JP2002209582A - 耐熱性グルコキナーゼ遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いた耐熱性グルコキナーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 耐熱性グルコキナーゼを遺伝子工学的に大量
製造するための遺伝子操作材料と、この材料を用いた耐
熱性グルコキナーゼの製造方法の提供。 【解決手段】 好熱性バチルス属微生物であるバチルス
・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）等のＤＮＡライブラ
リーから得られた遺伝子の発現産物のうちの特定のアミ
ノ酸配列からなる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺
伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は耐熱性グルコキナー
ゼをコードする遺伝子と、この遺伝子を含有する組換え
ベクター、組換えベクターによる形質転換体、並びにこ
の形質転換体による耐熱性グルコキナーゼの製造方法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】グルコキナーゼ[EC.2.7.1.2]は、生体内
では解糖系の第一段階、すなわちＡＴＰの導入において
重要な役割を果たす酵素である。一方、検査用組成物の
必須成分として、グルコースを測定する場合、あるいは
サンプル中のグルコースを消去する際、いずれにおいて
も産業上有用な酵素であり、各種検査試薬に用いられて
いる。

【０００３】グルコキナーゼがグルコースに対して非常
に高い基質特異性を示すのに対し、同様な反応を触媒す
る酵素として知られているヘキソキナーゼ[EC.2.7.1.1]
は、多種にわたる糖を基質とする異なる酵素である。さ
らに、これら2種の酵素は、アミノ酸配列の相同性が低
いという点においても、全く異なるタンパク質である。

【０００４】本発明者等は、好熱性微生物であるバチル
ス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermop
hilus）より単離したグルコキナーゼが非常に安定であ
ることを見いだし、その効率的な製造方法を提案した
（特開昭５６-１２７０８６号公報参照）。

【０００５】一方、グルコキナーゼ遺伝子を生体内で発
現させる方法が、特開昭６０−１０２１９５号公報、特
開昭６１−１２４３９０号公報、特開平１１−１２７８
８０号公報、特表平１０-５１２７６２号公報、特開平
６-２９２４８５号公報、特表平１０-５０７０８４号公
報、特表平１０-５０５４９８号公報、特表平０８-５０
８３９８号公報および再表９８／０１２３４３号公報な
どで開示されているが、これらのグルコキナーゼは安定
性、基質親和性などの点において、本発明に記載される
酵素とは異なるものである。またその発現方法は、酵素
を単離精製して大量生産することには適さず、本発明に
おいて開示する方法とは異なるものである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らが提案した
上記の製造方法により、熱および保存安定性に優れたグ
ルコキナーゼが得られ、その精製も容易に行うことが可
能となった。しかしながら、上記方法において耐熱性グ
ルコキナーゼを製造する場合には、通常５０℃〜６０℃
の高温度で生産菌体を培養することにより得ているた
め、多量のエネルギーが必要であった。また、この微生
物のグルコキナーゼ生産量が少量であるために、耐熱性
グルコキナーゼの大量生産が困難であるという問題点は
依然として未解決であった。

【０００７】本発明は、好熱性微生物であるバチルス・
ステアロサーモフィラス（Bacillusstearothermophilu
s）に由来する耐熱性グルコキナーゼを遺伝子工学的に
大量製造するための遺伝子操作材料と、この材料を用い
た耐熱性グルコキナーゼの製造方法を提供することを目
的としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、このよう
な課題を解決するために鋭意研究を行った結果、上記の
バチルス・ステアロサーモフィラスが産生する耐熱性グ
ルコキナーゼ遺伝子を単離および構造決定することに成
功し、さらに、耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入した組換えベクターを得、こ
の組換えベクターをエシェリシア属に属する菌株などに
含ませた該耐熱性グルコキナーゼ生産能を有する菌株を
培地で培養すると、効率よく該耐熱性グルコキナーゼが
生産されること等を見出し、本発明に到達した。

【０００９】すなわち、本発明の第一は、配列番号１で
表されるアミノ酸配列からなる耐熱性グルコキナーゼを
コードする遺伝子または配列番号１で表されるアミノ酸
配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換また
は付加されたアミノ酸配列からなる耐熱性グルコキナー
ゼをコードする遺伝子を要旨とするものである。また、
本発明の第二は、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ
を有し、かつ耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子
または配列番号２の塩基配列において１または数個の塩
基が欠失、置換または付加された塩基配列からなる耐熱
性グルコキナーゼをコードする遺伝子を要旨とするもの
である。さらに、本発明の第三は、第一または第二の発
明の遺伝子を含有する組換えベクターを要旨とするもの
である。本発明の第四は、第三の発明の組換えベクター
を含む形質転換体を要旨とするものである。本発明の第
五は、第四の形質転換体を培地中で培養し、培養物から
耐熱性グルコキナーゼを採取することを特徴とする耐熱
性グルコキナーゼの製造方法を要旨とするものである。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明に係る耐熱性グルコキナー
ゼは、配列番号１に表したアミノ酸配列を有するタンパ
ク質であり、さらにグルコキナーゼ活性を失わない限
り、該アミノ酸配列における１もしくは複数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有す
るタンパク質も含むものである。本発明の遺伝子は、上
記アミノ酸配列をコードする遺伝子であって、具体的に
は、配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡに代表される
遺伝子であり、場合により、配列番号２の塩基配列にお
ける１もしくは複数の塩基が欠失、置換もしくは付加さ
れた塩基配列からなる遺伝子である。

【００１１】このような遺伝子は、例えば、配列番号２
の一部配列を合成し、この合成ＤＮＡをプローブとして
ＤＮＡライブラリーから単離する方法、配列番号２の両
端部分の合成ＤＮＡをプライマーとし、染色体ＤＮＡを
鋳型とするＰＣＲ法によって目的遺伝子を増幅する方法
等によって取得することもできる。

【００１２】本発明の耐熱性グルコキナーゼ遺伝子の供
与微生物としては、好熱性バチルス属微生物が好まし
く、中でもバチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillu
s stearothermophilus)が好適であり、それらの具体例
としては、UK-563(FERM P-7275)、ACTT-7953 (FERM P-4
775)、ACTT-8005(FERM P-4776)、ACTT-10149(FERM P-47
77)、NCA-1503(FERM P-4778)、SP-43(FERM P-12754)等
が挙げられる。

【００１３】本発明を完成するための上記バチルス属細
菌からの耐熱性グルコキナーゼ遺伝子の単離、この遺伝
子を含有する組換えＤＮＡおよび組換えＤＮＡによる形
質転換体の作成、並びに形質転換体の培養等は、公知の
方法、例えばモレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning）(Sambrook, J., et al.,コールドスプリング
ハーバー出版社, Cold Spring Harbor, 1989)に記載さ
れている方法を組み合わせて行なうことができる。

【００１４】ここで用いられるベクターとしては、市販
のものでは、pUC19, pKK223-3, pPL-λなどが挙げられ
るが、pUC19など多コピーベクター由来のoriとtacプロ
モータを組み合わせて作製したベクターが好ましい。

【００１５】また、用いられる宿主としては、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９, ＴＧ１, ＢＬ２１, Ｎ４８３０−１などが挙
げられ、特にＴＧ１若しくはＢＬ２１が好ましい。

【００１６】上記のようにして取得した形質転換体を用
いて耐熱性グルコキナーゼを製造する方法としては、ま
ず、形質転換体を培養し、集菌した形質転換体の菌体を
超音波、あるいはリゾチーム等で溶菌し遠心分離した
後、遠心上清を市販のイオン交換樹脂、アフィニティー
樹脂等を用いて分取することにより製造できる。

【００１７】なお、グルコキナーゼの活性測定法並びに
活性表示法は以下の通りである。すなわち、活性測定は
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）50mM、アデノシン３リ
ン酸（ＡＴＰ）４mM、塩化マグネシウム２０mM、ＮＡＤ
Ｐ０．９ｍＭ、グルコース１２ｍＭ、グルコース６リン
酸脱水素酵素（ロッシュダイアグノスティック社製）
０．５ユニットを含む溶液1.0mlに酵素液10μlを混合
し、３０℃にて３４０ｎｍにおける吸光度変化の初速度
を測定することにより行った。また、酵素活性の単位は
前述の条件下で１分間に１μmolのＡＴＰが脱リン酸化
されるのに要する酵素量を１ユニットとした。

【００１８】

【実施例】以下、実施例を示して本発明をさらに詳細か
つ具体的に説明する。 実施例１：グルコキナーゼのＮ末端アミノ酸配列の解析 精製グルコキナーゼのＮ末端アミノ酸配列を、エドマン
分解法により決定した。決定されたＮ末端アミノ酸配列
は、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列の内、
１から65で表される。

【００１９】実施例２：ＤＮＡプライマーの作製 実施例１で判明した部分アミノ酸配列をコードするグル
コキナーゼ遺伝子の塩基配列を予想した。この配列を基
に設計されるオリゴヌクレオチドプローブには複数の形
状があるが、本発明では、配列表の配列番号３および４
で表される塩基配列を有するＧＫＤ１およびＧＫＵ１と
命名したオリゴヌクレオチドを、外部機関（アマシャム
ファルマシア社）に合成依託して作成しオリゴヌクレオ
チドプライマーとした。

【００２０】実施例３：バチルス・ステアロサーモフィ
ラス染色体ＤＮＡライブラリーの作製 好熱性バチルス属細菌バチルス・ステアロサーモフィラ
スUK-563(FERM P-7275)の菌体１gを公知の方法(Saito &
Miura, Biochim. Biophys., Acta, vol.72,p619, 196
3)に従いリゾチーム（生化学工業社製）により溶菌後、
ＳＤＳ含有アルカリ性緩衝液とフェノールでＤＮＡを抽
出した。さらに、ＲＮＡをＲＮアーゼで分解して染色体
ＤＮＡを1 mg精製した。

【００２１】得られた染色体ＤＮＡのうち100μgを制限
酵素Sau3AI（東洋紡社製）で部分分解して染色体ＤＮＡ
断片80 μgを得た。それとは別にベクターpUC19 1μg
（宝酒造社製）を制限酵素BamH I(東洋紡社製)で完全分
解し、細菌由来のアルカリファスファターゼ（宝酒造社
製）で処理してベクターＤＮＡ断片0.8μgを得た。得ら
れた染色体ＤＮＡ断片0.28μgとベクターＤＮＡ断片0.1
μgとをT4ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）を用い16℃、30分間連結反応を行い、組換え体ＤＮ
Ａを得た。得られた組換え体を大腸菌JM109コンピテン
トセル200μg（東洋紡社製）に混合し、氷上で１時間静
置した後、42℃、120秒間加温することにより、形質転
換を行なった。

【００２２】得られた形質転換体に1 mlのＬ培地を加え
37℃下で１時間培養後、培養液をアンピシリンを含むＬ
寒天平板培地に塗抹したところアンピシリン耐性菌株が
得られた。これら菌株をアンピシリン50μg/mlを含むＬ
培地に植菌後一晩培養し、集菌後プラスミドをアルカリ
-ＳＤＳ法により調製し、バチルス・ステアロサーモフ
ィラス染色体ＤＮＡライブラリーとした。

【００２３】実施例４：耐熱性グルコキナーゼをコード
する遺伝子の単離 実施例３で得た染色体ＤＮＡライブラリーを鋳型とし
て、グルコキナーゼ遺伝子がＮ末端部、およびＣ末端部
それぞれ増幅されるような２種のプライマーの組み合わ
せ、すなわち実施例２で作成したプライマーＧＫＤ１と
Ｍ１３−２０（宝酒造社製）の組み合わせおよび、実施
例２で作成したプライマーＧＫＵ１とＭ１３−２０（宝
酒造社製）の組み合わせを用い、ＰＣＲ法によりバチル
ス・ステアロサーモフィラスのグルコキナーゼをコード
する遺伝子断片を増幅した。

【００２４】ＰＣＲは以下に示す反応液組成および増幅
条件にて行った。 ＜反応液組成＞Taq DNA ポリメラーゼ（サワディー社
製）５U/１００μl 10倍濃度Taq DNA ポリメラーゼ用バ
ッファー １０μl/１００μl 染色体ＤＮＡ（鋳型ＤＮ
Ａ） 0.01μg/100μl dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各0.2 m
M プライマー 各１μM ＜増幅条件＞ (1) ９４℃、２分間（変性） (2) ９４℃、４５秒間（変性） (3) ５５℃、３０秒間（アニーリング） (4) ７４℃、２分間（反応） （上記(1)〜(4)のサイクルを計３０サイクル実施）

【００２５】それぞれの増幅ＤＮＡ断片と、T-ベクター
ｐT７Ｂｌｕｅを混合し、T4ファージ由来のＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）を用い16℃、30分間連結反応を行
い、組換え体ＤＮＡを得た。得られた組換え体を大腸菌
JM109コンピテントセル200μg（東洋紡社製）に混合
し、氷上で１時間静置した後、42℃、120秒間加温する
ことにより、形質転換を行なった。

【００２６】得られた形質転換体に1 mlのＬ培地を加え
37℃下で１時間培養後、培養液をアンピシリンを含むＬ
寒天平板培地に塗抹したところアンピシリン耐性菌株が
得られた。生育したコロニーの中から白色のものについ
て、アンピシリン50μg/mlを含むＬ培地に植菌後一晩培
養し、集菌後プラスミドをアルカリ-ＳＤＳ法により調
製し、グルコキナーゼ構造遺伝子部分についてジデオキ
シ法により塩基配列を決定した。

【００２７】上記で決定したグルコキナーゼをコードす
る塩基配列を基に、グルコキナーゼをコードする遺伝子
の全長が増幅されるように設計された２種のプライマ
ー、ＧＫＤ２とＧＫＵ２を外部機関（アマシャムファル
マシア社）に合成依託して作成しオリゴヌクレオチドプ
ライマーとした。ＧＫＤ２の配列は、配列表の配列番号
２で表される塩基配列の内、１から２１であり、またＧ
ＫＵ２の配列は、配列表の配列番号２で表される塩基配
列の内、９３２から９５４である。なおプライマーＧＫ
Ｄ２は、増幅断片のＮ端側に制限酵素ＮcｏＩによる切
断部位が創出されるように、５’末端にCCを付加する設
計とした。

【００２８】実施例３で得た染色体ＤＮＡを鋳型とし
て、プライマーＧＫＤ２とＧＫＵ２を用い、ＰＣＲ法に
よりバチルス・ステアロサーモフィラスのグルコキナー
ゼをコードする遺伝子全長を増幅した。

【００２９】ＰＣＲは以下に示す反応液組成および増幅
条件にて行った。 ＜反応液組成＞Taq DNA ポリメラーゼ（サワディー社
製） 5 U/100 μl 10倍濃度Taq DNA ポリメラーゼ用バ
ッファー 10 μl/100μl 染色体ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）
0.01 μg/100μl dATP, dTTP, dGTP, dCTP 各0.2 mM プ
ライマー 各１μM ＜増幅条件＞ (1) ９４℃、２分間（変性） (2) ９４℃、４５秒間（変性） (3) ５５℃、３０秒間（アニーリング） (4) ７４℃、２分間（反応） （上記(1)〜(4)のサイクルを計３０サイクル実施）

【００３０】増幅ＤＮＡ断片と、T-ベクターｐT７Ｂｌ
ｕｅをT4ファージ由来のＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）
を用い１６℃、３０分間連結反応を行い、組換えＤＮＡ
を得た。得られた組換えDNAを大腸菌JM109コンピテント
セル200μg（東洋紡社製）に混合し、氷上で１時間静置
した後、42℃、120秒間加温することにより、形質転換
を行なった。

【００３１】得られた形質転換体に１mlのＬ培地を加え
３７℃下で１時間培養後、培養液をアンピシリンを含む
Ｌ寒天平板培地に塗抹したところアンピシリン耐性菌株
が得られた。生育したコロニーの中から白色のものにつ
いて、アンピシリン５０μg/mlを含むL培地に植菌後一
晩培養し、集菌後プラスミドをアルカリ-ＳＤＳ法によ
り調製し、グルコキナーゼ構造遺伝子部分についてジデ
オキシ法により塩基配列を決定した。この塩基配列を、
配列表の配列番号２に示す。

【００３２】実施例５：発現用プラスミドベクターの作
成 pKK223-3（アマシャムファルマシア社製）を、ＮaｅＩ
（東洋紡社製）および、ＰｖｕＩ（東洋紡社製）認識部
位で切断し、切断した直鎖状プラスミドをアガロースゲ
ル電気泳動で分離し、Tacプロモータを含むＤＮＡ断片
を回収した。一方、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）を、Ｅa
ｅＩ（（宝酒造社製）認識部位で切断し、T4ファージ由
来ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）によって平滑末端
化した後、ＰｖｕＩ（東洋紡社製）認識部位で切断し、
切断した直鎖状プラスミドをアガロースゲル電気泳動で
分離し、ｏｒｉを含むＤＮＡ断片を回収した。

【００３３】上記のTacプロモータを含むＤＮＡ断片0.1
μgとｏｒｉを含むＤＮＡ断片0.1μgを混合し、T4ファ
ージ由来のDNAリガーゼ（宝酒造社製品）を用い16℃、3
0分間連結反応を行い、発現用プラスミドベクターｐＵ
Ｃtacを得た。

【００３４】実施例６：組換えベクターの作製 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列の内、１か
ら２５残基に対応するコドンを大腸菌において出現頻度
の高いものに置き換えた、配列番号５で表される８５ｂ
ｐのDNAを、外部機関（アマシャムファルマシア社）に
依託し合成した。５’末端には、NcoI認識部位を導入す
るため、シトシンを２塩基付加した。このDNA断片、お
よび上記実施例４で得たグルコキナーゼ遺伝子を含むプ
ラスミドを、グルコキナーゼ遺伝子のＮ末端部に位置す
るＮcｏＩ認識部位およびClaI認識部位で切断し、それ
ぞれをアガロースゲル電気泳動で分離し、前者からは、
グルコキナーゼ遺伝子N末端部を、また後者からはC末端
部を含むＤＮＡ断片を回収した。これらのＤＮＡ断片そ
れぞれ0.1μgを混合し、T4ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造社製品）を用い16℃、30分間連結反応を行
い、N末端部２５残基のコドンが大腸菌に至適化された
耐熱性グルコキナーゼ遺伝子を含有する組換えプラスミ
ドｐTVOGKを得た。

【００３５】この組換えプラスミドｐTVOGKを、グルコ
キナーゼ遺伝子のＮ末端部に位置するＮcｏＩ認識部位
で切断して直鎖状とし、T4ファージ由来ＤＮＡポリメラ
ーゼ（宝酒造社製）によって平滑末端化した後、さらに
Ｃ末端下流に位置するHindIII認識部位で切断した。切
断した直鎖状プラスミドをアガロースゲル電気泳動で分
離し、グルコキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収し
た。一方、上記実施例５で得た発現用プラスミドベクタ
ーｐＵＣtacを、ＳＤ配列下流５塩基に位置するEcoRI認
識部位で切断して直鎖状とし、S1ヌクレアーゼ（宝酒造
社製）によって平滑末端化した後、さらにマルチクロー
ニングサイトのＨｉｎｄＩＩＩ認識部位で切断した。切
断した直鎖状プラスミドをアガロースゲル電気泳動で分
離し、Tacプロモータを含むＤＮＡ断片を回収した。こ
れら、グルコキナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片0.1μgと
ベクタープラスミド断片0.1μgを混合し、T4ファージ由
来のＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製品）を用い16℃、30分
間連結反応を行い、耐熱性グルコキナーゼ遺伝子を含有
する組換えベクターｐＵｔＯＧＫｓを得た。

【００３６】これをプラスミドｐＵｔＯＧＫｓとして平
成１２年１１月２９日付けで工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託した（受託番号：FERM P-１８１３
０）。図１はこの組換えベクターｐＵｔＯＧＫｓの作製
概要図である。

【００３７】実施例７：大腸菌での耐熱性グルコキナー
ゼの製造 実施例６で作成したｐＵｔＯＧＫｓを、カルシウム法で
作製した大腸菌TG1コンピテントセル200μgに混合し、
氷上で１時間静置後、42℃、120秒間加温し、形質転換
を行なった。得られた形質転換体に１mlのＬ培地を加え
37℃下で１時間培養後、培養液をアンピシリンを50μg/
ml含むＬ寒天平板に塗抹したところ、耐熱性グルコキナ
ーゼ遺伝子を含む形質転換大腸菌１００個のコロニーを
得、これをTG1／ｐＵｔＯＧＫｓとした。形質転換大腸
菌TG1／ｐＵｔＯＧＫｓをアンピシリン50μg/mlを含む
Ｌ培地300mlに植菌後、37℃にて一晩前培養を行なっ
た。前培養液をアンピシリン50μg/mlを含むＬ培地２０
リットルに植菌し、３７℃にて１０時間培養後イソプロ
ピルβチオガラクトピラノシドを1mM加え、さらに１５
時間培養した後集菌した。得られた菌体には、１００万
ユニットのグルコキナーゼ活性が含まれていた。菌体を
１０００mlの２５mMリン酸緩衝液（pH8.0）に懸濁後、
超音波処理した。菌体破砕物を除いた上澄より、Blue-
セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィ
ーおよびDEAE-セファロースを用いたイオン交換クロマ
トグラフィーにてグルコキナーゼの精製を行なったとこ
ろ、グルコキナーゼを３６万ユニット回収した。これ
は、バチルス・ステアロサーモフィラスUK-５６３(FERM
P-７２７５)を２０リットル培養した場合に得られるグ
ルコキナーゼの５０倍の酵素量である。

【００３８】得られたグルコキナーゼの性質を調べたと
ころ、６０℃、１時間処理後の残存活性は１００%、至
適作用pHはpH8.0、グルコースに対するKmは０．１mMで
あった。これらの結果から、本発明の方法によって得ら
れたグルコキナーゼが、バチルス・ステアロサーモフィ
ラスUK-５６３(FERM P-７２７５)由来のグルコキナーゼ
と同じ性質を有するものであることが確認された。

【００３９】

【発明の効果】本発明によれば、耐熱性グルコキナーゼ
を簡便な方法で大量に、しかも低コストで製造すること
が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における耐熱性グルコキナーゼ遺伝子を
含む組換えベクターの作製概念図である。

【配列表】 <110> UNITIKA LTD. <120> GENE FOR THERMOSTABLE GLUCOKINASE,VECTOR AND TRANSFORMANT THEREOF,AND METHOD FOR PRODUSING THEMOSTABLE GLUCOKINASE THEREWITH <130> 00P00472 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus UK-563 <400> 1 Met Glu Gln Trp Leu Val Gly Ile Asp Leu Gly Gly Thr Thr Thr Lys 1 5 10 15 Met Ala Phe Ile Thr Glu Asp Gly Ile Ile Val His Lys Trp Glu Ile 20 25 30 Pro Thr Asp Thr Ser Asn Arg Gly Glu Arg Ile Val Ala His Ile Ala 35 40 45 Arg Ser Leu Asp Glu Thr Leu Ala Arg Leu Gly Gly Thr Lys Glu Gln 50 55 60 Leu Leu Ala Ile Gly Ile Gly Ala Pro Gly Pro Val Gln Glu Glu Thr 65 70 75 80 Gly Met Leu Tyr Glu Ala Val Asn Leu Gly Trp Lys His Tyr Pro Leu 85 90 95 Lys Arg Gln Leu Glu Glu Glu Thr Gly Leu Pro Val Ala Val Asp Asn 100 105 110 Asp Ala Asn Ile Ala Ala Leu Gly Glu Met Trp Lys Gly Ala Gly Gly 115 120 125 Gly Ala Arg His Leu Leu Phe Val Thr Leu Gly Thr Gly Val Gly Gly 130 135 140 Gly Val Ile Ala Asn Gly Ala Ile Val Arg Gly Thr Asn Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Glu Ile Gly His Met Thr Met Val Ala Asp Gly Gly Ala Pro Cys 165 170 175 Asn Cys Gly Lys Thr Gly Cys Leu Glu Thr Ile Ala Ser Ala Thr Gly 180 185 190 Ile Val Arg Ile Ala Gly Glu Lys Leu Ala Ala Ser Glu Arg Pro Ser 195 200 205 Ala Leu Arg Gly Gly Asp Val Thr Ala Lys Ala Val Phe Asp Ala Ala 210 215 220 Lys Thr Gly Asp Ala Leu Ala Leu Glu Val Val Glu Glu Val Thr Arg 225 230 235 240 Tyr Leu Gly Leu Ala Leu Ala Asn Ala Ala Asn Val Thr Asn Pro Glu 245 250 255 Lys Ile Val Ile Gly Gly Gly Val Ser Lys Ala Gly Ala Leu Leu Val 260 265 270 Glu His Val Ala Ala His Phe Arg Arg Tyr Ala Phe Pro Arg Val Ala 275 280 285 Ala Gly Ala Glu Ile Val Leu Ala Thr Leu Gly Asn Asp Ala Gly Val 290 295 300 Ile Gly Gly Ala Trp Leu Ala Lys Ser Leu Ile Gly Ala 305 310 315 <210> 2 <211> 954 <212> DNA <213> Bacillus stearothermophilus UK-563 <220> <221> CDS <222> (1)..(954) <400> 2 atg gaa cag tgg ttt gtg ggc atc gat ctt ggc ggc acg acg acg aag 48 Met Glu Gln Trp Phe Val Gly Ile Asp Leu Gly Gly Thr Thr Thr Lys 1 5 10 15 atg gcg ttt att aca gaa gac gga att att gta cac aaa tgg gaa att 96 Met Ala Phe Ile Thr Glu Asp Gly Ile Ile Val His Lys Trp Glu Ile 20 25 30 cca aca gac acg tcc aac cgc ggc gaa cgg atc gtc gcc cat atc gcc 144 Pro Thr Asp Thr Ser Asn Arg Gly Glu Arg Ile Val Ala His Ile Ala 35 40 45 cgg tcg ttg gat gaa acg ctc gcc cgg ctt ggc gga acg aaa gaa cag 192 Arg Ser Leu Asp Glu Thr Leu Ala Arg Leu Gly Gly Thr Lys Glu Gln 50 55 60 ctg ctc gcc atc gga atc ggc gcc ccc ggg ccg gtt cag gaa gaa aca 240 Leu Leu Ala Ile Gly Ile Gly Ala Pro Gly Pro Val Gln Glu Glu Thr 65 70 75 80 gga atg ctg tat gaa gcg gtc aat cta gga tgg aaa cac tac ccc tta 288 Gly Met Leu Tyr Glu Ala Val Asn Leu Gly Trp Lys His Tyr Pro Leu 85 90 95 aaa cga cag ctc gaa gaa gag aca ggg ctg ccg gtg gcc gtc gac aat 336 Lys Arg Gln Leu Glu Glu Glu Thr Gly Leu Pro Val Ala Val Asp Asn 100 105 110 gac gcg aat atc gcc gcc ctc ggc gaa atg tgg aaa ggg gcc ggg gga 384 Asp Ala Asn Ile Ala Ala Leu Gly Glu Met Trp Lys Gly Ala Gly Gly 115 120 125 ggg gcg cgc cat ttg ctg ttt gtg acg ctc ggc acc ggc gtt ggc ggc 432 Gly Ala Arg His Leu Leu Phe Val Thr Leu Gly Thr Gly Val Gly Gly 130 135 140 ggc gta atc gcc aac ggg gcc atc gtg cgc ggg acg aac ggc gcc ggt 480 Gly Val Ile Ala Asn Gly Ala Ile Val Arg Gly Thr Asn Gly Ala Gly 145 150 155 160 gga gaa atc ggc cat atg acg atg gtt gca gac ggc ggc gcg ccg tgc 528 Gly Glu Ile Gly His Met Thr Met Val Ala Asp Gly Gly Ala Pro Cys 165 170 175 aac tgc ggc aaa acg ggc tgt ttg gaa acg att gcg tcg gcg acc ggc 576 Asn Cys Gly Lys Thr Gly Cys Leu Glu Thr Ile Ala Ser Ala Thr Gly 180 185 190 att gtg cgg att gcc ggc gaa aag ctg gct gcc agc gag cgt ccg agc 624 Ile Val Arg Ile Ala Gly Glu Lys Leu Ala Ala Ser Glu Arg Pro Ser 195 200 205 gcg ctc cgc ggc ggc gat gtc acc gcc aaa gct gtg ttt gac gcc gcc 672 Ala Leu Arg Gly Gly Asp Val Thr Ala Lys Ala Val Phe Asp Ala Ala 210 215 220 aaa acg ggg gat gcg ctc gcg ctt gag gtt gtt gag gag gtg acg cgc 720 Lys Thr Gly Asp Ala Leu Ala Leu Glu Val Val Glu Glu Val Thr Arg 225 230 235 240 tat ctc ggt ttg gcg ttg gcg aat gcg gct aat gtg acc aat ccg gag 768 Tyr Leu Gly Leu Ala Leu Ala Asn Ala Ala Asn Val Thr Asn Pro Glu 245 250 255 aaa att gtg atc ggc ggc ggt gtc tcg aag gcg ggg gca ctg ctc gtt 816 Lys Ile Val Ile Gly Gly Gly Val Ser Lys Ala Gly Ala Leu Leu Val 260 265 270 gag cat gtc gcc gcc cat ttc cgc cgc tat gct ttt ccg cgt gtc gcc 864 Glu His Val Ala Ala His Phe Arg Arg Tyr Ala Phe Pro Arg Val Ala 275 280 285 gcc gga gcg gag atc gtg ctg gca acg ctc ggc aat gac gcc gga gtc 912 Ala Gly Ala Glu Ile Val Leu Ala Thr Leu Gly Asn Asp Ala Gly Val 290 295 300 atc ggc ggc gcc tgg ttg gcg aaa tcg ctc atc ggc gcc taa 954 Ile Gly Gly Ala Trp Leu Ala Lys Ser Leu Ile Gly Ala 305 310 315 <210> 3 <211> 317 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus UK-563 <400> 3 Met Glu Gln Trp Phe Val Gly Ile Asp Leu Gly Gly Thr Thr Thr Lys 1 5 10 15 Met Ala Phe Ile Thr Glu Asp Gly Ile Ile Val His Lys Trp Glu Ile 20 25 30 Pro Thr Asp Thr Ser Asn Arg Gly Glu Arg Ile Val Ala His Ile Ala 35 40 45 Arg Ser Leu Asp Glu Thr Leu Ala Arg Leu Gly Gly Thr Lys Glu Gln 50 55 60 Leu Leu Ala Ile Gly Ile Gly Ala Pro Gly Pro Val Gln Glu Glu Thr 65 70 75 80 Gly Met Leu Tyr Glu Ala Val Asn Leu Gly Trp Lys His Tyr Pro Leu 85 90 95 Lys Arg Gln Leu Glu Glu Glu Thr Gly Leu Pro Val Ala Val Asp Asn 100 105 110 Asp Ala Asn Ile Ala Ala Leu Gly Glu Met Trp Lys Gly Ala Gly Gly 115 120 125 Gly Ala Arg His Leu Leu Phe Val Thr Leu Gly Thr Gly Val Gly Gly 130 135 140 Gly Val Ile Ala Asn Gly Ala Ile Val Arg Gly Thr Asn Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Glu Ile Gly His Met Thr Met Val Ala Asp Gly Gly Ala Pro Cys 165 170 175 Asn Cys Gly Lys Thr Gly Cys Leu Glu Thr Ile Ala Ser Ala Thr Gly 180 185 190 Ile Val Arg Ile Ala Gly Glu Lys Leu Ala Ala Ser Glu Arg Pro Ser 195 200 205 Ala Leu Arg Gly Gly Asp Val Thr Ala Lys Ala Val Phe Asp Ala Ala 210 215 220 Lys Thr Gly Asp Ala Leu Ala Leu Glu Val Val Glu Glu Val Thr Arg 225 230 235 240 Tyr Leu Gly Leu Ala Leu Ala Asn Ala Ala Asn Val Thr Asn Pro Glu 245 250 255 Lys Ile Val Ile Gly Gly Gly Val Ser Lys Ala Gly Ala Leu Leu Val 260 265 270 Glu His Val Ala Ala His Phe Arg Arg Tyr Ala Phe Pro Arg Val Ala 275 280 285 Ala Gly Ala Glu Ile Val Leu Ala Thr Leu Gly Asn Asp Ala Gly Val 290 295 300 Ile Gly Gly Ala Trp Leu Ala Lys Ser Leu Ile Gly Ala 305 310 315 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthesized DNA <400> 4 atggarcart ggmtngtngg nat 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthesized DNA <400> 5 gtrtcngtng gdatytccca ytt 23 <210> 6 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthesized DNA <400> 6 ccatggaaca gtggctggtt ggcatcgacc tgggcggcac caccaccaaa atggcgttca 60 tcaccgaaga cggcatcatt gtaca 85

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列から
   なる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 配列番号１で表されるアミノ酸配列にお
   いて１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ
   れたアミノ酸配列からなる耐熱性グルコキナーゼをコー
   ドする遺伝子。
3. 【請求項３】 配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡを
   有し、かつ耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 配列番号２の塩基配列において１または
   数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列から
   なる耐熱性グルコキナーゼをコードする遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項１ないし請求項４のいずれかに記
   載の遺伝子を含有する組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の組換えベクターを含む
   形質転換体。
7. 【請求項７】 請求項６記載の形質転換体を培地中で培
   養し、培養物から耐熱性グルコキナーゼを採取すること
   を特徴とする耐熱性グルコキナーゼの製造方法。