JP2001515710A

JP2001515710A - シュードモナス属の細菌群を検出するための核酸配列および方法

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Publication number: JP2001515710A
Application number: JP2000510755A
Authority: JP
Inventors: コルネリアベルクホフ，; アレクサンダーガシュ，; アンヤブラウアー，; コルトゥグレーネヴァルト，; フライムートヴィルボーン，; アルントロルフス，
Original assignee: ビオテコンゲゼルシャフトフュアビオテヒノロギッシェエントヴィックルングウントコンズルティンクエムベーハー
Priority date: 1997-09-09
Filing date: 1998-09-09
Publication date: 2001-09-25
Also published as: WO1999012949A3; DE59814284D1; US20030082656A1; US6893817B2; AU9538798A; DE19739611A1; EP1012156B1; EP1012156A2; DK1012156T3; ATE407940T1; WO1999012949A2

Abstract

(57)【要約】本発明はシュードモナス属、特にシュードモナスアエルギノーザの細菌群を検出するための核酸分子もしくは分子群ならびに方法に関する。さらに本発明の目的は、前記検出方法を実施するためのテストキットもしくは複数のテストキットである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】この発明は、シュードモナスを検出するための核酸分子、キットならびにその
使用に関する。

【０００２】発明の一般的背景グラム陰性菌シュードモナスアエルギノーザは広く分布した、人間に対する病原菌であり、これは特に新生児および抵抗の弱まった人間にとり健康上高い危
険を意味する。その高い臨床上の重要性、しばしば存在する抗生物質耐性および
毒素、特に毒性の高い外毒素Ａ（Ｗｏｏｄｓ、Ｄ．Ｅ．およびＩｇｌｅｗｓｋｉ
、Ｂ．Ｈ．、Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５、７１４−７２２（１９８３）
のほかに、シュードモナスアエルギノーザは食品中毒で最も重要な病原菌である。シュードモナスアエルギノーザを検出するために、常套的な方法を利用して少なくとも４日必要になる。そのため早急に食料品および臨床試料におけるシ
ュードモナスアエルギノーザの迅速検出法を開発する必要がある。

【０００３】個々の微生物を検出するための定期的な導入に向けて近年一連の新たな方法が
開発されてきた。これには、多価または単クローン抗体の導入に基づく免疫学的
な方法と、病原菌に特異的な核酸へのハイブリッド形成を利用して検出するため
の核酸プローブが使用される方法とが含まれる。その他の方法として、核酸ハイ
ブリッド形成による確認反応のある、またはそれに適合する確認反応のない特異
的な核酸増幅に基づく方法が記述されている。核酸を増幅するために導入された
方法は、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒ
ｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）［米国特許第４６８３１９５号、第４６８３２０２号
および第４９６５１８８号］、リガーゼ連鎖反応［ＷＯ公開第８９／０９８３５
号］、‘自己維持配列複製’［欧州特許出願ＥＰ３２９８２２号］、‘増幅系に基づく転写’［欧州特許出願ＥＰ３１０２２９号］およびＱβ ＲＮＡレプリ
カーゼ系［米国特許第４９５７８５８号］がある。

【０００４】上述の核酸に基づく方法は、常套的な微生物学の方法の場合と異なり、被検試
料から検出すべき微生物の時間のかかる増殖がなくなるか、または大幅に短縮で
きるほど敏感である。従ってそれぞれの微生物の存在または非在の検査は、上述
の核酸に基づく方法を適用により通常１日以内に終了してしまう。特に常套的な
方法を利用した検出のために数日ないし数週間が必要になる場合でも、それによ
り著しい時間短縮が達成される。

【０００５】シュードモナスアエルギノーザを検出するためのＰＣＲに基づく種々の方法が記述されている。外毒素Ａ遺伝子から３６９ｂｐ長さのＤＮＡ部位の増幅を利
用して、選択的にシュードモナスアエルギノーザ種の菌株の存在を検出することができた（Ｋｈａｎら（１９９４）応用環境微生物学６０、３７３９−３７４
５）。たしかにこのＰＣＲ系により他の種の細菌は検出されなかったが、合計１
３０の試験したシュードモナスアエルギノーザ菌株の９６％でのみ増幅物を観察することができた。このＰＣＲ系は、それによりシュードモナスアエルギノーザの全菌株の存在を確実に検出できる迅速法の確立のために条件付きでのみ適
している。

【０００６】もう１つの、最近公表された、マルチプレックスＰＣＲに基づく方法を利用し
て、一方で蛍光性のシュードモナスと他方でシュードモナスアエルギノーザの選択的な検出が達成された［ＤｅＶｏｓら（１９９７）、臨床微生物学誌３５、１２９５−１２９９］。合計１５０の試験されたシュードモナスアエルギノーザの分離株のそれぞれをこの方法により検出することができた。しかし欠点は
、選択的なシュードモナスアエルギノーザの検出のために考慮されたｏｐｒＬ遺伝子がシュードモナス属の他の種にも高保存されていることである。Ｖｏｓｓ
らにより使用されたプライマの結合箇所の領域で遺伝暗号が指定されるアミノ酸
は、シュードモナスプチダおよびシュードモナスアエルギノーザにおいて同一
である。従ってシュードモナスアエルギノーザの検出は単に個々のアミノ酸コドンの第３位置の変化に限定された幾つかのわずかに異なる塩基対に基づく。こ
れは発明に基づき誤った正のもしくは誤った負の結果が発生する大きな危険を秘
めている。

【０００７】記述されたマルチプレックスＰＣＲ系は、特にｏｐｒＩおよびｏｐｒＬ遺伝子
の高い保存性のため、たとえばＰＣＲ反応に続いて種々のプローブの導入により
、たとえばシュードモナスフルオレッセンス、シュードモナスメンドシーナ、
シュードモナスプチダまたはシュードモナススツツェリのような、他の臨床的
に重要なシュードモナス属の種も検出する可能性をまったく提供しない。

【０００８】ここに明示した発明の目的は、プライマおよび／またはプローブとしての核酸
配列の導入がシュードモナスアエルギノーザ種の全代表物質の可能な限り完全な検出を保証する核酸配列の確立であった。この発明のもう１つの目的は、たと
えばＰＣＲでもしくはＰＣＲに続いてプライマおよび／またはプローブの種々の
変異体の導入により、任意にシュードモナス属の他の種の検出も可能にするため
、シュードモナス属のさまざまな種の中に高い配列変異性を有するゲノム領域を
見つけ出すことであった。

【０００９】検出すべき微生物群のそれぞれの大きさに応じて、かつ区別するべき（検出し
ない）微生物のそれぞれの進展変化の親縁性（類似性）に応じて、所望の特異性
を有するそれぞれ適したＤＮＡ配列を見出すため、差異的なＤＮＡ配列に基づく
検出は非常に広範囲の事前準備を必要とする。ここに記述した発明はそのような
ＤＮＡ配列に係り、それによりシュードモナス属の細菌群、特にシュードモナス
アエルギノーザの迅速検出が可能になる。

【００１０】発明の説明一態様により、この発明の基礎となる課題は、核酸分子により、即ち、一方で
検出すべきシュードモナス属の細菌群に、他方で検出しない細菌群に属し、（ａ）自体公知の方法で前記群の１つのシュードモナス菌株（第１菌株）からゲ
ノムＤＮＡを単離し、（ｂ）自体公知の方法で２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位を必要のある場合に直接隣
接する２３Ｓ領域および／または直接隣接する５Ｓ領域と共に増幅し、かつ増幅
生成物を得（第１増幅生成物）、（ｃ）これらの群の第２、第３、．．．．．および／または第ｎシュードモナス
菌株と共にそれぞれ段階（ａ）および（ｂ）に従ってゲノムＤＮＡを単離し、２
３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位を必要のある場合に直接隣接する２３Ｓ領域および／
または直接隣接する５Ｓ領域と共に増幅し、かつ増幅生成物を得（第２、第３、
．．．．．第ｎ増幅生成物）、（ｄ）自体公知の方法で（ｂ）および（ｂ）に従って得られた増幅生成物のＤＮ
Ａ配列を同定し、かつ（ｂ）に基づく増幅生成物のＤＮＡ配列を（ｃ）に基づく
１つまたはそれ以上の増幅生成物のＤＮＡ配列と比較し、かつ（ｅ）プライマとしてまたはプローブとして核酸分子を自体公知の方法で得、そ
れを利用して検出すべきシュードモナス属の細菌群が核酸分子の配列領域内の少
なくとも１つのヌクレオチド位置の違いを利用して検出しないシュードモナスの
細菌群から区別することができる、複数の菌株から出発することにより取得できる、前記核酸分子により、解決され
る。

【００１１】本発明に基づく核酸分子は、一方で検出すべきシュードモナス属の細菌群に、
他方でシュードモナスとして検出しない他の属の細菌群（他の属群）に属する、
菌株から出発することにより取得可能にすることができる。

【００１２】もう１つの態様により、この発明の基礎となる課題は、核酸分子により、即ち
、検出すべきおよび検出しないシュードモナス属の細菌群の１つに属し、（ａ）自体公知の方法でこれらの群の１つのシュードモナス菌株（第１菌株）か
らゲノムＤＮＡを単離し、（ｂ）自体公知の方法で２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位を必要のある場合に直接隣
接する２３Ｓ領域および／または直接隣接する５Ｓ領域と共に増幅し、かつ増幅
生成物を得（第１増幅生成物）、（ｃ）これらの群の第２、第３、．．．．．および／または第ｎシュードモナス
菌株と共にそれぞれ段階（ａ）および（ｂ）に従ってゲノムＤＮＡを単離し、２
３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位を直接隣接する２３Ｓ領域および／または直接隣接す
る５Ｓ領域と共に増幅し、かつ増幅生成物を得（第２、第３、．．．．．第ｎ増
幅生成物）、（ｄ）自体公知の方法で（ｂ）および（ｃ）に従って得られた増幅生成物のＤＮ
Ａ配列を同定し、かつ（ｂ）に基づく増幅生成物のＤＮＡ配列が（ｃ）に基づく
１つまたはそれ以上の増幅生成物のＤＮＡ配列と比較し、かつ（ｅ）プライマとしてまたはプローブとして核酸分子を自体公知の方法で得、そ
れを利用して検出すべきシュードモナス属の細菌群を核酸分子の配列領域内の少
なくとも１つのヌクレオチド位置の違いを利用して検出しないシュードモナス属
の細菌群から区別することができる、複数の菌株から出発することにより取得可能である、前記核酸分子により解決さ
れる。

【００１３】本発明による核酸分子は、検出すべきシュードモナスアエルギノーザ種の細菌群と、検出しない他の種の細菌群とに属する、菌株から出発することにより獲
得可能にすることができる。

【００１４】さらにこの発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ１またはそれと相補的な配列の核酸分子に関する。

【００１５】さらにこの発明は、前記核酸分子よりも短縮された配列、しかも前記領域また
はヌクレオチド位置１２ないし１３１の領域内の配列を有するような核酸分子に
関する。

【００１６】さらにこの発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ１の核酸分子よりも短縮された配列、すなわち（i）ＳＥＱＩＤＮＯ３、または（ii）ＳＥＱＩＤＮＯ４、または（iii）ＳＥＱＩＤＮＯ５、または（iv）（i）、（ii）および（iii）とそれぞれ相補的な配列を有するような核酸分子に関する。

【００１７】さらにこの発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ２またはそれと相補的な配列の核酸分子に関する。

【００１８】本発明による核酸分子は、その配列に関し少なくとも１０個連続する該核酸分
子ヌクレオチド鎖のヌクレオチドにおいて、（i）上記請求項のいずれか１項記載の核酸分子と同一であり、または（ii）連続するヌクレオチド１０個のうち９個で上記請求項のいずれか１項記載
の核酸分子と一致し、または（iii）連続するヌクレオチド１０個のうち８個で上記請求項のいずれか１項記載の核酸分子と一致し、または（iv）少なくとも９０％以上が上記請求項のいずれか１項記載の核酸分子と同族
であること、を特徴とすることができる。

【００１９】このような本発明による核酸分子は、１０個ないし２５０個および好ましくは
１５個ないし３０個のヌクレオチド長さであることを特徴とすることができる。

【００２０】本発明による核酸分子は、この核酸分子が一本鎖または二本鎖で存在すること
を特徴とすることができる。

【００２１】本発明による核酸分子は、この核酸分子が（i）ＤＮＡとして、または（ii）（i）に相当するＲＮＡとして、または（iii）ＰＮＡ（以下参照）として存在し、その際この核酸分子が必要のある場合に分析的な検出方法のために、特にハイ
ブリッド形成および／または増幅に基づき、自体公知の方法で修飾されることを
特徴とすることができる。

【００２２】このような本発明に基づく核酸分子は、少なくとも１０個連続する該核酸分子
のヌクレオチド鎖のヌクレオチドのうちヌクレオチドの２０％まで、特に１個ま
たは２個のヌクレオチドが、プローブおよび／またはプライマのために自体公知
の類似の構成要素、特に細菌において自然に存在しないヌクレオチドと置換され
ることにより修飾することができる。

【００２３】さらに本発明による核酸分子は、この核酸分子が分析的な検出方法のために自
体公知の方法で、特に抗体、抗原、酵素および／または酵素もしくは酵素複合体
と親和性のある物質を利用して、１つまたはそれ以上の放射性群、着色群、蛍光
群、固相へ不動化するための群および／または間接的もしくは直接的な反応、特
に酵素反応のための群、および／または別様に修飾するまたは修飾された核酸類
似の構造群を有することにより、またはこれらを追加することにより修飾もしく
は標識することができる。

【００２４】もう１つの態様により、この発明の基礎となる課題は、分析的な検出方法、特
にシュードモナス属の細菌群を検出するためのキットにより解決され、このキッ
トは１つまたはそれ以上の本発明による核酸分子を特徴とする。

【００２５】もう１つの態様により、この発明の基礎となる課題は、シュードモナス属の細
菌群に類族する、細菌の存在または非在を検出するための、１つまたはそれ以上
の本発明に基づく核酸分子または本発明によるキットの使用により解決される。

【００２６】本発明による使用は、シュードモナス属の細菌群がシュードモナスアエルギノーザの種々の菌株を含み、またはこれらの菌株により形成されることを特徴と
することができる。

【００２７】このような本発明による使用は、シュードモナス属の細菌群が専らシュードモ
ナスアエルギノーザの菌株であることを特徴とすることができる。

【００２８】さらに本発明による使用は、核酸ハイブリッド形成および／または核酸増幅が
実施されることを特徴とすることができる。

【００２９】さらに本発明による使用は、ポリメラーゼ連鎖反応が核酸増幅として実施され
ることを特徴とすることができる。

【００３０】さらに本発明による使用は、検出すべき細菌がゲノムＤＮＡおよび／またはＲ
ＮＡの区別を利用して、本発明に基づく核酸分子の領域内の少なくとも１つのヌ
クレオチド位置で検出しない細菌から区別されることにより検出が実施されるこ
とを特徴とすることができる。

【００３１】さらに本発明による使用は、ＳＥＱＩＤＮＯ１またはそれと相補的な配列の核酸分子の領域内の区別を利用して区別されることを特徴とすることができる
。

【００３２】すなわち核酸ハイブリッド形成または増幅を利用して特異的な微生物を検出す
るために、本発明に基づき病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドが使用される。
病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドは１０個ないし２５０個の塩基（好ましく
は１５個ないし３０個の塩基）長さの核酸であり、その塩基配列は特異的な微生
物または微生物群に特徴的である。上記方法によるこれらの病原菌に特異的なオ
リゴヌクレオチド（たとえばプライマまたはプローブとして）の使用時における
ＤＮＡへのハイブリッド形成もしくはＤＮＡの増幅は、適切な反応条件下で、そ
れぞれの検出すべき微生物のＤＮＡが存在する場合にのみ行なうことができる。

【００３３】原核リボソームは３つの別種の核酸成分を含み、これらは一般に５Ｓ、１６Ｓ
および２３ＳｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）として知られている。リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）のための遺伝子情報はゲノム内で典型的に縦列の形態で配置
されている。このような単位の組織は１６Ｓ−２３Ｓ−５Ｓであり、その際３つ
の遺伝子は遺伝子間の短い超可変部により互いに分離されている。この単位はゲ
ノムの中で多重に存在し、反復する単位の数は種々の細菌の中で変化させること
ができる。全細菌領域にわたる１６ＳｒＤＮＡ２３ＳｒＤＮＡおよび５Ｓｒ
ＤＮＡの領域内のＤＮＡ配列の高い保存性は、調査される微生物のＤＮＡ配列の
正確な知識がなくても非特異的なオリゴヌクレオチドのデザインを可能にする。
このような非特異的なオリゴヌクレオチドは、大きな通常系統発生的に親縁性の
微生物群にとり特徴的である。この非特異的オリゴヌクレオチドの使用により、
専門家には、ＰＣＲを利用したＤＮＡ増幅による適切な予備実験の後に、たとえ
ば任意の微生物の２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位の、ｒＤＮＡ断片の単離が達成さ
れた。次いでＤＮＡ配列により該当する微生物の遺伝子間の超可変部の配列を同
定することができる。

【００３４】一方で可能な限り多数の検出すべき細菌（たとえばさまざまなシュードモナス
種）の２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位のＤＮＡ配列順序と、他方でそれに続くこの
ＤＮＡ配列の比較は、調査した群（たとえば全てのシュードモナス種）の中で変
化せず、または非本質的にのみ変化したＤＮＡ領域の検出を可能にする。

【００３５】一方で選択された検出しない細菌（たとえばシュードモナス属に含まれない細
菌）の２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位のＤＮＡ配列順序と、他方でそれに続く検出
すべき細菌（たとえばさまざまなシュードモナス種）の配列を有するこれらのＤ
ＮＡ配列の比較は、検出すべき細菌（たとえば全てのシュードモナス種）に特徴
的なＤＮＡ配列の検出を可能にする。これらのＤＮＡ配列から再びオリゴヌクレ
オチドを導くことができ、それぞれの細菌群（たとえばシュードモナス属の全種
）を特異的に検出する目的で、プライマおよび／またはプローブとして核酸に基
づく方法で使用可能である。

【００３６】本発明に記述された、シュードモナス属の細菌群、特にシュードモナスアエルギノーザ種の細菌を検出するためのＤＮＡ配列は、２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部
位および直接隣接する２３ＳｒＤＮＡの領域に基づく。この部位のＤＮＡ配列は多数の細菌のために同定された。正確な配列比較により、プライマおよび／ま
たはプローブとして種／属に特異的な検出方法に使用するために利用できる病原
菌に特異的な核酸配列が同定された。

【００３７】それぞれの微生物群を検出するために、核酸、好ましくはゲノムＤＮＡが、ま
ず初めに被検標本もしくは細菌培養の中に含まれる細胞から遊離される。次に核
酸ハイブリッド形成を利用して、しかもプローブとして本発明に基づく病原菌に
特異的なオリゴヌクレオチドの導入下で、病原菌に特異的な核酸配列の直接的な
検出が被検査標本の中で行なうことができる。そのために、たとえば‘サザンブ
ロット’または‘ドットブロット’のような、専門家に知られている種々の方法
が適している。

【００３８】しかし、特により感度が高いために、求めているＤＮＡ／ＲＮＡ配列がまず初
めに核酸、好ましくはＰＣＲを増幅するための上述の方法を利用して増幅される
間接的な検出方法が好ましい。

【００３９】上記方法の使用下でのＤＮＡ／ＲＮＡの増幅は、プライマとしての病原菌に特
異的なオリゴヌクレオチドの導入下で行なうことができる。その際検出すべき微
生物のＤＮＡ／ＲＮＡが存在する場合にのみ特異的な増幅体が形成される。プロ
ーブとして病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドの使用下で後続の検出反応によ
り検出方法の特異性を高めることができる。この後続の検出反応のために、同様
に病原菌に非特異的なオリゴヌクレオチドの使用が可能である。

【００４０】選択肢として、１つまたはそれ以上の非特異的なオリゴヌクレオチドの存在中
でも核酸増幅を実施することができるため、その結果、必要がある場合には他の
検出しない微生物のＤＮＡ／ＲＮＡも増幅することができる。このような増幅方
法の１つは、通常特異性が少なく、かつそのためプローブ（群）として１つまた
はそれ以上の病原菌に特異的なオリゴヌクレオチド（群）による後続の検出反応
により保証されなければならない。

【００４１】専門家には、間接的な方法で生ずる増幅生成物を検出することができる種々の
方法が知られている。この方法には、特にゲル電気泳動を利用した可視化、不動
化された反応生成物へのプローブのハイブリッド形成［ナイロンまたは硝酸繊維
素フィルタ（‘サザンブロット’）またはたとえば‘ビーズ’または微量定量プ
レートに結合］および不動化されたプローブへの反応生成物のハイブリッド形成
（たとえば‘逆ドットブロット’またはプローブと結合された‘ビーズ’または
微量定量プレート）が含まれる。

【００４２】病原菌に特異的なオリゴヌクレオチド（たとえばプローブおよびプライマ）が
記述された直接的または間接的な検出方法のために標識もしくは修飾できる多数
の異なる変形態様が記述されている。これらは、たとえば放射性の、着色された
、蛍光性のまたは別様に修飾されたもしくは修飾する群、たとえば抗体、抗原、
酵素もしくは酵素または酵素複合体と親和性のあるその他の物質を含むことがで
きる。プローブもしくはプライマは、自然に存在するかまたは合成で製造された
二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくはたとえばＰＮＡのようなＤ
ＮＡまたはＲＮＡの修飾された形態とすることができる（これらの分子の場合は
糖単位がアミノ酸またはペプチドで交換されている）。プローブまたはプライマ
の個々のまたは複数のヌクレオチドは、類似の構成要素（たとえば標的核酸の中
に自然に存在しないヌクレオチド）に対して置換することができる。上述の間接
的な検出方法では、内部標識増幅体を介しても検出することができる。これは、
たとえば増幅反応中に修飾（たとえばジゴキシゲニンまたはフルオレセイン結合
）されたヌクレオシド三リン酸の取込みを介して行なうことができる。

【００４３】本発明に基づく病原菌に特異的なオリゴヌクレオチドとして適しているのは、
少なくとも１０個の塩基長さの配列で下記の配列１ないし５またはこの配列と相
補的な配列と一致する、好ましくは１０個ないし２５０個および特に１５個ない
し３０個の塩基長さの核酸である。この１０個の塩基長さの配列内のわずかな差
異（１個ないし２個の塩基）は、増幅および／またはハイブリッド形成時にそれ
ぞれ所定の特異性を失わずに可能である。専門家には、このようなわずかな差異
の場合の反応条件がそれに応じて変化させる必要のあることが知られている；た
とえばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング、編集発行Ｇ．Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ＆Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、コールドスプリングハーバーラボラトリ出版、１９８９参照。

【００４４】２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位の領域におけるシュードモナスアエルギノーザ（ＡＴＣＣ１０１４５）の配列は次のとおりである。（配列１＝ＳＥＱＩＤＮＯ１）

【化１】

【００４５】さらに、２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位の領域における配列は、６個の別のシュ
ードモナスアエルギノーザ種の菌株ならびに次の種の少なくともそれぞれ１つの菌株のために同定された：シュードモナスアスプレニ、シュードモナスシト
ロネロシス、シュードモナスコルガータ、シュードモナスフルオレッセンス、
シュードモナスフラギ、シュードモナスメンドシーナ、シュードモナスシュードアルカリゲネス、シュードモナスプチダ、シュードモナススツツェリ、シ
ュードモナスシリンガエ。この配列比較は、複数の、配列１から導かれたオリゴヌクレオチドがシュードモナスアエルギノーザ種の細菌群の選択的な検出に適していることを明らかにした。このような病原菌に特異的なオリゴヌクレオチ
ドに適しているものは部位（１２−１３１）の配列である。

【００４６】配列１から以下のＰＣＲのためのプライマ（配列３および５）として、かつプ
ローブ（配列４）として、特に適したオリゴヌクレオチドが導かれた。

【００４７】オリゴヌクレオチドＰａ１（配列２）は、シュードモナスアエルギノーザＡＴＣＣ１０１４５の２３ＳｒＤＮＡ遺伝子の位置２８２３−２８４２に相当す
る［Ｔｏｓｃｈｋａら（１９８７）、核酸研究１５、７１８２］：

【化２】

【００４８】例１：ポリメラーゼ連鎖反応によるシュードモナスアエルギノーザ種の細菌群の検出第１表に掲載した細菌群の純粋培養から、標準方法を利用してＤＮＡが単離さ
れた。次にこのＤＮＡ組織標本のそれぞれ約１０ないし１００ｎｇがそれぞれ０
．４μＭオリゴヌクレオチドＰａ１およびＰａ２またはＰａ４およびＰａ２、２
００μＭｄＮＴＰ’ｓ（ベーリンガーマンハイム）、４ｍＭＭｇＣｌ_２、１６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、６７ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０
１％トウィーン２０および０．０３Ｕ／μｌＴａｑポリメラーゼ（バイオマスタ）の存在中でＰＣＲの中に取込まれた。ＰＣＲは下記の熱特性を有するパーキ
ン-エルマー９６００（Ｐａ１およびＰａ２）／バイオメトラトリオ-サーモブロック（Ｐａ４およびＰａ２）サーモサイクラーの中で実施された：

【００４９】ａ）オリゴヌクレオチドＰａ１およびＰａ２による増幅 − 初期変性９５℃ ５ｍｉｎ − 第１増幅（１５サイクル）９４℃ ３５ｓｅｃ６８℃ ３０ｓｅｃ７２℃ ３０ｓｅｃ − 第２増幅（２０サイクル）９４℃ ３５ｓｅｃ６４℃ ３０ｓｅｃ７２℃ ３０ｓｅｃ − 最終合成７２℃ ５ｍｉｎ

【００５０】ｂ）オリゴヌクレオチドＰａ４およびＰａ２による増幅 − 初期変性９５℃ ５ｍｉｎ − 増幅（３５サイクル）９５℃ ３０ｓｅｃ６２℃ ３０ｓｅｃ７２℃ ２０ｓｅｃ − 最終合成７２℃ ５ｍｉｎ

【００５１】ＰＣＲ反応の終了後、増幅生成物はアガロース-ゲル電気泳動を利用して分離され、かつ臭化エチジウムで着色することにより可視化された。予期されていた
長さ１９１ｂｐ／１０２ｂｐの生成物は、シュードモナスアエルギノーザ種の菌株のＤＮＡが存在していた場合でのみ観察された（第１表参照）が、テストさ
れた他の細菌のＤＮＡの存在では観察されなかった。この経過の終了後、ゲルの
中に含まれているＤＮＡが標準方法を利用してナイロン-フィルタに転写され、かつ特異性を検査するために５’末端でビオチニル化されたオリゴヌクレオチド
Ｐａ３（配列４）によりハイブリッド形成された。このハイブリッド形成は、５
ｘＳＳＣ、２％阻害試薬、０．１％ラウリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳおよ
び５ｐｍｏｌ／ｍｌプローブにおいて４８℃で４時間行われた。２ｘＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳで２ｘ５ｍｉｎ間室温で、かつ２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１ｘ
１５ｍｉｎ４８℃で洗浄された。検出は標準方法にしたがってアルカリ性のホス
ファターゼ抱合体（エキストラビジン、シグマ社、＃Ｅ-２６３６）を利用して５-臭素-４-塩素-３-リン酸インドリルおよび４-ニトロ-ブルー塩化テトラゾリウム（ベーリンガーマンハイム社）の存在中で行われた。

【００５２】フィルタでは、あらかじめアガロース-ゲル上の帯域でも可視的であった場合のみの帯域が観察された（第１表参照）。それによりＰＣＲを利用してもハイブ
リッド形成を利用してもテストされた８６シュードモナスアエルギノーザの全菌株の存在が検出された。これに対し、テストされたが、これらの種に属してい
ない細菌株のいずれもこの系により検出されなかった。

【００５３】第１表：オリゴヌクレオチドＰａ１／Ｐａ２（ＳＥＱＩＤＮＯ２およびＳＥＱＩＤＮＯ３）およびＰａ４／Ｐａ２（ＳＥＱＩＤＮＯ５およびＳＥＱＩＤＮＯ３）によるＰＣＲ増幅と、それに続くオリゴヌクレオチドＰａ３（ＳＥＱＩＤＮＯ４）によるハイブリッド形成の結果。

【表１】

【００５４】

【表２】

【００５５】

【表３】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月９日（２０００．３．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】検出すべき微生物群のそれぞれの大きさに応じて、かつ区別するべき（検出し
ない）微生物のそれぞれの進展変化の親縁性（類似性）に応じて、所望の特異性
を有するそれぞれ適したＤＮＡ配列を見出すため、差異的なＤＮＡ配列に基づく
検出は非常に広範囲の事前準備を必要とする。ここに記述した発明は、このよう
なＤＮＡ配列に係り、それによりシュードモナス属の細菌群、特にシュードモナ
スアエルギノーザの迅速検出が可能になる。さらに、プローブまたはプライマとして微生物を検出するための、特にシュー
ドモナスアエルギノーザを検出するために使用できる核酸分子であって、１６Ｓ−２３Ｓ遺伝子間の部位から得られるものが知られている（ＷＯ９６／００２
９８およびアクタミクロビオロギカポロニカ、４４（１９９５）１１１−１１
７）。ここでシュードモナスアエルギノーザは他のシュードモナス種からも他の属群の細菌からも区別することができる。また、シュードモナス種ではない細菌のための２３Ｓ−５Ｓ遺伝子間の部位が
成功裡に種および属に特異的な核酸分子を単離するために使用できることが知ら
れている（応用細菌学誌、８０（１９９６）２４４−２５１および欧州特許ＥＰ
０７３９９８８号）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ブラウアー，アンヤドイツ連邦共和国Ｄ−13409 ベルリン、レジデンツシュトラーセ 100 (72)発明者グレーネヴァルト，コルトゥドイツ連邦共和国Ｄ−10555 ベルリン、エルベルフェルダーシュトラーセ 12 (72)発明者ヴィルボーン，フライムートドイツ連邦共和国Ｄ−14057 ベルリン、ヌーカントシュトラーセ９ (72)発明者ロルフス，アルントドイツ連邦共和国Ｄ−18055 ロシュトック、シュレーデルシュトラーセ 39 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 CA01 CA09 CA11 CA20 HA14 4B063 QQ06 QQ41 QQ42 QQ50 QQ52 QR08 QR32 QR39 QR42 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QS35 QX02 4C057 MM04 MM09

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一方で検出すべきシュードモナス属の細菌群に、他方で検出
しない細菌群に属する核酸分子であって、複数の菌株から出発し、（ａ）自体公知の方法で前記細菌群の１つの菌株（第１菌株）からゲノムＤＮＡ
を単離し、（ｂ）自体公知の方法で２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位を必要のある場合に直接隣
接する２３Ｓ領域および／または直接隣接する５Ｓ領域と共に増幅し、かつ増幅
生成物を得（第１増幅生成物）、（ｃ）前記細菌群の第２、第３、．．．．．および／または第ｎ菌株と共にそれ
ぞれ段階（ａ）および（ｂ）に従ってゲノムＤＮＡを単離し、２３Ｓ／５Ｓ遺伝
子間の部位が必要のある場合に直接隣接する２３Ｓ領域および／または直接隣接
する５Ｓ領域と共に増幅し、かつ増幅生成物を得（第２、第３、．．．．．第ｎ
増幅生成物）、（ｄ）自体公知の方法で（ｂ）および（ｃ）に従って得られた増幅生成物のＤＮ
Ａ配列を同定し、かつ（ｂ）に基づく増幅生成物のＤＮＡ配列を（ｃ）に基づく
１つまたはそれ以上の増幅生成物のＤＮＡ配列と比較し、そして（ｅ）プライマとしてまたはプローブとして核酸分子が自体公知の方法で得、そ
れを利用して検出すべきシュードモナス属の細菌群を核酸分子の配列領域内の少
なくとも１つのヌクレオチド位置における違いを利用して検出しない細菌群から
区別することにより取得できる、前記核酸分子。
【請求項２】一方で検出すべきシュードモナス属の細菌群に、他方でシュ
ードモナスとして検出しない他の属の細菌群（他の属群）に属する、菌株から出
発することにより取得できる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】検出すべきおよび検出しないシュードモナス属の細菌群の１
つに属する核酸分子であって、複数の菌株から出発し、（ａ）自体公知の方法でこれらの群の１つのシュードモナス菌株（第１菌株）か
らゲノムＤＮＡを単離し、（ｂ）自体公知の方法で２３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位が必要のある場合に直接隣
接する２３Ｓ領域および／または直接隣接する５Ｓ領域と共に増幅し、かつ増幅
生成物を得（第１増幅生成物）、（ｃ）これらの群の第２、第３、．．．．．および／または第ｎシュードモナス
菌株と共にそれぞれ段階（ａ）および（ｂ）に従ってゲノムＤＮＡを単離し、２
３Ｓ／５Ｓ遺伝子間の部位が直接隣接する２３Ｓ領域および／または直接隣接す
る５Ｓ領域と共に増幅し、かつ増幅生成物を得（第２、第３、．．．．．第ｎ増
幅生成物）、（ｄ）自体公知の方法で（ｂ）および（ｃ）に従って得られた増幅生成物のＤＮ
Ａ配列を同定し、かつ（ｂ）に基づく増幅生成物のＤＮＡ配列を（ｃ）に基づく
１つまたはそれ以上の増幅生成物のＤＮＡ配列と比較し、かつ（ｅ）プライマとしてまたはプローブとして核酸分子を自体公知の方法で得、そ
れを利用して検出すべきシュードモナス属の細菌群が核酸分子の配列領域内の少
なくとも１つのヌクレオチド位置における違いを利用して検出しないシュードモ
ナス属の細菌群から区別することにより取得できる、前記核酸分子。
【請求項４】検出すべきシュードモナスアエルギノーザ種の細菌群と、検出しない他の種の細菌群とに属する、菌株から出発することにより取得できる
、請求項１または３に記載の核酸分子。
【請求項５】ＳＥＱＩＤＮＯ１またはそれと相補的な配列の請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６】請求項５に記載の核酸分子よりも短縮された配列であって、
しかも前記領域またはヌクレオチド位置１２ないし１３１の領域内の配列を有す
る核酸分子。
【請求項７】請求項５に記載の核酸分子よりも短縮された配列、すなわち（i）ＳＥＱＩＤＮＯ３、または（ii）ＳＥＱＩＤＮＯ４、または（iii）ＳＥＱＩＤＮＯ５、または（iv）（i）、（ii）および（iii）とそれぞれ相補的な配列を有する核酸分子。
【請求項８】ＳＥＱＩＤＮＯ２またはそれと相補的な配列の核酸分子。
【請求項９】核酸分子の配列に関し少なくとも１０個連続する該核酸分子
ヌクレオチド鎖のヌクレオチドにおいて（i）請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子と同一であり、または（ii）連続するヌクレオチド１０個のうち９個で請求項１〜８のいずれかに記載
の核酸分子と一致し、または（iii）連続するヌクレオチド１０個のうち８個で請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子と一致し、または（iv）少なくとも９０％以上が請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子と同族
であることを特徴とする、核酸分子。
【請求項１０】核酸分子が１０個ないし２５０個および好ましくは１５個
ないし３０個のヌクレオチド長さであることを特徴とする、請求項９に記載の核
酸分子。
【請求項１１】核酸分子が一本鎖または二本鎖で存在することを特徴とす
る、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１２】核酸分子が（i）ＤＮＡとして、または（ii）（i）に相当するＲＮＡとして、または（iii）ＰＮＡとして存在し、その際この核酸分子が必要のある場合に分析的な検出方法のために、特にハイ
ブリッド形成および／または増幅に基づき、自体公知の方法で修飾されることを
特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項１３】少なくとも１０個連続する核酸分子ヌクレオチド鎖のヌク
レオチドのうちヌクレオチドの２０％まで、特に１個または２個のヌクレオチド
が、プローブおよび／またはプライマのために自体公知の類似の構成要素、特に
細菌において自然に存在しないヌクレオチドと置換されることにより核酸分子が
修飾されることを特徴とする、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】核酸分子が分析的な検出方法のために自体公知の方法で、
特に抗体、抗原、酵素および／または酵素もしくは酵素複合体と親和性のある物
質を利用して、１つまたはそれ以上の放射性群、着色群、蛍光群、固相へ不動化
するための群および／または間接的もしくは直接的な反応、特に酵素反応のため
の群、および／または別様に修飾するもしくは修飾された核酸類似構造の群を有
することにより、またはこれらを追加することにより核酸分子が修飾もしくは標
識されることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】特にシュードモナス属の細菌群を検出するための、通性助
剤の存在中でおよび分析的検出方法のためのキットの形態における請求項１〜１
４のいずれかに記載の、１つまたはそれ以上の核酸分子。
【請求項１６】シュードモナス属の細菌群に属し、細菌の存在または非在
を検出するための、請求項１〜１４のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の核
酸分子または請求項１５に記載のキットの形態における使用。
【請求項１７】シュードモナス属の細菌群がシュードモナスアエルギノーザの種々の菌株を含み、またはこれらの菌株により形成されることを特徴とす
る、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】シュードモナス属の細菌群が専らシュードモナスアエルギノーザの菌株であることを特徴とする、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】核酸ハイブリッド形成および／または核酸増幅が実施され
ることを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれかに記載の使用。
【請求項２０】ポリメラーゼ連鎖反応が核酸増幅として実施されることを
特徴とする、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】検出すべき細菌がゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの区
別を利用し、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸分子の領域内の少なくとも
１つのヌクレオチド位置で検出しない細菌から区別されることにより検出が実施
されることを特徴とする、請求項１６〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】請求項５に記載の核酸分子の領域内における区別を利用し
て区別することを特徴とする、請求項２１に記載の使用。