをコードする配列或いはその任意の一部が、ｍＲＮＡプローブの生成のために
ベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野において
知られ、市販されており、Ｔ７、Ｔ３或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメ
ラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりｉｎｖｉｔｒｏでＲＮ
Ａプローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々の市販の
キット（Pharmacia&upjohn (Kalamazoo,MI)、Promega (Madison WI)及びUS Bioc
hemical Corp (Cleveland OH)）を用いて行われる。適当なリポータ分子或いは標識が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色
素生産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を含む。

【０１２０】ＨＰＫＭをコードするヌクレオチド配列と形質転換された宿主細胞は、細胞培
養からのタンパク質の発現及び回収のために適した条件下で培養されることがで
きる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまた
ベクタにより、分泌されるか或いは細胞内に含有される。ＨＰＫＭをコードする
ポリヌクレオチドを含む発現ベクタは、原核細胞膜或いは真核細胞膜を介してＨ
ＰＫＭの分泌を促すシグナル配列を含むように設計することができることは当業
者には理解されよう。他の組換え構造を用いて、可溶性タンパク質の精製を容易
にするポリペプチド領域をコードするヌクレオチド配列にＨＰＫＭをコードする
配列を結合する場合もある。そのような精製を容易にする領域は、限定はしない
が、固定化金属上で精製できるようにするヒスチジン−トリプトファンモジュー
ルのような金属キレート化ペプチド、固定化免疫グロブリン上で精製できるよう
にするタンパク質Ａドメイン及びＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製系（Immunex Corp
., Seatile, WA）において用いられるドメインを含む。精製ドメインとＨＰＫＭ
との間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）に対して特異な配列のような分割可能リンカー配列を含有することにより、精製が
容易になる場合もある。１つのそのような発現ベクタが、ＨＰＫＭ及びチオレド
キシン或いはエンテロキナーゼ切断部位に先行する６ヒスチジン残基をコードす
る核酸を含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＡＣ（
Porath, J. 等 (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281)に記載されるような固定化金属イオン親和性クロマトクグラフィ）において精製を容易にし、一方エンテ
ロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からのＨＰＫＭを精製するための手段を提
供する（例えば、Kroll,D.J.等(1993;DNA Cell Biol. 12:441-453を参照されたい)。

【０１２１】組換え生成物に加えて、ＨＰＫＭのフラグメントは、固相技術（Merrifield J
(1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154）を用いる直接ペプチド合成により生成さ
れる場合もある。タンパク質合成は手動技術を用いて或いは自動化により実行さ
れることができる。例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (P
erkin Elmer)を製造者により提供される取扱説明書に従って用いることにより自
動合成を実現してもよい。ＨＰＫＭの種々のフラグメントは化学的に個別に合成
されるか、或いは化学的方法を用いて結合され、完全長分子を生成することがで
きる。

【０１２２】治療本発明のヒトプロテインキナーゼ分子間には化学的及び構造的相同性がある。
さらに、さらにＨＰＫＭは癌及び免疫反応において発現される。それゆえＨＰＫ
Ｍは癌及び免疫障害においてある役割を有するものと考えられる。それゆえＨＰ
ＫＭが発現している癌或いは免疫障害では、ＨＰＫＭの発現を減少させることが
望ましい。ＨＰＫＭの発現が減少した癌或いは免疫障害では、タンパク質を供給
し、発現を増加させることが望ましい。

【０１２３】それゆえ一実施例では、ＨＰＫＭ或いはフラグメント又は誘導体を被検者に投
与して、ＨＰＫＭの発現或いは活性の減少に関連する癌を治療或いは予防するこ
とができる。そのような障害は、限定はしないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒
色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳
房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓
、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子
宮の癌が含まれる。

【０１２４】別の実施例では、ＨＰＫＭ或いはフラグメント又は誘導体を発現することがで
きるベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記癌を含む癌を治療或いは予
防することができる。

【０１２５】さらに別の実施例では、適当な医薬品担体とともに実質的に精製されたＨＰＫ
Ｍを含む医薬品組成物を被検者に投与して、限定はしないが、上記癌を含む癌を
治療或いは予防することができる。

【０１２６】さらに別の実施例では、ＨＰＫＭの活性を調節するアゴニストを被検者に投与
して、限定はしないが、上記癌を含む癌を治療或いは予防することができる。

【０１２７】ＨＰＫＭ或いはフラグメント又は誘導体を被検者に投与してＨＰＫＭの発現或
いは活性の減少に関連する免疫障害を治療或いは予防することができる。そのよ
うな障害は、限定はしないが、ＡＩＤＳ、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、ア
レルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化
症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮
膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑
、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋
本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅班性狼瘡、多発性硬化症、重
症筋無力症、心筋または心膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎
、リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシ、全
身性紅班性狼瘡、全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、及び癌、血
液透析、体外循環の合併症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、
原虫感染、及び蠕虫感染；及び外傷を含む場合もある。

【０１２８】別の実施例では、ＨＰＫＭ或いはそのフラグメント又は誘導体を発現すること
ができるベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む免疫障害を
治療或いは予防することができる。

【０１２９】さらに別の実施例では、適当な医薬品担体とともに実質的に精製されたＨＰＫ
Ｍを含む医薬品組成物を被検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む免
疫障害を治療或いは予防することができる。

【０１３０】さらに別の実施例では、ＨＰＫＭの活性を調節するアゴニストを被検者に投与
して、限定はしないが、上記障害を含む免疫障害を治療或いは予防することがで
きる。

【０１３１】さらに別の実施例では、ＨＰＫＭのアンタゴニストを被検者に投与して、ＨＰ
ＫＭの発現或いは活性の増加に関連する癌を治療或いは予防することができる。
そのような癌は、限定はしないが、上記癌を含む。一態様では、ＨＰＫＭを特異
に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接、或いはＨＰＬＭを発現する細胞
或いは組織に医薬品因子を運ぶためのターゲッティング或いは送達機構として間
接的に用いることもできる。

【０１３２】別の実施例では、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現す
ることができるベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記癌を含む癌を治
療或いは予防することができる。

【０１３３】さらに別の実施例では、ＨＰＫＭのアンタゴニストを被検者に投与して、ＨＰ
ＫＭの発現或いは活性の増加に関連する免疫障害を治療或いは予防することがで
きる。そのような免疫障害は、限定はしないが、上記免疫障害を含む。一態様で
は、ＨＰＫＭを特異に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接、或いはＨＰ
ＬＭを発現する細胞或いは組織に医薬品因子を運ぶためのターゲッティング或い
は送達機構として間接的に用いることもできる。

【０１３４】別の実施例では、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現す
ることができるベクタを被検者に投与して、限定はしないが上記障害を含む免疫
障害を治療或いは予防することができる。

【０１３５】他の実施例では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、
相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投与
される場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製
薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは
相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる
。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに
より有害な副作用に対する危険性を低減することができる。

【０１３６】ＨＰＫＭのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成されるこ
とができる。詳細には、精製されたＨＰＫＭを用いて抗体を生成するか、或いは
医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ＨＰＫＭと特異に結合するものを
同定することができる。

【０１３７】ＨＰＫＭに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて生成することができる。
そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ
、一本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラ
グメントを含む場合がある。中和性抗体（ダイマ形成を抑制する抗体）が特に治
療上の使用に適している。

【０１３８】抗体を生成する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿
主を、ＨＰＫＭ或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴペ
プチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のア
ジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバン
トは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような
ミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプ
チド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのよ
うな表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルヴムが特に好ましい。

【０１３９】ＨＰＫＭに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド
、或いはフラグメントは、少なくとも５アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、
より好ましくは少なくとも１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それら
は自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子から
なる完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ＨＰＫＭアミノ酸の短い伸展部
はキーホールリンペットヘモシアニンのような別のタンパク質の伸展部及びキメ
ラ分子に対して生成される抗体と融合されることもできる。

【０１４０】ＨＰＫＭに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子
の生成を実現する任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術は、
限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢ
Ｖ−ハイブリドーマ技術を含む（Koehler等(1975) Nature 256:495-497、Kozbor
等 (1985) J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983) Proc Natl Acad Sci 8
0:2026-2030、Cole, S.P 等 (1984) Mol. Cell Biol.62:109-120）。

【０１４１】さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及
び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス
プライシングを用いることができる（Morrison 等(1984) Proc Natl Acad Sci 8
1:6851-6855: Neuberger 等(1984) Nature 312:604-608; Takeda 等(1985) Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術を、当
分野で知られた方法を用いて適合して、ＨＰＫＭ特異性一本鎖抗体を生成しても
よい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体が
、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成され
ることもできる（Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:10134-10137）。

【０１４２】また抗体は、リンパ球集団においてin vivoで生成を誘発することにより、或いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文（Orlandi 等(1989, Proc Natl A
cad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:293-299)
に開示されるような非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングすることに
より生成することもできる。

【０１４３】またＨＰＫＭに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させるこ
ともできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子の
ペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ´）２フラグメント及びＦ（
ａｂ´）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成すること
ができるＦａｂフラグメントを含む。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを、所望
の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速にしかも容易に同定
できるように作製してもよい（Huse WD 等 (1989) Science 256:1275-1281）。

【０１４４】種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために
スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗
体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは
免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ
ムノアッセイは典型的には、ＨＰＫＭとその特異的抗体との間の複合形成体を測
定することを含む。２つの非干渉性ＨＰＫＭエピトープに反応するモノクローナ
ル抗体を利用する２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結合タ
ンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox、前掲)。

【０１４５】本発明の別の実施例では、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチド或いはその
任意のフラグメント又は相補配列を治療のために用いる場合もある。一態様では
、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、ｍＲＮＡの転写
を遮断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、ＨＰＫ
Ｍをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換されることができる
。このように相補分子或いはフラグメントを用いて、ＨＰＫＭ活性を調節するか
、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は当分野で
は周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより大きなフ
ラグメントを、ＨＰＫＭをコードする配列のコード化或いは調節領域に沿った種
々の位置から設計することができる。

【０１４６】レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル
スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、
組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある
。当業者には周知の方法を用いて、ＨＰＫＭをコードする遺伝子のポリヌクレオ
チドに相補的な核酸配列を発現するベクタを作製することができる（例えばSamb
rook 等(前掲)及びAusubel 等 (前掲)を参照されたい）。

【０１４７】ＨＰＫＭをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ＨＰＫＭをコードする高
レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと形質
転換することにより遮断されるようになる。そのような作製物は、翻訳できない
センス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。ＤＮＡ内
に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼによ
り無能にされるまで、ＲＮＡ分子を転写し続けることができる。一過性の発現は
、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレメン
トがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。

【０１４８】上記のように遺伝子発現の修飾は、ＨＰＫＭをコードする遺伝子の制御、５´
或いは調節領域（シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン）に対
する相補配列或いはアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはＰＮＡ）を設計す
ることにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置−
１０と＋１０との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に「三重ら
せん」塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑
制がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放されるよ
うになるため、三重らせん対は有用である。三重ＤＮＡを用いる最近の治療の進
歩は、論文（Gee JE 等(1994)In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Immun ologic Approaches, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY, pp.163-177)に記載されている。また相補配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結
合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように設計することができ
る。

【０１４９】リボザイム、すなわち酵素ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの特異な切断を触媒するため
に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖
切断分割が伴う。用いられる例は、ＨＰＫＭをコードする配列のヌクレオチド鎖
切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハン
マヘッドモチーフリボザイムを含む。

【０１５０】任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ
ザイム切断部位ＧＵＡ、ＧＵＵ及びＧＵＣに対して標的分子を走査することによ
り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオ
チドを無能にする副次構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補
標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価す
ることができる。

【０１５１】本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分
野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ
ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を
含む。別法では、ＲＮＡ分子は、ＨＰＫＭをコードするＤＮＡ配列のin vitro及
びin vivo転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモータを用いて種々のベクタ
内に組み込むことができる。別法では、これらのｃＤＮＡ作成物は、相補ＲＮＡ
を合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導的に導入することが
できる。

【０１５２】ＲＮＡ分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能
な修飾は、限定はしないが、分子の５´並びにまた３´末端でのフランキング配
列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな
くホスホロチオネート或いは２´Ｏ−メチルの使用を含む。この概念はＰＮＡの
生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ
チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易には識別
されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾され
た形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に
拡張されることができる。

【０１５３】細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoで使用するのに同様に適している。ex vivo治療の場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻さ
れる自家移植物に対してクローンのように繁殖することができる。形質移入、リ
ポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマによる送達は、当分野で周知の方
法を用いて実現することができる（例えばGoldman, C.K. 等(1997）Nature Biot
echnology 15:462-466を参照されたい)。

【０１５４】上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検体に適用
されることができる。

【０１５５】本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可
能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組
成物は、ＨＰＫＭ、ＨＰＫＭに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト
或いはＨＰＫＭのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或いは限
定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の滅菌の
生体適合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少
なくとも１つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これらの組
成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与
してもよい。

【０１５６】本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内
、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局
所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。

【０１５７】活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ
るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含
む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す
る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis
hing Co. Easton PA)の最新版に見出される。

【０１５８】経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の
製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により
、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤
、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ
る。

【０１５９】経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合
して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは
糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得
られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト
ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは
他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び
アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン
のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、
架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト
リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。

【０１６０】糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮
糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル（carbop
ol gel）、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別
、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣
錠コーティングに加えられる場合もある。

【０１６１】経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ
トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー
ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ
フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤
、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定
化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活
性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合も用いない場
合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁
される場合がある。

【０１６２】非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため
に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注
入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ
キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合
物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親
油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト
リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応
じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ
せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。

【０１６３】局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製
において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。

【０１６４】本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶
解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、封入（entrapping）或
いは凍結乾燥処理による方法で製造される。

【０１６５】医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩
類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶
性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され
たｐＨ範囲４．５−５．５の１ｍＭ−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％スク
ロース、２％−７％マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で
ある。

【０１６６】医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条
件の治療のためにラベルを貼付される。ＨＰＫＭの投与の場合、そのようなラベ
ル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。

【０１６７】本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた
めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の
能力内で果たすことができる。

【０１６８】任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッ
セイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおい
て最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路
が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経
路を確定することができる。

【０１６９】製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばＨＰＫＭ或いはその
フラグメント、ＨＰＫＭの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはＨＰＫＭ
のインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効度及び
毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばＥＤ５０
（集団の５０％において製薬的に有効な量）及びＬＤ５０（集団の５０％が致死
する量）により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指
数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示
す医薬品組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータ
は、ヒトに投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合
物の投与量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくＥＤ５０を含む血中濃度の
範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度及び
投与経路によりこの範囲内で変化する。

【０１７０】厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ
れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或
いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の
重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性／反応を含
む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日毎、毎週或いは
２週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。

【０１７１】通常の投与量は０．１μｇ〜１００，０００μｇまで変化し、投与の経路にも
よるが、全投与量は約１ｇまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手
引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、
タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合
に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の
細胞、状態、位置等に対して特異であろう。

【０１７２】診断別の実施例では、ＨＰＫＭを特異に結合する抗体を、ＨＰＫＭの発現により特
徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はＨＰＫＭ、アゴニスト、アン
タゴニスト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検定法に
おいて用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上記した
方法と同様の方法で調製することができる。ＨＰＫＭに対する診断検定法は、抗
体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてＨＰＫＭを
検出する方法を含む。抗体は、修飾しても修飾しなくても用いることができ、リ
ポータ分子と共有結合或いは非共有結合の何れかで結合することにより標識され
ることができる。当分野において知られる種々のリポータ分子を用いることがで
き、そのいくつかが上記される。

【０１７３】ＨＰＫＭを測定するためのＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ及びＦＡＣＳを含む種々のプロ
トコルが当分野において知られており、ＨＰＫＭ発現の変更されたレベル或いは
異常なレベルを診断するための方法を提供する。ＨＰＫＭ発現のための正常或い
は標準的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出された体液
或いは細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でＨＰＫＭに対する抗体と結合す
ることにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定量するこ
とができるが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現したＨＰＫＭ
の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と
被検者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する。

【０１７４】本発明の別の実施例では、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドを診断のた
めに用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配
列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びＰＮＡを含む。ポリヌクレオチドを
用いて、ＨＰＫＭの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子発現
を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ＨＰＫＭの存否及び過
剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のＨＰＫＭレベルの調節をモニ
タすることができる。

【０１７５】一態様では、ＨＰＫＭ或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含
むポリヌクレオチド配列を検出することができるＰＣＲプローブを用いるハイブ
リダイゼーションにより、ＨＰＫＭをコードする核酸配列を同定することができ
る。非常に特異な領域、例えば５´調節領域内の１０個の特有のヌクレオチド、
或いは特異性の低い領域、例えば特に３´コード化領域の何れかからなるプロー
ブの特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性（最大、高、中
間或いは低）が、そのプローブがＨＰＫＭをコードする自然発生配列、アレルの
みを同定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであろう。

【０１７６】またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ＨＰＫＭをコードす
る配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも５０％を含むことが好まし
い。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡ或いはＲＮＡであり、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１又はＳＥＱＩＤＮＯ：１２の配列に、或いはプロモータ、エンハンサエレメント及び自然発生ＨＰＫＭのイントロ
ンを含むゲノム配列に由来する。

【０１７７】ＨＰＫＭをコードするＤＮＡのための特異なハイブリダイゼーションプローブ
を生成するための手段は、ＨＰＫＭ或いはＨＰＫＭ誘導体をコードする核酸配列
を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含む。そ
のようなベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なＲＮＡポリメラー
ゼ及び適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりin vitroでＲＮＡプローブ
を合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種
々のリポータ群、例えば³²Ｐ或いは³⁵Ｓのような放射性核種、又はアビジン／ビ
オチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フォスファターゼのよ
うな酵素標識により標識されることができる。

【０１７８】ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチド配列はＨＰＫＭの発現に関連する障害
の診断のために用いることができる。そのような障害は、限定はしないが、腺癌
、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、
膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓
、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣
、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー
、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己
免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、ク
ローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性
胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺
炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅班性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力
症、心筋または心膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、リウマ
チ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシ、全身性紅班
性狼瘡、全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、及び癌、血液透析、
体外循環の合併症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染
、及び蠕虫感染；及び外傷のような免疫障害とを含む。ＨＰＫＭをコードするポ
リヌクレオチド配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ドットブロット、又は
他の膜系技術において、又はＰＣＲ技術において、又は変更されたＨＰＫＭ発現
を検出するために患者生検からの体液或いは組織を利用するディップスティック
、ｐｉｎ、ＥＬＩＳＡ検定法或いはマイクロアレイにおいて用いることができる
。そのような定性的或いは定量的方法は当分野において周知である。

【０１７９】特定の態様では、ＨＰＫＭをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特に
上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。Ｈ
ＰＫＭをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハイブ
リダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織サン
プルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプルは
洗浄され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或いは抽
出されたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著しく
変更されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配
列とハイブリダイズされており、サンプル内のＨＰＫＭをコードするヌクレオチ
ド配列の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような検定法
を用いて、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に特定の
治療措置の有効度を評価することができる。

【０１８０】ＨＰＫＭの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対する
正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被検
者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適し
た条件下でＨＰＫＭをコードする配列或いはそのフラグメントと結合することに
より与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得られ
た値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから得ら
れた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される
。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。

【０１８１】一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ
ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため
に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か
ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと
ができる。

【０１８２】癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の
発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検
出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予
防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生
を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。

【０１８３】ＨＰＫＭをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさらな
る診断上の使用は、ＰＣＲの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化学
的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはin vitroで生成されてもよい
。オリゴマは、ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドのフラグメント、或いは
ＨＰＫＭをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのフラグメ
ントを含み、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化された条件下で用い
られることが好ましい。同一の２つのオリゴマ、入れ子状の組のオリゴマ、或い
はオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するＤＮＡ或いはＲＮＡ配列を
検出並びにまた定量するために低い厳密な条件下で用いることができる。

【０１８４】またＨＰＫＭの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオチ
ドの放射標識或いはビオチン標識、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結果が
書き込まれる標準曲線を含む（Melby, P.C. 等 (1993) J. Immunol. Methods, 1
59:235-244; Duplaa, C. 等 (1993) Anal. Blochem. 229-236）。多数サンプルを定量する速度は、ＥＬＩＳＡフォーマットの検定法を実行することにより加速
することができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペク
トル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化がもたらされる。

【０１８５】さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの
に由来するオリゴヌクレオチド或いはその長寸のフラグメントをマイクロアレイ
の標的として用いることもできる。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発
現レベルを同時にモニタし（転写画像を生成するために）、遺伝子変異配列、突
然変異及び多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、
疾患の遺伝的基礎を理解し、かつ疾患を診断し、また治療薬剤の活性を発生及び
モニタするために用いることができる。

【０１８６】一実施例では、当分野で周知の方法を用いてマイクロアレイが準備、使用及び
解析される（例えばBrennan, T.M. et al. (1995) U.S. Patent NO. 5,474,796;
Schena, M. et al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldesch
weiler et al. (1995) PCT applicationWO95/251116; Shalon, D. et al. (1995
) PCT application WO95/35505; Heller, R.A. et al.(1997) Proc. Natl. Acad
. Sci. 94:2150-2155; and Heller, M.J. et al. (1997) U.S. Patent No.5,605
,662を参照されたい）。

【０１８７】本発明の別の実施例では、ＨＰＫＭをコードする核酸配列を用いて、自然発生
ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、又
は例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）、細菌性人工
染色体（ＢＡＣ）、細菌性Ｐ１構造体或いは単一染色体ｃＤＮＡライブラリのよ
うな人工染色体構造にマッピンクされてもよい（例えばPrice, C.M. (1993) Blo
od Rev. 7:127-134; and Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154を参照さ
れたい）。

【０１８８】蛍光in situハイブリダイゼーションは、他の物理的な染色体マッピング技術及び遺伝マップデータと相関をなす（例えばHeinz-Ulrich, et al.(1995) in Me
yers, R.A. (ed.) Molecular.Biology and Biotechnology, VCH Publishers New
York, NY, pp. 965-968を参照されたい）。遺伝子マップデータの例は種々の科
学雑誌或いはOnline Mendelian Inheritance in Man（ＯＭＩＭ）に見出すことができる。物理的染色体マップ上のＨＰＫＭをコードする遺伝子の位置と特定の
疾患或いは特定の疾患に対する素因との間の相関は、その遺伝的疾患に関連する
ＤＮＡの領域の境界を定めることを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用
いて、正常者と保菌者、すなわち感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出す
ることができる。

【０１８９】染色体標本のin situハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカを用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張するため
に用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配
置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカを明ら
かにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体腕或い
はその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺
伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度
疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴから１１ｑ２２−２３まで
への遺伝子連鎖により自然のまま局在されていれば、その領域に対する任意の配
列マッピングが、さらなる研究のための関連或いは調節遺伝子を表すことができ
る(例えばGatti等(1998) Nature 336:577-580を参照されたい)。また本発明のヌ
クレオチド配列を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における
転座、逆位等により染色体位置内の差を検出することができる。

【０１９０】本発明の別の実施例では、ＨＰＫＭ、その触媒作用或いは免疫原性フラグメン
ト又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のものに
おいて化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなスク
リーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持体
に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい。
ＨＰＫＭと被試験因子との間に形成される結合複合体が測定される場合もある。

【０１９１】薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、対象のタンパク質への適
当な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを実現する（例
えばGeysen, et al. (1984) PCT application WO84/03564を参照されたい）。こ
の方法では、ＨＰＫＭに適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプ
ラスチックピン或いはある他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化
合物はＨＰＫＭ或いはそのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合され
たＨＰＫＭが当分野で周知の方法により検出される。また精製されたＨＰＫＭは
、上記の薬物スクリーニング技術において用いるためのプレート上に直接コーテ
ィングされることもできる。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉
し、それを固体支持体上に固定化することもできる。

【０１９２】別の実施例では、ＨＰＫＭを特異に結合することができる中和性抗体がＨＰＫ
Ｍを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを
使用する。このようにして、抗体を用いて、ＨＰＫＭと１つ或いはそれ以上の抗
原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。

【０１９３】さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝
子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ
オチド配列の特性に依存する場合には、ＨＰＫＭをコードするヌクレオチド配列
を、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。

【０１９４】以下の例は、本発明を例示するために与えるものであり、本発明を制限するも
のではない。

【０１９５】

【実施例】

例示のために、インサイト社クローン２０６１８４４を単離したＯＶＡＲＮＯ
Ｔ０３ｃＤＮＡライブラリの準備及び配列決定が記載される。ＬＩＦＥＳＥＱ内
のライブラリのｃＤＮＡの準備及び配列決定は時間とともに変化しており、徐々
に変化することため、ライブラリが作製され、解析された特定の時期に利用可能
なキット、プラスミド及び装置類を使用している。

【０１９６】１ＯＶＡＲＮＯＴ０３ｃＤＮＡライブラリの作製ＯＶＡＲＮＯＴ０３ｃＤＮＡライブラリは、４３歳白人女性から得られた微視
的に正常な卵巣組織から作製された。悪性腫瘍と診断された卵巣を切除するため
に、患者が片側の卵巣卵管摘出を受けた際に、正常及び腫瘍性の組織が切除され
た。患者には以前に正常分娩及び処女子宮摘出の病歴があった。未同定のウイル
ス性肝炎、脳血管障害、アテローム性硬化症、僧帽弁疾患もあった。家族の病歴
には、母親に悪性膵臓癌が、また祖母に悪性乳癌があった。

【０１９７】冷凍組織をBrinkmann Homogenizer Polytron-PT 3000（Brinkmann Instrument
s, INC., Westbury, NJ）を用いて、グアニジウムイソチオシアネートの中でホモジナイズし溶解した。この溶解産物を、Beckman L8-70M超遠心分離器において
Beckman SW28ロータを用いて（Beckman Instruments）、５．７Ｍの塩化セシウムクッションを用いて周囲温度で１８時間、１分当たり２５，０００回転の回転
数で遠心分離した。そのＲＮＡは、StratageneのＲＮＡ単離プロトコル（Strata
gene）に従ってｐＨ４．０の酸性フェノールで２度抽出され、０．３Ｍの酢酸ナ
トリウム及び２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ、ＲＮＡアーゼの無い水
に再懸濁され、３７℃で２５分間ＤＮアーゼ処理された。その反応は等量の酸性
フェノールで停止され、ＲＮＡをOLIGOTEX kit（QIAGEN, Chatsworth, CA）を用
いて単離し、ｃＤＮＡライブラリの作製のために用いた。

【０１９８】このＲＮＡをｃＤＮＡ合成、プラスミドクローニング用のSUPERSCRIPT Plasmi
d System (Life Technologies)における推奨プロトコルに従って取り扱い(Cat.
# 18248-013,Gibco/BRL)、ｃＤＮＡをpSport 1に結合した。その後プラスミドpS
port1をDH5αコンピテント細胞（Cat.#18258-012; Gibco/BRL）に形質転換した。

【０１９９】２ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、Miniprep Kit (Cat. No. 77468; Adva
nced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg MD)を用いて精製した。このキットは９６０個の精製用の試薬を有する９６穴ブロックからなる。推奨
プロトコルを用いたが、以下の点を変更した。１）２５mg/Lのカルベニシリン及
び０．４%のグリセロールと共に１mlの滅菌Terrific Broth（Catalog#22711, Gi
bco/BRL）において細菌を培養した。２）植菌の後、培地を２４時間インキュベートし、インキュベーション終了時に６０μｌの溶解バッファに溶解した。３）
ブロックの内容物が主要なフィルタプレートに加えられる前に、毎分２９００回
転で５分間、Beckman GS-6Rを用いて遠心分離ステップが実行された。４）イソプロパノールをＴＲＩＳバッファに加える任意選択のステップは繰返しては行わ
なかった。プロトコルの最終ステップの終了後、サンプルをBeckman９６穴ブロックに移し、保管した。

【０２００】プラスミドＤＮＡを精製する別の方法は、MAGIC MINIPREPSTM DNA purificati
on system (Cat. No. A7100, Promega)或いはQIAwelVM-8 Plasmid, QIAweU PLUS
DNA及びQIAwell ULTRA DNA Purification Systems (Qiagen, Inc.)を使用する方法を含む。

【０２０１】このｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers （PTC200 from MJ Res
earch, Watertown, MA）及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systems と組み合わせてHamilton Micro Lab 2200 （Hamilton, Reno, NV）を用いてSang
er F.及びA.R. Coulsonの方法（1975, J. Mol. Biol.94:441f）により行われ、読み枠が決定された。

【０２０２】３ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索配列表のヌクレオチド配列及び、それらから類推されるアミノ酸配列を問い合
わせ配列として用いて、例えばGenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIのようなデータベースを検索した。これらのデータベースには既に同定された配列が
注釈付きで含められており、BLAST（Basic Local Alignment Toolを表す）を用いて相同性（類似性）を有する領域をこのデータベースのなかから検索した（Al
tschul. S.F. (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschulら(1990) J. Mol. B
iol. 215:403-10）。

【０２０３】 BLASTは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作成して配列の類似性を決定する。そのアライメントの局所的性質のために、BLASTは厳密な一致、すなわち原核生物（細菌）や真核生物（動物、菌類、又は植物）を起源
とする相同体を求める際に特に有効である。一次配列パターンや二次構造ギャッ
プの問題を処理する際には、参照して本明細書の一部としているSmith R.F.及び
T.F. Smith（1992, Protein Engineering 5:35-51）に記載のアルゴリズムのような他のアルゴリズムを用いることができる。本明細書に開示された配列の長さ
は少なくとも４９ヌクレオチドであり、不必要な塩基は１２％以下である（この
場合、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴではなく、Ｎが記録される）。

【０２０４】 BLAST法は、参照して本明細書の一部としているKarlin. S.及びS.F. Altschul
（1993: Proc. Nat. Acad. Sci. 90:5873-7）に詳細に記載されているように、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索し、発見したあらゆる配列の
一致の統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有意性の閾値を満たす一致の
みを報告する。本出願での閾値は、ヌクレオチドで１０^-25、ペプチドで１０^-8 に設定した。

【０２０５】インサイト社ヌクレオチド配列が霊長類（ｐｒｉ）、齧歯類（ｒｏｄ）及び哺
乳動物（ｍａｍ）配列の場合にＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して検索され、
その後同じクローンから推定されたアミノ酸配列が、GenBank機能タンパク質データベース、哺乳動物（ｍａｍｐ）、脊椎動物（ｖｒｔｐ）及び真核生物（ｅｕ
ｋｐ）に対して相同性を検索された。

【０２０６】４ノーザン分析ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術
であり、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞タイプまたは組織に由来する
ＲＮＡが結合した膜とのハイブリダイゼーションを行う（例えば、Sambrook, 前
掲, ch. 7及びAusubel, F.M. et al. 前掲, ch. 4 and 16を参照されたい）。

【０２０７】 BLAST（Altschul, S.F. 1993及び1990, 前出）を用いる類似のコンピュータ技
術を用いて、GenBank又はLIFESEQ^TMデータベース（Incyte Pharmaceuticals）の
ようなデータベースにおける同一或いは関連する分子を検索した。この分析は、
多くの膜系ハイブリダイゼーションと比較して非常に高速である。さらにコンピ
ュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるかの分類
を決定することができる。

【０２０８】検索の基準値は、積スコア（product score）であり、これは以下の式で定義されるものである。（配列の一致率（％）×最大BLASTスコア（％））／１００この積スコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の両方を
考慮している。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の範囲
で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、通常
積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、スコ
アの低いものも関連する分子として同定することもできる。

【０２０９】ノーザン分析の結果は、ＨＰＫＭをコードする転写物が発生するライブラリの
リストとして報告される。配列の存在量（abundance）及び存在率（percent abu
ndance）のリストも報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反映
し、存在率は、存在量をｃＤＮＡライブラリ内で検出された配列の総数で割った
値である。

【０２１０】５ＨＰＫＭをコードする配列の延長本発明のポリヌクレオチドのうちの１つの配列を用いて、部分ヌクレオチド配
列を完全長まで伸長するためにオリゴヌクレオチドプライマを設計した。１つの
プライマを合成してアンチセンス方向の伸長を開始し、他のプライマを合成して
センス方向の配列を伸長した。プライマを用いて、対象の領域に対する新規で未
知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列の
伸長を容易にした。初期プライマが、OLIGO 4.06 (National Biosciences)或いは他の適当なプログラムを用いてｃＤＮＡから設計され、長さが約２２〜３０の
ヌクレオチドになり、５０％以上のＧＣ含有物を有し、約６８〜７２℃の温度で
標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマ−プライマ
２量体化をもたらすことになるヌクレオチドの伸展は避けられた。

【０２１１】選択されたヒトｃＤＮＡライブラリ（Gibco/BRL）を用いて配列を伸長した。２つ以上の伸長が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸長させるた
めに、追加のプライマの組が設計される。

【０２１２】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを４０ｐｍ
ｏｌかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する場合、ＰＣＲがPelt
ier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA)を用いて、ステップ１１分間９４℃（初期変性）ステップ２１分間６５℃ ステップ３６分間６８℃ ステップ４１５秒間９４℃ ステップ５１分間６５℃ ステップ６７分間６８℃ ステップ７さらに１５サイクル間ステップ４−６の繰返しステップ８１５秒間９４℃ ステップ９１分間６５℃ ステップ１０７分１５秒間６８℃ ステップ１１１２サイクル間ステップ８−１０の繰返しステップ１２８分間７２℃ ステップ１３４℃（保持）のパラメータで実行された。

【０２１３】反応混合物の５−１０μｌ部分標本が低濃度（約０．６−０．８％）アガロー
スミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸長に成功した
かを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、QI
A Quick^TM (QIAGEN Inc.Chatsworth, CA)を用いて精製され、再結合及びクローニングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除され
た。

【０２１４】エタノール沈殿後、その生成物は１３μｌの連結緩衝液中に再溶解され、１μ
ｌＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５ユニット）及び１μｌＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼが加えられ、その混合物は２〜３時間室温で、或いは１６℃で一晩の間イン
キュベートされた。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適当な媒質内に
ある）が３μｌの連結混合物と形質転換され、８０μｌのＳＯＣ媒質内で培養さ
れた（例えばSambrook、前掲、付録Ａ p.2を参照されたい）。３７℃で１時間イ
ンキュベートした後、Ｅ．ｃｏｌｉ混合物が、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertan
i (LB)-agar (Sambrook、前掲、付録Ａ p.1を参照されたい)上に蒔かれた。翌日
、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取られ、適当な市販の滅菌
９６穴微量定量プレートの個々のウエル内に置かれた１５０μｌの液体ＬＢ／２
ｘＣａｒｂ媒質内で培養された。その翌日、各５μｌの一晩おいた培養株が有菌
の９６穴プレートに移され、水で１：１０に希釈された後、５μｌの各サンプル
がＰＣＲアレイに移された。

【０２１５】ＰＣＲ増幅の場合、４ユニットのｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタプライ
マ及び伸長反応のために用いられる１つ或いは両方の遺伝子特異的プライマを含
む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）が各ウエルに加えられた。増幅
は、ステップ１６０秒間９４℃ ステップ２２０秒間９４℃ ステップ３３０秒間５５℃ ステップ４９０秒間７２℃ ステップ５さらに２９サイクルの間ステップ２−４の繰返しステップ６１８０秒間７２℃ ステップ７４℃（保持）の条件で実行された。

【０２１６】ＰＣＲ反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ
れた。ＰＣＲ生成物の大きさが、元の部分ｃＤＮＡと比較され、適当なクローン
が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。

【０２１７】同様にして、ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１又はＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１２のヌクレオチド配列を用いて、上記手順、５´伸長用に設計されたオリ
ゴヌクレオチド及び適当なゲノムライブラリを用いて５´調節配列を得る。

【０２１８】６個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１又はＳＥＱＩＤＮＯ：１２に基
づくハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノ
ムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標
識について特に記載されるが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね
同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドをOLIGO 4.06（National Bioscience）のような最新のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと
、２５０μＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham）及びＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超精細樹脂カラ
ム（Pharmacia & Upjohn）を用いて精製する。毎分１０⁷カウントの標識されたプローブを含むアリコットを、エンドヌクレアーゼ（AseI，Bgl II，EcoRI，Pst
I，Xba1或いはPvuII；DuPont NEN）の１つを用いて切断したヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜系ハイブリダイゼーション分析において用いる。

【０２１９】各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画して、ナイロン膜
（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に転写する。ハイブリダイ
ゼーションは４０℃で１６時間行われる。非特異的シグナルを取り除くため、ブ
ロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウムまでの徐々に厳密性が増す条件で順次室温にて洗浄する。XOMAT AR^TMフィル
ム（Kodak, Rochester, NY）を、Phosphoimager cassette（Molecular Dynamics
, Sunnyvale, CA）においてブロットに数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。

【０２２０】７マイクロアレイ化学的な結合手順及びインクジェット装置を用いて、基質の表面上にアレイエ
レメントを合成することができる（例えば前掲のBaldeschweilerを参照されたい
）。ドット或いはスロットブロットに類似のアレイを用いてエレメントを配列し
、熱的、ＵＶ、機械的或いは化学的結合手順、又は真空システムによりエレメン
トを基質表面に結合することもできる。典型的なアレイは手作業で、或いは利用
可能な方法及び機械を用いて作製し、任意の適当な数のエレメントを含むことが
できる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。走査画像を調べて、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列
の相補性の程度及び相対的な量を求める。

【０２２１】別法では完全長ｃＤＮＡ或いは発現した配列タグ（Expressed Sequence Tag：
ＥＳＴ）がマイクロアレイのエレメントを構成する。本発明のヌクレオチド配列
の１つに対応するか、或いは本発明に関連するｃＤＮＡライブラリから無作為に
選択された完全長ｃＤＮＡ或いはＥＳＴが、適当な基質、例えばスライドガラス
上に配列される。ｃＤＮＡは、例えばＵＶ架橋結合を用いて、熱及び化学的に、
その乾燥することによりスライドガラスに固定される（Schena, M. et al. (199
5) Science 270:467-470, and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6:639-6
45を参照されたい）。基質上のエレメントにハイブリダイズさせるために、蛍光
プローブが準備され、使用される。その基質が上記の手順により解析される。

【０２２２】マイクロアレイ用のプローブ配列は、ポリペプチドを含むシグナル配列のため
の遺伝子コーディングに共通の保存されたタンパク質モチーフを有する配列を見
つけるために、種々のｃＤＮＡライブラリに由来する多数のクローンをスクリー
ニングすることにより選択することができる。一実施例では、ｃＤＮＡライブラ
リから同定された配列が、適当な解析プログラム、例えばBlock 2 Bioanalysis
Program (Incyte, Palo Alto, CA)を用いて、保存されたタンパク質モチーフを有するそれらの遺伝子配列を同定するために解析される。Swiss-Prot Database 及びPROSITEに含まれる配列情報に基づくこのモチーフ解析プログラムは、ゲノム或いはｃＤＮＡ配列から翻訳された未だ特徴付けられていないタンパク質の機
能を決定する方法である（例えばBairoch, A. et al. (1997) Nucleic Acids Re
s. 25:217-221;及びAttwood, T. K. et al. (1997) J. Chem. Inf. CornpUt. Sc
i. 37:417-424を参照されたい）。PROSITEを用いて、極端に配列が異なるために
保存されたモチーフを用いて検出することができない機能的或いは構造的なドメ
インを同定することができる。その方法は重量マトリクス（weight matrices）に基づく。この方法により同定されたモチーフはその後、一致の確率の分布の測
定値を得るために、SWISS-PROTデータベースに対して較正される。

【０２２３】別の実施例では、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて、共有されたモチー
フ、詳細にはコンセンサス配列を見つける（Pearson, W.R. and D.J. Lipman (1
988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448; and Smith, T.F. and M.S. Water
man (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197）。ＨＭＭは最初に音声認識パターンを
試験するために開発されたが、現在、タンパク質及び核酸配列を解析するために
、またタンパク質構造をモデリングするために生物学の分野で用いられている（
Krogh, A. et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; and Coilin, M. et a
l. (1993) Protein Sci. 2:305-314）。ＨＭＭは形に関する確率的な基礎を有し
、アミノ酸或いはヌクレオチドのための位置特異スコアを用いる。そのアルゴリ
ズムは新たに同定された配列からの情報を取りこむまで継続し、そのモチーフ解
析の能力を高める。

【０２２４】８相補的ポリヌクレオチドＨＰＫＭをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自
然発生のＨＰＫＭの発現を低減又は阻害するために用られる。約１５〜約３０個
の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について特に記載されるが、より小さ
な配列或いはより大きな配列フラグメントの場合でも概ね同じ方法を用いること
ができる。Oligo4.06ソフトウェア及びＨＰＫＭのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計することができる。転写を阻害するためには、
最も固有の５′配列から相補的なオリゴヌクレオチドをデザインし、これを用い
てプロモータがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するため
には、相補的なオリゴヌクレオチドをデザインして、リボソームがＨＰＫＭをコ
ードする転写物に結合するのを防ぐ。

【０２２５】９ＨＰＫＭの発現ＨＰＫＭの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクタ内にサブクローニングし、そのベ
クターを宿主細胞に移入することによって達成される。このベクタは、適当なプ
ロモータ、例えば対象のｃＤＮＡと動作可能に関連するクローニング部位のβガ
ラクトシダーゼ上流を含む（例えばSambrook, supra, pp. 404-433; and Rosenb
erg, M. et al. (1983) Methods Enzymol. 101:123-138を参照されたい）。

【０２２６】単離された形質移入菌株を、ＩＰＴＧを用いて標準的な方法で誘導し、初めの
βガラクトシダーゼの８残基、約５〜１５残基のリンカー、及び完全長タンパク
質からなる融合タンパク質を作製する。このシグナル配列が細菌増殖培地へのＨ
ＰＫＭの分泌を誘導し、この培地を以下に記載の活性のアッセイにおいて直接用
いることができる。

【０２２７】１０ＨＰＫＭの活性の実証ＨＰＬＭ活性はγ標識された³²Ｐ−ＡＴＰを用いるタンパク質基質のリン酸化
及びγ放射線同位元素カウンタを用いる取り込まれた放射能の測定により測定す
ることができる。ＨＰＫＭはタンパク質基質、³²Ｐ−ＡＴＰ及びキナーゼバッフ
ァを用いてインキュベートされる。その後基質に取り込まれた³²Ｐは遊離³²Ｐ−
ＡＴＰから電気泳動により分離され、取り込まれた³²Ｐがカウントされる。回収
された³²Ｐの量はアッセイにおけるＨＰＫＭの活性に比例する。リン酸化された
所定のアミノ酸残基の判定は、加水分解されたタンパク質のホスホアミノ酸解析
により行われる。

【０２２８】１１ＨＰＫＭ特異的抗体の産生標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電
気泳動法（例えばHarrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495を参
照されたい）または他の精製技術を用いて実質的に精製されたＨＰＫＭを用いる
。ＨＰＫＭアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を用いて解析して
免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者が周知の手段に
より合成して、当業者に周知の方法で抗体を産生するために用いる。Ｃ末端付近
或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトープの選択方
法は当分野において周知である（例えばAusubel et al. 前掲, ch. 11を参照されたい.）。

【０２２９】典型的にはオリゴペプチドは長さ１５残基で、ｆｍｏｃ（フルオレニルメトキ
シカルボニル）化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod
el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester（
MBS: Ausubel等、前出）と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニ
ン(KLH, Sigma, St.Louis, MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジ
ュバント内でオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体で免疫される。その結果生じる抗血
清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合し、１％ＢＳＡで遮断し、ウサギ
抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと
反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。

【０２３０】１２特異的抗体を用いる自然発生ＨＰＫＭの精製自然発生或いは組換えＨＰＫＭは、ＨＰＫＭに対して特異な抗体を用いる免疫
親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、ＨＰ
ＫＭ抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia＆Upjohn)のような活性化さ
れたクロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより構成される。結合後、製造
者の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。

【０２３１】ＨＰＫＭを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ＨＰＫＭを
選択吸収させる条件下（例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの）で
洗浄される。カラムは、抗体／ＨＰＫＭ結合を分裂させる条件下（ｐＨ２〜３の
緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ）
で溶出され、ＨＰＫＭが回収される。

【０２３２】１３ＨＰＫＭと相互作用する分子の同定ＨＰＫＭ或いはその生物学的活性フラグメントが、¹²⁵I Bolton-Hunter試薬(B
olton AE 等(1973) Biochem J 133:529)を用いて標識される。多穴プレートのウ
エル内に以前に配列された候補分子が、標識されたＨＰＫＭでインキュベートさ
れ、洗浄され、標識されたＨＰＫＭ複合体を有する任意のウエルが検定される。
種々のＨＰＫＭ濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及びＨＰＫＭと候
補分子との関係を示す値を計算する。

【０２３３】上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部
としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は
、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発
明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はその
ような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に
、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは
関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入るものと考慮
されたい。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/12 ４Ｃ０８４ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ４Ｈ０４５ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/68 9/12 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/52 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヒルマン、ジェニファー・エルアメリカ合衆国カリフォルニア州94040・マウンテンビュー・＃12・モンロードライブ 230 (72)発明者ラル、プリーティアメリカ合衆国カリフォルニア州95054・サンタクララ・ラスドライブ 2382 (72)発明者エイカーブラム、イングリッド・イーアメリカ合衆国カリフォルニア州94061・レッドウッドシティー・ジョンソンストリート 1234 (72)発明者シャー、パルビアメリカ合衆国カリフォルニア州94087・サニーベイル・＃５・クイーンシャルロットドライブ 1608 (72)発明者コーレイ、ニール・シーアメリカ合衆国カリフォルニア州94040・マウンテンビュー・＃30・デールアベニュー 1240 (72)発明者ゲグラー、カール・ジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州94025・メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA26 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA12 BA10 CA04 CA12 EA04 GA11 GA16 HA03 HA12 4B050 CC03 DD11 FF14E LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QQ53 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 QX07 4B065 AA26X AA72X AA88X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA29 CA44 CA46 4C084 AA17 BA03 CA62 DC02 NA14 ZA152 ZA452 ZA552 ZA592 ZA662 ZA812 ZA892 ZA962 ZA972 ZB052 ZB072 ZB132 ZB152 ZB262 ZB272 ZB322 ZB332 ZB352 ZC062 ZC312 ZC352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 DA89 EA28 EA51 FA72 FA73 FA74 GA26 HA05 HA06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤＮＯ：６並びにそのフラグメントからなる群から選択されたアミノ酸配列を含む
実質的に精製されたプロテインキナーゼ分子（ＨＰＫＭ）。
【請求項２】請求項１のアミノ酸配列に少なくとも９０％アミノ酸同一
性を有するＨＰＫＭの実質的に精製された変異体。
【請求項３】請求項１のＨＰＫＭをコードする単離され、精製されたポ
リヌクレオチド配列。
【請求項４】請求項３のポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％ポリ
ヌクレオチド同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
【請求項５】請求項３のポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項６】請求項３のポリヌクレオチド配列に厳密な条件下ハイブリ
ダイズする単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項７】請求項３のポリヌクレオチド配列に相補的な単離され、精
製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項８】ＳＥＱＩＤＮＯ：７、ＳＥＱＩＤＮＯ：８、ＳＥＱＩＤＮＯ：９、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１及びＳＥＱ
ＩＤＮＯ：１２並びにそのフラグメントからなる群から選択されたポリヌクレオチド配列を含む単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項９】請求項８のポリヌクレオチド配列に少なくとも９０％ポリ
ヌクレオチド同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
【請求項１０】請求項８のポリヌクレオチド配列に相補的な単離され、
精製されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】請求項３のポリヌクレオチド配列の少なくともフラグメ
ントを含む発現ベクタ。
【請求項１２】請求項１１の発現ベクタを含む宿主細胞。
【請求項１３】ＳＥＱＩＤＮＯ：１、ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：４、ＳＥＱＩＤＮＯ：５、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：６並びにそのフラグメントからなるアミノ酸配列を含むポリペプチドを生
成するための方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項１２の宿主細胞を培養す
る過程と、ｂ）前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有すること
を特徴とする方法。
【請求項１４】適当な医薬品担体とともに請求項１のＨＰＫＭを含む医
薬品組成物。
【請求項１５】請求項１のＨＰＫＭに特異に結合する精製された抗体。
【請求項１６】請求項１のＨＰＫＭの精製されたアゴニスト。
【請求項１７】請求項１のＨＰＫＭの精製されたアンタゴニスト。
【請求項１８】請求項１４の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検
者に投与する過程を含む癌を治療或いは予防するための方法。
【請求項１９】請求項１４の医薬品組成物の有効量を治療を要する被検
者に投与する過程を含む免疫障害を治療或いは予防するための方法。
【請求項２０】請求項１７のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
検者に投与する過程を含む癌を治療或いは予防するための方法。
【請求項２１】請求項１７のアンタゴニストの有効量を治療を要する被
検者に投与する過程を含む免疫障害を治療或いは予防するための方法。
【請求項２２】核酸材料を含む生物学的サンプルにおいてＨＰＫＭをコ
ードするポリヌクレオチドを検出するための方法であって、（ａ）前記生物学的サンプルの前記核酸材料の少なくとも１つに請求項７のポ
リヌクレオチドをハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合
体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイ
ブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおいてＨＰＫＭをコ
ードするポリヌクレオチドの存在と相関をなすことを特徴とする方法。
【請求項２３】前記生物学的サンプルの前記核酸材料が、ハイブリダイ
ゼーション前にポリメラーゼ連鎖反応により増幅されることを特徴とする請求項
２２に記載の方法。