JP2002104972A

JP2002104972A - トポイソメラーゼ阻害剤

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Publication number: JP2002104972A
Application number: JP2000299045A
Authority: JP
Inventors: Toshio Tanaka; 俊雄田中
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2002-04-10
Anticipated expiration: 2020-09-29
Also published as: JP4768909B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、制癌剤として有用な新規なトポイ
ソメラーゼ阻害剤を提供することを目的とする。【解決手段】式（Ｉ）：【化１】（式中、Ｒ¹は直鎖または分岐鎖状アルキル基、Ｒ²はプ
リン塩基またはピリミジン塩基を示す。）で表されるヌ
クレオチドアルキル誘導体を含むトポイソメラーゼ阻害
剤、および、制癌剤として使用するための該阻害剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヌクレオチドアル
キル誘導体の新しい用途に関する。さらに詳しく言え
ば、ヌクレオチドアルキル誘導体を含むトポイソメラー
ゼ阻害剤、および、制癌剤として使用するための該阻害
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】トポイソメラーゼは、ＤＮＡ鎖の切断と
再結合に関与する酵素であり、超螺旋（スーパーコイ
ル）型ＤＮＡを弛緩型ＤＮＡに変換し、ＤＮＡの複製、
転写、組換え等の過程で生じる高次構造の歪みを解消
し、ＤＮＡ代謝を円滑に進行させる機能を有している。
このトポイソメラーゼには、その作用メカニズムの違い
によってトポイソメラーゼＩ型（トポＩ）およびトポイ
ソメラーゼII型（トポII）が存在することが知られてい
る。トポＩは、二本鎖ＤＮＡの片方のみを切断し、もう
片方のＤＮＡ鎖を通過させた後、切断面を閉じる反応を
触媒する酵素であり、トポIIは、二本鎖ＤＮＡを同時に
切断し、その間を別のＤＮＡ鎖が通過した後、切断箇所
を再結合する反応機構を有する酵素である。

【０００３】１９８４年、米国のLiu, L.F.博士らは、
当時主要な制癌剤であったアムサクリン（ｍ−ＡＭＳ
Ａ：4'-(9-acridinylamino)methanesulfon-m-anisidid
e）が細胞内のＤＮＡトポイソメラーゼを標的とし、こ
の酵素活性を阻害することにより、制癌効果を発揮する
ことを明らかにした（Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,
第81巻, 1361頁, 1984年）。続いて、エピポドフィロキ
シン誘導体（エトポシド：ＶＰ−１６、テニポシド：Ｖ
Ｍ−２６）、アドリアマイシンをはじめ、多くの制癌剤
のトポイソメラーゼ阻害活性が報告された（Liu, L.F.,
Ann. Rev. Biochem., 第58巻, 351頁, 1989年、Drlic
a, K. et al., Biochem., 第27巻, 2253頁, 1988年）。
トポイソメラーゼ阻害剤の多くは、一時的に切断された
ＤＮＡ鎖とトポイソメラーゼとの反応中間体（クリーバ
ブル複合体）に結合し、クリーバブル複合体の状態でト
ポイソメラーゼの機能を停止させる効果を有する。その
ため、ＤＮＡ鎖が切断されたままの状態となり、細胞増
殖が妨げられたり、アポトーシスが誘導されたりするの
で、制癌剤として利用できるものが多い。また、癌細胞
のような増殖の激しい細胞には、正常細胞に比べてこの
トポイソメラーゼが多く存在することが知られている
（Spitzner, Nucleic. Acid. Res., 第16巻, 5533頁, 1
988年）。したがって、トポイソメラーゼ阻害活性を有
する化合物の探索によって得られた物質は、制癌剤とし
て有用である。

【０００４】癌は、我が国では死亡率第１位の疾患であ
る。近年、手術療法や放射線療法といった局所療法の進
歩が癌患者の生存率の向上に寄与しつつあるものの、癌
は転移により全身に広がった時点で発見されることも多
く、癌治療方法の確立には、かかる全身性疾患となった
癌への対応が急務である。この点で、制癌剤を中心とす
る化学療法の開発に寄せられる期待は、ますます高まっ
ている。また、癌細胞に関する分子生物学的アプローチ
の進展は、従来明らかにされていなかった制癌剤の作用
機構の解明に重要な指針を与えてきている。

【０００５】これらのことを契機として、トポイソメラ
ーゼ阻害活性を有する制癌剤のスクリーニングが行わ
れ、その結果、植物成分由来のゲニステイン（Okura,
A., Biochem. Biophys. Res. Commun., 第157巻, 183
頁, 1988年）、イリノテカン（Kunimoto, T., Cancer R
es., 第47巻, 5944頁, 1987年）、微生物由来成分であ
るテルペンテシン（Kawada, S-Z., Cancer Res., 第51
巻, 2922頁, 1991年）、クレロシジン（Kawada, S-Z.,
J. Antibiot., 第45巻, 1182頁, 1992年）、セイントピ
ン（Yamashita, Y., Biochem., 第30巻, 5838頁, 1991
年）およびその誘導体であるＵＣＥ６（Fujii, N., J.
Antibiot., 第46巻, 1173頁, 1993年）、ブルガレイン
（Fujii, N., J. Biol. Chem., 第268巻, 13160頁, 199
3年）等の有望な医薬品候補物質が見出されるに至っ
た。

【０００６】一方、分子内にフッ素を有するフルオロウ
ラシル化合物が制癌活性を有することは、これまでによ
く知られている。また、ウリジン５’−アルキルホスフ
ェート類が酵母菌のαおよびαハプロイド（１倍体）細
胞間の有性凝集を細胞の成長に影響を与えることなく阻
害したり（FEMS Microbiol. Lett., 第147巻, 17頁,199
7年）、抗真菌活性を有する（特開平１０−２１８７７
８号公報）ことが報告されている。さらに、本発明者ら
は、ヌクレオシド５’−アルキルホスフェート類がカル
シウム拮抗作用を有し、血小板凝集抑制剤として有用で
あることを見出している（特開２０００−２４７８９１
号公報）。しかしながら、フッ素を含まないヌクレオシ
ド５’−アルキルホスフェート誘導体についてのトポイ
ソメラーゼ阻害活性は報告されておらず、該誘導体が制
癌剤として有用であるとの報告もない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、制癌剤とし
て有用な新規なトポイソメラーゼ阻害剤を提供すること
を目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来
技術に鑑みて、種々のヌクレオシド誘導体について鋭意
研究を重ねた結果、ヌクレオシド５’−アルキルホスフ
ェート誘導体、とりわけ、ウリジン５’−アルキルホス
フェート誘導体（ＵＭＰＣ）およびアデノシン５’−ア
ルキルホスフェート誘導体（ＡＭＰＣ）が顕著なトポイ
ソメラーゼ阻害活性を有する事実を見出し、この知見に
基づいて本発明を完成するに至った。すなわち、本発明
は、（１）式（Ｉ）：

【化２】（式中、Ｒ¹は直鎖または分岐鎖状アルキル基、Ｒ²はプ
リン塩基またはピリミジン塩基を示す。）で表されるヌ
クレオチドアルキル誘導体を含むトポイソメラーゼ阻害
剤、（２）Ｒ¹が炭素数３０を超えないアルキル基であ
る、上記（１）記載のトポイソメラーゼ阻害剤、（３）
Ｒ¹が炭素数４〜２４のアルキル基である、上記（２）
記載のトポイソメラーゼ阻害剤、（４）Ｒ¹が炭素数１
６のアルキル基である、上記（３）記載のトポイソメラ
ーゼ阻害剤、（５）Ｒ¹が炭素数２０のアルキル基であ
る、上記（３）記載のトポイソメラーゼ阻害剤、（６）
Ｒ²がウラシルである、上記（１）〜（５）のいずれか
１つに記載のトポイソメラーゼ阻害剤、（７）Ｒ²がア
デニンである、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記
載のトポイソメラーゼ阻害剤、（８）ヌクレオチドアル
キル誘導体が遊離形または生体内で遊離形を与え得る医
薬的に許容される任意形で使用される、上記（１）〜
（７）のいずれか１つに記載のトポイソメラーゼ阻害
剤、（９）制癌剤として使用するための、上記（１）〜
（８）のいずれか１つに記載のトポイソメラーゼ阻害剤
を提供するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】上記式（Ｉ）において、Ｒ¹で示
されるアルキル基は、直鎖状または分岐鎖状のいずれで
あってもよい。その炭素数は、通常３０を超えることは
なく、好ましくは４〜２４、更に好ましくは１６〜２０
である。このようなアルキル基の具体例としては、ブチ
ル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシ
ル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシ
ル、ヘプタデシル、オクタデシル、エイコシルなどの直
鎖状アルキル、または、ゲラニル、ファルネシルなどの
分岐鎖状アルキルを挙げることができる。Ｒ²で示され
るプリン塩基、ピリミジン塩基は、アデニン、グアニ
ン、ウラシル、シトシン、チミンなどの通常の塩基のほ
か、これらのメチル化体などの修飾塩基であってもよ
い。（必要なければ削除してください。）現時点で好ましいと考えられるものは、Ｒ¹が炭素数１
６のｎ−ヘキサデシル基または炭素数２０のｎ−エイコ
シル基を表し、Ｒ²がウラシルを表す場合、すなわちウ
リジン５’−ヘキサデシルホスフェート（ＵＭＰＣ１
６）、ウリジン５’−エイコシルホスフェート（ＵＭＰ
Ｃ２０）、あるいは、Ｒ¹が炭素数１６のｎ−ヘキサデ
シル基を表し、Ｒ²がアデニンを表す場合、すなわちア
デニン５’−ヘキサデシルホスフェート（ＡＭＰＣ１
６）である。

【００１０】有効成分としてのヌクレオチドアルキル誘
導体は、遊離形のみならず、医薬的に許容される限り、
水和物、塩、エステルなど、生体内で遊離形を与えるこ
とのできる任意の形で使用されてよい。したがって、以
下の記載において、式（Ｉ）の化合物は、遊離形のみな
らず、そのような医薬的に許容される任意形をも包括し
て意味するものとする。

【００１１】上記式（Ｉ）の化合物であるヌクレオチド
５’−アルキル誘導体は、一般に対応するヌクレオチド
５’−モノホスフェート（式（Ｉ）において、Ｒ¹＝Ｈ
に相当する化合物）から自体常套の方法（FEBS Lett.,
第94巻, 339-341頁, 1978年、Life Sci., 第43巻, 437-
444頁, 1988年、FEBS Lett., 第352巻, 353-355頁,1994
年）により合成することができる。例えば、ウリジン
５’−アルキル誘導体の場合、ウリジン５’−モノホス
フェートおよび種々の直鎖状または分岐鎖状アルキルア
ルコールをｔ−ブチルアルコールに溶解し、ジシクロヘ
キシルカルボジイミドの存在下で反応させることによ
り、製造することができる。反応温度は、溶媒の種類に
より異なるが、通常６０〜１００℃、好ましくは７０〜
９０℃であり、反応時間は、反応温度により異なるが、
通常２〜２０時間、好ましくは６〜８時間である。

【００１２】本明細書において「癌」とは、その最も広
い意味で使用するものであり、腫瘍、新生組織形成、癌
腫、肉腫、白血病、リンパ腫などを包含する。また、本
明細書において「制癌」とは、癌性病変の予防、癌性病
変の進行の遅延、癌性病変の生成の抑制、癌性病変の減
少、または癌性病変の除去を意味する。

【００１３】癌細胞は、正常細胞に比べ急速な増殖をす
るのが特徴と考えられている。制癌剤は、この特徴を利
用して増殖性の細胞に対し毒性を持つ薬剤を用いる化学
療法である。本発明のトポイソメラーゼ阻害剤は、癌細
胞の増殖を抑制したり、アポトーシスを誘導する制癌剤
として用いることができ、良性腫瘍並びに肉腫、白血
病、リンパ腫およびがん腫などの悪性腫瘍（癌）等の治
療のため、通常全身的または局所的に、一般的には経口
または非経口の形で投与される。本発明の式（Ｉ）の化
合物を投与する際には、経口投与のための固体組成物、
液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための
注射剤、点滴剤、口腔剤、経直腸剤、あるいは経皮投与
により、すなわち薬剤を適用するのに都合のよい一般的
な方法で投与することができる。

【００１４】経口投与のための固体組成物には、錠剤、
丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれ、カプセル
剤には、軟カプセル剤および硬カプセル剤が含まれる。
液体組成物には、例えば、シロップ、懸濁液、エマルジ
ョンが含まれる。固体組成物は、一つまたはそれ以上の
活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤と混合さ
れる。組成物は、常法にしたがって、不活性な希釈剤以
外の一般的な添加物、例えば、潤滑剤、崩壊剤、安定化
剤、溶解補助剤を含有していてもよい。

【００１５】錠剤は、化合物をそのまま、または賦形
剤、結合剤、崩壊剤若しくはその他の適当な担体を加え
て均等に混和し、慣用的な固体処方の製造方法により製
造することができる。このような担体の例は、ステアリ
ン酸マグネシウム、デンプン、ラクトース、シュークロ
ースおよびセルロースを包含する。また、必要に応じて
着色剤、矯味剤などを加えることができ、さらに、白
糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロ
キシプロピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あ
るいは腸溶性のフィルムで剤皮を施してもよいし、また
２以上の層で皮膜してもよい。

【００１６】カプセル形である組成物は、慣用的なカプ
セル化操作を用いて製造できる。例えば、活性成分含有
のペレットを標準担体の使用により調製し、次いで硬ゼ
ラチンカプセルに充填することができる。別法として、
いずれか適当な医薬担体、例えば、水性ガム、セルロー
ス、シリケートまたは油を用いて分散液または懸濁液を
調製し、ついで該分散液または懸濁液を軟ゼラチンカプ
セルに充填することができる。

【００１７】経口投与のための液体組成物は、薬学的に
許容される懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等
を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤を含んでいて
もよい。このような組成物は、不活性な希釈剤以外に必
要に応じて安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、分散安定
剤またはその他の適当な添加剤を加えることができる。

【００１８】本発明による非経口投与のための注射剤
は、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤・乳剤を
包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤は、一つ
またはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性
な希釈剤と混合される。水性の希釈剤としては、例え
ば、注射用水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶
液、または生理食塩水とブドウ糖溶液の混合液が挙げら
れる。非水性の希釈剤としては、例えば、オリブ油、ゴ
マ油、ダイズ油、ツバキ油、ナタネ油、トウモロコシ
油、落花生油、綿実油のような植物油、エタノール、プ
ロピレングリコール、ポリエチレングリコール類のよう
な有機溶媒が挙げられる。このような組成物は、さらに
抗酸化剤、キレート剤、緩衝剤、水溶性有機溶剤などの
安定化剤、無痛化剤、保存剤、等張化剤、乳化剤、溶解
補助剤のような添加剤を含んでいてもよい。

【００１９】抗酸化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウ
ム、アスコルビン酸など、キレート剤としては、ＥＤＴ
Ａ、チオグリコール酸、チオ乳酸など、緩衝剤として
は、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩などを挙げることが
できる。懸濁剤、乳剤の調製においてはアラビアゴム、
トラガント、ゼラチン、ポリソルベート８０（登録商
標）を初めとする多くの乳化剤が用いられる。これらの
非経口投与のための注射剤は、加熱法（乾熱法、高圧蒸
気法、流通蒸気法、煮沸法、間けつ法）、ろ過法、照射
法（放射線法、紫外線法、高周波法）などの公知の滅菌
手段によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組
成物を製造し（例えば、凍結乾燥法等により）、使用前
に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用す
るような、用時溶解型の製剤とすることもできる。

【００２０】本発明の式（Ｉ）の化合物の投与量は、年
齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等によ
り異なるが、通常、成人患者一人あたり、一回につき、
１００μｇから４００ｍｇの範囲で、一日一回から数回
経口投与されるか、または、成人患者一人あたり、一回
につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回か
ら数回非経口投与される。また、一日あたり４００ｍｇ
までの用量で、連続的静脈内注入により投与してもよ
い。かくして、経口投与による一日の全用量は、１００
μｇから２０００ｍｇの範囲にあり、非経口投与による
一日の全用量は１０μｇ〜４００ｍｇの範囲にある。適
当には、該化合物を連続的治療の期間中、例えば、一週
間またはそれ以上の期間投与する。もちろん、投与量は
種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない
量で十分な場合もあるし、また範囲を超えて必要な場合
もある。なお、本発明において、式（Ｉ）の化合物をト
ポイソメラーゼの阻害を目的として投与する場合、明ら
かな毒性は認められない。以下に実施例において、製造
例、製剤例および試験例をあげて本発明を詳しく説明す
るが、これらは単なる例示であり、本発明はこれらに限
定されるものではない。

【００２１】

【実施例】製造例１：ウリジン５’−ヘキサデシルホス
フェート（Ｒ¹＝Ｃ₁₆Ｈ₃₃、Ｒ²＝ウラシル：ＵＭＰＣ１
６）の調製ウリジン５’−モノホスフェート（６００μｍｏｌ）お
よびヘキサデシルアルコール（６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬ
のｔ−ブチルアルコールに溶解した後、３ｍｍｏｌのジ
シクロヘキシルカルボジイミドを加え、８０℃で２０時
間加熱した。反応終了後、生成した沈殿を濾別し、ｔ−
ブチルアルコールを減圧下に除去した。残渣をヘキサン
およびアセトンの混液（１：１）で数回洗浄し、乾燥し
た後、クロロホルムおよびメタノールの混液（９５：
５）に溶解した。これを同溶液にて作成したシリカゲル
カラムに負荷し、カラムを同液で充分洗浄してジシクロ
カルボジイミドを流出させた。以後、メタノールの濃度
を順次、上昇させることによって、ウリジン５’−ヘキ
サデシルホスフェートを溶出した。溶出液から溶媒を減
圧下に除去することにより、白色の沈殿を得た。対ウリ
ジン５’−モノホスフェートあたりの収率は、３２．４
％であった。

【００２２】製造例２：ウリジン５’−エイコシルホス
フェート（Ｒ¹＝Ｃ₂₀Ｈ₄₁、Ｒ²＝ウラシル：ＵＭＰＣ２
０）の調製ウリジン５’−モノホスフェート（６００μｍｏｌ）お
よびエイコシルアルコール（６ｍｍｏｌ）を原料とし、
製造例１の製法例に準じて操作して、ウリジン５’−エ
イコシルホスフェート（ＵＭＰＣ２０）を得た。

【００２３】製造例３：アデノシン５’−ヘキサデシル
ホスフェート（Ｒ¹＝Ｃ₁₆Ｈ₃₃、Ｒ²＝アデニン：ＡＭＰ
Ｃ１６）の調製アデノシン５’−モノホスフェート（６００μｍｏｌ）
およびヘキサデシルアルコール（６ｍｍｏｌ）を原料と
し、製造例１の製法例に準じて操作して、アデノシン
５’−ヘキサデシルホスフェート（ＡＭＰＣ１６）を得
た。

【００２４】製剤例１：静脈注射剤式（Ｉ）の化合物１〜４０ｍｇ緩衝剤ｐＨ約７まで溶媒１００ｍＬまで上記の製剤例１において、緩衝剤の具体例としてはクエ
ン酸塩、リン酸塩および水酸化ナトリウム／塩酸を、溶
媒の具体例としては水を挙げることができる。

【００２５】製剤例２：錠剤式（Ｉ）の化合物１〜４０ｍｇ希釈剤／充填剤５０〜２５０ｍｇ結合剤５〜２５ｍｇ崩壊剤５〜５０ｍｇ滑沢剤１〜５ｍｇ上記製剤例２において、希釈剤／充填剤の具体例として
は微結晶セルロース、ラクトースおよび澱粉を、結合剤
の具体例としてはポリビニルピロリドンおよびヒドロキ
シプロピルメチルセルロースを、崩壊剤の具体例として
はナトリウム澱粉グリコレートおよびクロスポビドン
を、滑沢剤の具体例としてはステアリン酸マグネシウム
およびステアリルフマル酸ナトリウムを挙げることがで
きる。

【００２６】製剤例３：経口用懸濁液式（Ｉ）の化合物１〜４０ｍｇ沈殿防止剤０．１〜１０ｍｇ希釈剤２０〜６０ｍｇ保存剤０．０１〜１．０ｍｇ緩衝剤ｐＨ約５〜８まで共溶媒０〜４０ｍｇ香料０．０１〜１．０ｍｇ着色剤０．００１〜０．１ｍｇ上記製剤例３において、沈殿防止剤の具体例としてはキ
サンチンガムおよび微結晶セルロースを、希釈剤の具体
例としてはソルビトール溶液、典型的には水を、保存剤
の具体例としては安息香酸ナトリウムを、緩衝剤の具体
例としてはクエン酸塩を、共溶媒の具体例としてはアル
コール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコー
ルおよびシクロデキストリンを挙げることができる。

【００２７】試験例トポイソメラーゼ阻害活性の測定本発明のヌクレオチドアルキル誘導体のトポイソメラー
ゼ阻害活性は、文部省がん特定総合がん・制がん剤ス
クリーニング委員会が策定した平成１１年度版「制がん
剤の分子標的スクリーニング−その概要と利用法−」中
の「ヒトＤＮＡトポイソメラーゼ阻害活性の検定」に記
載の方法に基づいて、組換えヒト・トポＩおよびトポII
を用い、検定した。トポＩ阻害活性は、カンプトテシン
（ＣＰＴ）を陽性対照として、超螺旋（スーパーコイ
ル）を持った環状プラスミドＤＮＡの弛緩反応により、
以下のようにして測定した。３００、２５０、２００、
１５０、１００、５０μＭの濃度で式（Ｉ）の化合物を
反応液に加える。反応後、反応液を平板アガロースゲル
を用いた電気泳動に供し、ゲルを臭化エチジウムで染色
した後、弛緩した環状プラスミドＤＮＡの量（反応生成
物）の変化から、５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）値を求め
る。化合物の酵素阻害活性の強度は、以下のように表現
する。２＋：ＩＣ₅₀≦３０μＭ、１＋：３０＜ＩＣ₅₀≦１００μＭ、 ±：１００＜ＩＣ₅₀＜３００μＭ、 −：ＩＣ₅₀≧３００μＭトポII阻害活性は、エトポシド（ＶＰ−１６）を陽性対
照として、連環状ＤＮＡである原生動物トリパノゾーマ
のキネトプラストＤＮＡ（ＫＤＮＡ）の脱連環反応によ
り、以下のようにして測定した。３００、２５０、２０
０、１５０、１００、５０μＭの濃度で式（Ｉ）の化合
物を反応液に加える（阻害活性が強い場合は、４５、３
０、２０、１５、１０、５、２．５μＭまたは８、４、
２、１、０．５、０．２５μＭ）。反応後、反応液を平
板アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、ゲルを臭化
エチジウムで染色した後、脱連環したキネトプラストＤ
ＮＡの量（反応生成物）の変化から、５０％阻害濃度
（ＩＣ₅₀）値を求める。化合物の酵素阻害活性の強度
は、以下のように表現する。２＋：ＩＣ₅₀≦３０μＭ、１＋：３０＜ＩＣ₅₀≦１００μＭ、 ±：１００＜ＩＣ₅₀＜３００μＭ、 −：ＩＣ₅₀≧３００μＭ

【００２８】試験例１：ＵＭＰＣ１６およびＵＭＰＣ２
０のトポイソメラーゼＩ（トポＩ）阻害活性の測定トポＩ阻害活性は、市販のトポイソメラーゼＩアッセイ
キット（TopoGEN製）を用い、添付の使用説明書にした
がって操作し、測定した。ＵＭＰＣ１６およびＵＭＰＣ
２０をそれぞれメタノールに所定の濃度に溶解し、試料
溶液とした。エッペンドルフチューブに水１３．５μ
Ｌ、１０倍量の反応緩衝液（１００ｍＭのトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１．５Ｍ
の塩化ナトリウム、１％ウシ血清アルブミン、１ｍＭの
スペルミジン、５０％グリセロール）２μＬ、スーパー
コイルＤＮＡ１μＬ（０．２５μｇ／μＬ）、ヒト・
トポイソメラーゼＩ（TopoGEN製）１．５μＬ（２ｕｎ
ｉｔｓ／μＬ）、試料溶液２μＬを添加し、混合した。
試料溶液の代わりにカンプトテシン（ＣＰＴ：TopoGEN
製）を添加したものを陽性対照、メタノールのみを添加
したものを陰性対照とした。３７℃で３０分間反応させ
た後、５倍量の反応停止液（５％Sarkosyl、０．１２５
％ブロモフェノールブルー、２５％グリセロール）を５
μＬ添加し、混合した。１％アガロースゲルに反応液を
負荷し、１００Ｖで約３０分間電気泳動した。マーカー
として、予めトポイソメラーゼＩで処理して弛緩したプ
ラスミドＤＮＡを同時に泳動した。臭化エチジウム（ギ
ブコ製）溶液（１μｇ／ｍＬ）中でゲルを振盪し、ＤＮ
Ａを染色した後、ＵＶトランスイルミネーターで観察し
て、ポラロイド（登録商標）撮影し、ＤＮＡ量の変化か
ら５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を求めた。結果を図１、図
２および表１に示した。ＵＭＰＣ１６のトポＩ阻害活性
は、ＵＭＰＣ１６の濃度が１５０μＭを越える範囲で認
められた。２５０μＭ以上の濃度では酵素活性は１００
％阻害され、また、２００μＭの濃度では未反応のＤＮ
Ａバンドと弛緩したＤＮＡバンドがほぼ等量検出された
ことから、ＵＭＰＣ１６のトポＩに対するＩＣ₅₀はおよ
そ２００μＭと推定された。また、ＵＭＰＣ２０のトポ
Ｉ阻害活性は、ＵＭＰＣ２０の濃度が１００μＭを越え
る範囲で認められ、１５０μＭ以上の濃度では酵素活性
は１００％阻害された。また、１００μＭの濃度では未
反応のＤＮＡバンドと弛緩したＤＮＡバンドがほぼ等量
検出されたことから、ＵＭＰＣ２０のトポＩに対するＩ
Ｃ₅₀はおよそ１００μＭと推定された。

【００２９】

【表１】

【００３０】試験例２：ＵＭＰＣ１６およびＵＭＰＣ２
０のトポイソメラーゼII（トポII）阻害活性の測定トポII阻害活性は、市販のトポイソメラーゼIIアッセイ
キット（TopoGEN製）を用い、添付の使用説明書にした
がって操作し、測定した。ＵＭＰＣ１６およびＵＭＰＣ
２０をそれぞれメタノールに所定の濃度に溶解し、試料
溶液とした。エッペンドルフチューブに、水１３μＬ、
１０倍量の反応緩衝液（５００ｍＭのトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）、１．２Ｍの塩化カリウム、１００ｍ
Ｍの塩化マグネシウム、５ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのジチ
オスレイトール、３００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミ
ン）２μＬ、キネトプラストＤＮＡ（ＫＤＮＡ）１．５
μＬ（１２５ｎｇ／μＬ）、ヒト・トポイソメラーゼII
α（TopoGEN製）１．５μＬ（２ｕｎｉｔｓ／μＬ）、
試料溶液２μＬを添加し、混合した。試料溶液の代わり
にエトポシド（ＶＰ１６：TopoGEN製）を添加したもの
を陽性対照、メタノールのみを添加したものを陰性対照
とした。３７℃で３０分間反応させた後、５倍量の反応
停止液（５％Sarkosyl、０．１２５％ブロモフェノール
ブルー、２５％グリセロール）を５μＬ添加し、混合し
た。１％アガロースゲルに反応液を負荷し、１００Ｖで
約３０分間電気泳動した。マーカーとして、予めトポイ
ソメラーゼIIで処理して脱連環したＫＤＮＡおよび制限
酵素（ＸｈｏＩ）処理したＫＤＮＡを同時に泳動した。
臭化エチジウム（ギブコ製）溶液（１μｇ／ｍＬ）中で
ゲルを振盪し、ＤＮＡを染色した後、ＵＶトランスイル
ミネーターで観察して、ポラロイド撮影し、ＤＮＡ量の
変化から５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を求めた。結果を図
３、図４および表２に示した。ＵＭＰＣ１６のトポII阻
害活性は、ＵＭＰＣ１６の濃度が２．５μＭを超える範
囲で認められた。３０μＭ以上の濃度では酵素活性は１
００％阻害され、また、１０μＭの濃度では、未反応の
ＤＮＡバンドと脱連環したＤＮＡバンドがほぼ等量検出
されたことから、ＵＭＰＣ１６のトポIIに対するＩＣ₅₀
はおよそ１０μＭと推察された。また、ＵＭＰＣ２０の
トポII阻害活性は、ＵＭＰＣ２０の濃度が１μＭを超え
る範囲で認められた。４μＭ以上の濃度では酵素活性は
１００％阻害され、また、２μＭの濃度では、未反応の
ＤＮＡバンドと脱連環したＤＮＡバンドがほぼ等量検出
されたことから、ＵＭＰＣ２０のトポIIに対するＩＣ₅₀
はおよそ２μＭと推察された。

【００３１】

【表２】

【００３２】試験例３：アデノシン５’−ヘキサデシル
ホスフェート（ＡＭＰＣ１６）のトポイソメラーゼＩお
よびII阻害活性の測定製造例３で得たＡＭＰＣ１６について、試験例１および
試験例２と同様に操作し、トポＩおよびトポII阻害活性
を調べた。その結果、表３に示すとおり、ＡＭＰＣ１６
は、トポＩおよびトポIIのいずれに対しても阻害活性を
示した。

【００３３】

【表３】

【００３４】以上のように、ＵＭＰＣ１６のトポＩに対
する阻害活性はＩＣ₅₀でおよそ１０μＭ、トポIIに対し
てもＩＣ₅₀でおよそ１０μＭと強い阻害活性を示した。
また、ＵＭＰＣ２０の阻害活性は、トポＩに対してのＩ
Ｃ₅₀はおよそ１００μＭとやや低いものの、トポIIに対
するＩＣ₅₀はおよそ２μＭと強い阻害活性を示した。ト
ポＩの陽性対照として用いたＣＰＴの阻害活性はトポＩ
に特異的であり、また、トポIIの陽性対照として用いた
ＶＰ１６の阻害活性はトポIIに特異的なものである。上
記試験例の結果、ＵＭＰＣ１６は、トポＩおよびトポII
のいずれに対しても阻害活性を示した。また、ＵＭＰＣ
２０の阻害活性は、ＶＰ１６と同様にトポIIにより強く
作用すると考えられる。その活性はＶＰ１６に比較して
４０倍強いものであった。ＡＭＰＣ１６においてもトポ
ＩおよびトポII阻害活性が認められたが、ＡＭＰＣの場
合は、トポＩ阻害活性の方がやや優れていた。これらの
ことから、ＵＭＰＣ１６、ＵＭＰＣ２０およびＡＭＰＣ
１６をはじめとする、ヌクレオチド５’−アルキル誘導
体は、トポイソメラーゼ阻害剤として有用であり、さら
に制癌剤として有用な物質であると考えられる。

【００３５】

【発明の効果】本発明によれば、式（Ｉ）で表されるヌ
クレオチドアルキル誘導体を有効成分として用いること
により、新規なトポイソメラーゼ阻害剤が得られ、これ
は、制癌剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】スーパーコイルを有する環状プラスミドＤＮ
Ａの弛緩を指標とした、ＵＭＰＣ１６のトポＩ阻害活性
を示す電気泳動パターン。

【図２】スーパーコイルを有する環状プラスミドＤＮ
Ａの弛緩を指標とした、ＵＭＰＣ２０のトポＩ阻害活性
を示す電気泳動パターン。

【図３】連環状ＤＮＡであるキネトプラストＤＮＡの
脱連環を指標とした、ＵＭＰＣ１６のトポII阻害活性を
示す電気泳動パターン。

【図４】連環状ＤＮＡであるキネトプラストＤＮＡの
脱連環を指標とした、ＵＭＰＣ２０のトポII阻害活性を
示す電気泳動パターン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｈ 19/10 Ｃ０７Ｈ 19/10 19/20 19/20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式（Ｉ）：【化１】（式中、Ｒ¹は直鎖または分岐鎖状アルキル基、Ｒ²はプ
リン塩基またはピリミジン塩基を示す。）で表されるヌ
クレオチドアルキル誘導体を含むトポイソメラーゼ阻害
剤。
【請求項２】Ｒ¹が炭素数３０を超えないアルキル基
である、請求項１記載のトポイソメラーゼ阻害剤。
【請求項３】Ｒ¹が炭素数４〜２４のアルキル基であ
る、請求項２記載のトポイソメラーゼ阻害剤。
【請求項４】Ｒ¹が炭素数１６のアルキル基である、
請求項３記載のトポイソメラーゼ阻害剤。
【請求項５】Ｒ¹が炭素数２０のアルキル基である、
請求項３記載のトポイソメラーゼ阻害剤。
【請求項６】Ｒ²がウラシルである、請求項１〜５の
いずれか１つに記載のトポイソメラーゼ阻害剤。
【請求項７】Ｒ²がアデニンである、請求項１〜５の
いずれか１つに記載のトポイソメラーゼ阻害剤。
【請求項８】ヌクレオチドアルキル誘導体が遊離形ま
たは生体内で遊離形を与え得る医薬的に許容される任意
形で使用される、請求項１〜７のいずれか１つに記載の
トポイソメラーゼ阻害剤。
【請求項９】制癌剤として使用するための、請求項１
〜８のいずれか１つに記載のトポイソメラーゼ阻害剤。