【発明の詳細な説明】
サイレージの保存のための細菌処理発明の分野
本発明は、嫌気条件下で貯蔵した後に動物用飼料として使用される農作物を保
存する方法に関する。詳細には、本発明は、サイレージの消化の程度度および速
度が改善されるように、嫌気条件下で貯蔵した後の牧草を保存する方法に関する
。発明の背景
サイレージ添加剤の使用は農業分野の多くで広範囲に受け入れられた慣習にな
っている。サイロ貯蔵プロセス中では、サイレージを切断すると直ちに好気性呼
吸が始まる。この初期段階中に植物組織中の可溶性炭水化物が酸化されそして二
酸化炭素と水とに変換される。このプロセスは、酸素レベルが涸渇するかまたは
水溶性炭水化物が枯渇するかいずれかまで持続する。サイロ貯蔵材料の適切な包
装およびシールを用いる理想的な条件下では、呼吸は２,３時間しか持続しない
。この期間中の微生物の増殖は酸素に耐性のものに限られる。代表的には、これ
は、好気性細菌、酵母、および糸状菌が含まれる。これらの生物は、糖を二酸化
炭素、熱、および水に代謝するので、一般的にはこの系には好ましくないと認識
されている。
この初期段階に起こる別の重要な化学変化は植物プロテアーゼによる植物タン
パク質の破壊である。タンパク質はアミノ酸に分解され、そしてさらにアンモニ
アとアミンに代謝される。このプロセス中に、サイレージのpH低下速度に依存し
て、総タンパク質の50％までが破壊されることが報告されている。
一旦嫌気条件が確立されると、嫌気性細菌が増殖する。腸内細菌および異種発
酵乳酸菌が、一般的に確立されてくる最初の集団である。これらの生物は、グル
コースおよびフルクトースの発酵により、主に、酢酸、エタノール、乳酸、およ
び二酸化炭素を生成する。一旦pHが下がり始めると、主に乳酸を生成する同種発
酵乳酸菌集団が顕著に増加する。乳酸レベルが急速に増加するとpHは約４にまで
低下する。この点で、サイロに貯蔵された塊は一般的には、妨げられなければ、
貯蔵中安定なままである。
要約すると、材料を最初に酸素制限構造（例えば蓋付きサイロ中）に詰める場
合は、pHは低下し、残存酸素が使用され、そして材料は乳酸発酵を受けると言わ
れている。材料は安定に維持され、そしてこの条件で何ヵ月間も貯蔵され得る。
サイレージが給餌のために準備される場合、上蓋が外され、そして給餌するた
めにサイロが開けられる。次に、材料が空気に曝され、そしてこのプロセスはも
はや嫌気性ではなくなる。サイレージ自体または風で運ばれる汚染物中の微生物
叢は存在する酸類の酸化を開始し得る。この酸化は飼料の量または乾燥物質の損
失を引き起こすので、飼料損失を生じる。さらに、生じたpHおよび温度の上昇は
動物にとって不快なものであり、そして飼料が熱くなり始めた後ではその飼料は
動物に拒絶される。実施において観察される好気性での不安定性発生率は、サイ
ロ貯蔵材料をサイロから取り出す速度および開口前に材料がサイロに貯蔵されて
いた時間の長さに依存する。サイレージをゆっくりと取り出す場合には、次いで
、開けられたサイレージの表面に劣化を生じさせるまでにより長い時間がかかる
。より長いサイロ貯蔵時間は、酸濃度をより高く、かつ微生物叢集団を全て減少
する傾向にあるので、一般的にはより安定なサイレージが生成する。一般的には
、サイレージは開口後少なくとも５日間安定である。これは、サイレージを取り
出すために適切な時間を与える。
最近、細菌接種物が、グラス（grass）サイレージ、アルファルファサイレー
ジ、およびトウモロコシサイレージを含む貯蔵サイレージの保存に役立つことが
知られている。例えば、発酵段階中の乳酸菌の接種は発酵プロセスに有益であり
得る。例えば、1989年6月27日に発行されたHillの米国特許第4,842,871号、なら
びに本明細書中に引用した参照文献を参照のこと。水分の多いアルファルファの
安定性に関しては、この増大はおそらく、接種物が嫌気性発酵速度を増大し、そ
してpHを低下させるためである。これは、その結果初期段階で好気性のpH感受性
微生物叢により引き起こされる酸化的損失が回避されるので有益である。全植物
トウモロコシ、アルファルファなどのようなサイレージにおいては、接種物は繊
維の利用可能性の増大を引き起こすことおよび／またはより速い速度でサイレー
ジ量当たりのより多い栄養素を提供することによってサイレージの消化に有益な
効果を有し得る。
従って、本発明の１つの目的は、初期嫌気性段階中およびサイロを空気に対し
て開口する際の初期好気性段階中の両方で有効な細菌サイレージ接種物を開発す
ることである。
本発明のさらなる目的は、サイレージの消化速度を増大し、そしてそれにより
栄養素を動物により速く利用できるようなサイレージ接種物を開発することであ
る。
本発明のさらなる目的は、サイレージの消化の程度を増大し、それによってよ
り多くの栄養素を給餌される動物に利用できるようなサイレージ接種物を開発す
ることである。
本発明の目的ならびに他の目的の各々を達成する方法および態様は本明細書中
以下の詳細な説明から明らかである。発明の要旨
本発明においては、グラス、アルファルファおよび／またはトウモロコシサイ
レージを含むサイレージは、サイロ貯蔵プロセスの初期嫌気性段階中およびサイ
ロを開けた後の初期好気性条件段階中の両方で保存される。保存は特定の通性細
菌接種物を混合することによって達成される。本発明の接種物はサイレージ（特
にアルファルファサイレージ）の消化の程度および速度を改善する。この接種物
はLactobacillus plantarumおよびEnterococcus faeciumの選択した株を組み合
わせたものである。本発明の接種物は他の細菌と共存し得るので、サイロ貯蔵プ
ロセスを決して妨げない。詳細には、この接種物は、TJ1:Lactobacillus planta rum
347とEnterococcus faecium 301との組合せ、ATCC番号 を有する;ST:L actobacillus plantarum 346とLactobacillus plantarum 347との組合せ、ATCC
番号 を有する;およびFS:Lactobacillus plantarum 286とLactobacillus p lantarum
346との組合せ、ATCC番号 を有する、を含む。本発明はさらに、
サイレージに少量ではあるがサイロ貯蔵保存有効量の本発明の接種物の試作（pr
ototype）で処理する工程を包含するサイレージを処理する方法を提供する。本
発明の接種物はアルファルファサイレージの消化性の改善において特に効果的で
ある。発明の詳細な説明
本明細書中で使用される場合、用語「サイレージ」はグラスサイレージ、アル
ファルファサイレージ、トウモロコシサイレージ、モロコシ（sorghom）サイレ
ージ、発酵穀類およびグラス混合物などのような全ての型の発酵農作物を含むよ
うに意図される。これらは全て本発明の接種物で首尾良く処理され得る。本発明
はアルファルファサイレージの消化の程度および速度の改善において特に有効で
ある。
本発明の驚くべき局面は、Lactobacillus plantarumおよび／またはEnterococ cus faeciumの特定の株の特定の組合せだけが本発明において有効に機能するこ
とである。Lactobacillusをサイレージに添加することは一般的な手法として公
知である。例えば、米国特許第4,981,705号を参照のこと。しかし、本発明はLac tobacillus plantarumおよびEnterococcus faeciumに関して特異的な株を必要と
する。特に、本発明で作用することが見い出された接種物は以下のものである：Enterococcus faecium 301と組み合わせたLactobacillus plantarum 347（「TJ1
」）、Lactobacillus plantarum 347と組み合わせたLactobacillus plantarum 3
46（「ST」）、およびLactobacillus plantarum 346と組み合わせたLactobacill us plantarum 286（「FS」）である。しかし、本出願人らの発明は、種特異的で
あるが、これらの種ならびに名を挙げた種および株の所望の特性を示すそれらの
遺伝的等価物またはそれらの有効な変異体を含むように意図されることが理解さ
れるべきである。このような遺伝的等価物または変異体は親種と機能的に等価で
あると考えられる。自然発生的な突然変異が微生物において通常に生じること、
および変異はまた既知の多様な技術により意図的に生じさせ得ることが当業者に
周知である。例えば、突然変異体は化学的技術、放射活性および組換え技術を使
用して作製され得る。
変異体または遺伝的等価物を誘導する方法に関係なく、重要なことは、それら
が親種および／または株について記載されたようにサイレージを保存するように
機能することである。言い換えると、本発明は、例えば主要でない分類学的改変
のようなこのような主要でない変化をもたらす突然変異を含む。
本発明の処理に有用な代表的な組成物は、サイロ貯蔵産物の処理に有用な範囲
内の本発明の接種物を含み得る。すなわち、代表的には108〜1014個の生存個体
／トン、好ましくは109〜1011個の生存個体／トン、さらに好ましくは1010個の
生存個体／トンを含み得る。各株が約75％〜約25％までの範囲にある２つの株の
混合物が好ましい。接種物当たりの２つの株の各々が約50％の混合物が特に好ま
しい。
本発明の組成物はまた、例えば、Propionibacteria、Streptococcus、Lactoco
ccus、およびPediococcusのような他の通常のサイレージ貯蔵保存用個体ならび
に真菌または細菌由来の特定の酵素を含み得、これらは活性個体に対してどのよ
うな場合でも拮抗しない。
当業者は他の適切なキャリアおよび投与形態を知っているか、または定型的な
実験を使用してこれらを確認することができる。さらに、種々の組成物の処理は
、当業者に通常の標準的な技術（即ち、噴霧、散布など）を用いて実施され得る
。
上記の開示は本発明を一般的に記載する。以下の特定の実施例を参照すること
によってさらに詳細に理解することができるが、これらの実施例は、他に明示し
ない限り、説明の目的だけで本明細書中に提供しそして本発明を限定するように
は意図されていない。実施例
以下の表で示される実施例では、処理、調製、および貯蔵は標準的な方法を使
用して実施した。1992年、1993年、および1994年に実施したサイレージ貯蔵試験
に使用した接種物を、いずれの接種物も含有していないコントロールサンプルと
比較した。接種物のレベルは50：50混合物中で飼料１グラム当たり１×105個の
生存個体であった。これは１トン当たり９×1010個の個体に相当する。処理物は
液体として適用した。開発された試作接種物はLactobacillus plantarumとEnter ococcus faeciumの選択した株の次の組合せからなる:Lactobacillus plantarum
347株とEnterococcus faecium 301株(「TJ1」);Lactobacillus plantarum 286株
とLactobacillus plantarum 346株(「FS」);およびLactobacillus plantar um
346株とLactobacillus plantarum 347株（「ST」）。
試作組合せ物は50：50の比率で混合され、そしてしおれて切断されたアルファ
ルファに液体形態で１×105cfu／g試料の割合で適用した。処理した飼料を等量
部に分けそして水力学的圧縮機を使用して４”×14”の実験用PVCサイロ中に標
準的な密度に詰めた。サイロは、金属リングでしっかりおさえたゴムキャップで
各末端でシールした。一方の末端は、ガスは漏出できるが依然として嫌気的生活
を維持できるように、圧力放出バルブに取り付けた。実験用サイロは口を開ける
前に、農場サイロ条件をシミュレートするため20〜25℃で80〜120日間貯蔵した
。
実験用サイロを開け、サイレージを清潔な容器中に取り出し、混合し、そして
微生物、化学、および消化分析用にサンプルを採取した。残っているサイレージ
をプラスチック内層ポリスチレン製クーラーに入れ、このサイレージ塊の中心に
探査針を入れ、そして好気性安定性を測定するために１週間の間３時間毎に温度
を測定した。サイレージを空気に暴露する場合、好気性微生物によるサイレージ
中の糖および発酵産生物消費の結果として大量の栄養素の損失が生じ得る。糖は
呼吸で二酸化炭素と水に分解され、熱を発生する。サイレージの高い消化可能性
部分の損失に加えて、いくつかの好気性微生物は動物の健康に影響を与える毒素
を産生する。
空気曝露の際のサイレージの安定性を測定するために２回測定法を使用した。
サイレージの温度が環境温度より1.7℃高くなる時間を、サイレージの「腐敗」
と称した。これは、サイレージを空気に曝した後に好気性微生物が増殖を開始し
てサイレージの加熱を引き起こす前の時間の測定値である。累積度日数または「
cumm＿dd」は実際の温度曲線と環境温度により描いた線と間の面積の積分である
。これは総加熱量の尺度である。上昇した温度はタンパク質破壊の速度および量
を増大し、そして窒素、繊維および他の成分の消化性を減少させる。
アンモニア窒素の測定は、pHを上げ、続いてサイレージから出るアンモニアを
水蒸気蒸留することによるアンモニアイオンの解離を含む標準的な方法を使用し
て実施した。アンモニア窒素の量は滴定により定量測定される。アンモニア窒素
のレベルは発酵速度の指標である。より速い発酵速度は、タンパク質分解酵素の
活性をより低下させ、それによってより多くのタンパク質を動物に利用可能にす
る。
発酵終点測定はpHである。アルファルファサイレージに十分なpHは4.5未満で
ある。pHが下がるにつれて、タンパク質分解活性は低下する。pH測定は、pH4.0
消化の程度および速度を決定するために、消化分析用にサンプルを乾燥させ、
分光学（NIRS）で走査した。スペクトルの両極端（extreme）を選択し、そして
それに対して、インビトロ乾燥物質（IVDM）の消化の速度および程度を測定した
。IVDMの消化速度はルーメンで起こることをシミュレートするように設計した系
を使用して測定した。乾燥サイレージサンプルを緩衝液および生存している繊維
分解（cellulytic）微生物を含有するルーメン液と組み合わせる。繊維分解微生
物はサイレージサンプル中の繊維を消化する際に、ガスを発生する。消化速度は
時間に対するガス発生をプロットすることにより作成した曲線の直線部分の傾斜
として定義した。これは、ルーメン液のバッチ間の微生物集団におけるバリエー
ションを示すために標準品のパーセントとして表わした。より速い消化速度は、
栄養素を動物により速く利用可能にし、そしてより多い乳または肉を生産するた
めにこの栄養素の動物への利用を可能にすることを意味する。接種物がこの増大
を引き起こす方法の１つの可能性は、接種物が飼料の構造を変化させ、ルーメン
微生物に対して飼料をより利用可能にし、これによって順次、飼料が動物による
使用のためのエネルギーに変換されるということである。一定の期間中に発生し
たガスの総量は消化の程度と称され、そしてこれもまた、標準品のパーセントと
して表わした。消化の程度は繊維の消化によって利用可能とされる総栄養素量の
指標である。両極端のIVDM消化の速度および程度をNIRS較正した式に加え、そし
て残っているサンプルの値をこれらのスペクトルに基づいて予測した。
下記表１、２、および３は実施した試験を要約する。「コントロール」は非接
種サイレージを示す。
表１は1992年の試験によるデータを要約する。表１は、TJ1、FS、およびSTが
全て、コントロールサイレージより高い消化速度を有することを示している。従
って、接種されたサイレージ由来の栄養素は、接種されていないサイレージ由来
の栄養素より速く動物に利用可能となる。TJ1接種されたサイレージおよびFS接
種されたサイレージはまた、コントロールサイレージより低いアンモニア窒素レ
ベルも示し、従って、より早い発酵速度を示し、これはより少ないタンパク質損
失を導く。pH値は全て受容可能であり(＜4.5)、接種されたサイレージはコント
ロールサイレージよりも数字的に良好なpHを有していた。
表２は、pH、腐敗、cumm＿dd、消化の程度、および消化の速度に関する７回の
試験にわたる1993年の試験によるデータを要約する。アンモニア窒素について５
回の試験を実施した。TJ1、FS、およびSTは全て、接種されていないサイレージ
より有意に（ｐ≦0.1）高い消化速度（栄養素をより速く利用できる）および消
化の程度（栄養素をより多く利用できる）、ならびにより低い（ｐ≦0.1）アン
モニア窒素レベル（タンパク質損失がより少ない）を示す。接種物はまた、コン
トロールサイレージより良好な腐敗値およびcumm＿dd値を提供し、これはより良
好な好気性安定性を示す。より良好な腐敗値は、好気性加熱による栄養素の損失
が少ないことを示す。cumm＿dd値は全て非常に低く、これは総加熱が最小である
ことを示した。好気性微生物が増殖を開始し、そして加熱を引き起こす前に６日
間以上経過する場合は、腐敗値は全て満足できるものであった。cumm＿dd値は非
常に低く、これは総加熱が最小であったことを示した。
表３は、1994年にTJ1について実施された５回の試験およびSTについて実施さ
れた４回の試験によるデータを要約する。これらのデータはTJ1およびSTがコン
トロールサイレージより高い消化速度および消化の程度を有することを示す。接
種されたサイレージはまた、コントロールサイレージ（これは4.5を超えるpHを
有した）より有意に（ｐ≦0.20）良好なpH値を有した。
表１ 1992アルファルファ試験の要約
表２ 1993アルファルファ試験の要約
表３ 1994アルファルファ試験の要約
Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for preserving crops used as animal feed after storage under anaerobic conditions. In particular, the present invention relates to a method of preserving grass after storage under anaerobic conditions so that the degree and rate of digestion of the silage is improved. BACKGROUND OF THE INVENTION The use of silage additives has become a widely accepted practice in many agricultural fields. During the silo storage process, aerobic respiration begins as soon as the silage is cut. During this early stage, soluble carbohydrates in plant tissue are oxidized and converted to carbon dioxide and water. This process lasts until either oxygen levels are depleted or water-soluble carbohydrates are depleted. Under ideal conditions with proper packaging and sealing of silo storage material, breathing lasts only a few hours. The growth of microorganisms during this period is limited to those resistant to oxygen. Typically, this includes aerobic bacteria, yeast, and filamentous fungi. These organisms are generally recognized as undesirable for this system because they metabolize sugars to carbon dioxide, heat, and water. Another important chemical change that occurs during this early stage is the destruction of plant proteins by plant proteases. Protein is broken down into amino acids and further metabolized to ammonia and amines. It has been reported that up to 50% of total protein is destroyed during this process, depending on the rate of pH reduction of the silage. Once anaerobic conditions are established, anaerobic bacteria grow. Enterobacteria and heterologous fermented lactic acid bacteria are the first populations to be generally established. These organisms produce mainly acetic acid, ethanol, lactic acid, and carbon dioxide by fermentation of glucose and fructose. Once the pH begins to drop, the population of homologous fermented lactic acid bacteria that produces mainly lactic acid increases significantly. As lactic acid levels increase rapidly, the pH drops to about 4. At this point, the mass stored in the silo generally remains stable during storage unless obstructed. In summary, if the material is first packed into an oxygen-limited structure (eg, in a silo with a lid), it is said that the pH will drop, the remaining oxygen will be used, and the material will undergo lactic fermentation. The material is kept stable and can be stored for months at this condition. When the silage is ready for feeding, the top lid is removed and the silo is opened for feeding. Next, the material is exposed to air and the process is no longer anaerobic. The microflora in the silage itself or in the wind-borne contaminants can initiate oxidation of the acids present. This oxidation causes feed loss, as it causes loss of feed quantity or dry matter. Furthermore, the resulting increase in pH and temperature is unpleasant for the animal, and the food is rejected by the animal after the food has started to heat up. The incidence of aerobic instability observed in practice depends on the rate at which the silo storage material is removed from the silo and the length of time the material has been stored in the silo before opening. If the silage is taken out slowly, it will then take longer to cause the surface of the opened silage to degrade. Longer silo storage times generally produce more stable silage, as higher acid concentrations and a tendency to reduce the microbiome population altogether. Generally, silage is stable for at least 5 days after opening. This gives adequate time to remove the silage. Recently, bacterial inoculants have been known to help preserve silage storage, including grass silage, alfalfa silage, and corn silage. For example, inoculation of lactic acid bacteria during the fermentation stage can be beneficial to the fermentation process. See, for example, Hill, U.S. Pat. No. 4,842,871, issued Jun. 27, 1989, as well as references cited herein. With respect to the stability of wet alfalfa, this increase is probably due to the inoculum increasing the anaerobic fermentation rate and lowering the pH. This is beneficial because the oxidative losses caused by the aerobic pH-sensitive microflora in the early stages are thereby avoided. In silages, such as whole plant corn, alfalfa, etc., the inoculum benefits the silage digestion by causing increased fiber availability and / or providing more nutrients per silage volume at a faster rate. Can have various effects. Accordingly, one object of the present invention is to develop a bacterial silage inoculum that is effective both during the initial anaerobic phase and during the initial aerobic phase when opening the silo to air. It is a further object of the present invention to develop a silage inoculum that increases the digestion rate of the silage and thereby makes nutrients available to the animal faster. It is a further object of the present invention to develop a silage inoculum that increases the extent of digestion of the silage, thereby making more nutrients available to the animal being fed. The manner and embodiments for achieving each of the objects of the invention, as well as others, will be apparent from the detailed description herein below. SUMMARY OF THE INVENTION In the present invention, silage, including glass, alfalfa and / or corn silage, is stored both during the initial anaerobic stage of the silo storage process and during the initial aerobic stage after opening the silo. Storage is achieved by mixing specific facultative bacterial inoculum. The inoculum of the present invention improves the degree and rate of digestion of silage, especially alfalfa silage. This inoculum is a combination of selected strains of Lactobacillus plantarum and Enterococcus faecium . Since the inoculum of the present invention can coexist with other bacteria, it never interferes with the silo storage process. In particular, this inoculum was designated TJ1: Lactobacillus planta rum 347 in combination with Enterococcus faecium 301, ATCC number ST: Combination of L actobacillus plantarum 346 and Lactobacillus plantarum 347, ATCC number Having; and FS: combination of Lactobacillus plantarum 286 and Lactobacillus p lantarum 346, ATCC No. Having. The present invention further provides a method of treating silage, comprising the step of treating the silage with a small but silo storage effective amount of a prototype of the inoculum of the present invention. The inoculum of the present invention is particularly effective in improving the digestibility of alfalfa silage. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION As used herein, the term "silage" refers to all types of fermented crops such as grass silage, alfalfa silage, corn silage, sorghom silage, fermented cereals and grass mixtures, and the like. Is intended to include. All of these can be successfully treated with the inoculum of the present invention. The present invention is particularly effective in improving the extent and rate of digestion of alfalfa silage. Surprising aspect of the invention, only certain combinations of certain strains of Lactobacillus plantarum and / or Enterococ cus faecium is to function effectively in the present invention. Adding Lactobacillus to silage is known as a general technique. See, for example, U.S. Patent No. 4,981,705. However, the present invention requires strains specific for Lac tobacillus plantarum and Enterococcus faecium . In particular, inoculum to act in the present invention has been found are the following: Enterococcus Lactobacillus in combination with faecium 301 plantarum 347 ( "TJ1"), Lactobacillus plantarum 3 46 combined with Lactobacillus plantarum 347 ( "ST" ), and is a Lactobacill us plantarum 286 in combination with Lactobacillus plantarum 346 ( "FS"). However, Applicants' invention is intended to include species-specific, but also those genetic equivalents or effective variants thereof, which exhibit the desired properties of these species and the named species and strains. It is to be understood that this is intended. Such genetic equivalents or variants are considered to be functionally equivalent to the parent species. It is well known to those skilled in the art that naturally occurring mutations usually occur in microorganisms, and that mutations can also be intentionally made by a variety of known techniques. For example, mutants can be made using chemical, radioactive and recombinant techniques. Regardless of the method by which the mutants or genetic equivalents are derived, what is important is that they function to preserve silage as described for the parental species and / or strain. In other words, the invention includes mutations that result in such minor changes, such as minor taxonomic alterations. A typical composition useful for the treatment of the present invention may include the inoculum of the present invention in a range useful for treating silo storage products. That is, it may typically contain 10 8 -10 14 surviving individuals / ton, preferably 10 9 -10 11 surviving individuals / ton, more preferably 10 10 surviving individuals / ton. A mixture of two strains, with each strain ranging from about 75% to about 25% is preferred. Particularly preferred is a mixture of about 50% of each of the two strains per inoculum. The compositions of the present invention may also include other conventional silage storage and storage individuals, such as, for example, Propionibacteria, Streptococcus, Lactococcus, and Pediococcus, as well as certain enzymes from fungi or bacteria, which are active relative to the active individual. Do not antagonize in any case. One skilled in the art will know other suitable carriers and modes of administration or will be able to ascertain these using routine experimentation. In addition, processing of the various compositions may be performed using standard techniques common to those skilled in the art (ie, spraying, dusting, etc.). The above disclosure generally describes the present invention. The invention can be understood in more detail by reference to the following specific examples, which, unless otherwise indicated, are provided herein by way of explanation only and limit the invention. Not intended to be. EXAMPLES In the examples shown in the tables below, processing, preparation, and storage were performed using standard methods. The inoculum used for the silage storage tests performed in 1992, 1993, and 1994 were compared to control samples that did not contain any inoculum. The level of inoculum was 1 × 10 5 surviving animals per gram of feed in the 50:50 mixture. This corresponds to 9 × 10 10 individuals per ton. The treatment was applied as a liquid. The developed inoculum consists of the following combinations of selected strains of Lactobacillus plantarum and Enter ococcus faecium : Lactobacillus plantarum 347 and Enterococcus faecium 301 (`` TJ1 ''); Lactobacillus plantarum 286 and Lactobacillus plantarum 346 (`` FS "); and Lactobacillus plantar um 346 strain and the Lactobacillus plantarum 347 shares (" ST "). The prototype combination was mixed at a ratio of 50:50 and applied to wilted and cut alfalfa in liquid form at a rate of 1 × 10 5 cfu / g sample. The treated feed was divided into equal parts and packed into standard density in 4 "x 14" laboratory PVC silos using a hydraulic compressor. The silos were sealed at each end with a rubber cap firmly held by a metal ring. One end was attached to a pressure release valve so that gas could escape but still maintain anaerobic life. Laboratory silos were stored at 20-25 ° C for 80-120 days before opening their mouth to simulate farm silo conditions. The laboratory silo was opened, the silage was removed into a clean container, mixed, and samples were taken for microbial, chemical, and digestive analysis. The remaining silage was placed in a plastic inner layer polystyrene cooler, a probe was placed in the center of the silage mass, and the temperature was measured every three hours for one week to determine aerobic stability. When exposing silage to air, large amounts of nutrient loss can occur as a result of sugar and fermentation product consumption in the silage by aerobic microorganisms. Sugar is broken down into carbon dioxide and water by respiration, producing heat. In addition to loss of the high digestible portion of silage, some aerobic microorganisms produce toxins that affect animal health. A duplicate measurement was used to determine silage stability upon air exposure. The time at which the temperature of the silage was 1.7 ° C above the ambient temperature was called silage "rot". This is a measure of the time before the aerobic microorganisms begin to proliferate and cause the silage to heat after exposing the silage to air. Cumulative frequency days or "cumm_dd" is the integral of the area between the actual temperature curve and the line drawn by the ambient temperature. This is a measure of the total heating. Elevated temperatures increase the rate and amount of protein destruction and reduce the digestibility of nitrogen, fiber and other components. Ammonia nitrogen measurements were performed using standard methods involving dissociation of ammonia ions by raising the pH followed by steam distillation of the ammonia leaving the silage. The amount of ammonia nitrogen is quantitatively measured by titration. The level of ammonia nitrogen is an indicator of the fermentation rate. A faster fermentation rate results in less proteolytic enzyme activity, thereby making more protein available to the animal. The fermentation endpoint measurement is pH. A pH sufficient for alfalfa silage is less than 4.5. As the pH decreases, the proteolytic activity decreases. pH measurement is pH 4.0 Drying the sample for digestion analysis to determine the extent and rate of digestion, Scanning with spectroscopy (NIRS). The extremes of the spectrum were chosen, and the rate and extent of digestion of in vitro dried material (IVDM) was determined. The digestion rate of IVDM was measured using a system designed to simulate what happens in the lumen. The dried silage sample is combined with a buffer and a rumen fluid containing viable cellulytic microorganisms. Fibrinolytic microorganisms generate gas when digesting fibers in silage samples. Digestion rate was defined as the slope of the linear portion of the curve generated by plotting gas evolution against time. This was expressed as a percentage of the standard to indicate the variation in microbial population between batches of rumen fluid. A faster digestion rate means that the nutrient is made available to the animal faster, and that this nutrient is available to the animal to produce more milk or meat. One potential way in which the inoculum causes this increase is that the inoculum alters the structure of the feed, making the feed more available to rumen microorganisms, which in turn reduces the energy required for use by animals. Is converted to The total amount of gas evolved during a period of time is referred to as the degree of digestion and was also expressed as a percentage of the standard. The degree of digestion is an indicator of the total nutrient available by fiber digestion. The rates and extent of IVDM digestion at both extremes were added to the NIRS calibrated equation, and the values of the remaining samples were predicted based on these spectra. Tables 1, 2, and 3 below summarize the tests performed. "Control" indicates uninoculated silage. Table 1 summarizes data from the 1992 study. Table 1 shows that TJ1, FS, and ST all have higher digestion rates than control silage. Thus, nutrients from the inoculated silage are made available to the animal faster than nutrients from the uninoculated silage. TJ1-inoculated silage and FS-inoculated silage also show lower levels of ammonia nitrogen than control silage, thus exhibiting faster fermentation rates, which leads to less protein loss. All pH values were acceptable (<4.5) and the inoculated silage had a numerically better pH than the control silage. Table 2 summarizes data from 1993 tests over seven tests on pH, spoilage, cumm_dd, degree of digestion, and rate of digestion. Five tests were performed for ammonia nitrogen. TJ1, FS, and ST are all significantly (p ≦ 0.1) higher digestion rates (faster nutrient availability) and degree of digestion (more nutrients available), and lower (p ≦ 0.1) than uninoculated silage. p ≦ 0.1) indicates ammonia nitrogen level (less protein loss). The inoculum also provides better spoilage and cumm_dd values than the control silage, which indicates better aerobic stability. Better decay values indicate less nutrient loss due to aerobic heating. The cumm_dd values were all very low, indicating that the total heating was minimal. If the aerobic microorganisms began to grow and elapse more than 6 days before causing heating, the spoilage values were all satisfactory. The cumm_dd values were very low, indicating that the total heating was minimal. Table 3 summarizes data from five tests performed on TJ1 and four tests performed on ST in 1994. These data indicate that TJ1 and ST have a higher digestion rate and degree of digestion than control silage. The inoculated silage also had significantly (p ≦ 0.20) better pH values than the control silage, which had a pH above 4.5. Table 1. Summary of the 1992 Alfalfa Test Table 2 Summary of 1993 Alfalfa Test Table 3 Summary of the 1994 Alfalfa Study
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