JP2002171973A

JP2002171973A - Ｄｎａメチル化パターンによる細胞の同定法

Info

Publication number: JP2002171973A
Application number: JP2000372954A
Authority: JP
Inventors: Kunio Shioda; 邦郎塩田; Satoshi Tanaka; 智田中; Jun Okane; 潤大鐘; Ataru Hattori; 中服部
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 2000-12-07
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2002-06-18
Also published as: US20020072059A1; EP1213360A1

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞等の同定方法の提供。【解決手段】被検細胞、組織又は核から単離されたDN
Aのメチル化パターンの情報を解析して細胞を同定する
ことを特徴とする細胞、組織又は核の同定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、DNAメチル化パタ
ーンによる細胞、組織又は核の同定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞の種類を同定する場合、形態的な特
徴、及び特定のタンパク質又は糖鎖などの細胞内で作ら
れる数種類の分子が、その指標として用いられてきた。
例えば、軸索上に伸びた形態を有する細胞、及び神経線
維タンパク質が発現している細胞は、神経であると判断
することができる。このように、従来は、正常個体から
得られた組織・細胞試料を解析する場合は、形態や数種
類の分子を調べるという伝統的な手段により行われてい
る。

【０００３】しかし、例えば培養下で、胚性幹細胞から
誘導して神経細胞又は他の移植用細胞を作製することに
なると、移植後に期待した細胞の機能が発現しない可能
性、あるいは増殖の制御をすることができない細胞にな
る可能性も考えられる。しかも、細胞の形態は様々な培
養条件下では大きく変化することもある。従って、従来
の伝統的な細胞同定法以外に精度の高い細胞同定方法の
確立が望まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、DNAのメチ
ル化パターンを利用した細胞、組織又は核の同定法を提
供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、DNAのメチル化パ
ターンが細胞の種類により異なる点に着目し、当該メチ
ル化パターンの情報を解析することにより、細胞、組織
又は核を同定し得ることを見出し、本発明を完成するに
至った。すなわち、本発明は、被検細胞、組織又は核か
ら単離されたDNAのメチル化パターンの情報を解析し
て、細胞、組織又は核を同定することを特徴とする細
胞、組織又は核の同定方法である。

【０００６】さらに、本発明は、被検細胞、組織又は核
から単離されたDNAのメチル化パターンの情報を、目的
の細胞、組織又は核を作製するための指標として使用す
る方法である。さらに、本発明は、被検細胞、組織又は
核から単離されたDNAのメチル化パターンの情報を指標
として、目的の細胞、組織又は核を作製するために不可
欠な遺伝子領域を特定する方法である。

【０００７】さらに、本発明は、被検細胞、組織又は核
から単離されたDNAのメチル化パターンの情報を解析す
る手段と、得られる解析結果を指標として細胞、組織又
は核を同定する手段とを含んでなる、コンピュータを細
胞、組織又は核の同定システムとして機能させるための
プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録
媒体である。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００８】

【発明の実施の形態】ヒトを含む哺乳類では、発生の過
程でいったん分化した細胞は、細胞分裂後も親細胞と同
じ性質を受け継ぎ、その性質は、通常、個体の生涯を通
じて保たれる。ゲノムDNAは細胞の種類に関わり無く、
すべて同じセットの遺伝情報を有しているが、発現され
る遺伝子のセットは細胞の種類により限定されている。
本発明者は、細胞の種類に応じて特有のゲノムDNAのメ
チル化パターンが存在することを見出した。ゲノムDNA
のメチル化は遺伝子のサイレント化と関連しているの
で、細胞・組織特異的なDNAメチル化パターンは、細胞
の種類に固有の遺伝子発現記憶の機構として機能してい
ることとなる。

【０００９】本発明の方法は、細胞、組織又は核（以下
「細胞等」ともいう）の種類により、ゲノムDNAに現れ
るメチル化のパターンが異なることを利用して、そのパ
ターン情報を解析することを特徴とする。「解析する」
とは、(1) DNAのどの部分のメチル化及び/又は非メチル
化がその細胞等に特異的であるかを同定すること、(2)
特異的部位のメチル化の有無を検出してその細胞等の種
類を同定することのいずれか一方又は両方を意味する。
例えば、図１に示すように、細胞A、B及びCの３種類の
細胞が存在し、ゲノムDNAのある特定の領域に８種類の
遺伝子が存在していると仮定する。この領域におけるメ
チル化を調べた結果、細胞Aについては遺伝子１、２、
５及び８がメチル化されており、細胞Bについては遺伝
子１、４、５及び８がメチル化されており、細胞Cにつ
いては遺伝子１、３、６及び８がメチル化されているこ
とが分かったとする。なお、「遺伝子X（Xは遺伝子名又
は任意の番号若しくは記号を表す。）がメチル化され
る」とは、遺伝子Xのある特定の領域に存在する5'-CG-
3'配列（以下「CpG配列」という）において、シトシン
の5位の炭素がメチル化されることを意味する。これら
のメチル化パターンを比較すると、遺伝子１、７及び８
は、メチル化のパターン（CpG配列のメチル化の有無）
がいずれの細胞においても共通しており、3者を区別す
ることはできない。しかし、細胞A〜Cの範囲内では、遺
伝子2のメチル化は細胞Aに特異的であり、遺伝子３及び
６のメチル化は細胞Cに特異的であり、遺伝子４のメチ
ル化は細胞Bに特異的であることがわかる。従って、細
胞A〜Cの範囲において、遺伝子２がメチル化されている
という情報を持つ細胞は、「細胞A」であると同定する
ことができる。さらに、遺伝子1〜8のメチル化・非メチ
ル化パターンの組み合わせ情報をあわせることでより確
実な同定が可能になる。このようにして、遺伝子のメチ
ル化は細胞により異なることを利用してメチル化情報を
解析することにより、所定の細胞を同定することができ
る。

【００１０】また、「メチル化パターンの情報」とは、
DNA上のどの配列がメチル化されているかという情報で
あり、DNAのメチル化パターンを検出することによりそ
の情報を入手することができる。この場合、DNA上の配
列の識別記号又は識別番号（例えば、図１において遺伝
子１〜８の番号）は、遺伝子がゲノム上に位置する順に
付与してもよく、特定の規則性を有する限り（対比する
遺伝子同士の記号又は番号が一致する限り）、ゲノム上
の位置とは全く無関係に付与してもよい。

【００１１】本発明の方法の対象となるDNAは、例えば
動物由来の細胞等から得られるゲノムDNAを好ましく用
いることができる。なお、組織には、各種臓器を含む。
例えば脳、脊髄などの神経系組織、食道、胃、小腸、大
腸などの消化器、肺、気管支などの呼吸器、精巣、卵
巣、子宮、胎盤などの生殖器、腎臓、膀胱などの泌尿
器、骨髄、血液などの造血器等が挙げられる。また、細
胞としては、例えば胚性幹細胞、栄養膜幹細胞、骨髄幹
細胞、神経幹細胞等が挙げられ、上記組織からタンパク
質分解酵素等で処理して得た細胞、及び培養細胞のいず
れをも含む。さらに、核は、上記細胞抽出液を遠心処理
し、核分画とその他の分画とを分離することにより得る
ことができる。

【００１２】動物由来のゲノムDNAとしては、例えばヒ
ト、サル、イヌ、マウス、ラット、ウシ由来のものが挙
げられる。ゲノムDNAの調製は、公知の任意の方法によ
り行うことができる（Okazaki, Y.et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1995))。例えば、組織サンプルを破
砕した後、適当な細胞溶解液（タンパク質分解酵素を含
む）に溶解する。得られる溶解液を例えばフェノール/
クロロホルム/イソアミルアルコールによる抽出処理に
かけてエタノール中にゲノムDNAを沈殿させる。

【００１３】上記の通り得られたDNAからメチル化を検
出するための方法は特に限定されるものではなく、任意
の手法を採用することができる。例えば、RLGS法、MS-P
CR法、サザンブロッティング法、CpGアイランドマイク
ロアレイ法などにより、メチル化パターンを作製するこ
とができる。但し、本発明においては、上記方法に限定
されるものではなく、メチル化情報を得るための手法で
あればどのような手法でもよい。以下、RLGS法、MS-PCR
法、サザンブロッティング法、CpGアイランドマイクロ
アレイ法を例に説明する。

【００１４】(1) RLGS法 RLGS法（Restriction Landmark Genomic Scanning法）
とは、制限酵素の認識部位を目印（ランドマーク）とし
て用い、このランドマークをシグナルとして検出する手
法を意味し、広く知られた方法である。すなわち、種々
の細胞又は組織からDNAを抽出し、メチル化感受性制限
酵素で切断してDNA断片を作製し、標識物質（例えば
³²P）で末端を標識し、1次元電気泳動でDNA断片を分離
する。さらに電気泳動後のDNA断片をメチル化感受性制
限酵素とは異なる他の制限酵素で消化し、2次元目の電
気泳動にかけ、オートラジオグラフィー等によりスポッ
トを解析する。そして、細胞や組織特有のスポットのパ
ターンのデータベースを作成する。さらに、同定を目的
とする細胞や、比較対照の細胞の上記スポットパターン
を作成し、そのパターンを比較することで目的の細胞を
同定する。本発明では、メチル化感受性を持った制限酵
素を用いることで、ゲノムの数千箇所に渡る領域のメチ
ル化状況を一度に解析することができる。

【００１５】まず、抽出したゲノムDNAを第１の制限酵
素であるメチル化感受性酵素で切断する（図２(1)、
(2)）。メチル化感受性酵素とは、図２(1)において
「A」の位置を切断する酵素（制限酵素Aとする）であ
る。そして、CGというジヌクレオチドのうちシトシンの
5位がメチル化（修飾）されている場合は、メチル化の
影響を受けてその部位を切断できなくなる酵素を意味す
る。

【００１６】制限酵素Aとしては、切断したときに生じ
る平均断片長が100kbを超える程度のもの、すなわち平
均100kbを超える間隔でしか存在しない制限酵素部位を
認識する制限酵素であって6〜8塩基認識のものが好まし
い。制限酵素Aとしては、例えばNotI、BssHII、SalI等
が挙げられる。

【００１７】上記制限酵素Aによる切断部位を、標識ヌ
クレオチドを導入することにより標識する（図２
(3)）。標識物質としては、[α-³²P]dCTP、[α-³²P]dGT
P等の放射性同位体、テトラメチル-ローダミン-6-dUT
P、フルオレセイン-12-dUTP等の蛍光色素等が挙げら
れ、任意に選択することができる。標識ヌクレオチドの
導入は、市販のキット（例えばNew England Biolab社の
Sequenase ver. 2）を用いることができる。

【００１８】制限酵素Aによる切断断片をさらに短い断
片にするため、制限酵素Aとは種類を異にする第2の制限
酵素処理を行う（図２(4))。第2の制限酵素は、切断し
たときに生じる平均断片長が数〜数十kbもの、すなわち
平均数〜数十kbの間隔で存在する制限酵素部位を認識す
る制限酵素であって4〜6塩基認識ものである（図２にお
いてBの位置を切断する酵素であり、制限酵素Bとす
る。）。制限酵素Bとしては、例えばPvuII、Eco RV等が
挙げられる。制限酵素Bによる処理を施したのち、一次
元分画を行う（図２(5)）。

【００１９】分画終了後、前記制限酵素A及び制限酵素B
とは種類を異にする第3の制限酵素溶液にチューブを浸
して、一次分画産物について制限酵素処理を行う。第3
の制限酵素は、制限酵素A及びBよりも切断頻度の高い酵
素であって、切断したときに生じる平均断片長が数百bp
程度の間隔で存在する制限酵素部位を認識するものであ
る（図２において「C」の位置を切断する酵素であり、
制限酵素Cとする。）。制限酵素Cには4〜6塩基認識もの
を用いることができ、例えばPstI、HinfI、MboI等が挙
げられる。

【００２０】制限酵素Cで断片を処理すると、制限酵素
認識部位AとBとで挟まれた断片（A-B断片という）は制
限酵素認識部位AとCとで挟まれた断片（A-C断片とい
う）、及び制限酵素認識部位CとBとで挟まれた断片（B-
C断片という）に切断され、得られるDNA断片の平均鎖長
はそれぞれ数百bp以下になる。これらの断片について二
次元分画を行う（図２(6)）。二次元分画法としては、
例えば５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動による方法
等を採用することができる。

【００２１】スポットの検出は、標識物質の種類に応じ
た手法により行う。例えば、標識物質として³²Pを用い
た場合はオートラジオグラフィーによる検出が挙げら
れ、蛍光色素を用いた場合は蛍光イメージアナライザー
(例えばBioRad社のMolecular Imager FX装置)による検
出が挙げられる。

【００２２】こうして得られた各スポットの位置を原点
からX方向（1次元電気泳動の方向）、Y方向（2次元電気
泳動の方向）の距離（X₁, Y₁)、（X₂, Y₂)、・・・
（X_n, Y_n)で表すと、このX座標は制限酵素Aの認識部位
から制限酵素Bの認識部位まで（A-B断片）の距離を、Y
座標は制限酵素Aの認識部位から制限酵素Cの認識部位ま
で（A-C断片）の距離を反映する。従って、これらの座
標を利用してゲノム上のある特定の遺伝子に識別標識を
付与し（ゲノム上に整列された順序であるとは限らな
い。）、そのスポットのパターンを解析することによ
り、試験に供した細胞がどのようなものであるか、その
同定を行うことができる。但し、簡略化のため、識別標
識は、座標以外に連続番号や記号で表記してもよい。

【００２３】上記のようにしてRLGS法により得られたメ
チル化パターンの解析は、例えば以下の通り行うことが
できる。スポットには、試験に供したどの細胞や組織で
も常に出現するもの、及び細胞や組織に応じて出現する
ものとそうでない（出現しない）ものとが存在する。例
えば、８種類の細胞について得られるスポットパターン
のうち、ある特定の位置のスポットの検出を行った結
果、８種類全ての細胞についてスポットが現れる場
合、及び１〜７種類の細胞についてスポットが現れる
場合が生ずる。本発明では、この定常的に出現するスポ
ット（上記の場合）は解析の対象から除外し（考慮し
ない）、試験した細胞によってスポットの出現が変化し
た箇所（上記の場合）を選択する。次に、ある細胞等
に応じて出現の仕方が異なるスポットの位置に識別番号
（連続番号でも座標の表示でもよい）を付与する。

【００２４】後述の実施例に示すように、８種類の細胞
等についてメチル化パターンを作製したものを例に説明
する。それぞれの細胞等については約1000箇所のスポッ
トのパターンが生じ、このうち、167箇所がスポットの
出現パターンに相違が生じるため、これを解析の対象と
して選択し、残りのスポットは8種類の細胞及び組織の
全てに出現するため解析の対象から除外する。ただし、
特異的に検出されるスポットの位置を同定するためのマ
ーカーとなる。なお、図５に示すスポットはC57BL/6マ
ウスの腎臓由来のDNAのメチル化パターンであり、この
パターン上に、上記167箇所の位置を○印で付した。他
の７種類の細胞等についても同様である。

【００２５】予め任意の細胞等について作製されたパタ
ーン上に識別番号を付した位置のスポットの有無と、試
験した細胞等について作製されたパターン上に上記と同
じ識別番号を付した位置のスポットの有無とを検出・比
較し、その組織又は細胞に特有のスポットであるか否か
を判断する。ここで、各識別番号を付した位置のスポッ
トの有無を図５に示すように模式的に示しておくと、ス
ポットが、調べた組織又は細胞に特有であるか否かを判
断することができる。例えば、79番の位置に出現したス
ポットは8種類のサンプルのうち胚性幹細胞（未分化）
のみであるので、79番の位置に出現するスポットを得た
細胞は胚性幹細胞（未分化）であると同定することがで
きる。換言すれば、胚性幹細胞（未分化）は、79番の位
置にスポットが出現するといえる。

【００２６】但し、試験した特定の細胞等に特有の1個
のスポットのみを解析すべきスポットとして選択する必
要はなく、複数のスポットの組み合わせによって細胞等
を同定することが可能である。例えば、図５において、
79番及び80番のスポットに着目すると、79番及び80番の
両者にスポットが生じた場合は胚性幹細胞の未分化型で
あると同定することができ、79番はスポットが生じない
が80番はスポットが生じた場合は胚性幹細胞の分化型で
あると同定することができる。スポットの組み合わせが
2個、3個又はそれ以上であっても同様である。サンプル
数は上記例示の８種類の細胞等に限定されるものではな
く、その種類をさらに増加させることにより、より詳細
に細胞等を同定することが可能である。すなわち、ある
一定数の種類において特異的であることが分かっても、
試験する細胞等の種類を増加するとその細胞等に特異的
でないことが判明する場合もあり得る。従って、メチル
化パターンが特異的であるか否かは、できるだけサンプ
ルの数を増やして解析するか、あるいは同定目的に応じ
て試験すべきサンプルを限定又は選択し、その範囲内で
解析することが好ましい。

【００２７】得られたスポットが、ある組織又は細胞に
特有なものである場合は、そのスポットはある組織又は
細胞由来の情報源となる（スポットの位置、濃淡等）。
そこで、このようなスポットの有無（例えば図５の模式
図の情報）をデータベースとして蓄積しておく。データ
ベースの構築は、コンピュータ解析することができるよ
う、それぞれの情報をデジタル化することにより行う。
例えば、位置のデジタル化は座標又は識別番号により、
スポットの濃淡のデジタル化は、スポット強度を定量す
ることにより行われる。

【００２８】これらのデータを蓄積しておくことによ
り、種類や由来が不明な細胞であっても、その細胞につ
いて得られたスポットのパターンをデータベースと比較
することで、その種類を特定することが可能である。ス
ポットのパターンをデータベースと比較するには、細胞
等同定処理用のコンピュータプログラムにより行うこと
ができる。そして、細胞等をいくつかのカテゴリーに分
類しておくことにより、系統的な同定をすることが可能
である。

【００２９】(2)MS- PCR法 PCR法においては、特定のゲノム上の遺伝子が増幅され
るように特異的プライマーを設計及び合成し、これらの
プライマーを用いて当該遺伝子を鋳型としてPCRを行
う。増幅前にゲノムDNA中の遺伝子領域をメチル化感受
性制限酵素で切断すると、メチル化されている遺伝子は
切断されず、メチル化されない遺伝子は切断されること
となる。これらの遺伝子をPCR法により増幅し、増幅さ
れた断片を電気泳動により分離し、バンドの態様を調べ
る。このとき、メチル化されていたものではバンドが観
察され、メチル化されていなかったものではバンドが観
察されないことを利用して、試験した遺伝子はメチル化
されているか否かを知ることができる。

【００３０】例えば、図１において、細胞Aの遺伝子１
のメチル化を調べる場合は、まず、遺伝子1がPCRにより
増幅されるように特異的プライマーを設計する。特異的
プライマー（フォワード及びリバースプライマー）は、
遺伝子１上の任意の領域から選択することもでき、遺伝
子１の5'側に隣接する領域及び3'側に隣接する領域から
選択することもできる。プライマーのヌクレオチド数は
10〜35、好ましくは20〜30であり、増幅断片が100〜100
0bp、好ましくは200〜500bpとなるようにプライマーを
設計する。また、プライマーは、増幅断片中にメチル化
感受性酵素の認識部位が含まれるように設計する。増幅
すべき遺伝子の塩基配列が不明の場合は、市販の自動塩
基配列決定装置（例えばPERKIN-ELMER社製373A DNAシー
クエンサー等）により塩基配列を決定することができ
る。

【００３１】PCRは任意の装置（例えばStratagene社のR
obocycler等）を用い、適当なサイクル条件を適宜設定
する。PCR後は、メチル化感受性酵素で処理し、アガロ
ースゲル電気泳動等に付してバンドを調べる。

【００３２】(3) サザンブロッティング（Southern blo
tting）法ゲノムDNAをメチル化感受性制限酵素で切断すると、メ
チル化されている制限酵素部位は切断されず、メチル化
されていない制限酵素部位は切断される。切断したゲノ
ムDNAをアガロース電気泳動により分離し、DNA断片をナ
イロン膜に転写し、³²P標識した遺伝子に特異的なプロ
ーブをハイブリさせることで、プローブとして用いた遺
伝子のメチル化の有無を、検出されるバンドの長さの違
いとして検出することが出来る。

【００３３】(4) CpGアイランドアレイ法ゲノムDNAをメチル化されうる配列を含まない制限酵素
により切断した後に、PCR用のプライマー部位を含んだ
リンカーを接続する。リンカーを接続したゲノムDNA断
片をメチル化感受性制限酵素で切断した後にリンカー中
のプライマーを用いてPCR法により増幅する。このと
き、メチル化されていないものはメチル化感受性制限酵
素によりプライマー間で切断されて増幅されず、メチル
化されていたもののみが増幅されることになる。そこ
で、任意の2つの組織や細胞どうしで同様のPCR反応を行
うとそれぞれに特異的なメチル化領域の存在により増幅
される遺伝子の種類に差が出来ることになる。それらを
サブトラクション法によりメチル化に差のあったものの
みを選別してプローブとする。これらのプローブを遺伝
子ライブラリーとハイブリダイズさせて、塩基配列を確
認して遺伝子を同定することが出来る。

【００３４】２．遺伝子領域の特定、及び細胞等を製造
するための指標としての使用本発明においては、DNAのメチル化パターンの情報は、
目的の細胞、組織又は核を作製するための指標として使
用することができる。すなわち、細胞の種類によりメチ
ル化パターンが異なることを利用して、目的の細胞、組
織又は核を作製するために不可欠な領域を特定すること
ができる。

【００３５】例えば、図１において、メチル化パターン
の解析により、細胞Aと細胞Bとは同じ胚幹細胞（ES細
胞）であるが、遺伝子２がメチル化され、遺伝子４が脱
メチル化されている場合（細胞A）は分化型ES細胞、遺
伝子２が脱メチル化され、遺伝子４がメチル化されてい
る場合（細胞B）場合は未分化型ES細胞に分類されるこ
とが判明したものと仮定する。この場合は、目的の細胞
（すなわちES細胞）を作製するために不可欠な遺伝子領
域は、遺伝子２及び４である。組織を製造する場合及び
核を製造する場合でも、不可欠な遺伝子領域の特定方法
は細胞の場合と同様である。

【００３６】遺伝子のメチル化は、DNAをメチル基転移
酵素（例えばSss I、Hpa II methylase）で処理するこ
とにより行われる。一旦分化した細胞では、シトシンの
メチル化は細胞分裂に先立つDNA複製時（S期）に、DNA
メチル基転移酵素によって親鎖DNAのメチル化シトシン
を認識し、娘鎖DNAをメチル化することで、新たな細胞
にメチル化パターンが受け継がれる。

【００３７】従って、分化型のES細胞の製造を目的とす
る場合は、細胞Bの遺伝子をランダムにメチル化して培
養すればよい。培養は、一般に使用されているRPMI1640
培地、DMEM培地、MEM培地、又はこれらの培地に牛胎児
血清等を添加した培地等を用いて、一般的動物細胞培養
手法に準じて行うことができる。その後、脱メチル化処
理を行ってランダムにメチル化をはずした後に、前記と
同様にメチル化パターンの情報を解析して、その結果を
指標として細胞Bの遺伝子２がメチル化され、遺伝子４
が脱メチル化されている細胞、組織又は核をスクリーニ
ングして単離することにより、目的の細胞等を得ること
ができる。

【００３８】本発明において、目的の細胞としては特に
限定されるものではないが、例えば胚性幹細胞、栄養膜
幹細胞、骨髄幹細胞、神経幹細胞等が有用性の高い細胞
として挙げられる。また、目的の組織は特に限定される
ものではなく、例えば脳、脊髄などの神経系組織、食
道、胃、小腸、大腸などの消化器、肺、気管支などの呼
吸器、精巣、卵巣、子宮、胎盤などの生殖器、腎臓、膀
胱などの泌尿器、骨髄、血液などの造血器等が挙げられ
る。目的の組織を製造する方法は、体外培養下で、適切
な細胞数（培地25mlあたり10⁶から10⁷個、好ましくは6
x 10⁶から10⁷個）まで培養した後、通常の組織培養を行
って組織に再生させる方法等が採用される。

【００３９】本発明の方法は、目的の部位のみにメチル
化を入れたり（メチル化）、又ははずしたり（脱メチル
化）、あるいは自由に幹細胞が作れるようになったとき
においても、幹細胞であるかどうかあるいは幹細胞の度
合いを評価することで、例えば生体移植などへの安全性
の評価や効率の向上に寄与することができる。

【００４０】３．細胞同定システム本発明の同定システムは、(a) 被検細胞から単離された
DNAのメチル化パターンの情報を解析する手段と、(b)
得られる解析結果を指標として細胞を同定する手段とを
含む。

【００４１】上記(a)の解析手段は、ある一のゲノムDNA
のメチル化パターン及び他のゲノムDNAのメチル化パタ
ーンをそれぞれ検出する手段（「検出エンジン」ともい
う）、並びに得られる検出値を比較する手段（「比較エ
ンジン」ともいう）により構成される。上記(b)の同定
手段は、上記比較結果を指標として前記一のDNAと他のD
NAとの同一性を求める手段（「同一性作成エンジン」と
もいう）により構成される。

【００４２】(1) DNAメチル化パターンの検出エンジン本発明において、DNAメチル化パターンの検出は、前記
の通り得られたパターンをデジタル化し、そのデジタル
情報を使用又は適用することにより行うことができる。

【００４３】(2) 比較エンジン比較エンジンでは、(i)ある野生型の細胞等のDNAメチル
化パターンの情報と、(ii)ある変異型の細胞等のDNAメ
チル化パターンの情報、又は特定の細胞等のDNAメチル
化パターンの情報と、(iii)同定の対象となる細胞等のD
NAメチル化パターンの情報を蓄積する。

【００４４】(3) 細胞同定エンジン細胞等同定エンジンは、比較エンジンにより得られたデ
ータ（スポット又はバンドが出現する位置の違い、スポ
ット又はバンドの濃さの違い等）に基づいて、ある細胞
等と他の細胞等との同一性を導く手段である。この手段
は、例えば細胞Aと細胞Bとの同一性を調べる場合におい
て、細胞AのDNAメチル化パターンの情報が、細胞BのDNA
メチル化パターンの情報と比較してどの程度変化したと
きに、その細胞Aは細胞Bに対して同一なのか、異なるの
か、という判断を実行する手段である。

【００４５】ここで、本発明の同定システムの構成例を
示すブロック図を示す（図６）。図６に示す同定システ
ムは、CPU601、ROM602、RAM603、入力部604、送信/受信
部605、出力部606、ハードディスクドライブ(HDD)607及
びCD-ROMドライブ608を備える。

【００４６】CPU601は、ROM602、RAM603又はHDD607に記
憶されているプログラムに従って、細胞等同定システム
全体を制御し、後述する同定処理を実行する。ROM602
は、細胞等同定システムの動作に必要な処理を命令する
プログラム等を格納する。RAM603は、細胞等同定処理を
実行する上で必要なデータを一時的に格納する。入力部
604は、キーボードやマウス等であり、細胞等同定処理
を実行する上で必要な条件を入力するとき等に操作され
る。送信／受信部605は、CPU601の命令に基づいて、通
信回線を介してデータベース610等との間でデータの送
受信処理を実行する。出力部606は、入力部604から入力
された各種条件、スポット又はバンドの位置又は座標、
バンド又はスポットの濃淡データ等を、CPU601からの命
令に基づいて表示処理を実行する。なお、出力部606と
しては、コンピュータのディスプレイ又はプリンターな
どが例示される。HDD607は、細胞若しくは組織同定プロ
グラム又はバンド若しくはスポット等のメチル化パター
ン情報を格納し、CPU601の命令に基づいて、格納してい
るプログラム又はデータ等を読み出し、例えばRAM603に
格納する。CD-ROMドライブ608は、CPU601の指示に基づ
いて、CD-ROM609に格納されている細胞等同定プログラ
ムから、プログラム又はデータ等を読み出し、例えばRA
M603に格納する。

【００４７】CPU601は、入力部などから受け取ったデー
タを出力部606に供給するとともに、データベースから
受け取ったデータに基づいて細胞等同定処理を実行す
る。データベースとは、前記の通り得られたスポットを
デジタル化し、そのデジタル情報を蓄積したものをい
う。

【００４８】図7は、RLGS法によりメチル化パターンを
解析した場合において、図6に示すプログラムによる細
胞同定処理を行ったときの例を示すフローチャートであ
る。実施例に示すように、スポットのパターンが図3の
ように得られ、このうち167箇所（○で囲んだ箇所）を
設定する。これを各細胞等について行い、スポットの有
無を模式的に図5のように示したとする。図5に示すデー
タを例として、細胞等同定処理例を示す。

【００４９】まず、RLGS法により得られたスポットのパ
ターンデータを入力する（ステップ1(S1)）。データ入
力が確定するまでは、ステップ1及びステップ2を繰り返
す。なお、データの入力により、それぞれの組織又は細
胞から得られた情報（図5に示すデータ）は、データベ
ースに登録されるものとする。また、スポットの強弱の
データは、図5に示すような「●」、「◎」「○」、
「−」等の記号でもよく、０、１、３、５等の数値でも
よい。

【００５０】データの確定後、79番にスポットが強く現
れたか否かを判断する（ステップS3）。スポットが強い
と判断した場合（Yes）は、対象となった組織又は細胞
は胚性幹細胞（未分化型）であると決定する（ステップ
S4）。スポットがないと判断した場合(No)は、次に、16
0番又は161番にスポットが強く現れたか否かを判断する
（ステップS5）。スポットが強いと判断した場合は、対
象となった組織又は細胞は胚性幹細胞（分化型）である
と決定する（ステップS6）。160番又は161番のスポット
が生じないと判断された場合は、次に、98番にスポット
が強く現れたか否かを判断する（ステップS7）。スポッ
トが強いと判断した場合は、対象となった組織又は細胞
は栄養膜細胞（未分化型）であると決定する（ステップ
S8）。スポットがないと判断した場合は、次に、12番に
スポットが強く現れ、かつ、13番にスポットが現れない
かどうかを判断する（ステップS9）。12番にスポットが
強く現れ、かつ、13番にスポットが現れなかったと判断
した場合は、対象となった組織又は細胞は栄養膜細胞
（分化型）であると決定する（ステップS10）。上記以
外のスポットのパターン（12番が○であり、かつ、13番
が○又は●である）の場合は、次に、149番にスポット
が強く現れたか否かを判断する（ステップS11）。149番
にスポットが強く現れたと判断した場合は、対象となっ
た組織又は細胞は腎臓であると決定する（ステップS1
2）。149番にスポットが現れなかったと判断した場合
は、49番、52番、60番又は61番にスポットが強く現れた
か否かを判断する（ステップS13）。49番、52番、60番
又は61番のスポットのいずれかが強く現れたと判断した
場合は、対象となった組織又は細胞は胎盤であると決定
する（ステップS14）。49番、52番、60番及び61番のス
ポットのいずれも現れなかったと判断した場合は、44番
にスポットが強く現れたか否かを判断する（ステップS1
5）。44番にスポットが強く現れたと判断した場合は、
対象となった組織又は細胞は脳であると決定する（ステ
ップS16）。44番にスポットが現れなかったと判断した
場合は、30番、31番、32番、33番、62番、65番及び66番
のいずれかのスポットが強く現れたか否かを判断する
（ステップS17）。30番、31番、32番、33番、62番、65
番及び66番のいずれかのスポットが強く現れたと判断し
た場合は、対象となった組織又は細胞は精子であると決
定する（ステップS18）。30番、31番、32番、33番、62
番、65番及び66番の少なくとも１つにスポットが現れな
かったと判断した場合は、同定操作は終了する（ステッ
プS20）。各細胞等の同定がなされた段階においても、
同定操作は終了する（ステップS19）。

【００５１】上記例示した細胞等とは別の細胞等につい
ても、図5と同様のパターンの模式図を作成し、図7に示
すフローチャートと同様のプログラムに従って、同定操
作を行うことができる。

【００５２】本発明の細胞同定方法においては、既に決
定された各細胞等のDNAメチル化パターンと、同定の対
象となる細胞等のDNAメチル化パターンとを関連付けて
おくことが重要である。すなわち、既に決定された各細
胞等のDNAメチル化パターンの情報に基づいて、同定の
対象となる細胞等の情報を決定することが重要である。
そこで、既に決定された各細胞等のDNAメチル化パター
ンの情報と、被検細胞等について得られたDNAメチル化
パターンの情報とを記録したコンピュータ読み取り可能
な記録媒体を使用するのが好ましい。この記録媒体に
は、コンピュータを、上記検出されたメチル化パターン
を比較する手段と、その比較結果を指標として、細胞を
決定する決定器として機能させるためのプログラムが記
録されていてもよい。このプログラムは、別の記録媒体
に記録されていてもよい。記録媒体には、CD-ROM、ハー
ドディスク、ROM、RAM等が含まれる。

【００５３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。〔実施例1〕 RLGS法によるメチル化パターンの解析本実施例では、RLGS法を一例として用いてメチル化パタ
ーンの解析を行った。

【００５４】(1) ゲノムDNAの調製ゲノムDNAは、公知方法に従って以下の通り調製した。
それぞれの凍結した組織サンプル（0.5-1g）を破砕し、
25mlの溶解バッファー（150mM EDTA, 10mM Tris-HCl pH
8.0, 1% SDS）(プロテイナーゼK（10mg/ml:Merk）を含
有)に溶解した。混合物を55℃で20分インキュベートし
た。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール
（50:49:1）による抽出を2回行い、エタノール中にゲノ
ムDNAを沈殿させ、200μlのTE（10mM Tris-HCl, 1mM ED
TA pH7.6）に溶解した。

【００５５】(2) RLGS法シトシンの5'のメチル化は、哺乳類のゲノムDNAで唯一
見られる化学修飾である。マウスの数種類の細胞（胚性
幹細胞、栄養膜幹細胞、精子）又は組織（胎盤、腎臓、
脳）を用いてDNAメチル化状況を解析した。

【００５６】RLGSは、公知の方法に準じて行った（Okaz
aki et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:5610-561
4, 1995）。7μlのTE中3.5μgのゲノムDNAを、0.4μM d
GTPs、0.2μM dCTP(Amersham)、0.4μM ddATP及び0.4μ
M ddTTPの存在下で 10unitのクレノウ断片（TOYOBO）で
処理した。得られたDNAをまずランドマーク制限酵素と
して20unitのNotI又はBssHIIで処理し、0.33μM [α-³²
P]dCTP及び0.33μM [α-³²P]dGTP（Amersham）の存在
下、1.3unitsのSequenase Ver.2.0(USB Co., Ltd.)を用
いて5'突出末端を放射標識した。標識DNA（1.5μg）を2
0unitsのPvuII（TaKaRa）で処理した後、１次元電気泳
動を行った（0.9％アガロースディスクゲル、約23時
間、230V）。次に、ゲル中のDNA断片を1000unitsのPstI
（TaKaRa）で処理した。2次元電気泳動は、150Vで20時
間行った。電気泳動終了後、ゲルを乾燥させ、-80℃で7
〜10日間X線フィルム(Kodak XAR5)に感光させた。

【００５７】その結果、約1,000のRLGSスポットが検出
され（図3）、細胞や組織の種類に関係なく、常に検出
されるスポットが約85％存在した。細胞の種類により検
出されるスポットのパターンが異なる箇所に番号をつけ
（番号１〜167、図3）、これらのスポットから抽出した
いくつかのスポットの検出例を図4に示した。図4におい
て、＃79は胚性幹細胞に特異的であり、他の組織では検
出されない。同様に＃98は栄養膜幹細胞に特異的であ
る。＃91は胎盤又は栄養膜細胞系列に特異的である。＃
99は脳と分化栄養膜細胞に認められる。＃30は精子に特
異的なスポットである。一方、＃27は他の細胞・組織で
は認められるが、精子では認められない。このようにし
て、異なった細胞間又は組織間で検出されるか否かを示
したRLGSスポットに番号をつけ、167個の違いが見つか
った。

【００５８】上記167個のスポットについて、細胞・組
織特異的メチル化パターンの模式図を図5に示した。こ
の解析例より、パターンの単独又はそれらの組み合わせ
により、組織・細胞特異的にメチル化又は非メチル化さ
れている領域（少なくとも167領域）が存在することを
示している。このことは逆に、未知の細胞でも、メチル
化パターンを解析することで、細胞や組織の種類を特定
することが可能であることを示している。

【００５９】〔実施例2〕遺伝子領域の特定実施例１(1)に準じてゲノムDNAを抽出することにより得
られたラットの胎盤、脳、腎臓の遺伝子領域のメチル化
状態の差異を検出した結果、1033遺伝子中24の遺伝子に
メチル化パターンの差が見られた。

【００６０】メチル化パターンの差が検出された遺伝子
を単離し、塩基配列を既知のデータベースで検索したと
ころ、胎盤特異的脱メチル化遺伝子としてクエン酸トラ
ンスポーター（C3TP）・エストロジェン硫酸基転移酵素
（STE）が、脳特異的遺伝子として、スフィンゴ脂質リ
ン酸化酵素（SPHK）・Frizzledがそれぞれ同定された。

【００６１】

【発明の効果】本発明により、DNAのメチル化パターン
を利用した細胞等の同定方法が提供される。本発明の方
法によれば、特徴が十分に明らかにされていない未知の
細胞であっても細胞の種類を特定することができ、有用
な細胞株の開発・樹立に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法の概要を示す図である。

【図２】RLGS法の概要を示す図である。

【図３】メチル化パターンを示す写真である。

【図４】メチル化パターンを示す写真である。

【図５】メチル化パターンの模式図である。

【図６】細胞等同定システムのブロック図である。

【図７】細胞等同定プログラムによる処理例を示すフロ
ーチャートの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者大鐘潤東京都文京区弥生１−１−１東京大学大学院農学生命科学研究科内 (72)発明者服部中東京都文京区弥生１−１−１東京大学大学院農学生命科学研究科内Ｆターム(参考） 2G045 AA24 BB01 BB07 BB50 BB51 CB01 CB30 FA20 FB05 FB08 JA03 4B024 AA11 BA80 CA01 HA11 4B063 QA01 QA12 QA18 QQ02 QQ42 QR14 QR56

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検細胞、組織又は核から単離されたDN
Aのメチル化パターンの情報を解析して、細胞、組織又
は核を同定することを特徴とする細胞、組織又は核の同
定方法。
【請求項２】被検細胞、組織又は核から単離されたDN
Aのメチル化パターンの情報を、目的の細胞、組織又は
核を作製するための指標として使用する方法。
【請求項３】被検細胞、組織又は核から単離されたDN
Aのメチル化パターンの情報を指標として、目的の細
胞、組織又は核を作製するために不可欠な遺伝子領域を
特定する方法。
【請求項４】被検細胞、組織又は核から単離されたDN
Aのメチル化パターンの情報を解析する手段と、得られ
る解析結果を指標として細胞、組織又は核を同定する手
段とを含んでなる、コンピュータを細胞、組織又は核の
同定システムとして機能させるためのプログラムを記録
したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。