JP2002345469A

JP2002345469A - コエンザイムｑ１０の製造法

Info

Publication number: JP2002345469A
Application number: JP2001127470A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Matsuda; 英幸松田; Makoto Kawamuki; 誠川向; Reika Yajima; 麗嘉矢島
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2001-04-25
Publication date: 2002-12-03
Also published as: WO2002088365A1; EP1391515A1; CZ20033217A3; US20040234975A1; CA2444973A1; EP1391515A4; NO20034781D0; NO20034781L

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属する真菌類
由来のコエンザイムＱ₁₀の側鎖合成遺伝子を利用するこ
とにより、微生物によってコエンザイムＱ₁₀を効率よく
生産する方法を提供する。【解決手段】Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓａｌｂｕｓ
由来の特定のＤＮＡ配列、又はこの配列において１若し
くは複数の塩基が欠失、追加、挿入、置換されたＤＮＡ
配列を有し、デカプレニル２燐酸合成酵素活性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品等として用
いられているコエンザイムＱ₁₀の製造に関する。さらに
詳細には、コエンザイムＱ₁₀の生合成に関するキー酵素
であるコエンザイムＱ₁₀側鎖合成酵素、すなわちデカプ
レニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子をＢｕｌｌｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ属に属する真菌より単離し、これを微生
物に導入することによりコエンザイムＱ₁₀を生成させる
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来のコエンザイムＱ₁₀の製造法は、タ
バコなどの植物由来のコエンザイムを単離してその側鎖
長を合成法により調整する等によって工業的には生産さ
れている。

【０００３】また、コエンザイムＱ₁₀は細菌や酵母など
の微生物から高等動植物に至るきわめて幅広い生物によ
り生産されることが知られており、微生物を培養してそ
の菌体より本物質を抽出する方法が最も有効な一つの製
造法であると考えられ、実際の工業的な生産にも用いら
れている。しかしながら、これらの方法では、生成量が
少なかったり、操作が煩雑であったりする等、その生産
性は良好とは言い難い。

【０００４】また、コエンザイムＱ₁₀の生合成に関わる
遺伝子を単離し、遺伝子組換え技術により当該遺伝子を
増幅しコエンザイムＱ₁₀の生産増強に利用する試みもな
されている。生体内において、コエンザイムＱ₁₀は、多
くの酵素が関与した多段階の複雑な反応によって生成さ
れている。その生合成経路は、原核生物と真核生物では
一部異なっているが、いずれも基本的には大きく３つの
ステップ、すなわち、コエンザイムＱ₁₀のプレニル側鎖
のもとになるデカプレニル２燐酸を合成するステップ、
キノン環のもとになるパラヒドロキシ安息香酸を合成す
るステップ、そして、これらの２つの化合物を結合させ
て置換基を順次変換してコエンザイムＱ ₁₀を完成させる
ステップよりなっている。これらの反応の中で、生合成
反応全体の律速であると言われ、コエンザイムＱ₁₀の側
鎖の長さを決定している反応、すなわちデカプレニル２
燐酸合成酵素の反応は最も重要な反応であると考えられ
る。

【０００５】従って、コエンザイムＱ₁₀を効率よく生産
させる為には、生合成のキー遺伝子であるデカプレニル
２燐酸合成酵素の遺伝子を単離して生産増強に利用する
ことが有効であると考えられ、その遺伝子源としてはコ
エンザイムＱ₁₀を比較的多量に生産している真菌類が有
力な候補となる。

【０００６】これまでにデカプレニル２燐酸合成酵素の
遺伝子としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃhａｒｏｍｙｃ
ｅｓｐｏｍｂｅ（特開平９−１７３０７６）やＧｌｕ
ｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ（特開平
１０−５７０７２）などいくつかの種類の微生物より分
離されているが、本来これらの微生物ではコエンザイム
Ｑ₁₀の生産性が十分とはいえず、これらの微生物では効
率的な培養や分離精製などは出来ていなかった。そこ
で、さらにコエンザイムＱ₁₀を高生産する微生物由来の
本酵素遺伝子を単離することが望まれていた。真菌類由
来のデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子としては、Ｓａ
ｉｔｏｅｌｌａ属微生物からの単離が報告されているが
（ＷＯ００／５６５９）、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属
微生物からの該酵素遺伝子の単離に関しては、報告され
ていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の生産
に関する問題を解決するべく、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ属に属する真菌由来のコエンザイムＱ₁₀の側鎖合成
遺伝子を単離してこれを利用することにより、微生物に
よってコエンザイムＱ₁₀を効率よく生産することを目的
とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成する為
に、本発明では、まず、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属
に属する真菌よりコエンザイムＱ₁₀の生合成に関与する
キー遺伝子、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子を単
離するための検討を重ね、該遺伝子を単離することに成
功し、本発明を完成するに至った。

【０００９】即ち本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は
（ｃ）のＤＮＡ：（ａ）塩基配列が配列番号１に記載の
ものであるＤＮＡ：（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に
おいて１若しくは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／
又は置換された塩基配列を有し、かつデカプレニル２燐
酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
である：（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮ
Ａとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡ。

【００１０】本発明はまた、以下の（ｄ）又は（ｅ）の
タンパク質である：（ｄ）アミノ酸配列が配列番号２に
記載のものであるタンパク質：（ｅ）配列番号２に示す
アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、追加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列から
なり、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタ
ンパク質。

【００１１】本発明はまた、上記（ｄ）及び（ｅ）のタ
ンパク質をコードするＤＮＡである。本発明はまた、上
記ＤＮＡをベクターに組み込んでなる発現ベクターであ
る。本発明はまた、宿主微生物を上記ＤＮＡ又は発現ベ
クターにて形質転換してなる形質転換体である。本発明
はさらに、上記形質転換体を培地中で培養し、培養物中
にコエンザイムＱ ₁₀を生成蓄積し、これを採取すること
を特徴とするコエンザイムＱ₁₀の製造方法でもある。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明者らは、コエンザイムＱ₁₀
を比較的多量に生産しているＢｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ
属に属する真菌から本酵素遺伝子を分離するための検討
を重ねたところ、ＰＣＲ法によって該遺伝子の断片を取
得することに成功した。

【００１３】既知のデカプレニル２燐酸合成酵素、及び
本酵素と類縁で鎖長の違うコエンザイムＱの長鎖プレニ
ル鎖合成酵素であるポリプレニル２燐酸合成酵素の遺伝
子の配列を比較し、その相同性の高い領域についてＰＣ
Ｒプライマーを各種合成した。そしてこれらのプライマ
ーを種々組み合わせ、ＰＣＲの条件をいろいろ検討した
ところ、プライマーＤＰＳ−１（配列表配列番号３）及
びＤＰＳ−１１ＡＳ（配列表配列番号４）を用い、Ｐ
ＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１分→４
３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰り返す
ことにより、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属に属する真菌
ＢｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓａｌｂｕｓＩＦＯ１１
９２の染色体遺伝子から本酵素遺伝子の約２２０ｂｐの
断片が増幅してくることを、その遺伝子の塩基配列を解
析することにより明らかにした。

【００１４】次に本酵素遺伝子の全長を取得するため
に、ＢｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓａｌｂｕｓＩＦＯ
１１９２の菌体からｍＲＮＡを調製し、先に取得した内
部配列を基にプライマーを作製し、５'ＲＡＣＥ法を用
いることにより該酵素遺伝子の５'末端側断片を、ｍＲ
ＮＡに特異的なポリＡ配列に対するオリゴｄＴプライマ
ーでＲＴ−ＰＣＲを行うことにより３'末端側断片を取
得した。さらに、取得したそれぞれの断片の内部配列を
基にプライマーを作成し、これを用いてＰＣＲを行い、
該酵素遺伝子の全長を含むと思われるＤＮＡ断片を取得
した。

【００１５】得られたＤＮＡ断片について塩基配列の決
定を行ったところ、配列表の配列番号１に示した配列を
持つことが明らかとなり、この配列から予想できるアミ
ノ酸配列にはデカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子とし
て特徴的な配列がみられた。

【００１６】本発明のＤＮＡは、塩基配列が配列番号１
に記載のものであるＤＮＡであってもよいし、配列番号
１に示す塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠
失、追加、挿入及び／又は置換された塩基配列を有し、
かつデカプレニル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク
質をコードするＤＮＡであってもよいし、配列番号１に
示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件
でハイブリダイズし、かつデカプレニル２燐酸合成酵素
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても
よい。なお、多くのアミノ酸は１種以上のコドンで規定
される（遺伝暗号の縮重）ことから、配列番号２に示す
アミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡと
しては、配列番号１で示す塩基配列からなるＤＮＡ以外
にも多数存在する。従って、本発明のＤＮＡには、配列
番号２で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコード
するＤＮＡも含まれる。

【００１７】ここで、「１若しくは数個の塩基が欠失、
追加、挿入及び／又は置換された塩基配列」とは、蛋白
核酸酵素増刊遺伝子増幅ＰＣＲ法ＴＡＫＫＡＪ
３５（１７），２９５１−３１７８（１９９０）又はＨ
ｅｎｒｙＡ．Ｅｒｌｉｃｈ編加藤郁之進鑑訳ＰＣ
Ｒテクノロジー（１９９０）等に記載の当業者に周知の
方法により欠失、追加、挿入及び／又は置換できる程度
の数の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換されてな
る塩基配列を意味する。

【００１８】「配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮ
Ａとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮ
Ａ」とは、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡを
プローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション
法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、又はサザン
・ハイブリダイゼーション法等を用いることにより得ら
れるＤＮＡのことをいう。当業者であれば、該ハイブリ
ダイゼーションをＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
２ｎｄＥｄｔ．（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｒｙＰｒｅｓｓ，１９８
９）に記載されている方法に準じて実施して、目的とす
るＤＮＡを容易に取得できる。

【００１９】また、「デカプレニル２燐酸合成酵素活性
を有するタンパク質」とは、配列番号２に示すアミノ酸
配列からなるタンパク質を用いた場合の１０％以上、好
ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、さら
に好ましくは８０％以上の収率でデカプレニル２燐酸を
合成する能力を持つタンパク質のことをいう。このよう
な測定は、ＦＰＰ（ファルネシル２燐酸）と¹⁴Ｃ−ＩＰ
Ｐ（放射ラベルしたイソペンテニル２燐酸）を用いて対
象酵素と反応させ、生成した¹⁴Ｃ−ＤＰＰ（デカプレニ
ル２燐酸）をホスファターゼにより加水分解後、ＴＬＣ
にて分離して、各鎖長のスポットへの取り込みによって
確定する（Ｏｋａｄａｅｔａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５５，５２−５９）。

【００２０】本発明のタンパク質は、アミノ酸配列が配
列番号２に記載のものであるタンパク質であってもよい
し、配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／又は置換され
たアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２燐酸合成
酵素活性を有するタンパク質であってもよい。

【００２１】「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追
加、挿入及び／又は置換されたアミノ酸配列」は、部分
特異的突然変異誘発法など当業者に周知の方法により、
アミノ酸を欠失、追加、挿入及び／又は置換することに
より取得可能である。具体的には、ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄＲｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１００，
４４８（１９８３）等の文献に記載されている。

【００２２】デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子を発現
させるためには、適当なプロモーターの下流に該遺伝子
を接続することが必要であるが、例えば遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を制限酵素によって切り出したり、ＰＣＲによ
って酵素をコードする遺伝子部分のみを増幅させたりし
た後、プロモーターを持つベクターに挿入することによ
り発現ベクターとすることができる。

【００２３】本発明において、デカプレニル２燐酸合成
酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み
込む発現用ベクターとしては特に限定されず、例えば、
大腸菌由来のプラスミドに、適当なプロモーターを組み
込んだものが挙げられる。大腸菌由来のプラスミドとし
ては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１
９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１９等が挙げられ、プロモー
ターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロ
モーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、
λＰＬプロモーター等が挙げられる。

【００２４】また、本発明においては発現用ベクターと
して、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−３Ｔ、ｐＧＥＸ−３
Ｘ（以上、ファルマシア社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔII、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、（東洋紡社製）、ｐＭ
ＡＬＣ２、ｐＥＴ−３Ｔ、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４/ ０３
６１３に記載）等を用いることもできる。このうち、ｐ
ＵＣＮＴが好適に用いられ、具体的な例としては、発現
用ベクターｐＵＣＮＴに配列番号１に示すＤＮＡ配列を
有する遺伝子を挿入すれば、デカプレニル２燐酸合成酵
素遺伝子の発現ベクターを作製することができる。

【００２５】そして、該酵素遺伝子の発現ベクターを適
当な微生物に導入することによりコエンザイムＱ₁₀の生
産に利用することが可能となる。宿主微生物としては特
に限定されず、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉが好
適に用いられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉと
しては特に限定されず、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＢＬ−２
１、ＪＭ１０９、ＮＭ５２２、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、
ＤＨ５等が挙げられる。このうちＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉＤＨ５αが好適に用いられ、例えば、デ
カプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発現ベクター、ｐ
ＮＴＢ１を大腸菌に導入した場合には、大腸菌が本来は
生産しないコエンザイムＱ₁₀を生産するように変換でき
る。この大腸菌菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴＢ
１）は経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技
術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にＦＥＲ
ＭＢＰ−７５１２として寄託されている。

【００２６】本発明で得られた形質転換体を、常法に従
い、培養し、培養物中からコエンザイムＱ₁₀を採取する
ことにより、コエンザイムＱ₁₀を製造することができ
る。宿主微生物がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉで
ある場合は、培地として、ＬＢ培地や、グルコースやカ
ザミノ酸を含むＭ９培地を用いることができる。プロモ
ーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピ
ルチオガラクトシドやインドリル−３−アクリル酸のよ
うな薬剤を培地に加えてもよい。培養は例えば、３７℃
で１７〜２４時間行い、この際必要により通気や攪拌を
行ってもよい。

【００２７】本発明において、得られたコエンザイムＱ
₁₀は精製を行ってもよく、粗精製物として用いてもよ
く、用途により適宜選択することができる。得られた培
養物からコエンザイムＱ₁₀を単離するには公知の分離・
精製法を適宜組み合わせることができる。公知の分離・
精製法としては、塩析や溶媒沈殿等の溶解度を利用する
方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、及び、（ＳＤ
Ｓ−）ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として
分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフ
ィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティークロ
マトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相
高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する
方法、等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法
等が挙げられる。

【００２８】本発明において得られたコエンザイムＱ₁₀
の用途は特に限定されず、医薬品等に好適に用いること
ができる。

【００２９】

【実施例】（実施例１）Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓａ
ｌｂｕｓＩＦＯ１１９２の染色体ＤＮＡをＣ．Ｓ．
Ｈｏｆｆｍａｎらの方法（Ｇｅｎｅ、５７（１９８７）
２６７−２７２）で調製した。既知の長鎖プレニル２燐
酸合成酵素の遺伝子との相同性からＰＣＲに用いるプラ
イマーＤＰＳ−１（配列表配列番号３）及びＤＰＳ−１
１ＡＳ（配列表配列番号４）を設計した。これらを用
いてＰＣＲを９４℃、３分間の熱処理の後、９４℃、１
分→４３℃、２分→７２℃、２分のサイクルを４０回繰
り返すことにより行い、１．２％アガロースゲル電気泳
動により分析した。そして得られた約２２０ｂｐの断片
をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇ
ｌａｓ（商標）ＢｒａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシ
ャムファルマシアバイオテク社製）を用いて精製した
後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７
ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社
製）を用いて大腸菌発現用ベクターにクローニングし、
ｐＴ７−Ｂ１ＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシ
ークエンサー（３７７型、パーキンエルマー社製）を用
い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエルマー社
製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商
標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅ
ｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉ
ｔｈＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明
書に従って反応を行い配列を決定した。その結果、Ｂ
ｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓａｌｂｕｓＩＦＯ１１９
２からは配列表の配列番号１の８３５から１０４４まで
の塩基配列を有するＤＮＡ断片が得られた。これらＤＮ
Ａ断片は、翻訳配列に長鎖プレニル鎖を持つプレニル２
燐酸合成酵素に特徴的な領域のアミノ酸配列「ＧＤＦＬ
ＬＸＲＡ」（Ｘは、ＡまたはＧ）が見出せたことによ
り、デカプレニル２燐酸合成酵素の遺伝子の一部である
ことが想定された。

【００３０】（実施例２）Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｕｓＩＦＯ１１９２を５０ｍＬの７０３培地
（５ｇ/Ｌペプトン、３ｇ/Ｌイーストエキス、３ｇ/
Ｌマルトエキス、１ｇ/ＬグルコースｐＨ６．０）で
２５℃、４８時間培養後３０００回転２０分で集菌し、
菌体を液体窒素で直ぐに凍結させた。凍結した菌体を凍
結状態のまま、−７０℃で冷やしてあった乳鉢に入れて
液体窒素を時折入れて溶けないようにしながら乳棒にて
粉砕した。十分に粉になった菌体をＲＮＡ精製キット
ＲＮｅａｓｙＭａｘｉＫｉｔ（キアゲン社製）を用
いて全ＲＮＡを調製した。抽出した全ＲＮＡをＲＮＡ精
製キットＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（キアゲン社
製）を用いて精製度を上げた。この精製全ＲＮＡからｍ
ＲＮＡ精製キット（Ｏｌｏｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０〈Ｓｕ
ｐｅｒ〉（商標）ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｋｉｔ、宝酒造製）を用いてｍＲＮＡを調製した。

【００３１】（実施例３）Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｕｓＩＦＯ１１９２のデカプレニル２燐酸合
成酵素遺伝子の、実施例１で取得したＤＮＡより３'側
を含むＤＮＡ断片取得を行った。実施例１で取得したＤ
ＮＡ断片の内部配列に基づき作成したプライマーＢ１Ｓ
（配列表配列番号５）とＲＴ−ＰＣＲキット（Ｈｉｇｈ
ｆｉｄｅｌｉｔｙＲＮＡＰＣＲＫｉｔ、宝酒造
製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。そして得られた約
８５０ｂｐの断片をゲルより切り出してＤＮＡ抽出キッ
ト（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ（商標）ＢｒａｎｄＰｒｅｐ
Ｋｉｔ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）を
用いて精製した後、ＰＣＲ産物ダイレクトクローニング
キット（ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、Ｎ
ＯＶＡＧＥＮ社製）を用いて大腸菌発現用ベクターにク
ローニングし、ｐＴ７−Ｂ２ＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基
配列をＤＮＡシークエンサー（３７７型、パーキンエル
マー社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキ
ンエルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）Ｂｉｇ
Ｄｙｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ
ＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫ
ｉｔＷｉｔｈＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標）ＤＮ
Ａｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取
り扱い説明書に従って反応を行い配列を決定した。

【００３２】（実施例４）Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｕｓＩＦＯ１１９２のデカプレニル２燐酸合
成酵素遺伝子の、実施例１で取得したＤＮＡより５'側
を含むＤＮＡ断片取得を行った。実施例２で調製したｍ
ＲＮＡを鋳型にして、実施例３で取得したＤＮＡ断片の
内部配列を基に作成したプライマーＢ７ＡＳＰ（配列表
配列番号６“５'側リン酸化修飾”）を用い、５'-Ｆｕ
ｌｌＲＡＣＥＣｏｒｅＳｅｔ（宝酒造製）を用い
て逆転写反応を行い、実施例３で取得した断片の一部を
含む該遺伝子の５'領域のｃＤＮＡを合成させた。さら
に同キットを用いてｃＤＮＡを環化させた。この環化ｃ
ＤＮＡを鋳型にして、実施例３で既知部分の配列を基に
作成したプライマーＢ５Ｓ（配列表配列番号７）及びプ
ライマーＢ４ＡＳ（配列表配列番号８）でＰＣＲを行っ
た。さらにこのＰＣＲ反応物に対して、プライマーＢ６
Ｓ（配列表配列番号１１）とプライマーＢ３ＡＳ（配列
表配列番号１０）でＰＣＲを行い約９５０ｂｐの断片を
取得した。そして得られた約９５０ｂｐの断片をゲルよ
り切り出してＤＮＡ抽出キット（Ｓｅｐｈａｇｌａｓ
（商標）ＢｒａｎｄＰｒｅｐＫｉｔ、アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社製）を用いて精製した後、ＰＣ
Ｒ産物ダイレクトクローニングキット（ｐＴ７Ｂｌｕｅ
Ｔ−ＶｅｃｔｏｒＫｉｔ、ＮＯＶＡＧＥＮ社製）を用い
て大腸菌発現用ベクターにクローニングし、ｐＴ７−Ｂ
３ＤＰＳを得た。ＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンサ
ー（３１０型、パーキンエルマー社製）を用い、ＤＮＡ
シークエンスキット（パーキンエルマー社製、ＡＢＩ
ＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉ
ｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄ
ｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔＷｉｔｈＡｍｐｔｉ
Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、
ＦＳ）を使用して、その取り扱い説明書に従って反応を
行い、配列を決定した。

【００３３】（実施例５）Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ
ａｌｂｕｓＩＦＯ１１９２のデカプレニル２リン酸
合成酵素遺伝子の全長を得るため、ｐＴ７−Ｂ２ＤＰ
Ｓを鋳型にして、該遺伝子の５'末端の配列を基に作成
したプライマーＢＮ１（配列表配列番号１１）と前記の
プライマーＢ３ＡＳ（配列表配列番号１０）でＰＣＲを
行い５'末端側約９１０ｂｐの断片を取得した。またｐ
Ｔ７−Ｂ３ＤＰＳを鋳型にして、前記のプライマーＢ１
Ｓ（配列表配列番号５）と該遺伝子の３'末端の配列を
基に作成したプライマーＢＣＨ（配列表配列番号１２）
でＰＣＲを行い３'末端側約７５０ｂｐの断片を取得し
た。両断片を混合して変性後徐冷してアニーリングさせ
ＤＮＡポリメラーゼで二本鎖を合成させた。そして、こ
れを鋳型にしてプライマーＢＮ１とプライマーＢＣＨで
ＰＣＲを行い該遺伝子の全長を含むＤＮＡを取得した。
ＤＮＡシークエンサー（３１０型、パーキンエルマー
社製）を用い、ＤＮＡシークエンスキット（パーキンエ
ルマー社製、ＡＢＩＰＲＩＳＭ（商標）ＢｉｇＤｙ
ｅ（商標）ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅ
ｑｕｅｎｃｅＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ
ＷｉｔｈＡｍｐｔｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＦＳ）を使用して、その取り扱
い説明書に従って塩基配列を決定し、Ｂｕｌｌｅｒｏｍ
ｙｃｅｓａｌｂｕｓＩＦＯ１１９２のデカプレニ
ル２燐酸合成酵素遺伝子の全配列を明らかにすることが
できた。約１. ６ｋｂｐのＤＮＡについてその塩基配列
を決定したが、その結果を配列表の配列番号１に示す。
また、この塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列
番号２に示した。

【００３４】（実施例６）実施例４で得られたＤＮＡを
制限酵素ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、発
現用ベクターｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４/ ０３６１３に記
載）に挿入してデカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子の発
現ベクター、ｐＮＴＢ１を作製した。得られた発現ベク
ター、ｐＮＴＢ１の制限酵素地図を図１に示す。なお、
ＤＰＳとは、デカプレニル２燐酸合成酵素遺伝子のコー
ド領域を意味する。

【００３５】（実施例７）デカプレニル２燐酸合成酵素
遺伝子の発現ベクターｐＮＴＢ１を大腸菌ＤＨ５αに導
入し、組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴＢ
１）を作製した。その組換え大腸菌を１０ｍＬのＬＢ培
地で３７℃、一晩振とう培養し、菌を遠心分離（３００
０回転、２０分間）で集めた。菌体を１ｍＬの３％硫酸
水溶液に懸濁し、１２０℃、３０分間熱処理後、２ｍＬ
の１４％水酸化ナトリウム水溶液を添加して更に１２０
℃、１５分間熱処理した。この処理液に３ｍＬのヘキサ
ン・イソプロパノール（１０：２）を添加して抽出し、
遠心分離の後、その有機溶媒層１. ５ｍＬを分離し、減
圧条件で溶媒を蒸発させて乾固した。これを２００μＬ
のエタノールに溶解し、その２０μＬを高速液体クロマ
トグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−１０Ａ）により分
析した。分離には逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｃｋＯＤ
Ｓ−Ａ、２５０×４. ６ｍｍ、Ｓ−５μｍ、１２０Ａ）
を用い、２７５ｎｍの波長の吸光度で生成したコエンザ
イムＱ₁₀を検出した。Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴ
Ｂ１）の結果（移動相：エタノール／メタノール＝２／
１で分析）を図３に示した。図３に示すように、デカプ
レニル２燐酸合成酵素遺伝子を導入して発現させること
によって、組換え大腸菌では、大腸菌が本来生産しない
コエンザイムＱ₁₀を、生産するようになった。得られた
組換え大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴＢ１）
（受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７５１２）は経済産業省産
業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（茨城県つ
くば市東１丁目１番３号）に平成１３年３月１６日に寄
託した。

【００３６】

【発明の効果】コエンザイムＱ₁₀の生合成に関するキー
酵素、デカプレニル２燐酸合成酵素をコードする遺伝子
をＢｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ属の真菌より単離し、配列
決定を行った。また、これを大腸菌に導入して発現させ
ることに成功した。さらに遺伝子配列を改良することに
より著量生産に成功した。本発明の方法を用いることに
より医薬品等として用いられているコエンザイムＱ₁₀を
効率的に製造することができる。

【００３７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 鐘淵化学工業株式会社 <120> コエンザイムＱ１０の製造法 <160> 12 <210> 1 <211> 1584 <212> DNA <213> Bulleromyces albus <400> 1 atg ttt cgt tcg gcg cgg gcg gcc act cga gca gct agg cga gct gcc 48 Met Phe Arg Ser Ala Arg Ala Ala Thr Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala 1 5 10 15 ggg acc agg tca tca ttg atc aaa tcg aca ccc tca ccg gct tcc gat 96 Gly Thr Arg Ser Ser Leu Ile Lys Ser Thr Pro Ser Pro Ala Ser Asp 20 25 30 gtg gcg aat cca tcc ctc gct cag agg tcg ata cga agt ata tcg acg 144 Val Ala Asn Pro Ser Leu Ala Gln Arg Ser Ile Arg Ser Ile Ser Thr 35 40 45 act cga acg tct tcc tcg cct cag aca gca tgg gcg gaa gcg acg gaa 192 Thr Arg Thr Ser Ser Ser Pro Gln Thr Ala Trp Ala Glu Ala Thr Glu 50 55 60 tcc gca cac tcg atc ttg acc cct ccc acg gcc aat tca ccc tct caa 240 Ser Ala His Ser Ile Leu Thr Pro Pro Thr Ala Asn Ser Pro Ser Gln 65 70 75 80 gat ccc cta gaa gcg ata tac agt gaa atc tca aca tta cgt tcg tcc 288 Asp Pro Leu Glu Ala Ile Tyr Ser Glu Ile Ser Thr Leu Arg Ser Ser 85 90 95 ctg ttc agc atg ctt gga tcg tca cat ccg tct ttg gat aaa gtc gca 336 Leu Phe Ser Met Leu Gly Ser Ser His Pro Ser Leu Asp Lys Val Ala 100 105 110 aag tac tac ttc caa gcg gaa gga aaa cac ctt cgt cca cta ctg gtg 384 Lys Tyr Tyr Phe Gln Ala Glu Gly Lys His Leu Arg Pro Leu Leu Val 115 120 125 cta tta ttg tca caa gcg acg aac ggc cta gcc gga agt gat agc tgg 432 Leu Leu Leu Ser Gln Ala Thr Asn Gly Leu Ala Gly Ser Asp Ser Trp 130 135 140 gag agg gcg aga cat gag gct cag agg agg aat gtg gat gac agt ttg 480 Glu Arg Ala Arg His Glu Ala Gln Arg Arg Asn Val Asp Asp Ser Leu 145 150 155 160 acg agc agg gga ggg gta ttg aat gat tgg aat ccg gaa caa atg ggc 528 Thr Ser Arg Gly Gly Val Leu Asn Asp Trp Asn Pro Glu Gln Met Gly 165 170 175 aaa gag gat cag cag agt aat cca gga gcc gtg ttc gcc aac cca ttc 576 Lys Glu Asp Gln Gln Ser Asn Pro Gly Ala Val Phe Ala Asn Pro Phe 180 185 190 agc ata acg ccc tcg aat cgc tca acc ccg tca tca acg tca tca acg 624 Ser Ile Thr Pro Ser Asn Arg Ser Thr Pro Ser Ser Thr Ser Ser Thr 195 200 205 gct tcg aca gaa gcg cca tcc aat gct tcc tcc tct ctc tcc gac att 672 Ala Ser Thr Glu Ala Pro Ser Asn Ala Ser Ser Ser Leu Ser Asp Ile 210 215 220 ttc aac tcg atg ctt cct tcc tcc tcc tca tac acc gtc cct ctt cct 720 Phe Asn Ser Met Leu Pro Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Val Pro Leu Pro 225 230 235 240 ccc tca ctg cag tct tca cct ctg gcc tcg ctg tac agc tcg ccc gga 768 Pro Ser Leu Gln Ser Ser Pro Leu Ala Ser Leu Tyr Ser Ser Pro Gly 245 250 255 acg ccc gag att ctc tcg acg caa aga cgc cta gcg agc atc acc gag 816 Thr Pro Glu Ile Leu Ser Thr Gln Arg Arg Leu Ala Ser Ile Thr Glu 260 265 270 atg atc cac gtt gct tcg tta tta cac gac gac gta att gac aac tcg 864 Met Ile His Val Ala Ser Leu Leu His Asp Asp Val Ile Asp Asn Ser 275 280 285 gca tta cgg cgg aac ctg ccc tct gcc cca tcc gcc ttt ggc tca aaa 912 Ala Leu Arg Arg Asn Leu Pro Ser Ala Pro Ser Ala Phe Gly Ser Lys 290 295 300 ttg tct atc ctc tct ggc gac ttt ttg ctc ggt cgg gca tct gtc gcc 960 Leu Ser Ile Leu Ser Gly Asp Phe Leu Leu Gly Arg Ala Ser Val Ala 305 310 315 320 ctc tcg cgg ctt ggc tcg aat gag gtc gta gag cta ttg gcg acg gtc 1008 Leu Ser Arg Leu Gly Ser Asn Glu Val Val Glu Leu Leu Ala Thr Val 325 330 335 atc gcc aat ctg gtg gaa gga gag gtt ctg caa tta cga gcg acg tcg 1056 Ile Ala Asn Leu Val Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Arg Ala Thr Ser 340 345 350 agc aac gag tcc aca atc gag tgg gat cgg atg ttt gag gag tac atg 1104 Ser Asn Glu Ser Thr Ile Glu Trp Asp Arg Met Phe Glu Glu Tyr Met 355 360 365 agg aag acc tac ttg aag aca gcc agt ctc atg tcg aag tca tgt agg 1152 Arg Lys Thr Tyr Leu Lys Thr Ala Ser Leu Met Ser Lys Ser Cys Arg 370 375 380 gcg gcg gta atc ctc ggt gga tgc gga aga gac att gag agc gaa tgg 1200 Ala Ala Val Ile Leu Gly Gly Cys Gly Arg Asp Ile Glu Ser Glu Trp 385 390 395 400 gtc aag gat gtg gcg tat gga tat gga agg aac ttg ggc att gcg ttc 1248 Val Lys Asp Val Ala Tyr Gly Tyr Gly Arg Asn Leu Gly Ile Ala Phe 405 410 415 cag ctt gtg gac gac gca ctt gac ttt atc ccc gct tcc gac atg ggc 1296 Gln Leu Val Asp Asp Ala Leu Asp Phe Ile Pro Ala Ser Asp Met Gly 420 425 430 aaa ccc tcc gac gga gcc gac cta tca ctc ggt ctc gct acc gca ccc 1344 Lys Pro Ser Asp Gly Ala Asp Leu Ser Leu Gly Leu Ala Thr Ala Pro 435 440 445 gcc ttg ttc gcc tac aag cag aac ccg gcc ttg ggc cct ttg atc ttg 1392 Ala Leu Phe Ala Tyr Lys Gln Asn Pro Ala Leu Gly Pro Leu Ile Leu 450 455 460 cgg aag ttc gag ggt gaa ggg gat gtt caa gct gcc aag aag atg atc 1440 Arg Lys Phe Glu Gly Glu Gly Asp Val Gln Ala Ala Lys Lys Met Ile 465 470 475 480 atg gag tct gat ggt gtg aag gag acg ata aac ctt gca aag aaa ttt 1488 Met Glu Ser Asp Gly Val Lys Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Lys Phe 485 490 495 gca aac tcg gca aag gac ttg tta gag cta tta cca gag agc gag gct 1536 Ala Asn Ser Ala Lys Asp Leu Leu Glu Leu Leu Pro Glu Ser Glu Ala 500 505 510 aga ggg gcg ttg gtc ggc ctc acg aag aag gtt gtg gaa aga gtg 1581 Arg Gly Ala Leu Val Gly Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Arg Val 515 520 525 aag 1584 Lys <210> 2 <211> 528 <212> PRT <213> Bulleromyces albus <400> 2 Met Phe Arg Ser Ala Arg Ala Ala Thr Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala 1 5 10 15 Gly Thr Arg Ser Ser Leu Ile Lys Ser Thr Pro Ser Pro Ala Ser Asp 20 25 30 Val Ala Asn Pro Ser Leu Ala Gln Arg Ser Ile Arg Ser Ile Ser Thr 35 40 45 Thr Arg Thr Ser Ser Ser Pro Gln Thr Ala Trp Ala Glu Ala Thr Glu 50 55 60 Ser Ala His Ser Ile Leu Thr Pro Pro Thr Ala Asn Ser Pro Ser Gln 65 70 75 80 Asp Pro Leu Glu Ala Ile Tyr Ser Glu Ile Ser Thr Leu Arg Ser Ser 85 90 95 Leu Phe Ser Met Leu Gly Ser Ser His Pro Ser Leu Asp Lys Val Ala 100 105 110 Lys Tyr Tyr Phe Gln Ala Glu Gly Lys His Leu Arg Pro Leu Leu Val 115 120 125 Leu Leu Leu Ser Gln Ala Thr Asn Gly Leu Ala Gly Ser Asp Ser Trp 130 135 140 Glu Arg Ala Arg His Glu Ala Gln Arg Arg Asn Val Asp Asp Ser Leu 145 150 155 160 Thr Ser Arg Gly Gly Val Leu Asn Asp Trp Asn Pro Glu Gln Met Gly 165 170 175 Lys Glu Asp Gln Gln Ser Asn Pro Gly Ala Val Phe Ala Asn Pro Phe 180 185 190 Ser Ile Thr Pro Ser Asn Arg Ser Thr Pro Ser Ser Thr Ser Ser Thr 195 200 205 Ala Ser Thr Glu Ala Pro Ser Asn Ala Ser Ser Ser Leu Ser Asp Ile 210 215 220 Phe Asn Ser Met Leu Pro Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Val Pro Leu Pro 225 230 235 240 Pro Ser Leu Gln Ser Ser Pro Leu Ala Ser Leu Tyr Ser Ser Pro Gly 245 250 255 Thr Pro Glu Ile Leu Ser Thr Gln Arg Arg Leu Ala Ser Ile Thr Glu 260 265 270 Met Ile His Val Ala Ser Leu Leu His Asp Asp Val Ile Asp Asn Ser 275 280 285 Ala Leu Arg Arg Asn Leu Pro Ser Ala Pro Ser Ala Phe Gly Ser Lys 290 295 300 Leu Ser Ile Leu Ser Gly Asp Phe Leu Leu Gly Arg Ala Ser Val Ala 305 310 315 320 Leu Ser Arg Leu Gly Ser Asn Glu Val Val Glu Leu Leu Ala Thr Val 325 330 335 Ile Ala Asn Leu Val Glu Gly Glu Val Leu Gln Leu Arg Ala Thr Ser 340 345 350 Ser Asn Glu Ser Thr Ile Glu Trp Asp Arg Met Phe Glu Glu Tyr Met 355 360 365 Arg Lys Thr Tyr Leu Lys Thr Ala Ser Leu Met Ser Lys Ser Cys Arg 370 375 380 Ala Ala Val Ile Leu Gly Gly Cys Gly Arg Asp Ile Glu Ser Glu Trp 385 390 395 400 Val Lys Asp Val Ala Tyr Gly Tyr Gly Arg Asn Leu Gly Ile Ala Phe 405 410 415 Gln Leu Val Asp Asp Ala Leu Asp Phe Ile Pro Ala Ser Asp Met Gly 420 425 430 Lys Pro Ser Asp Gly Ala Asp Leu Ser Leu Gly Leu Ala Thr Ala Pro 435 440 445 Ala Leu Phe Ala Tyr Lys Gln Asn Pro Ala Leu Gly Pro Leu Ile Leu 450 455 460 Arg Lys Phe Glu Gly Glu Gly Asp Val Gln Ala Ala Lys Lys Met Ile 465 470 475 480 Met Glu Ser Asp Gly Val Lys Glu Thr Ile Asn Leu Ala Lys Lys Phe 485 490 495 Ala Asn Ser Ala Lys Asp Leu Leu Glu Leu Leu Pro Glu Ser Glu Ala 500 505 510 Arg Gly Ala Leu Val Gly Leu Thr Lys Lys Val Val Glu Arg Val Lys 515 520 525 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー DPS-1 <400> 3 aaggatcctn ytncaygayg aygt 24 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー DPS-1 1AS <400> 4 arytgnadra aytcncc 17 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー B1S <400> 5 tcggcattac ggcggaacct g 21 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー B7ASP <400> 6 cacaccatca gactc 15 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー B5S <400> 7 tgggtcaagg atgtggcgta 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー B4AS <400> 8 cagattggcg atgaccgtcg c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー B6S <400> 9 gttcgcctac aagcagaacc c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー B3AS <400> 10 ttgagccaaa ggcggatggg 20 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー BN1 <400> 11 aaggatccat atgtttcgtt cggcgcgg 28 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:プライマー BCH <400> 12 ccaagcttct acttcactct ttccac 26

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクターｐＮＴＢ１の制限酵素地図。

【図２】組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α（ｐＮＴ
Ｂ１）による補酵素Ｑ₁₀生産を示すＨＰＬＣチャート。

フロントページの続き (72)発明者矢島麗嘉兵庫県明石市小久保120−55−Ａ804 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA10 BA80 CA03 CA04 CA12 CA20 DA06 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD04 EE01 LL01 LL05 4B064 AD92 CA02 CA19 CC01 CC24 CD30 CE02 CE08 DA01 DA13 4B065 AA26X AA72Y AB01 AC14 AC16 BA02 BB01 BC03 BC26 BD01 BD08 BD16 CA09 CA29 CA43 CA44 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮ
Ａ：（ａ）塩基配列が配列番号１に記載のものであるＤ
ＮＡ：（ｂ）配列番号１に示す塩基配列において１若し
くは数個の塩基が欠失、追加、挿入及び／又は置換され
た塩基配列を有し、かつデカプレニル２燐酸合成酵素活
性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ：（ｃ）配列
番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズし、かつデカプレニル２燐
酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ。
【請求項２】以下の（ｄ）又は（ｅ）のタンパク質：
（ｄ）アミノ酸配列が配列番号２に記載のものであるタ
ンパク質：（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列におい
て１若しくは数個のアミノ酸が欠失、追加、挿入及び／
又は置換されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニ
ル２燐酸合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項３】請求項２記載のタンパク質をコードする
ＤＮＡ。
【請求項４】発現用ベクターに請求項１又は３記載の
ＤＮＡを組み込んでなる発現ベクター。
【請求項５】発現用ベクターは、ｐＵＣＮＴである請
求項４記載の発現ベクター。
【請求項６】発現ベクターは、ｐＮＴＢ１である請求
項５記載の発現ベクター。
【請求項７】宿主微生物を請求項１、又は３記載のＤ
ＮＡにて形質転換してなる形質転換体。
【請求項８】宿主微生物を請求項４、５又は６記載の
発現ベクターにて形質転換してなる形質転換体。
【請求項９】宿主微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉである請求項７又は８記載の形質転換体。
【請求項１０】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５αであ
る請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】形質転換体は、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５
α（ｐＮＴＢ１）（ＦＲＰＭＢＰ−７５１２）である
請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】請求項７、８、９、１０又は１１記載
の形質転換体を培地中で培養し、培養物中にコエンザイ
ムＱ₁₀を生成蓄積し、これを採取することを特徴とする
コエンザイムＱ₁₀の製造方法。