JP2001521758A

JP2001521758A - タナチンをコードする遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び得られる病害抵抗性形質転換植物

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Publication number: JP2001521758A
Application number: JP2000519588A
Authority: JP
Inventors: フレシネ，ジヨルジユ; ドウローズ，リシヤール; オフマン，ジユール
Original assignee: アベンティス・クロップサイエンス・エス・アー
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2001-11-13
Also published as: HUP0100084A2; HUP0100084A3; NZ504505A; WO1999024594A1; FR2770853B1; ZA9810183B; PL340374A1; AU1160499A; EP1029065A1; US6770798B1; FR2770853A1; AU758749B2; CA2309323A1; IL136004A0; AR017574A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、タナチンをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含む宿主生物形質転換用ベクター、及び、形質転換方法に関する。より特定的には本発明は、植物細胞及び植物の形質転換、植物によって産生された植物に病害抵抗性、特に菌類病害抵抗性を与えるドロソマイシンに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の目的は、タナチンをコードするＤＮＡ配列、該配列を含む宿主生物形
質転換用ベクター、及び、該宿主生物の形質転換方法である。

【０００２】より特定的には本発明は、植物細胞及び植物の形質転換、並びに、これらの形
質転換植物によって産生され植物に病害抵抗性特に菌類病害抵抗性を与えるタナ
チンに関する。

【０００３】今日では、環境保護の観点から抗真菌性防御物質による処理を減らすことまた
は望ましくは避けることが要望され、従って植物を特に菌類病害抵抗性にする必
要性が増大しつつある。菌類病害抵抗性を強化する手段としては、このような病
害を確実に防御し得る物質を産生できるように植物を形質転換する方法が考えら
れる。

【０００４】抗菌性または抗真菌性、特に植物病害の原因となる真菌類に対する抵抗性を有
している天然起原の種々の物質、特にペプチドは公知である。しかしながら問題
は、形質転換された植物によって産生され、しかもその抗菌性及び抗真菌性を維
持しており、その抗菌性及び抗真菌性を植物に付与し得る物質を見出すことであ
る。本発明で使用された抗菌剤または抗真菌剤なる用語は、本来の意味の抗菌性
または抗真菌性と静菌性及び静真菌性の双方を包含する。

【０００５】タナチンは、Ｐｓｏｄｉｕｓ種、好ましくは成熟ｍａｃｕｌｉｖｅｎｔｒｉｓ
に対する細菌性誘発によって産生されるペプチドである。細菌誘発によるその製
造及びそのｉｎｖｉｔｒｏ抗真菌性及び抗菌性はフランス特許出願ＦＲ２７３
３２３７に記載されている。

【０００６】最初にタナチンの遺伝子を同定した後、宿主生物にタナチンを発現させて菌類
病害抵抗性及び細菌性病害抵抗性を与えるために、宿主生物、特に植物にタナチ
ンを挿入し得る方法を見出し、上記に提起した問題の極めて有利な解決に成功し
た。

【０００７】従って、本発明の目的は最初に、タナチンをコードする核酸フラグメント、タ
ナチンをコードする該フラグメントと宿主生物特に植物体内で機能し得る５′及
び３′位置のヘテロロガス調節要素とから成るキメラ遺伝子、このキメラ遺伝子
を含む宿主生物形質転換用ベクター、及び、形質転換された宿主生物を提供する
ことである。本発明はまた、タナチンをコードする少なくとも１つの核酸フラグ
メントを含む形質転換された植物細胞、該細胞を含む病害抵抗性植物、特に該細
胞から再生された病害抵抗性植物に関する。本発明は最後に、植物を病害抵抗性
にするために適当なベクターによってタナチンをコードする遺伝子を挿入するこ
とから成る植物の形質転換方法に関する。

【０００８】本発明において、タナチンなる用語は、本質的にフランス特許出願ＦＲ２７３
３２３７に記載された１１アミノ酸から成るベプチド配列、及び、抗真菌活性ま
たは抗菌活性の実質的な変性を惹起しないアミノ酸部位の幾つかのアミノ酸が等
価の別のアミノ酸で置換されている等価の相同配列を意味する。本質的にフラン
ス特許出願２７３３２３７に記載されたペプチド配列なる用語は、配列番号１で
定義される配列（配列１）を意味するだけでなく、宿主生物、特に植物細胞また
は植物の体内で発現及びターゲッティングするために必要なペプチド残基を一方
もしくは他方の末端または双方の末端に含む配列を意味する。

【０００９】タナチンは式（Ｉ）：

【００１０】

【化１】のペプチドであり、式中の、ＸａａはＮＨ２または１−１０アミノ酸を含む可変配列残基であり、ＸａｂはＯＨまたは０−５アミノ酸を含む可変配列残基である。

【００１１】好ましくは、Ｘａａが少なくとも１つのアミノ酸を含むとき、このアミノ酸は
２０個の基本アミノ酸の１つであり、より特定的にはＧｌｙ，Ｓｅｒ，Ｌｙｓ，
Ｐｒｏ及びＶａｌから成るグループから選択される。Ｘａｂが少なくとも１つの
アミノ酸を含むとき、このアミノ酸は２０個の基本アミノ酸の１つであり、より
特定的にはＧｌｎ，Ａｒｇ及びＭｅｔから成るグループから選択される。

【００１２】本発明の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）のペプチドの２つのシステイン
残基が分子間ジスルフィドブリッジを形成している。

【００１３】従って、本発明は最初に、上記に定義のタナチンをコードする核酸フラグメン
ト、特にＤＮＡフラグメントに関する。本発明のこのフラグメントは、Ｐｓｏｄ
ｉｕｓ種、好ましくはｍａｃｕｌｉｖｅｎｔｒｉｓから単離されたフラグメント
であるか、または、ペプチドを発現させる宿主生物体内でタナチンを発現するよ
うに改造された誘導フラグメントである。核酸フラグメントは標準的な単離及び
精製方法によって得られてもよく、または、合成オリゴタヌクレオチドの連続ハ
イブリダイゼーションという常用の技術によって得られてもよい。これらの技術
は特にＡｕｓｕｂｅｌらによって記載されている。

【００１４】本発明によれば、「核酸フラグメント」なる用語は、ＤＮＡ型またはＲＮＡ型
、好ましくはＤＮＡ型のヌクレオチド配列、特に二重鎖のｃＤＮＡを意味する。

【００１５】本発明の実施態様によれば、タナチンをコードする核酸フラグメントは、配列
番号１で記述されるＤＮＡ配列（配列１）、該配列の相同配列または相補配列を
包含する。

【００１６】好ましくは、本発明の核酸フラグメントは配列番号２によって記述されるＤＮ
Ａ配列（配列２）、該配列の相同配列または相補配列を含む。

【００１７】本発明において、「相同」なる用語は、配列番号１または２で記述されるヌク
レオチド配列に比べて１つまたは複数の配列修飾を有しており且つタナチンをコ
ードしている核酸フラグメントを意味する。これらの修飾は常用の突然変異誘発
技術、またはハイブリダイゼーションによる配列の製造に使用した合成オリゴヌ
クレオチドを選択することによって得られる。同一アミノ酸の発現に導く核酸の
多数の組合せに関しては、配列番号１または２で記述される基準配列と相同配列
との差異が重要であり、合成によって得られる１００未満の核酸のサイズのＤＮ
Ａフラグメントについてはこのような差異が特に重要である。基準配列に対する
相同度が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少な
くとも９０％が有利である。これらの修飾は通常は中性である。即ち、得られる
タナチンの一次配列に全く影響を与えない。

【００１８】本発明はまた、コーディング配列と宿主生物、特に植物細胞または植物体内で
機能し得る５′及び３′のヘテロロガス調節要素とから成るキメラ遺伝子（また
は発現カセット）に関する。コーディング配列は、上記に定義のタナチンをコー
ドするＤＮＡフラグメントを少なくとも１つ含む。

【００１９】宿主生物なる用語は、タナチンを産生させるために本発明のキメラ遺伝子を導
入し得る任意の単細胞または多細胞の下等生物または高等生物を包含する。特に
、細菌、例えば、大腸菌、酵母菌、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属またはＫ
ｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母または好ましくは植物細胞及び植物がある。

【００２０】本発明における「植物細胞」なる用語は、カルスのような未分化組織、胚、植
物の部分、苗木または種子のような分化組織を構成し得る植物由来の任意の細胞
を意味する。

【００２１】本発明における「植物」なる用語は、光合成可能な任意の分化多細胞生物、特
に単子葉植物または双子葉植物、より特定的にはトウモロコシ、コムギ、ナタネ
、ダイズ、イネ、サトウキビ、テンサイ、タバコ、綿などのような動物の飼料ま
たはヒトの食料に使用されるかまたは使用されない栽培植物を意味する。

【００２２】タナチンをコードするＤＮＡフラグメントの発現に必要な調節要素は、宿主生
物次第で当業者に公知である。調節要素としては特に、プロモーター配列、転写
アクチベーター、トランジットペプチド、ターミネーター配列、開始コドン、終
止コドンがある。調節要素を同定及び選択する手段及び方法は当業者に公知であ
る。

【００２３】本発明の核酸フラグメントはまた、５′及び／または３′でタナチンのコーデ
ィング配列に融合した核酸配列を含み得る。これによって「タンパク質−タナチ
ン」の形態の融合タンパク質が得られる。宿主生物の酵素系によってこの融合タ
ンパク質が切断されてタナチンが遊離され得る。タナチンと融合するこのタンパ
ク質は、例えば細胞質もしくは細胞膜または特殊な種類の植物の場合には組織も
しくは細胞外マトリックスのような宿主生物の部分に特定してタナチンの産生を
調節及び局限するシグナルペプチドまたはトランジットペプチドでよい。

【００２４】１つの実施態様によれば、トランジットペプチドは、葉緑体またはミトコンド
リア指向性シグナルでよく、このシグナルは葉緑体またはミトコンドリアで開裂
される。

【００２５】本発明の別の実施態様によれば、シグナルペプチドはＮ末端シグナル、即ち、
後で小胞体にタンパク質を保持させるシグナルと結合する「プレペプチド」でも
よく、または液胞指向性ペプチド、即ち「プロペプチド」でもよい。小胞体は、
「細胞装置」が例えばシグナルペプチドの開裂のような産生タンパク質の成熟処
理を行う場所である。

【００２６】より特定的には本発明は、植物の形質転換に関する。植物体内のプロモーター
調節配列としては、植物体内で天然に発現する遺伝子の任意のプロモーター配列
、特に、細菌、ウイルスまたは植物起原のプロモーター配列、例えばリブロース
−ビスカルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）の小サブユニットの遺伝子、または
、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ１９Ｓまたは３５Ｓ）の遺
伝子ような植物ウイルスの遺伝子、タバコのＰＲ−１ａもしくはアスパラガスの
ＡｏＰＲＴ−Ｌのような病原体によって誘発されるプロモーターがある。好まし
くは、例えば欧州特許出願ＥＰ０５０７６９８に記載されているヒストンプロモ
ーターを少なくとも含む配列のような、病原体の攻撃によってコーディング配列
を構成的または誘導的に超発現させるプロモーター調節配列を使用する。

【００２７】本発明によればまた、プロモーター調節配列と共に、プロモーターとコーディ
ング配列との間に位置する他の調節配列を使用し得る。このような調節配列の例
として、転写アクチベータ（「エンハンサー」）があり、例えば、国際特許出願
ＷＯ８７／０７６４４に記載のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の翻訳アクチ
ベータ、または、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ＆Ｆｒｅｅｄによって記載されたタ
バコ腐食ウイルス（ＴＥＶ）の転写アクチベータ、または、一本鎖もしくは二重
鎖のトランジットペプチドがある。この場合には任意に中間配列によって隔てら
れていてもよい。即ち欧州特許出願ＥＰ０５０８９０９に記載されているように
、転写方向で、葉緑体局在酵素をコードする配列と、葉緑体局在酵素をコードす
る植物遺伝子のＮ末端成熟部分の配列の一部と、葉緑体局在酵素をコードする植
物遺伝子のＮ末端成熟部分の配列の一部から成る葉緑体局在酵素をコードする植
物遺伝子の第二のトランジットペプチドをコードする配列とが順次に含まれてい
る。トランジットペプチドとしては、Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎらによって記載さ
れたタバコのＰＲ−１ａ遺伝子のシグナルペプチドがあり、このペプチドのコー
ディング配列を配列番号３で示す。

【００２８】シグナルペプチド融合タンパク質ＰＲ−１−タナチンをコードする配列及びこ
の融合タンパク質もまた、本発明の構成部分である。この配列は特に、配列番号
５によって記述された配列、より特定的にはこの配列の塩基１２−１６４に対応
するコーディング部分で表される。

【００２９】ターミネーター調節配列またはポリアデニル化配列としては、例えば、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのｎｏｓターミネーターのよう
な細菌起原、または、欧州特許出願ＥＰ０６３３３１７に記載のヒストンターミ
ネーターのような植物起原の対応する任意の配列を使用し得る。

【００３０】本発明によれば、キメラ遺伝子は更に、形質転換された宿主生物に適応した選
択マーカーを含み得る。このような選択マーカーは当業者に公知である。例えば
、ペニシリンのような抗生物質耐性遺伝子、または植物の除草剤に耐性の遺伝子
がある。

【００３１】本発明はまた、宿主生物を形質転換するために少なくとも１つの上記に定義の
キメラ遺伝子を含むクローニング及び発現ベクターに関する。このベクターは、
上記のキメラ遺伝子に加えて、少なくとも１つの複製起点を有している。このベ
クターは、本発明のキメラ遺伝子の導入によって形質転換されたプラスミド、コ
スミド、バクテリオファージまたはウイルスから構成され得る。このような形質
転換ベクターは形質転換すべき宿主生物次第で当業者に公知であり、多くの文献
に記載されている。

【００３２】植物細胞または植物を形質転換するためには、特に育成植物の形質転換に使用
でき、更に固有の複製要素及び発現要素を含むウイルスがよい。本発明によれば
、植物細胞または植物の形質転換ベクターは好ましくはプラスミドである。

【００３３】本発明の目的は更に、上記に定義のような少なくとも１つの核酸フラグメント
またはキメラ遺伝子の組込みから成る宿主生物、特に植物細胞の形質転換方法で
ある。形質転換は、専門文献、特に本願に引用した参考文献に十分に記載された
適当な公知の手段を用い、特に本発明のベクターによって行うことができる。

【００３４】１つの方法シリーズでは、ＤＮＡ配列を結合させた粒子によって細胞またはプ
ロトプラストを衝撃する。別の方法シリーズでは、植物の体内移入手段としてＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドまたはＡ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミドに挿入した
キメラ遺伝子を使用する。

【００３５】マイクロインジェクション、電気穿孔、ＰＥＧによる直接沈降のような別の方
法も使用し得る。

【００３６】当業者は宿主生物、特に植物細胞または植物の種類に従って適当な方法を選択
できよう。

【００３７】更に、上記に定義のタナチンをコードする配列を含むキメラ遺伝子を有効量で
含む形質転換宿主生物、特に植物細胞または植物も本発明の目的である。

【００３８】本発明の目的はまた、形質転換細胞を含む植物、特に形質転換細胞から再生さ
れた植物である。再生は、例えば上記に引用の参考文献に記載のような種の性質
に依存する適当な任意の方法で得られる。

【００３９】植物細胞の形質転換方法及び植物の再生方法に関しては以下の特許及び特許出
願を参照するとよい：ＵＳ４，４５９，３５５；ＵＳ４，５３６，４７５；ＵＳ
５，４６４，７６３；ＵＳ５，１７７，０１０；ＵＳ５，１８７，０７３；ＥＰ
２６７，１５９；ＥＰ６０４，６６２；ＥＰ６７２，７５２；ＵＳ４，９４５，
０５０；ＵＳ５，０３６，００６；ＵＳ５，１００，７９２；ＵＳ５，３７１，
０１４；ＵＳ５，４７８，７４４；ＵＳ５，１７９，０２２；ＵＳ５，５６５，
３４６；ＵＳ５，４８４，９５６；ＵＳ５，５０８，４６８；ＵＳ５，５３８，
８７７；ＵＳ５，５５４，７９８；ＵＳ５，４８９，５２０；ＵＳ５，５１０，
３１８；ＵＳ５，２０４，２５３；ＵＳ５，４０５，７６５；ＥＰ４４２，１７
４；ＥＰ４８６，２３３；ＥＰ４８６，２３４；ＥＰ５３９，５６３；ＥＰ６７
４，７２５；ＷＯ９１／０２０７１及びＷＯ９６／０６１２８。

【００４０】本発明はまた、上記に定義の再生植物の栽培及び交配から得られる形質転換植
物及び形質転換植物の種子に関する。

【００４１】このような形質転換植物はいくつかの病害、特に菌類病害または細菌性病害に
抵抗性である。このため、上記の病害抵抗性植物を製造することを主目的として
タナチンをコードするＤＮＡ配列を組込むことができる。タナチンは、Ｃｅｒｃ
ｏｓｐｏｒａ特にＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｂｅｔｉｃｏｌａ，Ｃｌａｄｏｓｐｏ
ｒｉｕｍ特にＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｈｅｒｂａｒｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ
特にＦｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍまたはＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉ
ｎｅａｒｕｍ、またはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ特にＰｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ
ｃｉｎｎａｍｏｍｉによって引き起こされる菌類病害に有効である。

【００４２】キメラ遺伝子はまた、１つまたは複数の除草剤耐性遺伝子のような選択マーカ
ーを少なくとも１つ含むのが有利である。

【００４３】また、例えば除草剤耐性遺伝子のような別の有益なペプチドまたはタンパク質
をコードする別の配列で植物を形質転換するときにタナチンをコードするＤＮＡ
配列を選択マーカーとして組込むことも可能である。

【００４４】このような除草剤耐性遺伝子は当業者に公知であり、種々の特許出願、特にＥ
Ｐ１１５６７３、ＷＯ８７／０４１８１、ＥＰ３３７８９９、ＷＯ９６／３８５
６７またはＷＯ９７／０４１０３に記載されている。

【００４５】勿論、本発明によって形質転換された細胞及び植物は、タナチンをコードする
配列に加えて、細菌起原または真菌類起原の別の病害に対する抵抗性を植物に付
与し得る別の相補ペプチドをコードする別のヘテロロガス配列を含み得る。

【００４６】タナチンをコードする一次配列と別の有益なペプチドまたはタンパク質をコー
ドする少なくとも１つの別の配列とを有しているキメラ遺伝子を含む同一ベクタ
ーを用いて別の配列を組込んでもよい。

【００４７】また、上記に定義の常用の技術を使用し、少なくとも１つの別の配列を含む別
のベクターを用いて別の配列を組込んでもよい。

【００４８】本発明の植物は更に、タナチンをコードする本発明の遺伝子を含む一方の親植
物と少なくとも１つの別の有益なペプチドまたタンパク質をコードする遺伝子を
含む他方の親植物とを交配することによって得られる。

【００４９】別の抗真菌性ペプチドをコードする配列のうちでも特に、フランス特許出願Ｆ
Ｒ２７２５９９２にＦｅｈｌｂａｕｍら（１９４４）によって記載されまた１９
９７年７月２４日出願の未公開のフランス特許出願ＦＲ９７０９１１５に記載さ
れたドロソマイシンをコードする配列、または、フランス特許出願２７４５００
４及び１９９７年８月２０日出願の未公開のフランス特許出願９７１０３６２に
記載されたアンドロクトニンをコードする配列が挙げられる。

【００５０】以下の実施例は、本発明によるタナチンをコードする配列、キメラ遺伝子、組
込みベクター及び形質転換植物の製造を説明する。添付の図１−５は、キメラ遺
伝子を構築するために作製した幾つかのプラスミドの概略構造を示す。これらの
図中、種々の制限部位をイタリック体で示す。

【００５１】実施例１：キメラ遺伝子の構築以下に使用した技術はすべて、標準的実験技術である。これらの技術の詳細な
プロトコルは特にＡｕｓｕｂｅｌらに記載されている。

【００５２】ｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐ：タバコのＰＲ−１ａ遺伝子のシグナルペプチドを含むプ
ラスミドの作製以下にオリゴ１及びオリゴ２で示す２つの相補的合成オリゴヌクレオチドを６
５℃で５分間ハイブリダイズさせ、次いで３０分を要して３０℃までゆっくりと
温度を低下させる。

【００５３】

【化２】

【００５４】オリゴ１とオリゴ２とのハイブリダイゼーション後、一本鎖で維持されたＤＮ
Ａは、各オリゴの３′末端から二重鎖オリゴヌクレオチドを作製するために大腸
菌のポリメラーゼ１のクレノウフラグメント（製造業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ）によって規定された標準条件）のマトリックスとなる。得
られた二重鎖オリゴヌクレオチドを次に、制限酵素ＳａｃＩＩ及びＮａｅＩによ
って消化し、同じ制限酵素で消化したプラスミドｐＢＳＩＩＳＫ（−）（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）にクローニングする。このようにして、タバコのＰＲ−１ａ遺
伝子のシグナルペプチドをコードする領域（配列３）を含むクローンが得られる
。

【００５５】ｐＲＰＡ−ＰＳ−ＰＲ１ａ−ｔｈａｎ：３′非転写領域のないシグナルペプチ
ドＰＲ−１ａに融合したタナチンをコードする配列の作製ｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐに記載の処理条件でオリゴ３及びオリゴ４で示す２つの相
補的合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。

【００５６】

【化３】

【００５７】オリゴ３とオリゴ４とのハイブリダイゼーション後、一本鎖で維持されたＤＮ
Ａは、各オリゴの３′末端から二重鎖オリゴヌクレオチドを作製するために大腸
菌のポリメラーゼ１のクレノウフラグメント（製造業者（ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ）によって規定された標準条件）のマトリックスとなる。タ
ナチン（配列１）のコーディング部分を含むこの二重鎖オリゴヌクレオチドを次
に、制限酵素ＮａｅＩで消化しておいたプラスミドｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐに直接ク
ローニングする。得られたクローンが正しい配向であることを配列決定によって
確認する。ここで、Ｎ末端のＮｃｏＩ制限部位とＣ末端のＳｃａＩ、ＳａｃＩＩ
及びＢａｍＨＩ部位との間に融合タンパク質ＰＲ−１ａ−タナチンをコードする
領域を含むクローンが得られる（配列４）。

【００５８】ｐＲＡＰ−ＲＤ−２２９：融合タンパク質ＰＲ−１ａ−タナチンをコードする
配列を含む植物体内における発現ベクターの作製プラスミドｐＵＣ−１０から誘導されたプラスミドｐＲＴＬ−２ＧＵＳをＤｒ
．ＪｉｍＣａｒｒｉｎｇｔｏｎ（ＴｅｘａｓＡ＆ＭＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
，未記載）から入手した。図１に概略構造を示すこのプラスミドは、タバコ腐食
ウイルスの５′非翻訳配列（ＴＥＶ５′ ＵＴＲ；Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ＆
Ｆｒｅｅｄ，１９９０）を含むＲＮＡの発現を誘発するカリフラワーのモザイ
クウイルスから単離した重複ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ２×３５
Ｓプロモーター；Ｏｄｅｌｌら，１９８５）、大腸菌のβ−グルクロニダーゼの
遺伝子（ＧＵＳＪｅｆｆｅｒｓｏｎら，１９８７）及びＣａＭＶ３５ＳのＲ
ＮＡのポリアデニル化部位（ＣａＭＶｐｏｌｙＡ；Ｏｄｅｌｌら，１９８５）
とを順次に含む。

【００５９】プラスミドｐＲＴＬ−２ＧＵＳを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、
大きいＤＮＡフラグメントを精製する。プラスミドｐＲＰＡ−ＰＳ−ＰＲ１ａ−
ｔｈａｎを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、融合タンパク質ＰＲ−１
ａ−タナチンをコードする領域を含む小さいＤＮＡフラグメントを精製する。精
製した２つのＤＮＡフラグメントを次に、発現カセットに結合して、融合タンパ
ク質ＰＲ−１ａ−タナチンを植物体内で合成する発現カセットを作製する。この
発現カセットの概略構造を図２に示す。「ＰＲ−１ａ−タナチン」は、ｐＲＰＡ
−ＲＤ−２３０の融合タンパク質ＰＲ−１ａ−タナチンのコーディング領域を表
す。タナチンはシグナルペプチドＰＲ−１ａの作用によって植物の細胞外マトリ
ックスに運搬される。

【００６０】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５：マルチクローニング部位を含むプラスミドの作製プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１９５は、プラスミドｐＵＣ-１９由来の、マルチクローニング部位を含むプラスミドである。下記のオリゴ５（Ｏｌｉｇｏ５
）及びオリゴ６（Ｏｌｉｇｏ６）に相補的な合成オリゴヌクレオチドを、ｐＲ
ＰＡ-ＭＤ-Ｐについて記載した方法に従いハイブリダイズさせ二本鎖とした。

【００６１】

【化４】

【００６２】得られた二本鎖オリゴヌクレオチドは、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩにより消化し、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片
を用いて遊離二本鎖末端としたｐＵＣ−１９中に連結した。これによりアグロバ
クテリウム・タメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）のプラスミドベクター中に発現カセットを容易に導入可能な、マルチ
クローニング部位を含むベクターを得る。該マルチクローニング部位の構造の模
式図を図３に示す。

【００６３】ｐＲＰＡ−ＲＤ−２３２：ｐＲＰＡ-ＲＤ-１９５中へのｐＲＰＡ−ＲＤ−２２
９のＰＲ−１ａ−タナチン（ｔｈａｎａｔｉｎｅ）の発現カセットの導入プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−２３０を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。Ｐ
Ｒ−１ａ−タナチンの発現カセットを含むＤＮＡ断片を精製した。精製した断片
は、あらかじめ制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し子牛消化管ホスファターゼで脱
ホスフォリル化したｐＲＰＡ−ＲＰ−１９５中に連結した。

【００６４】ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４：ｐＲＰＡ−ＢＬ−２３７（ＥＰ０,５０８,９０９）
のブロモキシニル耐性遺伝子を含むｐＲＰＡ−ＢＬ−１５０Ａ（ＥＰ０,５０８,
９０９）由来のプラスミドＰＣＲを用いた遺伝子増幅によりｐＲＰＡ−ＢＬ−２３７からブロモキシニル
耐性遺伝子を単離した。得られた断片は遊離末端を有しており、クレノウポリメ
ラーゼの作用により標準条件下で遊離末端を形成させたｐＲＰＡ−ＢＬ−１５０
ＡのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。このようにしてブロモキシニル耐性遺
伝子を右末端近傍に有し、左末端近傍にカナマイシン耐性遺伝子を含み、該二つ
の遺伝子の間にマルチクローニング部位を含むアグロバクテリウム・タメファシ
エンスのベクターを得る。ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４の構造模式図を図４に示す。
図中、”ｎｏｓ”はアグロバクテリウム・タメファシエンスのノパリン合成酵素
のポリアデニレーション部位を現し（Ｂｅｖａｎ＆ｃｏｌｌ．，１９８３) 、”ＮＯＳｐｒｏ”はアグロバクテリウム・タメファシエンスのノパリン合成酵素のプロモーターを現し（Ｂｅｖａｎ＆ｃｏｌｌ．，１９８３)、”ＮＰＴＩＩ”は大腸菌のトランスポゾンＴｎ５のネオマイシン・ホスフォトランス
フェラーゼ遺伝子を現し（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ＆ｃｏｌｌ．，１９８１）、
”３５Ｓｐｒｏ”はキャベツ花モザイクウイルスの単離３５Ｓプロモーターを現し（Ｏｄｅｌｌ＆ｃｏｌｌ．，１９８５）、”ＢＲＸ”はＫ．ｏｚａｅｎ
ａｅの単離ニトリラーゼ遺伝子を現し（Ｓｔａｌｋｅｒ＆ｃｏｌｌ．，１９８８
）、”ＲＢ”及び”ＬＢ”は、各々、アグロバクテリウム・タメファシエンスの
Ｔｉプラスミド配列の右及び左末端を現す。ｐＲＰＡ−ＲＤ−１８４：ｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４への特有の新規制限部位の
付加下記のオリゴ７（Ｏｌｉｇｏ７）及びオリゴ８（Ｏｌｉｇｏ８）に相補的
な合成オリゴヌクレオチドをｐＲＰＡ−ＭＤ−Ｐについて記載した方法に従いハ
イブリダイズさせ二本鎖とした。

【００６５】

【化５】

【００６６】アガロースゲル（３％Ｎｕｓｉｅｖｅ（商標），ＦＭＣ製）で分離後、上記
オリゴヌクレオチドの二本鎖ハイブリッド（９５塩基対）を精製した。プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４は制限酵素ＸｍａＩを用いて消化し、ＤＮＡのより大
きい断片のほうを精製した。得られたＤＮＡの二つの断片を連結した。

【００６７】このようにしてブロモキシニル耐性遺伝子とカナマイシン選択マーカー遺伝子
の間に異なる制限部位を有するｐＲＰＡ−ＲＤ−１７４から誘導されたプラスミ
ドを得る。

【００６８】該プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１８４の構造模式図を図５に示す。”ｎｏｓ” 、”ＮＰＴＩＩ”、”ＮＯＳｐｒｏ”、”３５Ｓｐｒｏ”、”ＢＲＸｇｅｎｅ”、”ＲＢ”及び”ＬＢ”の用語は図４における意味と同じである。

【００６９】ｐＲＰＡ−ＲＤ−２３５：細胞外マトリックス指向性タナチン（ｔｈａｎａｔ
ｉｎｅ）をコードする遺伝子構築物を含むアグロバクテリウム。タメファシエン
スベクターの作製プラスミドｐＲＰＡ−ＲＤ−２３２を制限酵素ＰｍｅＩ及びＡｓｃＩで消化し
、ＰＲ−１ａ−ｔｈａｎａｔｉｎｅ遺伝子を含むＤＮＡ断片を精製した。プラス
ミドｐＲＰＡ−ＲＤ−１８４を同様の制限酵素で消化した。ＰＲ−１ａ−ｔｈａｎａｔｉｎｅの発現カセットを含むＤＮＡ断片をｐＲＰＡ−ＲＤ−１８４に連結
した。このようにして、タナチン（ｔｈａｎａｔｉｎｅ）の植物細胞外マトリックス中での発現を誘導するＰＲ−１ａ−ｔｈａｎａｔｉｎｅ融合タンパクをコー
ドする配列を含むアグロバクテリウム・タメファシエンスベクターを得る。

【００７０】実施例２：タバコ形質転換体の除草剤耐性２．１−形質転換ｐＲＰＡ−ＲＤ−２３５ベクターを、コスミドｐＴＶＫ２９１（Ｋｏｍａｒｉ＆ｃｏｌｌ．，１９８６）を溶原化するアグロバクテリウム・タメファシエ
ンスＥＨＡ１０１株（Ｈｏｏｄ＆ｃｏｌｌ．，１９８７）に導入した。形質転換技法は、Ｈｏｒｓｈ＆ｃｏｌｌ．（１９８５）の手法に基づく。

【００７１】２．２−再生葉部エクスプラントからのタバコＰＢＤ６（フランス、ＳＥＩＴＡ起源）の再
生は、３０ｇ/ｌの蔗糖及び２００μｇ/ｍｌのカナマイシンを含むムラシゲ−ス
クーグ（ＭＳ；Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ-Ｓｋｏｏｇ）培地内で行われる。温室内また
はイン・ビトロで栽培された植物体より葉部エクスプラントを採取し、続く３段
階のステップよりなる葉片ディスク法（Ｈｏｒｓｈ＆ｃｏｌｌ．，１９８５
）に従って再生する：まず初めに、１５日間、ナフチル酢酸（ＡＮＡ）０．０５
ｍｇ／ｌとベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）２ｍｇ／ｌを含む３０ｇ／ｌの蔗糖
添加培地上で発芽を誘導する。このステップの過程で形成された芽は、１０日間
、ホルモンを含有しない３０ｇ/ｌ蔗糖添加ＭＳ培地上で培養することにより展開させる。次いで展開した芽を採取し、ホルモンを含有せず、半濃度の塩、ビタ
ミン及び糖類を有する発根用ＭＳ培地上で培養する。約１５日後、発根した芽を地面に移す。

【００７２】２．３−ブロモキシニルへの耐性ｐＲＰＡ−ＲＤ−２３５構築物により形質転換された２０個の植物体が再生さ
れ地面に移された。これらの植物の第５葉を、温室内で、１ヘクタール当たり０．２ｋｇのブロモキシニル有効量に相当するパードナー（Ｐａｒｄｎｅｒ）水性
懸濁液で処理した。

【００７３】ブロモキシニルに対する完全な耐性を示した植物のみが異なった実験に用いら
れ、その実験において形質転換植物により発現されたタナチンは菌類の攻撃に対
する抵抗性を植物体に付与した。

【００７４】引用文献

【００７５】

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】キメラ遺伝子を構築するために作製したプラスミドの概略構造。

【図２】キメラ遺伝子を構築するために作製したプラスミドの概略構造。

【図３】キメラ遺伝子を構築するために作製したプラスミドの概略構造。

【図４】キメラ遺伝子を構築するために作製したプラスミドの概略構造。

【図５】キメラ遺伝子を構築するために作製したプラスミドの概略構造。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者オフマン，ジユールフランス国、エフ−67000・ストラスブール、リユ・クロズネル、５Ｆターム(参考） 2B030 AA00 AD05 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA80 CA03 CA07 DA01 EA01 GA11 4B063 QA01 QA13 QQ09 QQ42 QQ53 QR08 QR55 QR62 4B065 AA88X AA88Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 BA16 BA20 CA30 EA06 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】タナチンをコードする核酸配列を含むことを特徴とする核酸
フラグメント。
【請求項２】ＤＮＡ型のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項
１に記載の核酸フラグメント。
【請求項３】ＤＮＡ型ヌクレオチド配列が、配列番号１で記述されるＤＮ
Ａ配列（配列１）、前記配列の相同配列または相補配列から成ることを特徴とす
る請求項２に記載の核酸フラグメント。
【請求項４】ＤＮＡ型ヌクレオチド配列が、配列番号２で記述されるＤＮ
Ａ配列（配列２）、前記配列の相同配列または相補配列から成ることを特徴とす
る請求項３に記載の核酸フラグメント。
【請求項５】「タンパク質−タナチン」の形態の融合タンパク質が得られ
るように、タナチンをコードする配列の５′及び／または３′に融合した核酸配
列を含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の核酸フラグメ
ント。
【請求項６】タンパク質がシグナルペプチドまたはトランジットペプチド
であることを特徴とする請求項５に記載の核酸フラグメント。
【請求項７】シグナルペプチドがタバコのＰＲ−１ａ遺伝子のシグナルペ
プチドであることを特徴とする請求項６に記載の核酸フラグメント。
【請求項８】配列番号５によって記述されるＤＮＡ配列（配列５）、前記
配列の相同配列または相補配列から成ることを特徴とする請求項７に記載の核酸
フラグメント。
【請求項９】配列５の塩基１２−１６４に対応するコーディング部分から
成ることを特徴とする請求項８に記載の核酸フラグメント。
【請求項１０】タンパク質がシグナルペプチドまたはトランジットペプチ
ドであることを特徴とする「タンパク質−タナチン」の形態の融合タンパク質。
【請求項１１】シグナルペプチドがタバコのＰＲ−１ａ遺伝子のシグナル
ペプチドであることを特徴とする請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】配列番号５（配列５）によって記述されることを特徴とす
る請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】コーディング配列と共に、宿主生物特に植物体内で機能し
得るヘテロロガス調節要素を５′及び３′位置に含むキメラ遺伝子であって、コ
ーディング配列が請求項１から９のいずれか一項に記載のタナチンをコードする
ＤＮＡフラグメントを少なくとも１つ含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項１４】宿主生物が植物細胞及び植物から選択されることを特徴と
する請求項１３に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１５】更に、選択マーカーを含むことを特徴とする請求項１３ま
たは１４に記載のキメラ遺伝子。
【請求項１６】宿主生物の形質転換に使用されるクローニング及び発現ベ
クターであって、少なくとも１つの複製起点と請求項１３から１５のいずれか一
項に記載の少なくとも１つのキメラ遺伝子とを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１７】育成植物の形質転換に使用されるウイルスから成り、固有
の複製要素及び発現要素を更に含むことを特徴とする請求項１６に記載のベクタ
ー。
【請求項１８】プラスミドから成ることを特徴とする請求項１６に記載の
ベクター。
【請求項１９】請求項１３から１５のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子
を有効量で含むことを特徴とする形質転換された宿主生物。
【請求項２０】植物細胞または植物であることを特徴とする請求項１９に
記載の形質転換された宿主生物。
【請求項２１】形質転換細胞を含む植物であることを特徴とする請求項２
０に記載の形質転換された宿主生物。
【請求項２２】植物が形質転換細胞から再生されることを特徴とする請求
項２１に記載の形質転換された宿主生物。
【請求項２３】請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸フラグメント
または請求項１３から１５のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子を含むことを特
徴とする形質転換された植物細胞。
【請求項２４】請求項２３に記載の形質転換植物細胞を少なくとも１つ含
む病害抵抗性形質転換植物。
【請求項２５】Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ特にＣｅｒｃｏｓｐｏｒａｂｅｔ
ｉｃｏｌａ，Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ特にＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｈｅｒ
ｂａｒｕｍ，Ｆｕｓａｒｉｕｍ特にＦｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍまたは
Ｆｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、またはＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ
特にＰｈｙｔｏｐｈｔｏｒａｃｉｎｎａｍｏｍｉによって引き起こされる病害
に抵抗性であることを特徴とする請求項２４に記載の形質転換植物。
【請求項２６】請求項２４または２５に記載の植物の栽培及び／または交
配によって得られることを特徴とする病害抵抗性形質転換植物。
【請求項２７】請求項２４から２６のいずれか一項に記載の形質転換植物
の種子。
【請求項２８】請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸フラグメント
または請求項１３から１５のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子の少なくとも１
つを宿主生物に挿入することを特徴とする宿主生物、特に植物細胞または植物の
形質転換方法。
【請求項２９】請求項１から９のいずれか一項に記載の核酸フラグメント
または請求項１３から１５のいずれか一項に記載のキメラ遺伝子の少なくとも１
つを宿主生物に挿入することを特徴とする、菌類病害または細菌性病害に対する
抵抗性を与える植物の形質転換方法。
【請求項３０】請求項１６から１８のいずれか一項に記載のベクターを用
いてキメラ遺伝子を挿入することを特徴とする請求項２９または２９に記載の方
法。