JP2002253266A

JP2002253266A - アスタキサンチンのための方法

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Publication number: JP2002253266A
Application number: JP2001155428A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Hoshino; 達雄星野; Kazuyuki Oshima; 和行尾島; Yutaka Setoguchi; 豊瀬戸口
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-24
Publication date: 2002-09-10
Anticipated expiration: 2021-05-24
Also published as: EP1158051A1; NO20012552L; BR0102104A; AU4604301A; ID30360A; NO20012552D0; JP4861569B2; DE60115757T2; US20030049720A1; EP1158051B1; CN100376674C; DE60115757D1; ATE312928T1; KR20010107680A; CA2346620A1; TWI248466B; AU784237B2; CN1340628A; MXPA01005121A; ES2254285T3

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明により、カロテノイドを生産する方法
を提供することを課題とする。【解決手段】カロテノイド生産が可能な親生物を、オ
ルタナティブオキシダーゼ活性の減少を誘導するような
条件下で処理し、カロテノイド生産性が促進された生物
を選択することにより得られる生物の培養を含む、カロ
テノイドを生産する方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カロテノイドの製
造のための分子生物学およびそのために有用な生物材料
に関する。

【０００２】

【従来の技術】アスタキサンチンは、動物（例えば、フ
ラミンゴおよびショウジョウトキなどの鳥類、ならびに
ニジマスおよびサケなどの魚類）、藻類および微生物な
どの非常にさまざまな生物に分布することが知られてい
る。また、アスタキサンチンが反応性酸素種に対する強
い抗酸化作用をもつことも認知されており、癌などのい
くつかの疾患から生細胞を防御するための薬学的用途へ
の適用が期待されている。さらに、工業的応用の観点か
らは、アスタキサンチンは動物に特徴的な橙赤色を付与
し、市場における消費者への魅力に貢献するため、特に
サケなどの養殖魚の業界ではアスタキサンチンの着色剤
としての需要が高まりつつある。

【０００３】ファフィア・ロドザイマ（Phaffia rhodoz
yma）は、特にアスタキサンチンを生産するカロテノイ
ド生産性酵母菌株として知られている。他のカロテノイ
ド生産酵母であるロドトルラ（Rhodotorula）属とは異
なり、ファフィア・ロドザイマ（P. rhodozyma）はD-グ
ルコースなどのいくつかの糖を発酵できる。これは工業
的応用の観点からは重要な特徴である。最近の分類学的
研究でファフィア・ロドザイマ（P. rhodozyma）の性周
期が明らかになり、その有性状態（telemorphic stat
e）はキサントフィロマイセス・デンドロホス（Xantho
phyllomyces dendrorhous）と命名された（W.I. Golube
v；Yeast 11、101〜 110、1995）。ファフィア・ロドザ
イマからアスタキサンチン高生産株を得るためにいくつ
かの菌株改良試験が行われてきたが、この10年間、この
ような試みは従来の変異誘発法およびプロトプラスト融
合法を用いることに限られてきた。最近、ウェリー（We
ry）らは、ファフィア・ロドザイマゲノムのリボソーム
DNA遺伝子座に多コピーで組み込ませるために非複製プ
ラスミドを用いる、ファフィア・ロドザイマを用いた宿
主ベクター系を開発した（Weryら、Gene、184、89〜9
7、1997）。また、ベルドーズ（Verdoes）らは、ゲラニ
ルゲラニルピロリン酸からβ-カロテンへの反応を触媒
する酵素をコードする3種類のカロテノイド生産遺伝子
と同様に、ファフィア・ロドザイマの形質転換株を得る
ためのさらに改良されたベクターを報告した（国際公開
公報第97／23633号）。従来の方法が到達した生産性を
上回るためにファフィア・ロドザイマの菌株改良研究に
おける遺伝子工学の重要性は近い将来さらに高まると考
えられる。

【０００４】多くの研究者らは、アスタキサンチンの生
産が発酵期よりも増殖における呼吸期において刺激され
るため、アスタキサンチンがファフィア・ロドザイマ中
で抗酸化剤としての役割を果たすのではないかと推測し
ている。一般に、活性酸素種は、ユビキノン・プールの
還元速度と呼吸鎖の下流における電子伝達の減少速度と
の間に不均衡が生じたために、呼吸鎖で電子がオーバー
フローした結果として、呼吸期に生産される傾向があ
る。このような推測において、アスタキサンチンは、ス
ーパーオキシドジスムターゼが生きた生物中で働くよう
に、このような活性酸素種を消去させている可能性があ
る。

【０００５】シュレーダー（Shroeder）らは、ファフィ
ア・ロドザイマの呼吸鎖は、アスタキサンチンの生産が
刺激される増殖後期にKCN感受性の呼吸からKCN耐性の呼
吸に移行することを報告した（J. Biol. Chem.、270、1
8374〜18379、1995）。KCN感受性の呼吸鎖は、広くさま
ざまな生物に分布している通常の電子伝達鎖であって、
そこではユビキノン・プール内の電子が、複合体IIIを
介して複合体IVに伝達される。この呼吸鎖は、KCNまた
はアンチマイシンAによって阻害されることが知られて
いる。一方で、KCN耐性の呼吸鎖は、植物および菌類に
分布している。この呼吸鎖においては、オルタナティブ
オキシダーゼ（AOX）と呼ばれるミトコンドリア膜タン
パク質が、酸素分子をレセプターとして用いることによ
り、ユビキノン・プール中の電子を水（H₂O）分子に伝
達する実質的な役割を果たしている。AOX活性は、n-没
食子酸プロピル（n-PG）またはサリチルヒドロキサム酸
（SHAM）によって阻害されることが知られている。

【０００６】ファフィア・ロドザイマに由来するアンチ
マイシン感受性のアスタキサンチン高生産株の特徴付け
の研究において、アン（An）らは、このような変異体
は、電子伝達鎖からオーバーフローした電子によって生
産される活性酸素種の反応を消去するために、より多く
のアスタキサンチンを生産するのではないかと推測した
（Appl. Env. Microbiol.、55、116〜124、1989）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、カロ
テノイドを生産する方法を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、電子伝達鎖が
還元状態である条件下において、アスタキサンチンの生
合成がアップレギュレートされるのではないかという仮
定に基づいて考案された。このような還元状態は、アン
チマイシンA、KCN、n-PGまたはSHAMなどの特異的阻害剤
を添加することによって誘導されると考えられる。この
ような状態はまた、電子伝達の不均衡をもたらす何らか
の変異によっても誘導されると考えられる。

【０００９】本発明に従って、SHAMに対する耐性を付与
された変異体が得られた。このような変異体は、親株よ
りも50％高いアスタキサンチン生産性を獲得していた。

【００１０】本発明は、ファフィア・ロドザイマ由来の
オルタナティブオキシダーゼをコードする遺伝子のクロ
ーニングを含む。また、本発明には、大腸菌やサッカロ
マイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）な
どの適切な宿主生物内でこのような遺伝子を発現させる
結果として、酵素的特徴づけも含まれる。したがって、
クローニングされた遺伝子を、プロモーター配列の部位
特異的変異誘発またはアンチセンス法を用いることによ
り、ファフィア・ロドザイマなどの適切な宿主において
AOX活性を減少させるために使用してもよい。また、こ
れらのカロテノイド生産における効果は、このような形
質転換体を適切な培地において適切な培養条件下で培養
することによって確認されうる。

【００１１】本発明は、オルタナティブオキシダーゼ活
性の減少を誘導する条件下で、カロテノイド生産が可能
な親生物を処理する段階、およびカロテノイド生産性が
増強された生物を選択する段階によって得られる生物の
培養を含む、カロテノイドを生産するための新規の方法
を提供する。本発明の方法において使用される生物は、
オルタナティブオキシダーゼ阻害剤に対する耐性の変化
を利用して、カロテノイド生産性が増強された変異株で
あってもよい。前記生物は、オルタナティブオキシダー
ゼ阻害剤に対して耐性の変異体であってもよい。本発明
に係る方法は、原生生物界または菌界に属する生物、よ
り好ましくはシネココッカス（Synechococcus）属、シ
ネコシスティス（Synechocystis）属、ヘマトコッカス
（Haematococcus）属、ドナリエラ（Dunaliella）属、
ファフィア（Phaffia）属、キサントフィロマイセス（X
anthophyllomyces）属、アカパンカビ（Neurospora）
属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ブラケスレア（Bla
keslea）属、またはフィコマイセス（Phycomyces）属に
属する生物を用いることによって実施することができ、
中でも最も好ましい生物は、ファフィア・ロドザイマ株
およびキサントフィロマイセス・デンドロラス株であ
る。

【００１２】本発明に用いられるオルタナティブオキシ
ダーゼ阻害剤は、n-没食子酸プロピルおよびサリチルヒ
ドロキサム酸からなる群より選択されうる。

【００１３】本発明はまた、親生物に比べて増強された
レベルでカロテノイド生産が可能な変異株を確立する方
法を提供し、これにはオルタナティブオキシダーゼ活性
を減少させた条件下でカロテノイド生産が可能な生物を
培養する段階、および前記の親生物よりも高いレベルで
カロテノイド生産が可能な生物を選択する段階も含まれ
る。オルタナティブオキシダーゼ活性を減少させるため
の前記の条件には、オルタナティブオキシダーゼ阻害剤
を存在させることが含まれる。この目的のためのオルタ
ナティブオキシダーゼ阻害剤は、n-没食子酸プロピルお
よびサリチルヒドロキサム酸からなる群より選択してよ
い。本発明の変異株のための生物は、原生生物界または
菌界に属する生物、より好ましくはシネココッカス（Sy
nechococcus）属、シネコシスティス（Synechocystis）
属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属、ドナリエラ
（Dunaliella）属、ファフィア（Phaffia）属、キサン
トフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属、アカパン
カビ（Neurospora）属、ロドトルラ（Rhodotorula）
属、ブラケスレア（Blakeslea）属、またはフィコマイ
セス（Phycomyces）属に属する生物であってもよく、中
でも最も好ましい生物はファフィア・ロドザイマ株およ
びキサントフィロマイセス・デンドロラス株である。

【００１４】別の局面においては、本発明はまた、上記
の方法で得られる親生物に比べて増強されたレベルでカ
ロテノイド生産が可能な生物の変異株にも関する。前記
の変異体は、0.3〜0.45mg / mlのSHAMを含む培地中でさ
えも、SHAMを含まない培地中と類似した増殖速度で増殖
することができるという点で、より具体的に特徴づけら
れる。

【００１５】本発明の一つの態様として、ファフィア・
ロドザイマATCC96594株に由来するSHAM耐性変異体が提
供されている。このようなSHAM耐性変異株は、2000年4
月3日に、それぞれDSM13429、DSM13430、DSM13431とし
てDSMZ（Deutsche Sammlung der Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH、Mascheroder Weg 1b、D-38124 Bra
unschweig、Germany）に寄託された。

【００１６】本発明の方法で用いられる生物は、オルタ
ナティブオキシダーゼの遺伝子発現が変化して、親生物
に比べて効率が減少している組換え生物であってもよ
い。本発明はさらに、オルタナティブオキシダーゼの遺
伝子発現が変化して、宿主生物に比べて効率が減少して
いることを特徴とする、宿主生物に比べて増強されたレ
ベルでカロテノイド生産が可能な組換え生物を提供す
る。このような生物は、アンチセンス技術、部位特異的
変異誘発、化学的変異誘発などから選択される技術を利
用してオルタナティブオキシダーゼの遺伝子発現を変化
させたものであってもよい。この目的のための生物は、
原生生物界または菌界に属する生物、より好ましくはシ
ネココッカス（Synechococcus）属、シネコシスティス
（Synechocystis）属、ヘマトコッカス（Haematococcu
s）属、ドナリエラ（Dunaliella）属、ファフィア（Pha
ffia）属、キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyce
s）属、アカパンカビ（Neurospora）属、ロドトルラ（R
hodotorula）属、ブラケスレア（Blakeslea）属、また
はフィコマイセス（Phycomyces）属に属する生物であっ
てもよく、中でも最も好ましい生物は、特に上記の寄託
物であるファフィア・ロドザイマ株およびキサントフィ
ロマイセス・デンドロラス株である。

【００１７】本発明はまた、カロテノイド生産が可能な
生物に由来するオルタナティブオキシダーゼをコードす
る組換えDNA配列を提供する。組換えDNAは、原生生物界
または菌界に属する生物、より好ましくはシネココッカ
ス（Synechococcus）属、シネコシスティス（Synechocy
stis）属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属、ドナ
リエラ（Dunaliella）属、ファフィア（Phaffia）属、
キサントフィロマイセス（Xanthophyllomyces）属、ア
カパンカビ（Neurospora）属、ロドトルラ（Rhodotorul
a）属、ブラケスレア（Blakeslea）属、またはフィコマ
イセス（Phycomyces）属に属する生物から得られ、中で
も最も好ましい生物は、特に上記の寄託物であるファフ
ィア・ロドザイマ株およびキサントフィロマイセス・デ
ンドロラス株である。本発明に係る組換えDNA配列は、
配列番号：2によって同定されるものか、または配列番
号：2と55％以上、より好ましくは75％以上、最も好ま
しくは95％以上の同一性を有するものであってもよい。

【００１８】該組換えDNA配列は、（a）配列番号：1に
記載のアミノ酸配列を有する前記の酵素をコードするも
の、または（b）（i）対立遺伝子変異体と、（ii）1つ
もしくは複数のアミノ酸の付加、挿入、欠失および／も
しくは置換を持ち、かつ定まった酵素活性を有する酵素
とから選択される前記の酵素の変異体をコードするもの
として、特に特徴づけられてもよい。特に特定される上
記の単離DNA配列は、ファフィア・ロドザイマ遺伝子に
由来する配列であってもよく、（i）配列番号：2に示さ
れたDNA配列、（ii）配列番号：2に示されたDNA配列の
同義コード（isocoding）または対立遺伝子変異体、な
らびに（iii）1つまたは複数のヌクレオチドの付加、挿
入、欠失および／または置換を有し、且つ前記酵素活性
を有するポリペプチドをコードする、配列番号：2に示
されたDNA配列の誘導体から選択される。

【００１９】本発明はまた、宿主生物の形質転換のため
の該組換えDNAの使用も提供する。組換えDNAの簡便な形
態はベクターであると思われる。組換えDNAの使用によ
って得られる組換え生物は、オルタナティブオキシダー
ゼの酵素活性を減少させることができる。組換えDNAに
より形質転換された宿主生物は、カロテノイド、特にア
スタキサンチンの生産方法の改良に有用であると考えら
れる。したがって、本発明はこのような組換え生物も提
供する。

【００２０】さらに、本発明は、上記の組換えDNAを適
当な宿主生物に導入する段階、およびこのように得られ
た組換え生物を培養する段階を含む、カロテノイドの生
物学的生産方法を提供する。したがって、カロテノイド
の生産を実施する条件下で上記の組換え生物を培養する
ことを特徴とする、カロテノイドを生産するための方法
は、本発明の一つの局面である。この方法をアスタキサ
ンチンの生物学的生産に適用することも可能である。

【００２１】本発明の係る方法においては、（１）オル
タナティブオキシダーゼ活性の減少を誘導するためにカ
ロテノイド生産が可能な親生物を処理すること、および
カロテノイド生産性が促進された生物を選択することに
より得られる、生物を培養する段階を含む、カロテノイ
ドを生産する方法であることを特徴とする。

【００２２】また、本発明の係る方法においては、
（２）生物が、オルタナティブオキシダーゼ阻害剤に対
する耐性の変化を利用して、カロテノイド生産性を促進
させた変異株である、上記（１）記載の方法であること
を特徴とする。

【００２３】また、本発明の係る方法においては、
（３）生物がオルタナティブオキシダーゼ阻害剤に対し
て耐性の変異株である、上記（１）または（２）記載の
方法であることを特徴とする。

【００２４】また、本発明の係る方法においては、
（４）生物が原生生物界もしくは菌界に属し、より好ま
しくはシネココッカス（Synechococcus）属、シネコシ
スティス（Synechocystis）属、ヘマトコッカス（Haema
tococcus）属、ドナリエラ（Dunaliella）属、ファフィ
ア（Phaffia）属、キサントフィロマイセス（Xanthophy
llomyces）属、アカパンカビ（Neurospora）属、ロドト
ルラ（Rhodotorula）属、ブラケスレア（Blakeslea）
属、またはフィコマイセス（Phycomyces）属に属する、
上記（２）または（３）記載の方法であることを特徴と
する。

【００２５】また、本発明の係る方法においては、
（５）生物がファフィア・ロドザイマ株である、上記
（２）から（４）のいずれか一項記載の方法であること
を特徴とする。

【００２６】また、本発明の係る方法においては、
（６）生物が、DSM13429、DSM13430、およびDSM13431か
らなる群より選択される株である、上記（２）から
（５）のいずれか一項記載の方法であることを特徴とす
る。

【００２７】また、本発明の係る方法においては、
（７）オルタナティブオキシダーゼ阻害剤が、n-没食子
酸プロピルおよびサリチルヒドロキサム酸からなる群よ
り選択される、上記（２）から（６）のいずれか一項記
載の方法であることを特徴とする。

【００２８】また、本発明の係る方法においては、
（８）親生物に比べて促進されたレベルでカロテノイド
生産が可能な変異株を確立する方法であって、オルタナ
ティブオキシダーゼ活性を減少させるような条件下でカ
ロテノイド生産が可能な生物を培養し、該親生物よりも
高いレベルでカロテノイド生産が可能な生物を選択する
段階を含む方法であることを特徴とする。

【００２９】また、本発明の係る方法においては、
（９）オルタナティブオキシダーゼ活性を減少させる条
件に、オルタナティブオキシダーゼ阻害剤が存在するこ
とが含まれる、上記（８）記載の方法であることを特徴
とする。

【００３０】また、本発明の係る方法においては、（１
０）オルタナティブオキシダーゼ阻害剤が、n-没食子酸
プロピルおよびサリチルヒドロキサム酸からなる群より
選択される、上記（９）記載の方法であることを特徴と
する。

【００３１】また、本発明の係る方法においては、（１
１）生物が原生生物界もしくは菌界に属し、より好まし
くはシネココッカス属、シネコシスティス属、ヘマトコ
ッカス属、ドナリエラ属、ファフィア属、キサントフィ
ロマイセス属、アカパンカビ属、ロドトルラ属、ブラケ
スレア属、またはフィコマイセス属に属する、上記
（８）から（１０）のいずれか一項記載の方法であるこ
とを特徴とする。

【００３２】また、本発明の係る方法においては、（１
２）生物がファフィア・ロドザイマ株である、上記
（８）から（１１）のいずれか一項記載の方法であるこ
とを特徴とする。

【００３３】また、本発明の係る方法においては、（１
３）生物が、DSM13429、DSM13430、およびDSM13431から
なる群より得られる株である、上記（８）から（１２）
のいずれか一項記載の方法であることを特徴とする。

【００３４】また、本発明の係る変異株においては、
（１４）上記（８）から（１３）のいずれか一項におい
て定義された方法により得られる、親生物に比べて促進
されたレベルでカロテノイド生産が可能な生物の変異株
であることを特徴とする。

【００３５】また、本発明の係る変異株においては、
（１５）生物が原生生物界もしくは菌界に属し、より好
ましくはシネココッカス属、シネコシスティス属、ヘマ
トコッカス属、ドナリエラ属、ファフィア属、キサント
フィロマイセス属、アカパンカビ属、ロドトルラ属、ブ
ラケスレア属、またはフィコマイセス属に属する、上記
（１４）記載の変異株であることを特徴とする。

【００３６】また、本発明の係る変異株においては、
（１６）生物がファフィア・ロドザイマ株である、上記
（１４）または（１５）記載の変異株であることを特徴
とする。

【００３７】また、本発明の係る方法においては、（１
７）生物が、オルタナティブオキシダーゼの遺伝子発現
を変化させて、宿主生物に比べて効率が減少している組
換え生物である、上記（１）記載の方法であることを特
徴とする。

【００３８】また、本発明の係る方法においては、（１
８）アンチセンス技術、部位特異的変異誘発、化学的変
異誘発などより選択される技術を利用してオルタナティ
ブオキシダーゼの遺伝子発現を変化させた、上記（１
７）記載の方法であることを特徴とする。

【００３９】また、本発明の係る方法においては、（１
９）生物が原生生物界もしくは菌界に属し、より好まし
くはシネココッカス属、シネコシスティス属、ヘマトコ
ッカス属、ドナリエラ属、ファフィア属、キサントフィ
ロマイセス属、アカパンカビ属、ロドトルラ属、ブラケ
スレア属、またはフィコマイセス属に属する、上記（１
７）または（１８）記載の方法であることを特徴とす
る。

【００４０】また、本発明の係る方法においては、（２
０）生物がファフィア・ロドザイマ株である、上記（１
７）から（１９）のいずれか一項記載の方法であること
を特徴とする。

【００４１】また、本発明の係る方法においては、（２
１）生物が、DSM13429、DSM13430、およびDSM13431から
なる群より選択される株である、上記（１７）から（２
０）のいずれか一項記載の方法であることを特徴とす
る。

【００４２】また、本発明の係る組換え生物において
は、（２２）オルタナティブオキシダーゼの遺伝子発現
が変化して、宿主生物に比べて効率が減少していること
により特徴づけられる、宿主生物に比べて促進されたレ
ベルでカロテノイド生産が可能な組換え生物であること
を特徴とする。

【００４３】また、本発明の係る組換え生物において
は、（２３）アンチセンス技術、部位特異的変異誘発、
化学的変異誘発などより選択される技術を利用してオル
タナティブオキシダーゼの遺伝子発現を変化させた、上
記（２２）記載の組換え生物であることを特徴とする。

【００４４】また、本発明の係る組換え生物において
は、（２４）生物が原生生物界もしくは菌界に属し、よ
り好ましくはシネココッカス属、シネコシスティス属、
ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、ファフィア属、キサ
ントフィロマイセス属、アカパンカビ属、ロドトルラ
属、ブラケスレア属、またはフィコマイセス属に属す
る、上記（２２）または（２３）記載の組換え生物であ
ることを特徴とする。

【００４５】また、本発明の係る組換え生物において
は、（２５）生物がファフィア・ロドザイマ株である、
上記（２２）から（２４）のいずれか一項記載の組換え
生物であることを特徴とする。

【００４６】また、本発明の係る組換え生物において
は、（２６）生物が、DSM13429、DSM13430、およびDSM1
3431からなる群より選択される株である、上記（２２）
から（２５）のいずれか一項記載の組換え生物であるこ
とを特徴とする。

【００４７】また、本発明の係る組換えDNAにおいて
は、（２７）カロテノイド生産が可能な生物に由来する
オルタナティブオキシダーゼをコードする組換えDNAで
あることを特徴とする。

【００４８】また、本発明の係る組換えDNAにおいて
は、（２８）生物が原生生物界もしくは菌界に属し、よ
り好ましくはシネココッカス属、シネコシスティス属、
ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、ファフィア属、キサ
ントフィロマイセス属、アカパンカビ属、ロドトルラ
属、ブラケスレア属、またはフィコマイセス属に属す
る、上記（２７）記載の組換えDNAであることを特徴と
する。

【００４９】また、本発明の係る組換えDNAにおいて
は、（２９）生物がファフィア・ロドザイマ株である、
上記（２７）または（２８）記載の組換えDNAであるこ
とを特徴とする。

【００５０】また、本発明の係る組換えDNAにおいて
は、（３０）配列が配列番号：2と同一であるか、また
は配列番号：2と55％以上の同一性を有する、上記（２
７）から（２９）のいずれか一項記載の組換えDNAであ
ることを特徴とする。

【００５１】また、本発明の係る組換えDNAにおいて
は、（３１）推定アミノ酸配列が配列番号：1と同一で
あるか、または配列番号：1と51.5％以上の同一性を有
する、上記（２７）から（２９）のいずれか一項記載の
組換えDNAであることを特徴とする。

【００５２】

【発明の実施の形態】多くの研究者らは、アスタキサン
チンの生産が発酵期よりも増殖における呼吸期において
刺激されるため、アスタキサンチンがファフィア・ロド
ザイマ中で抗酸化剤としての役割を果たすのではないか
と推測している。一般に、反応性酸素種は、呼吸鎖の下
流におけるユビキノン・プールの還元速度と電子伝達の
速度減少との間に電子伝達の不均衡が生じたために、呼
吸鎖で電子がオーバーフローした結果として、呼吸期に
生産される傾向がある（図1）。このような推測におい
て、アスタキサンチンは、スーパーオキシドジスムター
ゼが働くように、活性酸素種の反応を消去している可能
性がある。

【００５３】この推測に基づき、アスタキサンチンの過
剰生産は、ファフィア・ロドザイマの呼吸鎖の阻害とし
て認識された。実際に、アン（An）らは、KCN感受性の
呼吸が遮断され、より多くのアスタキサンチンを生産す
る変異体をファフィア・ロドザイマから単離した（App
l. Env. Microbiol.、55、116〜124、1989）。

【００５４】一方、シュレーダー（Shroeder）らはアス
タキサンチンの生産が刺激される増殖後期にファフィア
・ロドザイマの呼吸鎖がKCN感受性の呼吸からKCN耐性の
呼吸に移行した（J. Biol. Chem.、270、18374〜1837
9、1995）と報告した。こうした状況では、オルタナテ
ィブオキシダーゼによって媒介されるKCN耐性の呼吸
は、アスタキサンチンの生産期の呼吸に対してより影響
を与えると考えられる。オルタナティブオキシダーゼの
阻害は、アスタキサンチンの過剰生産をもたらすと思わ
れる。

【００５５】ファフィア・ロドザイマにおけるアスタキ
サンチンの生産に対する、呼吸活性の特異的阻害の効果
を調べるために、オルタナティブオキシダーゼを阻害す
ることが知られているSHAMを、寒天増殖培地に段階的に
希釈した濃度で加えた。こうした研究において、0.3〜
0.45mg / mlのSHAMの存在下においてさえも、SHAMを含
まない培地中と同様の増殖活性を示すいくつかの自然突
然変異体が現れた。驚いたことに、このような変異体
は、それらの親株よりも50％多くアスタキサンチンを生
産することが見出された。このことによって、アスタキ
サンチンの過剰生産を招く何らかの変異が、オルタナテ
ィブオキシダーゼ活性の減少により引き起こされた、呼
吸鎖の還元状態による増殖阻害を補償しうることを示し
ている。

【００５６】したがって、本発明は、オルタナティブオ
キシダーゼの特異的な阻害剤である0.3〜0.45mg / mlの
SHAMに対して耐性の単離変異体を提供する。上記と同様
に、当業者には容易に理解されるように、より高い生産
性でアスタキサンチン生産が可能な変異株は、オルタナ
ティブオキシダーゼに対する1つまたは複数の任意の阻
害剤の存在下で適当な生物を培養する段階、および前記
阻害剤の存在下における増殖活性および親生物よりも高
いアスタキサンチンの生産性を示す生物をスクリーニン
グする段階によって確立されうる。アスタキサンチンの
生産性は、ファフィア・ロドザイマ細胞からカロテノイ
ドを抽出する段階、および実施例2に例示されているよ
うにアスタキサンチンのレベルを測定する段階によって
決定されうる。約10％の生産性の増加が、親株よりも高
いレベルでアスタキサンチン生産が可能な変異株を選択
するための可能な判断基準となる。こうして得られた変
異株をオルタナティブオキシダーゼ阻害剤のプレッシャ
ーの下で再培養およびスクリーニングすることで、生産
性を改善させることができる。こうして得られた変異株
を、適切な培地中でアスタキサンチン生産に適用するこ
とができる。

【００５７】オルタナティブオキシダーゼの活性を減少
させるためには、遺伝子工学の方法を用いたほうが、培
養培地にSHAMなどの特異的な阻害剤を添加するといった
方法よりも多くの利点がある。このような利点の1つは
経済的な理由である。このような阻害剤を添加すると、
生産コストが増大すると考えられる。そして、このよう
な阻害剤を培養培地に添加すると、精製過程において添
加した阻害剤を最終産物から除去するという別の不利益
が生じる。

【００５８】さらに、本発明は、ファフィア・ロドザイ
マに由来するオルタナティブオキシダーゼをコードする
単離された組換えDNA配列を提供する。

【００５９】本発明の該DNAは、その5'非翻訳領域およ
び3'非翻訳領域の中にある短い断片間に隣接するオープ
ンリーディングフレームのみを含むcDNAを意味しうると
共に、イントロンと関心対象の遺伝子の発現に伴うプロ
モーターおよびターミネーターなどの調節配列とを含む
ゲノムDNAも意味しうる。

【００６０】本発明者らはまず、縮重PCR法を用いて、A
OX遺伝子の一部を含む部分遺伝子断片をクローニングし
た。この縮重PCRとは、他種から得られ、同一または同
様の機能を有する既知の酵素とアミノ酸配列の相同性が
高い、関心対象の遺伝子をクローニングするための方法
である。縮重PCRにおいてプライマーとして用いられる
縮重プライマーは、アミノ酸配列を対応するヌクレオチ
ドへと逆翻訳することによって設計された（「縮重され
た」）。このような縮重プライマーにおいては、A、C、
GもしくはTの任意のものからなる混合プライマー、また
はアンビギュイティーコードの箇所にイノシンを含むプ
ライマーが一般に用いられる。本発明では、上記の遺伝
子をクローニングするための縮重プライマーとして混合
プライマーを用いた。用いるPCR条件は、プライマーお
よび遺伝子に応じて、本明細書において後述のように変
更した。

【００６１】上記の縮重PCRによって得られた部分DNA断
片を標識した後にプローブとして用いて、適切な宿主中
でファージベクターまたはプラスミドベクター中に構築
されたゲノムライブラリーをスクリーニングすることに
より、コード領域のほかにイントロンならびにプロモー
ターまたはターミネーターなどの調節領域も含む全遺伝
子を染色体からクローニングすることができる。一般
に、ライブラリーの構築およびそれに続くシークエンシ
ング、制限酵素消化、ライゲーションなどの遺伝子操作
には、宿主株として大腸菌、そしてλファージベクター
などのファージベクター、またはpUCベクターなどのプ
ラスミドベクターの大腸菌ベクターがしばしば用いられ
る。本発明においては、ファフィア・ロドザイマのEcoR
Iゲノムライブラリーが、λベクターの誘導体であるλg
t11において構築された。クローニングする必要のある
インサートの長さである挿入サイズは、ライブラリーを
構築する前にサザンブロットハイブリダイゼーションに
よって決定した。本発明では、プローブとして用いるDN
Aが、供給者（Boehringer-Mannheim、Mannheim、German
y）が作成した手順書に従い、通常の³²P標識の代わりに
ステロイドハプテンであるジゴキシゲニン（DIG）で標
識された。関心対象の遺伝子の一部を有するDIG標識DNA
断片をプローブとして用いることにより、ファフィア・
ロドザイマの染色体から構築したゲノムライブラリーの
スクリーニングが行われた。ハイブリダイズしたプラー
クが採取され、以降の検討に用いた。陽性プラークを単
離した後、配列決定に簡便に用いることのできる適当な
プラスミドベクター中に、インサート断片を導入した。
本発明において、陽性ファージベクター中のインサート
断片を、トランスポゾンが挿入されたシークエンシング
のための誘導体を構築するために用いたpOCUS-2ベクタ
ー中にサブクローニングした（Locus Pocus System,Nov
agen, Madison, U.S.A.）。

【００６２】本発明において、ほとんどのシークエンシ
ングの場合にTaq DNAポリメラーゼを用いるオートサイ
クルシークエンシングプロトコールを使用して、自動蛍
光DNAシークエンサーであるアルフレッドシステム（ALF
red system）（Pharmacia、Uppsala、Sweden）を用い
た。

【００６３】ゲノム配列を決定した後、対応する遺伝子
のcDNAをクローニングするためにコード領域の配列を用
いた。cDNA断片をクローニングするためにPCR法も利用
した。オープンリーディングフレーム（ORF）の5'末端
および3'末端の配列と同一な配列に適当な制限酵素部位
を付加してPCRプライマーを合成し、これらのPCRプライ
マーを用いてPCRを行った。本発明では、このcDNAのPCR
クローニングにおいて、cDNAプールを鋳型として用い
た。このcDNAプールは、ウイルス逆転写酵素およびTaq
ポリメラーゼ（Clontech、Palo Alto、U.S.A.）によっ
て製造されたキャップファインダーキット（CapFinder
Kit）を用いて、ファフィア・ロドザイマから得られたm
RNAを鋳型として、インビトロで合成されたさまざまなc
DNA種よりなる。このように得られた関心対象のcDNA
を、その配列により確認することができる。さらに、こ
のように得られたcDNAは、大腸菌またはサッカロマイセ
ス・セレビシエにおいて適当なプロモーターの下で機能
する発現ベクターにcDNA断片をクローニングした後で、
その酵素活性を確認するのに用いることができる。

【００６４】真核生物由来の遺伝子を発現させるために
は、大腸菌またはサッカロマイセス・セレビシエの発現
ベクターにcDNAをクローニングする方法がしばしば用い
られる。これは、イントロン構造の特異性が生物間で多
様であるという事実と、他種のイントロン配列を認識で
きないという事実に起因している。事実、原核生物はそ
れ自身の遺伝的背景にイントロン構造を有さない。酵母
においてさえも、サッカロマイセス・セレビシエの属す
る子嚢菌類とファフィア・ロドザイマの属する担子菌類
では遺伝的背景が異なっている。ウェリー（Wery）ら
は、ファフィア・ロドザイマに由来するアクチン遺伝子
のイントロン構造は、子嚢菌類の酵母サッカロマイセス
・セレビシエによって認識されず、スプライシングも受
けないことを示した（Yeast、12、641〜651、1996）。

【００６５】何人かの他の研究者らは、何種類かの遺伝
子のイントロン構造が、その遺伝子発現の調節に関わる
ことを報告した（Dabeva, M. D.ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A.、83、5854、1986）。イントロン構造がこ
のような自身の遺伝子発現の調節に関わっている、関心
対象の遺伝子をセルフクローニングする場合には、イン
トロンを有するゲノム断片を用いることが重要である可
能性がある。

【００６６】菌株改良研究に遺伝子工学の方法を適用す
るためには、転写および翻訳などの事象における遺伝的
機構を研究することが必要である。遺伝的機構を研究す
るためには、そのエキソンだけでなく、その上流活性化
配列（UAS）、プロモーター、イントロン構造およびタ
ーミネーターの遺伝子配列も決定することが重要であ
る。

【００６７】本発明に従って、オルタナティブオキシダ
ーゼをコードする遺伝子をファフィア・ロドザイマのゲ
ノムDNAからクローニングし、そのイントロン構造、な
らびに5'隣接領域および3'隣接領域を含めたオルタナテ
ィブオキシダーゼ（AOX）遺伝子を含むゲノム配列を決
定した。

【００６８】酵素活性の確認に続いて、オルタナティブ
オキシダーゼ活性を減少させるための遺伝子改変の研究
も行うことができる。

【００６９】本発明においては、ポリペプチド配列は、
配列番号：2およびAOX活性を有するその断片、ならびに
配列番号：2への特異的結合を同定するのに十分なスト
リンジェント条件下で配列番号：2にハイブリダイズ
し、且つそのハイブリッドがオルタナティブオキシダー
ゼの機能を有するポリペプチドをコードするポリペプチ
ド配列を含む。例えば、以下に記載のハイブリダイゼー
ション条件および洗浄条件の任意の組み合わせを使用し
て、必要とされる特異的結合が達成され得る。

【００７０】高ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン 6×SSC 0.5％ SDS 100μg/mlの変性されたサケ精子DNA 50％ホルムアミド 42℃で穏やかに振盪させることによって一晩インキュベ
ーションする。

【００７１】高ストリンジェントな洗浄 2×SSC、0.5％ SDS中で室温にて15分間、1回洗浄した
後、0.1×SSC、0.5％ SDS中で室温にて15分間洗浄す
る。

【００７２】低ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン 6×SSC 0.5％ SDS 100μg/mlの変性されたサケ精子DNA 50％ホルムアミド 37℃で穏やかに振盪させることによって一晩インキュベ
ーションする。

【００７３】低ストリンジェントな洗浄 0.1×SSC、0.5％ SDS中で室温にて15分間、1回洗浄す
る。

【００７４】中度にストリンジェントな条件とは、ハイ
ブリダイゼーション反応が起こる温度および/または上
記の洗浄条件を変化させることによって得られる。本発
明においては、高ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件および洗浄条件を使用することが好ましい。

【００７５】遺伝的な方法を用いて遺伝子発現を減少さ
せるためには、いくつかの方法が利用できる。このよう
な方法の1つはアンチセンス法である。アンチセンス法
は、関心対象の遺伝子配列と相補的な配列を有する人工
遺伝子断片を導入することにより、関心対象の遺伝子の
発現を減少させる方法である。そして、このようなアン
チセンス遺伝子断片は、インビボで目的遺伝子の成熟mR
NA断片と複合体を形成し、結果としてmRNAからの効率的
な翻訳を阻害すると考えられる。AOX遺伝子のアンチセ
ンスRNAを構築するためには、AOX遺伝子に対して相補的
なcDNA鎖をクローニングするPCR法を用いることができ
る。

【００７６】もう一つの方法は、プロモーター領域の突
然変異誘発である。一般に遺伝子は互いに異なる機能を
有するいくつかの部分からなる。真核生物において、対
応する蛋白質をコードする遺伝子は、リボソームRNA（r
RNA）、核内低分子RNA（snRNA）および転移RNA（tRNA）
に関する遺伝子とは異なり、未成熟メッセンジャーRNA
（pre-mRNA）へと転写される。この転写事象にはRNAポ
リメラーゼII（PolII）が中心的な役割を果たすが、Pol
IIは、プロモーターおよびUASを含む上流領域を含むシ
スエレメントならびにトランス作用蛋白質因子なしで、
それ単独では転写を開始することはできない。まず、い
くつかの基本的な蛋白質構成要素からなる転写開始複合
体が、発現されようとする遺伝子の5'隣接領域にあるプ
ロモーター配列を認識する。この事象においては、熱シ
ョック応答または栄養飢餓状態に対する適応などのよう
にある種の特殊な調節を受けて発現される遺伝子の場合
には、いくつかの別の因子が必要である。このような場
合には、UASがプロモーター配列周辺の5'非翻訳上流領
域に存在することが必要で、いくつかの正または負の調
節蛋白質がUASを認識してそれと結合する。転写開始複
合体のプロモーター配列に対する結合強度はプロモータ
ー周囲のトランス作用因子の結合による影響を受け、こ
れによって転写活性の調節が可能となる。

【００７７】転写開始複合体がリン酸化によって活性化
されると、転写開始複合体は転写開始部位からの転写を
開始する。転写開始複合体のいくつかの部分は伸長複合
体がプロモーター領域から遺伝子の3'側に向かって解離
し（この段階はプロモータークリアランス事象（cleara
nce event）と呼ばれる）、伸長複合体は遺伝子の3'隣
接下流領域に位置する終結配列に達するまで転写を続け
る。

【００７８】関心対象の遺伝子の発現を低下させるため
には、上記のUAS配列を含む目的遺伝子のプロモーター
領域における従来の化学的突然変異誘発法または遺伝的
部位特異的突然変異誘発法による変異誘発がしばしば用
いられる。この方法においては、関心対象の遺伝子の5'
末端に由来するプロモーター領域および関心対象の遺伝
子の3'末端に由来するターミネーター領域と融合させた
レポーター遺伝子を含む遺伝子カセットに変異を誘発
し、ファフィア・ロドザイマに導入する。レポーター遺
伝子の活性の差を検出することで、効率的な変異をスク
リーニングすることができる。関心対象の酵素の発現が
低下すると思われる変異株は、このような変異型プロモ
ーター領域を有する組換えDNAによる宿主株の形質転換
を行うことによって入手しうる。

【００７９】アンチセンスAOX遺伝子またはAOX遺伝子の
変異プロモーターを含むベクターのような構築物は、適
当な宿主株の中に移行させることができる。宿主株とし
てファフィア・ロドザイマを使用する場合は、ファフィ
ア・ロドザイマ内で機能する選択マーカーを有する適切
なベクターに、このような構築物をクローニングするこ
とによって実施する。選択マーカーには、有毒な抗生物
質の存在下でも宿主の生存を可能にする酵素をコードす
る薬剤耐性遺伝子がしばしば用いられる。pGB-Ph9に含
まれるG418耐性遺伝子は、薬剤耐性遺伝子の一例である
（Weryら、Gene,184, 89-97, 1997。このようなプラス
ミドは、染色体とプラスミド間の相同組換えにより、フ
ァフィア・ロドザイマの染色体に取り込まれることが可
能である。

【００８０】形質転換の方法としては、酢酸リチウム法
およびエレクトロポレーション法（Weryら、Gene、18
4、89〜97、1997）がファフィア・ロドザイマの形質転
換に用いられる。

【００８１】このような遺伝子組換えファフィア・ロド
ザイマを、適切な培地中で培養し、そのアスタキサンチ
ン生産性を評価することが可能と思われる。

【００８２】以下の実施例により、添付の図面を参照し
ながら、本発明をさらに詳細に説明する。

【００８３】後述する実施例には、以下の材料および方
法を用いた。

【００８４】菌株ファフィア・ロドザイマ（P. rhodozyma）ATCC 96594株
（ブダペスト条約に準拠して1998年4月8日に寄託番号AT
CC 74438として再寄託された）大腸菌Y1090r^-：araD139、hsdR(r_K ^-、m_K ⁺)、mcrB⁺、rps
L、supF、trpC12::Tn10、ΔlacU169、Δlon、F^-、λ^-、
(pMC9)(Clontech) 大腸菌DH5α株：F^-、φ80d、lacZΔM15、Δ(lacZYA-arg
F)U169、hsd(r_K ^-、m_K ⁺)、recA1、endA1、deoR、thi-1、
gyrA96、relA1(東洋紡、大阪、日本) 大腸菌γΔドナー：Δ(gpt-proA)62、leu、44、ara14、
galK2、lacY1、Δ(mcrC-mrr)、(r_B ^-、m_B ^-)、xyl-5、mtl
-1、recA13、[F⁺::Tn1000(tet^s)](Novagene) 大腸菌γΔレシピエント：F^-、araD139、γ(ara-leu)76
96、galE15、galK16、Δ(lac)X74、(Str^r)、hedR2(r_K12
^-、m_K12 ⁺)、mcrA、mcrB1::Tn5(kan^r)(Novagene) 大腸菌TOP10株：F^-、mcrA、Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ8
0、M15、ΔlacX74、recA1、deoR、araD139,(ara-leu)76
97、galU、galK、rpsL(Str^r)、endA1、nupG(Invitroge
n、NV Leek, the Netherlands) 大腸菌KB822株：pcnB80、zad::Tn10、ΔlacU169、hsdR1
7、endA1、thi-1、supE44

【００８５】ベクター λgt11（Clontech） pCR2.1-TOPO（Invitrogen） pOCUS-2 pBluescriptII SK-（Stratagene） pGBPh9（Weryら、Yeast、12、641〜651、1996）

【００８６】培地ファフィア・ロドザイマ株は通常、YPD培地（DIFCO、De
troit、USA）中で維持する。大腸菌株はLB培地（1リッ
トル当たり10gのバクトトリプトン（DIFCO、5gの酵母抽
出物（DIFCO）および5gのNaCl）中で維持する。軟寒天
（0.7％寒天；WAKO）中でのλファージの増殖にはNZY培
地（1リットル当たり5gのNaCl、2gのMgSO ₄-7H₂O、5gの
酵母抽出物（DIFCO）、10gのNZアミンA型（WAKO、大
阪、日本））を用いる。寒天培地を調製する場合には、
1.5％寒天（WAKO）を添加した。サリチルヒドロキサム
酸（SHAM）は、アルドリッチ（Aldrich）（Milwaukee、
U.S.A.）より購入した。

【００８７】方法分子遺伝学技術の一般的な方法については、分子クロー
ニング：実験マニュアル（Molecular cloning：a Labor
atory Manual）、第2版（Cold Spring HarborLaborator
y Press、1989）の方法に従った。制限酵素およびT4 DN
Aリガーゼは、宝酒造（大津、日本）から購入した。

【００８８】ファフィア・ロドザイマからの染色体DNA
の単離は、QIAGENゲノムキット（QIAGEN Genomic キッ
ト）（QIAGEN、Hilden、Germany）を、製造者から提供
された手順に従って用いることによって行った。形質転
換された大腸菌からのプラスミドDNAのミニプレップ
は、DNA自動分離装置（PI-50、クラボウ、大阪、日本）
を用いて行った。大腸菌形質転換株からのプラスミドDN
Aのミディプレップ（midi-prep）はQIAGENカラム（QIAG
EN）を用いて行った。DNA断片はQIAクイック（QIAquic
k）またはQIAEX II（QIAGEN）を用いてアガロースから
単離および精製した。

【００８９】ファフィア・ロドザイマからの全RNAの単
離は、アイソゲン（Isogen）（ニッポンジーン、富山、
日本）を用いるフェノール法によって行った。mRNAは、
このようにして得た全RNAからmRNA分離キット（Clontec
h）を用いて精製した。cDNAはキャップファインダー（C
apFinder）cDNA作製キット（Clontech）を用いて合成し
た。

【００９０】インビトロパッケージングは、ギガパック
IIIゴールド（Gigapack III gold）パッケージング抽出
物（Stratagene、La Jolla, U.S.A.）を用いて行った。
λDNAの単離は、ウイザードλプレップスDNA精製システ
ム（Wizard lambda preps DNA purification system）
（Promega, Madison, U.S.A.）により、製造業者のプロ
トコールに従って調製した。

【００９１】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、パーキ
ンエルマー（Perkin Elmer）社のサーマルサイクラー、
モデル2400を用いて行った。それぞれのPCR条件は各実
施例で述べる。PCRプライマーは供給販売会社から購入
した。DNAシークエンシングは自動蛍光DNAシークエンサ
ー（ALFred、Pharmacia）を用いて行った。

【００９２】DH5αのコンピテント細胞は、東洋紡から
購入した。全ての化学物質は、記載されていない場合に
はWAKOから購入した。

【００９３】

【実施例】実施例1：ファフィア・ロドザイマATCC96594
株からのSHAM耐性変異体、SHAM1、SHAM2およびSHAM3の
単離ファフィア・ロドザイマの増殖に対する、オルタナティ
ブオキシダーゼによって媒介されるKCN耐性の呼吸の阻
害効果を調べるために、YPD寒天培地上のファフィア・
ロドザイマの培養物にSHAMを添加した。SHAMはエタノー
ルに溶解し、終濃度がそれぞれ0.05、0.15、0.30、0.45
および0.90mg / mlになるようにYPD寒天培地に加えた。
希釈後に、これらの培地上に2×10⁷細胞 / mlのファフ
ィア・ロドザイマATCC96594株を広げた。20℃で3日間培
養した後、得られたコロニーを数えた。その結果、SHAM
含有YPD寒天上で増殖したコロニーの数は、SHAMを含ま
ない対照培地上で増殖したコロニーの数とほぼ同じであ
った。しかし、SHAM含有培地上で増殖したコロニーの大
きさは、対照培養物に比べて小さかった。表1に、対照
のコロニーに対する相対的なコロニーの直径を示す。

【００９４】

【表１】 SHAM含有YPD寒天上で増殖したコロニーの相
対的な大きさ

【００９５】興味深いことに、SHAMを0.3mg / mlおよび
0.45mg / ml含む培地上で増殖したコロニーの中で、い
くつかのコロニーは対照のコロニーと似た大きさを示し
た。このようなコロニーはまた、対照のコロニーよりも
濃色の色素沈着を呈した。対照のコロニーと似た大きさ
を示した4個のコロニーを採取し、YPD寒天培地上に線条
接種した。SHAMを含まないYPD寒天培地上でさえも、す
べてのコロニーは対照のコロニーよりも濃色の色素沈着
を呈した。この結果より、これらの菌株は自然突然変異
体である可能性が示唆され、SHAM1、SHAM2、SHAM3およ
びSHAM4と名付けられた。

【００９６】実施例2：耐性変異体、SHAM1、SHAM2およ
びSHAM3のフラスコ発酵 SHAM耐性変異体、SHAM1、SHAM2およびSHAM3のアスタキ
サンチン生産性を評価するために、振盪フラスコの中で
発酵させた。これらの変異体およびその親株ATCC96594
株を、新しく調製された寒天培養物から500mlの大きさ
のバッフルフラスコに入った50mlのYPD培地に、660nmに
おける最終的な吸光度が0.05になるように接種した。発
酵は、20℃、200r.p.m.にて行われた。適当な間隔をお
いて3mlの培地を採取し、細胞の収量およびアスタキサ
ンチン含量を解析した。

【００９７】細胞の収量は、660nmにおける吸光度とし
て測定した。乾燥細胞重量については、1.5mlの微量遠
心管中の1.0mlの培地を120℃で一晩加熱した後に細胞重
量を測定した。後述のようにガラスビーズで破砕するこ
とにより、細胞からカロテノイドを抽出した後に、ファ
フィア・ロドザイマのアスタキサンチン含量をHPLC法で
測定した。1mlの培地を遠心した後に得られた細胞を蒸
留水で2倍に濃縮し、茶色の遮光試験管（13.5mm、11c
m）に入れたこの細胞懸濁液（0.5ml）に10.0gのガラス
ビーズを加えた。次に、1.5mlのアセトン／ブチル化ヒ
ドロキシトルエン（BHT）／水（450mlのアセトンと50ml
の水に45mgのBHTを入れる）を加え、その後、水平卓上
振盪機を用いて試験管を1時間振盪した。抽出の後、適
当な濃度のビキシン（nacalai tesque、京都、日本）を
内部標準として含む5mlのアセトン／BHT／水を加えた。
後述のHPLCシステムを用いて、上清のアスタキサンチン
含量を解析した。（HPLCシステムのハードウェアは、To
soh（東京、日本）より購入した。）

【００９８】HPLCカラム：YMC-Pak ODS-A（6mm、150mm
（YMC社、Milford、U.S.A.））温度：室温溶出液：アセトニトリル／メタノール／イソプロパノー
ル（85／10／5）注入量：10μl 流速：2.0ml / 分検出：471nmの紫外光

【００９９】表2に結果をまとめた。すべての変異体
は、親株であるATCC96594株よりも50％高いアスタキサ
ンチン生産性を示した。この結果より、これらの変異体
で生じた何らかの変異は、アスタキサンチン生産量を増
加させることにより、オルタナティブオキシダーゼ活性
の阻害を補償するために起こっている可能性がある。

【０１００】

【表２】 SHAM耐性変異体のアスタキサンチン生産性

【０１０１】実施例3：ファフィア・ロドザイマからのm
RNAの単離およびcDNAライブラリーの構築ファフィア・ロドザイマのcDNAライブラリーを構築する
ために、細胞を破砕した直後にフェノール抽出法で全RN
Aを単離し、mRNA分離キット（mRNA separationkit）（C
lontech）を用いて、ファフィア・ロドザイマATCC96594
株からのmRNAを精製した。

【０１０２】まず、YPD培地で2日間培養した10mlの培養
液を遠心して（1500×g、10分間）、ATCC96594株の細胞
を収集し、抽出緩衝液（0.7M 塩化カリウムを含む10mM
クエン酸ナトリウム／塩酸（pH 6.2））で1回洗浄し
た。細胞を2.5mlの抽出緩衝液に懸濁した後、フレンチ
プレスホモジナイザー（Ohtake Works社、東京、日本）
を用いて1500kgf / cm²で破砕し、製造者に指定された
方法に従って、速やかに2倍容量のイソゲン（Nippon ge
ne）と混合した。この段階で、400μgの全RNAが回収さ
れた。

【０１０３】次に、mRNA分離キット（Clontech）を用い
て、製造者に指定された方法に従って、この全RNAを精
製した。最終的に、ファフィア・ロドザイマATCC96594
株より16μgのmRNAが得られた。

【０１０４】cDNAライブラリーを構築するために、製造
者に指定された方法に従って、キャップファインダーPC
R cDNA構築キット（Clontech）を用いた。1μgの精製mR
NAを用いて第1鎖の合成を行い、次にPCRで増幅した。PC
Rによる増幅の後、1mgのcDNAプールを得た。

【０１０５】実施例4：ファフィア・ロドザイマ由来の
部分的AOX（オルタナティブオキシダーゼ）遺伝子のク
ローニングファフィア・ロドザイマから得られた部分的なAOX遺伝
子をクローニングするために、縮重PCR法を行った。オ
ルタナティブオキシダーゼの配列を多重アラインメント
解析（ClustalW, Thompson, J. D.ら、Nucleic Acids R
esearch, 22, 4673-4680, 1994）に使用した種およびデ
ータベースへのアクセッション番号は以下の通りであ
る。

【０１０６】他種由来の既知のオルタナティブオキシダ
ーゼ遺伝子の共通配列に基づいて、表3に示したよう
に、2つの混合プライマーのヌクレオチド配列を設計
し、合成した。

【０１０７】

【表３】 AOX遺伝子のクローニングに用いられたプラ
イマーの配列

【０１０８】ExTaq（宝酒造）をDNAポリメラーゼとして
用い、実施例1で得たcDNAプールをテンプレートとして
用いる、95℃ 30秒間、50℃ 30秒間および72℃ 15秒間
の25サイクルからなるPCR反応の後に、反応混合物をア
ガロースゲル電気泳動にかけた。望ましい長さのPCRバ
ンドを回収し、QIAクイック（QIAquick）（QIAGEN）を
製造者による方法に従って用いて精製した後にpCR2.1-T
OPO（Invitrogen）と連結した。コンビテント大腸菌TOP
10株の形質転換後に６つの白色コロニーを選択し、DNA
自動分離装置を用いてプラスミドを単離した。シークエ
ンシングの結果、3つのクローンが、推定アミノ酸配列
が既知の選択的オキシダーゼ遺伝子と類似する配列を有
することが明らかになった。単離したcDNAクローンをpA
OX514と命名し、以降の検討に用いた。

【０１０９】実施例5：ファフィア・ロドザイマからの
ゲノムDNAの単離ファフィア・ロドザイマからゲノムDNAを単離するため
に、QIAGENゲノムキットを製造者が指定した方法に従っ
て用いた。

【０１１０】まず、YPD培地中で一晩培養した培養液100
mlから遠心処理（1500×g、10分間）によってファフィ
ア・ロドザイマATCC 96594株を回収し、TE緩衝液（1mM
EDTAを含む10mM Tris／HCl（pH 8.0））で1回洗浄し
た。QIAGENゲノムキットのY1緩衝液8ml中に懸濁した
後、酵素消化によって細胞を破壊するためにリティカー
ゼ（SIGMA, St. Louis, U.S.A.）を濃度2mg／mlとなる
ように添加して反応混合物を30℃で90分間インキュベー
トし、続いて次の抽出段階へと進めた。最終的に、20μ
gのゲノムDNAを得た。

【０１１１】実施例6：pAOX514をプローブとして用いる
サザンブロットハイブリダイゼーションファフィア・ロドザイマ由来のAOX遺伝子を含むゲノム
断片のクローニングのために、サザンブロットハイブリ
ダイゼーションを行った。2μgのゲノムDNAをEcoRIで消
化してアガロースゲル電気泳動にかけた後、酸およびア
ルカリ処理を行った。トランスブロット（transblot）
（城東理化、東京、日本）を1時間用いることにより、
変性DNAをナイロン膜（Hybond N+、Amersham、Buckingh
amshire, U.K.）に転写した。DNAをナイロン膜に転写
し、熱処理（80℃、90分間）によって固定した。プロー
ブは、DIGマルチプライミング法（Boehringer Mannhei
m）を用いてテンプレートDNA（EcoRIで消化したpAOX51
4）を標識することによって調製した。ハイブリダイゼ
ーションは製造者が指定した方法を用いて行った。その
結果、ハイブリダイズしたバンドは、5.5〜7.0キロベー
ス（kb）の位置に認められた。

【０１１２】実施例7：AOX遺伝子を含むゲノム断片のク
ローニング 4μgのゲノムDNAをEcoRIで消化し、アガロースゲル電気
泳動にかけた。続いて、長さが5.0〜7.0kbの範囲にある
DNAを、QIAEX IIゲル抽出キット（QIAEX II gel extrac
tion kit）（QIAGEN）によって製造業者の指示に従って
回収した。精製したDNAを、EcoRIで消化してCIAP（仔ウ
シ腸アルカリホスファターゼ）で処理したλgt11（Clon
tech）0.5μgと16℃で一晩連結させ、ギガパックIIIゴ
ールド（Gigapack III gold）パッケージング抽出物（S
tratagene）を用いてパッケージングを行った。パッケ
ージングがなされた抽出物を大腸菌Y1090株に感染さ
せ、NZY培地とともにLB寒天培地の上に重層化した。Eco
RIで消化したpAOX514をプローブとして用いることによ
り、約6000個のプラークをスクリーニングした。1つの
プラークが標識化プローブとハイブリダイズした。

【０１１３】ファフィア・ロドザイマ由来の推定される
AOX遺伝子を含むこのλgt11誘導体は、ウィザードラム
ダプレップスDNA精製システム（Wizard lambda preps D
NA purification system）（Promega）を用いて調製さ
れた。EcoRIによる消化の結果、このλgt11誘導体は6kb
のEcoRIインサートを含んでいることがわかった。次
に、このλgt11誘導体を鋳型として、2つのプライマーa
ox3およびaox5をプライマーとして用いてPCRを行った。
実施例4に記載したと同じPCR条件下でPCRを行ったとこ
ろ、予想された0.3kbのバンドが得られた。このλgt11
誘導体が、ファフィア・ロドザイマの推定されるAOX遺
伝子を含んでいる可能性が示唆された。このλgt11誘導
体中の6.0kbのインサートEcoRI断片をQIAquick（QIAGE
N）で精製し、DH5α株を宿主株としてpOCUS-2ベクター
（Novagen）にサブクローニングして、pOCUSAOX607を得
た。

【０１１４】実施例8：AOX遺伝子を含むゲノム断片のシ
ークエンシング pOCUSAOX607をγδ供与コンピテント細胞に移行させ、L
ocus Pocus system（Novagen）で用いるシークエンシン
グ誘導体の調製に使用した。シークエンシング誘導体の
調製法は、製造者に供給されたプロトコールに従った。
シークエンシングのプライマーとして、表4に記載され
た配列を持つCy5標識プライマーを合成し、AutoCycle s
equencing kit（Pharmacia）を用いたシークエンシング
に使用した。

【０１１５】

【表４】 AOX遺伝子のシークエンシングに用いたプラ
イマーの配列

【０１１６】シークエンスの結果、ファフィア・ロドザ
イマに由来するAOX遺伝子を含むゲノム断片の2561塩基
対を含むヌクレオチド配列を決定した。

【０１１７】コード領域は、1206塩基対の中に、10個の
エキソンと9個のイントロンを含んでいる。イントロン
は、5'または3'に偏りなくコード領域全体を通して分散
していた。遺伝子解析ソフトウェアGENETYX-SV/RC（Sof
tware Development社、東京、日本）バージョン4.0.1を
用いることにより、オープンリーディングフレームは40
2アミノ酸（配列番号：1）よりなり、その配列は他種由
来のオルタナティブオキシダーゼの既知のアミノ酸配列
と著しく類似していることがわかった（黒色アスペルギ
ルス（Aspergillus niger）由来のオルタナティブオキ
シダーゼと51.5％の同一性を有する）。αヘリックス構
造を形成すると推定アミノ末端における疎水性アミノ酸
残基の伸張は、このアミノ酸末端領域が膜貫通領域また
はミトコンドリアの輸送ペプチドである可能性を示して
いた。PSORTIIプログラム（http://psort.nibb.ac.jp:8
800/）は、このタンパク質は82.6％の予測値でミトコン
ドリアタンパク質の可能性があることを予測した。

【０１１８】実施例9：AOX遺伝子の上流領域のクローニ
ング pAOX514は、AOX遺伝子のプロモーターを含むに十分な長
さを持たないように思われたので、Genome Walker Kit
（Clontech）を用いてAOX遺伝子の5'隣接領域のクロー
ニングを行った。まず、表5に示した配列を有するPCRプ
ライマーを合成した。

【０１１９】

【表５】 AOX遺伝子の5'隣接領域のクローニングに用
いたプライマーの配列

【０１２０】ライブラリー構築の方法およびPCR条件
は、製造者に指定されたのと同じものを用いた。実施例
5で得られたゲノムDNA調製物をPCRの鋳型として使用し
た。5'末端にSca I部位を持つPCR断片（1.2kb）と、5'
末端にDra I部位を持つPCR断片（3.0kb）が回収され、
大腸菌TOP10を宿主株として用いて、pCR2.1-TOPOにクロ
ーニングした。上記の2つのそれぞれ独立した実験によ
るシークエンシングの結果として、pAOXSc702と名付
け、さらなる研究に用いた。pAOXSc702中のインサート
断片の配列に基づいて、表6に記載した配列を持つ４個
のPCRプライマーを合成した。

【０１２１】

【表６】 AOXプロモーター領域のクローニングに用い
たプライマーの配列

【０１２２】PCR条件は、DNAポリメラーゼとしてHFポリ
メラーゼ（Clontech）を用いた以外は、実施例4に示し
たものと同じである。aox15およびaox16の組み合わせで
は、長さが0.7kbの断片が増幅された。aox17およびaox1
8の組み合わせでは、長さが0.5kbの断片が増幅された。
これらの断片をpCR2.1-TOPOにクローニングし、大腸菌T
OP10株を形質転換した。6個の独立した白いコロニーか
らそれぞれプラスミドを調製し、シークエンシングに用
いた。結果として、インサート断片の配列が互いに同一
な、予想されたクローンが得られた。aox15およびaox16
の組み合わせにおいて、得られたクローンはpAOX714#15
16と名付けられた。aox17およびaox18の組み合わせにお
いて、得られたクローンはpAOX714#1718と名付けられ
た。シークエンシングの結果、ファフィア・ロドザイマ
のAOX遺伝子のプロモーター領域を含むpAOX714#1516お
よびpAOX714#1718の配列が決定された。AOXプロモータ
ーを含む決定された配列は、その長さが1406塩基対であ
った。

【０１２３】実施例8および実施例9で得られた配列を組
み合わせて、AOX遺伝子およびそのプロモーターおよび
ターミネーターを含むヌクレオチド配列（3.7kb）（配
列番号：2）を決定した。

【０１２４】実施例10：AOX遺伝子のアンチセンスプラ
スミドの構築 AOX遺伝子の構造遺伝子全体に及ぶアンチセンス遺伝子
断片をPCR法により増幅し、その後、ファフィア・ロド
ザイマのASTプロモーターによってAOXアンチセンス遺伝
子が転写される、組込みベクターにクローニングした。

【０１２５】

【表７】 AOX遺伝子のアンチセンスの構築に用いたプ
ライマーの配列

【０１２６】aox101およびaox102の両プライマーは、制
限酵素SfiI（GGCCNNNNNGGCC）に対する非対称的な認識
配列を有するが、それらの非対称的な張り出し（hang-o
ver）配列は異なるように設計された。こうすること
で、同じ非対称的な配列をライゲーション配列に持つ発
現ベクター内での方向性を持った（directional）クロ
ーニングが可能になると思われる。

【０１２７】TaqポリメラーゼとしてHFポリメラーゼ（C
lontech）、および鋳型として実施例3で調製したcDNAを
用いたPCRを以下の条件下で行った。94℃で15秒間、55
℃で30秒間、72℃で45秒間を30回繰り返す。増幅された
PCR断片を精製し、pCR2.1-TOPOベクターにクローニング
した。シークエンシングにより、1つのクローンが正確
な断片を有していることが判明し、このクローンはpAOX
1007#0102と名付けられた。AOX遺伝子のアンチセンス断
片の配列は、配列番号：15に記載されている。

【０１２８】AOXアンチセンス遺伝子の翻訳を制御する
プロモーターおよびターミネーター断片として、実施例
5で調製した染色体からASTプロモーターおよびASTター
ミネーターをクローニングした。

【０１２９】

【表８】 ASTプロモーターおよびASTターミネーターの
クローニングに用いたプライマーの配列

【０１３０】PCR条件は以下の通りである。94℃で15秒
間、55℃で30秒間、72℃で90秒間を25回繰り返す。ast4
9およびast50の組み合わせでは、長さが1.25kbの断片が
増幅された。ast36およびast37の組み合わせでは、長さ
が0.3kbの断片が増幅された。これらの断片をpCR2.1-TO
POにクローニングし、大腸菌TOP10を形質転換した。6個
の独立した白いコロニーからそれぞれプラスミドを調製
し、シークエンスに用いた。その結果、ASTプロモータ
ーおよびASTターミネーターの正確な配列（欧州特許第1
035206A1号）を有したクローンが選択され、さらなる研
究に用いられた（ASTプロモーターにはpUAST407、およ
びASTターミネーターにはpAST526#3637）。

【０１３１】次に、NotIとKpnIで消化したpAST526#3637
およびKpnIとSacIで消化したpG418Sa330（欧州特許第1
035 206 A1号）をNotIとSacIで消化したpBluescriptII
SK-（Stratagene）にライゲーションすることにより、A
STターミネーター配列をG418耐性カセットに融合させ
た。ライゲーション混合液でKB822コンピテント細胞を
形質転換した。制限酵素解析の結果、正確な構造を有す
る1つのクローン（pUAST418）を、さらなる研究のため
に選択した。

【０１３２】その後、リボソームDNA（rDNA）の遺伝子
座（Weryら、Gene、184、89〜97、1997）を含む3.1kbの
SacI断片を、pUAST418のG418カセットの下流に挿入し
た。rDNA断片は、真核生物の染色体に多コピー存在して
いる。rDNA断片を介して組み込むことで、使用した宿主
の染色体上に多コピーで組み込まれることになり、これ
により発現ベクターに含まれる外因性遺伝子を過剰発現
させることができる。この目的のために、rDNA遺伝子を
含むpGBPh9由来のSacI断片を、SacIで消化して細菌性ア
ルカリホスファターゼで処理したpUAST418にライゲーシ
ョンした。ライゲーション混合液でKB822コンピテント
細胞を形質転換した。制限酵素解析の結果、rDNA断片が
互いに異なった向きに挿入された2つのクローン（pURDN
A421およびpURDNAR421）を、さらなる研究のために選択
した。

【０１３３】次に、ファフィア・ロドザイマ中で機能す
る発現ベクターを構築するために、ASTターミネーター
の上流にASTプロモーターを挿入した。pUAST407の1.0kb
のNotIおよびBglII断片、ならびにpUAST407の0.25kbのB
glIIおよびPstI断片を、NotIおよびSse8387 Iで消化し
たpURDNA421またはpURDNAR421にライゲーションした。
ライゲーション混合液によりKB822コンピテント細胞を
形質転換し、得られた各6つのコロニーに対して制限酵
素解析を行った。ASTプロモーターが正しい向きに挿入
されたクローンを（rDNA断片の向きが逆向きなpF718お
よびpR718）、さらなる研究のためにそれぞれ選択し
た。

【０１３４】最後に、pAOX1007#0102の1.2kbのSfiI断片
を、SfiIで消化したpF718またはpR718に挿入することに
より、AOXアンチセンス構築物が完成した。得られたプ
ラスミドは、pFAOX828およびpRAOX828と名付けられた。

【０１３５】実施例11：AOXアンチセンスベクターによ
るファフィア・ロドザイマの形質転換 AOXアンチセンスベクターpFAOX828およびpRAOX828で、
ファフィア・ロドザイマ野生株であるATCC96594株を形
質転換した。微粒子銃を用いた形質転換は、「分子生物
学（Molecular Biology）」（Johnsonら、53、147〜15
3、1996）中の方法の項に述べられている方法に従って
行った。ファフィア・ロドザイマATCC96594株を、YPD培
地中で定常期に達するまで培養した。培地を遠心した
後、滅菌水を用いて細胞を10倍に濃縮し、100μg / ml
のジェネティシンならびに0.75MのD-マンニトールおよ
びD-ソルビトールを含むYPD培地上に200μlの細胞懸濁
液を広げた。粒径0.9μmの金粒子1.5mgを5μgのプラス
ミドでコーティングし、微粒子銃を用いた形質転換にお
いて供与DNAとして使用した。pFAOX828によって形質転
換され、増強された色素沈着を呈したジェネティシン耐
性コロニーの一つを、そのアスタキサンチン生産性およ
びAOX遺伝子によってコードされるオルタナティブオキ
シダーゼ活性の減少を鑑み、さらなる特徴付けのために
選択した。

【０１３６】実施例12：ファフィア・ロドザイマ、ATCC
96594株由来のpFAOX828組込み体の特徴づけ試験管（直径21mm）に入れた10mlのYPD培地中で、20℃
で3日間成育させた種培養を用いて、500mlのエルレンマ
イヤーフラスコに入れた50mlのYPD培地中で、ファフィ
ア・ロドザイマの形質転換体ATCC96594::pFAOX828を親
株であるATCC96594株と一緒に20℃で3日間培養した。異
なる時点、例えば接種の24時間、43時間、および65時間
後に適切な容量の培養液を採取し、KCNの存在下または
非存在下において、その増殖、アスタキサンチン生産
性、および酸素摂取活性を解析した。この24、43および
65時間の時点というのは、それぞれ対数期後期の増殖
期、定常期中期および定常期後期に相当する。

【０１３７】増殖を解析するために、1mlの培地を微量
遠心した後に得られた細胞を100℃で1日間乾燥させて乾
燥細胞重量を測定したほか、UV-1200光度計（Shimadzu
社、京都、日本）を用いて660nmでの吸光度を測定し
た。

【０１３８】アスタキサンチン含量およびカロテノイド
の総量を解析するために、1.0mlの培地を微量遠心して
細胞を収集し、ガラスビーズによって破砕し、ファフィ
ア・ロドザイマ細胞からカロテノイドを抽出するために
用いた。抽出の後、破砕された細胞を遠心によって除去
し、残渣をHPLCにかけてカロテノイド含量を解析した。
使用したHPLC条件は以下の通りである。

【０１３９】HPLCカラム：Chrompack Lichrosorb si-60
（4.6mm、250mm）温度：室温溶出液：アセトン／ヘキサン（18／82）に対して、1ml
/ lの水を加える注入量：10μl 流速：2.0ml / 分検出：450nmの紫外光

【０１４０】アスタキサンチンの参考文献を、エフ．ホ
フマン−ラロシュアーゲー（F.Hoffman-La Roche A
G）（バーゼル、スイス）より得た。

【０１４１】KCNの存在下または非存在下において、酸
素摂取活性を測定することで呼吸活性を決定するため
に、Iijima Electronics Corporation（愛知、日本）に
よって製造されたDOメーターモデルB-505およびDOプロ
ーブGU-BMを用いた。収集した細胞を0.5M KPB（pH 7.
4）に再懸濁した。そして、DO解析用チャンバー内で、
この細胞懸濁液のうち200μlを2.3mlの水で希釈した。
測定は、0.48mM KCNの存在下または非存在下において、
0.2mlの1M グルコースを添加することによって測定を開
始した。

【０１４２】表9に結果をまとめた。

【０１４３】

【表９】（呼吸活性は、酸素摂取 nmol / 分×乾燥細胞 mgで表
した。）

【０１４４】表9に示したように、培養の24時間後に
は、AOXアンチセンス形質転換体であるATCC96594::pFAO
X828の増殖は親株であるATCC96594に比べて遅かった
が、43時間後には親株と同様な細胞収量を示した。形質
転換株のアスタキサンチンおよびカロテノイド含量は15
％増加した。その呼吸活性から、形質転換株は親株と同
様なKCN感受性の呼吸活性（95％）を有するが、オルタ
ナティブオキシダーゼを介するKCN耐性の呼吸は、培養2
4時間後には宿主株に比べて20％のレベルまで減少して
おり、培養43時間後には完全に減退した。

【０１４５】この結果より、KCN耐性の呼吸を媒介する
オルタナティブオキシダーゼ活性の減少は、ファフィア
・ロドザイマにおけるアスタキサンチンおよびカロテノ
イドの過剰生産につながることが示された。

【０１４６】

【発明の効果】本発明により、カロテノイド生産が可能
な親生物を、オルタナティブオキシダーゼ活性の減少を
誘導するような条件下で処理し、カロテノイド生産性が
促進された生物を選択することにより得られる生物の培
養を含む、カロチノイドを生産する方法が提供された。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG エフ．ホフマン−ラロシュアーゲー <120> Process for astaxanthin アスタキサンチンのための方法 <130> 20685 <150> 00111148.3 <151> 2000-05-24 <160> 19 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> Phaffia rhodozyma <400> 1 Met Ser Leu Ala Arg Cys Leu Val Gln Ala Ser Thr Arg Ser Leu 1 5 10 15 Ser Arg Thr Val Arg Pro Ser Tyr Leu Thr Pro Leu Thr Val His 20 25 30 Phe Phe Ser Ser Thr Ile Ser Arg Ser Cys Ser Arg Ser Tyr Ser 35 40 45 Thr Ser Asn Thr Arg Leu Ser Thr Ser Asn Gly Gln Gln Ser Thr 50 55 60 His His Leu Ala Asp Asn Val Pro Leu Thr Thr Asp Lys Gln Arg 65 70 75 His Leu Gln Gly Val Ile Gly Gly Glu Gly Met His Gln His Asp 80 85 90 Ala Thr Thr Val Ala His Thr Asp Pro Leu Ala Ser Val Ile Gln 95 100 105 Asp Leu Thr Val Pro Thr Asn Gly Ser Trp Val Met His Asn Pro 110 115 120 Val Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Asp Ala Val Gln Val Val His Arg 125 130 135 Pro Pro Thr Asn Thr Ser Asp Gln Val Ser Thr Lys Leu Val Lys 140 145 150 Met Leu Arg Trp Gly Phe Asp Leu Val Ser Asn Tyr Lys His Val 155 160 165 Pro Phe Pro Ala Asn His Lys Glu Leu Ser Val Thr Gln Leu Arg 170 175 180 Gln Met Gly Cys Leu Leu Ser Pro Asp Gln Trp Met Thr Arg Phe 185 190 195 Ile Phe Leu Glu Thr Thr Ala Ala Ile Pro Gly Met Val Gly Gly 200 205 210 Leu Leu Arg His Leu Gln Ser Leu Arg Leu Met Arg Arg Asp Gly 215 220 225 Gly Trp Ile His Thr Leu Leu Ala Glu Ala Glu Asn Glu Arg Leu 230 235 240 His Leu Leu Thr Phe Met Ser Met Ala Asn Pro Pro Leu Trp Phe 245 250 255 Arg Ala Leu Ile Leu Gly Ala Gln Gly Val Phe Tyr Asn Leu Phe 260 265 270 Phe Ile Thr Tyr Leu Ile Ser Pro Pro Val Ala His Arg Phe Val 275 280 285 Ala Cys Leu Glu Glu Glu Ala Val Val Thr Tyr Thr Arg Ile Ile 290 295 300 Ser Asp Ile Glu Asn Gly Tyr Val Pro Glu Trp Glu Lys Leu Pro 305 310 315 Ala Pro Glu Ile Ala Ile Ser Tyr Trp Arg Leu Pro Pro Asp Ala 320 325 330 Thr Phe Leu Asp Thr Leu Arg Ala Ile Arg Ala Asp Glu Ala Thr 335 340 345 His Arg Phe Val Asn His Thr Phe Ala Ser Leu Asp Ser Lys Lys 350 355 360 Asp Phe Asn Pro Phe Ala Ile Ala Glu Pro Asp Ala Thr Thr Lys 365 370 375 Gly Ser Val Tyr Gly Phe Thr Arg Asp Glu Ala Ala Ala Phe Ala 380 385 390 Gln Lys Thr Arg Glu Arg Met Ser Gln Thr Asn 395 400 <210> 2 <211> 3724 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <221> exon <222> (1407)...(1674) <220> <221> intron <222> (1675)...(1769) <220> <221> exon <222> (1770)...(1873) <220> <221> intron <222> (1874)...(1948) <220> <221> exon <222> (1949)...(2155) <220> <221> intron <222> (2156)..(2264) <220> <221> exon <222> (2265)...(2295) <220> <221> intron <222> (2296)...(2372) <220> <221> exon <222> (2373)...(2423) <220> <221> intron <222> (2424)...(2515) <220> <221> exon <222> (2516)...(2645) <220> <221> intron <222> (2646)...(2735) <220> <221> exon <222> (2736)...(2831) <220> <221> intron <222> (2832)...(2914) <220> <221> exon <222> (2915)...(2998) <220> <221> intron <222> (2999)...(3085) <220> <221> exon <222> (3086)...(3206) <220> <221> intron <222> (3207)...(3320) <220> <221> exon <222> (3321)...(3434) <220> <221> 5'UTR <222> (1295)...(1296) <223> (EXPERIMENTAL) <220> <221> polyA_site <222> (3682)...(3683) <223> (EXPERIMENTAL) <400> 2 gaattcaaca ggtcaaatga gaaaggacaa ggtgaagaga tggaaccaga 50 agcaatcagc gagagtaaag acgatggttc taaacataca ttgggcacga 100 ctcccttgat ccgaggcagg tatacgacca gatacaaaaa caagctgacg 150 gtcacggccg aaaataggaa ggagagttgc aacgctcggc taaagaaggt 200 ggattcaatc acaacacacg gtcaaggcaa gcatgacata ttgagctttt 250 gcttgagtat ctcgcgatca aagtgatgat ggatgcttct aaggatcgtc 300 tttatctttc cgccaggaga tgtgcaataa caagagagga agagaaacgt 350 aaaggagtgt actcacatgc ccaaaccacc ggcgttggat tcgagaagag 400 ctcttcttag gctgtctccg acgccccaat ggcggacgcc caatagtcca 450 aacacgatgt acttgccatt ccgaagaagg ttaggaaggt atgggctcga 500 agctgctgat tgaccagaca taggacaaga acaaataaag agacaagaaa 550 cgacaacgac cgagcagata tctgactaga gaaaaccgtg gcgacgttgc 600 aatgtttggg cccgaaaaaa gatgagttgc tttgttttcg agtcgtcctg 650 tagccccagc tggggactag ccgctgtcac gaggaaacag gcgtgggtgg 700 atgctccacc acatggatgg ttacacacgc cacactgccg cacgctgcgc 750 agatataacc cgttcaacac ccgacaacga actggttgac cttccgaggt 800 gaccatcaag cttggatgtt cagctgcgat attcagctac gatgatatgt 850 atgccgaaca caagtagtaa aatggctcag aaagacacag aagaaacggc 900 gttcattact ccgaaagacg agacatcccc gcatgaatct ctggacgata 950 aagccaagcg gacggacgga agcccattgg cgatggtcgg ttactaaccc 1000 tgctggcttc actgcttggc ctgacttgac tgtctcttcc tcacttgctg 1050 tcttgactcg gtcgacggat aactcgccaa acccatcaac acggcagtcc 1100 gtttagattt ccgttcccac ctcttcttcg agtttccgtt catgctctac 1150 taatgcgttt actgaattca acacaatgtc taattgaatc tgctgactgt 1200 actgcctgtt gatctgaggt ttctgacact aacatgactt atcatttggc 1250 tgacttataa atagttcgag accaacagct cttaattctg atcctgccta 1300 catacatatc tactctttgc tcgaccattg catcaaacca ttgcacgctt 1350 ctctccatac tggctatatc acaatacctg ccatatacat tgcccaacta 1400 ccaaca atg tct ctt gct aga tgt ctt gtc cag gca tca act 1442 cgg tca ctt tcg cgt acc gtt cgg cca tcc tat ctc aca cct 1484 cta aca gtt cac ttc ttc tcc tca aca atc tca agg agc tgc 1526 tcc agg tca tat tca acg tcg aac acc cgc ctt tca aca tct 1568 aat ggt caa caa tca acg cat cat ctt gcg gac aat gtt cct 1610 ctc acc acc gac aaa caa agg cac ctt caa ggc gtc atc ggc 1652 ggt gag ggc atg cat cag cat g gtccgttctt ctgtcctcta 1694 tcatattcgt atcaaaatat ggattagttc ttattcacaa ttctttatct 1744 catcaaacat gcttactgtc catag at gca acg acg gta gct cat 1789 acg gat ccc tta gct tcc gtc ata caa gat ttg act gtt ccc 1831 act aac gga tct tgg gtg atg cat aat ccc gtc tat act cga 1873 gtacgtctct gaacgcttcg cttcaattat tcctgcgcta gctacagctc 1923 accggtcctt ctccctttct gacag act gag tta gat gct gtt cag 1969 gtc gtt cat cgt ccc ccc acc aac acg tcc gac caa gtc tcc 2011 acc aag ctt gtc aag atg ctc cga tgg gga ttc gac ctt gtc 2053 agc aac tac aaa cat gtt ccc ttt ccc gca aac cac aaa gaa 2095 ctc agc gtc act caa ttg cgc caa atg ggc tgt ctt ctc tcg 2137 cct gat caa tgg atg acg gttagtatta cttactcttg tcgtcagtat 2185 tcatggcaac atattgctca tctagtcaag tgcacacgtc catttcgtct 2235 aatttgttac tttttctgaa aattcacag agg ttc atc ttt cta gaa 2282 aca aca gct gct a gttcgttcat ccaccaacac aaccattctt 2325 gataataccc actttttctt cgatactgat atttatactc aacctag tt 2374 cct gga atg gtt ggc ggt ctc ttg cgc cat ctt cag tct ctc 2416 cga ctc a gttcgtttca ttctttcttc tcgattgatc atcgttttgg 2463 catcatctgt tgataagcat agtccttacg cattcgatct tgattcgttc 2513 ag tg cga cgg gat ggt ggt tgg att cac acg ctt ctt gct 2553 gaa gct gaa aac gaa cgt ctc cac ctt ctg acg ttc atg agc 2604 atg gct aat cca cct ctc tgg ttc cga gct ttg ata ctg gga 2637 gct caa gg gtcagccttt tttatcatta ttaatattaa tttctctctc 2685 tagacgatca cggaccatgt gctgagaggg tcttcatata tgctttgcag 2735 g gtt ttt tat aac ctg ttc ttc ata act tat tta att tcc 2775 ccg ccg gtg gct cat cga ttc gtt gcc tgc ctg gag gaa gaa 2817 gct gtc gtt act ta gtaagatcga tcgttgcaat catgctcgag 2861 tagtctttta gtttgttaat cattcgattg ggattggttt cgtatttcat 2911 cag c aca aga att atc agt gat atc gag aac ggc tat gta 2951 cct gaa tgg gaa aag ctt ccc gct ccc gag att gct ata tct 2993 tac tg gtctgcttga cttcagtcgc acagtttcat ttgtcttgac 3038 atgtaaattg ttactgacaa tatgctcaca aatatcacct tcatcag g 3086 cga ctt cct ccc gat gct acc ttt ttg gac aca ctg cga gcc 3128 atc cga gca gat gag gcc act cat cga ttc gtg aat cac aca 3170 ttt gcc agc ctg gac tct aag aaa gac ttc aat cca 3206 gttcgtatag accttccaaa ccctaactgc gcgtcctcga ctgaaactta 3256 tagattgatc aaatctcaaa ccttcattcg cctgtcattc atctctgttt 3306 cgaaatcaca taag ttt gcg ata gcc gag cca gac gcc act act 3350 aaa ggc tcg gta tat ggt ttc aca cgg gac gag gcc gcc gcc 3392 ttc gct cag aag acg aga gaa cgc atg tct cag acc aat tga 3434 tattcatccc taattgtcct atactctttc tcttcttcat gtttgattct 3484 ctgtactatt ttctggcggt ttgtatagtt ttatgggtca agttcggttt 3534 tcttttttgg ttgttcttct ctttcccata ttgaataaaa tccgtctatg 3584 ttttccttga tcttgattcg gatcgattgt cactcctcac tcctctctcc 3634 tcattcatct actctacctc agtcttatat gggttatgtc gcttccttct 3684 caaatgacat acgcaaactc agtatttgag aacattgtga 3724 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:degenerate PCR primer(sense primer) <400> 3 aaygarmgna tgcayytnyt nacntt 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:degenerate PCR primer (antisense primer) <400> 4 gcytcytcyt cnarrtancc nacraa 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:sequencing primer (5' nucleotide was Cy5-labeled) <400> 5 agctacaaca tacgaaaggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:sequencing primer (5' nucleotide was Cy5-labeled) <400> 6 ggggaactga gagctctaaa 20 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:genome walking PCR primer (primary primer) <400> 7 gtgtcagaaa cctcagatca acaggc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:genome walking PCR primer (nested primer) <400> 8 caacaggcag tacagtcagc agattc 26 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for cloning of promoter region (sense primer) <400> 9 gaattcaaca ggtcaaatga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for cloning of promoter region (antisense primer) <400> 10 atccacccac gcctgtttcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for cloning of promoter region (sense primer) <400> 11 ggaaacaggc gtgggtggat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer for cloning of promoter region (antisense primer) <400> 12 gaattcagta aacgcattag 20 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : PCR primer for construction of antisense AOX gene (sense primer) <400> 13 ggccattatg gcctcaattg gtctgagaca tgc 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : PCR primer for construction of antisense AOX gene (antisense primer) <400> 14 ggccgaggcg gccatgtctc ttgctagatg tct 33 <210> 15 <211> 1232 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <400> 15 ggccattatg gcctcaattg gtctgagaca tgcgttctct cgtcttctga 50 gcgaaggcgg cggcctcgtc ccgtgtgaaa ccatataccg agcctttagt 100 agtggcgtct ggctcggcta tcgcaaatgg attgaagtct ttcttagagt 150 ccaggctggc aaatgtgtga ttcacgaatc gatgagtggc ctcatctgct 200 cggatggctc gcagtgtgtc caaaaaggta gcatcgggag gaagtcgcca 250 gtaagatata gcaatctcgg gagcgggaag cttttcccat tcaggtacat 300 agccgttctc gatatcactg ataattcttg tgtaagtaac gacagcttct 350 tcctccaggc aggcaacgaa tcgatgagcc accggcgggg aaattaaata 400 agttatgaag aacaggttat aaaaaacccc ttgagctccc agtatcaaag 450 ctcggaacca gagaggtgga ttagccatgc tcatgaacgt cagaaggtgg 500 agacgttcgt tttcagcttc agcaagaagc gtgtgaatcc aaccaccatc 550 ccgtcgcatg agtcggagag actgaagatg gcgcaagaga ccgccaacca 600 ttccaggaat agcagctgtt gtttctagaa agatgaacct cgtcatccat 650 tgatcaggcg agagaagaca gcccatttgg cgcaattgag tgacgctgag 700 ttctttgtgg tttgcgggaa agggaacatg tttgtagttg ctgacaaggt 750 cgaatcccca tcggagcatc ttgacaagct tggtggagac ttggtcggac 800 gtgttggtgg ggggacgatg aacgacctga acagcatcta actcagttcg 850 agtatagacg ggattatgca tcacccaaga tccgttagtg ggaacagtca 900 aatcttgtat gacggaagct aagggatccg tatgagctac cgtcgttgca 950 tcatgctgat gcatgccctc accgccgatg acgccttgaa ggtgcctttg 1000 tttgtcggtg gtgagaggaa cattgtccgc aagatgatgc gttgattgtt 1050 gaccattaga tgttgaaagg cgggtgttcg acgttgaata tgacctggag 1100 cagctccttg agattgttga ggagaagaag tgaactgtta gaggtgtgag 1150 ataggatggc cgaacggtac gcgaaagtga ccgagttgat gcctggacaa 1200 gacatctagc aagagacatg gccgcctcgg cc 1232 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artficial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : PCR primer for cloning of AST promoter (sense primer) <400> 16 gcggccgcac gtacagacta agatcgac 28 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artficial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : PCR primer for cloning of AST promoter (antisense primer) <400> 17 ggccataatg gccatggaga aagtaggtgg caa 33 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artficial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : PCR primer for cloning of AST terminater (sense primer) <400> 18 cctgcaggcc gcctcggccg ttgattcttc atatgttaa 39 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artficial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : PCR primer for cloning of AST terminater (antisense primer) <400> 19 ggtaccctgc agtcgacaaa catgaa 26

【図面の簡単な説明】

【図１】ファフィア・ロドザイマの呼吸鎖に関する作
業モデルを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者瀬戸口豊神奈川県藤沢市片瀬山４−27−２Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA05 BA08 CA04 DA12 EA04 GA11 HA12 4B064 AH01 CA06 CA19 CC24 CD07 CE02 CE08 CE10 DA05 DA11 4B065 AA72X AA72Y AB01 AC14 BA02 BD01 BD16 BD29 BD30 CA18 CA28 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】オルタナティブオキシダーゼ活性の減少
を誘導するためにカロテノイド生産が可能な親生物を処
理すること、およびカロテノイド生産性が促進された生
物を選択することにより得られる、生物を培養する段階
を含む、カロテノイドを生産する方法。
【請求項２】生物が、オルタナティブオキシダーゼ阻
害剤に対する耐性の変化を利用して、カロテノイド生産
性を促進させた変異株である、請求項1記載の方法。
【請求項３】生物がオルタナティブオキシダーゼ阻害
剤に対して耐性の変異株である、請求項1または2記載の
方法。
【請求項４】生物が原生生物界もしくは菌界に属し、
より好ましくはシネココッカス（Synechococcus）属、
シネコシスティス（Synechocystis）属、ヘマトコッカ
ス（Haematococcus）属、ドナリエラ（Dunaliella）
属、ファフィア（Phaffia）属、キサントフィロマイセ
ス（Xanthophyllomyces）属、アカパンカビ（Neurospor
a）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ブラケスレア
（Blakeslea）属、またはフィコマイセス（Phycomyce
s）属に属する、請求項2または3記載の方法。
【請求項５】生物がファフィア・ロドザイマ株であ
る、請求項2から4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】生物が、DSM13429、DSM13430、およびDS
M13431からなる群より選択される株である、請求項2か
ら5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】オルタナティブオキシダーゼ阻害剤が、
n-没食子酸プロピルおよびサリチルヒドロキサム酸から
なる群より選択される、請求項2から6のいずれか一項記
載の方法。
【請求項８】親生物に比べて促進されたレベルでカロ
テノイド生産が可能な変異株を確立する方法であって、
オルタナティブオキシダーゼ活性を減少させるような条
件下でカロテノイド生産能を有する生物を培養し、かつ
該親生物よりも高いレベルでカロテノイド生産が可能な
生物を選択する段階を含む方法。
【請求項９】オルタナティブオキシダーゼ活性を減少
させる条件に、オルタナティブオキシダーゼ阻害剤が存
在することが含まれる、請求項8記載の方法。
【請求項１０】オルタナティブオキシダーゼ阻害剤
が、n-没食子酸プロピルおよびサリチルヒドロキサム酸
からなる群より選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】生物が原生生物界もしくは菌界に属
し、より好ましくはシネココッカス属、シネコシスティ
ス属、ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、ファフィア
属、キサントフィロマイセス属、アカパンカビ属、ロド
トルラ属、ブラケスレア属、またはフィコマイセス属に
属する、請求項8から10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】生物がファフィア・ロドザイマ株であ
る、請求項8から11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】生物が、DSM13429、DSM13430、および
DSM13431からなる群より得られる株である、請求項8か
ら12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】請求項8から13のいずれか一項におい
て定義された方法により得られる、親生物に比べて促進
されたレベルでカロテノイド生産が可能な生物の変異
株。
【請求項１５】生物が原生生物界もしくは菌界に属
し、より好ましくはシネココッカス属、シネコシスティ
ス属、ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、ファフィア
属、キサントフィロマイセス属、アカパンカビ属、ロド
トルラ属、ブラケスレア属、またはフィコマイセス属に
属する、請求項14記載の変異株。
【請求項１６】生物がファフィア・ロドザイマ株であ
る、請求項14または15記載の変異株。
【請求項１７】生物が、オルタナティブオキシダーゼ
の遺伝子発現を変化させて、宿主生物に比べて効率が減
少している組換え生物である、請求項1記載の方法。
【請求項１８】アンチセンス技術、部位特異的変異誘
発、化学的変異誘発などより選択される技術を利用して
オルタナティブオキシダーゼの遺伝子発現を変化させ
た、請求項17記載の方法。
【請求項１９】生物が原生生物界もしくは菌界に属
し、より好ましくはシネココッカス属、シネコシスティ
ス属、ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、ファフィア
属、キサントフィロマイセス属、アカパンカビ属、ロド
トルラ属、ブラケスレア属、またはフィコマイセス属に
属する、請求項17または18記載の方法。
【請求項２０】生物がファフィア・ロドザイマ株であ
る、請求項17から19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】生物が、DSM13429、DSM13430、および
DSM13431からなる群より選択される株である、請求項17
から20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】オルタナティブオキシダーゼの遺伝子
発現が変化して、宿主生物に比べて効率が減少している
ことにより特徴づけられる、宿主生物に比べて促進され
たレベルでカロテノイド生産が可能な組換え生物。
【請求項２３】アンチセンス技術、部位特異的変異誘
発、化学的変異誘発などより選択される技術を利用して
オルタナティブオキシダーゼの遺伝子発現を変化させ
た、請求項22記載の組換え生物。
【請求項２４】生物が原生生物界もしくは菌界に属
し、より好ましくはシネココッカス属、シネコシスティ
ス属、ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、ファフィア
属、キサントフィロマイセス属、アカパンカビ属、ロド
トルラ属、ブラケスレア属、またはフィコマイセス属に
属する、請求項22または23記載の組換え生物。
【請求項２５】生物がファフィア・ロドザイマ株であ
る、請求項22から24のいずれか一項記載の組換え生物。
【請求項２６】生物が、DSM13429、DSM13430、および
DSM13431からなる群より選択される株である、請求項22
から25のいずれか一項記載の組換え生物。
【請求項２７】カロテノイド生産が可能な生物に由来
するオルタナティブオキシダーゼをコードする組換えDN
A。
【請求項２８】生物が原生生物界もしくは菌界に属
し、より好ましくはシネココッカス属、シネコシスティ
ス属、ヘマトコッカス属、ドナリエラ属、ファフィア
属、キサントフィロマイセス属、アカパンカビ属、ロド
トルラ属、ブラケスレア属、またはフィコマイセス属に
属する、請求項27記載の組換えDNA。
【請求項２９】生物がファフィア・ロドザイマ株であ
る、請求項27または28記載の組換えDNA。
【請求項３０】配列が配列番号：2と同一であるか、
または配列番号：2と55％以上の同一性を有する、請求
項27から29のいずれか一項記載の組換えDNA。
【請求項３１】推定アミノ酸配列が配列番号：1と同
一であるか、または配列番号：1と51.5％以上の同一性
を有する、請求項27から29のいずれか一項記載の組換え
DNA。