JP2001520522A - トランスジェニック植物におけるフルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼの発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼ（ＦＤＡ）は、トリオースリン酸をフルクトース−１，６−ビスリン酸へ変換する反応を可逆的に触媒する酵素である。葉において、この酵素は、葉緑体（デンプン合成）及びサイトゾル（ショ糖生合成）に位置する。特に葉におけるデンプン生合成能力を増大させ、そして一般的にショ糖生成を増大させることにより植物収穫量を改良するため、葉緑体において大腸菌ｆｄａ遺伝子を発現するトランスジェニック植物が作製された。ｆｄａトランスジーンを発現する植物由来の葉は、特に光周期の初期に、空ベクターを発現する対照植物と比較して、有意に高いデンプン蓄積を示したが、葉におけるショ糖は低下していた。トランスジェニック植物は、有意に高い根重量も有していた。さらに、ｆｄａを発現するトランスジェニック・ジャガイモは、改良された固体均一性を示した。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック植物におけるフルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼの 発現 本発明は、植物の成長及び発達、収穫量、生長力、ストレスに対する抵抗性、 様々な貯蔵プールへの炭素の配分及び貯蔵、並びにデンプンの分布を増大させる か、又は改良するための、トランスジェニック植物におけるフルクトース１，６ ビスリン酸アルドラーゼ（ＦＤＡ）の発現に関する。ＦＤＡを発現するトランス ジェニック植物は、穀物植物における成長、収穫量及び品質の改良をもたらす、 植物のソース器官及びシンク器官における増大した炭素の同化、エクスポート及 び貯蔵を有している。 遺伝子工学の最近の進歩により、外来（しばしば「異種」とも呼ばれる）の遺 伝子又は改良された内因性遺伝子を含むよう植物を形質転換するための不可欠な 道具が提供された。これらの遺伝子は、植物組織に既に存在する経路を改良する か、又は生成物レベルを修飾するため、代謝効率を増大させるため、及び又はエ ネルギーコストを節約するために新規経路を細胞に導 入することができる。特有の生理学的及び生化学的特性、並びに高等農業経済学 及び穀物加工に関して非常に重要な特徴を有する植物を作製することが、現在で は可能である。植物の成長及び発達、穀物の収穫可能性及び安定性、並びに穀物 の品質及び組成において必須の役割を果たす特性には、増強された炭素同化、効 率的な炭素貯蔵、及び増大した炭素のエクスポート及び分配が含まれる。 植物による大気からの炭素固定（光合成）は、あらゆる生物におけるプロセス を支持するための主要なエネルギー源となっている。一般的に「ソース器官」と 呼ばれる、光合成活性の主要な部位は、成熟葉、そして程度は低いが緑色茎であ る。ソース葉の主要な炭素生成物は、葉緑体における炭水化物の一時的な貯蔵形 態となっているデンプン及び高等植物における炭素輸送の支配的な形態となって いるショ糖である。「シンク器官」と名付けられたその他の植物部分（例えば、 根、実、花、種、塊茎、及び鱗茎）は、一般的に自主栄養性ではなく、成長及び 発達のためショ糖又はその他の主要な転移可能な炭水化物のインポートに頼って いる。貯蔵シンクは、インポートされた代謝物を、ショ糖及びその他のオリゴ糖 、デンプン及びその他の多 糖、タンパク質、並びにトリグリセリドとして受託する。 葉において、カルヴィン回路（炭素同化をもたらす生化学的経路）の主要な生 成物は、トリオースリン酸（トリオース−Ｐ）としても知られる、グリセルアル デヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）及びジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）であ る。Ｇ３Ｐ及びＤＨＡＰのフルクトース１，６ビスリン酸（ＦＢＰ）への縮合は 、酵素フルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼ（ＦＤＡ）により可逆的に触 媒され、様々なイソ酵素が知られている。酸性イソ酵素は、葉緑体に存在すると 考えられており、全葉アルドラーゼ活性の約８５％を占めている。塩基性イソ酵 素はサイトゾルに存在する。両イソ酵素は、核ゲノムによりコードされていると 考えられており、異なる遺伝子によりコードされている（Ｌｅｂｈｅｒｚら、１ ９８４）。 葉において、葉緑体ＦＤＡはカルヴィン回路における必須の酵素であり、該回 路においてその活性はデンプン生合成のための代謝物を生成する。アンチセンス 技術によりプラスチドのアルドラーゼ酵素活性の４０％超を除去すると、葉にお けるデンプン蓄積並びに可溶性タンパク質及びクロロフィルのレベルが減少する のみならず、植物の成長及び根の形成も減少した （Ｓｏｎｎｅｗａｌｄら、１９９４）。対照的に、サイトゾルＦＤＡはショ糖生 合成経路の一部であり、該経路においてＦＢＰ生成の反応を触媒する。さらに、 サイトゾルＦＤＡは、ソース植物組織及びシンク植物組織の両方において、解糖 経路及び糖新生経路における重要な酵素でもある。 ジャガイモ産業において、デンプン含量が高く固体が均一である塊茎の作製は 、非常に望ましく貴重である。ラセット・バーバンク（Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂ ａｎｋ）及びシェポディ（Ｓｈｅｐｏｄｙ）のような、フレンチフライ製造に現 在用いられているジャガイモ変種には、塊茎髄（内側コア）と皮質（外側コア） の間の不均一な固体の沈積という短所がある。髄組織からとられたフレンチフラ イ・ストリップは、外側皮質のフレンチフライ・ストリップと比較した場合、水 分含量が高い。皮質組織が典型的には２４パーセントという固体レベルを示すの に対し、髄組織は典型的には１７パーセントという固体レベルを示す。その結果 、フレンチフライ製造プロセスにおいて、髄ストリップには、過剰の水分を排除 するため、より長い時間の、湯どうし、乾燥、及び予備揚げ（ｐａｒ−ｆｒｙ） が必要である。髄フライにとって適切な加工は、固体含量が高い皮質 からのフライにとっては過剰調理となる。フレンチフライ加工者の湯どうし、乾 燥、予備揚げの時間は、固体含量が低い髄ストリップ及び固体含量が高い皮質ス トリップに適合するよう、しかるべく調整される必要がある。髄から皮質へのデ ンプンの分布がより均一な固体含量が高いジャガイモでは、湯どうし、乾燥、予 備揚げの時間が短縮されるため、より高い植物処理量及びコスト節約と共に、よ り均一な完成フライ製品が可能となるであろう。 様々なフルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼが以前に特徴決定されて いるが、トランスジェニック植物における酵素の過剰発現が、植物において、炭 素の同化、エクスポート、及び貯蔵の増大、植物における油及び／又はタンパク 質の生成の増大、並びに塊茎固体均一性の改良のような、有利な結果を提供する ことが発見された。 本発明は、フルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼ（ＦＤＡ）酵素をコ ードし、かつ植物における炭素の同化、エクスポート、及び貯蔵の増大において 有用な、構造ＤＮＡ構築物を提供する。 前記の達成において、本発明の一つの局面に従い、 （ａ）（ｉ）標的植物組織の細胞において機能するプロモーター、 （ｉｉ）フルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼ酵素をコードするＲＮＡ配 列の生成を引き起こす構造的ＤＮＡ配列、 （ｉｉｉ）転写終結及びＲＮＡ配列の３’末へのポリアデニル化ヌクレオチドの 付加を引き起こす、植物細胞において機能する３’非翻訳ＤＮＡ配列 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子を植物のゲノムに挿入する工程、 （ｂ）形質転換された植物細胞を得る工程、並びに （ｃ）形質転換された植物細胞から、上昇したＦＤＡ活性を有する遺伝学的に形 質転換された植物を再生させる工程 を含む、上昇した炭素の同化、貯蔵、エクスポート、及び改良された固体均一性 を有する遺伝学的に形質転換された植物を作製する方法が提供される。 本発明のもう一つの局面において、 （ｉ）標的植物組織の細胞において機能するプロモーター、 （ｉｉ）フルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼ酵素をコードするＲＮＡ配 列の生成を引き起こす構造ＤＮＡ配列、 （ｉｉｉ）転写終結及びＲＮＡ配列の３’末へのポリアデニル化ヌクレオチドの 付加を引き起こす、植物細胞において機能す る３’非翻訳ＤＮＡ配列 を配列内に含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子が提供される。 本発明のさらなる局面において、フルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼ 酵素をコードするＲＮＡ配列の生成を引き起こす構造ＤＮＡ配列は、プラスチド への酵素の輸送を促進するため葉緑体移動ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔ ｉｄｅ）とカップリングされる。 本発明に従い、様々な植物のソース組織における炭素の同化、貯蔵及びエクス ポートを増大させるための改良された手段が提供される。さらに、シンク（根、 塊茎、種、茎、及び鱗茎など）における炭素蓄積が改良され、従って様々なシン クのサイズが増大し（より大きい根、塊茎など）、その結果収穫量及び穀物生産 性が増大する手段が提供される。これらのシンクの増大した炭素利用能は、シン クにおける組成及び使用効率（油、タンパク質、デンプン及び／もしくはショ糖 の生成、並びに／又は固体均一性）も改良するであろう。 本発明の目的により、以下の点を含む様々な利点が達成されうる。 第一に、葉緑体におけるＦＤＡ酵素の発現を増大させること は、カルヴィン回路における炭素の流量を増大させ、光周期の初期における大気 からの炭素同化を増大させるであろう。これは、光合成効率の増大及び葉緑体に おけるデンプン生成（光合成が低いか又は存在しない期間に分解される葉におけ る炭素貯蔵形態）の増大をもたらすであろう。これらの反応はいずれも、葉によ るショ糖生成の増大及び所定の光周期における炭素エクスポートの正味の増大を もたらすであろう。このショ糖容量の増大は、穀物植物において望ましい特性で あり、稙物の成長、貯蔵能、収穫量、生長力、及びストレスに対する抵抗性の増 大をもたらすであろう。 第二に、光合成細胞のサイトゾルにおけるＦＤＡ発現を増大させることにより 、ソース葉からのショ糖の生成及びエクスポートの増大がもたらされるであろう 。このソース容量の増大は、穀物植物において望ましい特性であり、植物の成長 、貯蔵能、収穫量、生長力、及びストレスに対する抵抗性の増大をもたらすであ ろう。 第三に、シンク組織におけるＦＤＡの発現は、種又はその他のシンクにおけ る解糖における炭素の流量（及び、従ってピルビン酸レベル）の増大を介した、 アミノ酸及び／又は脂肪酸 のプールの増大、並びにデンプンが主要な貯蔵非構造的炭水化物である種、根、 茎、及び塊茎におけるグルコース６−リン酸の生成（逆解糖）の増大の結果とし てのデンプン・レベルの増大のような、いくつかの望ましい特性を示しうる。こ のシンク強度の増大は、穀物植物において望ましい特性であり、植物の成長、貯 蔵能、収穫量、生長力、及びストレスに対する抵抗性の増大をもたらすであろう 。 第四に、本発明は、ジャガイモ由来の食品の商業的な製造における使用にとっ て特に望ましい。フレンチフライ及びその他の製品の製造に使用されるジャガイ モには、塊茎髄（内側コア）と皮質（外側コア）の間の不均一な固体の分布とい う短所がある。従って、そのような塊茎の髄領域からのフレンチフライ・ストリ ップは、同塊茎からの皮質ストリップと比較して、低い固体含量及び高い水分含 量を有する。従って、フレンチフライ加工者は、最終的な内側ストリップが充分 に調理されつつ、外側の皮質ストリップが過剰調理されないよう、加工パラメー ターを調整することを試みる。しかし、そのような調整の結果は、非常に変動し やすく、製品の品質を低下させることがある。ｆｄａを発現するトランスジェニ ック・ジャガイモは、フレン チフライ及びポテトチップの加工者に、許容される農業経済学的特性と共に、よ り高い塊茎固体均一性を一貫して示す生製品を提供する。フレンチフライ工場製 造プロセスにおいて、固体均一性がより高い塊茎からの内側髄フライストリップ が必要とする、冷凍及び小売店及び制度上の最終消費者への出荷の前の、湯どう し、特定の固体含量への乾燥、及び予備揚げのための時間は、より短くなるであ ろう。 従って、ジャガイモに関して、本発明は１）全ての塊茎領域からのフレンチフ ライが、加工されたときほぼ同一である、より高品質で、より均一な最終フライ 製品、２）加工時間の短縮によるフレンチフライ加工工場における高い処理量、 並びに３）湯どうし、乾燥、及び予備揚げの時間が短縮され、それに必要なエネ ルギー投入量が減少することによる加工者コスト節約を提供する。高い固体均一 性を示す生塊茎製品はまた、ポテトチップ産業における望ましくない品質である 、サドル・カール及び中心の泡状化傾向が減少したポテトチップを作製するであ ろう。脂肪含量の減少も起こるであろう。これは、消費者へのアピールの改良及 び消費者の油使用（及びコスト）の減少に寄与するであろう。固体均一性の増大 は、全体的な塊茎固体の 増大とも言い換えられる。フレンチフライ産業及びチップ産業の両方にとって、 この全体的な塊茎固体増大も、加工時間の短縮による加工工場における処理量の 増大、及び湯どうし、乾燥、予備揚げ、及び最終揚げのためのエネルギー投入量 の減少によるコスト節約をもたらす。 図１は、大腸菌由来のフルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子のヌ クレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す（配列番号：１）。 図２は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１７５２４のプラスミド地図を示す。 図３は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１７５４２のプラスミド地図を示す。 図４は、ｆｄａトランスジーン（ｐＭＯＮ１７５２４）及び対照（ｐＭＯＮ１ ７２２７）を発現するタバコ葉におけるショ糖、グルコース、及びデンプンのレ ベルの日中の変動を示す。明期は７：００時から１９：００時までである。完全 に拡大し老化していない葉のみを採取した。 図５は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１３９２５のプラスミド地図を示す。 図６は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１７５９０のプラスミド地図を示す。 図７は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１３９３６のプラスミド地図を示す。 図８は、植物形質転換ベクターｐＭＯＮ１７５８１のプラスミド地図を示す。 図９は、改良されていない非トランスジェニック・ラセット・バーバンク（Ｒ ｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）（下列）と比較された、固体均一性が改良された シーガル・ラセット・バーバンク（Ｓｅｇａｌ Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ ）系統（上列）のジャガイモ塊茎断面図を示す。 本発明は、生長および発育、収量、質、デンプン貯蔵の均一性、生長力および 、またはストレス耐性の増加あるいは改善を示す植物細胞および植物の生産方法 に向けられている。この方法では、遺伝子工学により植物の細胞ゲノムに組込ん だｆｄａ（フルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ）遺伝子をコードする ＤＮＡ配列を利用し、そのように作製したトランスジェニック植物にＦＤＡ酵素 を発現させる。ＦＤＡ酵素を過剰発現する植物では、カルヴィン回路を通しての 炭素の流れが増加 し、光周期初期の大気の炭素同化が増加し、その結果光合成の効率とデンプンの 産生が増加する。したがって、そのような植物では葉によるスクロースの産生が 増加し、一定の光周期中の炭素輸送が正味増加することとなる。このようにソー スでの収容量が上昇すると植物の生長も増加し、次により多くのバイオマスを産 生し、およびまたはシンクサイズを増し、最終的にはトランスジェニック植物の 収量が増大する。このバイオマスの増大とシンクサイズの上昇は、その植物の種 やＦＤＡ酵素を過剰発現する植物の生長条件によって、様々な様式あるいは植物 部位で示される。つまり、ＦＤＡの過剰発現によるサイズの上昇は、植物の種や ある特定の生長段階におけるシンクの部位、そして例えば干ばつ、気温、あるい は他のストレスといったある生長条件による環境の影響に依存して、種子、果実 、茎、葉、塊茎、鱗茎、あるいは他の植物部位で見られる。したがって、ＦＤＡ を過剰発現するトランスジェニック植物では、植物ソースやシンク器官への炭素 同化、輸送および貯蔵が増加し、結果として生長、収量、均一性および質の改善 がなされることになる。 ＦＤＡを過剰発現する植物は、ＦＤＡを過剰発現する植物の 種に依存し、デンプン、油およびまたはタンパク質の産生増加などの望ましい性 質をも示す。よって、特定の植物種でＦＤＡを過剰発現させることにより炭素の 流れの方向に影響を与えあるいは変化させ、解糖および糖新生代謝経路でのＦＤ Ａの役割を介して、代謝産物の利用および貯蔵をデンプン生産、タンパク質生産 、あるいは油生産に向けることができる。 外来ＦＤＡの発現により炭素の関係が変更するメカニズムは、ソース−シンク の関係に由来すると考えられる。葉の組織はスクロースのソースであり、ＦＤＡ 発現が増加したその活性によってより多くのスクロースがシンクに輸送されたと すると、シンク組織の一定重量当たりの炭素（糖、デンプン、油、タンパク質等 ）または窒素（タンパク質等）貯蔵量が増加することになる。 二本鎖ＤＮＡの形で存在する遺伝子の植物内での発現は、ＤＮＡの片方鎖から のＲＮＡポリメラーゼによるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写、続いて 起こる核内でのｍＲＮＡ一次転写産物のプロセシングを含む。このプロセシング は３'の非翻訳領域に関与し、ＲＮＡの３'末端にポリアデニル化ヌクレオチドを 付加する。ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写は、通常プ ロモーターと呼ばれるＤＮＡ領域によって制御される。プロモーター領域は、Ｒ ＮＡポリメラーゼに対し、ＤＮＡと関連し対応するＲＮＡ相補鎖を作る鋳型とし てＤＮＡの片方鎖を用いてｍＲＮＡの転写を開始する合図を出す塩基配列を含む 。次にこのＲＮＡが、細胞のタンパク質生合成機構により、そこにコードしてあ るタンパク質生産の鋳型として用いられる。 植物細胞内で活性を有する数々のプロモーターが文献に記されている。これに は、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）やオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモー ター（これらはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘 導プラスミド上に存在する）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９ Ｓおよび３５Ｓやゴマモザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ−プロモーター等のｃ ａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓプロモーター、非常に豊富な植物ポリペプチドであるリ ブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳ ＣＯ）の光誘導性プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロ モーター等が含まれる。これらのプロモーターはすべて、植物で発現される様々 なタイプのＤＮＡ構築物を構築するのに用いられている。例えば、 ＰＣＴ公報ＷＯ ８４／０２９１３を参照のこと。 植物細胞内でＤＮＡの転写を起こすと知られているあるいは見出されているプ ロモーターは、本発明で利用することが可能である。そのようなプロモーターは 植物や植物ウイルス等の様々な材料から得ることができ、増強したＣａＭＶ３５ ＳプロモーターやｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子等の植物遺伝子から単離したプロモ ーターを含むがこれに制限されない。以下に述べるように、選択した特定のプロ モーターはフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ酵素を有効量産生する に充分な発現をもたらすことができ、炭素同化、輸送あるいは貯蔵を望ましく増 加させることが好ましい。本発明の二本鎖ＤＮＡ分子の発現は恒常的なプロモー ターにより動かし、植物のすべてあるいはほとんどの組織でＤＮＡ分子を発現さ せることが可能である。代わりに、葉、茎、根、塊茎、種子、果実等の特異的組 織でｆｄａ遺伝子を発現させることも好ましい。選択したプロモーターは所望の 組織、発育特異性を示すであろう。当業者により、炭素同化、輸送あるいは貯蔵 の所望の増加を誘導するのに必要なフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラー ゼ量は、植物のタイプによって異なることが認識されるであろう。したがって、 所望の組織における発現能力と適当なプロモーター強度を有するプロモーターを 選択し、所望のフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ活性を産生する、 あるいは標的組織での糖質代謝が望ましく変更したトランスフォーマントを選択 することにより、プロモーター機能を最適化するべきである。植物ゲノムへの遺 伝子挿入位置により同じ異種遺伝子を含むトランスフォーマント間にもバリエー ションがあることから（通常、「位置効果」と呼ばれる）、トランスフォーマン トプールからの選択アプローチは、植物内での異種構造遺伝子の発現では日常的 に行われている。植物細胞でＤＮＡの転写（恒常的あるいは組織特異的）をもた らすことが知られているプロモーターに加えて、植物のｃＤＮＡライブラリーか ら目的の標的組織で選択的あるいは好ましく発現する遺伝子をスクリーニングし 、当該分野で既知の方法でプロモーター領域を単離することにより、その他のプ ロモーターを本発明に利用するため同定することも可能である。特に、トウモロ コシ、ソルガム、およびサトウキビ等のＣ４植物を利用してＦＤＡの過剰発現に より収量を増加させる場合、維管束鞘細胞特異的（あるいは細胞増強発現）プロ モーターを用い、恒常的プロモーターあるいは葉肉細胞増強発 現の性質を有するプロモーターを用いないのが望ましい。 葉や茎のような植物のソース組織でｆｄａ遺伝子を発現する目的には、本発明 の二本鎖ＤＮＡ分子内で利用されるプロモーターは、これら特異的組織で比較的 高い発現をすることが好ましい。このため、多くの葉特異的あるいは葉増強発現 をする遺伝子のプロモーターから選択してもよい。文献で知られているそのよう な遺伝子の例としては、エンドウマメの葉緑体グルタミンシンテターゼＧＳ２（ Ｅｄｗａｒｄら、１９９０）、小麦の葉緑体フルクトース１，６−ビスホスファ ターゼ（ＦＢＰａｓｅ）（Ｌｌｏｙｄら、１９９１）、ジャガイモの核光合成Ｓ Ｔ−ＬＳ１（Ｓｔｏｃｋｈａｕｓら、１９８９）、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓｔｈａｌｉａｎａのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）とカルコ ンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子（Ｌｅｙｖａら、１９９５）が挙げられる。また 、光合成活性のある組織で活性があると示されたものには、東洋カラマツ（Ｌａ ｒｉｘｌａｒｉｃｉｎａ）から単離されたリブロース１，５−ビスリン酸カルボ キシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、１９９４）；マツ（ｃａ ｂ６；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９４）、小麦（Ｃａｂ−１；Ｆｅｊｅｓら、１ ９９０）、 ホウレンソウ（ＣＡＢ−１；Ｌｕｅｂｂｅｒｓｔｅｄｔら、１９９４）、および 米（ｃａｂ１Ｒ；Ｌｕａｎら、１９９２）から単離されたＰＳＩＩのクロロフィ ルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｃａｂ遺伝子；トウモロコシからのピルビ ン酸正リン酸ジキナーゼ(ＰＰＤＫ)（Ｍａｔｓｕｏｋａら、１９９３）；タバコ Ｌｈｃｂ１^*２遺伝子（Ｃｅｒｄａｎら、１９９７）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＳＵＣ２スクロース−Ｈ＋共輸送体遺伝子（Ｔｒｕｅｒｎ ｉｔら、１９９５）；ホウレンソウから単離されたチラコイド膜タンパク質（ｐ ｓａＤ，ｐｓａＦ，ｐｓａＥ，ＰＣ，ＦＮＲ，ａｔｐＣ，ａｔｐＤ，ｃａｂ，ｒ ｂｃＳ；Ｏｅｌｍｕｅｌｌｅｒら、１９９２）がある。シロガラシのＬｈｃＢお よびＰｓｂＰ等の他のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質も研究され、文献に記 述されている（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ；Ｋｒｅｔｓｃｈら、１９９５）。こ こで述べたものに相同的なプロモーターについても、標準の分子生物学的手法に より標的あるいは関連する作物植物から単離して試験することができる。 例えば、ジャガイモ稙物の塊茎；トマトの果実；トウモロコシ、小麦、米、あ るいは大麦の種子といった植物のシンク組織 でこのｆｄａを発現させるために、本発明の二本鎖ＤＮＡ分子内で利用されるプ ロモーターは、これら特異的組織で比較的高い発現をすることが好ましい。クラ スＩパタチンプロモーター（Ｂｅｖａｎら、１９８６;Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、 １９９０）；ジャガイモ塊茎ＡＤＰＧＰＰ遺伝子の大および小サブユニット（Ｍ ｕｌｌｅｒら、１９９０）；スクロースシンターゼ（ＳａｌａｎｏｕｂａｔとＢ ｅｌｌｉａｒｄ、１９８７，１９８９）；２２ｋＤａタンパク質複合体およびプ ロテイナーゼインヒビターを含む主要塊茎タンパク質（Ｈａｎｎａｐｅｌ、１９ ９０）；顆粒結合デンプンシンターゼ遺伝子（ＧＢＳＳ）（Ｒｏｈｄｅら、１９ ９０）；他のクラスＩおよびＩＩパタチン（Ｒｏｃｈａ−Ｓｏｓａら、１９８９ ；Ｍｉｇｎｅｒｙら、１９８８）を含む多くの塊茎特異的あるいは塊茎増強発現 をする遺伝子が知られている。他のプロモーターも、種子や果実等の特異的組織 でフルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ遺伝子を発現させるのに用いる ことができる。βコングリシニンのプロモーター（Ｔｉｅｒｎｅｙ、１９８７） あるいはｎａｐｉｎやファゼオリンプロモーター等の他の種子特異的プロモータ ーを、種子でｆｄａ遺伝子を特異的に過剰発現させる ために利用することが可能である。ゼインは、トウモロコシの胚乳内に見られる 貯蔵タンパク質の１グループである。ゼイン遺伝子のゲノムクローンが単離され （Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９８２）、１５ｋＤａ，１６ｋＤａ，１９ｋＤａ，２ ２ｋＤａ，２７ｋＤａおよびガンマ遺伝子を含むこれらクローン由来のプロモー ターも、トウモロコシや他の植物の種子でｆｄａ遺伝子を発現させるのに利用で きる。トウモロコシ、小麦、あるいは米内で機能することが知られている他のプ ロモーターには、以下の遺伝子のプロモーターが含まれる：ｗａｘｙ、Ｂｒｉｔ ｔｌｅ、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ ２、枝つくり酵素ＩおよびＩＩ、デンプンシンター ゼ、枝切り酵素、オレオシン、グルテリンおよびスクロースシンターゼ。小麦や 米でと同様にトウモロコシの胚乳でｆｄａ遺伝子を発現するのに特に好ましいプ ロモーターは、米のグルテリン遺伝子のプロモータであり、さらに好ましくは、 Ｏｓｇｔ−１プロモーター（Ｚｈｅｎｇら、１９９３）；トウモロコシ顆粒結合 デンプンシンターゼ（ｗａｘｙ）遺伝子（ｚｍＧＢＳ）；米の小サブユニットＡ ＤＰＧＰＰプロモーター（ｏｓＡＧＰ）；ゼインプロモーター、特にトウモロコ シの２７ｋＤａゼイン遺伝子プロ モーター（ｚｍ２７）（一般的にＲｕｓｓｅｌｌら、１９９７を参照）である。 小麦でのｆｄａ遺伝子の発現に適したプロモーターの例としては、ＡＤＰグルコ ースピロホスホリラーゼ（ＡＤＰＧＰＰ）サブユニット、顆粒結合および他のデ ンプンシンターゼ、枝つくりおよび枝切り酵素、胚形成大量タンパク質、グリア ジン、およびグルテニン遺伝子のプロモーターが含まれる。米でのそのようなプ ロモーターの例としては、ＡＤＰＧＰＰサブユニット、顆粒結合および他のデン プンシンターゼ、枝つくり酵素、枝切り酵素、スクロースシンターゼ、およびグ ルテリン遺伝子のプロモーターが含まれる。特に好ましいプロモーターは、米グ ルテリンのプロモーター、Ｏｓｇｔ−１である。大麦でのそのようなプロモータ ーの例としては、ＡＤＰＧＰＰサブユニット、顆粒結合および他のデンプンシン ターゼ、枝つくり酵素、枝切り酵素、スクロースシンターゼ、ホルデニン、胚グ ロブリン、およびアリューロン特異的タンパク質遺伝子のプロモーターが含まれ る。 根組織の固形分は、根特異的プロモーターの下流でｆｄａ遺伝子を発現させるこ とにより増加できる。そのようなプロモーターの例として、酸性キチナーゼ遺伝 子のプロモーター （Ｓａｍａｃら、１９９０）が挙げられる。根組織における発現も、同定された ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの根特異的サブドメイン（Ｂｅｎｆｅｙら、１９８ ９）を利用することにより実施可能である。 本発明のＤＮＡ構築物により産生されるＲＮＡは、５'非翻訳リーダー配列も 含む。この配列は、遺伝子を発現するために選択したプロモーター由来でよく、 ｍＲＮＡの翻訳を上昇させるために特異的に修飾することが可能である。５'非 翻訳領域は、ウイルスＲＮＡ、適当な真核生物の遺伝子、あるいは合成遺伝子配 列からも得られる。本発明は以下の例で示される構築物に制限されず、その例で は非翻訳領域がプロモーター配列に付随する５'非翻訳配列由来である。反対に 、非翻訳リーダー配列は非関連のプロモーターあるいはコード配列由来でもよい 。 単子葉植物では、コード配列の発現を促進あるいは増強するため、イントロン が遺伝子構築物に好ましく含まれる。適当なイントロンの例にはＨＳＰ７０イン トロンおよび米のアクチンイントロンが含まれ、どちらも当該分野で周知である 。別の適当なイントロンとして、トウゴマのカタラーゼイントロン（Ｓｕｚｕｋ ｉら、１９９４）がある。ポリアデニル化シグナル キメラ植物遺伝子の３'非翻訳領域は、植物内でＲＮＡの３'末端にポリアデニ ル酸ヌクレオチドを付加する機能を果たすポリアデニル化シグナルを含む。適当 な３'領域の例としては、（１）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子等のＡｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シ グナルを含む転写された非翻訳３'領域、（２）大豆貯蔵タンパク質遺伝子およ びリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝 子と同様の植物遺伝子が挙げられる。フルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ活性のプラスチド方向への発現 本発明の一実施形態では、ＦＤＡタンパク質をプラスチドに標的とするため、 ｆｄａ遺伝子を葉緑体輸送ペプチドに融合させる。以下で用いるように、葉緑体 およびプラスチドは、アミロプラストを含む様々なプラスチド形態を含むよう意 図される。多くのプラスチド局在タンパク質は核の遺伝子から前駆体として発現 され、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）によりプラスチドへ標的とされる。ＣＴＰ は輸送段階で除去される。そのような 葉緑体タンパク質の例には、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの 小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ，ＳＳＵ）、５−エノールピルビン酸シキ ミ酸３−リン酸シンターゼ(ＥＰＳＰＳ)、フェレドキシン、フェレドキシンオキ シドレダクターゼ、集光性複合体タンパク質ＩとＩＩ、およびチオレドキシンＦ が含まれる。非プラスチドタンパク質はＣＴＰとの融合タンパク質を利用するこ とにより葉緑体に標的とできること、およびＣＴＰ配列はタンパク質をプラスチ ドに標的とするのに充分であることが示されている。当業者により、フルクトー ス１，６−ビスリン酸アルドラーゼ酵素を植物細胞のプラスチドに輸送するため に、特有のプラスチド輸送ペプチドの機能性を用いた様々な他のキメラ構築物が 作製可能であることも認識されるであろう。ｆｄａ遺伝子は、葉緑体ゲノムにそ の遺伝子を形質転換することにより、プラスチドに標的とすることも可能である （Ｄａｎｉｅｌｌら、１９９８）。フルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ この中で用いられる「フルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ」という 語は、グリセルアルデヒド３−リン酸（Ｇ３Ｐ）とジヒドロキシアセトンリン酸 （ＤＨＡＰ）を形成するフルク トース１，６−ビスリン酸の可逆的開裂を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．４．１．２． １３）を意味する。アルドラーゼ酵素は、クラスＩとクラスＩＩと呼ばれる二つ のクラスに分類される（ＷｉｔｋｅとＧｏｔｚ、１９９３）。トウモロコシのサ イトゾル酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ０７７８９；Ｓ１０６３８ ）、米のサイトゾル酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＱ０５４３）、 ホウレンソウのサイトゾル酵素（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ３１０９ １；Ｓ２２０９３）等の多数のタンパク質と同様に、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔ ｈａｌｉａｎａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ１１９５８）、ホウレン ソウ葉緑体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ３１０９０；Ａ２１８１５； Ｓ２２０９２）、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッ ション番号Ｓ０７８５５；Ｓ３７８８２；Ｓ１２９４５；Ｓ３９１７８；Ｓ４４ ５２３；Ｘ７５７８１）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｂ４０７６７；Ｄ４１０８０）、Ｂ．ｓｕｂ ｔｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ５５４２６；Ｄ３２３５４； Ｅ３２３５４；Ｄ４１８３５）、エンドウ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 Ｓ２９０４８；Ｓ３４４１１）、 エンドウ葉緑体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ２９０４７；Ｓ３４４１ ０）、トウモロコシ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ０５０１９）、Ｃｈ ｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ ン番号Ｓ４８６３９；Ｓ５８４８５；Ｓ５８４８６；Ｓ３４３６７）、Ｃｏｒｙ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ ン番号Ｓ０９２８３；Ｘ１７３１３）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕ ｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ５２４１３）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌ ｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｒｄ ＫＷ２０株）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ ン番号Ｃ６４０７４）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａ（Ｇｅ ｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ００５６９７）、米（ＧｅｎＢａｎｋアクセ ッション番号Ｘ５３１３０）、およびトウモロコシの嫌気的制御遺伝子（Ｇｅｎ Ｂａｎｋアクセッション番号Ｘ１２８７２）由来のアルドラーゼ酵素をコードす る様々なｆｄａ遺伝子の配列が決定されている。 クラスＩ酵素は、動物や植物といった高等真核生物、およびＰｅｐｔｏｃｏｃ ｃｕｓ ａｅｒｏｇｅｎｓ（Ｌｅｂｈｅｒｚ とＲｕｔｔｅｒ、１９７３）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ（Ｌｏｎ ｄｏｎとＫｌｉｎｅ、１９７３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｔｒ ｉｂｌｉｎｇとＰｅｒｈａｍ、１９７３）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅ ｇｍａｔｉｓ（Ｂａｉら、１９７５）、ほとんどのブドウ球菌種（Ｇｏｔｚら、 １９７９）等を含むいくつかの原核生物から単離される。ＦＤＡ酵素の遺伝子は 既知の方法により取得でき、ウサギ（Ｌａｉら、１９７４）、ヒト（Ｂｅｓｍｏ ｎｄら、１９８３）、ラット（Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、１９８４）、Ｔｒｙｐａｎ ｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ（Ｃｌａｙｔｏｎ、１９８５）、およびＡｒａｂｉｄ ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（Ｃｈｏｐｒａら、１９９０）等のいくつかの生 物体で既になされている。これらのクラスＩ酵素は総分子量約１６０ｋＤａの常 に四量体タンパク質であり、基質と活性部位内のリシン残基間にイミン形成する ことにより機能する（Ａｌｆｏｕｎｄｅｒら、１９８９）。 動物では、Ａ、ＢおよびＣとして分類される三つのクラスＩアイソザイムがそ れぞれ筋肉、肝臓、および脳組織のサイトゾルで発現し、発現と区画化パターン の点で植物アルドラーゼと 異なる（Ｊｏｈら、１９８６）。高等植物の葉ではＦＤＡはクラスＩ酵素であり 、そのクラスに二つの異なるイソ酵素が認められている。一方は葉緑体に含まれ 、もう一方はサイトゾルに含まれている（Ｌｅｂｈｅｒｚら、１９８４）。酸性 植物アイソザイムは葉緑体のもののようであり、葉の全アルドラーゼ活性の約８ ５％を成す。塩基性植物アイソザイムはサイトゾルのもので、どちらのアイソザ イムも核のゲノムにコードされているらしく、異なる遺伝子によってコードされ ている（Ｌｅｂｈｅｒｚら、１９８４）。 クラスＩＩタイプのアルドラーゼは分子量約８０ｋＤａの通常二量体であり、 その活性は二価の金属イオン依存性である。クラスＩＩ酵素は、ラン藻類や細菌 等の原核生物、および真核生物の緑藻類、菌類から単離される（Ｂａｌｄｗｉｎ ら、１９７８）。ＦＤＡクラスＩＩ酵素の遺伝子は既知の方法により取得でき、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＪａｃｋとＨａｒｒｉｓ 、１９７１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｊａ ｃｋ、１９７３）、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｂａｌｄｗｉｎ ら、１９７８）を含むいくつかの生物体で既になされている。 同様の触媒活性を有する相同性の高いクラスＩＩフルクトース１，６−ビスリ ン酸アルドラーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ ｉｌｉｓ）；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｓｐｈａｅｒｏ ｉｄｅｓ）；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒ ｉｕｍ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ）；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ（ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（Ｃｈ ｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）；Ｃａｎｄｉｄａ（Ｃａｎ ｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｃｏｒｙｎ ｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ （Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）；およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｓ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ）等の他種の微生物でも発見で きると考えられている。 そのような配列は、例えば核酸ハイブリダイゼーションのような既知技術によ って容易に単離可能である。定められた核酸 対のハイブリダイゼーション性質が、類似性あるいは同一性の指標となる。核酸 配列は、既知のｆｄａ配列とハイブリ大豆する能力に基づいて選択できる。相同 性あるいは同一性の低い配列を選択するためには、低厳密性条件を採用する。約 ０．１５Ｍから約０．９Ｍ塩化ナトリウム、約２０℃から約５５℃範囲の温度と いった条件を利用することが望まれる。開示した配列と同一性の高い核酸配列を 選択するためには、高厳密性条件を採用する。典型的に用いられる条件は、約０ ．０２Ｍから約０．１５Ｍ塩化ナトリウム、約０．５％から約５％カゼイン、約 ０．０２％ＳＤＳあるいは約０．１％ Ｎ−ラウリルザルコシン、約０．００１ Ｍから約０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃から約７０℃のハイブリダイ ゼーション温度である。さらに好ましくは、高厳密性条件は、約０．０２Ｍ塩化 ナトリウム、約０．５％カゼイン、約０．０２％ ＳＤＳ、約０．００１Ｍクエ ン酸ナトリウム、約５０℃のハイブリダイゼーション温度である。当業者各人に より、当該分野で既知のｆｄａ配列と類似性を有するｆｄａ配列を単離するため の核酸ハイブリダイゼーションを実施する条件や方法に多くのバリエーションが 可能であり、ここで明らかに開示したものに限らないことが認識され るであろう。そのようなアプローチは、開示されたＥ．ｃｏｌｉのｆｄａ配列と の同一性が好ましくは６０％を超え、さらに好ましくは７０％を超え、最も好ま しくは８０％を超えるｆｄａ配列を単離するのに利用する。 Ｅｕｇｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｍｕｎｄａ ｎａ、およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｍａｓｒｈｅｉｎｈａｒｄｉは、生育条件に 依存してクラスＩあるいはクラスＩＩアルドラーゼを産生する（Ｃｒｅｍｏｎａ 、１９６８；ＲｕｓｓｅｌｌとＧｉｂｂｓ、１９６７；Ｇｕｅｒｒｉｎｉら、１ ９７１）。 Ｅ．ｃｏｌｉからのクラスＩＩｆｄａ遺伝子の単離を以下の例で示す。そのＤ ＮＡ配列を配列番号１および図１に示す。アミノ酸配列は配列番号２および図１ に示す。この遺伝子は単離して、述べたように選択した形質転換方法に適した植 物発現ベクターに挿入することにより利用できる。Ｅ．ｃｏｌｉのＦＤＡ酵素は ｐＨ７から９近傍に明らかなｐＨ至適範囲があり、５から７の低いｐＨ範囲でも 活性を保持する（Ｂａｌｄｗｉｎら、１９７８；Ａｌｆｏｕｎｄｅｒら、１９８ ９）。 このように、フルクトース１，６−ビスリン酸アルドラーゼ 活性をコードする多くの異なる遺伝子が単離され、本発明に利用できる。合成遺伝子の構成 本発明で考慮する糖質代謝酵素は、デンプンあるいはスクロースの合成あるい は分解に関与する反応を触媒する能力を示すタンパク質、ポリペプチド、あるい はペプチドフラグメントのいずれかのアミノ酸配列を含む。これらは藻類、細菌 、菌類、および原生動物等の異種材料、あるいは内在性の稙物配列から取得した 配列でもよく、その場合植物細胞に自然に見出されるいずれかの配列を意味し、 植物ウイルスあるいは植物病原性細菌由来の配列と同様に自然の（常在性の）植 物配列を含む。 糖代謝酵素遺伝子配列は部位特異的突然変異あるいはＰＣＲのような標準技術 によって修飾でき、またその配列の修飾は合成核酸配列を作製することにより達 成することが普通の当業者により認識され、本発明の糖生合成酵素の核酸配列も なお考慮されるであろう。例えばコドンの「ゆらぎ」部位を核酸配列が同じアミ ノ酸配列をコードするように変えたり、あるいは代わりに、保存的なアミノ酸の 置換が起こるようにコドンを変えることもできる。どちらの場合も、ペプチドあ るいはタンパク質 は目的の酵素活性を維持し、よってこれも本発明の一部と考える。 糖代謝酵素の核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡ配列で、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ 、ｍＲＮＡ由来あるいは全体または一部が合成されたものである。例えば適当な ソースからゲノムＤＮＡを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的 の配列を増幅しクローニングすることにより、構造遺伝子配列をクローニングす ることができる。代わりに、遺伝子配列は完全にまたは一部合成してもよく、特 に植物に好まれる配列を提供することが望ましい。このように、目的の構造遺伝 子の全体または一部は、選択した植物宿主の好むコドンを用いて合成してもよい 。植物の好ましいコドンは、例えば、その植物宿主種で発現されるタンパク質で 最も頻繁に利用されているコドンから決定する。遺伝子配列の他の修飾により、 わずかに異なった活性を有する変異体が得られる。 所望であれば、タンパク質配列を変えることなく、形質転換植物内で発現量を 増やしそのため糖含量にさらにポジティブに影響する方法で、ｆｄａ遺伝子の遺 伝子配列を変えることができる。遺伝子配列を変える好ましい方法は、ＰＣＴ公 報ＷＯ ９０ ／１００７６に述べられている。その中で述べられている方法論に従って合成し た遺伝子は、以下に示すように植物に導入し、ＦＤＡ酵素の発現量を増すことが できる。これは特に、トウモロコシ、米、小麦、サトウキビ、および大麦等の単 子葉植物で有効である。他のトランスジーンとの併用 ＰＣＴ公報ＷＯ ９６／２４６７９に記されたスクロースホスホリラーゼをコ ードする遺伝子、あるいはＥ．ｃｏｌｉのｇｌｇＣ遺伝子とその突然変異遺伝子 ｇｌｇＣ１６のようなＡＤＰＧＰＰ遺伝子といった、糖同化あるいは含量にポジ ティブな効果を与える他の遺伝子と併用することにより、トランスジェニック植 物内でのｆｄａの効果を増強できる。ＰＣＴ公報ＷＯ ９１／１９８０６により 、デンプンあるいは固形物を増加させるため、後者の遺伝子を導入する方法が開 示されている。炭素同化、輸送あるいは貯蔵を増加させるためにｆｄａと併用で きる遺伝子は、他に、スクロースリン酸シンターゼ（ＳＰＳ）がある。ＰＣＴ公 報ＷＯ ９２／１６６３１によって、そのような一遺伝子およびトランスジェニ ックでのその利用が開示されている。植物の形質転換／再生 本発明の核酸構築物を開発する上では、通常、構築物またはそのフラグメント の様々な構成成分を、例えばＥ．ｃｏｌｉ等の細菌宿主内で複製可能なプラスミ ドのような簡便なクローニングベクターに挿入する。文献に記述された数多くの ベクターが存在し、そのうちの多くは市販されている。クローニング後、所望の インサートを含むクローニングベクターを単離し、目的の配列の構成成分を適応 させるために制限消化、新しいフラグメントまたはヌクレオチドの挿入、ライゲ ーション、欠失、変異、切除等のさらなる操作を実施してもよい。構築物が作製 できたら、次は、宿主細胞の形質転換方法に従ったさらなる操作に適したベクタ ーに移行させる。 本発明のＤＮＡ分子は、形質転換細胞を非形質転換細胞から容易に同定して選 択できるように、典型的に選択マーカーを含む。そのような例としては、これに 限らないがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子（Ｐｏ ｔｒｙｋｕｓら、１９８５）が含まれ、これはカナマイシン耐性を付与する。ｎ ｐｔＩＩ遺伝子を発現している細胞は、カナマイシンやＧ４１８等の適当な抗生 物質を用いて選択することができる。他のよく 用いられる選択マーカーとして、ｂｉａｌａｐｈｏｓ耐性を付与するｂａｒ遺伝 子；グリフォセート耐性を付与する突然変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（Ｈｉｎ ｃｈｅｅら、１９８８）；ブロモキシニル耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子（ Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８８）；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素耐性を付 与する突然変異アセトラクテートシンターゼ遺伝子(ＡＬＳ)（ヨーロッパ特許出 願番号１５４，２０４、１９８５）；およびメトトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝 子（Ｔｈｉｌｌｅｔら、１９８８）が含まれる。 本発明の実施により、炭素同化を増強し、炭素輸送および分配を上昇できる植 物は、アカシア、アルファルファ、ａｎｅｔｈ、リンゴ、アンズ、アーティチョ ーク、アルキュラ、アスパラガス、、アボカド、バナナ、大麦、マメ類、ビート 、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、カノ ーラ、カンタループメロン、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリ、サ クランボ、コエンドロ、カンキツ類、クレメンタイン、コーヒー、トウモロコシ 、綿、キュウリ、ベイマツ、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ユーカリ、ウイキ ョウ、イチジク、ヒョウタン、ブドウ、グレープフルーツ、ハニ ーデューメロン、クズイモ、キーウィフルーツ、レタス、リーキ、レモン、ライ ム、テーダマツ、マンゴー、メロン、マッシュルーム、ナッツ、カラスムギ、ア ブラナ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、パパイヤ、パセリ、エンドウ マメ、モモ、ペーナッツ、西洋ナシ、ピーマン、カキ、マツ、パイナップル、プ ランタン、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジア ータマツ、チコリ、ダイコン、ラズベリー、米、ライムギ、モロコシ、ｓｏｕｔ ｈｅｒｎ ｐｉｎｅ、大豆、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウダイコン 、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェリン、茶、タバ コ、トマト、ライ小麦、芝生、つる植物、スイカ、小麦、ヤムイモ、およびズッ キーニを含むがこれに限らない。 ｆｄａ遺伝子を含む本発明の二本鎖ＤＮＡ分子は、いずれかの適当な方法によ り植物のゲノムへ挿入することができる。 適当な植物形質転換ベクターは、例えばＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら（ １９８３）、Ｂｅｖａｎ（１９８４）、Ｋｌｅｅら（１９８５）、およびＥＰＯ 公報１２０，５１６によって開示されたものと同様にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド由来のものを 含む。植物細胞に本発明のＤＮＡ構築物を挿入するためには、Ａｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍのＴｉあるいは根誘導（Ｒｉ）プラスミド由来の植物形質転換ベクタ ーに加えて、他の方法も利用可能である。そのような方法には、例えばリポソー ム、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡの取り込みを増加させる化学薬品、微 粒子銃を介しての遊離ＤＮＡの導入、およびウイルスまたは花粉を利用した形質 転換が含まれる。ＤＮＡは葉緑体ゲノムに挿入してもよい（Ｄａｎｉｅｌｌら、 １９９８）。 微粒子銃を用いて単子葉植物にｆｄａ遺伝子を導入するのに適したプラスミド 発現ベクターは、以下のように構成される：通常胚乳であるが、単子葉植物のデ ンプン貯蔵組織での発現において特異的あるいは増強されるプロモーターで、例 えばトウモロコシの胚乳に見出されるゼイン遺伝子のプロモーター（Ｐｅｄｅｒ ｓｅｎら、１９８２）；遺伝子の発現を促進するためのスプライス部位を提供す るイントロンで、例えばＨｓｐ７０イントロン（ＰＣＴ公報ＷＯ ９３／１９１ ８９）；ノパリンシンターゼ３'配列（ＮＯＳ ３'；Ｆｒａｌｅｙら、１９８３ ）のような３'ポリアデニル化シグナル。この発現カセットは、大量ＤＮＡの作 製に適した高コピーレプリコン上で構 築するとよい。 双子葉植物の形質転換への利用に特に有効なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに基 づく植物形質転換ベクターは、プラスミドベクターｐＭＯＮ５３０（Ｒｏｇｅｒ ｓら、１９８７）である。プラスミドｐＭＯＮ５３０はｐＭＯＮ３１６（Ｒｏｇ ｅｒｓら、１９８７）の２．３ｋｂ ＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを ｐＭＯＮ５２６に組込んでできた、ｐＭＯＮ５０５の派生物である。プラスミド ｐＭＯＮ５２６は、ｐＭＯＮ５０５をＸｍａＩで切断し、クレノウポリメラーゼ 処理し、ライゲーションによりＳｍａＩ部位を除去した、ｐＭＯＮ５０５の単純 派生物である。プラスミドｐＭＯＮ５３０はｐＭＯＮ５０５のすべての性質とＣ ａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ発現カセットを保持し、プロモーターとポリアデニル化シ グナル間にＳｍａＩ単独切断部位を含む。 バイナリーベクターｐＭＯＮ５０５は、Ｔｉプラスミド相同性領域であるＬＩ ＨをミニＲＫ２プラスミドであるｐＴＪＳ７５（ＳｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒとＨ ｅｌｉｎｓｋｉ、１９８５）の３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩセグメン トに置換したｐＭＯＮ２００（Ｒｏｇｅｒｓら、１９８７）の派生物で ある。このセグメントは、ＲＫ２の複製起点であるｏｒｉＶ、三親接合法（Ｈｏ ｒｓｃｈとＫｌｅｅ、１９８６）を利用してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへ接合 するための転移起点であるｏｒｉＴを含む。プラスミドｐＭＯＮ５０５は、ＤＮ Ａフラグメントを挿入するための合成マルチリンカー、植物細胞をカナマイシン 耐性とするキメラＮＯＳ／ＮＰＴＩＩ'／ＮＯＳ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＡ ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓでの選択のためのスペクチノマイシン／ストレプトマ イシン耐性決定因子、トランスフォーマントおよび子孫への遺伝の評価を容易に する完全なノパリンシンターゼ遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉ内で大きなベクター の作製を容易にするｐＢＲ３２２複製起点を含むｐＭＯＮ２００の重要な性質を すべて保持する。プラスミドｐＭＯＮ５０５は、ｐＴｉＴ３７ノパリン型Ｔ−Ｄ ＮＡの右端由来の単一Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含む。サザンブロット解析により、 プラスミドｐＭＯＭ５０５およびこれに保有されるいずれのＤＮＡも植物ゲノム に挿入される、つまり、プラスミド全体が植物ゲノムに挿入されるＴ−ＤＮＡで あることが示された。挿入されたＤＮＡの一端は右の境界配列とノパリンシンタ ーゼ遺伝子間に位置し、もう一方の端は境界配列とｐＢＲ３２２ 配列間にある。 特に有効なＴｉプラスミドカセットベクターとしては、他にｐＭＯＮ１７２２ ７がある。このベクターはＰＣＴ公報ＷＯ９２／０４４４９に記述されており、 グリフォセート耐性を付与する酵素をコードする遺伝子（ＣＰ４と呼ばれる）を 含み、これはジャガイモやトマトを含む多くの植物の優れた選択マーカー遺伝子 である。この遺伝子はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチド （ＣＴＰ２）に融合し、その中で述べられているようにＦＭＶプロモーターから 発現される。 ｆｄａ遺伝子あるいはｃＤＮＡを含む適当数の細胞（またはプロトプラスト） が得られたら、細胞（またはプロトプラスト）を完全な植物体へ再生させる。再 生段階での方法論の選択は重要ではなく、マメ科（アルファルファ、大豆、クロ ーバ等）、セリ科（ニンジン、セロリ、パースニップ等）、アブラナ科（キャベ ツ、ダイコン、カノーラ／アブラナ等）、ウリ科（メロンおよびキュウリ）、イ ネ科（小麦、大麦、米、トウモロコシ等）、ナス科（ジャガイモ、タバコ、トマ ト、ピーマン）、ヒマワリ等の様々な花の作物、およびアーモンド、カシューナ ッツ、クルミ、ピカーン等の木の実のなる木を宿主として適当な手法 が利用できる。例えば、Ａｍｍｉｒａｔｏら（１９８４）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ら（１９８９）；Ｆｒｏｍｍ（１９９０）；Ｖａｓｉｌら（１９９０）；Ｖａｓ ｉｌら（１９９２）；Ｈａｙａｓｈｉｍｏｔｏ（１９９０）；およびＤａｔｔａ ら（１９９０）を参照のこと。 当業者が本発明の詳細な説明を容易に理解できるよう、以下の定義を提供する 。 「プロモーター」あるいは「プロモーター領域」という語は、通常コード配列 の土流（５'）に見られ、ＲＮＡポリメラーゼの認識部位あるいは正確な部位で の転写開始に必要な他の因子を提供することにより、メッセンジャーＲＮＡ（ｍ ＲＮＡ）の産生を制御することでコード配列の発現を制御する核酸配列のことを 言う。この中で考えたように、プロモーターあるいはプロモーター領域は、様々 な調節配列へのライゲーション、ランダムまたは調節下の突然変異誘発、および エンハンサー配列の付加または重複によって派生したプロモーターのバリエーシ ョンを含む。この中で開示したプロモーター領域および生物学機能的にこれと同 等なものは、適当な組換えベクターの一部として宿主に導入されると、ｍＲＮＡ を産生する能力として示される ように、その制御下でコード配列の転写を行う働きをする。 「再生」は、植物細胞（例えば、植物のプロトプラストあるいは外植体）から 植物を成長させる過程を言う。 「形質転換」は、外来核酸配列（例えば、ベクター、組換え核酸分子）を細胞 またはプロトプラストに導入する過程を言い、外来核酸は染色体に挿入されるか あるいは自己複製可能である。 「形質転換した細胞」とは、外来核酸分子の細胞内への導入により、そのＤＮ Ａが変化した細胞のことである。 「遺伝子」という語は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成Ｄ ＮＡ、あるいはペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ分子をコードする 他のＤＮＡ、およびコード配列に隣接し発現の調節に関与する領域のことを言う 。 「同一性」とは、二つの核酸あるいはタンパク質間の類似度のことを言う。二 つの配列のアラインメントは、適当なコンピュータープログラムを利用して行う 。配列アラインメントを実施するのに広く用いられ、認められているコンピュー タープログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ ｖ１．６（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９ ４）である。一致した塩基またはアミノ酸の数を塩基またはアミノ酸の総数で割 り、１００を掛け、パーセント同一性 が得られる。例えば、二つの５８０塩基対配列に一致する塩基が１４５あったら 、２５パーセントの同一性となる。二つの比較する配列の長さが異なる場合には 、一致した数を二つの短い方で割る。例えば、２００および４００アミノ酸のタ ンパク質間に一致するアミノ酸が１００あった場合、短い方に関して５０パーセ ントの同一性となる。もし短い方の配列の長さが５０塩基または５０アミノ酸に 満たない場合は、一致した数を５０で割って１００を掛け、パーセント同一性を 得る。 「Ｃ末端領域」とは、ペプチド、ポリペプチド、あるいはタンパク質鎖の中央 から遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸を保有する末端までの領域を言う。 「プロモーター領域と異種のＤＮＡセグメント」という語句は、コードするＤ ＮＡセグメントがそれと繋げるプロモーターと自然には同じ遺伝子内に存在しな いということを意味する。 「コードするＤＮＡ」という語は、この中で述べた酵素のいずれかをコードす る染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、あるいは合成ＤＮＡのことを言 う。 「ゲノム」という語は、細菌に適用する場合、細菌宿主細胞内の染色体とプラ スミドの両者を含む。細菌宿主細胞内に導入 される本発明のコードするＤＮＡは、それゆえ染色体に挿入されるか、あるいは プラスミドに存在する。「ゲノム」という語は、植物細胞に適用する場合、核内 に見出される染色体ばかりでなく、細胞の細胞成分内に見出されるオルガネラＤ ＮＡも含む。植物細胞内に導入される本発明のＤＮＡは、それゆえ染色体に挿入 されるか、あるいは細胞小器官に存在する。 「微生物」(ｍｉｃｒｏｂｅまたはｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ)という語は、 藻類、細菌、菌類、および原生動物のことを言う。 「ムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）」という語は、ペプチド、ポリペプチド、あるい はタンパク質の変異型を言う。 「Ｎ末端領域」とは、ペプチド、ポリペプチド、あるいはタンパク質鎖の遊離 のアミノ基を有するアミノ酸から鎖の中央までの領域を言う。 「過剰発現」とは、宿主細胞に導入したＤＮＡによってコードされるポリペプ チドまたはタンパク質の発現のことを言い、該ポリペプチドまたはタンパク質は 宿主細胞内に通常通りに存在しないか、あるいは該ポリペプチドまたはタンパク 質は、該ポリペプチドあるいはタンパク質をコードする外来ＤＮＡから通常発現 されるよりも高いレベルで発現されるように、該宿主 細胞に存在する。 「プラスチド」という語は、アミロプラスト、葉緑体、有色体、エライオプラ スト、エオプラスト、エチオプラスト、白色体、およびプロプラスチドを含む植 物細胞の細胞小器官のクラスのことを言う。これらの細胞小器官は自己複製し、 植物の種により大きさが約１２０ｋｂから２１７ｋｂにわたる一般的に「葉緑体 ゲノム」と呼ばれる環状ＤＮＡ分子を含み、これは通常逆方向反復領域を含む。 「単純糖基質」という語句は、単糖あるいはオリゴ糖を意味し、多糖は意味し ない；単純糖基質は、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースを含 む。コーンシロップ、デンプン、および糖蜜等の通常培地に用いられるさらに複 雑な糖基質は、単純糖基質に分解することができる。 「固形物」という語は、ほとんどがデンプン、他の多糖、単純糖、非構造的糖 、アミノ酸および他の有機分子からなる塊茎（ジャガイモ等の）あるいは果実（ トマト等の）の非水系成分ことを言う。 本発明の実施をより明らかにするため以下の例を提供するが、いかなる点にお いても本発明の範囲を限定するために妨げられ ない。当業者により、本発明の精神と範囲から外れることなく、ここで述べた方 法および遺伝子に様々な修飾、省略等が可能であることが認識されるであろう。 実施例 実施例１ ｃＤＮＡクローン化および過発現 他に示されない限り、ＰＣＲ、アガロース電気泳動、制限消化、連結反応、大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換、コロニースクリーニング、ウェスタンブロット などの基本的なＤＮＡ操作および遺伝子技法は、本質的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他 （１９８９）またはＭａｎｉａｔｉｓ他（１９８２）に記載されているプロトコ ルによって行った。 大腸菌ｆｄａ遺伝子配列（配列番号：１）をＧｅｎｂａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉ ｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｘ１４６８２）から得て、５’および３’末端に相同性を 有するヌクレオチドプライマを、ＰＣＲ増幅用に設計した。大腸菌染色体ＤＮＡ を抽出し、大腸菌ｆｄａ遺伝子を、５’オリゴヌクレオチド ５’ＧＧＧＧＣＣ ＡＴＧＧＣＴＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＡＴＴＴＣＧＴＡ３’（配列番号：３）およ び３’オリゴヌクレオチド ５’Ｃ ＣＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＡＧＡＡＣＧＴＣＧＡＴＣＧＣＧＴＴＣＡＧ３’（ 配列番号：４）を使用してＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲサイクル条件は次の通 りであり、すなわち、９４℃、５分（１サイクル）；ポリメラーゼの添加；９４ ℃、１分、６０℃、１分、７２℃、２分３０秒（３５サイクル）であった。１． ０８ｋｂＰＣＲ生産物をゲル精製し、大腸菌発現ベクタ、ｐＭＯＮ５７２３に結 合させて、凍結受容能のある大腸菌ＪＭ１０１細胞の形質転換に使用されるベク タ構造を形成した。ｐＭＯＮ５７２３ベクタは、大腸菌ｒｅｃＡプロモータおよ びＴ７遺伝子１０リーダ（Ｇ１０Ｌ）配列を含有し、大腸菌での高レベルの発現 が可能である（Ｗｏｎｇ他、１９８８）。形質転換した細胞を誘導した後、ＳＤ Ｓ ＰＡＧＥゲル上には約４０ｋＤａの明瞭なタンパク質バンドが明らかであり 、これは二量体アルドラーゼＩＩのサブユニットポリペプチド鎖のサイズと相互 に関連するものである。ほとんどの誘導タンパク質は、可溶性の相に存在するこ とが示された。高度に誘導されたタンパク質を含有するゲル切片を分離し、ホモ ジナイズされたゲル切片（フロイント完全アジュバントで乳化した）を注射した ヤギで抗体を生産した。 ｔａｑプロモータの制御下で、引き続きｆｄａ遺伝子配列を別の大腸菌発現ベ クタへとクローン化した。このベクタにより形質転換されたＪＭ１０１細胞のＩ ＰＴＧによる誘導は、同様に４０ｋＤａの過発現タンパク質バンドを示した。こ の新しいクローンを、ＦＤＡ活性用の酵素検定で使用した。このベクタ構造によ り形質転換された細胞を、液体培養物中で成長させ、ＩＰＴＧで誘導し、さらに ３時間成長させた。次に、細胞培養物３ｍＬをスピンダウンし、１００ｍＭのト リスに溶解させ、音波処理した。細胞ペレットをスピンダウンし、Ｂａｌｄｗｉ ｎ他（１９７８）に記載されている共役酵素検定を使用して、未精製の細胞抽出 液の上澄みを、ＦＤＡ活性について検定した。この検定は、３０℃で定期的に行 った。 最終濃度でトリス１００ｍＭ ｐＨ８．０、フルクトース１，６ビスリン酸４ ．７５ｍＭ、ＮＡＤＨ０．１５ｍＭ、ＴＩＭ ５００Ｕ／ｍＬ、およびＧＤＨ ３０Ｕ／ｍＬを含有する反応混合物中に、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＩ Ｍ）およびアルファグリセロリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の酵素が過剰に 存在する最終体積１ｍＬ中で反応を行った。 細胞抽出液の上澄みを添加した後、ＨＰダイオードアレイ分 光光度計を使用して、３４０ｎｍでの吸光度収の減少を記録した。アルドラーゼ 活性１国際単位（Ｉ．Ｕ．）は、この検定システムにおいて毎分ＮＡＤＨ２μｍ ｏｌの酸化を引き起こすものである。 ｆｄａ配列を有するベクタを含有した細胞抽出液のアルドラーゼ活性（タンパ ク質１ｍｇ当たり１３．１Ｉ．Ｕ．）は、対照ベクタで形質転換された細胞（タ ンパク質１ｍｇ当たり０．１５Ｉ．Ｕ．）に比べ、実質的な増加を示した。この 活性は、クラスＩＩのアルドラーゼを特に阻害することが知られているＥＤＴＡ によって、阻害されることが示された。 実施例２ タバコでの植物形質転換およびｆｄａ発現 ＦＤＡタンパク質のターゲッティング 植物のオルガネラ中での炭水化物の代謝およびデンプンの生合成に対する影響 を評価するため、大腸菌フルクトース１．６ビスリン酸アルドラーゼの標的をこ れらの植物のプラスチドとした。大腸菌アルドラーゼをプラスチドに移入するた めに、アルドラーゼをＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの小サブユニットシグナルペプチ ド（ＣＴＰ１）（Ｓｔａｒｋ他、１９９２）またはト ウモロコシの小サブユニットＣＴＰ（Ｒｕｓｓｅｌｌ他、１９９３）と融合させ てベクタを構成し、ＣＴＰ−ｆｄａ融合遺伝子が、ゴマノハグサのモザイクウィ ルスからの３５Ｓプロモータ（Ｐ−ＦＭＶ３５Ｓ；Ｇｏｗｄａ他、１９８９）と 、ノパリン合成酵素遺伝子配列の３’位が翻訳されない領域（ＮＯＳ３’；Ｆｒ ａｌｅｙ他、１９８３）との間に位置する構造を創り出した。発現カセットを含 有するベクタ構造［Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ１／ｆｄａ／ＮＯＳ３’］は、タバコ原 形質体の形質転換のために引き続き使用するが、これは以下の修正を加えながら Ｆｒｏｍｍ他（１９８７）に記述されるように行った。タバコ栽培変種キサンチ ・系統Ｄ（Ｔｘｄ）細胞懸濁液を、暗闇の中、２５０ｍＬフラスコ中で、２５℃ 、１３８ｒｐｍで成長させた。維持のため、体積９ｍＬの継代培養物を除去し、 ＭＳ塩、スクロース３％、イノシトール０．２ｇ／Ｌ、アスパラギン０．１３ｇ ／Ｌ、５０ｍｇ／ｍＬのＰＣＰＡ株８０μＬ、１ｍｇ／ｍＬのキネチン株５μＬ 、および１０００×ビタミン（ニコチン酸１．３ｇ／Ｌ、チアミン０．２５ｇ／ Ｌ、ピリドキシンＨＣＬ０．２５ｇ／Ｌ、およびパントテン酸カルシウム０．２ ５ｇ／Ｌ）１ｍＬを含有する４０ｍｌの新しいＴｘｄ培地に３〜４日おきに添加 した。 ２日経過した培養物から得られた１日経過した後の懸濁液細胞から、原形質体を 分離した。細胞１６ミリリットルを、新しいＴｘｄ培地４０ｍＬに添加し、２４ 時間成長させた後、原形質体を消化し分離した。酵素混合のための遠心段階は無 くした。電気穿孔法緩衝液および原形質体分離培地は、高圧滅菌するのではなく 濾過滅菌した。電気穿孔法緩衝液は、添加された４ｍＭのＣａＣｌ₂を有してい なかった。懸濁液細胞を酵素中で１時間消化した。原形質体を血球計でカウント し、自然のままの円形に見える原形質体のみをカウントした。電気穿孔法では、 ０．４−ｃｍギャップ、最大体積０．８ｍＬのＢｉｏ−ｒａｄ ＧｅｎｅＰｕｌ ｓｅｒキュベット（カタログ＃１６５−２０８８）を使用した。キュベットごと に、注目する遺伝子を含有するＤＮＡ５０〜１００μｇとともに、ルシフェラー ゼ遺伝子を含有する内部対照ＤＮＡ５μｇを添加した。電気穿孔法での最終の原 形質体密度は２×１０⁶／ｍＬであり、電気穿孔器の設定は、Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒで容量５００μファラドおよび１４０ボルトであった。 原形質体は、電気穿孔法緩衝液に再懸濁させた後氷の上に置き、電気穿孔法の後 １０分経過するまでそのままキュベットの氷の上に保った。原形質を、Ｔｘｄ 培地７ｍＬ＋０．４Ｍのマンニトールに添加し、電気穿孔法を行った後に培地を ならした。この段階では、ココナツ水はもはや使用しなかった。原形質体を、１ 時間の昼／夜の光周期方式で２６℃で成長させ、スピンダウンして検定し、また は電気穿孔の２０〜２４時間後に凍結させた。 形質転換後に得られた原形質体抽出液について行ったウェスタンブロット分析 は、タバコ原形質体の成熟したＦＤＡにプロセシングされたことを示していた。 約４０ｋＤａで移動するタンパク質の発現が検出されたが、この量はアルドラー ゼのサブユニットの分子量であり、大腸菌中のアルドラーゼが過発現した後にも 観察されたタンパク質のサイズである。 選択可能な標識発現カセットと同様の配向で、引き続き、発現カセット［Ｐ− ＦＭＶ／ＣＴＰ１／ｆｄａ／ＮＯＳ３’］をクローン化してｐＭＯＮ１７２２７ のＮｏｔＩ部位（ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０４４４９に記載されている）とし、第 ２図に示す植物の形質転換ベクタｐＭＯＮ１７５２４（配列番号：５）を形成し た。 米国特許第５４６３１７５号に記載されているが、ｆｄａ遺伝子とＡｒａｂｉ ｄｏｐｓｉｓＥＰＳＰＳシグナルペプチド （ＣＴＰ２）を融合させて、タバコ原形質体の形質転換のために追加の構造を作 成し使用した。シグナルペプチドをクローン化して（ＳｐｈＩ部位を通して）、 ＣＴＰ１−ｆｄａ融合（上述の）でのｆｄａ遺伝子配列のＮ−末端からすぐ上流 に位置するＳｐｈＩ部位を得た。次いでこの新しいＣＴＰ２−ｆｄａ融合遺伝子 をクローン化して、ＦＭＶプロモータとＮＯＳ３’配列の間にベクタを得た。Ｃ ＴＰ２／ｆｄａ遺伝子配列を含有するこの構造をタバコ原形質体の形質変換に使 用したとき、約４０ｋＤａで移動するタンパク質の発現が検出されたが、この量 はアルドラーゼのサブユニットの分子量であり、大腸菌中のアルドラーゼが過発 現した後にも観察されるタンパク質のサイズである。 次いで選択可能な標識発現カセットと同様の配向で、この構造からのＮＯｔＩ カセット［Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２／ｆｄａＮＯＳ３’］をクローン化してｐＭＯ Ｎ１７２２７のＮｏｔＩ部位を得、第３図に示す植物の形質転換ベクタｐＭＯＮ １７５４２（配列番号：６）を形成した。 タバコ原形質体でのＦＤＡの細胞質発現のため、ｆｄａ遺伝子配列（シグナル ペプチドと結合することなく）をクローン化 してＦＭＶプロモータとＮＯＳ３’配列の間にベクタ骨格が得られる構造を作成 した。タバコ原形質体を形質転換するためにこの構造を使用することによって、 約４０ｋＤａで移動する同じサイズのタンパク質の発現も示された。 タバコ植物でのｆｄａ発現 米国特許第５４６３１７５号に示すように、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの小サブ ユニットＣＴＰ１(ｐＭＯＮ１７５２４)（配列番号：５、第２図）およびＡｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓＥＰＳＰＳ（ＣＴＰ２）シグナルペプチド（ｐＭＯＮ１７５４ ２）（配列番号：６、第３図）と融合したｆｄａ遺伝子を含有する２つの構造を 、タバコ植物の形質転換に使用した。ＣＴＰ−ｆｄａ配列、ｐＭＯＮ１７２２７ がないベクタ（ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０４４４９に記載されている）を、負の対 照として使用した。植物の形質転換ベクタをＡＢＩ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ株に移動した。植物ベクタのＡＢＩ株への交配は、ヘルパープラスミドｐＲＫ ２０１３（Ｄｉｔｔａ他、１９８０）を使用し、三親接合系によって行った。 グロースチャンバで成長させたタバコ形質転換系統を発生させ、初めにウェス タンブロット分析によりスクリーニングを行 い、大腸菌発現ｆｄａに抗して出現させたヤギ抗体を使用して発現体を同定した 。引き続き、ｐＭＯＮ１７５２４発現タバコ系統について、ＹＳＩ Ｉｎｓｔｒ ｕｍｅｎｔ、Ｍｏｄｅｌ２７００Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ ｎａｌｙｚｅｒを使用して葉の非構造炭水化物を分析した（スクロース、グルコ ース、およびグルコース中に加水分解したデンプン）。開花段階から始め、葉の 試料もこれらの植物から採取し、葉の非構造炭水化物の昼行性の変化について分 析した。 ５００ｍｇから１ｇの新しいタバコの葉の組織試料を収集し、Ｐｏｌｙｔｒｏ ｎによる均一化によって、熱いＮａ−リン酸緩衝液（ＮａＨ₂ＰＯ₄ ４０ｇ／Ｌ 、およびＮａ₂Ｈ₂Ｏ₄ １０ｇ／Ｌを溶かした２倍の脱イオン水）５ｍＬに抽出 した。次いで試験管を８５℃の水浴中に１５分間置いた。試験管を、１２分間、 ３０００ｒｐｍで遠心分離にかけ、上澄みを可溶性糖分析用に貯えた。ペレット を、Ｖｏｒｔｅｘと混合した熱いＮａ−リン酸緩衝液５ｍＬ中に再懸濁し、上述 のように遠心分離にかけた。上澄みを注意深く除去し、前に得た上澄みの画分に 添加して、適切な膜を使用したＹＳＩによって可溶性の糖（スクロースおよびグ ルコース）の分析を行った。 ＭｅｇａｚｙｍｅＫｉｔ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、オーストラリア）を使用して、 デンプンをペレットから抽出した。このペレットには、５０％エタノール２００ μＬおよび熱安定アルファアミラーゼ３ｍＬ（３００Ｕ）を添加し、混合物を旋 回撹拌した。次いで試料を沸騰水中に６分間インキュベートし、２分および４分 後に撹拌した。試験管を５０℃の水浴中に置き、２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ ４．５）４ｍＬを淵加し、その後、０．１ｍＬのアミログルコシダーゼ（２０Ｕ ）を添加した。インキュベートは１時間行った。次いで試験管を、１５分間、３ ０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。上澄みから一部を採取し、ＹＳＩによりグル コースを分析した。遊離グルコースを調整して無水グルコースにした（１６２／ １８２の比で繁殖させることによってデンプン中に生じる）。試験管当たりの総 体積は７．１ｍＬであった。 表１に見られるように、タバコのｆｄａ遺伝子の発現は、葉のデンプン濃度の 著しい増加と相関していた。しかし第４図を参照すると、ｆｄａが発現した葉に ついてデンプン濃度の昼行性プロフィルを決定した場合、この増加は主に、光周 期の初期、すなわち葉の光合成活性がピークになることが知られている相 で明らかであった。デンプンのこの増加は、増加したデンプンが暗闇の期間中に 代謝回転するために、植物に明らかな負の影響を及ぼさない。対照に比べ、大腸 菌ｆｄａを発現するタバコの葉では、スクロースまたはグルコースの定常状態の 濃度に明らかな増加は見られなかった。 表１ ｆｄａ形質転換遺伝子¹（ｐＭＯＮ１７５２４）を発現する植物の葉の炭水化物 濃度 ¹ 葉の試料は正午に収集した。 構造ｐＭＯＮ１７５４２により形質転換された第２の組のトランスジェニック なタバコ植物を、温室内で成長させた。ＣＴＰ−ｆｄａ配列を持たないベクタｐ ＭＯＮ１７２２７を含有するタバコ植物を、負の対照として使用した。ウェスタ ンブロット分析によって発現のためにスクリーニングされたすべての ｐＭＯＮ１７５４２系統の中で、１８系統が高発現体がであり（総細胞タンパク 質の＞０．０１％）、１５系統が低発現体であった（＜０．０１％）。対照とし て、ヌルベクタｐＭＯＮ１７２２７を含有する１５の植物を使用した。ｆｄａ形 質変換遺伝子を発現する植物および負の対照から十分に伸びた葉について、切除 した葉の組織から師部浸出物を採取することによって、スクロースのエキスポー トについて試験を行った。師部浸出技法は、Ｇｒｏｕｓｓｏｌ他（１９８６）に 記載されている。葉を午前１１時３０分に収集し、ｐＨ６．０のＥＤＴＡ５ｍＭ を含有する浸出媒質中に入れ、光を完全にあてた湿度の高い状態の下、４時間か けて浸出させた。炭水化物分析法で既に述べたように、浸出溶液についてスクロ ース濃度を直ちに分析した。表２に見られるように、ｆｄａ形質変換遺伝子を発 現する植物では、原料の葉からのスクロースのエキスポートに著しい増加が観察 された。 ｆｄａを発現する葉によるスクロースのエキスポートの増加は、原料の容量の 増加の１つの例示であり、これはカルビン回路（トリオース−Ｐの利用の増加に 応答する）を通る炭素の流れの増加、したがって葉による正味炭素利用率の増加 のために、 非常に起こり得ることである。表２に見られるように、師部に装入されるスクロ ースの増加は、ｆｄａ発現レベルと相関する。 表２ ｆｄａ形質転換タバコ植物（ｐＭＯＮ１７５４２）の切除された葉からの、師部 浸出物中のスクロース濃度 表３を参照すると、植物の成長および発育の予備分析によれば、特定の成長お よび分析条件下、ｆｄａ遺伝子を発現する植物とベクタ対照との間では、植物当 たりの葉または莢の数、植物の高さ、茎の直径、または植物当たりの見かけ上の 種子の重量について著しい差がないことが明らかにされた。しかし表４に見られ るように、ｆｄａ−形質転換植物の根質量は、著しく高いものであった。これは 、これらの条件下では、根が、原料の葉によって生産された過剰な炭水化物を引 き付ける、より支配的なシンクを表したことを示すものであろう。さらにこの例 示によれば、大腸菌ｆｄａ遺伝子の存在下、根質量の増加は、 苗条の成長、花序、または結実に明らかな負の影響を及ぼすことなく実現される ことが示される。したがって、根の成長および最終の根の乾燥重量の増加は、発 芽の後の迅速な実生の定着をもたらし、干ばつ、低温ストレス、その他の環境変 化、および移植に耐えるためのより大きい植物の能力をもたらすために、望まし い植物特性である。異なる植物で、また異なる成長条件下では、その他の植物の 部分（例えば種子、果実、茎、葉、塊茎、球根など）で、ｆｄａ形質変換遺伝子 を過発現するタバコの根で観察される重量増加が見られることが予想される。 表３ ｆｄａ形質転換遺伝子¹（ｐＭＯＮ１７５４２）を発現するタバコの、ある一定 の植物成長および発育パラメータの評価 ¹ この分析を行うため、１４の高発現体系統と１５の対照系統とを比較した。 測定は、種子を収集する前に行った（ほとんどの莢は完全に熟していた）。葉の 数は、落葉を説明するために節の数をカウントすることによって確認した。 表４ 大腸菌ｆｄａ形質転換遺伝子¹（ｐＭＯＮ１７５４２）を発現する植物の、タバ コの根の乾燥重量 ¹ ５つの高発現体系統および７つの低発現体系統と、６つの対照植物からの根 を切除し、注意深く洗浄し、次いで６５℃の乾燥炉内に少なくとも４８時間置い た。根を炉から取り出し、実験室内で２時間平衡化させ、その後、乾燥重量を決 定した。 実施例３ トウモロコシ植物での植物形質転換およびｆｄａ発現 ＦＤＡタンパク質のターゲッティング プラスチドを標的にするペプチドを有しているｆｄａ遺伝子、およびプラスチ ドを標的にするペプチドを有していないｆｄａ遺伝子を含有するベクタをトウモ ロコシの形質転換用に作成したが、これは稲、麦、大麦、サトウキビ、ライコム ギなどを含めたその他の単子葉植物にも適している。 トウモロコシ植物中のｆｄａ遺伝子のシトゾル発現のため、ｆｄａ遺伝子配列 が、増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（ｅ３５Ｓ；Ｋａｙ他、１９８７）、ＨＳＰ ７０イントロン（米国特許第５５９３８７４号）、およびＮＯＳ３’ポリアデニ ル化配列（Ｆｒａｌｅｙ他、１９８３）を含有するベクタの骨格と融合した構造 を作成した。これは、クローン化してｐＭＯＮ３０４６０、すなわち単子葉植物 形質転換ベクタのＮ０ｔＩ部位になるＮｏｔＩカセット［Ｐ−ｅ３５Ｓ／ＨＳＰ ７０イントロン／ｆｄａ／ＮＯＳ３’］を創り出して、第５図に示す植物形質転 換ベクタｐＭＯＮ１３９２５を形成した。ｐＭＯＮ３０４６０は、選択可能な標 識ネオマイシンリン酸基転移酵素タイプＩＩ（ｎｐｔＩＩ）［Ｐ−３５Ｓ／ＮＰ ＴＩＩ／ＮＯＳ３’］用の発現カセットと、注目する遺伝子をクローン化するた めの特異なＮｏｔＩ部位を含有する。最終ベクタ（ｐＭＯＮ１３９２５）は、注 目する遺伝子および選択可能な標識遺伝子が同じ配向でクローン化するように構 成した。これらの遺伝子配列用の発現カセットを含有するベクタ断片は、細菌セ レクタ（Ｋａｎ）およびｏｒｉから切除し、ゲル精製し、植物形質転換に使用す ることができた。 トウモロコシ植物中で、葉緑体を標的とするｆｄａ遺伝子を 発現させるため、トウモロコシＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットＣＴＰ（Ｒｕｓ ｓｅｌｌ他、１９９３）に結合したｆｄａ遺伝子配列が、増強（ＣａＭＶ）３５ Ｓプロモータ、ＨＳＰ７０イントロン、およびＮＯＳ３’ポリアデニル化配列を 含有するベクタの骨格に融合している構造を作成した。これは、クローン化して 単子葉植物の形質転換ベクタｐＭＯＮ３０４６０のＮｏｔＩ部位になる（選択可 能な標識カセット［Ｐ−３５Ｓ／ＮＰＴＩＩ／ＮＯ３’］と同じ配向で）ＮＯｔ Ｉカセット［Ｐ−ｅ３５Ｓ／ＨＳＰ７０イントロン／ｍｚＳＳｕＣＴＰ／ｆｄａ ／ＮＯＳ３’］を創り出して、第６図に示すベクタｐＭＯＮ１７５９０を形成し た。このベクタから、ｆｄａ遺伝子発現カセットおよび選択可能な標識カセット を含有する断片を細菌セレクタ（Ｋａｎ）およびｏｒｉから切除し、ゲル精製し 、植物形質転換に使用することができた。 トウモロコシでのアルドラーゼ遺伝子のシトゾル胚乳特異発現のため、ｆｄａ 遺伝子配列をクローン化して、グルテリン遺伝子プロモータＰ−ｏｓｇｔ１（Ｚ ｈｅｎｇ他、１９９３）、ＨＳＰ７０イントロン、およびＮＯＳ３’ポリアデニ ル化配列を含有するベクタ（選択可能な標識カセット［Ｐ−３５Ｓ／ ＮＰＴＩＩ／ＮＯＳ３’］と同じ配向で）にし、第７図に示すベクタｐＭＯＮ１ ３９３６を形成した。このベクタから、ｆｄａ遺伝子発現カセット［ｐ−ｏｓｇ ｔ１／ＨＳＰ７０イントロン／ｆｄａ／ＮＯＳ３’］および選択可能な標識カセ ットを含有する断片を細菌セレクタ（Ｋａｎ）およびｏｒｉから切除し、ゲル精 製し、植物形質転換に使用することができた。 トウモロコシ植物の形質転換 ベクタｐＭＯＮ１３９２５（上述）またはｐＭＯＮ１７５９０（土述）で形質 転換したトランスジェニックなトウモロコシ植物を、当技術分野で良く知られて いる手順のミクロ発射ボンバード（Ｆｒｏｍｍ、１９９０；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａ ｍｍ他、１９９０；Ｗａｌｔｅｒｓ他、１９９２）を使用して生産した。未熟な トウモロコシの胚から生じる胚形成カルスを標的組織として使用した。ＴＥ緩衝 液に溶かした１ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを、本質的にＫｌｅｉｎ他（１９ ８８）に記載されている塩化カルシウム／スペルミジン法を使用して、Ｍ１０タ ングステン粒子上に沈澱させた。注目する遺伝子に加え、プラスミドは、カリフ ラワーモザイクウィルスからの３５Ｓプロモータによって動かされるネオマイシ ンリン酸基転移酵素ＩＩ遺伝 子（ｎｐｔＩＩ）も含有していた。胚形成カルス標的組織は、０．２Ｍマンニト ールおよび０．２Ｍソルビトールで約４時間にわたり浸透的に緩衝化させた培地 上で前処理を行い、その後ボンバード（Ｖａｉｎ他、１９９３）を行った。組織 には、ＢｉｏＲａｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐ ＤＳ）１０００装置の火薬版を使用して、ＤＮＡ被覆タングステン粒子により２ 回ボンバードを行った。ボンバードの約１６時間後、この組織を、マンニトール またはソルビトールを含有せずにＧ４１８”などの適切なアミノグリコシド抗生 物質を含有すること以外は同じ組成の培地上で継代培養して、３５Ｓ／ｎｐｔＩ Ｉ遺伝子を含有し発現する細胞用に選択した。活発に成長する組織セクタを、約 ３週間ごとに新しい選択培地に移した。ボンバードの約３ヶ月後、本質的にＤｕ ｎｃａｎおよびＷｉｌｄｈｏｌｍ（１９８８）により述べられるように、生き残 った胚形成カルスから植物を再生した。 形質転換したトウモロコシからのアルドラーゼ活性 葉のアルドラーゼ活性を測定するために、トウモロコシの葉の試料を採取し、 直ちにドライアイス土で凍結させた。１．２ｍＬの抽出緩衝液（Ｈｅｐｅｓ １ ００ｍＭ、ｐＨ８．０、 ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ、ＭｎＣｌ₂ ５ｍＭ、ＫＣｌ １００ｍＭ、ＤＴＴ １０ｍ Ｍ、ＢＳＡ １％、ＰＭＳＦ １ｍＭ、ロイペプチン１０μｇ／ｍＬ、アプロチ ニン１０μｇ／ｍＬ）に溶かした葉の組織を４℃ですりつぶすことによって、ア ルドラーゼ酵素を葉の組織から抽出した。抽出物を、１５０００×ｇ、４℃で３ 分間遠心分離にかけ、脱塩されていない上澄みについて酵素活性を検定した。こ の抽出法により、大腸菌ＦＤＡ活性が約６０％回復した。 アルドラーゼの全活性を、ＥＰＰＳ−ＮａＯＨ １００ｍＭ、ｐＨ８．５、フ ルクトースビスリン酸 １ｍＭ、ＮＡＤＨ ０．１ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭの 、アルファグリセロリン酸脱水素酵素 ４単位、およびトリオースリン酸異性化 酵素 １５単位からなる０．９８ｍＬの反応混合物中で決定した。葉の抽出物２ ０μＬを添加することによって、反応を開始した。１回の実験から生じた、結果 的に得られたデータを表５に示す。 表５ 形質転換したトウモロコシの葉からのアルドラーゼ活性 タンパク質が葉緑体を標的とするとき、表現型は、大腸菌ＦＤＡを発現する１ 次形質転換（ＲＯ植物）の際に見ることができた。葉はクロロチックであったが 、種子は通常のものであった。Ｒ１植物を、畑と温室実験の両方で成長させた。 デンプンは、ヨウ素染色を使用した葉の中には検出されず、受粉が遅れた。これ らのトウモロコシ植物中の表現型は、トウモロコシにＦＤＡ発現を引き起こすこ とを好まないｐＭＯＮ１７５９０とｐＭＯＮ１３９２５の両方のベクタに使用さ れたプロモータ（ｅ３５Ｓ）の結果であろうと考えられる。ｅ３５Ｓは葉肉増強 発現を引き起こすと考えられており、トウモロコシなどのＣ４植物中のカルビン 回路は主に維管束鞘細胞に生じることから、維管束鞘細胞中の増強発現を対象と する（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯプロモータなどの）プロモータの使用が好ましいであ ろう。このようなプロモータを含有し、かつＦＤＡの発現を生じさせるベクタが 調製されており、これはトウモロコシ中で試験が行われている。 特に、トモロコシＲｕＢＩＳＣＯの小サブユニット（ＰｍｚＳＳＵ、維管束鞘 細胞に特異なプロモータ）は、トウモロコシの細胞に特異なｆｄａを発現させる ベクタを構成するために使用されて きた。クラスＩのアルドラーゼ（ｆｄａＩ）、すなわち鉄−硫黄クラスタを持た ず、ｆｄａＩＩとは異なる性質を有するｆｄａは、Ｃ４穀物（例えばトウモロコ シ）中の炭素の代謝を改善するために利用した。クラスＩのアルドラーゼの遺伝 子をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ブドウ球菌）のゲノムから 増幅し、活性を確認した。次いで形質転換ベクタを構成し、両方のクラスのアル ドラーゼ（ｆｄａＩおよびｆｄａＩＩ）をトウモロコシ中に細胞固有の手法で発 現させた。以下のカセットを作成した。 ｐＭＯＮ１３８９９：ＰｍｚＳＳＵ／ｈｓｐ７０／ｍｚＳＳＵＣＴＰ／ｆｄａＩ ｐＭＯＮ１３９９０ＰｍｚＳＳＵ／ｈｓｐ７０／ｍｚＳＳＵＣＴＰ／ｆｄａＩＩ ｐＭＯＮ１３９８８：Ｐ３５Ｓ／ｈｓｐ７０／ｆｄａＩ これらのベクタは、概して上述のように、トウモロコシの形質転換のために使用 した。１次形質転換の生化学的および生理学的分析によって、成長および発生と トウモロコシの収量に増加をもたらすアルドラーゼ遺伝子の過発現の同定が可能 になるはずである。 また、トウモロコシの形質転換には、トウモロコシ胚乳での大腸菌ｆｄａＩＩ 遺伝子の発現を標的とする２つのベクタを使用した。ベクタｐＭＯＮ１３９３６ は、稲ｇｔ１プロモータを使用して、胚乳細胞の細胞質中にアルドラーゼの発現 を生じさせる。別のベクタ（ｐＭＯＮ３６４１６）は、トウモロコシＲｕＢＩＳ ＣＯの小サブユニットシグナルペプチドと同じプロモータを使用して、アミロプ ラスト中にタンパク質を局在させる。シトゾルアルドラーゼ形質転換のホモ接合 系統を同定し（３７の植物のホモ接合性を、ウェスタンブロット分析を使用して 確認した）、これらの植物からの種子を、穀類組成（水分、タンパク質、デンプ ン、および油）分析用に採取した。アミロプラストを標的とするアルドラーゼ発 現のためにスクリーニングを行った５３のｐＭＯＮ３６４１６の１次形質転換の 中で、１１個がポジティブであった。これらの植物について、ホモ接合性選択／ 繁殖の試験を行い、組成分析のためにホモ接合体からの穀粒を使用する。 実施例４ ポテト植物での植物形質転換およびｆｄａ発現 ｆｄａ発現のターゲッティング Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介ポテト形質転換のために、 ｆｄａ遺伝子がＦＭＶプロモータの後に発現してアルドラーゼ酵素が葉緑体シグ ナルペプチドＣＴＰ２と融合する植物発現ベクタ、ｐＭＯＮ１７５４２（既に述 べた）を使用した。 第２のポテト形質転換ベクタは、ＮＯｔＩカセット［Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２／ ｆｄａ／ＮＯＳ３’］（既に述べた）をクローン化してｐＭＯＮ２３６１６の特 異なＮｏｔＩ部位にすることによって構成した。ｐＭＯＮ２３６１６は、ノパリ ン型Ｔ−ＤＮＡライトボーダー領域（Ｆｒａｌｅｙ他、１９８５）、ネオマイシ ンリン酸基転移酵素タイプＩＩ遺伝子［Ｐ−３５Ｓ／ＮＰＴＩＩ／ＮＯＳ３’］ （選択可能な標識）用の発現カセット、この遺伝子発現カセットをクローン化す るための特異なＮｏｔＩ部位、およびＴ−ＤＮＡレフトボーダー領域（Ｂａｒｋ ｅｒ他、１９８３）を含有するポテト形質転換ベクタである。ＮｏｔＩカセット ［Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２／ｆｄａ／ＮＯＳ３’］（既に述べた）を、ｐＭＯＮ２ ３６１６のＮｏｔＩ部位へとクローン化することによって、第８図に示すポテト 形質転換ベクタｐＭＯＮ１７５８１が得られる。ベクタｐＭＯＮ１７５８１は、 この遺伝子および選択可能な標識遺伝子が同じ方向に転写されるように構成した 。 ポテト植物形質転換 植物形質転換ベクタを、ＡＢＩ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株内に移した。 植物ベクタのＡＢＩ株への交配は、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔ ｔａ他、１９８０）を使用し、三親接合系によって行った。ベクタｐＭＯＮ１７ ５４２は、形質転換系統のグリホサート選択に関してＰＣＴ公開ＷＯ９６／０３ ５１３に記載されている方法に従い、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋポテトカル スのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換を介したポテト形質転換のために使用 した。 ベクタｐＭＯＮ１７５４２による形質転換の後、葉をウェスタンブロット分析 にかけることにより、グリホサートの選択を経てきたトランスジェニックなポテ トの苗木に対して大腸菌アルドラーゼ発現用のスクリーニングを行った。検定さ れた１１２の独立した系統の中から５０のｆｄａ発現系統（４５％）を同定した が、このｆｄａ発現レベルは抽出可能な全タンパク質の０．１２％から１．２％ に及んでいた。 植物形質転換ベクタＰＭＯＮ１７５８１は、ＨＳ３１−６３８ポテトカルスの Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介形質転換のために使用した。ＨＳ３１−６３８ は、大腸菌からの変異体ＡＤＰ グルコースピロホスホリラーゼ（ｇｌｇＣ１６）遺伝子により予め形質転換され たＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋポテト系統である（米国特許第５４９８８３０ 号）。ポテトカルスをＰＣＴ公開ＷＯ９６／０３５１３に記載されている方法に 従って形質転換し、選択試薬としてグリホサートの代わりにカナマイシン（１５ ０〜２００ｍｇ／Ｌの濃度で投与された）を用いた。 組織培養苗木からの葉のパンチを検定することによって、ｆｄａ遺伝子の発現 のために形質転換したポテト植物にスクリーニングを行った。ｐＭＯＮ１７５８ １形質転換系統からの葉の組織のウェスタンブロット分析により（大腸菌アルド ラーゼに抗して生じた抗体を使用する）、スクリーニングが行われた５６の系統 の中で１２の発現系統を同定した。約４０ｋＤａで移動するタンパク質の発現が 検出されたが、この量は、大腸菌（クラスＩＩ）アルドラーゼサブユニットの分 子量、および大腸菌中のアルドラーゼの過形成後に観察されたタンパク質のサイ ズである。 形質転換したポテト植物の比重測定 ｐＭＯＮ１７５４２により形質転換した後に得られた５０のｆｄａ発現ポテト 系統から、７つの最も高い発現系統を組織培 養によりミクロ繁殖させ、各系統の８つのコピーを、Ｍｅｔｒｏ３５０ポット媒 質１／２、細かい砂１／４、Ｒｅａｄｙ Ｅａｒｔｈポット媒質１／４の混合物 を入れた直径１４インチ（約３５ｃｍ）、深さ１２インチ（約３０ｃｍ）のポッ トに植えた。組織培養からの野生型Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋの苗木を対照 として植えた。すべての植物を、日中の温度が約２１〜２３℃で夜間の温度が約 １３℃である温室内で約５ヵ月栽培した。植物には、その活発な成長期間全体を 通して１日おきに水を供給し、市販の肥料Ｐｅｔｅｒ’ｓ２０−２０−２０を、 商用の適用例と同様の濃度で週に１回与えて発達を促した。施肥は、初めの２ヵ 月半の間のみ行い、その時点で施肥を完全に停止した。植物を自然に老化させ、 約５０％老化した時点で、塊茎を収穫した。 収穫時の各系統ごとに、全８ポットからのすべての塊茎をプールし、全重量を 得た。次いで各系統ごとに、塊茎３０ｇ以上をプールし、このグループの塊茎に ついて比重を決定した。比重は、空気中の塊茎の重量を、空気中での重量から水 中での重量を引いた値で割った商である。これらの重量測定の結果を表６に示す 。 表６ 形質転換したポテト植物の比重測定 この表は、温室内で成長させた７系統すべてに関する塊茎の収率および比重の概 要を示す。この結果は、対照に比べ、１つのｆｄａ系統を除くすべてについて全 体的な塊茎の収率に増加が見られ、４系統については３０ｇを超える重量の塊茎 のパーセンテージに対応する増加があることを示している。組合せた塊茎が３０ ｇを超える場合、全重量のパーセントは対照の場合に近く、２系統については対 照よりも大きい。これは、６系統のうち５系統の全体的な収率がより高く、より 小さい塊茎を作っていないことを示している。すなわち全体的な収率が増加する と、より大きい塊茎（３０ｇを超える）のパーセンテージも対 応して増加する。しかし、塊茎の比重は増加しない。 結論として、ポテトでのｆｄａの発現により、塊茎のサイズを犠牲にすること なく植物当たりより大量の塊茎を生産すると思われる。これは、農業従事者が少 ないエーカー数を使用して同量の塊茎を生産できる可能性があることから、収率 に利益があることを示している。このような組合せが、塊茎の収率、塊茎の固形 分付着性、および全体的な塊茎の比重にどのような影響を与えるかを決定するた めにも、同様の実験をｇｌｇＣ１６などの他の炭水化物の代謝遺伝子を有するｆ ｄａの同時発現によって行う。 形質転換したポテトのアルドラーゼ活性 温室内で３ヵ月栽培した後（植付け後）、ｐＭＯＮ１７５４２で形質転換した 後に得られる、ｆｄａ発現が最も高いポテトの６系統から葉の試料を採取し、ア ルドラーゼ活性を検定した。 ポテトの葉のアルドラーゼ活性を測定するため、各系統から二重に葉の試料を 採取し、直ちにドライアイス上で凍結させた。１．２ｍＬの抽出緩衝液、すなわ ちＨｅｐｅｓ １００ｍＭ、ｐＨ８．０、ＭｇＣｌ₂ ５ｍＭ、ＭｎＣ１₂ ５ｍ Ｍ、ＫＣｌ１００ｍＭ、ＤＴＴ １０ｍＭ、ＢＳＡ １％、ＰＭＳＦ １ ｍＭ、ロイペプチン１０μｇ／ｍＬ、アプロチニン１０μｇ／ｍＬの緩衝液中、 ４℃ですりつぶすことによって、葉の組織０．２ｇからアルドラーゼを抽出した 。抽出物を、既に述べたようにしてアルドラーゼ活性について検定した。 ｆｄａを発現する形質転換されたポテトの独立した６系統について、アルドラ ーゼ活性の試験を行った。葉の内部でのｆｄａの発現は、植物全体の内部での発 現の指標であり、これは、それぞれの符号化ＤＮＡを発現させるＦＭＶプロモー タが、構成上、ポテト植物の組織のすべてではないとしてもそのほとんどでの遺 伝子発現を対象とするからである。 表７は、各系統に関するタンパク質発現の量的なデータと、個々の系統それぞ れに関する活性パーセントの概要を示す。 表７ 形質転換したRusset Burbankポテトの葉のアルドラーゼ活性形質転換したポテトの固形分の均一性 ｐＭＯＮ１７５４２で形質転換させた後に得られた、ｆｄａを発現する２５系 統のＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ（「Ｍａｅｓｔｒｏ」で示されるポテト系統 ）と、ｐＭＯＮ１７５８１で形質転換した後に得られた、ｇｌｇＣ１６（ＰＣＴ 公開ＷＯ９１／１９８０６および米国特許第５４９８８３０号）も含有してｆｄ ａを発現する１５系統のＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｏｌ ｉｄ（「Ｓｅｇａｌ」で示されるポテト系統）について、２つの異なる場所で圃 場試験を行った。各圃場現場ごとに、１系統当たり３６の植物（１系統当たり１ ２の植物を３回繰り返す）について、塊茎の固形分の分布を評価した。収穫の際 、各圃場現場ごとに、塊茎を１０〜１２オンス（約２８０〜３４０ｇ）のカテゴ リーに事前選別し、各反復地区から９個の塊茎を分析して３つのグループにした 。 直径が７〜８ｃｍの一般的な１０〜１２オンスの塊茎について、各塊茎から中 心の長手方向の薄片（１３ｍｍ）を除去することによって、デンプンの分布を評 価した。次いで薄片の皮を剥き、まな板上に平らに置き、そこで、塊茎の内側領 域（髄領域）を１４ｍｍコルクパンチによって除去する。髄から皮層（周 領域）の組織を、最大２インチ（約５ｃｍ）のコルクパンチによって除去した。 残りの皮層組織は、薄片の最外部領域からの幅が約８ｍｍの環であった。 次いで、プールされた髄のパンチおよびプールされた皮層のパンチを空中で、 次いで水中で計量することによって比重を決定した。 比重＝空中の重量／（空中の重量−水中の重量） 比重を計算した後、以下の方程式により固形分濃度を決定した。 −２１４．９２０６＋（２１８．１８５２^*比重） 固形分の均一性の程度（固形分均一性インデックス）を、髄と皮層の固形分の 比（髄の固形分を皮層の固形分で割った商）を計算することによって決定した。 画地当たり、３グループの３種の塊茎を平均し、そこで、圃場現場あたりの３反 復地区の平均を計算した。 固形分均一性に関するいくつかの予備試験（データは示さない）の分析によれ ば、形質転換されていない野生型Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋポテトは、成長 領域および農業の実践方法に応じて、髄と皮層の塊茎固形分の一般的な比が６８ ％〜７２％の 範囲内にあることが実証された。表８〜１１は、植物系統番号によって髄と皮層 の比を提供しており、髄と皮層の比がより高いと、固形分の均一性の程度がより 大きいことを示している。 表８および９は、ＳｅｇａｌおよびＭａｅｓｔｒｏに関する１つの圃場現場（ サイト１）からのデータをそれぞれ表しており、大部分のＳｅｇａｌおよびＭａ ｅｓｔｒｏ系統は、髄と皮層の固形分の比がＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋによ る対照の場合の６８．４％よりも高く、いくつかの系統では髄と皮層の固形分の 比が８２％に近づいていることを示している。 表１０および１１は、ＳｅｇａｌおよびＭａｅｓｔｒｏに関する別の圃場現場 （サイト２）からのデータをそれぞれ表しており、やはり大部分のＳｅｇａｌお よびＭａｅｓｔｒｏ系統は、髄と皮層の固形分の比がＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａ ｎｋによる対照の場合よりも高く、いくつかの系統では髄と皮層の固形分の比が ８８％に近づいていることを示している。サイト２の圃場試験では、Ｒｕｓｓｅ ｔ Ｂｕｒｂａｎｋによる対照は、髄と皮層の固形分均一性の比が一般的ではな く異常に高い７９．３％であり、これはおそらく環境的な成長条件のためである 。サイト２の結果は、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋポテト中に大腸 菌ｆｄａが単独で発現し、またはｇｌｇＣ１６と共発現することによって、形質 転換されていないＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋの塊茎の固形分均一性が既に非 常に高い場合には、生育期間であっても塊茎の固形分均一性が増加することを実 証している。すなわちｆｄａ遺伝子は、農業的条件によって既に異常に高い固形 分均一性レベルをもたらす場合も機能し続ける。 表８．固形分均一性インデックス：髄の固形分と皮層の固形分の比 表９．固形分均一性インデックス：髄の固形分と皮層の固形分の比表１０．固形分均一性インデックス：髄の固形分と皮層の固形分の比表１１．固形分均一性インデックス：髄の固形分と皮層の固形分の比 Ｓｅｇａｌ系統の髄と皮層の固形分の比に対するアルドラーゼの影響は、Ｍａ ｅｓｔｒｏ系統の場合よりもわずかに劇的である。この表現型は、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ宿主が比較的低レベルから通常レベルでｇｌｇＣ１６を発現さ せる生育環境での発現のためであり、したがってｆｄａとｇｌｇＣ１６の組合せ によって改善された利益が得られると本発明者らは考えている。固形分均一性が 改善された３つのＳｅｇａｌ系統の横断面状の塊茎の薄片（第９図）は、塊茎の 内側領域内で、デンプンの付着性がより大きいことを示している。特に、塊茎の 中心に向かって木部環を再配置することに付随して生じる皮層体積の増加と、デ ンプン密度の増加のためにより不透明な髄組織は、形質転換した系統では明らか である。この生理学的変性は、ソースからシンクへのスクロースのトランスロケ ーションの増加のためであると考えられ、これは、塊茎の発育中に師部の要素分 布に影響を及ぼし、または塊茎全体にわたるデンプンの生合成のためのスクロー スの利用可能性に、影響を及ぼすであろう。 実施例５ 綿植物での植物形質転換およびＦＤＡ発現 大腸菌ｆｄａベクタｐＭＯＮ１７５２４［ＦＭＶ／ＣＴＰ１ ／ｆｄａ］（第２図）およびｐＭＯＮ１７５４２［ＦＭＶ／ＣＴＰ２／ｆｄａ］ （第３図）を、Ｕｍｂｅｃｋ他（１９８７）により述べられかつ米国特許第５０ ０４８６３号に記載されているように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用して 綿に形質転換した。タンパク質は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＳＳＵ ＣＴＰｌ （ｐＭＯＮ１７５２４）またはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＥＰＳＰＳ（ｐＭＯＮ １７５４２）葉緑体シグナルペプチドを使用して、葉緑体を標的とした。 綿のアルドラーゼ発現 両方のベクタを用いて形質転換した５週間経過後のカルスを、ウェスタンブロ ット分析およびアルドラーゼ検定によって分析した。ウェスタンブロット分析は 、全長ＦＤＡ標準の位置で大量のタンパク質を示し、対照カルス抽出物の場合は 同じ位置でより少ない量を示した。タンパク質は、十分にプロセッシングされた と思われる。ＦＤＡが組織内で発現することを証明し活性を比較するために、２ つのベクタで形質転換されたカルスを、形質転換された生産物の活性の損失を妨 げる緩衝液に抽出した。ＢＳＡを添加して最終濃度を１ｍｇ／ｍＬとし、これに よって、ウェスタンブロットによる移入に関するプロセッシグの分析を 制限する。アルドラーゼ検定を、２５ｍＭのＥＤＴＡを加えまたは差し引いて行 い、これによって大腸菌酵素が阻害されるが植物酵素は阻害されない。検定の結 果を表１２に示す。 表１２ 綿のカルスおよび綿の葉のアルドラーゼ活性 この結果は、綿のカルスにｆｄａ遺伝子の良好な発現があることを示す。ほとん どすべてのカルスは、アルドラーゼ活性が少なくとも２倍高く、その増加はＥＤ ＴＡによる阻害に敏感に反応する。プロセッシングは、これらの試料を使用した ウェスタンブロット分析によって完全であると思われる。 引用文献

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年９月１４日（１９９９．９．１４） 【補正内容】 請求の範囲 １．ａ）植物細胞において機能するプロモーター、及び ｂ）フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードし、かつセンス方向でプロモーターと機能的に連結したＤＮＡ配 列 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 ２．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が原核生物由来である、請求項１に記載のＤＮＡ 分子。 ３．原核生物が大腸菌である、請求項２に記載のＤＮＡ分子。 ４．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、クラスＩＩフルクトース−１，６−ビスリン 酸アルドラーゼをコードする原核生物ＤＮＡ配列と少なくとも約６０％の同一性 を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ５．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、塩化ナト リウム濃度が０．１５Ｍと０．９Ｍの間であり、かつ温度が２０℃から５５℃ま での範囲内である条件下で、配列番号１として示されたコーディング領域とハイ ブリダイズすることができる配列である、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ６．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１として示されたコーディング領域 と少なくとも約６０％の同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ７．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するそのポ リペプチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１として示されたコーディング 領域を有するか、又は遺伝コードの縮重に従い配列番号１と同一のペプチドをコ ードする、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ８．請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ分子をゲノム内に含むト ランスジェニック植物細胞。 ９.請求項８に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。 １０．組換えＤＮＡ分子を含まない植物と比較して増大した光合成速度、増大し た収穫量、増大した成長速度及び改良された固体均一性からなる群より選択され る性質を示す、請求項１１ のトランスジェニック植物。 １１．トウモロコシ、小麦、米、トマト、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、 ヤムイモ、アーティチョーク、アルファルファ、ピーナッツ、大麦、綿、大豆、 カノーラ、ヒマワリ、テンサイ、リンゴ、ナシ、オレンジ、モモ、サトウキビ、 イチゴ、ラズベリー、バナナ、ブドウ、オオバコ、タバコ、レタス、キャッサバ 、アブラナ科の野菜、林業用種及び園芸用種からなる群より選択される穀物植物 である、請求項９又は１０に記載のトランスジェニック植物。 １２．植物がジャガイモである、請求項１１のトランスジェニック植物。 １３．請求項１２のジャガイモ由来の食品。 １４．フレンチフライ又はポテトチップである、請求項１３の食品。 １５．請求項９から１２のいずれか一項のトランスジェニック植物由来の繁殖素 材。 １６．請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換 すること、及びトランスジェニック植物を作製するため形質転換された細胞を再 生させることを含む、植物 において光合成速度を増大させるための方法。 １７．請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換 すること、及びトランスジェニック植物を作製するため形質転換された細胞を再 生させることを含む、植物において収穫量を増大させるための方法。 １８．請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換 すること、及びトランスジェニック植物を作製するため形質転換された細胞を再 生させることを含む、植物において成長速度を増大させるための方法。 １９．請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換 すること、及びトランスジェニック植物を作製するため形質転換された細胞を再 生させることを含む、植物において固体均一性を改良するための方法。 ２０．ジャガイモをフレンチフライ又はポテトチップに加工するための方法にお いて、ジャガイモにおいてより高い髄固体と皮質固体との比を提供するようｆｄ ａトランスジーンを過剰発現するジャガイモからフレンチフライ又はポテトチッ プを製造することを含む改良。 【図４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 キーシヨア，ギヤネツシユ・エム アメリカ合衆国、ミズーリ・63141、クリ ーブ・クール、ドライブ、サックストン・ リツジ・11966

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）植物細胞において機能するプロモーター、及び ｂ）フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードし、かつセンス方向でプロモーターと機能的に連結したＤＮＡ配 列 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子。 ２．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が原核生物由来である、請求項１に記載のＤＮＡ 分子。 ３．原核生物が大腸菌である、請求項２に記載のＤＮＡ分子。 ４．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、クラスＩＩフルクトース−１，６−ビスリン 酸アルドラーゼをコードする原核生物ＤＮＡ配列と少なくとも約６０％の同一性 を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ５．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１として示されたコーディング領域 とハイブリダイズすること ができる配列である、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ６．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１として示されたコーディング領域 と少なくとも約６０％の同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ７．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１として示されたコーディング領域 と少なくとも約７０％の同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ８．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１として示されたコーディング領域 と少なくとも約８０％の同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ９．フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの酵素活性を有するポリペ プチドをコードするＤＮＡ配列が、配列番号１として示されたコーディング領域 を有するか、又は遺伝コードの縮重に従い配列番号１と同一のペプチドをコード する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。 １０．請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ分子 をゲノム内に含むトランスジェニック植物細胞。 １１．請求項１０に記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。 １２．組換えＤＮＡ分子を含まない植物と比較して増大した光合成速度、増大し た収穫量、増大した成長速度及び改良された固体均一性からなる群より選択され る性質を示す、請求項１１のトランスジェニック植物。 １３．穀物植物である、請求項１１に記載のトランスジェニック植物。 １４．トウモロコシ、小麦、米、トマト、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、 ヤムイモ、アーティチョーク、アルファルファ、ピーナッツ、大麦、綿、大豆、 カノーラ、ヒマワリ、テンサイ、リンゴ、ナシ、オレンジ、モモ、サトウキビ、 イチゴ、ラズベリー、バナナ、ブドウ、オオバコ、タバコ、レタス、キャッサバ 、アブラナ科の野菜、林業用種及び園芸用種からなる群より選択される、請求項 １１に記載のトランスジェニック植物。 １５．植物がジャガイモである、請求項１１のトランスジェニック植物。 １６．請求項１５のジャガイモ由来の食品。 １７．フレンチフライ又はポテトチップである、請求項１６の食品。 １８．請求項１１のトランスジェニック植物由来の繁殖素材。 １９．請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換 すること、及びトランスジェニック植物を作製するため形質転換された細胞を再 生させることを含む、植物において光合成速度を増大させるための方法。 ２０．請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換 すること、及びトランスジェニック植物を作製するため形質転換された細胞を再 生させることを含む、植物において収穫量を増大させるための方法。 ２１．請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換 すること、及びトランスジェニック植物を作製するため形質転換された細胞を再 生させることを含む、植物において成長速度を増大させるための方法。 ２２．請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子で植物細胞を形質転換 すること、及びトランスジェニック植物を作製するため形質転換された細胞を再 生させることを含む、植物 において固体均一性を改良するための方法。 ２３．ジャガイモをフライ又はチップに加工するための方法において、該ジャガ イモにおいてより高い固体均一性を提供するｆｄａトランスジーンを過剰発現す るジャガイモを利用することを含む改良。