JP2002300876A

JP2002300876A - 組織を形成する細胞内で外来遺伝子を発現させる方法

Info

Publication number: JP2002300876A
Application number: JP2001105116A
Authority: JP
Inventors: Kazuhito Takeshima; 一仁竹島; Takashi Takahata; 貴志高畠; Satoru Sasagawa; 覚笹川
Original assignee: Nagoya Industrial Science Research Institute
Current assignee: Nagoya Industrial Science Research Institute
Priority date: 2001-04-03
Filing date: 2001-04-03
Publication date: 2002-10-15

Abstract

(57)【要約】【課題】組織を形成する細胞において外来遺伝子を発
現させる方法であって、外来遺伝子の発現効率が極めて
高く、安全性も高い方法を提供する。【解決手段】エレクトロポレーション法を用いて組織
を形成する細胞にmRNAを導入する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子導入法の技術分野
に属し、組織を形成する細胞内で外来遺伝子を発現させ
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子導入法は、遺伝子の機能解明等の
研究にとって極めて重要な手段の一つであり、現在まで
に様々な方法の開発、改良が行われている。代表的な方
法として、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、
エレクトロポレーション法（以上、Molecular Cloning,
Third Edition,16.7-16.36,Cold Spring Harbor Labor
atory Press, New York）、及びウイルスベクターを用
いた方法（Cells:A Laboratory Mannual,Section8）が
開発され、実用化されている。

【０００３】一方、遺伝子導入技術の進歩に伴って遺伝
子を導入する細胞（ターゲット細胞）の幅が広がり応用
的な利用が行われつつある。その一つとして、遺伝子導
入技術を臨床応用したいわゆる遺伝子治療が注目を集め
ている。遺伝子治療において用いられる遺伝子導入法
は、生体より細胞を取り出し生体外で遺伝子導入した後
に再び生体内へと戻す方法（ex vivo法）と、生体を構
成する細胞に直接遺伝子導入を行う方法（in vivo法）
に分かれる。前者はターゲット細胞への遺伝子導入の有
無の確認、及び安全性の確認をした後生体内に戻すこと
ができるといった利点がある一方で、培養操作等が煩雑
であるといった問題点がある。後者は遺伝子導入操作自
体は比較的容易に行えるものの、特に安全性の面で問題
がある。遺伝子治療における遺伝子導入法としてはエレ
クトロポレーション等の方法も用いられるが、遺伝子導
入効率が比較的良好である等の理由から主としてウイル
スベクターを用いた方法が採用されている。ウイルスベ
クターを用いる方法では、野生型のアデノウイルス、レ
トロウイルス、レンチウイルス等から病原性に関与する
遺伝子等を欠損させて弱毒化するとともに外来遺伝子を
導入し、そしてウイルスの有する感染能力を利用してタ
ーゲット細胞に感染させることにより外来遺伝子の導入
が行われる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】遺伝子導入法をターゲ
ット細胞の状態によって分類すれば、浮遊・遊離された
状態の細胞、即ち単細胞状態の細胞（例えば、培養細
胞）をターゲットとする場合と、組織（三次元系）を形
成した状態（多細胞状態）の細胞（例えば、生体を構成
する組織の細胞）をターゲットとする場合に分けること
ができる。いずれの場合においてもターゲット細胞内に
おいて高い効率で外来遺伝子を発現させることが望まれ
るが、組織を形成した状態の細胞をターゲットとする場
合については、三次元構造をなす細胞個々への遺伝子導
入状況が十分検討されていないこと及び細胞外マトリッ
クス等の影響を受けること等から現状における外来遺伝
子の発現効率は非常に低く、発現効率の向上が特に切望
されている。

【０００５】一方、組織を形成した状態の細胞に外来遺
伝子を導入する場合には、遺伝子発現効率の高さに加え
て安全性が重要なファクターとなる。即ち、生体を構成
する組織をターゲットとする場合等では生体の一部に直
接遺伝子導入が行われるため、必然的に遺伝子導入法自
体の安全性を高める必要がある。ところが、上記のよう
に現状の遺伝子導入方法では発現効率が低いため高濃度
に遺伝子を導入する必要があることや、繰り返して遺伝
子導入を行う必要があることから、ターゲット細胞（組
織）に大きなダメージを与えることとなる。また、遺伝
子導入法としてウイルスベクターを用いる方法を採用し
た場合には、いくら弱毒化したウイルスとはいっても元
来病原性を有するウイルスを利用するものであるからそ
の安全性については疑問が残る。

【０００６】従来の遺伝子導入法では、導入用分子とし
て主にDNA（DNA断片、プラスミド状のDNA等）が用いら
れる。即ち、DNAがターゲット細胞内へと導入される。
ところが、DNAを導入した場合には、細胞内に導入され
たDNAが核内に移行して染色体に組込まれる可能性があ
る。このような染色体への組込みは外来遺伝子の長期的
な発現にとっては好ましい一方で、ターゲット細胞の染
色体の変異を引き起こし、その生存、機能に悪影響を及
ぼす惧れがある。

【０００７】また、発生段階ないし組織の分化の段階で
一過的に発現される遺伝子をターゲット細胞内に導入し
て発現させることを目的とする場合等では発現のタイミ
ングが非常に重要であり、導入操作後速やかに外来遺伝
子が発現することが望ましい。また、導入操作後の比較
的短い時間にのみに発現することが望ましい。しかしな
がら、上記のごとくDNAを導入用分子として用いた場合
には、導入操作から外来遺伝子の発現までに時間がかか
りこのような要請に応えることができない。尚、癌細胞
などをターゲットとして細胞傷害性のタンパク質等をコ
ードする遺伝子を導入する場合においても、目的の作用
が得られた後は速やかにその発現が停止ないしは抑制さ
れることが好ましい。

【０００８】さらには、ウイルスベクターを用いた既存
の方法では用いるウイルスの種類によって感染できる細
胞が決まっており、即ちターゲットにできる細胞の範囲
が限られるものであり、汎用性の観点から問題の残るも
のであった。

【０００９】本発明は、以上の課題に鑑みなされたもの
であり、組織を形成する細胞において外来遺伝子を発現
させる方法であって、外来遺伝子の発現効率が極めて高
く、安全性の高い方法を提供することを目的とするもの
である。また、導入操作後、速やかに外来遺伝子の発現
が行われる方法を提供することを目的とする。さらに
は、汎用性の高い方法を提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく次の検討を行った。まず、外来遺伝子を発
現させるために細胞内に導入する分子として、DNAでは
なくmRNAに着目した。これは、次の理由からmRNAを使用
すれば外来遺伝子を高い効率、かつ即効的に発現できる
と考えたことによる。DNAを導入した場合にはそれが発
現するまでに核移行、DNAからmRNAへの転写、mRNAの細
胞質への移行、mRNAの翻訳等の一連のステップを経る必
要があるのに対し、mRNAを導入した場合には細胞質内で
直ちに翻訳させることができるからである。一方、mRNA
を導入する手段としてエレクトロポレーション法を採用
した。エレクトロポレーション法はターゲット細胞の種
類を問わず使用できるからである。そして、アフリカツ
メガエルの胚組織を実験対象として選択し、mRNAの導入
による外来遺伝子の発現の様子を観察した。その結果、
DNAを導入用分子として用いた場合に比較して、mRNAを
用いることにより外来遺伝子の発現効率が著しく向上す
ることが認められた。また、導入操作後速やかに外来遺
伝子の発現が観察された。さらに、その発現は短時間に
集中して発現されることがわかった。本発明は以上の知
見に基づき完成されたものであり、その構成は次の通り
である。 [１] エレクトロポレーション法を用いてmRNAを細胞内
に導入する、ことを特徴とする組織を形成する細胞内で
外来遺伝子を発現させる方法である。 [２] 前記組織が培養されている組織である、ことを特
徴とする[１]に記載の方法である。 [３] 前記組織が生体を構成している組織である、こと
を特徴とする[１]に記載の方法。 [４] 前記組織がヒト由来である、ことを特徴とする
[１]又は[２]に記載の方法。 [５] 前記組織がヒト由来である、ことを特徴とする
[３]に記載の方法。 [６] 前記組織が非ヒト動物由来である、ことを特徴と
する[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。 [７] [１]〜[６]のいずれかの方法によりmRNAが導入さ
れた細胞からなる組織。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明は、エレクトロポレーショ
ン法を用いてmRNAを細胞内に導入する、ことを特徴とす
る組織を形成する細胞内で外来遺伝子を発現させる方法
である。本発明では、導入手段としてエレクトロポレー
ション法が用いられる。エレクトロポレーション法と
は、電圧を瞬間的に印加することによりターゲット細胞
の細胞膜に一時的に微小な孔（pore）をあけ、当該孔を
介してターゲット細胞内へと遺伝子等の外来分子を導入
する方法であって(Molecular Cloning, Third Edition,
16.33, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Y
ork等)、大量の細胞に対して同時に外来分子の導入を行
うことができる。尚、本明細書においてターゲット細胞
とは、mRNAを導入することによりその中で外来遺伝子を
発現させる細胞をいう。また、本明細書において、ター
ゲット細胞により構成される組織、即ちエレクトロポレ
ーション法の対象となる組織をターゲット組織という。

【００１２】エレクトロポレーション法の基本的な操作
は周知の方法に従って行うことができる。即ち、後述の
mRNAを含む試料をマイクロインジェクション等によりタ
ーゲット組織の中又は周囲に存在させた状態でターゲッ
ト組織に対して所定の電圧の印加を行う。本発明では、
組織を形成している複数の細胞に対して一度にエレクト
ロポレーションを実施する。エレクトロポレーション法
の条件（印加電圧、パルス幅、パルス間隔、パルス回数
等）は、mRNAの導入効率、外来遺伝子の発現効率、ター
ゲット細胞の種類、ターゲット組織の状態、ターゲット
細胞へのダメージ等を考慮して適宜設定することができ
る。例えば、印加電圧については５Ｖ〜２５０Vの範
囲、パルス幅については１０msec〜１００msecの範囲、
パルス間隔（インターバル）については５０〜１０００
msecの範囲、電圧を印加する回数、即ちパルス回数につ
いては、２回〜１０回の範囲の条件でエレクトロポレー
ションを行うことができる。

【００１３】用いる電極の形状、電極の大きさ、各電極
間の間隔、電極の配置態様等は、ターゲット細胞の種
類、ターゲット組織の状態、導入するmRNA量、外来遺伝
子発現効率等を考慮して適宜設定することができる。電
極の形状の一例としては、針状の電極を挙げることがで
きる。また、平板状の電極を用いることもできる。また
針状の電極と平板状の電極とを組み合わせて用いること
もできる。

【００１４】電圧の印加は、例えばmRNAを注入した組織
に一対の電極を接触させて行うことができる。後述の実
施例に記載したように、組織側の電極と組織との間隔を
極めて近づけることにより（但し、電極と組織とを接触
させない）効率よく外来遺伝子を発現させ得ることが観
察されたことから、組織側の電極を組織に接触せず、且
つ極めて近接して配置することが好ましい。この場合の
電極と組織との間隔は、例えば100μm〜1mmであり、好
ましくは、300μｍ〜500μmである。

【００１５】mRNAはターゲット細胞内で発現させる外来
遺伝子に対応するものが用いられる。換言すれば、ター
ゲット細胞内において翻訳されてタンパク質あるいはペ
プチドが合成されることにより、外来遺伝子がターゲッ
ト細胞内で発現したのと実質的に同一の作用が得られる
mRNAを用いる。したがって、好ましくは外来遺伝子（DN
A）を転写することにより得られるmRNAを用いることが
できる。また、同等の機能を有するタンパク質等をコー
ドする範囲において、かかるmRNAの配列の一部が欠損、
置換等されたmRNA、又は特定の塩基配列の付加等をした
改変型のmRNAを用いることができる。例えば、シグナル
伝達部分を欠失あるいは変化させた膜受容体タンパク質
のmRNAであって当該mRNAを導入することにより本来の機
能を失った受容体タンパク質等を産生させ、ターゲット
細胞内における本来の機能を有するタンパク質の機能発
現を抑制ないしは阻止させる作用のあるもの（dominant
negative type mRNA）、正常な状態では上位のシグナ
ルを受けて初めて活性化するタンパク質のmRNAを常に活
性化状態にあるものに改変したもの（constitutiveacti
ve mRNA）を用いることができる。さらに、特定の薬剤
によって正負に活性調整可能な機能部分を付加した改変
タンパク質に対応するmRNAを用いることもできる。この
タイプのmRNAを用い薬剤処理を併せて行えば、ターゲッ
ト細胞内で外来遺伝子を単に発現させるだけでなく発現
の外的な制御が可能となる。

【００１６】以上のようなmRNAはin vitro転写法等の周
知の方法を用いて調製することができる。in vitro転写
法については市販のキットを利用することができる。例
えば、Ambion社（Ambion,Inc. Austin TX USA）製のRNA
合成キットを用いることができる。調製したmRNAは、使
用前は分解を防止するために凍結保存しておくことが好
ましい。例えば、調製後のmRNAをmRNA水溶液のまま或い
はエタノール沈殿させた状態で速やかに−80℃のフリー
ザーに移し、使用直前まで保存しておく。尚、本発明に
おけるmRNAには一本鎖のもの及び二本鎖のものが含まれ
る。

【００１７】複数種類のmRNAを同時に導入することもで
きる。また、導入するmRNA量は、目的とする発現量、発
現効率、ターゲット細胞の種類等を考慮して適宜設定さ
れる。また、mRNAとともに、導入するmRNAの発現効率を
上昇させる作用のある物質を併せて導入することができ
る。このような物質として、例えばmRNAの翻訳を阻害す
る分子の活性を抑制する作用のある物質を用いることが
できる。

【００１８】ターゲット細胞内で発現させる外来遺伝子
とは、ターゲット細胞が有する遺伝子以外の遺伝子をい
い、ターゲット細胞のゲノム内にある遺伝子と同一の遺
伝子であっても外部から導入されるものは本発明におけ
る外来遺伝子に含まれる。外来遺伝子の種類は特に限定
されないが、一例として欠損、変異等によりターゲット
細胞においてその機能が低下ないし停止している遺伝子
と同一の機能を有する遺伝子（例えば、同一の遺伝子）
が挙げられる。このような外来遺伝子を採用することに
より、当該機能が低下等している遺伝子の機能を補充し
てターゲット細胞の正常化を図ることができる。

【００１９】外来遺伝子の他の例として、正常に機能を
しているがその発現の増幅が望まれる遺伝子やターゲッ
ト細胞が本来有しない遺伝子であってそれが発現される
ことによりターゲット細胞の生存、維持等に有益な遺伝
子が挙げられる。例えば、ターゲット細胞に作用してタ
ーゲット細胞が本来有する機能とは異なる機能を発揮さ
せるタンパク質等、又は本来有する機能を高める作用の
あるタンパク質等をコードする遺伝子（例えば、分化を
誘導するタンパク質）、あるいはターゲット細胞自体に
は作用せず、ターゲット細胞から分泌されて周囲の細胞
に作用するタンパク質等（例えば、細胞間ネットワーク
に関与するタンパク質）をコードする遺伝子である。

【００２０】また、ターゲット細胞及び周囲の細胞に対
しては実質的に作用しないタンパク質等をコードする遺
伝子も本発明の外来遺伝子として採用し得る。このよう
な外来遺伝子としては、例えば医薬品等に利用されるタ
ンパク質等をコードする遺伝子が挙げられる。かかる外
来遺伝子を採用することにより、ターゲット細胞内で医
薬品等として利用可能な組換えタンパク質を産生させる
ことが可能である。このような外来遺伝子として、ヒト
エリスロポエチン遺伝子、ヒトフィブリノーゲン遺伝
子、ヒト血清アルブミン遺伝子、ヒトラクトフェリン遺
伝子、ヒトプロテインC、ヒトα-グルコシダーゼ遺伝子
等を例示することができる。

【００２１】本発明における組織（ターゲット組織）に
は、培養されている組織（本明細書において「培養組織」
という）、及び生体を構成している組織（本明細書にお
いて「生体組織」という）のいずれもが含まれる。ここで
の培養組織とは、培養されている状態の組織であって生
体の一部を切除して取り出された組織の他、生体より取
り出された後所定期間の培養を経た組織、又は生体より
取り出した細胞をもとにin vitroで構築した組織が含ま
れる。一方、生体組織とは、生体の一部を構成している
状態の組織をいう。組織の種類としては、例えば肝臓、
腎臓等の臓器を構成する組織、皮膚組織等が挙げられ
る。また、発生段階ないしは組織化の途中にある組織
（例えば胚組織）も含まれる。

【００２２】組織の由来は爬虫類、両生類、魚類、鳥
類、哺乳類などの動物であって、その種類は特に限定さ
れない。培養組織には、好ましくは哺乳類の組織を用
い、特に好ましくはヒトの組織を用いる。また、生体組
織には、好ましくは非ヒト動物由来の組織、特に好まし
くは非ヒト哺乳類（ウシ、ブタ、ヒツジ等）の組織を用
いる。尚、上記本発明の方法を実行することにより得ら
れる、mRNAが導入された細胞からなる組織も本発明に含
まれるものである。

【００２３】

【実施例】以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説
明する。 [実施例１] 導入用mRNAの調製ホタル・ルシフェラーゼ（以下、「FL」という）、GFP(Gr
een Fluorescent Protein)、BMP(bone morphogenetic p
rotein)4、及びNogginのそれぞれに対するmRNA（FL mRN
A、GFP mRNA、BMP4 mRNA、及びNoggin mRNA）を、市販
のin vitro転写キット（Ambion,Inc. Austin TX USA）
を利用して以下の手順により調製した。尚、BMP4はTGF-
βスーパーファミリーに属する成長因子で、初期発生に
おいて腹側化を規定する因子として知られている。ま
た、眼胞では背側に局在して発現し、背側を決定する因
子として推定されている。NogginはBMP4と直接結合し、
BMP4がその受容体に結合し機能を発現することを抑制す
る作用を有する。

【００２４】まず、mRNA転写用プラスミドに各遺伝子を
組込んだものを用意した（図１を参照）。mRNA転写用プ
ラスミドには、遺伝子導入部の前後にβ−グロブリン遺
伝子のUTR（Untranslated region：非翻訳領域）を組込
んであり、合成されるmRNAにはタンパク質に対応する領
域の前後にβ-グロビン遺伝子のUTR（非翻訳領域）が付
加される。これにより、mRNAの翻訳活性を高めることが
できるといわれている。次に、制限酵素（Sfi I）で直
鎖状にしたプラスミドをT3 RNA合成キット（Ambion社）
を用いてキャップアナログ（最終濃度6mM）の存在下で
転写反応を行った。この条件下では、合成されたmRNAの
80％以上にキャップ構造が付加される。これにより、導
入した際に効率良くタンパク質への翻訳が行われる。続
いて、ニックカラム(アマシャム・ファルマシア社)に反
応液を通過させ、mRNA合成反応に寄与しなかったモノヌ
クオレオチドやキャップアナログを除いて目的のmRNAを
精製した。以上のようにして得られたFL mRNA、GFP mRN
A、BMP4 mRNA、及びNoggin mRNAは純蒸留水に溶かして-
80℃に保存し、実験の都度、融解して用いた。

【００２５】[実施例２] 発現用プラスミドDNAの調製ホタル・ルシフェラーゼ（FL）、及びGFP遺伝子を含む
プラスミドDNA（FLプラスミドDNA、及びGFPプラスミドD
NA）をそれぞれ調製した。まず、CMVプロモータを付加
した発現用プラスミドベクター（pE₀β1/RN3P（Cell,8
7,pp989-1000,1996））からアフリカツメガエルEomesod
ermin遺伝子部分を切り出し、そこにFL（またはGFP）遺
伝子を挿入した発現用プラスミドベクターを用意した
（図２を参照）。次に、この発現用プラスミドベクター
をトランスフェクトした菌株を30mlのLB培地で培養した
後、mini prep kit（Qiagen社製）を用いて、プラスミ
ドDNAを精製した。精製操作はキットに添付の説明書に
従って行った。以上のようにして得られたFLプラスミド
DNA、及びGFPプラスミドDNAは、TE緩衝液(10 mM Tris・H
Cl, 1 mM EDTA pH8.0)中、4℃で保存し、実験の都度、
必要量をエタノール沈殿した後、HEKE 緩衝液 (20 mM H
EPES-KOH(pH 7.7), 150 mM KCl, 0.5 mM EDTA)に溶解し
て用いた。

【００２６】[実施例３] 導入する核酸の違いによる
ルシフェラーゼ活性発現の時間特性導入する核酸の違いにより外来遺伝子の時間的発現特性
がどのように変化するのかを調べた。導入する核酸とし
て実施例１及び２で調製したFL mRNAとFLプラスミドDNA
を用いた。これらの核酸を所定量アフリカツメガエルの
初期胚に導入し、所定時間経過後のルシフェラーゼ活性
をそれぞれ調べた。操作手順の詳細は次の通りである。

【００２７】ステージ13（神経板期初期）まで培養した
アフリカツメガエルの胚を用意し、神経板予定眼領域の
細胞層に核酸溶液(FLmRNAの場合は0.5μg/μl、FLプラ
スミドDNAの場合は0.7μg/μl)を10nl微注入し、直ちに
エレクトロポレータ(CUY-21型、トキワサイエンス)を用
いて印加電圧：20±１V、パルス幅：5 msec、パルス間
隔：95 msec、パルス回数：10回の条件下でDCパルス電
圧を印加した。尚、組織側の電極は、300-500μm程度ま
で胚に近づけて（ただし、接触させていない）印加し
た。このような方法により、細胞（組織）へのダメージ
がほとんどない状態でmRNAあるいはプラスミドDNAを効
率良く導入することができた。その後、胚を18℃で培養
し、所定時間（1.5、3.0、4.5、6.0、9.0、12、24、4
8、72時間）経過したところでサンプリングして各時間
におけるルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイ
キット(プロメガ社)を用いて以下の手順で測定した。

【００２８】まず、胚を２個一組でマイクロチューブに
取り、これに上記キット付属の細胞溶解液 100μlを加
えた。次に、5秒間、激しく攪拌して胚を溶解した。続
いて、2分間、4℃、15000rpmで遠心し、上清10μlを新
しいマイクロチューブに分取した。その後、分取試料に
ルシフェラーゼ発光基質（ルシフェリン）溶液40μlを
加えて30秒静置した後シンチレーションカウンターで発
光量を測定し、これをルシフェラーゼ活性とした。

【００２９】各時間について２個一組で10サンプル調製
し、それぞれの測定値を２で割って胚1個分に換算しそ
の平均値を求めた。そして、FL mRNA及びFLプラスミドD
NAの各時間の値を、それぞれの最大値を示す値を100％
とした場合の相対値で表しグラフにプロットした（図
３）。図３のグラフに示されるように、mRNAを用いた場
合はエレクトロポレーション後1.5時間で明確な活性が
検出されはじめ、12時間後には最大活性値を示し、その
後活性は減衰していった。また、72時間後(3日後)の残
存活性は最大活性値の7.4％であった。一方、プラスミ
ド DNAを用いた場合はエレクトロポレーション後6時間
までは有意の活性は検出されず、その後mRNAに比べ緩や
かな上昇率を示しながら24時間で最大活性を示し次第に
減衰していった。また、72時間後(3日後)の残存活性は
最大活性値の11.9％であった。尚、FL mRNAの最大活性
実測値（導入後１２時間）は、FLプラスミドDNAの最大
活性実測値（導入後２４時間）に比較して約120倍であ
った。また、導入後18時間以降、FL mRNAとFLプラスミ
ドDNAの活性値が逆転しているように見えるが、実測値
ではFL mRNAの場合の方がFLプラスミドDNAの場合に比べ
て40〜50倍高い。

【００３０】[実施例４] 発現効率の核酸の種類依存性
および濃度依存性核酸の種類により発現効率の濃度依存性がどのように異
なるのか（核酸の種類依存性）を調べた。また、導入す
る核酸の濃度による外来遺伝子の発現効率の変化（発現
効率の濃度依存性）を調べた。導入する核酸には実施例
１及び２で調製したFL mRNAとFLプラスミドDNAを用い
た。これらの核酸を導入濃度を変化させてアフリカツメ
ガエルの初期胚に導入し、各導入濃度におけるルシフェ
ラーゼ活性を調べた。操作手順の詳細は次の通りであ
る。

【００３１】導入濃度（FL mRNA又はFLプラスミドDNA）
を0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50μg/μl
に変化させてステージ13（神経板期初期）胚の神経板予
定眼領域にエレクトロポレーションを行った。エレクト
ロポレーションは実施例３と同様の方法で行った。ルシ
フェラーゼ活性の測定に最大活性が示される時間経過後
（FL mRNAの場合は12時間経過後、FLプラスミドDNAの場
合は24時間経過後）の試料を用いた。各測定点につき２
個一組で10サンプル調製し、実施例３の場合と同様に計
測しその平均値を図４に示すグラフにプロットした。
（Ａ）のグラフでは、実施例３の場合と同様に最大活性
値を100％とした場合の相対活性値をプロットしてあ
る。このグラフからわかるように、FL mRNAを用いた場
合には0.5〜0.75μg/μlで高限度活性を示した。一方、
プラスミド DNAを用いた場合には0.5〜1.0μg/μlで高
限度活性を示した。（Ｂ）のグラフはFL mRNA及びFLプ
ラスミドDNAの各最大活性測定値を対数メモリで表した
ものである。FL mRNA（0.5μg/μl）を用いた場合に
は、FLプラスミド DNA（0.75μg/μl）を用いた場合に
比べて約120倍の活性を示した。このように、mRNAを導
入する分子として用いることによりDNAを用いる場合に
比較して極めて高い遺伝子発現効率が得られた。

【００３２】[実施例５] 導入位置と発現部位の相関アフリカツメガエルのステージ13（神経板期初期）胚の
神経板の各部位に実施例１で調製したGFP mRNAを実施例
３に記載した方法で導入し、ステージ30まで培養した後
GFPの発現を観察した。図５の中央にステージ13（神経
板期初期）胚の模式図と、GFP mRNAを導入する領域
（A：眼、B：神経摺、C：中脳、D：後脳、E:神経管（胴
体中央部）、F：神経管（胴体後方部）の各予定運命領
域）を示した。模式図のまわりに各導入領域に対応する
ステージ30胚の蛍光観察像を示した。ステージ13胚で導
入した領域とステージ30胚で観察された蛍光領域の相関
関係は、過去に報告されている胚域予定運命図に一致し
ていた。

【００３３】[実施例６] 異所的に発現させたBMP4、No
gginの影響エレクトロポレーション法で導入したmRNAの導入組織内
における機能解析を行うため、実施例１で調製したBMP4
mRNA及びNoggin mRNAをそれぞれアフリカツメガエルの
胚に発生初期の段階で導入し、その影響を観察した。ま
ず、実施例３に記載した方法と同様の方法によりBMP4 m
RNA又はNoggin mRNAを所定量（BMP4 mRNA：0.4μg/μ
l、Noggin mRNA：0.4μg/μl）アフリカツメガエルのス
テージ13（神経板期初期）胚の神経板の眼胞領域に導入
した。尚、BMP4mRNA、Noggin mRNAが確実に導入された
ことを追跡する目的でGFP（0.1μg/μl）を同時にエレ
クトロポレーションした。

【００３４】エレクトロポレーション後、次の選択手順
に沿って眼胞領域に高効率でmRNAが導入された個体を選
別した。尚、図６に選択手順を図解した。 (1)GFP蛍光のポジティブ/ネガティブおよび強/弱により
胚を選別する。 (2)目的の部位（ここでは眼胞）に導入された個体を選
別する。

【００３５】選択した個体をステージ30まで培養し固定
した後、眼に時期・領域特異的発現する各種遺伝子の発
現パターンをwhole mount in situ hybridization法に
よって解析した。検出対象として、眼胞領域で特異的に
発現される遺伝子（tbx2,tbx3,tbx5,pax2,pax6）を用い
た。尚、tbx2、tbx3、tbx5は、Tボックスを持つ転写因
子群であり、眼胞では背側に局在して発現する。また、
pax2はホメオボックスを持つ転写因子であり、眼胞では
腹側に局在して発現する。pax6はホメオボックスを持つ
転写因子であり、眼形成におけるマスター遺伝子の一つ
である。その発現は眼胞全体に及ぶ。

【００３６】whole mount in situ hybridization法はH
arlandの方法（Methods in Cell Biology, Academic Pr
ess, pp685-695,1991）に従って行った。

【００３７】whole mount in situ hybridization法の
結果を図７に示した。図７の最下段には、ステージ42ま
で培養した胚を用いて形態変化を観察した結果（f,l,r,
x）が併せて示される。この実施例では、左眼の領域だ
けにmRNA（BMP4 mRNA又はNoggin mRNA）を導入してお
り、影響は左眼だけに現れる（図７のg,h,i,j,k,l及び
s,t,u,v,w,x）。右眼は正常な発現パターンを示す（a,
b,c,d,e,f及びm,n,o,p,q,r）ので対照実験群となる。図
７に示される結果より、BMP4が眼胞全体に発現した結
果、背側に局在して発現するtbx2, 3, 5遺伝子はその発
現が全体に拡がり、腹側に局在しているpax2は消失した
のが認められる。pax6の発現はやや拡大傾向にあった。
形態的な特徴として眼球の腹側に欠損が見られた。

【００３８】一方、Nogginが眼胞全体に発現した結果、
tbx2, 3, 5は消失してpax2の発現領域が拡大したのが観
察される。また、pax6の発現領域は眼胞中央に収束し
た。形態的な特徴としては、眼球全体が小さくなり水晶
体が欠損していることが観察された。以上より、導入部
位においてBMP4又はNogginが高効率で発現されたことが
わかる。また、いずれも眼領域のみにその影響は限定さ
れており、他の部分（耳、脳領域、心臓等）には影響は
なかった。このことから、局所的な導入効果（発現効
果）が得られたことがわかった。

【００３９】この発明は、上記発明の実施の形態及び実
施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の
範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲
で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、組織を形成する細胞内に
おいて極めて高い効率で外来遺伝子を発現させることが
可能な方法が提供される。また、本発明の方法では外来
遺伝子を高い効率で発現できるため、導入分子の量及び
導入回数を減少させることができ、ターゲット細胞（タ
ーゲット組織）に与えるダメージを抑えることができ
る。したがって、本発明が提供する方法は安全性の観点
からも優れたものである。一方、本発明の方法ではmRNA
を導入用の分子として用いるためターゲット細胞の染色
体を変異させる惧れがなく、この点においても安全性の
高い方法であるといえる。さらに、本発明の方法によれ
ば導入操作後速やかに外来遺伝子の発現効果が奏され、
しかもその発現効果は一過的であるため、所望のタイミ
ングかつ所望の期間に限って外来遺伝子を発現させるこ
とができる。加えて、本発明の方法ではエレクトロポレ
ーション法を利用するため、適用できる組織（細胞）の
範囲が広く汎用的であるという利点も有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例において用いられるmRNA転写用
プラスミドの構成を模式的に示した図である。遺伝子導
入部の前後にβ−グロブリン遺伝子のUTR（Untranslate
d region：非翻訳領域）が組込まれている。

【図２】図２は、実施例において用いられるin vivo発
現用プラスミドベクターの構成を模式的に示した図であ
る。CMVプロモータが組込まれている。

【図３】図３は、実施例３における結果を示すグラフで
あり、導入する核酸の違いによるルシフェラーゼ活性発
現の時間特性が示される。導入する核酸毎に最大活性を
求め、それを100％とした場合の相対値がプロットされ
る。

【図４】図４は、実施例４における結果を示すグラフで
あり、発現効率の核酸の種類依存性、及び濃度依存性が
示される。（Ａ）のグラフでは、図３と同様に最大活性
値を100％とした場合の相対活性値がプロットされる。
（Ｂ）のグラフでは、FLmRNAを導入した場合の最大活性
値、及びFLプラスミドDNAを導入した場合の最大活性測
定値が対数メモリで表される。

【図５】図５は、アフリカツメガエルの初期胚神経板の
各部位とGFP mRNA導入部位との対応を示す図である（一
部写真）。中央にはステージ13（神経板期初期）胚の模
式図が示される。また、模式図の周囲の写真は、GFP mR
NAを導入する領域（A：眼、B：神経摺、C：中脳、D：後
脳、E:神経管（胴体中央部）、F：神経管（胴体後方
部）の各予定運命領域）に対応するステージ30胚の蛍光
観察像である。

【図６】図６は、実施例６における、眼胞領域に高効率
でmRNAが導入された個体を選別する手順を示した図であ
る。

【図７】図７は、実施例６における、whole mount in s
itu hybridization法の結果、及びステージ42まで培養
した胚を用いて形態変化を観察した結果（f,l,r,x）の
写真である。g,h,i,j,k,lにBMP4 mRNAを導入した結果が
示され、s,t,u,v,w,xにNoggin mRNAを導入した結果が示
される。また、a,b,c,d,e,f及びm,n,o,p,q,rは対照実験
群である。

フロントページの続き (72)発明者笹川覚愛知県名古屋市緑区大高町字東山16−106 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA08 AA20 CA12 GA14 HA17 4B065 AA90X AB01 BA03 CA44 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エレクトロポレーション法を用いてmRNA
を細胞内に導入する、ことを特徴とする組織を形成する
細胞内で外来遺伝子を発現させる方法。
【請求項２】前記組織が培養されている組織である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記組織が生体を構成している組織であ
る、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記組織がヒト由来である、ことを特徴
とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】前記組織がヒト由来である、ことを特徴
とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】前記組織が非ヒト動物由来である、こと
を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】請求項１〜６のいずれかの方法によりmR
NAが導入された細胞からなる組織。