JP2002087938A - 養毛剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 脱毛抑制のための新規な養毛剤及びそのスク
リーニング方法の提供。 【解決手段】 ５αリダクターゼタイプ２に対する阻害
物質、形質転換成長因子β２に対する阻害物質、及びカ
スパーゼ−３に対する阻害物質の内の少なくとも２種類
を含む養毛剤；並びに５αリダクターゼタイプ２に対す
る阻害、形質転換成長因子β２に対する阻害、及びカス
パーゼ−３に対する阻害の内の少なくとも２種類の阻害
についてスクリーニングするか、あるいはカスパーゼ−
３に対する阻害についてスクリーニングし、次にアポト
ーシス抑制についてスクリーニングすることを特徴とす
る方法。この方法により、効率よく且つ高精度で、脱毛
抑制剤のスクリーニングを行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は養毛剤及びそのスク
リーニング方法に関し、さらに詳しくは毛周期の毛髪成
長期延長物質２種類以上の組合わせで含有する養毛剤、
及びその選択方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】男性の脱毛には男性ホルモン及びアポト
ーシスが関与することが知られている。一般に、細胞に
アポトーシスの信号が伝わると、複数のカスパーゼから
成るカスケードが活性化され、最下流において、前駆体
カスパーゼ−３からカスパーゼ−３が生成し、これが細
胞骨格タンパク質やＩＣＡＤ（In hibitor of Caspase-
Activatel DNAse)が切断することにより、細胞は不可逆
的な死（アポトーシス）に至ることが知られている。

【０００３】しかしながら、男性ホルモンの関与からカ
スパーゼによるアポトーシスに至る脱毛の過程は解明さ
れておらず、また脱毛とカスパーゼ−３との関係も解明
されていない。従って、脱毛機構の解明に基き合理的に
設計された養毛剤は知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、脱毛機構の
解明に基き、合理的に設計された養毛剤及びそのスクリ
ーニング方法を提供しようとするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決すべく種々検討した結果、男性型脱毛患者の前
頭部には５αリダクターゼタイプ２（５αＲ−II）が発
現しており、この酵素が、前頭でテストステロンからよ
り強力な男性ホルモンであるＤＨＴを産生し、この男性
ホルモンが毛乳頭細胞に働きかけ、形質転換成長因子β
２（TGF β２）産生を亢進し、TGF β２が毛包上皮細胞
においてカスパーゼ類を活性化し、アポトーシスを誘導
し、これにより毛周期における成長期から退行期への移
行、すなわちミニチュア化、軟毛化が促進され、脱毛に
至るという、一連のカスケード（退行期カスケード）を
解明した。

【０００６】そして、本発明者らは、この解明に基き、
新規な養毛剤及びそのスクリーニングを見出した。従っ
て本発明は、（イ）５αリダクターゼタイプ２（５αＲ
−II）に対する阻害物質、（ロ）形質転換成長因子β２
（TGF β２）に対する阻害物質、及び（ハ）カスパーゼ
−３に対する阻害物質、の内少なくとも２種類を組合せ
ることを特徴とする養毛剤を提供する。カスケードの下
流に位置する（ロ）形質転換成長因子β２（TGF β２）
に対する阻害物質と、（ハ）カスパーゼ−３に対する阻
害物質とを組合せるのが好ましい。

【０００７】本発明はまた、（イ）５αリダクターゼタ
イプ２（５αＲ−II）に対する阻害物質を選択するこ
と、（ロ）形質転換成長因子β２（TGF β２）に対する
阻害物質を選択すること、及び（ハ）カスパーゼ−３に
対する阻害物質を選択すること、の内少なくとも２種類
の選択を組合せることを特徴とする男性型脱毛に対する
抑制剤のスクリーニング方法を提供する。カスケードの
下流に位置する（ロ）形質転換成長因子β２（TGF β
２）に対する阻害物質の選択と、（ハ）カスパーゼ−３
に対する阻害物質の選択とを組合せるのが好ましい。

【０００８】しかしながら、上記の方法は、脱毛抑制剤
の一次スクリーニングとして、多数の被験物質の試験の
ためには好ましいが、目的とする物質を最終的に選択す
るためには精度に欠ける。従って、上記の方法により、
被験物質を一次スクリーニングして選択した後、より直
切的なアポトーシス阻害物質を選択するのが好ましい。
従って本発明はまた、カスパーゼ−３に対する阻害物質
を選択し、次にこれにより選択された物質についてマウ
ス表皮角化細胞の培養細胞におけるアポトーシスを抑制
する物質を選択することを特徴とする男性型脱毛に対す
る抑制剤のスクリーニング方法を提供する。

【０００９】

【発明の実施の形態】ヒトの毛髪の成長サイクルは５〜
６年間の成長期、２〜３週間の退行期及び２〜３箇月の
休止期を経て脱毛し、やがて新しい毛髪が発生してその
成長期が始まる。本発明者らはまず、TGF-β2 が退行期
を誘導・開始させること、すなわち成長期が短縮される
ことを実験的に証明した。すなわち、ヒト頭皮から得ら
れた成長期の毛包をTGF-β2 の存在下及び不存在下で器
官培養し、TGF-β2 の存在下で培養を行った場合に、自
然状態での退行期への移行と同様の形態的変化が生ずる
ことを確認した。

【００１０】また、成長期にあるヒト毛包及び退行期に
あるヒト毛包におけるTGF-β2 の分布を抗TGF-β2 抗体
を用いた免疫組織染色により観察し、成長期のヒト毛包
に比べて退行期の毛包に顕著にTGF-β2 が発現・分布し
ていることを見出した（実施例１）。さらに、TGF-β2
のアンタゴニストであることが知られている抗 -TGF-β
抗体及びフェチュイン（Fetuin）の存在下及び非存在下
で、ヒト毛包を器官培養し、毛の伸長を測定した。その
結果、抗 -TGF-β2 抗体又はフェチュインの存在下で
は、これらの不存在下に比べて毛の伸長が大であり、TG
F-β2 のアンタゴニストによりTGF-β2 が中和され、退
行期への移行が抑制されることが確認された（実施例
２）。

【００１１】本発明者らはさらに、ヒト退行期毛包をＴ
ＵＮＥＬ法により染色することにより、毛包が退縮する
際に毛母細胞にアポトーシスが生じていることを実施例
３において確認した。次に、毛髪サイクルの各期におけ
るカスパーゼ−３を観察したところ、毛髪サイクル全体
にわたってカスパーゼ−３が存在することが確認され、
カスパーゼ−３がアポトーシスにおいて機能しているこ
とが示唆された。

【００１２】そこで、ヒト毛包の器官培養において、カ
スパーゼ−３阻害物質であることが知られているカルボ
ベンゾキシ−バリル−アラニル−β−メチル−アスパル
−１−イル−フルオロメタン（ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）を
添加することによる毛の伸長と毛球部の形態の保持を観
察した。その結果、カスパーゼ−３阻害物質であるｚ−
ＶＡＤ−ｆｍｋが毛の伸長を促進し、毛球部の形態保持
に関与していることが確認され、カスパーゼ−３阻害物
質が毛周期における成長期を延長し、養毛効果を発揮す
ることが見出された。

【００１３】上記のことから、脱毛は、５αＲ−IIによ
る男性ホルモン（ＤＨＴ）の産生亢進、男性ホルモンに
よるTGF β２の産生亢進、TGF β２によるカスパーゼの
活性化、及びカスパーゼの活性化によるアポトーシスの
進行というカスケードを介して生ずることが明らかにな
った。従って、脱毛抑制のための養毛剤は、５αＲ−II
に対する活性阻害剤、TGF β２の作用抑制剤、及びカス
パーゼ類、特にカスケードの最下流にあるカスパーゼ−
３に対する阻害剤、からの２種類以上の組合せを含有す
ることが好ましい。

【００１４】さらに、脱毛抑制のための養毛剤は、５α
Ｒ−IIに対する活性阻害剤の選択、TGF β２の作用抑制
剤の選択、及びカスパーゼ類、特にカスケードの最下流
にあるカスパーゼ−３に対する阻害剤の選択のいずれ
か、特にこれらの２種類以上の選択の組合せによりスク
リーニングすることができる。５αＲ−IIの活性阻害
は、例えば次のようにして測定することができる。酵素
５αＲ−II液25μl 、サンプル25μl 及び放射性テスト
ステロン溶液（³H−テストステロン（１×10⁶ dpm)、テ
ストステロン１μM 、グルコース−６−リン酸（５mM)
、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（２ユニット／m
l）及びNADP（１mM））を37℃にて40分間インキュベー
トし、反応を停止させた後、反応生成物を薄層クロマト
グラフィーにより分離し、 dpmをカウントする。

【００１５】TGF β２の作用抑制は、例えば次のように
して測定することができる。TGF-β２がPA1-1 の産生を
誘導することを利用し、TGF-β２と被験物質との共存下
で細胞（例えば、毛乳頭細胞）を培養し、培地中のPA1-
1 を測定し、対照に比べてPA1-1 の上弁が抑制されたか
どうかを測定する。

【００１６】カスパーゼ−３の阻害は例えば次のように
して測定することができる。反応液用緩衝液として、例
えば25mM HEPES（pH.75)を用い、これに10％シュークロ
ース、0.1 ％の３−〔(3−コラミドプロピル）ジメチル
アンモニオ〕−１−プロパン・サルフォネート（CHAPS)
及び５mMジチオスレイトール（DTI)を含有せしめる。さ
らに基質として、合成した蛍光基質アセチル-Asp-Glu-V
al-Asp- メチルクマリンアミド（Ac-DEVD-MCA)を最終濃
度0.5mM に加える。次に、この溶液に被験試料を加え、
一定時間、一定温度において（例えば37℃にて30分間）
インキュベートし、反応停止液で反応を停止した後蛍光
計（励起：355nm ；放射：460nm)により測定することが
できる。

【００１７】本発明のアポトーシス抑制の測定は、例え
ば次のようにして行うことができる。まず、マウス表皮
角化細胞の培養細胞を調製する。すなわち、新生BALB／
ｃマウスの表皮角化細胞を、10％牛胎児血清（FCS)及び
５倍濃度のアミノ酸及びビタミンを含有する高栄養培地
（DMEM培地）中で培養を続ける。これにより細胞境界の
不明瞭な大きな細胞が優勢に増殖するが、培養表面の一
部には、重層しケラチンに被われた細胞密度の高い部分
が生ずる。上記細胞境界の不明瞭な大きな細胞をトリプ
シン処理により除去し、この操作を数ヶ月にわたり反復
し、重層を呈する細胞集団を集める。これがPam212細胞
である。継代の際には0.05％トリプシンと0.1 ％EDTAに
より細胞を剥離して分散せしめ、コンフルエントな細胞
を１：10に分割して新たなディッシュにまくと、２〜３
日で再びコンフルエントに達する。

【００１８】形態には正常な表皮より初代培養した角化
細胞の特徴を有している。すなわち円形ないし多角形を
呈する細胞が単層にコロニーを形成しながら増殖する。
一部は重層する傾向を示す。オーバーコンフルエントな
状態になると、細胞層全体がディッシュから剥離、脱落
することが多い。

【００１９】新生マウス表皮と同じ分子量（67，59，5
5，50kDa)のケラチンを発現する。オルニチン・デカル
ボキシラーゼ活性が初代培養表皮角化細胞より高く、ホ
ルボールエステル処理により顕著に増強される。同系の
新生マウスに接種すると100 ％の確率で扁平上皮癌を形
成し、寒天中での増殖能を獲得する。初代培養の表皮角
化細胞はCa²⁺濃度の高低により増殖、分化が調製される
が、Pam212ではその変化が明瞭でない。しかし、低濃度
のCa²⁺（＜0.1mM)中では細胞間結合を形成せず、また細
胞骨格にも変化が見られる。

【００２０】上記の細胞は、腫瘍壊死因子α（TNF α）
及びシクロヘキサミド（CHX)の存在下でアポトーシスを
生じ、浮遊死細胞を生ずる。従って、アポトーシス抑制
剤のスクリーニングにおいてはTNF α（10ng／ml) 及び
CHX （10μｇ／ml）を含有する10％FCS ＋DMEM培地中で
マウス表皮角化細胞の培養細胞、例えばPam212細胞を培
養し、この際に被験物質を添加した培養と、被験物質を
添加しない培養を行い、浮遊死細胞の発生状態を比較す
ればよい。

【００２１】

【実施例】次に、本発明を、実施例により具体的に説明
する。実施例１ ．５αＲ−IIが男性型脱毛患者の前頭部から得
られた毛乳頭細胞にのみ発現していることの確認 男性型脱毛患者の前頭部及び後頭部から得られた細胞の
mRHAを、５αＲ−Ｉ、５αＲ−II、AR、及びG3PPH 増幅
用プライマーによりPCR 増幅し、検出した結果を図１に
示す。この結果、５αＲ−IIは前頭部においてのみ発現
していることが確認された。

【００２２】実施例２．TGF-β2 が退行期の開始を促進
することの確認 （１）TGF-β2 による退行期開始の促進 Williams E培地（Gibco)にペニシリン、ストレプトマイ
シンおよびファンギゾン（Fungizone)の３種類の抗生物
質を加え、さらに10ng/ml ヒドロコーチゾン、10μg/ml
インシュリン、10ng/ml 五セレン酸ナトリウムおよび10
μg/mlトランスフェリンを添加した培地をインシュリン
含有培地、添加しない培地を基礎培地としてヒト毛包器
官培養に用いた。

【００２３】実体顕微鏡下でマイクロせん刃を用いて、
ヒト頭皮から成長期の毛包を単離した。単離した毛包は
基礎培地で洗浄したのち長さを測定し、インシュリン含
有培地（24穴のマイクロプレート使用：１穴あたり１m
l）中に沈ませて、37℃、5%CO ₂ を含む空気の気相条件
下で一晩培養した。再度長さを測定したのち、伸長が0.
25mm以上かつ成長期の形態が維持された毛包を選択し、
伸長が均等になるように10から12本づつの群に分けた。
それぞれの群について、被検物質を含む培地に交換した
のち、上記の気相条件下で培養を継続した。

【００２４】毛包の伸長は倒立顕微鏡の接眼鏡部にミク
ロメーターを挿入して経時的に測定した。毛包全体およ
び毛球部の写真は、倒立顕微鏡に接続したカメラによっ
て撮影した。培養２日目に、TGF-β2 を基礎培地に最終
濃度50μg/ml添加した培地に交換し、さらに５日間毛包
の伸長と形態変化を観察しながら培養を続けた。図２に
示す通り、培養６日目においてTGF-β2 を添加した毛包
は、無添加のコントロールに比べて退行期様の形態変化
が促進された。その他の増殖因子やサイトカインでは、
退行期様の形態変化が促進される現象は認められなかっ
た。従って、TGF-β2に退行期の促進作用があると考え
られた。

【００２５】なお、自然な頭髪における成長期から退行
期に移行する際の毛包の形態変化を図10に示す。図２と
図10との比較から、TGF-β2 により退行期への移行が促
進されたことが明らかである。

【００２６】（２）ヒト毛包におけるTGF-β2 の局在 ヒト頭皮組織または器官培養した毛包をPBS で洗浄した
のち、４％パラフォルムアルデヒド−リン酸バッファー
（pH7.2)で４時間固定し、エタノール系列で脱水、パラ
フィン包埋後、厚さ５μｍの組織切片を作製した。ヒト
毛包におけるTGF-β2 の役割を明らかにするため、ヒト
毛包におけるTGF-β2 の局在を調べた。ヒト毛包におけ
るTGF-β2 の局在の観察は、ヒト頭皮組織切片の抗TGF-
β2 抗体免疫染色により行った。

【００２７】脱パラフィン処理およびエタノール系列で
親水処理したヒト頭皮組織切片を用い、一次抗体として
抗TGF-β2 抗体（Santa Cruz）、二次抗体としてパーオ
キシダーゼ標識ウサギIgG を用いて、アビジン−ビオチ
ン−パーオキシダーゼ複合体法により、ヒト毛包におけ
るTGF-β2 の存在部位を免疫組織化学的に染色した。図
３に示す通り、TGF-β2 （の免疫染色性）は成長期後期
の毛包では外毛根鞘の最外層に認められた。一方、退行
期後期の毛包では、外毛根鞘最外層の細胞と毛乳頭上部
の退縮してゆく上皮系細胞にTGF-β2 （の免疫染色性）
が認められた。このことから、退行期後期においてTGF-
β2 が働いていると考えられた。

【００２８】（３）ヒト毛包の退行期初期におけるTGF-
β2 の局在 毛包が退行期に入ると毛母細胞の増殖は減少し、やがて
停止することから、退行期初期において毛母細胞の増殖
を抑制する物質が働いていると考えられる。ＴＧＦ−β
は上皮系細胞の増殖を強く抑制することが知られてお
り、退行期初期にＴＧＦ−βが働いて毛母細胞の増殖を
停止させ退行期を誘導する可能性がある。この可能性を
検証するには、退行期初期におけるＴＧＦ−βの局在を
明らかにする必要がある。

【００２９】ヒトの頭皮組織切片内に退行期初期の毛包
を見つけることは非常に困難であるが、５人の脱毛患者
から得られた1000枚以上の連続切片を解析することによ
り、退行期初期の変化を示すためＴＧＦ−βの染色を行
った。その結果、図４に示した通り、完全に成長期の形
態を保持していた毛包では、毛母や毛乳頭にTGF-β2
（の免疫染色性）はほとんど認められなかった。一方、
わずかに退行期の毛包に類似する形態変化を示した毛包
では、毛母と毛乳頭の境界部に強いTGF-β2 の免疫染色
性が認められた。このことから、TGF-β2 が働いて退行
期が誘導される年が明らかになった。

【００３０】毛包の器官培養法において、成長期の毛包
断片をインシュリン含有培地で培養した場合、約２週間
にわたって成長期の形態が保持されるのに対して、イン
シュリンを含有しない基礎培地で培養した場合には、毛
包は退行期の毛包に類似する形態に変化する。従って、
インシュリンを含有しない基礎培地で成長期の毛包を培
養し、わずかに形態変化が見られた毛包でのTGF-β2 の
局在を調べれば、退行期初期においてTGF-β2 が働いて
いるかを推定できる。そこで、１日だけ器官培養した
後、成長期の形態を保持していた毛包と、わずかに退行
期の毛包に類似する形態変化を示した毛包を、抗TGF-β
2 抗体により免疫染色した。その結果、図４と同様の変
化が実際にも起っていることが認められた。これを図５
に示す。

【００３１】実施例３ ．TGF-β2 抑制による毛髪退行期移行抑制効果 以上、ヒト毛周期においてTGF-β2 が働いて退行期が誘
導されると考えられたことから、成長期の毛包において
TGF-β2 の作用を抑制すれば、退行期への移行を妨げる
もしくは遅らせることができると考えられる。つまり、
TGF-β2 抑制による毛髪成長期延長効果が期待できる。
具体的には、ヒト毛包器官培養法においてTGF-β2 の作
用を抑制する物質を添加した場合に、毛伸長が促進され
る、もしくは退行期様の形態変化が抑制されるかどうか
で毛髪退行期移行抑制効果を検証した。

【００３２】（１）TGF-β中和抗体の影響 TGF-β中和抗体（ヒトTGF-β1 およびTGF-β2 の中和作
用を持つことが知られている）の毛髪退行期移行抑制効
果を検証した。方法は、ヒト毛包器官培養法に従った。
培養２日目に、TGF-βの中和作用を有する抗TGF-β抗体
(Genzyme社製）、またはコントロールのマウスIgG を、
基礎培地に最終濃度20μg/mlまたは100μg/mlになるよ
うに添加した培地に交換し、さらに４〜７日間毛包の伸
長と形態変化を観察しながら培養を続けた。図６に示し
たように、TGF-β中和抗体の添加で毛伸長が促進される
傾向が見られた。また、表１に示したように、TGF-β中
和抗体の添加で毛球部の形態が保持された毛包の割合が
上昇した。

【００３３】

【表１】

【００３４】 （２）シアロ糖タンパク質フェチュインの影響 シアロ糖タンパク質フェチュイン（分子量48,400）は、
哺乳動物胎児血清や、種々の疾患（特に外傷時）の成体
血中など存在する物質である。またフェチュインは、TG
F-βのレセプターに類似したアミノ酸配列と二次構造を
持ち、TGF-βのアンタゴニストとして働くことから（De
metriou M et al: J Biol Chem 271: 12755-12761, 199
6)、フェチュインの毛髪退行期移行抑制効果を検証し
た。

【００３５】フェチュイン（最終濃度1,10,50 μM)また
はコントロールのウシ血清アルブミン（最終濃度50μM)
を基礎培地に添加した培地に交換し、さらに７日間毛包
の伸長と形態変化を観察しながら培養を続けた。図７に
示したように、コントロールのウシ血清アルブミン添加
に比べて、フェチュイン添加で毛伸長は有意に促進され
た。これらTGF-β中和抗体とフェチュインの結果から、
TGF-β(2) 作用抑制による毛髪退行期移行抑制効果が実
証された。

【００３６】実施例４ ．退行期毛包におけるアポトーシスの確認 ヒト頭皮組織または器官培養した毛包をＰＢＳで洗浄し
たのち、４％パラフォルムアルデヒド−リン酸バッファ
ー（ｐＨ７．２）で４時間固定し、エタノール系列で脱
水、パラフィン包埋後、厚さ５μｍの組織切片を作製し
た。ヒト退行期毛包をＴＵＮＥＬ法で染色すると、毛乳
頭の周囲に存在する毛母細胞が染色されることから、毛
包が退縮する際に毛母細胞にアポトーシスが起こってい
ることが分かる（図８）。

【００３７】実施例５．前駆体カスパーゼ−３の分布 カスパーゼはすべて前駆体として生産され、カスケード
の上流に存在する分子によって切断されて活性化され
る。そこで、前駆体カスパーゼ−３に対する抗体を用い
て、毛包における前駆体カスパーゼ−３の局在を調べ
た。脱パラフィン処理およびエタノール系列で親水処理
したヒト頭皮組織切片を用い、一次抗体としてマウス抗
ヒト前駆体カスパーゼ−３抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ
社）、二次抗体としてパーオキシダーゼ標識マウスＩｇ
Ｇを用いて、アビジン−ビオチン−パーオキシダーゼ複
合体法により、ヒト毛包におけるカスパーゼ−３の存在
部位を免疫組織化学的に染色した。

【００３８】図９に示す通り、ヒト毛周期を通じて毛包
上皮系細胞の全域に前駆体カスパーゼ−３の免疫染色性
が認められた。このことから、毛包上皮系細胞は常にカ
スパーゼ−３を産生しており、毛包のアポトーシスにお
いてもカスパーゼ−３が働いているものと考えられた。

【００３９】実施例６．カスパーゼ−３の活性阻害によ
る毛髪成長期延長効果 毛母細胞を含む毛包上皮系細胞は常にカスパーゼ−３を
産生していることから、アポトーシスの刺激が毛包に伝
わり、毛乳頭周囲の毛母細胞でカスパーゼ−３の活性化
が起こると、これらの（毛母）細胞にアポトーシスが誘
導され、その結果、毛包は退縮（脱毛）へ至ると考えら
れる。

【００４０】このことから、カスパーゼ−３の活性を阻
害して毛母細胞や外毛根鞘細胞のアポトーシスを抑えれ
ば、毛包の退縮を妨ぐもしくは遅らせることができると
考えられる。つまり、カスパーゼ−３の活性阻害による
毛髪成長期延長効果が期待される。具体的な効果の検証
には、ヒト毛包器官培養法においてカスパーゼ−３の活
性を抑制する物質を添加した場合に、毛伸長が促進され
る、もしくは退行期様の形態変化が抑制されるかどうか
で毛髪成長期延長効果を検証した。

【００４１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）
にヘニシリン、ストレプトマイシンおよびファンギゾー
ル（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）の３種類の抗生物質を加え、
さらに１０ng／mlヒドロコーチゾン、１０μｇ／mlイン
シュリン、１０ng／ml亜セレン酸ナトリウムおよび１０
μｇ／mlトランスフェリンを添加した培地をインシュリ
ン含有培地、添加しない培地を基礎培地としてヒト毛包
器官培養に用いた。

【００４２】実体顕微鏡下でマイクロせん刃を用いて、
ヒト頭皮から成長期の毛包を単離した。単離した毛包は
基礎培地で洗浄したのち長さを測定し、インシュリン含
有培地（２４穴のマイクロプレート使用：１穴あたり１
ml）中に沈ませて、３７℃、５％ＣＯ₂ を含む空気の気
相条件下で一晩培養した。再度長さを測定したのち、伸
長が０．２５mm以上かつ成長期の形態が維持された毛包
を選択し、伸長が均等になるように１０から１２本づつ
の群に分けた。それぞれの群について、被検物質を含む
培地に交換したのち、上記の気相条件下で培養を継続し
た。

【００４３】毛包の伸長は倒立顕微鏡の接眼鏡部にミク
ロメーターを挿入して経時的に測定した。毛包全体およ
び毛球部の写真は、倒立顕微鏡に接続したカメラによっ
て撮影した。カルボベンゾキシ−バリル−アラニル−β
−メチル−アスパルト−１−イル−フルオロメタン（ｚ
−ＶＡＤ−ｆｍｋ）は、ほとんどすべてのカスパーゼを
阻害することが知られている。そこで、ｚ−ＶＡＤ−ｆ
ｍｋの毛髪成長期延長効果を器官培養法により検証し
た。ＤＭＳＯに溶解させたｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（最終濃
度１０，２０，１００μＭ）またはコントロールのＤＭ
ＳＯを基礎培地に添加した培地に交換し、さらに７日間
毛包の伸長と形態変化を観察しながら培養を続けた。図
10に示したように、コントロールのＤＭＳＯ添加に比べ
て、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ添加で毛伸長は促進された。ま
た、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ添加で、毛球部の形態が保持さ
れた毛包の割合が上昇した（表２）。

【００４４】

【表２】

【００４５】実施例７ ．カスパーゼ−３阻害剤のスクリーニング 10％のシュークロース、0.1 ％のCHAPS 及び５mM DTTを
含有する25mM HEPES緩衝液（pH 7.5) に基質Ac-DEVD-MC
A （アセチル-Asp-Gln-Val-Asp- メチルクマリンアミ
ド）を0.5mM を加えたもの16μｌに、被験サンプル２μ
ｌ及びカスパーゼ−３酵素液２μｌを加え、合計20μｌ
の反応混合物を37℃にて30分間インキュベートし、200
μｌの反応停止液を加えた後、蛍光計（励起波長355nm
；放射波長460nm)により測定した。

【００４６】被験試料としては、クアチャララーテ、コ
ンフリー、インジゴフェラ・チンクトリア・リン（Indi
gofera tinctoria Linn)、ナンバンサイカチ、オドリコ
ソウ、シコン、ハトムギ、コウチャ、トルメンチラ、シ
モツケソウ、ブドウ葉、ボダイジュ及びウーロンチャの
抽出液を用いた。結果を図10に示す。

【００４７】実施例８ ．アポトーシス抑制剤スクリーニング 新生BALB／ｃマウスの表皮角化細胞を、10％FCS 、並び
に５倍濃度のアミノ酸類及びビタミン類を含む高栄養培
地（DMEM培地）中で培養し、その結果、細胞境界の不明
瞭な大きな細胞が優勢となったが、部分的に、ケラチン
に被われた細胞密度の高い部分が生じた。細胞境界の不
明瞭な大きな細胞をトリプシン処理により除去し、この
操作を数ヶ月にわたって繰り返し、重層を呈する細胞集
団を分離し、Pam212細胞とした。

【００４８】上記のPam212細胞を、10ng／mlのTNF α及
び10μg ／mlのシクロヘキサミド（CHX)を含有するDMEM
＋10％FCS 培地中で培養し、アポトーシス発生実験系と
した。なお、Pam212細胞はTNF α及びCHX を含有する培
地中ではアポトーシスを生じさせるが、これらの添加物
を含有しない培地で培養した場合にはアポトーシスを生
じさせない。

【００４９】被験サンプルとして、TGF-２β抑制作用を
有することが知られているアマチャ抽出液、コンフリー
抽出液、シモノケソウ抽出液、クアチャララータ抽出
液、アマチャ抽出液とコンフリー抽出液の混合物、アマ
チャ抽出液とシモツケソウ抽出液の混合物、及びアマチ
ャ抽出液とクアチャララータ抽出液の混合物を用いた。
さらに、培養系にTNF α及びCHX を添加せず、さらに被
験サンプルも添加しないものと「対照」とし、TNF α及
びCHX を添加しない培養系に、被験サンプルを添加した
ものを、それぞれ、「シモツケソウ対照」、「アマチャ
対照］及び「クアチャララータ対照」とした。結果を表
３に示す。

【００５０】

【表３】

【００５１】その結果、実施例６においてカスパーゼ−
３阻害作用が認められたシモツケソウ抽出液及びクアチ
ャララータ抽出液、並びにTGF β２抑制作用を有するこ
とが知られているアマチャ抽出液にアポトーシス抑制効
果が認められた。

【００５２】実施例９．TGF-β２抑制作用を有するフェ
チュインとカスパーゼ−３阻害剤であるZ-VAD-fmk の併
用効果 TGF-β２抑制作用を有するフェチュイン、又はカスパー
ゼ−３阻害剤であるZ-VAD-fmk 、あるいはこの両者の存
在下で毛包を１週間培養した後の写真を図13に示す。両
者が共存した場合に非常によく毛包の形態が保存されて
いることがわかる。写真の下に示すごとく、両者の存在
下で退行期様変化を示す毛包の割合が明らかに低下し
た。

【００５３】

【発明の効果】以上の通り、カスパーゼ−３阻害及びア
ポトーシス抑制を指標とすることにより、脱毛抑制剤の
スクリーニングを効率よく、且つ高精度に行うことがで
きることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、男性型脱毛患者の前頭部のみに５αＲ
−IIが発現していることを示す電気泳動図であり、図面
代用写真である。

【図２】図２は、ヒト毛包をTGF-β2 の存在下で器官培
養した場合に退行期への移行が促進されることを示す写
真であり、生物の形態を示す図面代用写真である。

【図３】図３は、ヒト毛包の成長期及び退行期における
TGF-β2 の分布を示す写真であり、生物の形態を示す図
面代用写真である。

【図４】図４は、成長期から退行期におけるTGF-β2 の
変化（免疫染色）を示すものであり、生物の形態を示す
図面代用写真である。

【図５】図５は、ヒト毛包の退行期初期におけるTGF-β
2 の分布を示す写真であり、生物の形態を示す図面代用
写真である。

【図６】図６は、ヒト毛包を器官培養した場合の、抗 -
TGF-β2 中和抗体が毛の伸長に与える影響を示すグラフ
である。

【図７】図７は、ヒト毛包を器官培養した場合の、フェ
チュインが毛の伸長に与える影響を示すグラフである。

【図８】図８は、退行期における毛乳頭周囲の毛母細胞
がアポトーシスを起こしていることを示す、生物の形態
を表わす図面代用写真である。

【図９】図９は、ヒト毛周期にわたる前駆体カスパーゼ
−３の分布を示す、生物の形態を表わす図面代用写真で
ある。

【図１０】図１０は、ヒト毛包器官培養法におけるｚ−
ＶＡＤ−ｆｍｋの毛伸長への影響を示すグラフである。

【図１１】図１１は、成長期から退行期に自然に移行す
る場合の毛球部の形態変化を示す写真であり、生物の形
態を示す図面代用写真である。

【図１２】図１２は、各種植物抽出液のカスパーゼ−３
阻害作用を示すグラフである。

【図１３】図１３は、TGF-β2 抑制剤であるフェチュイ
ンとカスパーゼ−３阻害剤であるZ-VAD-fmk の共存下で
毛包の形態がよく保持されることを示す生物の形態を示
す図面代用写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 辻 弓子 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第二リサーチセンター内 (72)発明者 傳田 澄美子 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第二リサーチセンター内 (72)発明者 仲西 城太郎 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第二リサーチセンター内 Ｆターム(参考） 4C083 AA111 AA112 AD411 AD412 CC37 EE22 4C084 AA02 BA15 BA34 DC32 NA14 ZA922 4C088 AB12 AB51 AB66 BA08 NA14 ZA92

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （イ）５αリダクターゼタイプ２（５α
   Ｒ−II）に対する阻害物質、 （ロ）形質転換成長因子β２（TGF β２）に対する阻害
   物質、及び （ハ）カスパーゼ−３に対する阻害物質、の内、少なく
   とも２種類を組み合わせることを特徴とする養毛剤。
2. 【請求項２】 形質転換成長因子β２（TGF β２）に対
   する阻害物質、及びカスパーゼ−３に対する阻害物質を
   組合わせることを特徴とする、請求項１に記載の養毛
   剤。
3. 【請求項３】 TGF-β２に対する阻害剤がアマチャ抽出
   液であり、そしてカスパーゼ−３に対する阻害剤がシモ
   ツチソン抽出液又はクアチャララーテ抽出液である、請
   求項２に記載の養毛剤。
4. 【請求項４】 TGF-β２に対する阻害剤がフェチュイン
   であり、そしてカスパーゼ−３に対する阻害剤がZ-VAD-
   fmk である、請求項２に記載の養毛剤。
5. 【請求項５】 （イ）５αリダクターゼタイプ２（５α
   Ｒ−II）に対する阻害物質を選択すること、 （ロ）形質転換成長因子β２（TGF β２）に対する阻害
   物質を選択すること、及び （ハ）カスパーゼ−３に対する阻害物質を選択するこ
   と、の内、少なくとも２種類の選択を組み合わせること
   を特徴とする男性型脱毛に対する抑制剤のスクリーニン
   グ方法。