JP2002193982A - ホスファチジルセリンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ホスファチジルセリンの精製方法を提供する。 【解決手段】ホスファチジルセリンは、酵素Ｄ−ホスホ
リパーゼの存在下に、セリンを用いてホスファチジルコ
リンをホスファチジル基転移させて製造され、不純物と
して親水性化合物、蛋白質および無機塩を含有する。水
と極性有機溶媒の混合物で該ホスファチジルセリンを含
む、炭化水素溶媒の溶液から該ホスファチジルセリンを
抽出する。該極性有機溶媒としてイソプロパノールが好
まれ、該炭化水素溶媒としてトルエン、キシレン、ｎ−
ヘプタン、ｎ−ヘキサンまたはシクロヘキサンの中から
選ばれる溶媒が使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホスファチジルセ
リンの精製方法に関する。ホスファチジルセリンはリン
脂質であり、そのリン脂質は特に、各種の特性を有する
退縮性脳症候群の治療に使用されるが、特殊なリポソー
ム処方および天然のレシチンを基にした規定食組成物の
製造にも使用される、医薬組成物の製造に用いられる。

【０００２】

【従来の技術】ホスファチジルセリンは天然に広く存在
するリン脂質である。それは、動物性生体中の細胞膜の
主成分の一つであり、特に哺乳動物の脳組織中に多量に
存在する。医学文献にはホスファチジルセリンの、興味
ある特性が述べられている。とりわけ、最も重要な医学
文献は、記憶力を改善するのにホスファチジルセリンが
有効であることを述べている。

【０００３】以下の図式に従って、酵素Ｄ−ホスホリパ
ーゼの存在下に、ホスファチジルコリンをセリンでホス
ファチジル基転移せしめることは、ホスファチジルセリ
ンの工業生産にとって最も簡便な反応である。

【化２】

【０００４】この反応は、ＥＰ １ ０４８ ７３８号
公報に記載されているように、水性環境においても、ま
た、水相ではなく、水と混合しない有機溶媒、好ましく
はトルエン、を含有する系においても行うことができ
る。この２番目の方法はＵＳＰ５，７００，６６８号公
報に記載されている。

【０００５】用いられるホスファチジル基転移がどのよ
うな方法であれ、その方法の最終段階で分離されるホス
ファチジルセリンには、いずれにしても、多量の親水性
不純物、例えば、その水相中に存在するセリン、コリン
およびそれらの塩が含まれる。

【０００６】注目すべき他の特質は、関連文献（Biotec
hn. Techn., 7, 795(1993)）に記載された方法に従っ
て、Ｄ−ホスホリパーゼタイプの生成物の酵素活性を測
定することにより、１グラムの生成物は、どれをとって
も、酵素活性として約２国際単位を有することが判明し
たということである。

【０００７】厳格な純度基準に対する一般的な要請に従
って、その生成物から前記不純物を除去することは大い
に重要である。

【０００８】リン脂質の有機溶液から親水性物質を除去
するために汎用される方法は、効果がないことが証明さ
れた。実際は、ＵＳＰ５，７００，６６８号公報に記載
されているように、得られたリン脂質混合物のトルエン
溶液を同量の水で抽出し、次にその相を分離することに
より、有機相内のセリン含量とＤ−ホスホリパーゼの活
性は、水で抽出する前に発見された数値と比べて、事実
上変化がないことが判明している。

【０００９】同様に、トルエンで調整した、クロマトグ
ラフィーシリカを含有するクロマトグラフィーカラム上
で同様な有機溶液を溶離する。そこではトルエンを用い
て生成物の溶離が行われ、結果としてセリンが僅かに除
去され、そのリン脂質から酵素活性が僅かに除かれる。

【００１０】もう一つの実験では、セリンゆえに精製す
べきホスファチジルセリンの有機溶液にアセトンを添加
する。分析してみると、その沈殿生成物は、出発生成物
と比べて、セリン／ホスファチジルセリンの比が実質的
に変わらない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】それゆえに、本発明
は、酵素Ｄ−ホスホリパーゼの存在下にホスファチジル
コリンをセリンでホスファチジル基転移して得られ、ま
た、不純物として親水性化合物、蛋白質および無機塩を
含有する、ホスファチジルセリンの有効な精製方法を提
供することを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】いまや本出願人は、驚く
べきことに、極性有機溶媒を系に添加すれば、水抽出に
より、有機溶媒中のホスファチジルセリン溶液から親水
性不純物、蛋白質および無機塩がうまく除去できるとい
うことを見出した。

【００１３】従って本発明の目的は、 式（１）

【化３】 を有するホスファチジルセリンの精製方法であって、式
（１）において、Ｒ₁とＲ₂は同一であるかまたは異な
り、かつ、Ｃ₁₀−Ｃ₃₀のアシル基であり；ＸはＯＨまた
はＯＭであり、そこにおいてＭはアルカリ金属、アルカ
リ土類金属、アンモニウムおよびアルキルアンモニウム
より成る群から選ばれ、また、そのセリン部はＤ体、Ｌ
体またはラセミ体であって、好ましくはＬ体であり、水
と極性有機溶媒の混合物で炭化水素溶媒の溶液から前記
ホスファチジルセリンを抽出することから成る前記方法
である。

【００１４】

【発明の実施の形態】ＵＳＰ５，７００，６６８号公報
に含まれる記述に従って、水相とトルエン相から構成さ
れる２相系において、ホスファチジル基転移により製造
されるホスファチジルセリンの特殊な場合には、本発明
に従った方法は、反応の最終段階で水相からトルエン相
を分離した後で、そのトルエン相に対して直接的に行う
ことができる。

【００１５】他の方法に従って製造したホスファチジル
セリンの場合には、炭化水素溶媒、水および極性有機溶
媒を含有する混合物中でその生成物を攪拌することによ
り、その精製方法を有利に実施することができる。

【００１６】この場合にも、親水性不純物はその水相中
に見出されるはずであるが、興味あるリン脂質はその炭
化水素相中に存在する。

【００１７】相分離に続いて、アセトンを用いた沈降な
どのような公知の方法を用いてホスファチジルセリン相
を分離することができる。

【００１８】本方法に従って芳香族溶媒または脂肪族溶
媒を炭化水素溶媒として使用することができる。芳香族
溶媒の中でもトルエンまたはキシレンが好ましい。脂肪
族溶媒の中ではｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサンまたはシク
ロヘキサンが好ましい。

【００１９】極性有機溶媒としてアルコール溶媒を使用
することができ、そのものには１−５個の炭素原子が含
まれる。本発明の好ましい態様に従って、前記アルコー
ル溶媒は第２級アルコールおよび第３級アルコールの中
から選ばれる。より好ましくはイソプロパノールが使用
される。

【００２０】本発明に従った抽出は０−７０℃の範囲の
温度で、好ましくは２０−３０℃の範囲の温度で行うこ
とができる。

【００２１】炭化水素溶媒の量は、精製すべきリン脂質
１ｋｇに対して、４−３０リットルの範囲、好ましくは
６−１２リットルの範囲である。

【００２２】水と炭化水素溶媒の容積比は、０．２−５
の範囲、好ましくは０．３−１の範囲である。極性有機
溶媒と炭化水素溶媒の容積比は、０．２−２の範囲、好
ましくは０．３−１．２の範囲である。

【００２３】非環式鎖を変えて前記した方法をホスファ
チジルセリンに適用することができる。また、その方法
により、大豆、西洋アブラナまたは卵黄などの天然物に
由来するホスファチジルコリン、およびミリスチン酸、
パルミチン酸またはステアリンサンなどの飽和酸、およ
びオレイン酸またはリノール酸などの不飽和酸などの脂
肪酸で合成したホスファチジルコリンをホスファチジル
基転移して取り出した生成物を精製することができる。

【００２４】

【実施例】以下の実施例は、本発明の目的を限定するこ
となく、完全に本発明を開示するものである。

【００２５】実施例１ ２相系におけるホスファチジルコリンの製造 ホスファチジルコリン３２％とトリグリセライド５０％
を含有する、大豆レシチンの非脱油(de-oiled)フラクシ
ョン４００ｇを、３リットルのトルエンと共にフラスコ
に入れる。活性が３ＫＵ／ＩであるＤ−ホスホリパーゼ
の溶液１．３リットル中に、塩化カルシウム２２．７
ｇ、三水酸基化された酢酸ナトリウム(trihydrated sod
ium acetate)２７．６ｇおよびＬ−セリン６２．５ｇが
含まれる溶液を別途調製する。その溶液を酢酸でｐＨ
４．２とする。前記２つの溶液を合わせて、攪拌条件下
に２５℃で８時間保持する。濾過に続いてその相を分離
し、そのトルエン相の１／１０を真空条件下に濃縮する
（残りの部分は実施例２、３、４、５に記載される実験
に使用する）。その残渣を室温でアセトン５００ｍｌに
添加する。その生成物を濾過し、乾燥する。このように
してリン脂質と含量が５０％であるホスファチジルセリ
ンの混合物２７ｇが得られる。

【００２６】ＴＬＣ分析（溶出液：クロロホルム、メタ
ノール、水およびアンモニアの２８％水溶液の混合物
３００：１００：１０：１２； 検出器：ニンヒドリン
(ninhydrin)）によれば、最終生成物中に１．５％のＬ
−セリンが存在する。

【００２７】Ｄ−ホスホリパーゼが生成物中に存在する
ことは、関連文献(Biotechn. Techn.,7, 795 (1993))に
記載された方法で確認される。２．１ＩＵ／ｇの活性が
見られる。

【００２８】実施例２ イソプロパノールと水を用いた抽出によるホスファチジ
ルセリンの精製 実施例１において記載されるように調製されたトルエン
溶液３３０ｍｌを使用する。この溶液をイソプロパノー
ル２４０ｍｌや水１５０ｍｌと共に添加する。全体を室
温で攪拌して放置する。次にその相を分離する。そのト
ルエン相を濃縮し、その残渣をアセトン５００ｍｌ中へ
攪拌条件下に添加する。

【００２９】その生成物は、Ｌ−セリンの含量が０．３
％である。Ｄ−ホスホリパーゼは、その方法で使用され
る検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。

【００３０】実施例３ イソプロパノールと水の比率を変えた抽出によるホスフ
ァチジルセリンの精製 実施例１において記載されるように調製されたトルエン
溶液３３０ｍｌを使用する。この溶液をイソプロパノー
ル１５０ｍｌや水２４０ｍｌと共に添加する。全体を室
温で攪拌して放置する。次にその相を分離する。そのト
ルエン相を濃縮し、その残渣をアセトン５００ｍｌ中へ
攪拌条件下に添加する。

【００３１】その生成物は、Ｌ−セリンの含量が０．２
％である。Ｄ−ホスホリパーゼは、その方法で使用され
る検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。

【００３２】実施例４ イソプロパノールと水を用いた抽出によるホスファチジ
ルセリンの精製 実施例１において記載されるように調製されたトルエン
溶液３３０ｍｌを使用する。この溶液をエタノール１５
０ｍｌや水１５０ｍｌと共に添加する。全体を室温で攪
拌して放置する。次にその相を分離する。そのトルエン
相を濃縮し、その残渣をアセトン５００ｍｌ中へ攪拌条
件下に添加する。その生成物は、Ｌ−セリンの含量が
０．２％である。Ｄ−ホスホリパーゼは、その方法で使
用される検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。

【００３３】実施例５ 水／ｎ−ヘプタンの２相系におけるホスファチジルセリ
ンの調製とイソプロパノールと水を用いた精製 実施例１において原料として用いられる、大豆レシチン
と同じタイプのもの４０ｇを、ｎ−ヘプタン３００ｍｌ
と共にフラスコに装入する。活性が３ＫＵ／Ｉである、
Ｄ−ホスホリパーゼの溶液０．１３リットル中に、塩化
カルシウム２．３ｇ、三水酸基化された酢酸ナトリウム
(trihydrated sodium acetate)２．８ｇおよびＬ−セリ
ン６．３ｇが含まれる溶液を別途調製する。その溶液を
酢酸でｐＨ４．２とする。その２つの溶液を合わせて、
攪拌条件下に２５℃で２４時間保持する。濾過に続いて
その相を分離し、そのヘプタン相を１５０ｍｌのアセト
ンおよび１５０ｍｌの水を添加する。攪拌と沈降の後
で、その相を分離する。そのヘプタン相を低圧で濃縮す
る。その残渣を室温でアセトン５００ｍｌと共に添加す
る。その生成物を濾過し、乾燥する。このようにしてリ
ン脂質と含量が４８％であるホスファチジルセリンの混
合物２６．５ｇが得られる。

【００３４】その生成物は、Ｌ−セリンの含量が０．２
％である。Ｄ−ホスホリパーゼは、その方法で使用され
る検出限界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。

【００３５】実施例６ 有機溶媒の不存在下におけるホスファチジル基転移によ
りホスファチジルセリンの製造 エチルアルコールで抽出して得たリン脂質と大豆レシチ
ン（その主成分はホスファチジルコリン（６５％）であ
る。）の混合物４０ｇを、水８００ｍｌ中に塩化カルシ
ウム６０ｇを溶解させて調製した溶液と共に分離漏斗に
装入する。その混合物は攪拌条件下に２５℃で１時間保
持される。４時間後、少なくとも(at rest)７００ｍｌ
の水相を底部の栓から抜き出す。ｐＨ４．５の０．１Ｍ
酢酸塩緩衝液１３０ｍｌ中にＬ−セリン６４ｇを含有す
る溶液を別途調製する。この溶液を、親液性化形態で
１．０ＩＵ／ｍｇの活性を有するＤ−ホスホリパーゼ３
００ｍｇと共に添加する。得られた溶液を、予め調製し
たリン脂質の水溶分散剤に添加する。その混合物を攪拌
条件下に４５℃で３時間保持する。その反応生成物を濾
過分離する。水洗後そのものの重さは６０ｇである。

【００３６】部分標本を乾燥してセリンとＤ−ホスホリ
パーゼを定量測定する。測定結果は、セリンの含量が７
重量％であり、Ｄ−ホスホリパーゼの活性が２ＩＵ／ｇ
である。

【００３７】実施例７ 実施例６で得られたホスファチジルセリンの精製 実施例６で記載するようにして得られた、湿った生成物
の部分標本５ｇを、水、炭化水素溶媒（溶媒１）および
アルコール溶媒（溶媒２）を含有する溶媒混合物中に溶
解させて精製試験を行った。

【００３８】全試験において、攪拌および沈降の後で
は、ホスファチジルセリンは炭化水素相の中にのみ存在
する。その炭化水素相を濃縮してアセトンから沈殿させ
る。乾燥した生成物を分析して、セリンの含量およびＤ
−ホスホリパーゼの活性を測定する。後続する表１に
は、ホスファチジルセリンの精製条件および最終生成物
中に存在するセリンとＤ−ホスホリパーゼの量が示され
る。

【００３９】

【表１】

【００４０】実施例８ ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）の製造
および精製 ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）４０ｇ
をトルエン０．３リットルと共にフラスコに装入する。
３ＫＵ／Ｉの活性を有するＤ−ホスホリパーゼの溶液
０．１３リットル中に、塩化カルシウム２．３ｇ、三水
酸基化された酢酸ナトリウム２．８ｇおよびＬ−セリン
６．３ｇを含有する溶液を別途調製する。この溶液を酢
酸でｐＨ４．２とする。この２つの溶液を合わせて、攪
拌条件下に２５℃で８時間保持する。次に相分離を行
い、上部の相を、イソプロパノール２４０ｍｌと水１５
０ｍｌと共に添加する。全体を室温で攪拌して放置す
る。次にその相を分離する。そのトルエン相を濃縮し
て、攪拌条件下にその残渣をアセトン５００ｍｌに添加
する。その固形物を濾別し、真空条件下に乾燥させ、カ
ルシウム塩としてＤＯＰＳ３０ｇを得る。

【００４１】その生成物にはＬ−セリンが０．２％含ま
れる。Ｄ−ホスホリパーゼは、本方法で採用する検出限
界値（０．１ＩＵ／ｇ）より少ない。

【発明の効果】本発明に従って極性有機溶媒を系に添加
すれば、水抽出により、有機溶媒中のホスファチジルセ
リン溶液から親水性不純物、蛋白質および無機塩がうま
く除去できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピエトロ マッサルド イタリア国、00154 ローマ、ヴィア オ ドアルド ベッカリ、24 Ｆターム(参考） 4B064 AE63 CA21 CD06 CD13 DA01 DA10 4H050 AA02 AD16 BB11 BB14 BB31 BB42 BC33 BC35 BC51

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（１） 【化１】 を有するホスファチジルセリンの精製方法であって、 式（１）において、Ｒ₁とＲ₂は同一であるかまたは異な
   り、かつ、Ｃ₁₀−Ｃ₃₀のアシル基であり；ＸはＯＨまた
   はＯＭであり、そこにおいてＭはアルカリ金属、アルカ
   リ土類金属、アンモニウムおよびアルキルアンモニウム
   より成る群から選ばれ、また、そのセリン部はＤ体、Ｌ
   体またはラセミ体であって、好ましくはＬ体であり、 水と極性有機溶媒の混合物で炭化水素溶媒の溶液から前
   記ホスファチジルセリンを抽出することから成る前記方
   法。
2. 【請求項２】 前記炭化水素溶媒がトルエン、キシレ
   ン、ｎ−ヘプタン、ｎ−ヘキサンまたはシクロヘキサン
   の中から選ばれる請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記炭化水素溶媒が、精製されるホスフ
   ァチジルセリン１ｋｇ当たり、４−３０リットルの範囲
   で使用される請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記炭化水素溶媒が、精製されるホスフ
   ァチジルセリン１ｋｇ当たり、６−１２リットルの範囲
   で使用される請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記極性有機溶媒がアルコール溶媒であ
   る請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記アルコール溶媒が１−５個の炭素原
   子を含有するアルコールの中から選択される請求項５に
   記載の方法。
7. 【請求項７】 前記アルコール溶媒が第２級アルコール
   および第３級アルコールの中から選択される請求項５に
   記載の方法。
8. 【請求項８】 前記アルコール溶媒がイソプロパノール
   である請求項５に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記極性有機溶媒が、使用される炭化水
   素溶媒１ｋｇ当たり、０．２−２リットルの範囲で使用
   される請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記極性有機溶媒が、使用される炭化
    水素溶媒１ｋｇ当たり、０．３−１．２リットルの範囲
    で使用される請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 使用される水の量が、使用される炭化
    水素溶媒１ｋｇ当たり、０．２−５リットルの範囲であ
    る請求項１に記載の方法。
12. 【請求項１２】 使用される水の量が、使用される炭化
    水素溶媒１ｋｇ当たり、０．３−１リットルの範囲であ
    る請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記抽出が０−７０℃の範囲の温度で
    行われる請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記抽出が２０−３０℃の範囲の温度
    で行われる請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 式（１）を有する前記ホスファチジル
    セリンが、天然物または合成物に由来するホスファチジ
    ルコリンをホスファチジル基転移により製造される請求
    項１に記載の方法。