JP2002045192A

JP2002045192A - 核酸を検出するためのプローブおよび方法

Info

Publication number: JP2002045192A
Application number: JP2001173341A
Authority: JP
Inventors: James G Nadeau; ジェイムズ・ジー・ナデュー; Tobin J Hellyer; トビン・ジェイ・ヘルヤー
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 2000-06-08
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2002-02-12
Also published as: EP1162277A3; EP1162277A2; US6743582B2; CA2345979A1; US20020094527A1; EP1162277B1; US20020086306A1; US6316200B1; AU784489B2; AU5012601A; US20020102574A1; DE60118655D1; DE60118655T2; US6656680B2; ES2260119T3; US20050239084A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸標的配列を検出するための5'側アダプタ
ー配列を含む未標識シグナルプライマーを使用する。検
出システムは、その3'側末端がシグナルプライマーの5'
側アダプター配列の相補鎖にハイブリダイゼーションし
て5'側の突出した末端を作製するレポータープローブを
さらに含む。ポリメラーゼは突出した末端に充填し、レ
ポータープローブの5'側の突出した末端の相補鎖を合成
するために使用される。レポータープローブ相補鎖の合
成を直接的または間接的に標的の存在を示すものとして
検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の分野］本発明は、核酸標的配列を
検出するための材料と方法とに関する。

【０００２】［発明の背景］標識されたオリゴヌクレオ
チドの配列特異的なハイブリダイゼーションは、選択さ
れたヌクレオチド配列を検出して識別するための手段と
して長い間使用されている。このようなプローブを蛍光
標識で標識することはプローブハイブリダイゼーション
の検出を容易にするための比較的感度の良い、非放射性
の手段を提供している。最近開発された検出方法は、プ
ローブハイブリダイゼーションを検出するために、蛍光
強度の直接検出ではなく蛍光エネルギー移動（FET）の
過程を使用する。蛍光エネルギー移動は、一方（消光
剤）の吸収スペクトルが他方（ドナー）の発光スペクト
ルと重なり、2つの色素（dye）が非常に近い位置にある
場合に、ドナー蛍光団と（蛍光団であっても、蛍光団で
なくてもよい）消光色素との間で生ずる。これらの特性
を有する色素は、ドナー/消光剤色素対またはエネルギ
ー移動色素対と呼ばれる。ドナー蛍光団の励起状態のエ
ネルギーは、隣接する消光剤との共鳴双極子誘導性双極
子相互作用によって移動する。消光剤（「アクセプタ
ー」とも呼ばれる）も蛍光団である場合には、その蛍光
強度が増強される場合もある。エネルギー移動効率はド
ナーと消光剤との距離に大きく依存し、これらの関係を
予測する等式はForster(1948. Ann. Phys. 2, 55-75)に
よって展開されている。エネルギー移動効率が50%であ
るドナーと消光剤色素との距離はForster距離(R₀)と呼
ばれる。蛍光消光の他の機序は、例えば、電荷移動およ
び衝突消光を含むことも知られている。これらの場合に
は、消光剤は蛍光色素であってもよいが、必ずしもその
必要はない。FETに基づくものではない蛍光消光機序
は、典型的には、消光剤の吸収スペクトルとドナー蛍光
団の発光スペクトルとのある程度の重なりを必要としな
い。

【０００３】消光を生じるために近接した2つの色素の
相互作用を使用するエネルギー移動および他の機序は、
均一方式で実施することができるアッセイなど、ヌクレ
オチド配列を検出または識別するための魅力的な手段で
ある。均一アッセイ方式は、単一の蛍光標識の蛍光の検
出を使用する従来のプローブハイブリダイゼーションア
ッセイより簡単である。その理由は、異質アッセイは、
一般に、遊離標識からハイブリダイゼーションした標識
を分離する追加のステップを必要とするからである。典
型的には、FETおよびこれに関連する方法は、2つの相補
的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによ
って行われるとき、一方または両方の色素標識の蛍光特
性変化をモニタリングする。この方式では、蛍光特性の
変化は、典型的には、色素のうちの一つの蛍光強度の増
加として示されるように、エネルギー移動量の変化また
は蛍光消光量の変化として測定することができる。ハイ
ブリダイゼーションは、一方がドナー蛍光団で標識さ
れ、他方が消光剤で標識された2つの別個の相補的オリ
ゴヌクレオチド間で生じうる。2本鎖形態では、1本鎖オ
リゴヌクレオチドと比較して、ドナー蛍光が減少し（ま
すます消光する）および/またはエネルギー移動が増加
する。FETハイブリダイゼーションアッセイのいくつか
の方式は、Nonisotopic DNA Probe Techniques(1992. A
cademic Press, Inc., pgs. 311-352)に考察されてい
る。あるいは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼー
ションされない場合とオリゴヌクレオチドがその相補鎖
にハイブリダイゼーションされる場合とにおいて、一方
または両方の蛍光特性の検出可能な差が生ずるように、
ドナーおよび消光剤を1つのオリゴヌクレオチドに結合
することができる。この方式では、オリゴヌクレオチド
がハイブリダイゼーションされる場合には、ドナー蛍光
は典型的には増加し、エネルギー移動/消光は減少す
る。例えば、ドナーおよび消光色素で標識したオリゴヌ
クレオチドは、塩基対を形成して、エネルギー移動およ
び消光が生じてもよい、2つの色素を空間的に近接して
有するヘアピンを形成する自己相補的(self-complement
ary)配列を含有してもよい。第二のオリゴヌクレオチド
の相補鎖へのこのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションはヘアピンを妨害し、2つの色素間の距離を増
加させ、それによって消光しにくくする。TyagiおよびK
ramer(1996. Nature Biotech. 14, 303-308)およびB. B
agwell, et al.(1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-242
5; 米国特許第5,607,834号)を参照。核酸増幅を検出す
るための蛍光消光のエネルギー移動または他の機序を使
用する均一アッセイ方法も記載されている。L. G. Lee,
et al. (1993. Nuc. Acids Res. 21, 3761-3766)は、二
重標識したディテクタープローブがPCR中に標的増幅特
異的な様式で切断されるリアルタイムでの検出方法を開
示している。ディテクタープローブは、Taqポリメラー
ゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性がディテクタープロ
ーブを消化して、エネルギー移動対を形成する2つの蛍
光色素を分離するように、増幅プライマーの下流にハイ
ブリダイゼーションされる。プローブが切断されると蛍
光強度が増加する。

【０００４】増幅プライマーのハイブリダイゼーション
部位の下流の標的配列にハイブリダイゼーションするシ
グナルプライマー（ディテクタープローブと呼ばれるこ
ともある）は核酸増幅の均一検出のためのものとして記
載されてきた（引用することにより本明細書の一部をな
すものとする米国特許第5,547,861号）。シグナルプラ
イマーは、増幅プライマーの伸長と同様の様式でポリメ
ラーゼによって伸長される。増幅プライマーの伸長は、
標的増幅依存的な様式でシグナルプライマーの伸長産物
と置換して、標的増幅を示すものとして検出することが
できる2本鎖の二次的な増幅産物を作製する。1本鎖シグ
ナルプライマーを使用する均一検出方法の例は、米国特
許第5,550,025号（親油性色素および制限部位の導入）
および米国特許第5,593,867号（蛍光偏向検出）に記載
されている。さらに最近では、二次構造物のアンフォー
ルディングを使用するFET方法を使用して、核酸標的を
検出するためにシグナルプライマーが適用されている
（米国特許第5,691,145号および米国特許第5,928,869号
を参照）。ドナー/消光色素で標識した部分的1本鎖、部
分的2本鎖のシグナルプライマーについても最近では記
載されている。例えば、米国特許第5,846,726号は、ド
ナー/消光色素対が1本鎖制限エンドヌクレアーゼ認識部
位に隣接するシグナルを開示している。標的が存在する
場合には、制限部位は2本鎖になり、制限エンドヌクレ
アーゼによって切断される。切断することにより色素対
が分離されて、ドナー消光が減少する。

【０００５】米国特許第5,866,336号は、PCRにおいて増
幅プライマーに蛍光標識したヘアピンを使用することを
記載している。ヘアピンプライマーの3'側末端は、第二
のプライマーによって標的に付加される非標的配列の相
補鎖にハイブリダイゼーションする。このシステムで
は、ヘアピンプライマーは標的配列の増幅の必須部分を
なし、伸長可能でなければならない。一方、本発明で
は、レポータープローブは標的配列の増幅に関与しない
が、標的増幅と同時に生じる別個の系列の反応段階にお
いてシグナルを形成するので、レポータープローブは必
ずしも伸長可能でなくてもよい。さらにまた、本発明の
シグナルプライマーは標的の内部配列（すなわち、増幅
プライマー間）にハイブリダイゼーションするので、シ
グナル形成反応は標的の部分配列(subsequence)を検出
するが、増幅産物自体を検出しない。

【０００６】標的配列を検出する他の蛍光消光方法は、
1本鎖制限部位を含有するプローブの1本鎖標的への直接
的なハイブリダイゼーションによって作製される制限部
位の切断を使用する。日本国特許第93015439B号は、エ
ネルギー移動対を形成する2つの標識を標識した1本鎖ポ
リヌクレオチドプローブに1本鎖標的をハイブリダイゼ
ーションすることによって、ポリヌクレオチドを測定す
る方法を開示している。2本鎖ハイブリッドは制限酵素
によって標識の間で切断され、標識の一方の蛍光が測定
される。この方法の欠点は、プローブの制限部位も検出
される標的配列内に存在しなければならないことであ
る。S. S. Ghosh, et al. (1994. Nucl. Acids Res. 2
2, 3155-3159)は、蛍光共鳴エネルギー移動を使用して
分析される蛍光団標識オリゴヌクレオチドの制限酵素触
媒切断について記載している。これらのアッセイでは、
相補的なオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション
して、2本鎖制限部位を作製し、蛍光標識の一方は2本鎖
の各々に結合する。

【０００７】［発明の開示］本発明は、核酸標的配列増
幅を検出するためのシグナルプライマーを使用する。本
発明のシグナルプライマーは、米国特許第5,547,861号
（引用することにより本明細書の一部をなすものとす
る）に記載されているシグナルプライマーと構造が類似
しているが、未標識である。検出系は、その3'側末端が
シグナルプライマーの5'側末端配列の相補鎖にハイブリ
ダイゼーションして5'側に突出した末端（overhung）を
作製する標識レポータープローブをさらに含む。5'側の
突出した末端（レポーター部分）を形成するレポーター
プローブ領域は、突出した末端の相補鎖の合成の検出を
可能にする様式で標識される構造または配列を含む。好
ましくは、シグナルプライマーの伸長および相補鎖の合
成の前に蛍光が消光されるように、レポーター部分が蛍
光標識される。2本鎖にされるレポーター部分の相補鎖
の存在は、蛍光消光を直接低減させ、および/またはそ
の後の反応により消光を少なくするようにする。どちら
の機序でも、標識された構造または配列の相補鎖により
色素間の距離が増加する。ドナーの蛍光に関連する増加
または蛍光消光の低下に関連する別の蛍光パラメータの
変化は、標的配列の増幅を示すものとして検出すること
ができる。

【０００８】シグナルプライマーの5'側配列は、標的
（アダプター配列）にハイブリダイゼーションしない配
列を含む。アダプター配列は、異なる3'側標的結合配列
を有する種々のシグナルプライマーにおいて同一である
ように選択することができる（すなわち、「普遍的な」
5'側末端配列）。これにより、1つのレポータープロー
ブ配列を、任意の望ましい標的配列を検出するために使
用することができる。これは、標識のためのレポーター
プローブの合成がさらに複雑であるという点において有
利である。さらに、本発明は標的特異的シグナルプライ
マーの合成を単純にする。シグナルプライマーを標識し
ないので、異なる標的に特異的な、異なる標的結合配列
を有するシグナルプライマーをより容易に且つ効率的に
合成することができる。

【０００９】本明細書において使用する用語は以下のと
おりである。

【００１０】増幅プライマーとは、プライマー伸長によ
る標的配列の増幅のためのプライマーである。SDAで
は、増幅プライマー（標的結合配列）の3'側末端は標的
配列の3'側末端にハイブリダイゼーションする。増幅プ
ライマーは、5'側末端付近に制限エンドヌクレアーゼの
認識部位を含む。米国特許第5,455,166号、米国特許第
5,270,184号および欧州特許第0 684 315号に記載されて
いるように、認識部位が半改変（hemimodified）(「ニ
ッキング」)される場合には、認識部位は、DNA2本鎖の1
ストランドを切断する制限エンドヌクレアーゼのための
ものである。増幅反応を駆動するために特定の配列また
は構造は必要ではないので、PCRの増幅プライマーは標
的結合配列だけであってもよい。一方、3SRおよびNASBA
の増幅プライマーは、5'側末端付近にRNAポリメラーゼ
プロモーターを含む。このプロモーターは標的配列に追
加され、標的の多数のRNAコピーの転写を指示すること
によって、増幅反応を駆動する働きをする。

【００１１】伸長産物は、プライマーまたはプライマー
の一部およびプライマー結合部位の下流の配列の相補鎖
である新たに合成された鎖を含む。伸長産物は、相補的
配列を含有する鋳型へのプライマーのハイブリダイゼー
ションおよび鋳型を使用したポリメラーゼによるプライ
マーの伸長により生ずる。

【００１２】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れるまたは検出される核酸配列をいう。これらには、増
幅されるオリジナルの核酸配列、その相補的な第二の鎖
および複製または増幅によって作製されるオリジナルの
配列のコピーのどちらかの鎖が含まれる。標的配列は、
ハイブリダイゼーションされるプライマーを伸長するた
めの鋳型と呼ばれることもある。

【００１３】本発明によるシグナルプライマーは、標的
の相補的配列にハイブリダイゼーションする3'側標的結
合配列を含み、標的（アダプター配列）に相補的でない
5'側末端配列をさらに含む。アダプター配列は、その相
補的配列が以下に記載するようにレポータープローブの
3'側末端にハイブリダイゼーションするように選択され
る。本発明のいくつかの態様において、アダプター配列
は、以下に記載するように、その相補的配列がレポータ
ープローブの3'側末端とレポータープローブのレポータ
ー部分内の配列に結合するように選択される。本発明の
好ましい態様において、シグナルプライマーは検出可能
な標識を含まない。

【００１４】本発明によるレポータープローブは、好ま
しくは、少なくとも1つのドナー/消光色素対、すなわち
蛍光ドナー色素およびドナー蛍光団の消光剤である標識
を含む。標識は、標的配列に直接ハイブリダイゼーショ
ンしないレポータープローブの配列または構造（レポー
ター部分）に結合する。レポータープローブのレポータ
ー部分の3'側の配列は、シグナルプライマーアダプター
配列の相補鎖にハイブリダイゼーションするように選択
される。一般に、レポータープローブの3'側末端は、標
的配列との相補性のある配列を含有しない。しかし、レ
ポータープローブが、アダプター相補鎖にハイブリダイ
ゼーションする配列および標的相補鎖の短いセグメント
にハイブリダイゼーションする3'側末端の別の短い配列
を含有する場合もある。この場合には、標的相補鎖の領
域は、レポータープローブのアダプター特異的領域が同
時にハイブリダイゼーションされることなく、ハイブリ
ダイゼーションを可能にするほど大きくない。レポータ
ープローブの標識は、2本鎖にすることによって、標的
の存在または標的の増幅を示すレポーター部分の相補鎖
の存在を示すものとして検出される。レポータープロー
ブの3'側末端はポリメラーゼによる伸長を防止するよう
にキャップ形成されても、または伸長可能であってもよ
い。キャップ形成は、バックグラウンドシグナルと、プ
ライマーダイマーの形成および他の誤ったプライミング
事象により生じる偽の副反応における試薬の非生産的な
消費とを低下させることによって性能を増強しうる。

【００１５】本発明の方法により作製される、相補鎖の
存在が標的配列の存在を示すように標識することができ
る任意の核酸配列または構造は、レポータープローブの
レポーター部分として働くことができる。好ましくは、
ドナーの蛍光が標的の検出の前に消光され、標的の存在
を示すものとしてドナーの蛍光の消光が低下されるよう
に、レポーター部分はドナー/消光色素対で標識され
る。レポーター部分は、米国特許第5,928,869号に記載
されているステム-ループ（またはヘアピン）または米
国特許第5,691,145号に記載されているG-カルテット(G-
quartet)などの、レポータープローブの5'側末端の二次
構造であってもよい。二次構造が折りたたまれたときに
ドナーと消光剤が近い位置に存在して、ドナーの蛍光が
消光するように、二次構造を標識する。標的が存在する
場合に、二次構造は、ドナーと消光剤の間の距離が増加
するように、標的依存性プライマー伸長反応においてと
きほぐされる。これは消光を減少させ、標的配列の存在
を示すものとして検出することができるドナーの蛍光の
増加を生ずる。または、レポーター部分は、消光を引き
起こすのに十分に近い位置に存在するドナーおよび消光
剤で標識され、米国特許第5,846,726号および米国特許
第5,919,630号に記載されている1本鎖制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位(RERS)を含有するレポータープローブの
5'側末端の1本鎖配列であってもよい。1本鎖レポーター
プローブでは、RERSは切断可能ではない。しかし、標的
が存在する場合には、1本鎖RERSは、標的依存性プライ
マー伸長反応において2本鎖形態に変換され、それによ
って切断可能になる。適当な制限エンドヌクレアーゼに
よる処理は2つの色素間のRERSを切断し、それらを別個
の核酸断片に分離する。色素間の距離が関連して増加す
ることにより、標的配列の存在を示すものとして検出で
きるドナーの蛍光の消光が低下する。さらに別の実施態
様において、米国特許第5,846,726号および米国特許第
5,919,630号に教示されているように、標的依存的なプ
ライマー伸長反応において、RERSをニッキング可能にす
ることができる。この実施態様では、RERSが2本鎖にさ
れる場合には、制限エンドヌクレアーゼは、ドナーおよ
び消光剤が結合する鎖に切れ目を入れる（nick）。ポリ
メラーゼは切れ目（nick）から伸長し、レポータープロ
ーブから、色素の一方に結合した1本鎖断片を置換す
る。これはまた、ドナーと消光剤の距離を増加し、消光
の減少により、ドナーの蛍光が増加する。

【００１６】SDAに適用される本発明の方法の一実施態
様を図1Aに略図で例示する。反応の最初のステップは、
米国特許第5,547,861号に記載されているシグナルプラ
イマー反応に相当する。3'側標的結合配列(B)および非
相補的な5'側末端(A)を有するシグナルプライマーが増
幅プライマー(S₁)の下流の標的にハイブリダイゼーショ
ンする（ステップ1）。図1Aに示すように、シグナルプ
ライマーのハイブリダイゼーション部位全体が増幅プラ
イマーのハイブリダイゼーション部位の下流にある。し
かし、標的のシグナルプライマーのハイブリダイゼーシ
ョン部位と増幅プライマーのハイブリダイゼーション部
位は、本発明の方法に大きな影響を与えることなく、部
分的に（典型的に数ヌクレオチド）重なってもよい。本
明細書において使用する、標的のシグナルプライマーお
よび増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位に対
して「下流」という用語は、標的の重ならない部位およ
び部分的に重なる部位を含むことが意図される。標的へ
のハイブリダイゼーション後に、増幅プライマーおよび
シグナルプライマーは標的配列上で同時に伸長され、増
幅プライマーの伸長は1本鎖シグナルプライマー伸長産
物を置換する（ステップ2）。第二の増幅プライマー
(S₂)はシグナルプライマー伸長産物にハイブリダイゼー
ションし（ステップ3）、シグナルプライマー伸長産物
および増幅プライマーが共に伸長されて、一方の末端に
半改変された(hemimodified)RERSを有する2本鎖二次増
幅産物を作製する。SDAでは、RERSの未改変S₂鎖のニッ
キング（ステップ4において矢印で示す）およびニック
の下流の鎖の置換が、シグナルプライマーの相補鎖を含
む1本鎖オリゴヌクレオチドを作製する（ステップ5）。
シグナルプライマーの相補鎖および2本鎖二次増幅産物
は、標的が存在して増幅される場合にのみ作製される。
従って、それらは標的増幅を示すものとして検出するこ
とができる。

【００１７】米国特許第5,547,861号に教示される検出
方法では、2本鎖二次増幅産物が検出される。一方、本
発明は、ニッキング後に2本鎖二次増幅産物から置換さ
れる1本鎖オリゴヌクレオチドを検出する。このオリゴ
ヌクレオチドはシグナルプライマーの相補鎖を含むの
で、レポータープローブの3'側末端がそれにハイブリダ
イゼーションする（ステップ6）。標識された構造また
は配列を含有するレポータープローブの5'側末端は、ポ
リメラーゼの適当な基質である2つのへこんだ3'側末端
を有するオリゴヌクレオチドを形成する。レポータープ
ローブが伸長を防止するようにキャッピングされない場
合には、レポータープローブおよび1本鎖オリゴヌクレ
オチドは共に伸長されて完全な2本鎖分子を作製する
（ステップ7）。レポータープローブが伸長可能でない
場合には、（シグナルプライマーの相補鎖を含む）1本
鎖オリゴヌクレオチドのへこんだ3'側末端だけが伸長さ
れ、産物は一部1本鎖で、一部2本鎖である。どちらの場
合も、レポータープローブの標識された構造または配列
に相補的な配列が合成され、それを2本鎖にする。図1A
は、ドナー蛍光が消光されるようにドナー/消光色素対
で標識されたヘアピンレポーター部分を使用した本発明
を例示する。レポーター部分は2本鎖全体を検出される
ようにする必要がないことがこの例から考えられる。例
えば、ヘアピン構造の部分的な相補鎖は、ステムのアー
ムが互いにハイブリダイゼーションしないようにするの
に十分となりうる。本明細書において使用される、「2
本鎖レポーター部分」は、完全および部分的2本鎖レポ
ーター部分を含むが、ただしそれらはレポーター部分を
検出可能にするのに十分な2本鎖であることを意図して
いる。レポーター部分がプライマー伸長反応において2
本鎖にされる場合には、ヘアピンが巻き戻される。巻き
戻される結果、2つの色素は、消光剤によるドナー蛍光
の消光を低減させまたは除去するのに十分に間隔をおい
て分離される。その結果生ずるドナー蛍光の増加または
蛍光消光の変化に関連する別の蛍光パラメータ（蛍光寿
命、蛍光局在化または消光剤/アクセプター色素の発光
の変化）を標的配列の増幅を示すものとして検出するこ
とができる。また、図1Aに示すように、多数のレポータ
ー部分を1つのレポータープローブ中で組み合わせるこ
とができ、例えば標識されたヘアピンは1本鎖「ルー
プ」に1本鎖RERSを含むことができる。この実施態様で
は、レポーター部分の相補鎖の合成はヘアピンを巻き戻
して蛍光の増加を生じさせるだけでなく、RERSは同時に
切断可能またはニッキング可能になり、一般に追加の蛍
光の増加を生じる。

【００１８】図1Aに図示するように、レポータープロー
ブの折りたたまれたレポーター部分（例えば、ヘアピ
ン）はアダプター配列の相補鎖にハイブリダイゼーショ
ンしない。しかし、アダプター配列は、相補的配列がレ
ポータープローブの折りたたまれたレポーター部分の全
てまたは一部にハイブリダイゼーションするように選択
することができる。この場合では、ハイブリダイゼーシ
ョン後にポリメラーゼ触媒伸長を必要とすることなく、
ハイブリダイゼーションだけで、レポーター部分を全体
的または部分的に巻き戻す。この実施態様の折りたたま
れたレポーター部分はレポータープローブ配列の全体ま
たは一部を含むことができる。このような実施態様の例
において、レポータープローブは、Tyagi and Kramer、
上記によって記載される分子標識（molecular beacon）
であってもよく、標識ヘアピン（beacon hairpin）のル
ープはアダプター配列の全てまたは一部を含む。アダプ
ター配列の相補鎖は標的増幅中に合成されるので、それ
は分子標識(molecular beacon)に結合して、その構造を
巻き戻し、蛍光を増加させる。別の実施態様において、
増幅中に作製されるとき、1本鎖配列および折りたたま
れたレポーター部分の全てまたは一部がアダプター配列
に相補的な配列にハイブリダイゼーションするように、
レポータープローブは折りたたまれたレポーター部分の
3'側に1本鎖配列を含有する。

【００１９】他の別の実施態様では、他のレポーター部
分は図1Aに示す反応スキームにおいて置換することがで
きる。例えば、G-カルテット(G-quartets)などの他の折
りたたまれた核酸構造は、蛍光消光を減少させるのと同
様の標的依存性の様式で置換され、巻き戻すことができ
る。または、特殊化された線状配列を、例えばRERSのよ
うなレポーター部分として使用することができる。RERS
がレポーター部分として使用される場合には、ドナーお
よび消光剤は切断部位に隣接して結合される。その結果
RERSが2本鎖にされ、標的依存性の様式で切断されたと
き、2つの色素は別個の核酸断片に分離される（ステッ
プ8、図1A）。これらの別の二次構造も、G-カルテット
(G-quartets)のRERSなどの特殊化された配列と組み合わ
せることができる。あるいは、RERSは、2本鎖形態では
切断可能ではなく、ニッキング可能であってもよい。改
変されたヌクレオチドの導入およびニッキング可能なRE
RS'sの作製は増幅反応の必須部分であるため、これは、
SDAに使用するための特に好適な実施態様である。レポ
ータープローブ内でのニッキング可能なRERSの作製は図
1Aの反応スキームに追加の副反応を加える（図1Bに示
す）。図1Bは、図1Aのステップ7に例示する2本鎖分子の
RERSが切断されるのではなく、ニッキングされる場合の
反応を例示する。図1Bを参照すると、ポリメラーゼがニ
ッキング部位から伸長すると、2つの産物が作製され
る。すなわち、2本鎖分子が再生され（ここでは2つの色
素の一方だけを保有する）、ニッキング部位の下流の1
本鎖分子が置換される（ステップ9、2つの色素のうちの
他方を保有する）。2本鎖分子は再度ニッキングされ
て、別の1本鎖分子が置換され、置換された1本鎖分子が
増幅プライマーにハイブリダイゼーションし（ステップ
10）、伸長されて、完全な2本鎖分子においてニッキン
グ可能なRERSを作製することができる（ステップ11およ
び12）。さらなるニッキングおよび置換は、一方の末端
に以前のレポータープローブ由来の部分的RERSを有し、
標識を持たない1本鎖分子を作製する（ステップ13）。
これは新たなレポータープローブにハイブリダイゼーシ
ョンし（ステップ14）、ヘアピンがブリージングすると
き、へこんだ末端が伸長可能になり、部分的RERSをハイ
ブリダイゼーションさせる。へこんだ末端を埋める（fi
lling-in）とRERSがニッキング可能になり（ステップ1
5）、置換された1本鎖分子は反応に再度加わり、サイク
ルが反復する。これは、任意の別の標的増幅とは独立し
て生ずる別個の反応によって、1つのシグナルプライマ
ー/標的相互作用から最初に生じるシグナルを増幅す
る。

【００２０】一般に、シグナルプライマーのアダプター
配列の相補鎖とレポータープローブとの間の分子間塩基
対形成に関与する配列の鎖長は重大ではない。しかし、
シグナルプライマーでは、一般に、標的結合配列のT_mは
アッセイ効率により大きい影響を与えること、およびア
ッセイにおいてより長い標的結合配列は一般により蛍光
の強いシグナルを形成することが観察されている。これ
は、シグナルプライマーと標的配列にハイブリダイゼー
ションするための上流の増幅プライマーの伸長産物との
間の競合による場合がある。シグナルプライマーおよび
レポータープローブの適当な鎖長は、選択した反応条件
下において部分的な2本鎖分子を維持するための安定な
塩基対形成に必要なヌクレオチドの数によって決定さ
れ、当該技術の範囲内である。簡便にするために、塩基
対形成に関与する配列は、典型的には、鎖長が約8〜75
ヌクレオチドである。最大の鎖長は、オリゴヌクレオチ
ド合成および回収の容易さおよび効率などの実際の重要
性によってのみ限定される。

【００２１】反応におけるシグナルプライマーおよびレ
ポータープローブの適当な濃度の選択も当該技術の範囲
内である。好ましくは、シグナルプライマーおよびレポ
ータープローブの濃度は比較的高く、上流の増幅プライ
マーの濃度は比較的低い。その理由は、このようにする
ことで一般に反応において比較的大きい蛍光シグナルを
形成するからである。

【００２２】2本鎖標的配列の第二の相補鎖にハイブリ
ダイゼーションする第二のシグナルプライマーを、必要
に応じて、反応に加えることができるが、ただし、第一
および第二のシグナルプライマーは互いにハイブリダイ
ゼーションしない。第二のシグナルプライマーは第二の
増幅プライマーの下流の標的配列の第二の鎖にハイブリ
ダイゼーションし、伸長されて、第二の増幅プライマー
の伸長によって置換される。第二のシグナルプライマー
伸長産物は、第一の増幅プライマーのハイブリダイゼー
ションおよび伸長により2本鎖とされる。2本鎖標識構造
または配列の形成および色素対の分離は、標的配列の第
一の鎖と同様に進行する。第二のシグナルプライマー
は、好ましくは、第一のシグナルプライマーと同一の5'
側アダプター配列を含み、1つのレポータープローブに
よる両方の標的鎖の増幅産物の検出を可能にする。

【００２３】これに加え、必要がある場合には、標的の
ストランドあたり複数のシグナルプライマーを使用する
ことができ、各々同じストランドの他方の下流の標的配
列にハイブリダイゼーションし、全てのシグナルプライ
マーは増幅プライマーの下流にハイブリダイゼーション
される。このように、各シグナルプライマーは上流のデ
ィテクター核酸の伸長によって置換され、ほとんどの5'
側のシグナルプライマーは増幅プライマーによって置換
される。複数のシグナルプライマーを使用することは１
つの標的あたりに形成されるシグナルを増加または増幅
する利点を有し、アッセイ感度を増加させる。また、1
つのレポータープローブを使用して、全ての反応産物の
検出を可能にするために、シグナルプライマーの全てが
同じ5'側アダプター配列を含むことは好ましいが、必要
なことではない。

【００２４】複数の異なる標的配列を同時に検出するた
めに、多数のシグナルプライマーを使用することもでき
る。この場合では、シグナルプライマーの5'側アダプタ
ー配列は、好ましくは、検出される各標的について異な
る。各標的特異的シグナルプライマーの5'側アダプター
配列に特異的なレポータープローブを識別可能なドナー
/消光色素対で標識することによって、各標的に向けら
れるレポータープローブの蛍光消光の程度の変化を検出
することによって、あるいは各標的の存在を測定するこ
とができる。本発明のこの実施態様は、ある種の疾患状
態および状態に関連するものなどの1つのヌクレオチド
配列変種を検出するのに特に有用である。各シグナルプ
ライマーの標的結合配列は、標的の特定の配列変種に特
異的であるように選択することができる。標的にハイブ
リダイゼーションするための適切な標的結合配列を含む
シグナルプライマーだけがハイブリダイゼーションし、
伸長されて、アダプター配列の相補鎖が作製される。次
いで、そのアダプター配列の相補鎖に特異的なレポータ
ープローブが、どの配列変種が識別用標識により存在す
るかを示すシグナルを形成する。

【００２５】これに対し、多数の異なる標的を別個にア
ッセイするために、同じ5'側アダプター配列を多数の異
なる標的配列に向けるシグナルプライマーに使用するこ
とができる。異なる標的配列の特異性は、シグナルプラ
イマーの3'側標的結合配列を変更することによって与え
られる。この方法は、シグナルプライマーの設計および
合成を簡単にするだけでなく、任意の望ましい標的配列
を検出するために同じレポータープローブの使用を可能
にする。商業的には、これは、種々の標的ためのアッセ
イ系を作製するために1つだけのレポータープローブを
必要とし、それによって製造費用を削減し、新規標的の
アッセイの開発を単純化するという利点を有する。さら
に、それらは標識化を必要としないので、種々のシグナ
ルプライマーの合成が単純化され、低費用になる。

【００２６】SDA以外に、本発明のシグナルプライマー
を他のプライマー伸長増幅方法（例えば、PCR、3SR、TM
AまたはNASBA）に使用するために適合することができる
ことが明らかである。例えば、PCRにおいて、PCR増幅プ
ライマーを置換し、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を欠
損するストランド置換DNAポリメラーゼ（例えば、Prome
ga製のシーケンシンググレードTaqまたはNew England B
iolabs製のexo-Ventもしくはexo-Deep Vent）を使用す
ることによって本発明の方法をPCRに使用するために適
用することができる。シグナルプライマーは、PCR増幅
プライマーの下流の標的にハイブリダイゼーションす
る。それらは、本質的にSDAについて記載したように、
伸長され、標的から置換され、2本鎖にされる。シグナ
ルプライマー5'側アダプター配列の相補鎖を含む1本鎖
オリゴヌクレオチドは、2本鎖二次増幅産物を変性し、
次いでレポータープローブをハイブリダイゼーション
し、レポータープローブの標識されたレポーター部分の
相補鎖を合成するためのポリメラーゼ伸長によって作製
される。SDAシステムと同様に、相補鎖の合成はドナー
および消光色素の距離を変化させ、蛍光消光の程度を変
化させる。強度などの蛍光パラメータの関連する変化は
標的増幅を示すものとして働く。

【００２７】本発明の方法を3SR、TMAまたはNASBAに適
用するためには、鎖置換活性を有する5'-3'エキソヌク
レアーゼ欠損逆転写酵素を使用し、増幅プライマーの下
流のRNA標的にシグナルプライマーをハイブリダイゼー
ションする。以前に記載したものと同様の反応スキーム
では、ハイブリダイゼーションされるシグナルプライマ
ーは、1)伸長され、2)上流の増幅プライマーの伸長によ
って置換される。次いで、RNAポリメラーゼプロモータ
ーを含有する第二の増幅プライマーのハイブリダイゼー
ションおよび伸長によって、置換されたシグナルプライ
マー伸長産物を全体的に2本鎖にする。シグナルプライ
マー伸長産物の3'側末端を伸長することによって、第二
の増幅プライマーの5'側末端に位置するプロモーター配
列を2本鎖にする。2本鎖プロモーターから、RNAポリメ
ラーゼは、シグナルプライマー伸長産物に相補的なRNA
コピーを作製する。各RNAコピーの3'側末端は、シグナ
ルプライマーのアダプター配列に相補的な配列を含有す
る。次いで、この配列は、レポータープローブの相補的
領域にハイブリダイゼーションする。レポータープロー
ブが伸長可能である場合には、逆転写酵素はRNA鋳型に
対してプローブの3'側末端を伸長して、レポータープロ
ーブ伸長産物を作製する。次いで、RNase Hはこのヘテ
ロ2本鎖のRNA鎖を分解して、プロモーター配列を含有す
る第二の増幅プライマーとハイブリダイゼーションする
レポータープローブ伸長産物を遊離する。2本鎖形態へ
のプロモーター配列の変換は新たなラウンドのRNA合成
を開始し、レポーター部分配列全長を含むレポータープ
ローブ伸長産物に相補的である産物を産生する。レポー
タープローブのこれらのRNA標的へのハイブリダイゼー
ションはレポーター部分を巻き戻させ、ドナーおよび消
光色素が分離され、消光が低減するとシグナルを形成す
る。また、上記のように、レポータープローブがRNA標
的上で伸長され、サイクルが反復される。

【００２８】レポータープローブが伸長可能でない（キ
ャップされている）場合には、シグナルプライマーのア
ダプター配列は、アダプター配列の相補鎖がレポーター
プローブのレポーター部分にハイブリダイゼーションす
るように、配列を含有するように選択されなければなら
ない。反応は、キャップされたレポータープローブが伸
長されず、シグナルプライマー伸長産物のRNA相補鎖が
キャップされたレポータープローブ（レポーター部分を
含む）にハイブリダイゼーションすることを除いて、上
記のように進行する。レポーター部分が巻き戻るとシグ
ナルが形成され、ドナー蛍光の消光はハイブリダイゼー
ション中に軽減される。

【００２９】バックグラウンドを低くするためには、本
発明のシグナルプライマーが上記のように使用され、シ
グナルプライマー伸長産物が、上流の増幅プライマーの
伸長により置換されることによって標的配列から分離さ
れることが好ましい。しかし、プライマーが適当なアダ
プター配列を含有する場合には、種々の核酸増幅反応に
使用するために周知の増幅プライマーをレポータープロ
ーブのハイブリダイゼーションに使用することができる
ことが明らかである。この実施態様では、SDAプライマ
ーのアダプター配列は、SDAを駆動するニッキング可能
な制限エンドヌクレアーゼ部位と標的結合配列の間に位
置する。このプライマーを有するSDAは、レポータープ
ローブに相補的な3'側末端配列に含有する増幅された産
物を作製する。この相補的配列へのレポータープローブ
の結合は上記のようにシグナルを形成する。PCRおよびN
ASBAのためには、シグナルプライマーについて上記した
非相補的5'側末端を付加することによって増幅プライマ
ーを改変する。NASBAの場合には、RNAポリメラーゼプロ
モーターを欠損するプライマーは5'側アダプター配列で
改変されたプライマーである。PCRおよびNASBA中、アダ
プター含有プライマー伸長産物の相補鎖はシグナルプラ
イマーについて上記したように作成される。これらの相
補的な配列は、熱変性（PCR）またはRNA鋳型の酵素消化
（NASBAのRNase H）によって1本鎖にされ、1本鎖相補鎖
は次いで、シグナルプライマーについて上記したように
レポータープローブに結合する。シグナルプライマーと
しての増幅プライマーを使用すると、反応に追加のシグ
ナルプライマーの必要がなくなるが、この実施態様では
バックグラウンドが高くなる場合があるので、アッセイ
の感度は低下することがある。

【００３０】他の別の実施態様では、本発明のシグナル
プライマーを、標的配列を検出する非増幅系アッセイ方
式に使用することができる。第一の非標的増幅実施態様
では、5'側アダプター配列が5'側の突出した末端を形成
するように、シグナルプライマーの3'側1本鎖標的結合
配列は標的配列の3'側末端にハイブリダイゼーションす
る。標的配列は、鋳型として5'側の突出した末端を使用
して標的配列を伸長するためにポリメラーゼを使用し
て、シグナルプライマーに相補的なストランドを合成す
るためのプライマーとして機能する。シグナルプライマ
ーの標的結合配列が標的配列の一部だけにハイブリダイ
ゼーションする場合には、標的配列も5'側の突出した末
端を形成し、シグナルプライマーは鋳型として標的の5'
側の突出した末端を使用して同様に伸長されうる。また
は、標的配列のコピーの合成は本発明のこの実施態様で
は必要ないので、シグナルプライマーは伸長可能でなく
でもよい。どちらの場合も、シグナルプライマーのアダ
プター配列の相補鎖が合成される。2つの鎖が分離され
る結果、標的のシグナルプライマーアダプター配列の相
補鎖はレポータープローブの3'側末端にハイブリダイゼ
ーションし、アダプター配列相補鎖のへこんだ3'側末端
のポリメラーゼ伸長の結果、標識したレポーター部分を
2本鎖にする。米国特許第5,866,336号に記載されている
反応を上回るこの実施態様の利点は、突出した末端を使
用することにより、2つステップではなく1つの伸長ステ
ップにおいてアダプター配列の相補鎖の合成を可能にす
ることである。すなわち、アダプター配列の相補鎖は元
の標的に直接追加され、それによって増幅する必要なく
標的の検出を可能にする。本発明の第二の好ましい非標
的増幅実施態様では、シグナルプライマーは標的の内部
配列にハイブリダイゼーションされ、追加のプライマー
が上流にハイブリダイゼーションし、それと置換する
（通常、「バンパー（bumper）」プライマーと呼ばれ
る）。シグナルプライマーおよびバンパープライマー
は、シグナルプライマー伸長産物が標的配列から置換さ
れるように伸長される。下流のプライマー伸長産物がア
ダプター配列の相補鎖を含有し、バンパープライマーの
伸長によってシグナルプライマー伸長産物から置換され
るように、第二のプライマー対が伸長産物にハイブリダ
イゼーションされ、伸長される。レポータープローブは
アダプター配列の相補鎖にハイブリダイゼーションし、
レポーター部分の相補鎖を合成するために本明細書に記
載するようにアダプター配列は伸長される。これは、相
補鎖を分離するためにストランド置換に依存する等温反
応であるので、第一のバンパープライマーの伸長は標的
を2本鎖にし、任意のさらなる反応ステップに関与不可
能にする。コピーが作製され、置換されるが、コピー
は、標的の存在を示すものとして検出される元の標的の
サブ配列であり、サブ配列の1コピーだけが元の標的配
列あたり作製されるので、これは標的増幅と考えられな
い。

【００３１】前述の開示は、レポーター部分が蛍光ドナ
ー/消光色素対で標識され、レポーター部分の相補鎖の
合成は蛍光の増加によって検出される好ましい実施態様
に主に関する。この標識系により相補鎖の合成はリアル
タイムおよび/または均一アッセイ（すなわち、検出の
前に標識を分離しない）で検出することができる。しか
し、本発明に有用な他の標識は当業者に明らかである。
例えば、1つの蛍光標識はレポーター部分に使用するこ
とができ、レポーター部分の相補鎖が存在する場合には
蛍光局在化の変化が検出される（米国特許第5,593,867
号）。非蛍光標識も有用である。例えば、レポーター部
分は親油性色素で標識することができ、レポーター部分
の相補鎖が存在する場合には切断される制限部分を含有
する（米国特許第5,550,025号参照）。または、レポー
タープローブは放射性標識されてもよく、レポーター部
分の相補鎖の合成によって生ずる産物は電気泳動によっ
て分離され、オートラジオグラフィーによって可視化す
ることができる。免疫学的標識を使用することもでき
る。最初に未反応のレポータープローブを除去すること
により（例えば、固相のアダプター特異的捕獲）、次い
で標準的な化学発光または比色ELISAsを使用して、反応
したレポータープローブのハプテン標識を検出すること
により、レポーター部分の相補鎖の合成の後に、ハプテ
ンで標識したレポータープローブを検出することができ
る。ビオチン標識をハプテンと置換し、当技術上周知の
方法を使用して検出してもよい。

【００３２】レポーター部分の相補鎖の存在を示す標識
は、反応の選択されたエンドポイントとして検出するこ
とができる。しかし、ドナーと消光剤との距離が長いオ
リゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションおよびプラ
イマー伸長と同時に作製されるので、標識は、反応が生
じているとき、すなわち「リアルタイム」でモニターす
ることもできる。この均一リアルタイムアッセイ方式
は、存在する標的の最初の量についての半定量的または
定量的情報を提供するために使用することができる。標
識（例えば、蛍光強度）が反応中に変化する速度（標的
増幅の一部として、または非増幅検出方法において）
は、最初の標的レベルを示すものである。結果として、
標的配列の最初のコピー数が多く存在する場合には、標
識はより迅速に選択された閾値に到達する（すなわち、
正値性への時間が短い）。また、反応経過中の標識の変
化速度は、最初の標的含有量が少ない試料より最初の標
的含有量が多い試料においてより急速である。これらの
測定値または当技術上周知の他の測定値は、標的の存在
を示すものまたは標的増幅を示すものとなる。標的の最
初の量は、典型的には、実験結果を既知量の標的の結果
と比較することによって測定される。

【００３３】当技術上周知の多数のドナー/消光色素対
は本発明の好ましい実施態様において有用である。これ
らには、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(F
ITC)/テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRIT
C)、FITC/Texas Red^TM(Molecular Probes)、FITC/N-ヒ
ドロキシスクシンイミジル1-ピレンブチレート(PYB)、F
ITC/エオシンイソチオシアネート（EITC）、N-ヒドロキ
シスクシンイミジル1-ピレンスルホネート(PYS)/FITC、
FITC/ローダミンX、FITC/テトラメチルローダミン(TAMR
A)等が挙げられる。特定のドナー/消光剤対の選択は重
大ではない。エネルギー移動消光機序では、ドナー蛍光
団の発光波長が消光剤の励起波長と重なる、すなわち効
率的なエネルギー移動、電荷移動または蛍光消光を可能
にするために、2つの色素間に十分なスペクトルの重な
りが存在しなければならない。P-(ジメチルアミノフェ
ニルアゾ)安息香酸（DABCYL）は隣接する蛍光団、例え
ばフルオレセインまたは5-(2'-アミノエチル)アミノナ
フタレン（EDANS）からの蛍光を効果的に消光する非蛍
光消光色素である。ある種のドナー/消光剤対は上記に
例示されているが、以下の実施例では、他のものが当業
者に明らかであり、本発明にも有用であることがわか
る。本発明のレポータープローブにおいて蛍光消光を生
ずる任意の色素対は、消光が生じる機序にかかわらず、
本発明の方法に使用するのに好適である。末端および内
部の標識方法も当技術上周知であり、レポータープロー
ブのそれぞれの部位にドナーおよび消光色素を結合する
ために通常使用することができる。

【００３４】［実施例1］本発明によるシグナルプライ
マーを含有するストランド置換増幅（Strand Displacem
ent Amplification）反応は、合成標的配列を検出する
ために米国特許第5,547,861号に実質的に記載されてい
るように実施された。最初の反応は、10⁶コピーの標的
配列と、合成標的配列の増幅に適当なSDA増幅プライマ
ーと、標的に特異的な標的結合配列およびレポータープ
ローブの3'側配列と同一の5'側末端配列を含む本発明に
よる100 nmのシグナルプライマーと、200 nmのレポータ
ープローブとを含有した。RERSが無傷である場合に、フ
ルオレセインの蛍光が消光するように、レポータープロ
ーブの配列はフルオレセインおよびローダミンX(Rox)が
隣接する5'側領域にRERSを含有した。シグナルプライマ
ーおよびレポータープローブの配列（5'側から3'側方向
に示す）を以下に示す。標的結合配列は斜字体で示し、
シグナルプライマーの5'側アダプター配列およびレポー
タープローブの同一の3'側配列は下線をつけ、レポータ
ープローブのRERSは太字で示す。シグナルプライマー
（配列番号1）は、以下のとおりである。

【化１】レポータープローブ（配列番号2）は、以下のとおりで
ある。

【化２】

【００３５】第二の反応は標的を含有せず、第一の反応
と同じシグナルプライマーを含有した。第三の反応は、
10⁶コピーの標的およびレポータープローブだけを含有
する（すなわち、シグナルプライマーを含有しない）対
照反応であった。フルオレセインの蛍光は、増幅反応中
リアルタイムで検出された。図2に示すように、ドナー
蛍光は、標的が存在しない場合には低く、一定のまま
で、レポータープローブのRERSが2本鎖形態に変換され
て、切断されないことにより、反応中蛍光が消光したこ
とを示している。シグナルプライマーが存在しない場合
にも、ドナー蛍光は増幅反応中消光されたままであっ
た。しかし、標的、シグナルプライマーおよびレポータ
ープローブが存在する場合には、ドナー蛍光は、最初は
低いが、レポータープローブのRERSが2本鎖形態に変換
されて、切断されて蛍光消光程度を低下すると、増幅反
応の時間経過中に増加した。これらの結果は、本発明の
シグナルプライマーおよびレポータープローブは、蛍光
消光程度の変化をモニタリングすることによって核酸標
的配列を検出するために使用することができることを証
明している。

【００３６】同様の実験において、各々同じ配列を有す
るが、異なるドナー/消光色素対で標識されている、2つ
のレポータープローブの一方と種々のシグナルプライマ
ーを組み合わせたものを使用して、0および250コピーの
クローニングされたHIV標的DNAを検出した。シグナルプ
ライマーおよびレポータープローブの配列は以下に5'側
から3'側方向に示す。標的結合配列は斜字体で示し、シ
グナルプローブの5'側アダプター配列およびレポーター
プローブの同一の3'側配列は下線をつけ、レポータープ
ローブのRERSは太字にしてある。シグナルプライマー
は、以下のとおりである。

【化３】レポータープローブ（配列番号15）は、以下のとおりで
ある。

【化４】

【００３７】シグナルプライマーは、鎖長およびT_mにつ
いて、標的結合配列およびレポーター結合配列と異なっ
ていた。フルオレセインの蛍光を増幅中モニターした。
レポータープローブ/シグナルプライマーの組み合わせ
を比較するために、結果は蛍光曲線下免疫または「MOT
A」として表した。曲線より下の面積が大きいほど、特
定のレポータープローブ/シグナルプライマー組み合わ
せによって形成される蛍光が大きく、増幅された産物の
検出効率が高い。両方のレポータープローブは、HIV標
的を検出するために全てのシグナルプライマーと組み合
わせるとよく作動するが、性能は、一般に、アピンレポ
ーター部分を含有するレポータープローブほどよくな
い。しかし、これらの線状レポータープローブは、二次
構造を含有するレポータープローブより短いので、高収
率でより容易に合成される。フルオレセインダブシル(d
abcyl)レポータープローブを使用すると、より高いMOTA
値が得られ、これはこの色素対がより高い消光効率を有
することを示唆している。

【００３８】［実施例2］SDA反応は、実施例1に示す異
なるシグナルプライマーと、0または5,000コピーのクロ
ーニングされたHIV標的と、レポータープローブとを含
有するように調製した。レポータープローブの配列は以
下のようであった。

【化５】

【００３９】配列番号16は、ヘアピン構造の1本鎖ルー
プの5'側末端にBsoBI RERSを含有する。SDA反応は、500
nmのSDA増幅プライマーと、50 nMのバンパープライマ
ーと、200 nMのシグナルプライマーと、200 nMのレポー
タープローブとを含有した。ローダミンの蛍光を増幅中
モニターした。各シグナルプライマー/レポータープロ
ーブの組み合わせでは、ローダミンの蛍光は、増幅反応
中に標的が存在する場合に増加した。標的が存在しない
場合には、ローダミンの蛍光は反応中低下したままであ
った。反応の1つの結果を、配列番号3のシグナルプライ
マーについて示す。多数の曲線は複製試料を表す。結果
は、アダプター配列の鎖長およびTmはアッセイ性能に有
意に影響しないことを示した。しかし、シグナルプライ
マーの標的結合配列のT_mはシグナル形成に影響を与え、
より長い標的結合配列を含むシグナルプライマーはより
短い標的結合配列を有するものより性能がよかった。

【００４０】配列番号16を含む、3つの異なるレポータ
ープローブを使用して、実験を繰り返して行った。追加
のレポータープローブは以下のとおりであった。

【化６】

【００４１】この実験では、上流の増幅プライマーの濃
度を100 nMに低下した。増幅は、0または250コピーの標
的DNAが存在する場合に実施した。標的を含有する反応
は、5分ほどのインキュベーション後にフルオレセイン
蛍光の急速な増加を示した。一方、標的を含有しない反
応は、反応期間中、低いフルオレセイン蛍光を示した。
配列番号8および配列番号17を含有する反応の結果を図3
Bに示す。複数の曲線は複製試料である。レポータープ
ローブ/シグナルプライマーの組み合わせ配列番号16/配
列番号4および配列番号17/配列番号8は同様のMOTA値
（それぞれ、62,147および66,051）を示したが、配列番
号18/配列番号12の組み合わせは効率が低く（MOTA=49,8
79）、より短いプローブおよびプライマーの鎖長による
ハイブリダイゼーションおよび変換効率の低さを示唆し
ている。

【００４２】［実施例3］この実験では、ヘアピンおよ
び切断可能ではなくニッキング可能なBsoBI RERSを含む
レポータープローブをSDAにおいて試験した。レポータ
ープローブは以下の配列（配列番号19、TBD13.）を有し
た。

【化７】

【００４３】このレポータープローブを、増幅反応にお
いてシグナルプライマーとして配列番号4と共に使用し
た。HIV標的DNAが存在する場合には、48,000の平均MOTA
値が得られ、これと比較して、陰性対照のスコアーは15
0より低かった。同じ3'側末端配列を有するレポーター
プローブ配列番号16と比較したとき観察されたより低い
MOTAスコアーは、BsoBI部位のニッキング後の残存する
短いオリゴヌクレオチドのポリメラーゼの不十分なプラ
イミングによることがある。反応の性能は、このオリゴ
ヌクレオチドを安定化し、ポリメラーゼの結合のための
より大きい領域を提供するためにヘアピンの鎖長を延長
することによって増強することができる。

【００４４】［実施例4］この実験では、G-カルテット
（G-quartet）構造およびレポーター部分としてRERSを
含有するレポータープローブを使用してSDAを実施し
た。このレポータープローブは以下の配列（配列番号2
0、TBD14）を有した。

【化８】

【００４５】250コピーのHIV標的DNAの増幅経過中、フ
ルオレセイン蛍光の増加が観察された。標的が存在しな
い場合には、このような蛍光の増加は観察されなかっ
た。

【００４６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Nadeau, James G. Hellyer, Tobin J. <120> Probes and Methods for Detection of Nucleic Acids <130> Universal Reporter <140> <141> <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic sequence for experimental model <400> 1 ccaaaatgac agcttctgat ggaatgactc actgagttgg aacgt 45 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic sequence for experimental model <400> 2 tacctcgagt gcagccaaaa gacagcttct gatggaa 37 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 3 gaaagacgtt agccaccata cggatacccc ttttctttta aaattgtg 48 <210> 4 <211> 52 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 4 gaaagacgtt agccaccata cggatacccc ttttctttta aaattgtgga tg 52 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 5 gaaagacgtt agccaccata cggatacccc ttttctttta aaatt 45 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 6 gaaagacgtt agccaccata cggatacccc ttttctttta aaattg 46 <210> 7 <211> 43 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 7 acgttagcca ccatacggat accccttttc ttttaaaatt gtg 43 <210> 8 <211> 47 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 8 acgttagcca ccatacggat accccttttc ttttaaaatt gtggatg 47 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 9 acgttagcca ccatacggat accccttttc ttttaaaatt 40 <210> 10 <211> 41 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 10 acgttagcca ccatacggat accccttttc ttttaaaatt g 41 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 11 agccaccata cggatacccc ttttctttta aaattgtg 38 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 12 agccaccata cggatacccc ttttctttta aaattgtgga tg 42 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 13 agccaccata cggatacccc ttttctttta aaatt 35 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 14 agccaccata cggatacccc ttttctttta aaattg 36 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 15 tgcccgagtg aaagacgtta gccaccatac ggat 34 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 16 tagtgcccga gcactgaaag acgttagcca ccatacggat 40 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 17 tagtgcccga gcactacgtt agccaccata cggat 35 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 18 tagtgcccga gcactagcca ccatacggat 30 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 19 tagtgctcgg gcactgaaag acgttagcca ccatacggat 40 <210> 20 <211> 43 <212> DNA <213> Human immunodeficiency virus <400> 20 ggttggctcg aggttggtga aagacgttag ccaccatacg gat 43

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】本発明の方法によるストランド置換増幅(Str
and Displacement Amplification(SDA))反応における核
酸標的配列の検出を例示する。

【図１Ｂ】レポータープローブ中の蛍光標識した配列が
ニッキング可能なRERSである場合に生じうる追加の反応
段階を例示する。

【図２】実施例1の結果を例示する。

【図３Ａ】実施例2の結果を例示する。

【図３Ｂ】実施例2の結果を例示する。

フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ＢＥＣＴＯＮＤＲＩＶＥ，ＦＲＡＮＫＬＩＮＬＡＫＥＳ，ＮＥＷＪＥＲＳＥＹ 07417−1880，ＵＮＩＴＥＤＳＴＡＴＥＳＯＦＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者ジェイムズ・ジー・ナデューアメリカ合衆国メリーランド州21042，エリコット・シティ，クロムウェル・コート 10311 (72)発明者トビン・ジェイ・ヘルヤーアメリカ合衆国メリーランド州21117，オーウィングズ・ミルズ，ローヤルティ・サークル 110 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA14 CA04 CA09 HA12 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ01 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR42 QR56 QR62 QS25 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 a)標的配列に、アダプター配列を含むシ
グナルプライマーをハイブリダイゼーションすることに
よって、アダプター配列の相補鎖を作製するステップ
と、 b)該アダプター配列の相補鎖に、レポーター部分を含む
レポータープローブをハイブリダイゼーションすること
によって、2本鎖レポーター部分を作製するステップ
と、 c)該標的配列の存在を示すものとして、該レポーター部
分の該相補鎖の合成を検出するステップとを含む核酸標
的配列の検出方法。
【請求項２】前記アダプター配列の前記相補鎖に前記
レポーター部分をハイブリダイゼーションした結果、前
記2本鎖レポーター部分が作製される請求項1に記載の方
法。
【請求項３】前記レポーター部分の前記相補鎖の合成
の結果、前記2本鎖レポーター部分が作製される請求項1
に記載の方法。
【請求項４】前記アダプター配列の前記相補鎖が、標
的の増幅と同時に合成される請求項1に記載の方法。
【請求項５】増幅反応において、 a) 標的配列に、アダプター配列を含むシグナルプライ
マーをハイブリダイゼーションするステップと、 b) 該標的配列上で該シグナルプライマーを伸長して伸
長産物を作成するステップと、 c) 該伸長産物に増幅プライマーをハイブリダイゼーシ
ョンし、該増幅プライマーを伸長して、該アダプター配
列の相補鎖を合成するステップと、 d) 該アダプター配列の該相補鎖にレポーター部分を含
むレポータープローブをハイブリダイゼーションするこ
とによって、2本鎖レポーター部分を作製するステップ
と、 e) 該標的配列の増幅を示すものとして、該2本鎖レポ
ーター部分を検出するステップとを含む標的配列の増幅
の検出方法。
【請求項６】前記アダプター配列の前記相補鎖に前記
レポーター部分をハイブリダイゼーションした結果、前
記2本鎖レポーター部分が作製される請求項5に記載の方
法。
【請求項７】 a) アダプター配列が5'側の突出した末
端を作製するように、標的配列に、該アダプター配列を
含むシグナルプライマーをハイブリダイゼーションする
ステップと、 b) 該ハイブリダイゼーションされた標的配列の伸長に
よって該アダプター配列の相補鎖をハイブリダイゼーシ
ョンするステップと、 c) 該アダプター配列の該相補鎖に、レポーター部分を
含むレポータープローブをハイブリダイゼーションする
ことによって、2本鎖レポーター部分を作製するステッ
プと、 d) 該標的配列の存在を示すものとして、該2本鎖レポ
ーター部分を検出するステップとを含む核酸標的配列の
検出方法。
【請求項８】前記アダプター配列の前記相補鎖に前記
レポーター部分をハイブリダイゼーションした結果、前
記2本鎖レポーター部分が作製される請求項7に記載の方
法。
【請求項９】 a) 3'側標的結合配列と5'側アダプター
配列とを有する単一のオリゴヌクレオチドを含む未標識
シグナルプライマーと、 b) 5'側レポーター部分と、アダプター配列と実質的に
同一である3'側配列とを含むレポータープローブとを含
む標的配列を検出するためのオリゴヌクレオチド類のセ
ット。
【請求項１０】第一のシグナルプライマーのアダプタ
ー配列と実質的に同一であるアダプター配列を有する第
二のシグナルプライマーをさらに含む請求項9に記載の
オリゴヌクレオチド類のセット。
【請求項１１】第一のシグナルプライマーのアダプタ
ー配列と異なるアダプター配列を有する第二のシグナル
プライマーをさらに含む請求項9に記載のオリゴヌクレ
オチド類のセット。
【請求項１２】前記レポーター部分が標識された請求
項9に記載のオリゴヌクレオチド類のセット。