JP2001513504A - 細胞増殖および細胞死を調節する組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、多細胞器官における細胞増殖および細胞死を調節するのに有用な化合物および方法に関する。本発明は、詳しくはバクテリアＤＮＡ（Ｂ-ＤＮＡ）および第１の薬学的に受容できるキャリアを含む化合物に関し、ここで前記Ｂ-ＤＮＡは、動物の応答細胞における応答を誘導する。本発明は、より詳しくはミコバクテリアＤＮＡ（Ｍ-ＤＮＡ）および第１の薬学的に受容できるキャリアを含む化合物に関し、ここで前記Ｍ-ＤＮＡは動物の応答細胞の増殖を阻害し、動物の応答細胞におけるアポトーシスを誘導し、生理活性分子を産生する、動物の免疫系の応答細胞を刺激する。Ｍ-ＤＮＡ化合物の作成方法、およびＭ-ＤＮＡ化合物の使用方法もまた、開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 〔発明の分野〕 本発明は、ミコバクテリアDNA（B-DNA）および第１の薬学的に受容されるキャ
リアを含有する組成物に関し、B-DNAは、動物の応答細胞における応答を誘導す るにおいて有効である。特に、本発明は、Mycobacterium phlei-DNA（M-DNA）お
よび第１の薬学的に受容されるキャリアを含有する組成物に関し、M-DNAは、応 答細胞の増殖を阻害し、応答細胞においてアポトーシスを誘導し、免疫系の応答
細胞を刺激して生体分子を産生する。M-DNAを調製する方法、およびM-DNAを使用
する方法も開示される。

【０００２】 〔発明の背景〕 多細胞生物体において、組織中の細胞の数は、細胞増殖の速度から細胞排除の
速度を引くことによって決定される。アポトーシスは、組織（成体組織を含むが
これに制限されない）における細胞死の、遺伝的にプログラムされ、非炎症性で
あり、エネルギー依存性の形態である。アポトーシスは、４つの連続的な工程：
（１）細胞外または細胞内誘発による致死、（２）細胞内プロテアーゼおよびヌ
クレアーゼの活性化による細胞死、（３）他の細胞による死細胞の包み込み、お
よび（４）食脂肪のリソソーム内での死細胞の分解、からなる（Steller H. Sci
ence 267：1445-1449、1995）。細胞増殖、細胞アポトーシス、またはこれら２ つの組み合わせの調節における異常は、多様な疾患（ガン、神経変性、自己免疫
、および心臓疾患を含むがこれらに制限されない）の病因と関連する。

【０００３】 アポトーシスは、細胞表面レセプター（Fas（CD95）（Frenchら、Journal of
Cell Biology 133：355-364、1996）、および腫瘍壊死因子レセプター１（TNFR1
）を含むがこれらに制限されない）に結合するリガンドによって開始され得る。
FasへのFasL結合およびTNFR1へのTNFの結合は、細胞内シグナル伝達を開始して 、アポトーシス実行の致死的なタンパク質分解性のカスケードを開始するシステ
インアスパルチルプロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化を生じ、これは、核DNA フラグメント化、核マトリクスタンパク質（NuMA）の放出、および細胞基質接触
の喪失と関連する（Muzioら、Cell 85：817-827、1996）。

【０００４】 アポトーシスはまた、細胞内タンパク質（p53/p21レギュレーターを含むがこ れに制限されない）によって誘導され得る（Levine, A. Cell 88：323-331、199
7）。p53/p21は、転写因子として作用して、アポトーシスを媒介する遺伝子の発
現を活性化する。この遺伝子としては、限定されるものではないが、フリーラジ
カルを生成するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、次いでこのフリーラ
ジカルは細胞のミトコンドリアを損傷して、その内容物が細胞質に漏出し、アポ
トーシスカスパーゼを活性化する（Polyakら、Nature 389：300-305、1997）。

【０００５】 ガンは、非定型性の細胞の異常な網蓄積であり、これは、過剰の増殖、不十分
なアポトーシス、またはこれらの組合せから生じる。アポトーシス関連性の遺伝
子（例えば、Fas、TNFR1、およびp53/P21を含むがこれらに制限されない）にお ける変異は、ぞれぞれ、ガンの病因に関連してきた（Levine A. Cell 88：323-3
31、1997；Fisher D. Cell 78：529-542、1994）。アポトーシスは、ガンの病因
に対して重要であるだけでなく、抗ガン治療に対するそれらの耐性の尤度に対し
てもまた重要である。

【０００６】 アポトーシス誘導に対する耐性は、多剤耐性（MDR）の重要なカテゴリーとし て現わされ、治療の失敗の有意な割合を説明するようである。MDR、構造的およ び機能的に関連性のない化学療法剤に対する同時の耐性は、遺伝性および後天性
の両方であり得る。すなわち、あるガンは、治療に全く応答しないのに対し、他
のガンは、最初は、治療に対して感受性であり、薬物耐性を発揮する。化学療法
剤は、それらの治療効果について、ガン細胞におけるアポトーシスの誘導に主に
依存するので、化学療法剤の有効性を減少する薬物耐性は、直接的にまたは間接
的に、減少されたアポトーシスを導き、そして多様なガンにおける不十分な予後
と一般に関連する。

【０００７】 細胞溶解は、細胞の完全なまたは部分的な破壊であり、免疫系によって媒介さ
れる。本明細書中で使用されるように、単細胞、マクロファージ、および白血球
は、免疫系に含まれる。活性化されたマクロファージおよび単細胞は、動物の応
答細胞における応答を、加速、増幅、および調製する生体活性分子を生成する。
産生によって、合成および分泌が意味される。これらの生体活性分子としては、
サイトカインおよび反応性酸素種が挙げられるが、これらに制限されない。

【０００８】 サイトカインとしては、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-6（
IL-6）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-12（IL-12）、およ
びGM-CSFが挙げられるが、これらに制限されない。IL-12は、単独でおよび他の サイトカインと組合わせて、白血球（B-リンパ球、CD4+ Ｔ細胞、CD8+ Ｔ細胞、
NK細胞を含むがこれらに制限されない）の成熟を促進し、そして、インターフェ
ロン-γの分泌を誘導する。IL-12は、いくつかのガン細胞において抗ガン活性を
有することが報告される（Stineら、Annals NY Academy of Science 795：420-4
21、1996：Chenら、Journal of Immunology 159：351-359、1997）。この活性と
しては、特異的な細胞溶解性のT-リンパ球の活性化、ナチュラルキラー（NK）細
胞の活性化、ならびに抗脈管形成タンパク質IP-10およびMiGの誘導が挙げられる
が、これらに制限されない。IP-10は、ガン増殖および転移を阻害し、ガン誘導 性の新生血管形成を阻害し、そしてさらにNK細胞を活性化する（Angilloら、Ann
als NY Academy of Sciences 795：158-165、1996）。GM-CSFは、いくつかのガ ン細胞において、ガン後の活性を有することが報告される（Hawkyardら、Journa
l of Urology 150：514-518、1993）。

【０００９】 反応性酸素種としては、一酸化窒素、スーパーオキシドラジカル、およびヒド
ロキシルラジカルが挙げられるが、これらに制限されない。活性体の中でも特に
、一酸化窒素、スーパーオキシドラジカル、およびヒドロキシルラジカルが、応
答標的細胞においてアポトーシスおよび細胞溶解を誘導する。

【００１０】 生物学的および化学的起源の天然調製物および合成調製物（バクテリアからの
調製物を含むがこれに制限されない）は、動物において応答細胞を刺激するため
にまたは阻害するために使用されてきた。ミコバクテリウム（mycobacterium） 種からの細胞壁の調製物は、疾患（ガンを含むがこれに制限されない）を治療す
るために使用されてきた（米国特許第4,503,048号）。しかし、このような調製 物を使用して得られる治療学的恩恵は様々で、一定ではなく、調製物の調製、精
製、および供給方法に、ならびに調製物の安定性に依存するようである。

【００１１】 先行技術の抗ガン剤は、臨床学的な適用について十分であるとはいえないこと
が証明されている。これらの薬剤の多くは、無効果であるか（Bischoffら、Scie
nce 274：373-376、1996）、毒性であり、有意な副作用を有し（Lammら、Journa
l of Urology 153：1444-1450、1995）、薬物耐性または免疫感作を生じさせ、 そしてレシピエントを衰弱させる。さらに、これらの薬剤の多くは、それらの有
効性について、Fas、TNFR1、またはp53/p21に依存する。

【００１２】 それゆえ、ガン細胞の増殖を阻害し、かつガン細胞においてアポトーシスを誘
導する、ならびに免疫系の応答細胞を刺激してサイトカインおよび反応性酸素種
を産生する、新規な治療学的薬剤の必要性がある。この治療学的薬剤は、抗ガン
剤として、および他の抗ガン剤に対する補助薬として有用であるべきである。補
助薬とは、他の抗ガン剤とともに用いられ、治療効果を増加するために有用であ
ることを意味する。さらに、このような治療学的薬剤は、調製するのに簡便かつ
比較的安価であるべきであり、その活性は、調整物間で再生可能かつ経時的に安
定でなければならず、そしてガン細胞に対するその効果は、最少の毒性を伴う用
量レジメを用いて達成可能であるべきである。

【００１３】 〔発明の要旨〕 本発明は、ミコバクテリアDNA（B-DNA）および第１の薬学的に受容されるキャ
リアを含有する治療学的組成物を提供することによって上述の必要性を満たし、
当該組成物は、動物の応答細胞において応答を誘導するのに効果的である。特に
、本発明は、Mycobacterium phlei-DNA（M-DNA）および第１の薬学的に受容され
るキャリアを含有する治療学的組成物を提供し、応答としては、応答細胞（ガン
細胞を含むがこれらに制限されない）の増殖の阻害、および応答細胞（ガン細胞
を含むがこれらに制限されない）におけるアポトーシスの誘導、および免疫系の
応答細胞の刺激による生体活性分子の産生が挙げられるが、これらに制限されな
い。

【００１４】 M-DNA組成物は、調製するのに簡便かつ比較的安価であり、その活性は調製物 間で再生可能、かつ経時的に安定なままであり、そしてこの組成物は、最少の毒
性を伴う用量レジメで有効である。

【００１５】 M-DNAは、リゾチーム、プロティナーゼＫ、およびドデシル硫酸ナトリウムで の消化、ならびにフェノール抽出およびエタノール沈澱により、無傷のMycobact
erium phlei（M.phlei）から調製される（M.phlei-DNA）。あるいは、M-DNAは、
M.phleiを破壊し、固体成分を回収し、そしてM-DNA-M.phleiの細胞壁複合体（MC
C）を調製することによって、調製される。DNase非含有試薬が、調製の間のM-DN
A分解を最小化するために使用される。M-DNAは、フェノール抽出およびエタノー
ル沈澱によって、MCCから調製される（MCC-DNA）。

【００１６】 M-DNAおよび第１の薬学的に受容されるキャリアを含有するM-DNA組成物は、応
答細胞の増殖を阻害し、応答細胞においてアポトーシスを誘導し、および免疫系
の応答細胞を刺激して生体活性分子を産生するのに十分な投薬量で、動物に投与
される。このような第１の薬学的に受容されるキャリアとしては、液体キャリア
、固体キャリア、およびその両方が挙げられるが、これらに制限されない。液体
キャリアとしては、水性キャリア、非水性キャリア、またはその両方が挙げられ
るが、これらに制限されない。固体キャリアとしては、化学的に合成されたキャ
リアおよび天然のキャリアが挙げられるが、これらに制限されない。水性のキャ
リアとしては、水、生理食塩水、および生理学的な緩衝液が挙げられるが、これ
らに制限されない。非水性キャリアとしては、油または他の疎水性液体の処方物
、およびリポソームが挙げられるがこれらに制限されない。天然のキャリアとし
ては、脱タンパク質化され、脱脂質化され、洗浄された、M.phleiの細胞壁が挙 げられ、M-DNAは、M.phleiの細胞壁と複合体化される（MCC）が、これらに制限 されない。

【００１７】 さらに、M-DNA組成物は、第２の薬学的に受容されるキャリア中で投与され得 る。このような第２の薬学的に受容されるキャリアとしては、液体キャリアおよ
び固体キャリアが挙げられるが、これらに制限されない。さらに、液体キャリア
としては、水性キャリア、非水性キャリア、またはその両方が挙げられる。さら
に、固体キャリアとしては、化学的に合成されたキャリアおよび天然のキャリア
が挙げられる。

【００１８】 本発明のM-DNA組成物は、疾患を防止、治療、および排除するために有用であ る。本発明の組成物は、ガンのような望ましくないが制御されない細胞増殖によ
って媒介される疾患を治療するために特に有用である。M-DNA組成物はまた、他 の抗ガン剤の有効性を増強するための補助薬として有効である。このような薬剤
としては、薬物、免疫刺激剤、抗原、抗体、ワクチン、放射線、ならびに化学療
法的に、遺伝学的に、生物学的に操作された、および化学的に合成された薬剤、
ならびに活性化のためにまたは不活性化のために細胞死分子を標的する薬剤で、
応答細胞の増殖を阻害する、および応答細胞におけるアポトーシスを誘導する薬
剤が挙げられるが、これらに制限されない。

【００１９】 従って、本発明の目的は、動物の応答細胞において治療学的応答を誘導する組
成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、応答細胞の増殖を阻害する組成物および方法を提供する
ことである。 本発明の別の目的は、応答細胞においてアポトーシスを誘導する組成物および
方法を提供することである。 本発明の別の目的は、Fasに依存しないアポトーシスを誘導する組成物および 方法を提供することである。 本発明の別の目的は、TNFR1に依存しないアポトーシスを誘導する組成物およ び方法を提供することである。 本発明の別の目的は、p53/p21に依存しないアポトーシスを誘導する組成物お よび方法を提供することである。 本発明の別の目的は、薬物耐性に依存しないアポトーシスを誘導する組成物お
よび方法を提供することである。

【００２０】 本発明の別の目的は、応答細胞においてカスパーゼ活性を誘導する組成物およ
び方法を提供することである。 本発明の別の目的は、免疫系の応答細胞において応答を誘導して生体活性分子
を産生する組成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、免疫系の応答細胞を、生体活性分子を産生するように誘
導する組成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、免疫系の応答細胞を、サイトカインを産生するように誘
導する組成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、免疫系の応答細胞を、IL-6を産生するように誘導する組
成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、免疫系の応答細胞を、IL-10を産生するように誘導する 組成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、免疫系の応答細胞を、IL-12を産生するように誘導する 組成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、免疫系の応答細胞を、反応性の酸素種を産生するように
誘導する組成物および方法を提供することである。

【００２１】 本発明の別の目的は、動物においてガンを防止するのに有効である組成物およ
び方法を提供することである。 本発明の別の目的は、動物においてガンを治療するのに有効である組成物およ
び方法を提供することである。 本発明の別の目的は、動物においてガンを除去するのに有効である組成物およ
び方法を提供することである。

【００２２】 本発明の別の目的は、他の抗ガン治療剤に対する補助薬として有効である組成
物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、化学的な抗ガン剤に対する補助薬として有効である組成
物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、生物学的な抗ガン剤に対する補助薬として有効である組
成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、生物学的に操作された抗ガン剤に対する補助薬として有
効である組成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、抗ガンワクチンに対する補助薬として有効である組成物
および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、核酸ベースの抗ガンワクチンに対する補助薬として有効
である組成物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、放射療法に対する補助薬として有効である組成物および
方法を提供することである。

【００２３】 本発明の別の目的は、不完全に分化された細胞の最終的な分化を誘導する組成
物および方法を提供することである。 本発明の別の目的は、大量に調製され得る組成物を提供することである。 本発明の別の目的は、比較的安価に調製され得る組成物を提供することである
。 本発明の別の目的は、調製物間で再生可能な活性を有する組成物を提供するこ
とである。 本発明の別の目的は、経時的に安定なままである組成物を提供することである
。 本発明の別の目的は、経時的にその有効性を維持する組成物を提供することで
ある。 本発明の別の目的は、レシピエントに対して最小に毒性である組成物を提供す
ることである。 本発明の別の目的は、レシピエントにおいてアナフィラキシーを引き起こさな
い組成物を提供することである。 本発明の別の目的は、ツベルクリン皮膚試験に対して受容者を感作しない組成
物を提供することである。 本発明の、これらのおよび他の目的、特徴、および利点は、開示される実施態
様の以下の詳細な説明および添付の請求の範囲を参照した後に明らかになる。

【００２４】 〔発明の詳細な説明〕 本発明は、バクテリアデオキシリボ核酸（DNA）および第１の薬学的に受容さ れるキャリアを含有する治療学的組成物に関し、該組成物は、ヒトを含む動物の
応答細胞において応答を誘導するのに有効である。より詳細には、本発明は、ミ
コバクテリアDNA（B-DNA）および第１の薬学的に受容されるキャリアを含有する
組成物に関し、該組成物は、動物の応答細胞において応答を誘導するのに有効で
ある。最も詳細には、本発明は、M.phlei-DNA（M-DNA）および第１の薬学的に受
容されるキャリアを含有する組成物に関し、組成物は、応答細胞の増殖を阻害し
、応答細胞においてアポトーシスを誘導し、および免疫系の応答細胞を刺激して
生体活性分子を産生することにおいて、有効である。

【００２５】 本発明のM-DNA組成物は、調製するのに簡便で、比較的安価であり、その活性 は、調製物間で再現性があり、経時的に安定なままである。さらに、これは、レ
シピエントに対してあっても最少の毒性であり、レシピエントにおいて陽性のツ
ベルクリン反応を引き起こさず、および投与が反復されてもレシピエントにおい
てアナフィラキシー性の応答をほとんど引き起こさない。

【００２６】 多くのバクテリア種が、本発明を実施するために使用され得、これらのバクテ
リアとしては、コリネフォーム（Coryneform）バクテリア、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）種、ロドコッカス（Rhodococcus）種、ユーバクテリウム（
Eubacterium）種、ボルデテラ（Bordetella）種、エッシェリヒア（Escherichia
）種、リステリア（Listeria）種、ノカルジア（Nocardia）種、およびミコバク
テリウム種が挙げられるが、これらに制限されない。好ましくは、バクテリアDN
Aは、ミコバクテリウム種から調製され、M.phlei、M.smegmatis、M.fortuitum、
M.kansaasii、M.tuberculosis、M.bovis、M.vacciae、およびM.aviumが挙げられ
るが、これらに制限されない。最も好ましくは、ミコバクテリアDNAは、ミコバ クテリウム種のM.phleiから調製される。

【００２７】 M-DNAの治療学的活性を増加するための方法としては、同じもしくは異なるバ クテリア種に由来するDNAの刺激配列もしくはコンファメーションを、化学的に 補充すること、生物工学的に増幅すること、または同じもしくは異なるバクテリ
ア種に由来するDNAの適切な刺激配列もしくはコンファメーションを含むバクテ リアプラスミドを使用することが挙げられるが、これらに制限されない。M-DNA の治療学的活性を増加するための他の方法としては、M-DNAを、合成のもしくは 生物学的なキャリアに複合体化すること、またはM-DNAを、組織型もしくは細胞 型指向性のリガンドもしくは抗体に結合することが挙げられるが、これらに制限
されない。

【００２８】 M-DNAは、第１の薬学的に受容されるキャリア中に提供され、これは、M-DNAと
そのキャリアとを会合させることによって調製され得る。好ましくは、M-DNA組 成物は、液体キャリア、固体キャリア、またはその両方と、M-DNAとを、均一に および親和的に会合させることによって調製される。液体キャリアとしては、水
性キャリア、非水性キャリア、またはその両方が挙げられるが、これらに制限さ
れない。固体キャリアとしては、化学的に合成されたキャリア、および天然のキ
ャリアが挙げられるが、これらに制限されない。

【００２９】 水性キャリアにおける投与のために、混合、超音波処理、および精密流動化を
含むがこれらに制限されない技術によって、M-DNAは、水中に、生理食塩水中に 、または薬学的に受容される緩衝液中に、懸濁される。

【００３０】 非水性キャリアにおける投与のために、M-DNAは、ジグリセリド、トリグリセ リド、リン脂質、脂質、油、およびそれらの混合物を含むこれらに制限されない
中性油で、乳化され、油は、多価不飽和性のまたは飽和性の脂肪酸の適切な混合
物を含む。例としては、ダイズ油、アブラナ油、ヤシ油、オリーブ油、およびミ
グリオール（myglyol）が挙げられるがこれらに制限されず、脂肪酸炭素の数は 、12と22との間であり、脂肪酸は、飽和され得るか、不飽和であり得る。必要に
応じて、荷電された脂質またはリン脂質が、中性油中に懸濁され得る。

【００３１】 天然のキャリア（例えば、MCCを含むがこれに制限されない）における投与に ついて、M-DNAは、MCCの調製の間、M.phleiの細胞壁上で保持され、そして複合 体化される。MCCにおいて、M-DNAの量は、処理されていないM.phlei細胞中のM-D
NAの量に比例して富化され、そしてM-DNAは、処理されていないM.phlei細胞内の
M-DNAよりも、応答細胞により関係することができる。M-DNAの使用について開示
される方法がまた、MCCについて使用され得ることが理解される。

【００３２】 M-DNAおよび第１の薬学的に受容されるキャリアを含有するM-DNA組成物は、さ
らに、第２の薬学的に受容されるキャリアにおいて投与され得る。M-DNA組成物 および第２の薬学的に受容されるキャリア処方物は、液体キャリア、固体キャリ
ア、またはその両方と、M-DNA組成物とを、均一におよび親和的に会合させるこ とによって調製され得る。液体キャリアとしては、水性キャリア、非水性キャリ
ア、またはその両方が挙げられるが、これらに制限されない。固体キャリアとし
ては、化学的に合成されたキャリア、および天然のキャリアが挙げられるが、こ
れらに制限されない。

【００３３】 M-DNAおよびM-DNA組成物は、オイルエマルジョン、オイル中水エマルジョン、
または水中オイル中水エマルジョンとして投与され得る。さらに、これらは、キ
ャリア（リポソーム、部位特異的エマルジョン、長期持続性エマルジョン、粘着
性エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、マイクロパーティ
クル、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノパーティクル、およびミニポンプを
含むがこれらに制限されない）中で投与され得、M-DNAの持続的放出を許容する 種々の天然のまたは合成のポリマー、ミニポンプ、またはポリマーは、薬物供給
が必要とされる近傍において移植される。ポリマーおよびそれらの使用は、例え
ば、Bremら（Journal of Neurosurgery 74：441-446、1991）において記載され る。さらに、M-DNAおよびM-DNA組成物は、応答細胞にM-DNAを提示するために使 用される第１の薬学的に受容されるキャリアまたは第２の薬学的に受容されるキ
ャリアに関わらず、賦形剤の任意の１つ、全て、または任意の組合せとともに使
用され得る。これらの賦形剤としては、抗酸化剤、緩衝液、および静菌を含むが
これらに制限されず、ならびに懸濁化剤および濃化剤を含み得る。

【００３４】 以下の仮説に束縛されることを望まないが、M-DNAの治療学的効果としては、 応答細胞のアポトーシスを生じる細胞内シグナル伝達の開始、ならびに細胞溶解
および応答細胞のアポトーシスを生じる、サイトカインおよび反応性酸素種の産
生の刺激が挙げられるが、これらに制限されないと考えられる。アポトーシスお
よび細胞溶解は、個別でも組合わせても、抗ガン活性および補助薬活性の両方を
有する。すなわち、本発明のM-DNA組成物は、抗ガン剤として単独で使用され得 るか、または治療効果を増加するために、別の抗ガン剤の前に、同時に、または
後に使用され得る。

【００３５】 M-DNA組成物は、治療学的応答を誘導するのに有効な量で投与される。投与さ れるM-DNAの投薬量は、処置される条件、特定の処方物、他の臨床学的因子（例 えば、レシピエントの体重および状態、ならびに投与の経路）に依存する。好ま
しくは、投与されるM-DNAの量は、用量あたり約0.00001mg/kg〜約100mg/kgであ り、より好ましくは、用量あたり約0.0001mg/kg〜約50mg/kgであり、および最も
好ましくは、用量あたり約0.001mg/kgから約10mg/kgである。

【００３６】 M-DNAが、MCCとして、投与される場合、好ましくはMCCのDNA成分は、約0.001m
g DNA/100mg乾燥MCCと約90mg DNA/100mg乾燥MCCとの間であり、より好ましくは 、約0.01 DNA/100mg乾燥MCCと約40mg DNA/100mg 乾燥MCCとの間であり、最も好 ましくは、約0.1mg DNA/100mg 乾燥MCCと約30mg DNA/100mg乾燥MCCとの間である
。また、M.phleiの細胞壁のタンパク質の含量は、約２mg/100mg乾燥MCC未満であ
り、および脂肪酸の含量は、約２mg/100mg乾燥MCC未満であることが好ましい。

【００３７】 さらに、M-DNAが、MCCとして投与される場合、MCCの量は、好ましくは、用量 あたり約0.00001mg/kg〜約100mg/kgであり、より好ましくは、用量あたり約0.00
01mg/kg〜約50mg/kg MCCであり、および最も好ましくは、用量あたり約0.001mg/
kgから約10mg/kg MCCである。

【００３８】 投与の経路としては、経口、局所、皮下、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮内、包
膜内、損傷内、腫瘍内、膀胱内、膣内、眼内、直腸内、肺内、脊髄内、経皮、皮
下、身体の腔内の配置、経鼻吸入、肺吸入、皮膚への陥入、およびエレクトロコ
ーポレーションが挙げられるが、これらに制限されない。

【００３９】 投与の経路に依存するが、用量あたりの容量は、好ましくは、用量あたり約0.
001ml〜約100mlであり、より好ましくは、用量あたり0.01ml〜約50mlであり、お
よび最も好ましくは、用量あたり約0.1ml〜約30mlである。M-DNA組成物は、処置
されるガン、レシピエントの状態、および投与の経路に適切な、あるスケジュー
ルに対して、および期間にわたって、単回の用量で、および複数用量の治療で投
与され得る。

【００４０】 M-DNAの投与は、免疫化プロセスではないが、ガンを含むがこれに制限されな い疾患を、防止、治療、または排除する治療学的処置である。このようなガンと
しては、偏平上皮細胞ガン腫、線維肉腫、サルコイド肉腫、黒色腫、乳ガン、肺
ガン、直腸結腸ガン、腎臓ガン、骨肉腫、皮膚黒色腫、基底細胞ガン腫、膵臓ガ
ン、膀胱ガン、卵巣ガン、白血病、リンパ腫、およびそれらに由来する転移が挙
げられるが、これらに制限されない。

【００４１】 MCCは、M-DNA塩基対の長さを減少する超音波処理およびオートクレーブ後に、
ならびに回文構造のオリゴヌクレオチド配列の、プリン−プリン−C-G-ピリミジ
ン-ピリミジンの活性を回避するGpCメチル化後に、その有効性を保持する。

【００４２】 さらに、種々のガン細胞株（Fas異常、p52/p21異常、および薬物耐性のガン細
胞株を含むが、これらに制限されない）においてアポトーシスを誘導する、M-DN
Aの予期されない驚くべき能力は、医薬の分野において、長い間探求され、未だ 果たされていない必要性に向けられ、そしてヒトを含む動物に対して重要な利益
を提供する。

【００４３】 以下の実施例は、本発明をさらに説明するために役立つが、同時に、本発明の
制限をなすものではない。それとは反対に、手段は、種々の他の実施態様、改変
、およびその等価物を有し得ることが、明らかに理解されるべきである。それら
は、本明細書の記載を読んだ後に、本発明の精神および／または添付の請求の範
囲から逸脱することなく、当業者に示唆され得る。

【００４４】 〔実施例１〕 Mycobacterium phleiからのMCCの調製 MCCを、Mycobacterium phlei（110系統）から調製した。M.phleiを、Institut
fur Experimental Biologie and Medizin、Borstel、Germanyから得、そして-6
0℃にて滅菌乳汁中の懸濁液として保存した。M.phleiを、Petragnani培地（Difc
o Labs、Detroit、MI）上で培養し、そして10〜20日間、Bacto ACブロス（Difco
Labs）中で増殖した。細胞を、遠心分離沈降化によって採集した。以下の手順 において使用した全ての試薬を、M.phlei DNAの保存を増強するために選択した 。

【００４５】 約400グラムの湿性細胞集団を、約1200mlの容積を備える、オートクレーブし たブレンダーに置いた。細胞集団を、30秒から60秒の間、高スピードで混合した
。混合後、６mlのDNase非含有のTween80（Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO）
および200mlと400mlとの間のオートクレーブした水を、細胞混合物に添加した。
全細胞懸濁液を、約10秒間、低スピードで、ブレンダー中で再度混合した。

【００４６】 細胞分散を、超音波処理によって達成した。500mlの細胞懸濁液を（ここでは 、細胞が容量の50%〜70%を構成した）、１リットルのオートクレーブしたビーカ
ーに置き、そして超音波処理した。超音波処理物を、分画プロセスの間、氷上で
オートクレーブしたフラスコ中に保存した。破壊されなかった細胞を、低スピー
ドの遠心分離によって除去した。低スピードの遠心分離からの上清を、１時間、
27,500gで、15℃にて遠心分離し、そしてこの遠心分離からの上清を捨てた。

【００４７】 27,000g遠心分離からの沈殿物を、オートクレーブしたブレンダーに移し、そ してオートクレーブした脱イオン化水中で、低スピードで混合することによって
縣濁した。この懸濁液を、27,000gで、15℃にて、１時間、再度遠心分離し、そ して上清を、再度捨てた。沈殿物を、オートクレーブした脱イオン化水中に懸濁
し、そして５分間、350gでスピンして、残存する破壊されていない任意の細胞を
沈降した。上清を捨て、そして27,000gで１時間、15℃で遠心分離して、粗細胞 壁画分を沈殿させた。

【００４８】 粗細胞壁画分を、タンパク質分解酵素での消化によって脱タンパク質化し、注
意を払ってDNase非含有試薬を使用し、調製物中のDNAの量を最適化すること、お
よび調製物中でのDNAの構造を保存することを可能にした。約400gの全細胞に由 来する粗細胞壁画分を、１リットルの0.05M DNase非含有 Tris-HCl、pH7.5中に 、低スピードで混合することによって懸濁した。粗細胞壁画分を完全に懸濁した
後、50mgのDNase非含有トリプシン（Sigma Chemical Co）を添加し、そして35℃
で、６時間、懸濁液を磁性攪拌バーを使用して攪拌した。トリプシン処理後、50
mgのDNase非含有プロナーゼ（pronase）（Amersham Canada Limited、Oakville 、Ontario）を、トリプシン処理した粗細胞壁懸濁液の各リットルに添加した。 懸濁液を、磁性攪拌バーを使用して、12〜18時間、35℃で、攪拌した。

【００４９】 タンパク質分解消化後、粗細胞壁画分を、洗浄剤およびフェノールで脱脂質化
した。懸濁液の各リットルに、60gのDNase非含有尿素（Sigma Chemical Co.）、
2.0mlのDNase非含有100％フェノール、または150mlの90％ w/v フェノール（Sig
ma Chemical Co.）を添加した。懸濁液を含有したフラスコを、アルミホイルで 緩く覆い、60℃〜80℃に加温し、そして１時間、攪拌した。懸濁液を、10分間、
16000gでスピンし、上清画分とペレットの下の液体を捨てた。ペレットを、約１
リットルのオートクレーブした脱イオン化水中に再懸濁し、そして10分間、1600
0gで遠心分離することによって、３回洗浄した。

【００５０】 洗浄し、脱タンパク質化し、脱脂質化したMMCを、小量のオートクレーブした 水を有するオートクレーブした凍結乾燥したフラスコに懸濁液を移すことによっ
て凍結乾燥した。１つの300ml凍結乾燥化フラスコを、各30グラムの湿性細胞複 合体開始材料について使用した。MCC懸濁液を、ドライアイスで冷却したエタノ ール中でフラスコを回転することによって、シェル凍結した。フラスコの内容物
を凍結した後、フラスコを、凍結乾燥装置（Virtis Co. Inc.、Gardiner、NY） に備え付け、そして凍結乾燥した。凍結乾燥後、サンプルを、オートクレーブし
たねじ口容器に移し、そして無水硫酸カルシウムを含有するデシケータージャー
中に、-20℃で保存した。

【００５１】 他に記載しない限り、凍結乾燥したMCCを、オートクレーブした脱イオン化水 中に、または薬学的に受容されるDNase非含有緩衝液（生理食塩水およびPBSを含
むがこれらに制限されない）中に、再懸濁し、そして超音波処理によって乳化し
た。必要に応じて、乳化したMCC混合物を、１フロースルーについて、15000〜30
000psiでの精密流動化によってホモジナイズした。MCC懸濁液は、無菌的な条件 下でプロセスしたか、またはオートクレーブすることによって滅菌したかのいず
れかであった。

【００５２】 〔実施例２〕 MCCからのおよびM.phleiからのM-DNAの精製 MCCを実施例１におけるように調製した。M-DNAを、フェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール抽出、およびエタノール沈澱（Short Protocols in Mol
ecular Biology、第３版、Ausubelら編、John Wiley & Sons Inc.、New York、U
SA）によって、MCC（MCC-DNA）から精製した。予期しなかったことに、本発明者
らは、少なくとも約3.6%の乾燥重量のMCCが、抽出可能なM-DNAであることを見出
した。

【００５３】 M-DNAを、５mlのDNase非含有50mM Tris-HCl、５mM EDTA、pH8.0中にM.phlei（
110系統）を懸濁し、DNase非含有リゾチーム（Sigma Chemical Co.）を、１mg/m
lの濃度に添加し、そして90分間、37℃でインキュベーションすることによって 、M.phleiから精製した（M.phlei-DNA）。DNase非含有プロテイナーゼＫ（Life
Technologies、Burlington、Ontario、Canada）を、0.1mg/mlの濃度に添加し、D
Nase非含有ドデシル硫酸ナトリウム（BioRad、Richmond、CA）を、１％の濃度に
添加し、そしてインキュベーションを、10分間、65℃で継続した。M-DNAを、フ ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出し、そしてエタノール沈澱
した。

【００５４】 他で記載しない限り、M-DNAを、オートクレーブした脱イオン化水中、またはD
Nase非含有の薬学的に受容される緩衝液（生理食塩水、PBSを含むがこれらに制 限されない）中で、超音波処理した。MCC、MCC-DNA、およびM.phlei-DNAは、Lim
ulus amebocyte lysate QCL-1000キット（BioWhittaker、Walkersville、MD）を
使用して測定されるように、エンドトキシンを含まない。

【００５５】 〔実施例３〕 バクテリアDNA-バクテリア細胞壁複合体の調製、および他のバクテリア種から
のバクテリアDNAの調製 バクテリアDNA-バクテリア細胞壁複合体を、M.smegmatis、M.fortuitous、Noc
ardia rubra、Nocardia asteroides、Cornybacterium parvum、M.kansaasii、M.
tuberculosis、およびM.bovisから、実施例１におけるように調製する。バクテ リアDNAを、実施例２におけるようにバクテリアDNA-バクテリア細胞壁複合体か ら、および処理がなされていないバクテリアから精製する。

【００５６】 〔実施例４〕 DNase処理 MCC-DNA、M.phlei-DNA、およびMCCは、それぞれ、１μgのM-DNAおよびRegress
in（登録商標）（米国特許第4,744,9840号）を含有し、これを、20mM Tris HCl 、pH8.4、２mM MgCl₂、および50mM KCl中、１国際単位（IU）のRNase非含有DNas
eI（Life Technologies）で、１時間、25℃にて消化した。EDTAを2.5mMの最終濃
度に添加し、そして10分間、65℃で加熱することによってDNaseIを不活化した。
DNaseIは、１本鎖DNAおよび２本鎖DNAの両方を消化する。DNaseIでの消化は、DN
Aのほとんど全ての消化を生じる。Regressin（登録商標）（Bioniche、Inc. Lon
don、Ontario、Canada）は、１mgのミコバクテリア細胞壁抽出物、１ml PBS中の
20μlの鉱物油NF、および0.5% v/vのTween 80を含有する処方物である。

【００５７】 〔実施例５〕 MCC-DNAとM.phlei-DNAとの比較 MCC-DNAおよびM.phlei-DNAを、当業者に公知の手順を使用して、５％アガロー
スゲル（３ｈ；100V）中で電気泳動した。DNA分子量分布を、１D Main Program ソフトウエア（Advance American Biotechnology、Fullerton、CA）を使用して 、ゲル写真走査により分析した。 第１図において示されるように、M.phlei-DNAは、ゲノムDNAと同様に（＞1200
0bp）、約５と約10000塩基対（bp）との間に広範な範囲のオリゴヌクレオチドを
含む。MCC-DNAは、約５と約250塩基対との間のオリゴヌクレオチドの範囲、約40
塩基対での１つの主要なピーク、および小さなゲノムDNAを含む。

【００５８】 〔実施例６〕 細胞および試薬 OC2およびSW260を除く全ての細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（ATCC、Rockville、MD）から得、そしてATCCによって推奨される培地中で 培養した。OC2およびSW260は、J.K.Collins博士（University College Cork、Co
rk、Ireland）から得、そして10％ FCSを補充したDMEM培地中で培養した。表１ は、細胞株、それらの起源、およびそれらの特性を示す。

【００５９】

【表１】

【００６０】 マウスマクロファージを、1.5mlの滅菌Brewerのチオグリコール酸ブロス（Dif
co、Detroit、MI）を腹腔内に注入した雌性CD1マウスから得た。腹膜浸出液（＞
85％マクロファージ）を、４日目に採集し、HBSS中での遠心分離によって洗浄し
、そして10％ FCS、２mM L-グルタミン、および20mM HEPES（Life Technologies
）を補充したRPMI-1640培地中で培養した。細胞を、18時間、接着させ、その後 、非接着細胞を、加温培地で穏やかに洗浄することによって取出した。

【００６１】 マウス脾臓細胞を、滅菌のステンレススチールスクリーンを介して穏やかに裂
くことによって調製した。細胞懸濁液を、リンパ球-M細胞分離培地（CedarLane 、Hornby、Ontario、Canada）上に置き、そして2200rpmで30分間、遠心分離して
、赤血球および死細胞を取出した。これらの細胞を、10％ FCS、２mM L-グルタ ミン、および20mM HEPES（Life Technologies）を補充したRPMI-1640培地中で培
養した。

【００６２】 他で記載しない限り、細胞を、６ウェルの平底組織培養プレートに３×10⁵か ら10⁶細胞/mlとの間の濃度で播種し、そして５％ CO₂雰囲気中で、37℃にて維持
した。 ウシ胸腺（thymus）-DNA、ニシン精子（herring sperm）-DMA、およびエッシ ェリヒア コリ（Escherichia coli）リポ多糖（LPS）を、Sigma Chemical Co.か
ら得た。組換えヒトIL-12（hIL-12）を、R & D Systems（Minneapolis、MN）か ら得た。

【００６３】 〔実施例７〕 細胞増殖の阻害 細胞増殖を、ジメチルチアゾール-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）
還元を使用して（Mosmanら、Journal of Immunological Methods 65：55-63、19
83）、測定した。簡潔には、５mg/mlでPBS中に溶解した100μlのMTT（Sigma-Ald
rich）を、プレートの壁に添加した。４時間後、酸-イソプロパノール（イソプ ロパノール中の１mlの0.04N HCl）を添加し、そして還元されたMTTを、570nmの 波長で測定した。 HT-1376、HT-1197、B-16 F1、THP-1、RAW 264.7、Jurkat、HL-60、およびHL-6
0 MX-1細胞を、０μg/ml〜10μg/mlのM.phlei-DNA、MCC-DNA、ニシン精子DNA、 およびウシ胸腺DNAとともに、24時間、インキュベーションした。M.phlei-DNA（
第２Ａ図）およびMCC-DNA（第２Ｂ図）は、用量依存性の様式で、試験したガン 細胞株のそれぞれにおいて増殖を阻害したが、ニシン精子DNA（第２Ａ図および 第２Ｂ図）およびウシ胸腺DNA（第２Ａ図および第２Ｂ図）は、試験した細胞数 のいずれの増殖も阻害しなかった。 HT-1376、HT-1197、B-16 F1、THP-1、RAW 264.7、Jurkat、HL-60、およびHL-6
0 MX-1細胞を、０μg/ml〜10μg/mlのMCCとともに、24時間、インキュベーショ ンした。MCCは、用量依存性の様式で、試験したガン細胞株のそれぞれにおいて 、増殖を阻害した（第３図）。

【００６４】 ヒト白血病性THP-1単球を、０μg/ml〜10μg/mlのM.phlei-DNA、MCC-DNA、MCC
、およびhIL-12で、24時間、インキュベーションした。M.phlei-DNA、MCC-DNA、
およびMCCは、用量依存性の様式で、増殖を阻害した。hIL-12は、増殖を阻害し なかった（第４図）。 HT-1197（第５Ａ図）およびHT-1376（第５Ｂ図）ヒト膀胱ガン細胞を、０〜10
0μg/mlのMCCおよびLPSとともに、20時間、インキュベーションした。MCCは、増
殖を阻害した。LPSは増殖を阻害しなかった。

【００６５】 M.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCC（ここで、第１の薬学的に受容されるキャ リアは、M.phleiの細胞壁である）は、試験したガン細胞株のそれぞれの増殖を 阻害した。対照的に、LPS（これは、いくつかのガン細胞株においてアポトーシ スを誘導することが報告されている（Izquierdoら、Anticancer Drugs 7：275-2
801996）非特異的な免疫刺激因子である）；hIL-12（これは、いくつかのガン細
胞株においてアポトーシスを誘導することが報告されている（Stineら、Annals
NY Academy of Science 795：420-421、1996）サイトカインである）、ならびに
ウシ胸腺およびニシン精子からのDNAは、試験したガン細胞株のいずれの増殖も 阻害しない。これらのデータは、M-DNAが、試験したガン細胞株における増殖の 阻害を担うこと、ならびに他のDNA（ニシン精子DNAおよびウシ胸腺DNA）は、M-D
NAを置換え得ないこと、を示す。これらのデータはまた、M-DNAの、細胞増殖の 阻害が、非特異的な免疫刺激（LPS）から、およびサイトカイン活性（hIL-12） から生じないことを示す。さらにガン細胞のうち、p53/p21異常の、および薬物 耐性のHT-1376ヒト膀胱ガン細胞、および非定型性の薬物耐性HL-60 MX-1ヒト前 骨髄球性白血病細胞が阻害された。

【００６６】 〔実施例８〕 DNAフラグメント化によって示されるアポトーシスの誘導 ヌクレオソームの大きさのフラグメントへの、細胞性DNAのフラグメント化は 、アポトーシスを受ける細胞の特徴である。ヌクレオソームの大きさのフラグメ
ントは、アガロースゲル電気泳動によって測定されるように、長さ約200塩基対 の差を有するDNAフラグメントである（Newellら、Nature 357：286-289、1990）
。DNAフラグメント化を評価するために、非接着細胞を、200gで、10分間、遠心 分離によって回収した。非接着細胞のペレットおよび残存する接着細胞を、0.5m
lの低浸透圧性の溶解緩衝液（10mM Tris緩衝液、１mM EDTA、0.2％ Triton X-10
0、pH7.5）で溶解した。溶解物を、13,000gで、10分間、遠心分離し、そしてフ ラグメント化されたDNAを含有する上清を、50%イソプロピルアルコールおよび0.
5M NaCl中で、-20℃にて、一晩、沈澱した。沈澱物を、遠心分離によって回収し
、そして３時間、100Vで、0.7％アガロースゲルにおいて電気泳動することによ って分析した。

【００６７】 ヒト白血病性THP-1単球の懸濁培養物を、48時間、PBSとともに、ならびに１μ
g/mlの未処理のまたはDNaseIで処理したM.phlei-DNAおよびMCCとともに、ならび
に未処理のニシン精子DNAとともに、インキュベーションした（第６図）。M.phl
ei-DNA（レーン２）およびMCC（レーン４）は、有意なDNAフラグメント化を誘導
したが、PBS（レーン１）、DNaseIで処理したM.phlei-DNA（レーン３）、DNaseI
で処理したMCC（レーン５）、およびニシン精子-DNA（レーン６）は、DNAフラグ
メント化を誘導しなかった。123bpのDNAラダー（Life Technologies）を使用し て、ヌクレオソームの大きさのDNAフラグメントの分子量を測定した（レーンＬ ）。 THP-1単球の懸濁培養物を、48時間、PBSとともに、ならびに１μg/mlの未処理
のまたはDNaseIで処理したM.phlei-DNAおよびニシン精子DNAとともに、ならびに
hIL-12とともに、インキュベーションした（第７図）。M.phlei-DNAは、有意なD
NAフラグメント化を誘導したが（レーン５）、DNaseIで処理したM.phlei-DNA（ レーン４）、ニシン精子-DNA（レーン３）、DNaseIで処理したニシン精子-DNA（
レーン２）、hIL-12（レーン１）、およびPBS（レーン６）は、DNAフラグメント
化を誘導しなかった。123bp DNAラダー（Life Technologies）を使用して、ヌク
レオソームの大きさのDNAフラグメントの分子量を測定した（レーンＬ）。

【００６８】 HT-1197およびHT-1376ヒト膀胱ガン細胞を、48時間、１μg/mlのMCCとともに 、またはhIL-12とともにインキュベーションした（第８図）。MCCは、非接着性 のHT-1197（第８Ａ図、レーン２）およびHT-1376（第８Ｂ図、レーン２）細胞に
おいて、有意なDNAフラグメント化を誘導したが、接着性のHT-1197（第８Ａ図、
レーン３）およびHT-1376（レーン８Ｂ、レーン３）細胞においては、誘導しな かった。PBS（第８Ａ図および第８Ｂ図、レーン５）、hIL-12（第８Ａ図および 第８Ｂ図、レーン４）、DNaseIで処理したMCC（第８Ａ図および第８Ｂ図、レー ン７）、ならびに未処理の細胞（第８Ａ図および第８Ｂ図、レーン１）は、非接
着性のHT-1197細胞およびHT-1376細胞において、DNAフラグメント化を誘導しな かった。123bp DNAラダー（Life Technologies）を使用して、ヌクレオソームの
大きさのDNAフラグメントの分子量を測定した（第８Ａ図および第８Ｂ図、レー ンＬ）。

【００６９】 M.phlei-DNAおよびMCC（ここで、M-DNAは、保持され、そしてM.phlei細胞壁上
に複合体化される）は、ヒト白血病性THP-1単球において、ならびにHT-1197およ
びHT-1376ヒト膀胱ガン細胞において、アポトーシスを誘導したが、ニシン精子D
NA、hTL-12、ならびにDNaseIで処理したM.phlei DNAおよびMCCは、これらの細胞
においてアポトーシスを誘導しなかった。これらのデータは、M-DNAが、試験し たガン細胞株においてアポトーシスの誘導を担うこと、M-DNAのオリゴヌクレオ チドは、無傷（DNaseI処理）でなければならないこと、および他のDNA（ニシン 精子DNA）は、M-DNAを置換し得ないことを示す。これらのデータはまた、アポト
ーシスのM-DNA誘導は、非特異的な免疫刺激（LPS）から生じないことを示す。

【００７０】 〔実施例９〕 核分裂タンパク質装置（NuMA）の可溶化によって示される、アポトーシスの誘
導 NuMAの可溶化および放出によって引き起こされる細胞核における顕著な形態学
的変化は、アポトーシスの特徴である。NuMAの可溶化および放出を測定するため
に、培養細胞からの培地を回収し、そして200gで、10分間、遠心分離した。上清
を回収し、そして100μlの各上清を使用して、市販のELISA（Calbiochem、Cambr
idge、MA）（Millerら、Biotechniques 15：1042-1047、1993）を用いて、単位/
ml（U/ml）におけるNuMA放出を定量した。 ヒト白血病性THP-1単球を、48時間、０μg/ml〜10μg/mlのM.phlei-DNA、MCC-
DNA、MCC、およびニシン精子DNAとともにインキュベーションした。M.phlei-DNA
、MCC-DNA、およびMCCは、用量依存性の様式でNuMAの放出を誘導したが、ニシン
精子DNAは、NuMAの放出を誘導しなかった（第９図）。M.phlei-DNA、MCC-DNA、 およびMCCのDNaseI処理は、これらの細胞からのNuMA放出のそれらの誘導を、有 意に阻害した（第１０図）。

【００７１】 HT-1197およびHT-1376ヒト膀胱ガン細胞を、０μg/ml〜100μg/mlのMCCととも
にインキュベーションした。MCCは、用量依存性の様式で（第１１図）、および 時間依存性の様式で（第１２Ａ図および第12Ｂ図）、NuMAの放出を誘導した。Nu
MAの増強された放出は、HT-1197細胞（第１２Ａ図）およびHT-1376（第12Ｂ図）
細胞と、100μg/mlのMCCとのインキュベーション後、24時間以内に検出された。
M.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCCは、それぞれM-DNAを含有し、これらはガン
細胞のアポトーシスを誘導した。MCC（ここで、第１の薬学的に受容されるキャ リアは、M.phleiの細胞壁である）は、M.phlei-DNAまたはMCC-DNAよりもアポト ーシスを誘導した。このことは、応答細胞にM-DNAを提示するキャリアが、アポ トーシスのM-DNA誘導を達成することを示唆する。

【００７２】 〔実施例10〕 M.phlei-DNAによるJurkatヒトＴリンパ芽球細胞におけるアポトーシスのFasに
依存しない誘導 JurkatヒトＴリンパ芽球を、１時間、PBSとともに、１μg/ml CH-11抗体（Fas
に結合してアポトーシスを誘導する抗体）（＋コントロール）（Coulter-Immuno
tech、Hialeah、FL）とともに、または１μg/ml ZB4抗体（Fasに結合してアポト
ーシスを阻害する抗体（−コントロール）（Coulter-Immunotech）とともに、イ
ンキュベーションした。M.phlei-DNA、１μg/mlを添加し、そしてNuMA放出を、4
8時間後に測定した。 第１３図において示されるように、M.phlei-DNAは、ZB4の不在下、および存在
下の両方において、アポトーシスを誘導した。これらのデータは、M.phlei-DNA によるアポトーシスの誘導がFasに依存しないことを実証する。

【００７３】 〔実施例11〕 細胞増殖およびアポトーシスに対する、M.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCCの 効果のまとめ 表２は、ヒトおよびマウスのガン細胞株におけるDNAフラグメント化、NuMA放 出、およびフローサイトメトリー分析によって測定される、ガン細胞の増殖の阻
害に対する、およびガン細胞におけるアポトーシスの誘導に対する、M.phlei-DN
A、MCC-DNA、およびMCCの効果をまとめる。

【００７４】

【表２】

【００７５】 M.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCC（ここで、第１の薬学的に受容されるキャ リアは、M.phleiの細胞壁であり、M-DNAは、細胞壁上で複合体化される）は、試
験したガン細胞株のそれぞれの増殖を阻害し、試験したガン細胞のそれぞれにお
いてアポトーシスを誘導する。これらのガン細胞株は、非定型性の薬物耐性HL-6
0 MX-1ヒト前骨髄球性白血病細胞、p53/p21異常および薬物耐性HT-1376ヒト膀胱
細胞、Fas異常SW260ヒト結腸細胞、ならびに従来の薬物耐性LS1034ヒト盲腸ガン
腫細胞を含む。

【００７６】 〔実施例12〕 ヒト白血病性THP-1単球におけるカスパーゼ-3のMCC活性化 カスパーゼ3は、Fas-FasLシグナル伝達のアポトーシス経路の下流における重 要な酵素である。MCCがFasを回避し得、そしてガン細胞におけるカスパーゼカス
ケードを直接的に活性化し得るか否かを測定するために、カスパーゼ-3活性に対
するMCCの効果を、ヒト白血病性THP-1単球においてアッセイした。 THP-1単球（２×10⁷細胞）を、48時間、MCC（100μg/ml）とともにインキュベ
ーションした。THP-1細胞を、50mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、0.1% CHAPS、10
mM DTT、１mM EDTA、および10%グリセロール中に溶解した。カスパーゼ-3活性を
、市販のELISA（BIOMOL Research Laboratories、Inc.、Plymouth Meeting、PA ）を用いて、含まれる基質、インヒビター、および精製カスパーゼ-3酵素を使用
して測定した。結果を、405nmで読み取られる至適密度として表した。

【００７７】

【表３】

【００７８】 表３において示されるように、MCCとのインキュベーションは、ヒト白血病性T
HP-1単球において、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-3様活性の232％（３時間） および333％（６時間）の増加を生じた。カスパーゼ-3およびカスパーゼ-3様活 性のMCC誘導は、MCCのDNase処理によって無効にされた。カスパーゼ-3およびカ スパーゼ-3様活性のMCC誘導の特異性は、カスパーゼ-3インヒビターを使用して 実証された。MCC処理したTHP-1細胞抽出物へのカスパーゼ-3インヒビターの添加
は、測定可能な活性を全て無効にした。ヒト白血病性THP-1単球においてカスパ ーゼ-3およびカスパーゼ-3様活性を特異的におよび直接的に誘導するMCCの能力 は、全く予期されない。カスパーゼ-3およびカスパーゼ-3様活性を特異的に刺激
するために、MCCは、１つ以上の機構によって細胞に入り、そしてアポトーシス 実行の致死的なタンパク質分解性のカスケードを開始しなければならない。

【００７９】 〔実施例13〕 ヒト白血病性THP-1単球おけるMCC誘導性のアポトーシスに対する、タモキシフ
ェンの効果 ヒト白血病性THP-1単球を、90分間、コントロール培地中で、および10μg/ml タモキシフェン（Sigma-Aldrich）（進行した乳ガンの緩和処置において使用さ れる抗エストロゲン）を含有する培地中で、インキュベーションした。細胞を、
氷冷した培地で大量に洗浄し（２×）、培地中に約10⁶細胞/mlに再懸濁し、そし
て48時間、０、１、10、および100μg/mlのMCCとともにインキュベーションした
。アポトーシスを、NuMAを測定することによって定量した。

【００８０】

【表４】

【００８１】 表４において示されるように、タモキシフェン中でのプレインキュベーション
は、使用されたMCC濃度のそれぞれにて、MCC誘導性のアポトーシスを有意に増加
した。これらのデータは、MCC（ここで、M-DNAは、M.phleiの細胞壁と複合体化 される）が、他の抗ガン剤に対する補助薬として使用され得、処置効果を増加し
得ることを実証する。

【００８２】 〔実施例14〕 メチル化、超音波処理、およびオートクレーブによるM.phlei-DNAの改変 bacillus Calmette-Guerin（BCG）からの核酸調製物は、ガンの増殖を阻害す る（米国特許第4,579,941号；Tokunagaら、Microbiology and Immunology 36：5
5-666、1992）。BCG核酸における活性成分は、回文オリゴヌクレオチド配列のプ
リン-プリン-C-G-ピリミジン-ピリミジン（CGモチーフ）として同定されている 。CpGメチラーゼでのサイトシンメチル化は、このDNAの活性を無効にする（Krie
gら、Nature 374：546-549、1995）。それゆえ、M.phlei-DNAがアポトーシスを 誘導する能力に対するCpGメチル化の効果を、測定した。

【００８３】 M.phlei-DNA、１μgを、10mM Tris-HCl、pH7.9、50mM NaCl、10mM MgCl₂、１m
M DTT、および160μM S-アデノシルメチオニン中で、2.5UのCpG SssIメチラーゼ
（New England Biolabs、Mississauga、Ontario、Canada）を使用して、１時間 、37℃にてメチル化した。ネイティブなおよびメチル化されたM.phlei-DNAを、5
0mM NaCl、10mM Tris HCl、10mM MgCl2、および１mM DTT、pH7.9中で、１時間、
60℃にて、BstUI制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs）による切断に
供した。３時間、100Vでの0.5% アガロースゲルにおける電気泳動分析は、ネイ ティブなM.phlei-DNAが、BstUI制限エンドヌクレアーゼによって消化されたが、
メチル化されたM.phlei-DNAは、BstUI制限エンドヌクレアーゼによって消化され
なかったことを示した。このことは、M.phlei-DNAのメチル化が、完全であった ことを確認した。

【００８４】 第１４図において示されるように、メチル化は、ヒト白血病性THP-1単球から の、M.phlei誘導性のNuMA放出を改変しなかった。これらのデータは、BCGとは異
なり、CGモチーフは、M.phlei-DNAによるアポトーシス誘導に必要ではないこと を実証する。 M.phlei-DNA（１μg）の塩基対長を、W-38型超音波プロセッサー（HeatSystem
s-Ultrasonics、Inc.）において、氷上で、15秒間または20分間、超音波処理す ることによって、BstUI制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、また は121℃で30分間、オートクレーブすることによって（Castle Sybron MDT、Dubu
que、Iowa）、減少した。第１４図において示されるように、超音波処理、BstU 消化、およびオートクレーブは、それぞれ、約５塩基対から約250塩基対の範囲 に塩基対長を減少し、THP-1単球からのNuMA放出のM.phlei-DNA誘導を達成しなか
った。これらの結果は、M.phlei-DNAが、短いオリゴヌクレオチド長（約５塩基 対〜約250塩基対）であっても、ガン細胞においてアポトーシスを誘導すること を実証する。

【００８５】 ヒト白血病性THP-1単球を、48時間、未処理のM.phlei-DNAおよびMCCとともに 、ならびに30分間、121℃でオートクレーブされたM.phlei-DNAおよびMCCととも に、インキュベーションした。DNAの塩基対長を減少するオートクレーブは、こ れらの細胞の増殖を阻害するか（表５）、またはこれらの細胞においてアポトー
シスを誘導する（表６）、M.phlei-DNAおよびMCCの能力を影響しなかった。

【００８６】

【表５】

【００８７】

【表６】

【００８８】 〔実施例15〕 MCCは、インビボでガンの増殖を阻害する MCCおよびDNaseIで処理したMCCを、４℃で５分間、超音波処理することによっ
て（Heat Systems-Ultrasonics，Inc.）、２％ w/v 鉱物油および0.02％ w/v Tw
een80（Fisher Chemical Co.）を含有するPBS中で１mg/mlの最終濃度に乳化した
。 系統10の肝細胞腫細胞（系統２モルモットに同質遺伝子的）を迅速に解凍し、
遠心分離によって洗浄し、そして10⁶細胞/mlの濃度に、M199培地中に再懸濁した
。1.5×10⁶細胞を含有する0.1mlを、３月齢の系統２モルモットのわき腹に、皮 内注入した。ガンが、約0.5と0.8cmとの間の直径であった場合に、処置を注入後
６〜７日目に開始した。７匹の動物を、乳化緩衝液単独で処置し（コントロール
）、７匹の動物をMCCを含有する乳化緩衝液で処置し、および７匹の動物をDNase
で処理されたMCCを含有する乳化緩衝液で処置した。乳濁液は、ガンおよびその 周囲の正常な組織に、直接的に、滴下注入した。１mgの、MCCおよびDNaseIで処 理したMCCのを含有する１mlの全容量について、0.1mlの乳濁液を、０時間および
６時間で、投与した。

【００８９】 ガンの直径（最も長い直径＋最も短い直径）を、３週間、毎週記録した。ガン
の容量を、0.5×ａ（最も長い直径）×ｂ²（最も短い直径）として、mm³で算定 し、そして処置の０日目に比較したガン容量の増加を、各モルモットについて算
定した。統計学的分析を、反復を伴う２方向ANOVAを使用して（PHARM/PCSバージ
ョン4.2、MCS、Philadelphia、PA）、行った。処置における差異は、p≦0.05で 有意であると考えられた。 第１５図において示されるように、コントロール乳濁液では、ガン容量は、３
週目までに約22倍まで増加したが、MCCでは、ガン増殖は、コントロール乳濁液 に比較して、有意に阻害された（第１５図、表７）。DNaseIで処理したMCCでは 、ガン増殖は、コントロールと有意には異ならなかった（第１５図、表７）。

【００９０】

【表７】

【００９１】 これらのデータは、腫瘍の部位でのMCCの滴下注入は、腫瘍退行を生じること を示す。さらに、MCCと、DNaseIで処理したMCCとの間のガン増殖の阻害における
有意な（ｐ＜0.01）差異は、未分解のM-DNAが、インビボでのMCCの抗ガン活性に
必要であることを示す。

【００９２】 〔実施例16〕 MCC細胞傷害性 細胞傷害性は、血漿膜完全性の喪失および細胞質酵素（LDH（Wyllieら、Inter
national Review of Cytology 68：251-306、1980；Phillipsら、Vaccine 14：8
98-904、1996）を含むがこれに制限されない）の放出によって特徴付けられる。
ヒト膀胱ガン細胞は、細胞障害性薬剤で処理される場合にLDHを放出する（Rahma
n M. Urology International 53：12-17、1994）。 MCCの細胞傷害性を評価するために、HT-1197およびHT-1376ヒト膀胱ガン細胞 を、48時間、０μg/ml〜100μg/mlのMCCとともに、または全LDH放出についての コントロールとして、溶解緩衝液（10mM Tris、１mM EDTA、0.2％ Triton X-100
、pH7.5）（Filionら、Biochim Biophys Acta 1329：345-356、1997）とともに 、インキュベーションした。培養上清へのLDH放出を、市販のアッセイ（Sigma-A
ldrich）を使用して測定した。 LDH放出によって測定されるように、MCCは、HT-1197細胞に対しても、およびH
T-1376細胞に対しても、細胞傷害性ではなかった（第１７図）。細胞傷害性の不
在は、MCCが、ガン細胞の増殖を阻害するために、およびガン細胞においてアポ トーシスを誘導するために、直接的に作用することを実証する。

【００９３】 〔実施例17〕 インビトロでのサイトカイン合成の刺激 IL-12は、いくつかのガン細胞において抗ガン活性を有することが報告される （Voestら、Journal National Cancer Institute 87：581-586、1995；Stineら 、Annals NY Academy of Science 795：420-421、1996）が、GM-CSFは、いくつ かのガン細胞においてガン後活性を有することが報告される（Hawkyardら、Jour
nal of Urology 150：514-518、1993）。さらに、いくつかのガン細胞は、サイ トカインを分泌することが報告される（De Reijkeら、Urology Research 21：34
9-352、1993；Beversら、British Journal of Urology 80：35-39、1997）。そ れゆえ、HT-1197およびHT-1376ヒト膀胱ガン細胞による、ならびにヒトTHP-1単 球、マウスマクロファージ、マウスRAW264.7単球、ならびにマウス脾臓細胞によ
る、IL-6、IL-12、およびGM-CSF合成に対するMCCの効果を、測定した。

【００９４】 サイトカイン産生を、適切な市販のELISA（BioSource、Camarillo CA）を使用
して、100μlの培養上清中のpg/mlで測定した。IL-12 ELISAは、IL-12 p70複合 体および遊離のp40サブユニットの両方を測定する。 HT-1197およびHT-1376、THP-1、マクロファージ、RAW264.7、およびマウス脾 臓細胞を、48時間、１μg/ml MCCとともにインキュベーションした。第１図にお
いて示されるように、MCCは、ヒト単球およびマウスマクロファージにるIL-6お よびIL-12の産生を刺激したが、ヒト膀胱ガン細胞、マウス単球、または脾臓細 胞による産生は刺激しなかった。MCCは、試験したどのガン細胞においても、GM-
CSF産生を刺激しなかった。 これらのデータは、MCC（ここで、M.phleiの細胞壁は、第１の薬学的に受容さ
れるキャリアである）は、ヒト単球およびマウスマクロファージによる抗ガンサ
イトカインのIL-6およびIL-12の産生を刺激することを示す。MCCは、ヒト膀胱ガ
ン細胞によるサイトカインの産生を刺激しない。MCCは、ガン後のサイトカインG
M-CSFの産生を刺激しない。

【００９５】 〔実施例18〕 ヒトTHP-1単球によるIL-12産生に対する、未処理のおよびDNaseIで処理した、
M.phlei-DNA、MCC-DNA、MCC、およびRegressin（登録商標）の効果 ヒトTHP-1単球を、DNaseIでの処理の前に、DNaseIでの処理の後に、およびDNa
seIで処理したM.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCCへのM-DNAの添加の後に、48時 間、M.phlei-DNA、MCC-DNA、MCC、およびRegressin（登録商標）とともにインキ
ュベーションした。

【００９６】

【表８】

【００９７】 表８において示されるように、M.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCCは、それぞ れ、THP-1単球がIL-12を産生するのを刺激した。MCCは、M.phlei-DNAまたはMCC-
DNAよりもIL-12の産生を刺激した。RegessinOは、最小のIL-12産生を刺激した。
DNaseI処置は、約50％まで、M.phlei-DNA、MCC-DNA、MCC刺激されるIL-12産生を
減少した。RegessinOは、DNaseI処理によって影響されなかった。DNaseIで処理 したM.phleiに対するM.phlei-DNAの添加、およびDNaseIで処理したMCC-DNAに対 するMCC-DNAの添加は、IL-12産生のそれらの刺激を回復した。DNaseIで処理した
MCCに対するMCC-DNAの添加は、IL-12産生のその刺激を回復しなかった。

【００９８】 MCC（ここで、M.phlei細胞壁は、第１の薬学的に受容されるキャリアである）
は、M.phlei-DNAまたはMCC-DNAよりもIL-12産生を刺激し、このことは、応答細 胞に対してM-DNAを提示するために使用されたキャリアが、M-DNA刺激性のIL-12 産生を達成したことを示唆する。DNaseI処理は、M-DNAを分解し、M.phlei-DNA、
MCC-DNA、およびMCC刺激性のIL-12産生を有意に減少し、このことは、M-DNAのオ
リゴヌクレオチド形態が、IL-12産生の至適な刺激のために保存されなくてはな らないことを示唆する。DNaseIで処理したMCCへのM-DNAの添加は、IL-12産生の その刺激を回復せず、このことは、M-DNAが、MCCにおいてM.phleiの細胞壁に複 合体化される様式が、ヒト単球によるIL-12の至適な刺激のために重要であるこ とを示唆する。

【００９９】 〔実施例19〕 ヒトTHP-1単球によるIL-12産生のM.phlei-DNAおよびMCC刺激に対する、オート
クレーブの効果 ヒトTHP-1単球を、48時間、MCCおよびM.phlei-DNAとともに、ならびに30分間 、滅菌水中でオートクレーブしたMCCおよびM.phlei-DNAとともに、インキュベー
ションした。

【０１００】

【表９】

【０１０１】 表９において示されるように、DNA塩基対の大きさを減少するオートクレーブ は、単球によるIl-12産生のMCCおよびM.phlei-DNA刺激を影響しなかった。

【０１０２】 〔実施例20〕 ヒトTHP-1単球によるMCC-DNAおよびMCC刺激性のIL-12産生に対する、CD14抗体
処理の効果 ヒトTHP-1単球を、PBSとともに、または10μl/mlの抗CD14抗体（クローンMY4 、Coulter-Immunotech）とともに、１時間、インキュベーションした。次いで、
５μg/mlのMCC-DNAまたはMCCを添加し、そしてインキュベーションを、48時間、
継続した。CD14抗体（これは、細胞表面上のCD14レセプターに結合する）は、MC
C-DNA刺激性のIL-12産生の約85％の減少、およびMCC刺激性のIL-12産生の約20％
の減少を引き起こした（第１８図）。

【０１０３】 〔実施例21〕 ヒトTHP-1単球によるM.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCC刺激性の IL-12産生に対する、サイトラカシンDの効果 ヒトTHP-1単球を、48時間、10μg/mlのサイトカラシンD（Sigma Chemical Co.
）の存在下および不在下、PBSとともに、または１μg/mlのM.phlei-DNA、MCC-DN
A、またはMCCとともに、インキュベーションした。サイトカラシンD（これは、 食作用を阻害する）は、M.phlei-DNA刺激性のIL-12産生において64％の減少、MC
C-DNA刺激性のIL-12産生において50％の減少、およびMCC刺激性のIL-12産生にお
いて55％の減少を引き起こした（第１９図）。

【０１０４】 以下の仮説に束縛されることを意図しないが、第１８図および第１９図におい
て示されるデータに基づいて、M.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCCは、複数の機 構によって単球と相互作用することが考えられる。第１８図は、それらが、GPI 結合化膜レセプターCD14と相互作用し、そして内部移行されたことを示唆する。
この機構は、不溶性のMCCに対してよりも、可溶性のM.phlei-DNAおよびMCC-DNA に対して特異的である。第１９図は、それらが、食作用性のレセプター（例えば
、スカベンジャーレセプター）と相互作用し、そして内部移行されることを示唆
する。この機構は、可溶性のM.phlei-DNAおよびMCC-DNAに対してよりも、不溶性
のMCCに対して特異的である。

【０１０５】 〔実施例22〕 ヒトTHP-1単球によるIL-12産生に対する、CG配列およびMCCの効果 BCGからの核酸調製物は、リンパ球増殖、Ｂ-リンパ球によるIL-6およびIL-12 の分泌、単球によるIL-12の分泌、Ｔ-リンパ球によるIL-6およびインターフェロ
ンγの分泌、ならびにNK細胞によるインターフェロン-γの分泌を刺激すること が報告される（Klinmanら、Proceeding of the National Academy of Science U
SA 93：2879-2883、1996）。 BCG核酸の活性成分が、CGモチーフとして同定されているので、ヒトTHP-1単球
を、48時間、0.5、１、および５μg/mlのMCCまたは５'-GCTAGACGTTAGCGT-３'DNA
配列（自動化DNA合成機を使用して固相合成によって調製した）とともに、イン キュベーションした。

【０１０６】

【表１０】

【０１０７】 表１０において示されるように、CG含有オリゴヌクレオチド配列は、試験した
３つの濃度のいずれでもIL-12産生を刺激しなかったが、MCCは、１μg/mlで、IL
-12産生に対する有意な刺激効果を有した。

【０１０８】 〔実施例23〕 マウスマクロファージによるIL-12産生の、M.phlei-DNA、MCC-DNA、MCC、およ
びRegressin（登録商標）の刺激に対する、熱処理およびDNaseI処理の効果 マウス腹膜のマクロファージを、48時間、M.phlei-DNA、MCC-DNA、MCC、およ びRegressin（登録商標）とともに、ならびに100℃で、10分間、加熱し、次いで
、氷中で、２分間冷却したM.phlei-DNA、MCC-DNA、MCC、およびRegressin（登録
商標）とともに、インキュベーションした。

【０１０９】

【表１１】

【０１１０】 表１１において示されるように、５μg/mlの濃度で、IL-12産生は、MCCによっ
て最も大きく、M.phlei-DNAおよびMCC-DNAによってより小さく刺激され、ならび
にRegressin（登録商標）は、最も小さく刺激された。M.phlei-DNA、MCC-DNA、 およびRegressin（登録商標）の熱処理は、IL-12産生のそれらの刺激に対して何
ら有意な効果を有しなかった。示していないが、MCCの熱処理は、わずかである が、有意な、IL-12産生の増加を引き起こした。 マウス腹膜のマクロファージを、48時間、未処理のおよびDNaseIで処理した、
MCC-DNA、MCC、およびRegressin（登録商標）とともにインキュベーションした （第２０図）。IL-12産生は、MCCによって最も大きく、MCC-DNAによってより小 さく、ならびにRegressin（登録商標）によって最も小さく刺激された。MCC-DNA
およびMCCのDNaseI処理は、マウスマクロファージによるIL-12産生のそれらの刺
激を有意に減少した。Regressin（登録商標）のDNaseI処理は、その活性に対し て何の効果も有しなかった。これらのデータはさらに、単球でのように（実施例
18）、M-DNAのオリゴヌクレオチド構造が、マウスマクロファージによるIL-12産
生の至適な刺激のために保存されなければならないことを示唆する。

【０１１１】 〔実施例24〕 マウス腹膜のマクロファージによる一酸化窒素（NO）産生に対する、M.phlei-
DNA、MCC-DNA、MCC、およびRegressin（登録商標）の効果 マクロファージ活性化は、反応性酸素種（一酸化窒素、スーパーオキシドラジ
カル、およびヒドロキシルラジカルを含むがこれらに制限されない）の産生を刺
激する。これらの反応性酸素種は、応答細胞における細胞溶解およびアポトーシ
スを誘導し、それゆえ、抗ガン活性を有する。 マウス腹膜のマクロファージを、48時間、0.1、5.0、または12.5μg/mlのM.ph
lei-DNA、MCC-DNA、MCC、およびRegressin（登録商標）とともに、インキュベー
ションした。100μlの培養上清を使用して、Griess試薬とNO₂ ^-との反応による、
nmol/Lで測定されるNOの産生はなかった。

【０１１２】

【表１２】

【０１１３】 表１２において示されるように、５μg/mlで、MCCは、M.phlei-DNA、MCC-DNA 、またはRegressin（登録商標）よりも有意に、NO産生を刺激した。 マウスマクロファージを、48時間、１μg/mlの未処理のおよびDNaseIで処理し
たMCCとともに、ならびに未処理のM.phlei-DNAおよびMCC-DNAとともに、インキ ュベーションした。

【０１１４】

【表１３】

【０１１５】 表１３において示されるように、MCCは有意なNO産生を刺激したので、M-DNAは
、M.phleiの細胞壁上で複合体化された。MCCのDNaseI処理（これは、M-DNAを分 解する）は、NO産生のMCC刺激を無効にした。MCC-DNAおよびM.phlei-DNAは、最 小のNO産生を刺激した。これらのデータは、M-DNAの無傷のオリゴヌクレオチド 構造、およびマクロファージにこれらのオリゴヌクレオチドを提示するキャリア
の両方が、NO産生の至適刺激に重要であることを実証する。

【０１１６】 〔実施例25〕 マウスRAW264.7単球による一酸化窒素（NO）の産生に対する、MCCの効果 マウスRAW264.7単球を、24時間、0.5〜95μg/mlのMCCとともにインキュベーシ
ョンした。漸増濃度のMCCは、漸増量のNO産生を刺激した（第２１図）。これは 、NO誘導のレセプターが、単球において至適に発現されないので予期されず、そ
れゆえ、NO産生は、通常、単球と関連しない。同じ条件下で、Regressin（登録 商標）は、NO産生を刺激しなかった。

【０１１７】 〔実施例26〕 インビボでのサイトカイン合成の刺激 CD-1マウスの４つの群（それぞれ、５匹のマウスを含む）を、50mg/kgのMCCで
、腹腔内注入した。血液を、注入の０、３、６、および24時間後に回収し、そし
て血中のIL-6、IL-10、IL-12、およびGMSFの濃度（pg/ml）を、注入の０、３、 ６、および24時間後に測定した（第２２図）。腹腔内MCCで、IL-6、IL-10、およ
びIL-12の血清濃度は、注入の３および６時間後に、有意に増加され、注入の24 時間後に、ほぼコントロール値（０時間）に減少した。GM-CSFの血清濃度は、注
入の３、６、および24時間後で、ほぼコントロール値（０時間）のままであった
。

【０１１８】 CD-1マウスの５つの群（それぞれ、５匹のマウスを含む）を、6.6mg/kgのMCC で、静脈内に注入した。血液を、注入の０、３、６、および24時間後に回収し、
そして血清中のIL-10およびIL-12の濃度（pg/ml）を、注入の０、３、６、およ び24時間後に測定した（第２３図）。静脈内MCCで、IL-12の血清濃度は、注入の
３および６時間後に有意に増加し、そして注入の24時間後に、ほぼコントロール
値（０時間）に減少した。IL-10の血清濃度は、注入の３、６、および24時間後 で、ほぼコントロール値（０時間）のままであった。

【０１１９】 これらのデータは、M-DNAのインビボ投与（ここで、MCCのように、M-DNAは、M
.phleiの細胞壁上で複合体化される）は、抗ガンサイトカインのIL-6、IL-10、 およびIL-12の産生を刺激するが、ガン後のサイトカインGM-CSFの産生を刺激し ないことを実証する。さらに、これらのデータは、投与されるMCCの量およびMCC
が投与される経路の両方が、インビボでサイトカインの産生を刺激するMCCの能 力を達成することを実証する。 CD1マウスの４つの群（それぞれ、４匹のマウスを含む）を、未処理のおよびD
NaseIで処理したM.phlei-DNAおよびMCCで、腹腔内注入した。３時間後、マウス を屠殺し、心臓微小穿刺によって血液を回収し、そして血清中のIL-12の濃度（p
g/ml）を測定した（表１４）。

【０１２０】

【表１４】

【０１２１】 表１４において示されるように、MCCおよびM.phlei-DNAのインビボ投与は、抗
ガンサイトカインIL-12の産生を刺激する。DNaseI処理後、MCC刺激性のIL-12産 生は、40.5％に減少し、そしてM.phlei-DNA刺激性のIL-12産生は、46.5％に減少
した。このことは、M-DNAのオリゴヌクレオチド構造が、インビボでのIL-12産生
の至適な刺激のために保存されなければならないことを実証する。

【０１２２】 〔実施例27〕 MCC安定性 MCCを、１mg/mlで、暗所中、４℃にて、または６ヶ月間、0.85％ w/v NaCl中 の滅菌懸濁液として保存した。平均粒子直径を、光子相関分光法（N4 Plus、Cou
lter Electronics Inc.）を使用して算定した。MCC懸濁液を、５×10⁴から10⁶計
数/秒間の格子計数速度に、0.85 w/v NaClで希釈した。平均粒子直径を、以下の
条件を用いて、サイズ分布プロセッサーモード（SDP）において算定した：液体 屈折指数1.33、温度20℃、粘性率0.93センチポアズ、90.0°の測定角度、サンプ
ル時間10.5μs、およびサンプル作動時間100秒。電位（粒子と大量の溶媒との間
の流体力学的界面での電荷）を、以下の条件を使用して、Delsa 440SX（Coulter
Electronics Inc.）において測定した：電流0.7mA、振動範囲500Hz、温度20℃ 、液体屈折指数1.33、粘性率0.93センチポアズ、比誘電率78.3、伝導率16.7ms/c
m、オンタイム2.5秒間、オフタイム0.5秒間、およびサンプル作動時間60秒間。 第２４図において示されるように、MCC電荷およびMCC直径は、６ヶ月の保存の
間、比較的未変化のままであった。さらに、THP-1単球における、IL-12産生のMC
C刺激およびアポトーシスのMCC誘導は、６ヶ月の保存の間、未変化のままであっ
た。

【０１２３】 〔実施例28〕 ヒト結腸ガンのMCC-DNAおよびMCC処置 ヒト結腸ガン細胞（ICM12C）を、免疫不全の胸腺欠損ヌードマウス（nu/nu マ
ウス）の皮下組織における異所性の固体腫瘍細胞として確立し、マウスを５つの
群に分割する。群１は、賦形剤のみを受ける。群２は、MCC-DNAを受ける。群３ は、DNaseIで処理したMCC-DNAを受ける。群４は、MCCを受ける。群５は、DNaseI
で処理したMCCを受ける。ガン集団を、処置の前に測定し、そして処置の４週間 の間、毎週測定した。群２のマウスおよび群４のマウスは、腫瘍集団の退行を示
す。

【０１２４】 〔実施例29〕 ヒト卵巣ガンのM.phlei-DNAおよびMCC処置 ヒト卵巣ガン細胞（36M2）を、免疫不全の胸腺欠損ヌードマウス（nu/nu マウ
ス）の腹腔における腹水として確立し、マウスを５つの群に分割する。群１は、
ベヒクルのみを受ける。群２は、M.phlei-DNAを受ける。群３は、DNaseIで処理 したM.phlei-DNAを受ける。群４は、MCCを受ける。群５は、DNaseIで処理したMC
Cを受ける。ガン集団を、処置の前に測定し、そして処置の４週間の間、毎週測 定した。群２のマウスおよび群４のマウスは、腹水ガン細胞における増殖の阻害
を示す。

【０１２５】 〔実施例30〕 イヌ伝搬性の性病ガンのMCC処置 性病ガン（VT）を伴うイヌを、４つの群に分割する。群１は、ビンクリスチン
を受ける。群２は、ビンクリスチンを、メトトレキセートおよびシクロホスファ
ミドと合わせて受ける。群３は、キャリアと複合体化され、キャリア上で提示さ
れる（ここで、キャリアは、ミコバクテリアの細胞壁（MCC）である）MCC-DNAを
受ける。群４は、ビンクリスチンおよびMCCを受ける。ガン集団を、処置の前に 測定し、そして処置の12週間の間、毎週測定する。群４のイヌは、VTの退行を示
す。

【０１２６】 〔実施例31〕 水性キャリア中での懸濁 M-DNAを、第１の薬学的に受容されるキャリア中に懸濁し、そして20％出量で 、５分間、超音波処理する（W385型 Sonicator、Heat Systems-Ultrasonics Inc
）。必要に応じて、超音波処理した組成物を、１フロースルーについて15000〜3
0000psiで、精密流動化によってホモジナイズする（M-110Y型；Microfluidics、
Newton、MA）。

【図面の簡単な説明】

【図１】 第１図。M.phlei-DNAおよびMCC-DNAのオリゴヌクレオチド分布。

【図２】 第２Ａ図。M.phlei-DNA、ウシ胸腺-DNA、ならびにニシン精子DNAによる、HT-1
376、HT-1197、B-16F1、THP-1、RAW 264.7、Jurkat、HL-60、HL-60 MX-1ガン細 胞の増殖の阻害。結果は、３回の独立した実験の平均±SDである。

【図３】 第２Ｂ図。MCC-DNA、ウシ胸腺-DNA、ならびにニシン精子DNAによる、HT-1376 、HT-1197、B-16F1、THP-1、RAW 264.7、Jurkat、HL-60、HL-60 MX-1ガン細胞の
増殖の阻害。結果は、３回の独立した実験の平均±SDである。

【図４】 第３図。MCCによる、HT-1376、HT-1197、B-16F1、THP-1、RAW 264.7、Jurkat 、HL-60、HL-60 MX-1ガン細胞の増殖の阻害。結果は、３回の独立した実験の平 均±SDである。

【図５】 第４図。M.phlei-DNA、MCC-DNA、MCC、およびhIL-12による、ヒト白血病性THP
-1単球の増殖の阻害。結果は、３回の独立した実験の平均±SDである。

【図６】 第５Ａ図。MCCおよびLPSによる、HT-1197およびヒト膀胱ガン細胞の増殖の阻 害。結果は、３回の独立した実験の平均±SDである。

【図７】 第５Ｂ図。MCCおよびLPSによる、HT-1376ヒト膀胱ガン細胞の増殖の阻害。結 果は、３回の独立した実験の平均±SDである。

【図８】 第６図。PBS、ニシン精子DNA、ならびに未処理の、およびDNaseIで処理した、
M.phlei-DNAおよびMCCによる、ヒト白血病性THP-1単球におけるDNAフラグメント
化の誘導。示される結果は、３つの実験のうちの１つであり、各実験のぞれぞれ
は、類似の結果を与えた。

【図９】 第７図。PBS、未処理の、およびDNaseIで処理したニシン精子DNAおよびM.phle
i-DNAによる、ならびにhIL-12による、ヒト白血病性THP-1単球におけるDNAフラ グメント化の誘導。示される結果は、３つの実験のうちの１つであり、各実験の
ぞれぞれは、類似の結果を与えた。

【図１０】 第８Ａ図。MCCおよびhIL-12による、HT-1197ヒト膀胱ガン細胞におけるDNAフ ラグメント化の誘導。示される結果は、３つの実験のうちの１つであり、各実験
のぞれぞれは、類似の結果を与えた。

【図１１】 第８Ｂ図。MCCおよびhIL-12による、HT-1376ヒト膀胱ガン細胞におけるDNAフ ラグメント化の誘導。示される結果は、３つの実験のうちの１つであり、各実験
のぞれぞれは、類似の結果を与えた。

【図１２】 第９図。MCC、M.phlei-DNA、MCC-DNA、およびニシン精子DNAによる、ヒト白血
病性THP-1単球からのNuMA放出。結果は、３回の独立した実験の平均±SDである 。

【図１３】 第１０図。未処理の、およびDNase処理されたM.phlei DNA、MCC-DNA、およびM
CCによるヒト白血病性THP-1単球からのNuMAの放出。結果は、３回の独立した実 験の平均±SDである。

【図１４】 第１１図。漸増濃度のMCCでの、HT-1376およびHT-1197ヒト膀胱ガン細胞から のNuMAの放出。結果は、３回の独立した実験の平均±SDである。

【図１５】 第１２Ａ図。48時間にわたる、１μg/ml MCCおよび100μg/ml MCCでの、HT-11
97ヒト膀胱ガン細胞からのNuMA放出。結果は、３回の独立した実験の平均±SDで
ある。

【図１６】 第１２Ｂ図。48時間にわたる、１μg/ml MCCおよび100μg/ml MCCでの、HT-13
76ヒト膀胱ガン細胞からのNuMA放出。結果は、３回の独立した実験の平均±SDで
ある。

【図１７】 第１３図。PBS、CH-11抗体、ZB4抗体、M.phlei-DNA；CH-11抗体＋M.phlei-DNA
、およびZB4抗体＋M.phlei-DNAとともにインキュベートされたJurkat細胞からの
NuMAの放出。

【図１８】 第１４図。PBS、M.phlei-DNA、超音波処理されたM.phlei-DNA、BstU１消化さ れたM.phlei-DNA、およびメチル化されたM.phlei-DNAによる、ヒト白血病性THP-
1単球からのNuMAの放出。

【図１９】 第１５図。モルモットの10系統ヘパートームにおける、MCC、およびDNaseI処 理されたMCCの抗ガン活性。結果は、各実験群において、７匹の動物の平均±SD である。

【図２０】 第１６図。MCC細胞傷害性の指標としての、HT-1197およびHT-1376ヒト膀胱ガ ン細胞からのLDH放出のパーセント。結果は、３回の独立した実験の平均±SDで ある。

【図２１】 第１７図。HT-1197およびHT-1376ヒト膀胱ガン細胞、ヒトTHP-1単球、マウス マクロファージ、マウスRAW 264.7単球、ならびにマウス脾臓細胞による、IL-6 、IL-12、およびGM-CSF産生のMCC刺激。結果は、３回の独立した実験の平均±SD
である。

【図２２】 第１８図。ヒトTHP-1単球による、MCC-DNAにおける、およびMCC誘導性のIL-12
産生における、CD14レセプターに対する抗体の効果。

【図２３】 第１９図。ヒトTHP-1単球による、M.phlei-DNA、MCC-DNA、およびMCC刺激性の
IL-12に対する、サイトカラシンDの効果。

【図２４】 第２０図。マウスマクロファージによる、IL-12産生に対する、未処置の、お よびDNase処置されたMCC-DNA、MCC、およびRegressin（登録商標）の効果。

【図２５】 第２１図。マウスRAW 264.7単球によるNO産生のMCC刺激。

【図２６】 第２２図。50mg/kg MCCの腹腔内注射による、CD-1マウスにおけるIL-6、IL-10
、IL-12、およびGM-CSFの刺激。

【図２７】 第２３図。6.6mg/kgの静脈内投与による、CD-1マウスにおけるIL-12産生の刺 激。

【図２８】 第２４図。６ヶ月の保存の間のMCCの安定性。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月７日（２０００．２．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０７５，１１１ (32)優先日 平成10年２月18日(1998．2．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０８６，３１７ (32)優先日 平成10年５月21日(1998．5．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 NA14 ZB07 ZB21 ZB26 ZC61

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物の応答細胞における応答を誘導することに有効な組成
   物であって： ａ．ミコバクテリアＤＮＡ（Ｂ-ＤＮＡ）、および ｂ．第１の薬学的に許容できるキャリア を含む組成物。
2. 【請求項２】 前記Ｂ-ＤＮＡが、M.phlei ＤＮＡ（M-ＤＮＡ）である、 請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 前記第１の薬学的に許容できるキャリアが、水性キャリア
   、非水性キャリアおよびミコバクテリアの細胞壁からなる群から選択される、請
   求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】 前記第１の薬学的に許容できるキャリアが水性キャリアで
   ある、請求項３記載の組成物。
5. 【請求項５】 前記第１の薬学的に許容できるキャリアがミコバクテリア
   の細胞壁である、請求項３記載の組成物。
6. 【請求項６】 前記ミコバクテリアの細胞壁がM.phleiの細胞壁である、 請求項５記載の組成物。
7. 【請求項７】 第２の薬学的に許容できるキャリアをさらに含む、請求項
   １記載の組成物。
8. 【請求項８】 前記第２の薬学的に許容できるキャリアが、水性キャリア
   および非水性キャリアからなる群から選択される、請求項７記載の組成物。
9. 【請求項９】 前記応答が、応答細胞の増殖の阻害、応答細胞におけるア
   ポトーシスの誘導、および生理活性分子を産生する免疫系の応答細胞の刺激から
   なる群から選択される、請求項１記載の組成物。
10. 【請求項１０】 前記応答が応答細胞の増殖の阻害である、請求項９記載
    の組成物。
11. 【請求項１１】 前記応答細胞がガン細胞である、請求項１０記載の組成
    物。
12. 【請求項１２】 前記応答が応答細胞におけるアポトーシスの誘導である
    、請求項９記載の組成物。
13. 【請求項１３】 前記アポトーシスの誘導はFasに依存しない、請求項１ ２記載の組成物。
14. 【請求項１４】 前記アポトーシスの誘導はp53/p21に依存しない、請求 項１２記載の組成物。
15. 【請求項１５】 前記アポトーシスの誘導は、薬剤耐性に依存しない、請
    求項１４記載の組成物。
16. 【請求項１６】 前記応答細胞がガン細胞である、請求項９記載の組成物
    。
17. 【請求項１７】 前記応答が生理活性分子を産生する免疫系の応答細胞の
    刺激である、請求項９記載の組成物。
18. 【請求項１８】 前記生理活性分子が、サイトカインおよび反応性酸素種
    からなる群から選択される、請求項１７記載の組成物。
19. 【請求項１９】 前記サイトカインは、ＩＬ-６、ＩＬ-１０およびＩＬ- １２からなる群から選択される、請求項１８記載の組成物。
20. 【請求項２０】 動物の応答細胞の応答を誘導する方法であって、 ａ．ミコバクテリアＤＮＡ（Ｂ-ＤＮＡ）、および ｂ．第１の薬学的に許容できるキャリア を含む組成物が、動物の応答細胞の応答を誘導するのに効果的な量で、投与を必
    要とする動物に投与される方法。
21. 【請求項２１】 前記Ｂ-ＤＮＡが、M.phleiＤＮＡ（Ｍ-ＤＮＡ）である 請求項２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記第１の薬学的に許容できるキャリアが、水性キャリ
    ア、非水性キャリアおよびミコバクテリアの細胞壁からなる群から選択される、
    請求項２０記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記第１の薬学的に許容できるキャリアが水性キャリア
    である、請求項２２記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記第１の薬学的に許容できるキャリアがミコバクテリ
    アの細胞壁である、請求項２２記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記ミコバクテリアの細胞壁がM.phleiの細胞壁である 、請求項２４記載の方法。
26. 【請求項２６】 第２の薬学的に許容できるキャリアをさらに含む、請求
    項２０記載の組成物。
27. 【請求項２７】 前記第２の薬学的に許容できるキャリアが、水性キャリ
    アおよび非水性キャリアからなる群から選択される、請求項２６記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記応答が、応答細胞の増殖の阻害、応答細胞における
    アポトーシスの誘導、および生理活性分子を産生する免疫系の応答細胞の刺激か
    らなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記応答が応答細胞の増殖の阻害である、請求項２８記
    載の方法。
30. 【請求項３０】 前記応答細胞がガン細胞である、請求項２９記載の方法
    。
31. 【請求項３１】 前記応答が、応答細胞におけるアポトーシスの誘導であ
    る、請求項２８記載の方法。
32. 【請求項３２】 前記アポトーシスの誘導はFasに依存しない、請求項３ １記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記アポトーシスの誘導はp53/p21に依存しない、請求 項３１記載の方法。
34. 【請求項３４】 前記アポトーシスの誘導は薬剤耐性に依存しない、請求
    項３１記載さの方法。
35. 【請求項３５】 前記応答細胞がガン細胞である、請求項３１記載の方法
    。
36. 【請求項３６】 前記応答が、生理活性分子を産生する免疫系の応答細胞
    の刺激である、請求項２８記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記生理活性分子が、サイトカインおよび反応性酸素種
    からなる群から選択される、請求項３６記載の方法。
38. 【請求項３８】 前記サイトカインは、ＩＬ-６、ＩＬ-１０およびＩＬ- １２からなる群から選択される、請求項３７記載の方法。
39. 【請求項３９】 動物の応答細胞におけるカスパース活性を誘導する方法
    であって、ａ．Ｍ-ＤＮＡ、および ｂ．M.phleiの細胞壁である第１の薬学的に受容できるキャリア を含む組成物が、動物の応答細胞におけるカスパース活性を誘導するのに効果的
    な量で、投与を必要とする動物に投与される方法。
40. 【請求項４０】 第２の薬学的に受容できるキャリアをさらに含む、請求
    項３９記載の方法。
41. 【請求項４１】 前記第２の薬学的に受容できるキャリアが、水性キャリ
    アおよび非水性キャリアからなる群から選択される、請求項４０記載の方法。
42. 【請求項４２】 前記応答細胞がガン細胞である、請求項３９記載の方法
    。
43. 【請求項４３】 動物のガンの治療のための組成物であって、 ａ．Ｍ-ＤＮＡ、および ｂ．第１の薬学的に受容できるキャリア を含む組成物を、ガンを治療するのに効果的な量で、治療を必要とする動物に投
    与することを含む組成物。
44. 【請求項４４】 動物におけるガンを治療するための方法であって、 ａ．Ｍ-ＤＮＡ、および ｃ．第１の薬学的に受容できるキャリア を含む組成物が、ガンを治療するのに効果的な量で、治療を必要とする動物に投
    与される方法。