【発明の詳細な説明】
腫瘍壊死因子レセプター-1誘導性アポトーシスおよびCD-95誘導性アポトーシス
の新規なインヒビターである、I-FLICE
発明の背景
発明の分野
本発明は、TNFR-1誘導性アポトーシスおよびCD-95誘導性アポトーシスの新規
なインヒビターに関する。より詳細には、ヒトI-FLICE（FLICE（FADD様ICE）の
インヒビター）ポリヌクレオチドをコードする単離された核酸分子が提供される
。I-FLICEポリペプチドもまた、I-FLICEポリペプチドを産生するためのベクター
、宿主細胞、および組換え方法と同様に提供される。本発明はさらに、I-FLICE
活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に
関する。アポトーシスと関連する疾患および障害を処置するための治療方法もま
た、提供される。
関連技術
細胞死の機構は、進化を通して保存され、そしてアクチベーター、インヒビタ
ー、およびエフェクターから構成される（Chinnaiyan，A.M.およびDixit，V.M.
，Curr．Blol．6:555-562(1996)）。細胞死経路のエフェクターアームは、カス
パーゼと称されるシステインアスパルギン酸特異的プロテアーゼの迅速に増殖す
るファミリーから構成される(Alnemri，E.S.ら、Cell 87:171(1996))。名称から
暗示されるように、これらのシステインプロテアーゼは、アスパラギン酸残基の
次で基質を切断する(Alnemri，E.S.ら、Cell 87:171(1996)；Walker，N.P.ら、C
ell 78:343-352(1994))。カスパーゼは、通常、単一のポリペプチドチモーゲン
として存在し、そしてアミノ末端プロドメイン、ならびに大きな触媒サブユニッ
トおよび小さな触媒サブユニットを含む(Wilson，K.P.ら、Nature 370:270-274(
1994)；Rotonda，J.ら、Nat．Struct．Biol．3:619-625(1996)；Fraser，A．お
よびEvan，G.，Cell 85:781-784(1996))。２鎖型活性酵素（大きな
サブユニットおよび小さなサブユニットから構成される）は、内部Asp残基での
タンパク質分解プロセシング後に得られる(Wilson，K.P.ら、Nature 370:270-27
4(1994)；Rotonda，J.ら、Nat．Struct．Biol．3:619-625(1996)；Fraser，A．
およびEvan，G.，Cell 85:781-784(1996))。このように、カスパーゼは、凝固(c
oagulation)カスケードにおいて観察されるチモーゲン活性化と類似の様式で、
互いに活性化し得る(Boldin，M.P.ら、Cell 85:805-815(1996))。レセプター会
合カスパーゼとしてのFLICEおよびMch4/FLICE2の同定は、細胞傷害性レセプター
CD-95およびTNFR-1による細胞死経路（death pathway）の活性化についての驚く
ほど直接的な機構を示唆した(Boldin，M.P.ら、Cell 85:805-815(1996)；Muzio
，M.ら、Cell 85:817-827(1996)；Vincenz，C.およびDixit，V.M.，J．Blol．Ch
em．272:6578-6583(1997)；Chinnaiyan，A.M.ら、Cell 81:505-512(1995))。活
性化の際に、両方のレセプターは、それらの細胞死誘導ドメイン(death domain)
を使用して、アダプター分子FADD（Fas会合細胞死誘導ドメインタンパク質）に
おける対応するドメインに結合する(Muzio，M.，ら、Cell 85:817-827(1996)；V
incenz，C.およびDixit，V.M.，J．Biol．Chem．272:6578-6583(1997)；Chinnai
yan，A.M.ら、Cell 81:505-512(1995))。Ｎ末端セグメントを欠くが、細胞死誘
導ドメインをなお保持するFADDのドミナントネガティブ型は、CD-95誘導性アポ
トーシスおよびTNFR-1誘導性アポトーシスの両方を強力に阻害する(Chinnaiyan
，A.M.ら、J．Biol．Chem．271:4961-4965(1996)；Muzio，M.ら、J．Biol．Chem
．272:2952-2956(1997))。細胞死経路で働くＮ末端セグメントの重要性を考慮し
て、Ｎ末端セグメントは、細胞死誘導エフェクタードメイン(DED)と命名されて
いる(Chinnaiyan，A.M.ら、J．Biol．Chem．271:4961-4965(1996))。
珍しいことに、DEDは、FLICEおよびMch4/FLICE2のプロドメイン内に存在し、
そして変異誘発研究は、FADDのDEDと、FLICEまたはMch4/FLICE2における対応す
るドメインとの間の同種親和性の相互作用が、CD-95およびTNFR-1シグナリング
複合体へのこれらのプロテアーゼの補充を担うことを示唆する(Muzio，M.ら、Ce
ll 85:817-827(1996)；Vincenz，C.およびDixit，V.M.，J．Biol．Chem．272:65
78−6583(1997)；Chinnaiyan，A.M.ら、Cell 81:505-512(1995)；Chinnaiy
an，A.M．ら、J．Biol．Chem．271:4961-4965(1996))。組み合わせると、これら
のデータは、FLICEおよびMch4/FLICE2が、アポトーシスを生じる下流のカスパー
ゼの大急ぎのタンパク質分解プロセシングを開始する先端の酵素であることと一
致する(Boldin，M.P.ら、Cell 85:805-815(1996)；Srinivasula，S.M.ら、PNAS
93:14486-14491(1996)；Fernandes-Alnemri，T．ら、PNAS 93:7464-7469(1996)
；Henkart，P.A.，Immunity 4:195-201(1996))。多くのウイルス遺伝子産物は、
感染した宿主中で存続するための手段として、CD-95媒介性殺傷およびTNFR-1媒
介性殺傷を拮抗する(Shen，Y.およびShenk，T.S.，Current Opinion in Genetic
s and Development 5:105-111(1995))。ポックスウイルスにコードされるセルピ
ンCrmAおよびバキュロウイルス遺伝子産物p35は、直接的なカスパーゼインヒビ
ターである(Walker，N.P.ら、Cell 78:343-352(1994))。対照的に、伝染性軟属
腫ウイルスタンパク質MC159およびウマヘルペスウイルスタンパク質E8は、FADD(
MC159)またはFLICE(E8)のいずれかに結合し、そしてレセプターシグナリング複
合体のアセンブリを崩壊し、それによって細胞死シグナルを阻止する、DED含有
デコイ分子をコードする(Hu，S.ら、J．Biol．Chem．272:9621-9624(1997)；Ber
tin，J．ら、PNAS 94:1172-1176(1997)；Thome，M．ら、Nature 386:527-521(19
97))。これらのウイルスインヒビターの存在は、機能的に等価な分子が、哺乳動
物ゲノムにおいてコードされるか否かの疑問を生じている。
治療的な目的のために（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関
節リウマチ、敗血症性ショック、敗血症、発作、CNS炎症、骨粗鬆症、虚血、再
灌流損傷、心臓血管疾患と関連する細胞死、多発性嚢胞腎疾患、心臓血管疾患に
おける内皮細胞のアポトーシス、変性(degenerative)肝疾患、MSおよび頭部損傷
傷害の処置において）アポトーシスを阻害するために有用である、本発明のポリ
ペプチドのような因子の必要性がある。従って、アポトーシスと関連する疾患お
よび障害を予防、改善、または治療することにおいて役割を果たし得る、アポト
ーシスのインヒビターであるこのような因子（例えば、本発明のI-FLICE-1ポリ
ペプチドおよびI-FLICE-2ポリペプチド）の同定および特徴付けの必要性がある
。
発明の要旨
本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または1997年５月15日にATCC
受託番号209038として細菌宿主中に寄託されたcDNAクローンによってコードされ
るアミノ酸配列を有するI-FLICE-1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含む、単離された核酸分子を提供する。本発明は、配列番号６に示されるアミ
ノ酸配列、または1997年５月15日にATCC受託番号209041として細菌宿主中に寄託
されたcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するI-FLICE-2ポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する
。
本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、および組
換えベクターを含む宿主細胞、ならびにそのようなベクターおよび宿主細胞を作
製する方法、および組換え技術によるI-FLICE-1ポリペプチドもしくはI-FLICE-2
ポリペプチドまたはI-FLICE-1ペプチドもしくはI-FLICE-2ペプチドの産生のため
にこのようなベクターおよび宿主細胞を使用するための方法に関する。
本発明はさらに、本明細書中に記載のポリヌクレオチドによってコードされる
アミノ酸配列を有する、単離されたI-FLICE-1ポリペプチドまたはI-FLICE-2ポリ
ペプチドを提供する。
本発明はさらに、I-FLICE-1発現またはI-FLICE-2発現における変化に起因した
、異常な細胞増殖から生じる疾患状態の診断または予後の間に有用な診断方法を
提供する。
本発明はまた、候補アゴニストまたはアンタゴニストが、I-FLICE-1ポリペプ
チドまたはI-FLICE-2ポリペプチドのいずれかの細胞活性を増強または阻害し得
るか否かを決定するためのスクリーニング方法を提供する。本方法は、I-FLICE-
1ポリペプチドまたはI-FLICE-2ポリペプチドの１つまたは両方を発現する細胞を
、候補化合物と接触させる工程、細胞応答をアッセイする工程、および細胞応答
を標準の細胞応答と比較する工程を包含し、ここで標準は、候補化合物の非存在
下でアッセイされ、これによって、標準を超えて増加した細胞応答は、候補化合
物がポリペプチド活性のアゴニストであることを示し、標準と比較して減少した
細胞応答は、候補化合物が活性のアンタゴニストであることを示す。
本発明のさらなる局面は、身体における増加したレベルのI-FLICE-1活性また
はI-FLICE-2活性を必要とする個体を処置するための方法に関し、この方法は、
そのような個体に、治療有効量の本発明の単離されたI-FLICE-1ポリペプチドも
しくはI-FLICE-2ポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物を投与する工
程を包含する。
本発明のなおさらなる局面は、身体における減少したレベルのI-FLICE-1活性
またはI-FLICE-2活性を必要とする個体を処置するための方法に関し、この方法
は、そのような個体に、治療有効量のI-FLICE-1アンタゴニストまたはI-FLICE-2
アンタゴニストを含む組成物を投与する工程を包含する。
図面の簡単な説明
図1A〜1Bは、I-FLICE-1(HSLAZ11)のヌクレオチド配列（配列番号１）および推
定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。このタンパク質は、480アミノ酸残基お
よび約55.3kDaの推定分子量を有する。
図２は、I-FLICE-1、I-FLICE-2、FLICE（配列番号３）、およびMch4（配列番
号４）のアミノ酸配列間の類似性の領域を示す。影付き（黒）は、コンセンサス
配列に正確に適合する残基を示す。
図３は、I-FLICE-1アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイ
ル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表
面確率を示す。「抗原性指数-Jameson-Wolf」グラフにおいて、図1A〜1B（配列
番号２）における、アミノ酸残基約41〜約92、約155〜約249、約332〜約447は、
I-FLICE-1タンパク質の示される非常に抗原性の高い領域に対応する。
図4A〜4Cは、I-FLICE-2(HCEBJ50)のヌクレオチド配列（配列番号５）および推
定アミノ酸配列（配列番号６）を示す。このタンパク質は、348アミノ酸残基お
よび約39.2kDaの推定分子量を有する。
図５は、I-FLICE-2アミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターン、およびコイ
ル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表
面確率を示す。「抗原性指数-Jameson-Wolf」グラフにおいて、図4A〜4C（配列
番号６）における、アミノ酸残基約62〜約136、約184〜約193、約205〜約341は
、I-FLICE-2タンパク質の示される非常に抗原性の高い領域に対応する。
図6A〜6Bは、アポトーシスのI-FLICE-1阻害を示す。I-FLICE-1の過剰発現はTN
FR-1誘導性細胞死（パネルＡ）、およびCD-95誘導性細胞死（パネルＢ）を弱め
た。293細胞（パネルＡ）または293-EBNA細胞（パネルＢ）を、レセプター構築
物pCMV β-ガラクトシダーゼとともに、示されたプラスミドで同時トランスフェ
クトした。示すデータは、計数された青色細胞の総数の関数としての気泡形成し
た（blebbing）青色細胞の百分率である。
詳細な説明
本発明は、それぞれ配列番号２あるいは配列番号６で示したアミノ酸配列を有
するである、I-FLICEI-1またはI-FLICE-2ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む核酸分子を提供する。それらのアミノ酸配列は、クローニングした
cDNAの配列決定により決定された。本発明のI-FLICE-1タンパク質は、FLICEおよ
びMch4（図２）（配列番号３および４）と配列相同性を有する。配列番号１で示
したヌクレオチド配列は、cDNAクローン（HSLAZ11）の配列決定により得られた
。このクローンは、1997年5月15日、アメリカンタイプカルチャーコレクション
、12301 Park Lawn Drive、Rockville、Maryland 20852に寄託し、受託番号2090
38が付与された。寄託されたクローンは、EcoRIおよびXhoI制限酵素切断部位を
用いて、pBluescript SK(-)プラスミド（Stratagene、La Jolla、CA）に挿入さ
れる。本発明のI-FLICE-2タンパク質は、FLICEおよびMch4（図２（配列番号３お
よび４））と配列相同性を有する。配列番号５に示したヌクレオチド配列は、cD
NAクローン（HCEBJ50）の配列決定により得られた。このクローンは、1997年5月
15日、アメリカンタイプカルチャーコレクション、12301 Park Lawn Drive、Roc
kville、Maryland 20852に寄託し、受託番号209041が付与された。寄託されたク
ローンは、EcoRIおよびXhoI制限酵素切断部位を用いて、pBluescript SK(-)プラ
スミド（Stratagene、La Jolla、CA）に挿入される。
核酸分子
他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定
されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied B
iosystems，Inc.からのModel 373）を用いて決定され、そして本明細書中で決定
されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、
上記のように決定されるDNA配列の翻訳によって推定された。従って、この自動
化アプローチによって決定された任意のDNA配列について当該分野において公知
のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを
含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるDNA
分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90％同一、よ
り代表的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9％同一である。実際の配列
は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のアプローチによっ
てさらに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列
と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌ
クレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定さ
れるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、配列決
定されるDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり、
このような挿入または欠失の点にて始まる。
配列番号１あるいは配列番号５中のヌクレオチド配列といった、本明細書で述
べる情報を用いることによって、I-FLICE-1あるいはI-FLICE-2ポリペプチドをコ
ードする本発明の核酸分子が、mRNAを出発物質として使ってcDNAをクローニング
する方法のような、標準的なクローニングおよびスクリーニングの手順を使って
得られ得る。発明の例示として、配列番号１に記載した核酸分子は、ヒト臍静脈
内皮細胞由来のcDNAライブラリー中に見い出された。この遺伝子は又、平滑筋由
来のcDNAライブラリー中でもまた同定された。配列番号１のI-FLICE-1 cDNAの決
定されたヌクレオチド配列は、約480アミノ酸残基および約55.3kDaの推定分子量
のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。配列番号２に
示すI-FLICE-1タンパク質は、FLICE（図２（配列番号３））と比較して全体で約
29%同一であり、約54%類似であった。
また発明の例示として、配列番号５に記載した核酸分子は、ヒト臍静脈内皮細
胞由来のcDNAライブラリー中に見い出された。この遺伝子はまた、小脳から単離
した脳の組織由来のcDNAライブラリー中で同定された。配列番号５のI-FLICE-2
cDNAの決定したヌクレオチド配列は、約348アミノ酸残基および約39kDaの推定分
子量のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。配列番号
６に示すI-FLICE-2タンパク質は、FLICE（図２（配列番号３））と比較して全体
で約28%同一であり、約54%類似であった。
加えて、I-FLICE-1およびI-FLICE-2は、それらの配列の大部分にわたってほと
んど同一である；しかしながら、I-FLICE-1はタンパク質のN-末端領域を含む付
加的なアミノ酸を有する。I-FLICE-1およびI-FLICE-2の両方のアミノ末端ドメイ
ンはFADDタンパク質(Hu，S.ら、J．Biol．Chem．272:17255-17257(1997);Irmler
，M.ら、Nature 388:190-195(1997))のDEDドメインと有意な配列の類似性を示す
。このドメインを通してFLICEタンパク質とdeathレセプターとが相互作用する。
I-FLICE-2のアミノ末端ドメインは、１つのみのDED/FADD相同性ドメインからな
る（配列番号６の1付近から75付近までのアミノ酸残基を含む）。一方、I-FLICE
-1のアミノ末端ドメインで見られる付加的なアミノ酸は２つめのDED/FADD相同性
ドメインを提供するようである（配列番号2の1付近から75付近までのアミノ酸残
基および91付近から171付近までのアミノ酸残基を含む）。I-FLICE-1およびI-FL
ICE-2の両方のカルボキシル末端ドメインはまた、システインプロテアーゼのICE
/CED-3ファミリーの活性サブユニットドメインに対する有意な配列の類似性をも
含む（配列番号2の172付近から375付近までのアミノ酸残基および376付近から48
0付近までのアミノ酸残基；配列番号６の76付近から252付近までのアミノ酸残基
および253付近から348付近までのアミノ酸残基を含む）。I-FLICE-1およびI-FLI
CE-2のいずれも触媒的なシステインを含まない。このシステインは、通常は全て
の既知のカスパーゼ（caspases）に存在する、保存性のペンタペプチドQACRGあ
るいはQACQGモチーフに組み込まれている。むしろ、I-FLICE-1およびI-FLICE-2
の両方はペンタペプチド配列QNYVV（配列番号2の358付近から362付近までのアミ
ノ酸残基および配列番号６の244付近から248付近までのアミノ酸残基）。さらに
、全てのカスパーゼにおいて見い出される、基質結合ポケットを形成する７つの
保存性残基のうち３つのみが、I-FLICE-1およびI-FLICE-2に存在する。触媒およ
び基質結合に関与する、キー（key）残基の保存性を欠いているために、I-FLICE
-1およびI-FLICE-2は、システインプロテアーゼではなく、そして基質結合能が
無
く、従って、ドミナントネガティブな阻害機能をこれらのタンパク質に与えるこ
とが結論付けられ得る。I-FLICE-1およびI-FLICE-2は、アポトーシスを阻害し得
る触媒的に不活性なカスパーゼの最初の例である。
示されるように、本発明の核酸分子は、RNA（例えば、mRNA）の形態、またはD
NA（例えば、cDNA、およびクローニングによって得られるか、または合成的に生
成されるゲノムDNAを含む）の形態で存在し得る。DNAは、二本鎖または一本鎖で
あり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であ
り得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）であり得る。
「単離された」核酸分子によって、ネイティブな環境から取り出された核酸分
子（DNAまたはRNA）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分
子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離されたDNA分子
のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えDNA分子、または溶
液中の（部分的または実質的に）精製されたDNA分子を含む。単離されたRNA分子
は、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明
に従う単離された核酸分子は、そのような合成的に生成された分子をさらに含む
。
本発明の単離された核酸分子は、配列番号１または配列番号５に示されたオー
プンリーディングフレーム（ORF）を含むDNA分子；I-FLICE-1またはI-FLICE-2タ
ンパク質のコード配列を含むDNA分子；および、上で記述した配列と実質的に異
なるが、遺伝コードの縮重によりやはりI-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質を
コードする配列を含むDNA分子を含む。当然ながら、遺伝コードは当該分野には
周知である。このように、当業者にとっては、そのような縮重した改変体を生成
することは日常的なことである。
加えて、本発明は、配列番号１の広範な部分に関連したヌクレオチド配列を有
する、核酸分子を提供する。それらの配列は、次に示すような、関連するcDNAク
ローンより決定された：HOSBY07R（配列番号23）、HSAVA13R（配列番号24）、HL
FBD88R（配列番号25）、HOSAH65R（配列番号26）、HUVBS23R（配列番号27）、HH
FFJ01RA（配列番号28）、HUVBL22R（配列番号29）およびHUVBX15R（配列番号30
）。
本発明はまた、配列番号５（I-FLICE-2）の広範な部分に関連したヌクレオチ
ド配列を有する、核酸分子を提供する。それらの配列は、次に示すような、関連
するcDNAクローンより決定された：HTNBE58R（配列番号31）、HTPBE58R（配列番
号32）、HOSBY07R（配列番号23）、HSAVA13R（配列番号24）、HLFBD88R（配列番
号25）、HOSAH65R（配列番号26）、およびHHFFJ01RA（配列番号28）。
別の局面において、本発明は、ATCC寄託番号209038（寄託日1997年5月15日）
で寄託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによってコードされているア
ミノ酸配列を有するI-FLICE-1ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子
を提供する。本発明はまた、ATCC寄託番号209041（寄託日1997年5月15日）で寄
託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによってコードされているアミノ
酸配列を有するI-FLICE-2ポリペプチドをコードする、単離された核酸分子を提
供する。さらなる実施態様においては、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチド
、またはN末端のメチオニンを欠く全長のI-FLICEポリペプチドをコードする、核
酸分子が提供される。本発明はまた、配列番号１または配列番号５で示したヌク
レオチド配列、あるいは、上で記述した寄託されたクローン中に含まれるI-FLIC
E-1またはI-FLICE-2 cDNAのヌクレオチド配列、あるいは上の配列のいずれかに
相補的な配列を有する核酸分子を有する、単離された核酸分子を提供する。この
ような単離された分子、特にDNA分子は、染色体とのin situハイブリダイゼーシ
ョンによる、遺伝子マッピングのためのプローブとして、および、例えばノーザ
ンブロット分析によって、ヒト組織におけるI-FLICE-1またはI-FLICE-2遺伝子の
発現を検出するためのプローブとして有用である。
本発明はさらに、本明細書中に記載されている単離された核酸分子のフラグメ
ントにも関する。寄託したcDNAのヌクレオチド配列あるいは配列番号１または配
列番号５で示したヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメント
によって、本明細書で述べる診断プローブおよびプライマーとして有用な、少な
くとも約15ヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも約20ヌクレオチド、
さらにより好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド、さらに一層より好ましくは
少なくとも約40ヌクレオチドの長さのフラグメントが意図される。当然ながら、
配列番号１に示す配列の長さにおいて、50、100、150、200、250、300、350、40
0、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、11
00、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、17
00、1750、1800、1850、1900、1950、2000あるいは2016ヌクレオチドのより長い
DNAフラグメントは、本発明により、ATCC寄託番号209038として寄託されたプラ
スミドに含まれるcDNAクローンのヌクレオチド配列、または配列番号１に示した
ようなヌクレオチド配列の大部分に、全てではないにしても対応するフラグメン
トであるように、、また有用である。同様に、配列番号５に示す配列の長さにお
いて、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、70
0、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、13
50、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、19
50、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500ある
いは2547ヌクレオチドのより長いDNAフラグメントは、本発明により、ATCC寄託
番号209041として寄託されたプラスミドに含まれるcDNAクローンのヌクレオチド
配列、または配列番号５に示したようなヌクレオチド配列の大部分に、全てでは
ないにしても対応するフラグメントであるように、また有用である。例えば、少
なくとも20ヌクレオチド長のフラグメントにより、寄託したcDNAのヌクレオチド
配列あるいは配列番号１または配列番号５に示したヌクレオチド配列由来の、20
あるいはそれ以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。
より特定の実施態様では、本発明の核酸分子は次のGenbank Accession Report
sの１つまたはそれ以上において同定された配列、核酸分子（例えば、クローン
）、あるいは核酸挿入物を含まない：AA001257、AA151642、AA149562、C05730、
AA565691、AA467756、D83882、AA002262、AA115793、AA467995、AA115792、AA46
7938、W60406、AA358042、AA468056、W23795、AA358043、T93307、AA453850、AA
379905、AA296229、H15978、AA501289、AA296309、AA296174、T30922、T48754、
AA453766、C05795、AA198928、N94588、H15052、Z42895、F13176、W52946、AA55
8404、AA070614、AA613966、AA525331、AA663074、AA135811、AA526099、AA3029
78、H68343、AA610255、AA229005、T05118、T30864、AA302968、またはAA364006
。これらの全ては、参考として、本明細書中に援用される。
本発明の好ましい核酸フラグメントは、1-FLICE-1タンパク質のエピトープ保
有部分をコードする核酸分子を含む。特に、本発明のこのような核酸フラグメン
トは、次のようなポリペプチドをコードする核酸分子を含む：配列番号２の41付
近から92付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の155付近から249
付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２の332付近から474付近のア
ミノ酸残基を含むポリペプチド。発明者らは、上のポリペプチドフラグメントが
I-FLICE-1タンパク質の抗原領域であることを決定した。他のこのような1-FLICE
-1タンパク質のエピトープ保有部分を決定する方法は、下で詳細に記述する。
本発明の好ましい核酸フラグメントは、1-FLICE-2タンパク質のエピトープ保
有部分をコードする核酸分子を含む。特に、本発明のこのような核酸フラグメン
トは、次のポリペプチドをコードする核酸分子を含む：配列番号６の62付近から
136付近のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６の184付近から193付近
のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号６の205付近から341付近のアミノ
酸残基を含むポリペプチド。発明者らは、上のポリペプチドフラグメントがI-FL
ICE-2タンパク質の抗原領域であることを決定した。他のこのような1-FLICE-2タ
ンパク質のエピトープ保有部分を決定する方法は、下で詳細に記述する。
別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ATCC受託番号第209038号または第20
9041号に含まれるcDNAクローン）中のポリヌクレオチドの部分にハイブリダイズ
するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェン
トなハイブリダイゼーション条件」によって、以下：50％ホルムアミド、５×SS
C（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、
５×デンハート液、10％硫酸デキストラン、および20g/mlの変性剪断サケ精子DN
A、を含む溶液中で42℃にて一晩のインキュベーション、続く約65℃にて0.1×SS
C中でフィルターを洗浄することが意図される。
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好まし
くは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさらに
より好ましくは約30〜70ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド（DNAまたはR
NAのいずれか）が意図される。これらは、以上、および以下でより詳細に考察さ
れるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの部分により、参照ポリヌ
クレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたcDNA、または配列番号1ま
たは５に示されるようなヌクレオチド配列）由来の20以上の連続したヌクレオチ
ドが意図される。当然のことながら、ポリA配列（例えば、配列番号１に示したI
-FLICE-1 cDNAまたは配列番号５に示したI-FLICE-2 cDNAの3'末端ポリ(A)トラク
ト）にのみ、またはT（またはU）残基の相補的なストレッチにのみハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の部分にハイブリダイズさせるために
使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜならば、このようなポ
リヌクレオチドは、ポリ(A)ストレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子
（例えば、ほとんど任意の二本鎖cDNAクローン）にハイブリダイズするからであ
る。
示されるように、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドをコードする本発明
の核酸分子は、以下を含み得るが、これらに限定されない：それ自体によって、
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；成熟ポリペプチドのコード
配列および付加的配列（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列
またはプレプロタンパク質配列のような分泌配列をコードする配列）；付加的非
コード配列を伴う、上記の付加的コード配列を含むかまたは含まない、ポリペプ
チドのコード配列で、付加的非コード配列は、例えば、イントロンおよび非コー
ド5'および3'配列（例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナルを含
む、転写、mRNAプロセシングにおいて役割（例えば、リボソーム結合およびmRNA
の安定性）を担う、転写された非翻訳配列を含むが、これらに限定されない）；
さらなる機能性を提供するような付加的アミノ酸をコードする付加的コード配列
。従って、ポリペプチドをコードする配列は、融合されたポリペプチドの精製を
容易にするペプチドをコードする配列のような、マーカー配列と融合され得る。
本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は
、とりわけ、pQEベクター（Qiagen,Inc.）中に提供されるタグのような、ヘキサ
−ヒスチジンペプチドである。これらの多くは市販されている。例えば、Gentz
ら、Proc．Natl．Acad．Scl．USA 86:821-824(1989)において記載されるように
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグ
は、
インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する、精製のた
めに有用な別のペプチドであり、それは、Wilsonら、Cell 37:767-778(1984)に
よって記載されている。以下で考察されるように、他のそのような融合タンパク
質は、Ｎ末端またはＣ末端にてFcに融合されたI-FLICE-1またはI-FLICE-2を含む
。
本発明は、さらに、I-FLICE-1またはI-FLICE-2のタンパク質の部分、アナログ
、または誘導体をコードする、本発明の核酸分子の改変体に関する。改変体は、
天然の対立遺伝子改変体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子改変体」によ
って、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形
態の１つが意図される。Genes II，Lewin，B.編、John Wiley&Sons，New York(1
985)。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成
され得る。
このような改変体には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加により産生さ
れる改変体が含まれる。この置換、欠失、または付加には１つ以上のヌクレオチ
ドが含まれ得る。改変体は、コード領域、非コード領域、または両方において変
化され得る。コード領域における変化は、保存的または非保存的アミノ酸置換、
欠失、または付加を生じ得る。これらの間で特に好ましいのは、サイレントな置
換、付加、および欠失であり、これらはI-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質、
またはそれらの部分の特性および活性を変化させない。この点に関してまた特に
好ましいのは、保存的置換である。
本発明のさらなる実施態様には、以下からなる群から選択されるポリヌクレオ
チドに、少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる：（ａ）
配列番号２中のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｂ）配列番号２中のアミノ酸配列を有するがN-末端のメチオニンが欠けて
いるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ATCC受託番号209038に
含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）、または
（ｃ）中のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
本発明のさらなる実施態様には、以下からなる群から選択されるポリヌクレオ
チドに、少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる：（ａ）
配列番号６中のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｂ）配列番号６中のアミノ酸配列を有するがN-末端のメチオニンが欠けて
いるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ATCC受託番号209041に
含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列；あるいは（ｄ）上記の（ａ）、（ｂ）、または
（ｃ）中のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
本発明のさらなる実施態様には、以下からなる群から選択されるポリヌクレオ
チドに、少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる：（ａ）
配列番号２中の1付近から75付近のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列；（ｂ）配列番号２中の91付近から171付近のアミノ酸を含むポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２中の172付近から3
75付近のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配
列番号２中の376付近から480付近のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列；（ｅ）配列番号６中の1付近から75付近のアミノ酸を含むポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号６中の76付近から252
付近のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列
番号６中の253付近から348付近のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列；または（ｈ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、
（ｆ）または（ｇ）中のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配
列。
I-FLICEポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に少なくとも、例え
ば、95％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、そのポ
リヌクレオチド配列が、I-FLICEポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配
列の各100ヌクレオチド毎に５つまでの点変異を含み得ることを除いて、そのポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることが意図される。
言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95％同一のヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列において５％までのヌ
クレオチドが、欠失されるかもしくは別のヌクレオチドで置換され得、または参
照配列における総ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが参照配列に挿
入され得る。これらの参照配列の変異は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位置
もしくは３’末端位置で、または参照配列のヌクレオチド間で個々に、もしくは
参照配列内で１つ以上の隣接した基内のいずれかで散在して、これらの末端位置
の間のどこかで起こり得る。
実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１もしくは配列
番号５に示されるヌクレオチド配列、または寄託されたcDNAクローンのヌクレオ
チド配列に対して、少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一である
かどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix
用バージョン８、Genetics Computer Group，University Research Park，575 S
cience Drive，Madison，WI 53711）のような公知のコンピュータープログラム
を使用して従来通りに決定され得る。BestfitはSmithおよびWaterman（Advances
in Applied Mathematics 2:482-489(1981)）の局所的相同性アルゴリズムを用
いて、２つの配列間の相同性が最も良いセグメントを見出す。特定の配列が、本
発明の参照配列に、例えば、95％同一であるかどうかを決定するために、Bestfi
tまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然のこと
ながら、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算
され、そして参照配列内のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャ
ップが許容されるようにパラメーターが設定される。
本出願は、I-FLICE活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関係なく
、配列番号１もしくは配列番号５に示される核酸配列、または寄託されたcDNAの
核酸配列と少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一である核酸分子
に関する。これは、特定の核酸分子がI-FLICE活性を有するポリペプチドをコー
ドしない場合でさえ、当業者は、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリ
ダイゼーションプローブ、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとし
て使用するかをなお知っているからである。I-FLICE活性を有するポリペプチド
をコードしない、本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ、(1)cDNAライブ
ラ
リーにおけるI-FLICE-1遺伝子もしくはI-FLICE-2遺伝子またはその対立遺伝子改
変体を単離すること；(2)Vermaら，Human Chromosomes:A Manual of Basic Tech
niques，Pergamon Press，New York(1988)に記載のような、I-FLICE-1遺伝子も
しくはI-FLICE-2遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展
開物に対するインサイチュハイブリダイゼーション(例えば、「FISH」)；および
、（３）特定の組織におけるI-FLICE-1 mRNAもしくはI-FLICE-2 mRNAの発現を検
出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。
しかし、配列番号１もしくは配列番号５に示される核酸配列、または実際にI-
FLICEタンパク質活性を有するポリペプチドをコードする寄託されたcDNAの核酸
配列に、少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一な配列を有する核
酸分子が好ましい。「I-FLICE活性を有するポリペプチド」によって、特定の生
物学的アッセイにおいて、I-FLICE-1活性またはI-FLICE-2活性を示すポリペプチ
ドが意図される。例えば、I-FLICE-1タンパク質活性またはI-FLICE-2タンパク質
活性は、実施例６に記載されるように、細胞死アッセイを用いて測定され得る。
もちろん、遺伝コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配列
、または配列番号１もしくは配列番号５に示される核酸配列に少なくとも95％、
96％、97％、98％、または99％同一である配列を有する多数の核酸分子が「I-FL
ICE活性を有するポリペプチド」をコードすることを直ちに認識する。実際に、
これらのヌクレオチド配列の縮重改変体の全てが同じポリペプチドをコードする
ので、このことは、上記の比較アッセイを行うことすらなく、当業者に明らかで
ある。縮重改変体でないそのような核酸分子について、妥当な数がまたI-FLICE
活性を有するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。
これは、当業者が、タンパク質の機能に有意に影響する可能性が低いか、または
その可能性がないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸
の第二の脂肪族アミノ酸での置換）を十分に知っているからである。
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をいかにして行うかに関するガ
イダンスが、Bowie,J.U.ら、「Deciphering the Message in Protein Sequences
:Tolerance to Amino Acid Substitutions」，Science 247:1306-1310(1990)に
おいて提供され、ここで筆者らは、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど
寛容性であることを示している。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクター
で遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるI-FLICE-1ポリペプチド
もしくはI-FLICE-2ポリペプチドまたはそのフラグメントの産生に関する。
ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベクタ
ーに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈澱物
のような沈澱物中か、または荷電した脂質との複合体中で導入される。ベクター
がウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイン
ビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
DNAインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファー
ジλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、およびtacプ
ロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウ
イルスLTRのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ
ロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終
結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含む
。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳され
るべきポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを含み、そして終わりに適切に位置
される終止コドン(UAA、UGA、またはUAG)を含む。
示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、またはネオマイシン耐性、ならびにE.coliおよび他の細菌に
おける培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺
伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、E.co
li細胞、Streptomyces細胞、およびSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（
例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2細胞およびSpodoptera Sf
9細胞）；動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、およびBowes黒色腫細胞）；な
らびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のた
めの適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60、およびpQE-9
（Qiagenから入手可能）;pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベク
ター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）;ならびにpt
rc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）が含ま
れる。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、お
よびpSG（Stratageneから入手可能）;ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL
（Pharmaciaから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明
らかである。
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE
-デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によってもた
らされ得る。このような方法は、Davisら，Basic Methods In Molecular Biolog
y(1986)のような多くの標準的実験室マニュアルに記載されている。
ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そし
て分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば、さ
らなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞における、精製の間の、
または続く取り扱いおよび保存の間の、安定性および持続性を改善するために、
ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にす
るためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終
調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改
善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付
加は、当該分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合
タンパク質は、タンパク質の可溶化のために有用な免疫グロブリン由来の異種領
域を含む。例えば、EP-A-0 464 533（カナダ対応出願第2045869号）は、別のヒ
トタンパク質、またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域の種々の
部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分
は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善され
た薬物動態学的特性を生じる(EP-A 0232 262)。一方、いくつかの使用について
、
融合タンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、そして精製
された後に、Fc部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Fc部分が、治療お
よび診断における使用に対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパ
ク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合）である。薬物探索において
、例えばhIL-5レセプターのようなヒトタンパク質は、hIL-5のアンタゴニストを
同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でFc部分と融合されて
いる。D.Bennettら，Journal of Molecular Recognition Vol.8:52-58(1995)、
およびK.Johansonら，The Journal of Biological Chemistry、Vol.270、No.16:
9459-9471(1995)を参照のこと。
I-FLICE-1タンパク質またはI-FLICE-2タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱ま
たはエタノール沈澱、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー
、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養
物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラ
フィー（「HPLC」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは、天然
の供絵源からの精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核
生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳
動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手
順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化
されていても、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポ
リペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変され
た開始メチオニン残基を含み得る。
I-FLICE-1ポリペプチドおよびフラグメントならびにI-FLICE-2ポリペプチドおよ
びフラグメント
本発明はさらに、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列、または
配列番号２もしくは６のアミノ酸配列を有する、単離されたI-FLICE-1ポリペプ
チドまたはI-FLICE-2ポリペプチド、あるいは上記ポリペプチドの一部を含むペ
プチドまたはポリペプチドを提供する。
I-FLICE-1ポリペプチドまたはI-FLICE-2ポリペプチドのいくつかのアミノ酸配
列が、タンパク質の構造または機能に有意な影響を与えることなく、変更され得
ることが当該分野において認識される。配列におけるこのような差異が意図され
る場合、タンパク質上に、活性を決定する重要な領域が存在することが思い出さ
れるべきである。
従って、本発明は、実質的なI-FLICE-1ポリペプチド活性もしくはI-FLICE-2ポ
リペプチド活性を示すI-FLICE-1ポリペプチドもしくはI-FLICE-2ポリペプチドの
改変体、または以下で議論されるタンパク質部分のようなI-FLICE-1タンパク質
またはI-FLICE-2タンパク質の領域を含むI-FLICE-1ポリペプチドもしくはI-FLIC
E-2ポリペプチドの改変体をさらに含む。このような変異体は、欠失、挿入、逆
位、反復、および型置換を含む。上記のように、どのアミノ酸の変化が表現型的
にサイレントであるようであるかに関するガイダンスは、Bowie,J.U.ら、「Deci
phering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substit
utions」，Science 247:1306-1310(1990)において見出され得る。
従って、配列番号２または配列番号６のポリペプチドのフラグメント、誘導体
またはアナログ、あるいは寄託されたcDNAによりコードされるポリペプチドのフ
ラグメント、誘導体またはアナログは、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存的な
アミノ酸残基または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基
）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコ
ードされるものであってもよいしそうでなくともよいもの、あるいは(ii)１つ以
上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポ
リペプチドの半減期を増加させるための化合物（例えば、ポリエチレングリコー
ル）のような別の化合物と融合したもの、あるいは(iv)さらなるアミノ酸が成熟
ポリペプチド（例えば、IgG Fc融合領域ペプチド配列）、またはリーダー配列も
しくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に
ついて使用される配列と融合したものであり得る。このようなフラグメント、誘
導体およびアナログは、本明細書の教示より当業者の範囲内であると考えられる
。
特に興味深いのは、荷電したアミノ酸の、別の荷電したアミノ酸、および中性
のアミノ酸、または負に荷電したアミノ酸との置換である。後者は、結果として
、正の電荷が減少したタンパク質を生じてI-FLICE-1タンパク質またはI-FLICE-2
タンパク質の特徴を改善した。凝集の防止は非常に望ましい。タンパク質の凝集
は活性を減少させるだけではなく、凝集体は免疫原性であり得ることから薬学的
処方物を調製する場合にも問題であり得る(Pinckardら、Clin.Exp.Immunol.2:33
1-340(1967);Robbinsら、Diabetes 36:838-845(1987);Clelandら、Crit.Rev.The
rapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377(1993))。
アミノ酸の置換はまた、細胞表面のレセプターに対する結合の選択性を変化さ
せ得る。Ostadeら、Nature 361:266-268(1993)は、TNF-レセプターの２つの公知
の型の１つのみに対するTNF-αの選択的な結合を生じる特定の変異を記載する。
従って、本発明のI-FLICE-1またはI-FLICE-2は、天然の変異もしくは人工操作の
いずれかに由来する１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含み得る。
示されるように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意には影響しない保存
的アミノ酸置換のような、重要でない性質の変化が好ましい（表１を参照のこと
）。
表１．保存的アミノ酸置換
当然、当業者の行うアミノ酸置換の数は、以上および以下に記載された因子を
含む、多くの因子に依存する。概して、いずれかの所定のI-FLICE-1ポリペプチ
ドもしくはI-FLICE-2ポリペプチド、またはその変異体についての置換の数は、
目的に依存して、50、40、30、20、10、５、または３より多くではない。
機能に必須である、本発明のI-FLICE-1タンパク質またはI-FLICE-2タンパク質
におけるアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニン走査型変異誘発のよう
な当該分野に公知の方法により同定され得る（CunninghamおよびWells,Science
244:1081-1085（1989））。後者の手順は、分子内の全ての残基に単一のアラニ
ン変異を導入する。リガンド相互作用に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴
、または光親和性標識のような構造分析により決定され得る（Smithら、J.Mol.B
iol．224:899-904（1992）およびde Vosら、Science 255:306-312（1992））。
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供される。「単離さ
れたポリペプチド」によって、そのネイティブな環境から取り出されたポリペプ
チドが意図される。従って、組換え宿主細胞内で産生されるおよび／または含ま
れるポリペプチドは、本発明の目的のために単離されているとみなされる。組換
え宿主細胞から部分的または実質的に精製されたポリペプチドもまた、「単離さ
れたポリペプチド」として意図される。例えば、組換え的に産生されたバージョ
ンのI-FLICE-1ポリペプチドまたはI-FLICE-2ポリペプチドは、SmithおよびJohns
on、Gene 67:31-40(1988)に記載された一工程方法により実質的に精製され得る
。
本発明のポリペプチドは、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプチド
；配列番号２におけるアミノ酸約１〜約480を含むポリペプチド；配列番号２に
おけるアミノ酸約２〜約480を含むポリペプチド；ならびに上記のポリペプチド
に少なくとも95％同一、なおさらに好ましくは少なくとも96％、97％、98％、ま
たは99％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた少なくとも30アミノ酸を、
より好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を
も含む。
本発明のポリペプチドはまた、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプ
チド；配列番号６におけるアミノ酸約１〜約348を含むポリペプチド；配列番号
６におけるアミノ酸約２〜約348を含むポリペプチド；ならびに上記のポリペプ
チドに少なくとも95％同一、なおさらに好ましくは少なくとも96％、97％、98％
、または99％同一であるポリペプチドを含み、そしてまた少なくとも30アミノ酸
を、より好ましくは少なくとも50アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部
分をも含む。
本発明のポリペプチドは、配列番号２におけるアミノ酸約１〜約75；配列番号
２におけるアミノ酸約91〜約171；配列番号２におけるアミノ酸約172〜約375；
配列番号２におけるアミノ酸約376〜約480；配列番号６におけるアミノ酸約１〜
約75；配列番号６におけるアミノ酸約76〜約252；配列番号６におけるアミノ酸
約253〜約348を含むポリペプチド；ならびに上記のポリペプチドに少なくとも95
％同一、なおさらに好ましくは少なくとも96％、97％、98％、または99％同一で
あるポリペプチドをさらに含み、そしてまた少なくとも30アミノ酸を、より好ま
しくは少なくとも50アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分をも含む。
I-FLICE-1ポリペプチドまたはI-FLICE-2ポリペプチドの参照アミノ酸配列に少
なくとも、例えば、95％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、
そのポリペプチド配列が、I-FLICE-1ポリペプチドまたはI-FLICE-2ポリペプチド
の参照アミノ酸の各100アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを
除いて、そのポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図さ
れる。言い換えれば、参照アミノ酸配列に対して少なくとも95％同一のアミノ酸
配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列においてアミノ酸残基の５％
までが、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得、または参照配列にお
ける総アミノ酸残基の５％までの多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。こ
れらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキ
シ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは参照配列内で１つ以
上の隣接した基内のいずれかに散在した、これらの末端位置の間のどこかで起こ
り得る。
実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２もしくは
配列番号６に示されるアミノ酸配列、または寄託されたcDNAクローンによりコー
ドされるアミノ酸配列に対して、少なくとも95％、96％、97％、98％、または99
％同一であるかどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis P
ackage，Unix用バージョン８、Genetics Computer Group，University Research
Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711）のような公知のコンピュータ
ープログラムを使用して従来通りに決定され得る。特定の配列が、例えば、本発
明の参照配列に95％同一であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは任意
の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然のことながら、同一
性のパーセンテージが参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照
配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容される
ようにパラメーターが設定される。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるSDS-PAGEゲルにおいて
または分子ふるいゲルろ過において分子量マーカーとして有用である。
別の局面において、本発明は、ペプチドまたはポリペプチドを提供し、これは
、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を含有する。このポリペプチド部
分
のエピトープは、本明細書中に記載されるポリペプチドの免疫原性または抗原性
エピトープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である
とき、抗体応答を誘発するタンパク質の一部分として定義される。他方、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」として定義される。
タンパク質の免疫原性エピトープ数は一般的に、抗原性エピトープ数よりも少な
い。例として、Geysenら,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3998-4002(1983)参照
のこと。
抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が
結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、その部分的に模倣されたタンパク質と
反応する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Su
tcliffe,J.G.,Shinnick,T.M.,Green,N.およびLearner,R.A.(1983)「Antibodies
that react with predetermined sites on proteins」,Science 219:660-666を
参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次
配列で頻繁に示され、そして簡単な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、
そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ
）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。
それゆえ本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発
明のポリペプチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起
するために有用である。例えば、Wilsonら、Cell 37:767-778(1984)の777頁を参
照のこと。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、従って、モノ
クローナル抗体を包含する抗体産生に有用であり、これらの抗体は本発明のポリ
ペプチドに特的に結合する。例として、Wilsonら,Cell:37:767-778(1984)の777
ページ参照のこと。
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは、
少なくとも７個の、さらにこのましくは少なくとも９個、そして最も好ましくは
少なくとも約15から約30個の間のアミノ酸の配列を含み、これらは本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列に含まれる。
I-FLICE-1特異的抗体の産生のために使用され得る抗原性ポリペプチドまたは
ペプチドの制限されない実施例として、以下のものが含まれる：配列番号２にお
ける約41〜約92までのアミノ酸残基を含有するポリペプチド；配列番号２におけ
る約155〜約249までのアミノ酸残基を含有するポリペプチド；配列番号２におけ
る約332〜約474までのアミノ酸残基を含有するポリペプチド。上記されるように
、本発明者らは、上記ポリペプチドフラグメントが、I-FLICE-1タンパク質の抗
原性領域であると決定した。
I-FLICE-2特異的抗体の産生のために使用され得る抗原性ポリペプチドまたは
ペプチドの制限されない実施例として、以下のものが含まれる：配列番号６にお
ける約62から約136までのアミノ酸残基を含有するポリペプチド；配列番号６に
おける約184から約193までのアミノ酸残基を含有するポリペプチド；配列番号６
における約205から約341までのアミノ酸残基を含有するポリペプチド。本発明者
らは、上記ポリペプチドフラグメントが、I-FLICE-2タンパク質の抗原性領域で
あると決定した。
本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
より産生され得る。Houghten,R.A(1985)General method for the rapid solid-p
hase synthesis of large numbers of peptides:specificity of antigen-antib
ody interaction at the level of individual amino acids.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 82:5131-5135。この「Simultaneous Multiple Peptide Synthesis(SMPS)
」プロセスは、Houghtenらの米国特許第4,631,211号(1986)でさらに記載される
。
当業者が理解するように、上記の本発明のI-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプ
チドおよびそのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（IgG）の定常
ドメインの一部と結合され得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タン
パク質は、精製を促進し、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例え
ば、ヒトCD4-ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリ
ンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質につ
いて示されている（EPA 394,827；Trauneckerら、Nature 331:84-86（1988））
。IgG部分によるジスルフィド結合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、
単
量体I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よ
りも、他の分子の結合および中和において効率的であり得る（Fountoulakisら、
J．Biochem．270:3958-3964（1995））。
疾患の診断および予後
異常な細胞生存に関連する特定の疾患状態を伴う哺乳動物の特定の組織は、対
応する「標準」動物（すなわち、疾患状態を有しない同じ種の哺乳動物）と比較
した場合、I-FLICE-1またはI-FLICE-2レベルおよびI-FLICE-1またはI-FLICE-2を
コードするmRNAレベルにおいて有意な変化を表すと考えられる。したがって、本
発明は、哺乳動物のそのような状態を検出するために有用である。好ましい動物
としては、サル（monkey）、尾なしサル（ape）、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウ
マ、ウサギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのはヒトである。
さらに、疾患状熊を伴う哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿
および脊髄液）において、疾患状態を有しない同種の哺乳動物由来の同様の液体
と比較した場合、増強したレベルのI-FLICE-1またはI-FLICE-2が検出され得ると
考えられる。したがって、本発明は、疾患状態の診断の間に有用な診断方法を提
供し、この方法は、哺乳動物細胞または体液中のI-FLICE-1またはI-FLICE-2をコ
ードする遺伝子の発現レベルをアッセイする工程、そしてその遺伝子発現レベル
を標準のI-FLICE-1またはI-FLICE-2と比較し、これにより標準をに対する遺伝子
発現レベルの増減が、異常な細胞生存に関連する特定の疾患状態のの指標となる
工程を含む。
本発明のI-FLICE-1またはI-FLICE-2を含む疾患状態の診断が、すでに従来方法
に従って実施されたとき、本発明は、予後の指標として有用である。予後指標に
より、有意に異常なI-FLICE-1またはI-FLICE-2遺伝子発現レベルを示す患者は、
より低いレベルで遺伝子を発現する患者に比較して、より悪い臨床結果を経験す
る。
「I-FLICE-1またはI-FLICE-2をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする
」ことによって、I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質のレベル、あるいはI-FL
ICE-1またはI-FLICE-2タンパク質をコードするmRNAのレベルを、第一の生物学
的サンプルで、直接的（例えば、絶対タンパク質レベルまたはmRNAレベルの測定
または推定によって）または相対的（例えば、第二の生物学的サンプルのI-FLIC
E-1またはI-FLICE-2タンパク質レベルあるいはmRNAレベルとの比較による）に、
定性的または定量的に測定または推定することを意図する。
好ましくは、第一の生物学的サンプル中のI-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク
質レベルあるいはmRNAレベルは、測定または推定され、標準I-FLICE-1またはI-F
LICE-2タンパク質レベルあるいはmRNAレベルと比較される。この標準は、疾患状
態を有さない個体から得た第二の生物学的サンプルから得られる。当該分野で理
解されるように、一旦標準I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質レベルあるいは
mRNAレベルが判明すると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
「生物学的サンプル」によって、I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質あるい
はmRNAを含有する、個体、細胞株、組織培養物、またはその他の供給源から得ら
れた、任意の生物学的サンプルが意図される。生物学的サンプルは、I-FLICE-1
またはI-FLICE-2タンパク質を含有する哺乳動物の体液（例えば、血清、血漿、
尿、滑液、および髄液）、卵巣、前立腺、心臓、胎盤、膵臓、肝臓、脾臓、肺、
乳房、さい帯組織およびその他の組織を包含する。哺乳動物から組織生検および
体液を得る方法は、当該分野で周知である。生物学的サンプルが、mRNAを含むべ
き場合、組織生検が好ましい供給源である。
増大した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連した疾患には、ガン（例え
ば、濾胞性リンパ腫、p53変異を伴う癌、ホルモン依存性腫瘍、および乳癌、卵
巣癌、前立腺癌、骨癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、および脾臓癌）；自己免疫疾患
（例えば、全身性エリテマトーデス、および免疫関連糸球体腎炎慢性関節リウマ
チ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよび
アデノウイルス）、情報（information）移植片対宿主病、急性移植片拒絶およ
び慢性移植片拒絶が包含される。細胞の生存低下またはアポトーシス増加に関連
する疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、敗血症
ショック、敗血症、発作、CNS炎症、骨粗鬆症、虚血、再灌流傷害、心臓血管疾
患に関連する細胞死、多嚢胞性腎疾患、心臓血管疾患における内皮細胞のアポト
ーシス、退行性肝臓疾患、MSおよび頭部外傷性損傷が含まれる。
タンパク質レベルの検出に利用可能なアッセイは当業者に周知であり、例えば
、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット解析、および
好ましくは、ELISAアッセイが使用され得る。
I-FLICE-1またはI-FLICE-2特異的抗体は、インタクトなI-FLICE-1またはI-FLI
CE-2タンパク質、あるいはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起さ
れ得、インタクトなI-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質および抗原性ポリペプ
チドフラグメントは、動物（例えば、ウサギまたはマウス）系に、キャリアタン
パク質（例えば、アルブミンの）とともに提示されるか、もしくは、十分長い（
少なくとも約２５アミノ酸）ならば、キャリアなしで提示される。
本明細書中で使用されるように、用語「抗体」(Ab)または用語「モノクローナ
ル抗体」（mAb）は、I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質に特異的に結合し得
るインタクトな分子および抗体フラグメント（例えば、FabおよびF(ab')2フラグ
メント）を包含し、これらは、FabおよびF(ab')2フラグメントは、インタクトな
抗体のFcフラグメントを欠き、循環からより迅速に除かれ、インタクトな抗体の
非特異的な組織結合をほとんど有し得ない（Wahlら,J.Nucl.Med.24:316-325(198
3)）。したがって、これらフラグメントが好ましい。
本発明の抗体は、任意の種々の方法により調製され得る。例えば、I-FLICE-1
またはI-FLICE-2タンパク質、あるいはこれらの抗原性フラグメントを発現する
細胞は、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために、動物に投
与され得る。好ましい方法においては、I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質の
調製物が調製され、そして、これを天然の混入物が実質的に無いように与えるた
めに精製される。次いで、この調製物を、より高い特異性のポリクローナル抗血
清を産生するために動物に導入する。
最も好ましい方法においては、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（あるい
はそのI-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質結合のフラグメント）である。この
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製され得る(Kohlerら,Na
ture 256:495(1975);Kohlerら,Eur.J.Immunol．6:511(1976);Kohlerら,Eur.J.Im
munol．6:292(1976);Hammerlingら,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybrido
mas,Elsevier,N.Y.,(1981)pp563-681）。
生物学的サンプルにおける、I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質レベルのア
ッセイは、抗体に基づいた技術を用いて行われ得る。例えば、組織内のI-FLICE-
1またはI-FLICE-2タンパク質の発現は、古典的な免疫組織学的方法で研究され得
る（Jalkanen,M.ら,J.Cell.Biol.101:976-985(1985);Jalkanen,M.ら,J.Cell.Bio
l.105:3087-3096(1987)）。
上記のように、I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質遺伝子発現を検出するた
めに有用な、抗体に基づいた他の方法には、イムノアッセイ（例えば、酵素結合
免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA））が挙げられる
。
適切な標識が当該分野で公知であり、そして、これには酵素標識（例えば、グ
ルコースオキシダーゼ）、放射性同位体（例えば、ヨウ素（125I,125I）、炭素
（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）、およびテ
クネチウム（99mTc））、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン
）およびビオチンが挙げられる。
全細胞RNAは、生物学的サンプルから、ChomczynskiおよびSacchi,Anal.Bioche
m.162:156-159(1987)に記載の単一工程のグアニジニウム−チオシアネート−フ
ェノール−クロロホルム法を用いて単離し得る。次いで、I-FLICE-1またはI-FLI
CE-2タンパク質をコードするmRNAのレベルは、適切な方法を用いてアッセイした
。これらには、ノーザンブロット解析（Haradaら,Cell 63:303-312(1990)）、S1
ヌクレアーゼマッピング（Fujitaら,Cell 49:357-367(1987)）、ポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（RT-PCR）(Makino
ら，Technique 2:295-301(1990))、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転
写(RT-LCR)が挙げられる。
アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイおよびに分子
本発明はまた、I-FLICE-1またはI-FLICE-2のアゴニストおよびアンタゴニスト
を同定するための化合物のスクリーニング方法を提供する。「アゴニスト」によ
り、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドにより媒介される１つ以上の活性を
増強し得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される。「アンタゴ
ニスト」により、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドにより媒介される１つ
以上の活性を阻害し得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される
。
したがって、さらなる局面において、候補のアゴニストまたはアンタゴニスト
が、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドのいずれかの細胞活性を増強し得る
かあるいは阻害し得るかを決定するためのスクリーニング方法が提供される。こ
の方法は、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドのうちの１つもしくは両方を
発現する細胞と候補化合物とを接触させ、細胞応答をアッセイし、そしてこの細
胞応答を標準細胞応答と比較することを包含する。ここで標準は、候補化合物の
非存在下でアッセイされる。これらにより、標準を超える増加した細胞応答は、
候補化合物がポリペプチド活性のアゴニストであることを示し、そして標準と比
較して減少した細胞応答は、候補化合物がポリペプチド活性のアンタゴニストで
あることを示す。「細胞応答のアッセイ」により、候補化合物およびI-FLICE-1
またはI-FLICE-2ポリペプチドのいずれかの存在下での細胞応答の定性的測定ま
たは定量的測定が意図される（例えば、TNFR-1またはCD-95誘導アポトーシスの
増減が天然の細胞リガンド（例えば、FLICEおよびMch4/FLICE2）へのI-FLICE-1
またはI-FLICE-2の結合）。
潜在的なアンタゴニストとして、小さな有機分子であるアミノ酸配列が挙げら
れ、これはI-FLICE-1またはI-FLICE-2、I-FLICE-1およびI-FLICE-2のフラグメン
トならびに抗I-FLICE-1抗体および抗I-FLICE-2抗体に結合する。天然に存在する
かまたは合成的であり得るI-FLICE-1およびI-FLICE-2のフラグメントは、天然の
細胞リガンドへの結合について競合することにより、I-FLICE-1およびI-FLICE-2
ポリペプチド媒介活性に拮抗する。小さな有機分子は、I-FLICE-1もしくはI-FLI
CE-2またはこれらのタンパク質の細胞リガンドへの競合的または非競合的のいず
れかの結合により、I-FLICE-1およびI-FLICE-2ポリペプチド媒介活性に競合し得
る。小さな有機分子の例としては、ヌクレオチド配列、および小さなペプチドま
たはペプチド様分子が挙げられるが、これに限られない。このような分子は、種
々の方法（例えば、Light and Lerner,Bioorganic & Medicinal Chemistry 3(7)
:955-967(1995);Chengら,Gene 171:1-8(1996);Gatesら,J.Mol.Biol.255:373-386
(1996)）により、産生され、そして活性についてスクリーニングされ得る。
同様に、潜在的なアゴニストとしても、本発明のポリペプチドのフラグメント
ならびに抗I-FLICE-1抗体および抗I-FLICE-2抗体が挙げられる。これらのタンパ
ク質のフラグメントは、天然の細胞リガンドに結合することおよび全長タンパク
質に関連する活性を誘導することにより、I-FLICE-1およびI-FLICE-2ポリペプチ
ド媒介活性のアゴニストとして作用し得る。本発明のアゴニストおよびアンタゴ
ニストはまた、配列番号２および６に示されるアミノ酸配列に対し９５％以上の
同一性を有するアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む。
他の潜在的なアンタゴニストには、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および
配列番号１および５に示される配列と三重らせんを形成し得るオリゴヌクレオチ
ドが挙げられる。一旦遺伝子配列が知られれば、アンチセンスおよび三重らせん
技術が、遺伝子発現を調節するために使用され得る。Okano,J.Neurochem.,56:56
0(1991);OLIGONUCLEOTIDES AS INHIBITORS OF GENE EXPRESSION,CRC Press,Boca
Raton,FL.(1998);Dervanら,Science 251:1360(1991);Cooneyら,Science 241:45
6(1988);Leeら,Nucl.Acids Res．6.3073(1979)。アンチセンス技術に関して、例
えば、RNAに転写されるI-FLICE-1またはI-FLICE-2DNA配列の一部分に相補的であ
るオリゴヌクレオチドが設計され得る。このオリゴヌクレオチドは、アンチセン
スRNAとしての形態または発現ベクターに取り込まれ得た形態を含む多くの形態
で細胞に送達され得る。発現ベクターに取り込まれた場合、オリゴヌクレオチド
は一般にI-FLICE-1またはI-FLICE-2のmRNA配列に相補的であるRNA分子が、イン
ビボ発現での際に産生される様式で配向付されている。発現されたアンチセンス
RNA分子は、I-FLICE-1またはI-FLICE-2のmRNAにハイブリダイズし、そしてイン
ビボで翻訳をブロックする。
実施例５に示された実験は、I-FLICE-1がFLICEおよびMch4/FLICE2の両方に結
合することを示す。実施例５に記載されるのと同様の免疫沈降アッセイは、I-FL
ICE-1およびI-FLICE-2に結合するさらなる分子の同定のために使用され得る。こ
のような結合分子は、候補のアンタゴニストおよびアゴニストである。
実施例６は、I-FLICE-1の過剰発現が、TNFR-1およびCD-95誘導細胞死の阻害を
生じることを示すために用いられた細胞死アッセイを示す。このアッセイはまた
、I-FLICE-1およびI-FLICE-2を指向するアゴニスト活性およびアンタゴニスト活
性を有する化合物をスクリーニングするために使用され得る。このスクリーニン
グ
方法は、I-FLICE-1またはI-FLICE-2のいずれか個別もしくは組み合わせの存在下
で、その化合物がTNFR-1およびCD-95誘導細胞死を増加させるかまたは減少させ
るかを決定するために使用される。
I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドドメインに結合するタンパク質および
他の化合物もまた、本発明による候補のアゴニストおよびアンタゴニストである
。これらの結合化合物は、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて「捕獲」され
得る（Fields and Song,Nature 340:245-246(1989);Gyurisら,Cell 75:791-803(
1993);Zervosら,Cell 72:223-232(1993)）．
アゴニストは、例えば、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドの作用を増強
するために、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、
敗血症ショック、敗血症、発作、CNS炎症、骨粗鬆症、虚血、再灌流傷害、心臓
血管疾患に関連する細胞死、多嚢胞性腎疾患、心臓血管疾患における内皮細胞の
アポトーシス、退行性肝臓疾患、MSおよび頭部外傷性損傷の処置において使用さ
れ得る。
アンタゴニストは、例えば、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドの作用を
阻害するために、例えば、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、p53変異を伴うガン、
ホルモン依存性の腫瘍、および乳癌、卵巣癌、前立腺癌、骨癌、肝臓癌、肺癌、
膵臓癌、および脾臓癌）；自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデスおよ
び免疫関連糸球体腎炎慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘルペ
スウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、情報（information）
移植片対宿主病、急性移植片拒絶および慢性移植片拒絶の処置において使用され
得る。
アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば、本明細書中で後に記載されるよ
うな薬学的に受容可能なキャリアとの組成物において用いられ得る。
治療薬
FLICEインヒビター（inhibitor）のためにI-FLICE-1およびI-FLICE-2と称され
る本発明の新規の哺乳動物インヒビターは、TNFR-1およびCD-95誘導アポトーシ
スの両方を阻害する、FLICEおよびMch4/FLICE2の触媒的に不活性な構造のホモロ
グである。これらは、天然に存在する、触媒的に不活性なカスパーゼの最初の例
であり、これは、アポトーシスの優勢なネガティブインヒビターとして作用し得
る。本発明のポリペプチドは、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、慢
性関節リウマチ、敗血症ショック、敗血症、発作、CNS炎症、骨粗鬆症、虚血、
再灌流傷害、心臓血管疾患に関連する細胞死、多嚢胞性腎疾患、心臓血管疾患に
おける内皮細胞のアポトーシス、退行性肝臓疾患、MSおよび頭部外傷性損傷の処
置において、治療目的のためのアポトーシス阻害のために有用である。
投与の態様
個体におけるI-FLICE-1またはI-FLICE-2の活性の標準または正常レベルの減少
によって生じる状態がI-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質の投与によって処置
され得ることが理解される。従って、本発明は、I-FLICE-1またはI-FLICE-2のレ
ベルの増加を必要とする個体を処置する方法をさらに提供する。この方法は、こ
のような個体に、本発明のI-FLICE-1またはI-FLICE-2（特に、成熟形態のI-FLIC
E-1またはI-FLICE-2）の単離ポリペプチドを、このような個体におけるI-FLICE-
1またはI-FLICE-2の活性レベルを増加するに有効な有効量を含む薬学的組成物を
投与する工程を包含する。
一般的な提案として、用量あたり非経口的に投与されるI-FLICE-1またはI-FLI
CE-2ポリペプチドの薬学的に有効な総量は、患者の体重あたり約1μg/kg/日〜10
mg/kg/日の範囲であるが、上記に注記されているように、これは治療上の裁量に
従う。より好ましくは、この用量は、少なくとも0.01mg/kg/日、そして最も好ま
しくは、ヒトに対して、ホルモンにつき約0.01および1mg/kg/日の間の範囲であ
る。継続投与される場合、I-FLICE-1またはI-FLICE-2ポリペプチドは、代表的に
は、約1μg/kg/時間〜約50μg/kg/時間の用量速度で、1日あたり1〜4回注入によ
るか、または、例えば、ミニポンプを使用した継続的皮下注入によってのいずれ
かで投与される。静脈内点滴用バッグ溶液もまた使用され得る。
本発明のI-FLICE-1またはI-FLICE-2を含有する薬学的組成物は、経口、直腸内
、非経口、槽内(intracistemally)、腟内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、液滴、
または経皮パッチによるように）、口腔に(bucally)、または経口または経鼻ス
プ
レーとして、投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性固体
、半固体、または液状充填剤、希釈物、カプセル化材料、または任意型の処方補
助剤を意味する。本明細書で使用される場合、用語「非経口」とは、静脈内、筋
肉内、腹腔内、胸骨下(intrasternal)、皮下、および関節内注射および注入を包
含する、投与様式をいう。
染色体アッセイ
本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト
染色体における特定の位置に特異的に標的化され、そしてハイブリダイズし得る
。本発明による染色体へのDNAのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連し
た遺伝子と相関づけるのに重要な第一歩である。
これに関して特定の好ましい実施態様では、本明細書中で開示されるcDNAは、
I-FLICE-1またはI-FLICE-2タンパク質遺伝子のゲノムDNAをクローニングするた
めに用いられる。これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およびラ
イブラリーを用いて達成され得る。次いで、この目的のために周知の技術を用い
るインサイチュ染色体マッピングのためにゲノムDNAが使用される。
さらに、いくつかの場合において、配列は、cDNAからPCRプライマー（好まし
くは、15〜25bp）を調製することにより、染色体にマッピングされ得る。遺伝子
の3'非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムDNAにおいて１つを超え
るエキソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、従って、増幅プロセスを
複雑化する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細
胞ハイブリッドのPCRスクリーニングのために用いられる。
中期染色体の範囲へのcDNAクローンの蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ン（「FISH」）は、一工程で、正確な染色体位置を提供するために用いられ得る
。この技術は、50または60bp程度の短さのcDNA由来のプローブと共に用いられ得
る。この技術の概説については、Vermaら、Human Chromosomes:A Manual Of Bas
ic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。
一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
学的な位置が、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、
例えば、V．McKusick，Mendelian Inheritance In Man（Johns Hopkins Univers
ity，Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である）に見出される。
次いで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖
分析（物理学的に隣接した遺伝子の同時遺伝）によって同定される。
次に、罹患個体と非罹患個体との間でのcDNAまたはゲノム配列における差異を
決定することが必要である。変異が罹患個体のいくらかまたは全てにおいて認め
られるが、いずれの正常個体でも認められない場合、この変異は、おそらく疾患
の原因因子である。
本発明に一般的に記載されるように、以下の実施例を参照することにより、本
発明は、より迅速に理解されるが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限
定として意図されない。
実施例
実施例１（a）：E.coliにおけるI-FLICE-1の発現および精製
細菌性発現ベクターpQE60を、本実施例の細菌性発現のために使用する（QIAGE
N，Inc.,9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）。pQE60はアンピシリン抗
生物質耐性(「Ampr」）をコードし、そして細菌の複製起点(「ori」)、IPTG誘導
性プロモーター、リボソーム結合部位（「RBS」）、QIAGEN Inc．(前出)から販
売されているニッケル-ニトリロ-三酢酸(「Ni-NTA」)アフィニティー樹脂を用い
るアフィニティー精製を可能にする、６つのヒスチジン残基をコードするコドン
、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリペ
プチドをコードするDNAフラグメントが、このペプチドのカルボキシル末端に共
有結合した６つのHis残基（すなわち、「６×Hisタグ」）を有するポリペプチド
を産生するような様式で挿入され得るように、配置される。
I-FLICE-1タンパク質の所望の部分をコードするDNA配列は、I-FLICE-1タンパ
ク質の所望の部分のアミノ末端配列にアニーリングし、そしてcDNAコード配列の
3'側の寄託された構築物中の配列にアニーリングするPCRオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて、寄託されたcDNAクローンから増幅される。pQE60ベクターに
おけるクローニングを容易にする制限部位を含むさらなるヌクレオチドは、それ
ぞれ、5'および3'側の配列に付加される。
タンパク質をクローニングするために、5'プライマーは、下線を付したNcoI制
限部位、続いて図1A〜1BのI-FLICE-1配列（配列番号１）のアミノ末端コード配
列に相補的な16（すなわち、275〜291）ヌクレオチドを含む、配列5'CGCCCATGGC
TGAAGTCATCCATCAG3’（配列番号７）を有する。当然、当業者は、5'プライマー
が開始するタンパク質コード配列の点は、短いかまたは長い形態の完全なタンパ
ク質の任意の所望の部分をコードするDNAセグメントを増幅するために変動され
得ることを理解する。3'プライマーは、下線を付したHindIII制限部位、続いて
図1A〜1BのI-FLICE-1 DNA配列（配列番号１）の終止コドンの直前の3’側のコー
ド配列に相補的な18（すなわち、1740〜1758）ヌクレオチドを、pQE60ベクター
中の６つのHisコドンの読み取り枠とともにコード配列の読み取り枠を維持する
ように制限部位に対して整列されたコード配列とともに含む、配列5'CGCAAGCTTG
TGCTGGGATTACAGGTG3’（配列番号８）を有する。
増幅されたI-FLICE-1のDNAフラグメントおよびpQE60ベクターは、NcoI／HindI
IIで消化され、次いで消化されたDNAは、ともに連結される。制限化されたpQE60
ベクターへI-FLICE-1のDNAを挿入することによって、IPTG誘導性プロモーターか
ら下流でかつ開始AUGおよび６つのヒスチジンコドンにインフレームに、I-FLICE
-1タンパク質コード領域を配置する。
連結混合物を、Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989)
に記載されるような標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質転
換する。複数のコピーのプラスミドpREP4（これは、lacリプレッサーを発現し、
そしてカナマイシン耐性（「Kanr」）を付与する）を含有するE.coil株M15/rep4
を本明細書中に記載の例示的実施例を行うにあたって使用する。この株（これは
、I-FLICE-1タンパク質を発現するのに適切である多くの株の内の単に一つの株
である）は、QIAGENInc.，(前出)から入手可能である。形質転換体を、アンピシ
リンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート上で増殖するそれらの能力により
同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてクローニングされ
たDNAの同定を、制限分析、PCRおよびDNA配列決定により確認する。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）とカナマイシン
（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培地中で一晩（「O/N」）増
殖させる。O/N培養物を用いて約1:25〜1:250の希釈で大規模培養物に接種する。
細胞を、0.4と0.6との間の、600nmでの光学密度（「OD600」）にまで増殖させる
。次いで、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を1mMの最終
濃度で加えて、lacIリプレッサーを不活化することにより、lacリプレッサー感
受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３〜４時間引き続きイン
キュベートする。次いで、細胞を遠心分離により採集する。
次いで、細胞を、6Mグアニジン-HCl、pH８中で４℃で３〜４時間撹拌する。細
胞片を、遠心分離により除去し、そしてI-FLICE-1を含む上清を、ニッケル−ニ
トリロ−三酢酸（「NiNTA」）アフィニティー樹脂カラム（QIAGEN、Inc.、前出
から入手可能）にロードする。６×Hisタグを有するタンパク質は、高親和性でN
I-NTA樹脂に結合し、そして単純な一工程手順で精製され得る（詳細については
、The QIAexpressionist、1995、QIAGEN、Inc.、前出を参照のこと）。簡単には
、上清を、６Ｍグアニジン-HCl、pH8中のカラムにロードし、カラムをまず、10
容量の６Ｍグアニジン-HCl、pH８で洗浄し、次いで10容量の６Ｍグアニジン-HCl
、pH６で洗浄し、そして最後にI-FLICE-1を６Ｍグアニジン-HCl、pH５で溶出す
る。
次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または200mM N
aClを有する50mM Na-酢酸緩衝液(pH6)に対して透析することによって再生する
。あるいは、タンパク質をNi-NTAカラムに固定される間に首尾良く再折り畳みさ
せ得る。推奨される条件は以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含む
500mM NaCl、20％グリセロール、20mM Tris/HCl pH7.4中の６Ｍ〜１Ｍの尿素の
直線勾配を用いて再生する。再生は、1.5時間以上の期間にわたって実施される
べきである。再生の後、タンパク質を250mMのイミダゾールを添加することによ
り溶出し得る。イミダゾールは、PBSまたは200mM NaClを有するpH６の50mM酢酸
ナトリウム緩衝液に対する最終透析工程によって除去する。精製したタンパク質
を、４℃で保存するか、または−80℃で凍結する。
実施例１（b）：E.coliにおけるI-FLICE-2の発現および精製
細菌性発現ベクターpQE60を、本実施例の細菌性発現のために使用する（QIAGE
N，Inc.,9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311）。pQE60はアンピシリン抗
生物質耐性(「Ampr」)をコードし、そして細菌の複製起点(「ori」)、IPTG誘導
性プロモーター、リボソーム結合部位（「RBS」）、QIAGEN Inc．(前出)から販
売されているニッケル-ニトリロ-三酢酸(「Ni-NTA」)アフィニティー樹脂を用い
るアフィニティー精製を可能にする、６つのヒスチジン残基をコードするコドン
、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリペ
プチドをコードするDNAフラグメントが、このペプチドのカルボキシル末端に共
有結合した６つのHis残基（すなわち、「６×Hisタグ」）を有するポリペプチド
を発現するように挿入され得るように、配置される。
I-FLICE-2タンパク質の所望の部分をコードするDNA配列は、I-FLICE-2タンパ
ク質の所望の部分のアミノ末端配列にアニーリングし、そしてcDNAコード配列の
3'側の寄託された構築物中の配列にアニーリングするPCRオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いて、寄託されたcDNAクローンから増幅される。pQE60ベクターに
おけるクローニングを容易にする制限部位を含むさらなるヌクレオチドは、それ
ぞれ、5'および3'側の配列に付加される。
タンパク質をクローニングするために、5'プライマーは、下線を付したNcoI制
限部位、続いて図4A〜4CのI-FLICE-2配列（配列番号５）のアミノ末端コード配
列に相補的な17（すなわち、311〜328）ヌクレオチドを含む、配列5'CGCCCATGGA
GATTGGTGAGGATTTG3'（配列番号９）を有する。当然、当業者は、5'プライマーが
開始するタンパク質コード配列の点は、短いかまたは長い形態の完全なタンパク
質の任意の所望の部分をコードするDNAセグメントを増幅するために変動され得
ることを理解する。3'プライマーは、下線を付したHindIII制限部位、続いて図4
A〜4CのI-FLICE-2のDNA配列（配列番号５）の終止コドンの直前の3'末端のコー
ド配列に相補的な16（すなわち1400〜1416）ヌクレオチドを、pQE60ベクター中
の６つのHisコドンの読み取り枠とともにコード配列の読み取り枠を維持するよ
うに制限部位に対して整列されたコード配列とともに含む、配列5'CGCAAGCTTAGA
GCATGCAGTGTCAG'（配列番号10）を有する。
増幅されたI-FLICE-2のDNAフラグメントおよびpQE60ベクターは、NcoI／HindI
IIで消化され、次いで消化されたDNAは、ともに連結される。制限化されたpQE60
ベクターへI-FLICE-2のDNAを挿入することによって、IPTG誘導性プロモーターか
ら下流でかつ開始AUGおよび６つのヒスチジンコドンにインフレームに、I-FLICE
-2タンパク質コード領域を配置する。
連結混合物を、Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual、第２
版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989
)に記載されるような標準的な手順を用いて、コンピテントなE.coli細胞に形質
転換する。複数のコピーのプラスミドpREP4（これは、lacリプレッサーを発現し
、そしてカナマイシン耐性（「Kanr」）を付与する）を含有するE.coli株M15/re
p4を本明細書中に記載の例示的実施例を行うにあたって使用する。この株（これ
は、I-FLICE-2タンパク質を発現するのに適切である多くの株の内の単に一つの
株である）は、QIAGEN Inc.，(前出)から市販されている。形質転換体を、アン
ピシリンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート上で増殖するそれらの能力に
より同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてクローニング
されたDNAの同定を、制限分析、PCRおよびDNA配列決定により確認する。
所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）とカナマイシン
（25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培地中で一晩（「O/N」）増
殖させる。O/N培養物を用いて約1:25〜1:250の希釈で大規模培養物に接種する。
細胞を、0.4と0.6との間の、600nmでの光学密度（「0D600」）にまで増殖させる
。次いで、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を１mMの最
終濃度で加えて、lacIリプレッサーを不活化することにより、lacリプレッサー
感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３〜４時間引き続きイ
ンキュベートする。次いで、細胞を遠心分離により採集する。
次いで、細胞を、6Mグアニジン-HCl、pH8中で４℃で３〜４時間撹拌する。細
胞片を、遠心分離により除去し、そしてI-FLICE-2を含む上清を、ニッケル−ニ
トリロ−三酢酸（「NiNTA」）アフィニティー樹脂カラム（QIAGEN、Inc.、前出
から入手可能）にロードする。６×Hisタグを有するタンパク質は、高親和性でN
I-NTA樹脂に結合し、そして単純な一工程手順で精製され得る（詳細について
は、The QIAexpressionist、1995、QIAGEN、Inc.、前出を参照のこと）。簡単に
は、上清を、６Ｍグアニジン-HCl、pH8中のカラムにロードし、カラムをまず10
容量の６Ｍグアニジン-HCl、pH８で洗浄し、次いで10容量の６Ｍグアニジン-HCl
、pH６で洗浄し、そして最後にI-FLICE-2を６Ｍグアニジン-HCl、pH５で溶出す
る。
次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、または200mM
NaClを有する50mM Na-酢酸緩衝液(pH6)に対して透析することによって再生す
る。あるいは、タンパク質をNi-NTAカラムに固定される間に首尾良く再折り畳み
させ得る。推奨される条件は以下の通りである：プロテアーゼインヒビターを含
む500mM NaCl、20％グリセロール、20mM Tris/HCl pH7.4中の６Ｍ〜１Ｍの尿素
の直線勾配を用いて再生する。再生は1.5時間以上の期間にわたって実施される
べきである。再生の後、タンパク質を250mMのイミダゾールを添加することによ
り溶出し得る。イミダゾールは、PBSまたは200mM NaClを有するpH６の50mM酢酸
ナトリウム緩衝液に対する最終透析工程によって除去する。精製したタンパク質
を４℃で保存するか、または-80℃で凍結する。
実施例２（a）：バキュロウイルス発現系におけるI-FLICE-1タンパク質のクロー
ニングおよび発現
この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターpA2を用いて、その
天然に関与する分泌シグナル（リーダー）配列を含む、完全なタンパク質をコー
ドするクローニングされたDNAを、成熟I-FLICE-1タンパク質を発現するバキュロ
ウイルスに、Summerら、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and In
sect Cell Culture Procedures、Texas Agricultural Experimental Station Bu
lletin第1555号(1987)に記載のような標準的な方法を用いて挿入する。この発現
ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の強力なポリ
ヘドリンプロモーター、続いてBamHIおよびAsp718のような簡便な制限部位を含
む。サルウイルス40（「SV40」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニ
ル化のために用いる。組換えウイルスの平易な選択のために、プラスミドは、同
じ方向で、弱Drosophilaプロモーターの制御下で、E.coli由来のβガラクトシダ
ーゼ遺伝子、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。
挿入遺伝子は、両側で、野生型ウイルスのDNAとの細胞媒介性相同組換えのため
にウイルス配列を隣接させて、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する
生存ウイルスを産生させる。
当業者に容易に理解されるように、構築物が、必要ならば、シグナルペプチド
およびインフレームAUGを含む、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置され
たシグナルを提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクターを、上記のベ
クター（例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1）の代わりに用い得る。例えば
、このようなベクターは、Luckowら、Virology 170:31〜39(1989)に記載される
。
寄託されたクローン中に、全長のI-FLICE-1タンパク質をコードするcDNA配列
（図１Ａ〜１Ｂ（配列番号１）に示されるAUG開始コドンを含む）を、この遺伝
子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
増幅する。5'プライマーは、下線を付したBamHI制限酵素部位、Kozak，M.，J．M
ol．Biol．196:947〜950(1987)に記載のような真核生物細胞の翻訳を開始するた
めの効率的なシグナル、続いて図1A〜1Bに示されるI-FLICE-1の完全タンパク質
の、17（すなわち、268〜285）塩基のAUG開始コドンで始まる配列を含む、配列5
'CGCGGATCCGCCATCATGTCTGCTGAAGTCATC3'(配列番号11)を有する。3'プライマーは
、下線を付したAsp718制限部位、続いて（図1A〜1B（配列番号１）における3’
非コード配列に相補的な18（1740〜1758）ヌクレオチドを含む、配列5'CGCGGTAC C
GTGCTGGGATTACAGGTG3'（配列番号12）を有する。
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La
Jolla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメ
ントを、BamHIおよびAsp718で消化する。そして、再度１％アガロースゲル上で
精製する。このフラグメントを本明細書中で「Ｆ1」と命名する。
プラスミドを、制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、そして必要に応じて、
当該分野で公知の日常的な技術を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リ
ン酸化し得る。次いで、このDNAを市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，
La Jolla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターDNAを
本明細書中で「V1」と命名する。
フラグメントF1および脱リン酸化プラスミドＶ1を、T4 DNAリガーゼで連結す
る。E.coli HB101またはXL-1 Blue細胞（Statagene Cloning Systems，La Jolla
，CA）のような他の適切なE.coli宿主を、連結混合物で形質転換し、そして培養
プレートに塗布する。ヒトI-FLICE-1遺伝子を有するプラスミドを含む細菌をPCR
法を用いて同定する。このPCR法で、プライマーの一つを用いてその遺伝子を増
幅する。そして、第２のプライマーは、ベクターの内部の源からであり、その結
果、I-FLICE-1遺伝子フラグメントを含むそれらの細菌コロニーのみがDNAの増幅
を示す。クローニングされたフラグメントの配列を、DNA配列決定によって確認
する。このプラスミドを、本明細書中で、pBac I-FLICE-1と命名する。
５μｇのプラスミドpBac I-FLICE-1を、FelgnerらProc．Natl．Acad．Sci．US
A 84:7413-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法を用いて、1.0μ
ｇの市販の線状化バキュロウイルスDNA（「BaculoGoldTMbaculovirus DNA」，Ph
armingen，San Diego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。1μgのBaculo
GoldTMウイルスDNAおよび５μｇのプラスミドpBac I-FLICE-1を、50μlの無血清
グレース培地（Life Technologies Inc.，GaIthersburg，MD）を含むマイクロタ
イタープレートの無菌ウェル中で混合する。その後、10μlのリポフェクチンお
よび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベ
ートする。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１
mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）
に滴下する。プレートを、前後に揺らして新たに添加された溶液を混合する。次
いで、プレートを27℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェク
ション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグ
レース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして培養を
27℃で４日間続ける。
４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）に記載されるよう
にプラークアッセイを行う。「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithers
burg）を有するアガロースゲルを、青く染色されたプラークを産生するgal発現
クローンの容易な同定および単離を可能にするために用いる。（このタイプの「
プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.、Gaithersbu
rgによって配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者
ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーションの
後、青く染色されたプラークを、マイクロピペッター（例えば、エッペンドルフ
）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培
地を含む微小遠心管中に再懸濁する。そして、組換えバキュロウイルスを含む懸
濁液を用いて、35mmディッシュに播種された昆虫Sf9細胞に感染させる。４日後
、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを４℃で保存する。こ
の組換えウイルスをV-I-FLICE-1と称する。
I-FLICE-1遺伝子の発現を確認するために、Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補
充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「MOI」）に
て組換えバキュロウイルスV-I-FLICE-1で感染させる。６時間後、その培地を除
去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technol
ogies Inc.，Rockville，MDから入手可能）に置き換える。放射性標識されたタ
ンパク質が所望される場合、42時間後、５μCiの35Ｓ-メチオニンおよび５μCi
の35Ｓ-システイン（Amershamから入手可能）を添加する。細胞をさらに16時間
インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集する。上清中のタンパク質
ならびに細胞内タンパク質をSDS-PAGE、続いて（放射性標識されていれば）オー
トラジオグラフィーにより分析する。精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配
列の微小配列決定を用いて、成熟タンパク質のアミノ末端配列を決定し得、従っ
て分泌シグナルペプチドの切断箇所および長さを決定し得る。
実施例２(b)：バキュロウイルス発現系におけるI-FLICE-2タンパク質のクローニ
ングおよび発現
この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターpA2を用いて、完全
なタンパク質をコードするクローニングされたDNAを、I-FLICE-2タンパク質を発
現するバキュロウイルスに、Summerら、A Manual of Methods for Baculovirus
Vectors and Insect Cell Culture Procedures、Texas Agricultural Experimen
tal Station Bulletin第1555号(1987)に記載のような標準的な方法を用いて挿入
する。この発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcMNP
V)の強力なポリヘドリンプロモーターを含み、続いてBamHIおよびAsp718のよ
うな簡便な制限部位を含む。サルウイルス40（「SV40」）のポリアデニル化部位
を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスの平易な選択のた
めに、プラスミドは、同じ方向で、弱Drosophilaプロモーターの制御下で、E.co
li由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリ
アデニル化シグナルを含む。挿入遺伝子は、野生型ウイルスのDNAとの細胞媒介
性相同組換えのためにウイルス配列の両側に隣接し、クローニングされたポリヌ
クレオチドを発現する生存ウイルスを産生する。
多くの他のバキュロウイルスベクターを、当業者に容易に理解されるように、
構築物が、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置されたシグナル（必要なら
ば、シグナルペプチドおよびインフレームAUGを含む）を提供する限り、上記の
ベクター（例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1）の代わりに用い得る。この
ようなベクターは、例えば、Luckowら、Virology 170:31〜39に記載される。
寄託されたクローン中の全長I-FLICE-2タンパク質をコードするcDNA配列（図4
A〜4C（配列番号６）中に示されるAUG開始コドンを含む）を、遺伝子の5'配列お
よび3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅する。
この5'プライマーは、下線を付したBamHI制限酵素部位を含む、配列：5'CGCGGAT CC
GCCATCATGGCAGAGATTGGTGAG3'(配列番号13)、Kozak，M.，J．Mol．Biol．196:9
47〜950(1987)に記載のように、真核生物細胞の翻訳を開始するための効率的な
シグナル、続いて、図4A〜4C中に示される完全なI-FLICE-2タンパク質の配列の1
7(304〜321)塩基（AUG開始コドンで始まる）を有する。3'プライマーは、下線を
付したAsp718制限部位を含む配列：5'CGCGGTACCAGAGCATGCAGTGTCAG3'（配列番号
14）続いて図4A〜4C（配列番号５）中の3'非コード配列に相補的な(すなわち、1
400〜1416)ヌクレオチドを有する。
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La
Jolla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。次いで、このフラグメ
ントを、BamHIおよびAsp718で消化し、そして、再度１％アガロースゲル上で精
製する。このフラグメントを本明細書中で「F1」と称する。
プラスミドを、制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、そして必要に応じて、
当該分野で公知の日常的な手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リ
ン酸化し得る。次いで、このDNAを、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.
，La Jolla，Ca）を用いて１％アガロースゲルから単離する。このベクターDNA
を本明細書中で「V1」と称する。
フラグメントF1および脱リン酸化プラスミドV1を、T4 DNAリガーゼで共に連結
する。E.coli HB101またはXL-1 Blue（Statagene Cloning Systems，La Jolla，
CA）のような他の適切なE.coli宿主細胞を、連結混合物で形質転換し、そして培
養プレートにまく。PCR法を使用して、ヒトI-FLICE-2遺伝子を有するプラスミド
を含む細菌を同定する。ここで、遺伝子および二次プライマーを増幅するために
使用される１つのプライマーは、ベクター内のウェル由来であり、その結果I-FL
ICE-2遺伝子フラグメントを含むこれらの細菌コロニーのみがDNAの増幅を示す。
クローニングされたフラグメントの配列を、DNA配列決定によって確認する。こ
のプラスミドを、本明細書中で、pBacI-FLICE-2と称する。
５μｇのプラスミドpBac I-FLICE-2を、FelgnerらProc．Natl．Acad．Sci．US
A 84:7413-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法を用いて、1.0μ
ｇの市販の線状化バキュロウイルスDNA（「BaculoGoldTMbaculovirus DNA」，Ph
armingen，San Diego，CA.）とともに同時トランスフェクトする。1μgのBaculo
GoldTMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac I-FLICE-2を、50μlの無血清
グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタ
イタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、10μlのリポフェクチンお
よび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベ
ートする。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１
mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）
に滴下する。プレートを再びロックし、そして新たな添加溶液を混合する。次い
でプレートを、27℃で５時間インキュベートする。５時間後、トランスフェクシ
ョン溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのグレ
ース昆虫培地を添加する。このプレートをインキュベーターに戻し、そして、培
養を27℃で４日間続ける。
４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）に記載されるよう
に、プラークアッセイを行う。「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithe
rsburg）を有するアガロースゲルを、青く染色されたプラークを産生するgal発
現クローンの容易な同定および単離を可能にするために用いる。（このタイプの
「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.、Gaithers
burg、により配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者
ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。適切なインキュベーションの
後、青く染色されたプラークを、マイクロピペッター（例えば、エッペンドルフ
）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培
地を含む微小遠心管中に再懸濁する。そして、組換えバキュロウイルスを含む懸
濁液を用いて、35mmディッシュに播種された昆虫Sf9細胞に感染させる。４日後
、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いでそれらを４℃で保存する。こ
の組換えウイルスをV-I-FLICE-2と称する。
I-FLICE-2遺伝子の発現を確認するために、Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補
充したグレース培地中で増殖させる。細胞を、約２の感染多重度（「MOI」）に
て組換えバキュロウイルスV-I-FLICE-2で感染させる。６時間後、その培地を除
去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technol
ogies Inc.，Rockville，MDから入手可能）に置き換える。放射性標識されたタ
ンパク質が所望される場合、42時間後、５μCiの35Ｓ-メチオニンおよび５μCi
の35Ｓ-システイン（Amershamから入手可能）を添加する。細胞をさらに16時間
インキュベートし、次いで、細胞を遠心分離により収集する。上清中のタンパク
質ならびに細胞内タンパク質を、SDS-PAGE、続いて（放射性標識されていれば）
オートラジオグラフィーにより分析する。精製タンパク質のアミノ末端のアミノ
酸配列の微小配列決定を用いて、成熟タンパク質のアミノ末端配列を決定し得、
従って分泌シグナルペプチドの切断箇所および長さを決定し得る。
実施例３：哺乳動物細胞におけるI-FLICEのクローニングおよび発現
代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（mRNAの転写の開
始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ
リアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハン
サー、Kozak配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナー部位およびアクセ
プター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写を、SV40由来
の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復（LTR）（例
えば、RSV、HTLVI、HIVI）ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモ
ーターを用いて達成し得る。しかし、細胞性エレメントもまた使用され得る（例
えば、ヒトアクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適切な発現ベ
クターとしては、例えば、PSVLおよびPMSG（Pharmacia，Uppsala，Sweden）、pR
SVcat（ATCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、ならびにpBC12MI（ATCC 67109
）のようなベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒ
トHela293細胞、H9細胞およびJurkat細胞、マウスNIH3T3細胞およびC127細胞、C
os1細胞、Cos7細胞およびCV1細胞、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、ならびにチ
ャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が挙げられる。
あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株に
おいて発現され得る。選択マーカー（例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、また
はハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされ
た細胞の同定および単離を可能にする。
トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて、大量のコードされたタン
パク質を発現し得る。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺
伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別
の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（GS）である（Murphyら、
Biochem J．227:277-279(1991)；Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(19
92)）。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖さ
せ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に
組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細
胞およびNSO細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（LT
R）（Cullenら、Molec．and Cell．Biol．5:438-447(1985)）およびCMV-エンハ
ンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530（1985））を含む。複数の
クローニング部位（例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、およびAsp718を有
する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに、ラ
ットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロン、ポリアデニル化、および終結
シグナルを含む。
実施例３(a)：COS細胞におけるI-FLICEのクローニングおよび発現
発現プラスミドｐI-FLICE-1 HAを、I-FLICE-1をコードするcDNAを発現ベクタ
ーpcDNAI/AmpまたはpcDNAIII(これは、Invitrogen，Inc.から入手し得る)へクロ
ーニングすることによって作製する。
発現ベクターpcDNAI/ampは以下を含む：（１）E.coliおよび他の原核生物細胞
における増殖に有効なE.coli複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の選
択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のための
SV40複製起点；（４）CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン；（５
）cDNAが都合良くCMVプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリリンカー
における制限部位の手段によってSV40イントロンおよびポリアデニル化シグナル
に作動可能に連結され得るように配置された、赤血球凝集素フラグメント（すな
わち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）をコードするいくつかのコドン、
続いて終止コドン、およびポリアデニル化シグナル。HAタグは、Wilsonら、Cell
37:767-778(1984)によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質
に由来するエピトープに対応する。標的タンパク質へのHAタグの融合は、HAエピ
トープを認識する抗体を用いる、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可
能にする。pcDNAIIIはさらに、ネオマイシン選択マーカーを含む。
I-FLICE-1をコードするDNAフラグメントを、組換えタンパク質発現がCMVプロ
モーターによって指向されるように、ベクターのポリリンカー領域にクローニン
グする。プラスミド構築ストラテジーは以下の通りである。寄託されたクローン
のI-FLICE-1 cDNAを、E.coliにおけるI-FLICE-1の発現のためのベクターの構築
について先に記載されるのとほとんど同じように、都合の良い制限部位を含むプ
ライマーを用いて増幅する。適切なプライマーとしては、本実施例で使用される
以下のものが挙げられる。下線を付したSmaI部位、Kozak配列、AUG開始コドン、
および完全なI-FLICE-1の5'コード領域の17塩基を含む5'プライマーは以下の配
列を有する：
5'CGCCCCGGGGCCATCATGTCTGCTGAAGTCATC(268-285)3'（配列番号15）。下線を付し
たXbaI部位、ストップコドン、および3'コード配列の18bpを含む3'プライマーは
、以下の配列（3'末端に）を有する：
5'CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTGCTGGGATTACAGGTG(1740-1758)3'
（配列番号16）。
PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、SmaIおよびXbaIで消化
し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning System
s，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037より入手可能)へ形質転
換し、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性コ
ロニーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。プ
ラスミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてI-FLICE-1コードフラグメントの
存在について制限分析または他の手段によって試験する。
組換えI-FLICE-1の発現のために、COS細胞を、例えば、Sambrookら，Molecula
r Cloning:a Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，Cold Spring
Harbor，New York(1989)に記載のように、DEAE-DEXTRANを用いて、上記のよう
に発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによるI-FLICE-1の
発現のための条件下でインキュベートする。
I-FLICE-1 HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowら，Antibodies:A Lab
oratory Manual,第２版;Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring H
arbor，New York(1988)に記載の方法を用いて、放射標識化および免疫沈降法に
よって検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、35
S-システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する
。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そしてWilsonら（上記に引用
される）に記載されるように界面活性剤含有RIPA緩衝液：150mM NaCl、１％ NP-
40、0.1％ SDS、１％ NP-40、0.5％ DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパ
ク質を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて、細胞溶解物および培養培地から
沈降させる。次いで、沈降したタンパク質を、SDS-PAGEおよびオートラジオグラ
フィーによって分析する。期待されるサイズの発現産物は、細胞溶解物において
観察され、これはネガティブコントロールにおいては見られない。
実施例３(b)：CHO細胞におけるI-FLICE-1のクローニングおよび発現
ベクターpC4を、I-FLICE-1タンパク質の発現のために使用する。プラスミドpC
4は、プラスミドpSV2-dhfr（ATCC受託番号37146）の誘導体である。このプラス
ミドは、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらの
プラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズ
ハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した
選択培地（αマイナスMEM、Life Technologies）中で細胞を増殖させることによ
って選択され得る。メトトレキサート（MTX）に耐性である細胞におけるDHFR遺
伝子の増幅は、よく考証されている（例えば、Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bert
ino，J.R.およびSchimke，R.T.，1978，J．Biol．Chem．253:1357-1370、Hamlin
，J.L.およびMa，C.1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:107-143、Page，M
．J.およびSydenham，M.A．1991，Biotechnology 9:64-68を参照のこと）。漸増
濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素DHFR
を過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第２の遺伝子がDHFR遺伝子
に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝
子の1,000を超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使
用し得ることは、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取
り除かれる場合、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む
細胞株が得られる。
プラスミドpC4は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Culle
nら、Molec．Cell．Biol．5:438-447(1985)）の長末端反復（LTR）の強力なプロ
モーター、およびヒトサイトメガロウイルス（CMV）（Boshartら、Cell 4:521-5
30(1985)）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む。
プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にするBamHI、XbaIおよびAsp
718制限酵素切断部位が存在する。これらのクローニング部位の後ろに、プラス
ミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の3'イントロンおよびポリアデニル化
部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のために使用され得る（例え
ば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、
または他のレトロウイルス（例えば、HIVおよびHLVI）由来の長末端反復）。Clo
ntechのTet-0ffおよびTet-On遺伝子発現系ならびに同様の系は、哺乳動物細胞に
おいて調節された方法でI-FLICE-1を発現するために使用され得る（Gossen，M.
，およびBujard，H．1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5547-5551）。mRNA
のポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグ
ロビン遺伝子由来）は、同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝
子を含む安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、gpt，G418、またはハイ
グロマイシン）との同時トランスフェクションに際して選択され得る。最初は、
１つより多い選択マーカー（例えば、G418およびメトトレキサート）を使用する
ことは、有利である。
プラスミドpC4を、制限酵素BamHIおよびAsp718で消化し、次いでウシ腸ホスフ
ァターゼを用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベ
クターを、１％アガロースゲルから単離する。
リーダー配列を含む完全なI-FLICE-1タンパク質をコードするDNA配列を、遺伝
子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて
増幅する。この5'プライマーは、下線を付したBamHI制限酵素部位,、Kozak，M.
，J．Mol．Biol．196:947〜950(1987)に記載のように、真核生物細胞の翻訳を開
始するための効率的なシグナル、続いて、図1A〜1B中に示される完全なI-FLICE-
1タンパク質の配列の17(すなわち、268〜285)塩基（AUG開始コドンで始まる）を
含む、配列：5'CGCGGATCCGCCATCATGTCTGCTGAAGTCATC3'(配列番号17)を有する。3
'プライマーは、下線を付したAsp718制限部位、続いて図1A〜1B（配列番号1）中
の3'非コード配列に相補的な18(1740〜1758)ヌクレオチドを含む配列：5'CGCGGT ACC
GTGCTGGGATTACAGGTG3'（配列番号18）を有する。
増幅させたフラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp78で消化し、
次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離したフラグメントおよ
び脱リン酸化ベクターを、T4 DNAリガーゼで連結する。次いで、E.coli HB101ま
たはXL-1 Blue細胞を形質転換し、そして、例えば、制限酵素分析を用いて、プ
ラスミドpC4に挿入されたフラグメントを含む細菌を同定する。
活性なDHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェ
クションのために使用する。５μｇの発現プラスミドpC4を、リポフェクチン（F
elgnerら、前出）を用いて、0.5μgのプラスミドpSV2-neoとともに同時トランス
フェクトする。プラスミドpSV2-neoは、優性選択マーカー（G418を含む一群の抗
生物質に対する耐性を与える酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子）を含む。細
胞を、1mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をトリ
プシン処理し、そして10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび１mg/ml
G418を補充したαマイナスMEM中のハイブリドーマクローニングプレート（Grein
er，Germany）に播種する。約10〜14日後、単一のクローンをトリプシン処理し
、次いで異なる濃度のメトトレキサート（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）
を用いて、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種する。次いで、最高濃度
のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（
１μM、２μM、５μM、10μM、20μM）を含む新たな６ウェルプレートに移す。
同じ手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。
所望の遺伝子産物の発現を、例えば、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによっ
て、または逆相HPLC分析によって分析する。
実施例３(c)：COS細胞でのI-FLICE-2のクローニングおよび発現
発現プラスミドpI-FLICE-2HAを、I-FLICE-2をコードするcDNAを、発現ベクタ
ーpcDNAI/AmpまたはpcDNAIII（Invitrogen,Inc.から入手可能）中にクローニン
グすることにより、作製する。
発現ベクターpcDNAI/ampは以下を含む：（１）E.coliおよび他の原核生物細胞
での増殖に有効なE.coli複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の選択の
ためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞での増殖のためのSV40複製
起点；（４）CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン；（５）赤血球
凝集素フラグメントをコードするいくつかのコドン（すなわち、精製を容易にす
るための「HA」タグ）、続いて、ポリリンカーの制限部位により、cDNAが簡便に
CMVプロモーターの発現制御下に配置され、そしてSV40イントロンおよびポリア
デニル化シグナルに作動可能に連結され得るように配置された終止コドンおよび
ポリアデニル化シグナル。HAタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由
来のエピトープに対応し、これはWilsonら、Cell 37:767〜778(1984)に記載され
ている。標的タンパク質へのHAタグの融合により、HAエピトープを認識する抗体
を有する組換えタンパク質の検出と回収が容易になる。pcDNAIIIは、さらに、選
択可能なネオマイシンマーカーを含有する。
I-FLICE-2をコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にク
ローン化し、その結果、組換えタンパク質の発現は、CMVプロモーターにより検
出される。プラスミドの構築ストラテジーは、以下の通りである。寄託クローン
のI-FLICE-2 cDNAを、E.coliでのI-FLICE-2の発現のためのベクター構築につい
て上で詳しく記載した簡便な制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。好適
なプライマーとしては、この実施例で使用される以下のものがあげられる。５’
プライマーは、下線のBamHI部位、Kozak配列、AUG開始コドンおよび完全なI-FLI
CE-2の5'コード領域17のコドンを含有し、以下の配列を有する：
5'CGCGGATCCGCCATCATGGCAGAGATTGGTGAG3'（配列番号19）。3'プライマーは、下
線のXbaI部位、終止コドンおよび16bpの3'コード配列を含有し、（3'末端に）以
下の配列を有する：
PCR増幅DNAフラグメント、およびベクター、pcDNAI/Ampを、BamHIおよびXbaI
で消化し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning
Systems、11099 North Torrey Pines Road,La Jolla,CA 92037から入手可能)に
形質転換し、形質転換した培養物をアンピシリン培養プレートに入れ、次いでイ
ンキュベートしてアンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドDNAを耐
性コロニーから単離し、そして制限分析またはその他の手段により、I-FLICE-2
コードフラグメントの存在について試験する。
組換えI-FLICE-2を発現させるため、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning
：a Laboratory Manual、Cold Spring Laboratory Press、Cold Spring Harbor
，New York(1989)に記載されるように、DEAE-DEXTRANを用いて、上述のように、
COS細胞を発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を、このベクターによるI
-FLICE-2の発現の条件下でインキュベートする。
I-FLICE-2-HA融合タンパク質の発現は、例えば、Harlowら、Antibody：A Labo
ratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring
Harbor,New York(1988)に記載の方法を用いて、放射標識および免疫沈降法によ
り検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後、細胞を35S-シス
テイン含有培地で８時間インキュベートすることにより標識する。上述のWilson
らの文献に記載のように、細胞および培地を回収し、細胞を洗浄、界面活性剤含
有RIPA緩衝液：150mM NaCl、1%NP-40、0.1%SDS、0.5%DOC、50mM TRIS、pH7.5で
溶解する。タンパク質を、HA特異モノクロナール抗体を用い、細胞ライセートお
よび培養培地から沈殿させる。次に、タンパク質沈殿物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびオートラジオグラフィーにより分析する。期待されるサイズの発現産物は細
胞ライセートに見られ、ネガティブコントロールには見られない。
実施例３(d)：CHO細胞でのI-FLICE-2のクローニングおよび発現
ベクターpC4を、I-FLICE-2タンパク質の発現に用いる。プラスミドpC4は、プ
ラスミドpSV-dhfr（ATCC受託番号37146）の誘導体である。このプラスミドは、S
V40初期プロモーターにより制御されるマウスDHFR遺伝子を含有する。ジヒドロ
葉酸活性を欠き、これらのプラスミドでトランスフェクトしたチャイニーズハム
スター卵巣細胞またはその他の細胞を、化学療法剤メトトレキセートを補充した
選択培地（アルファマイナスMEM、Life Technologies）中で細胞を増殖させるこ
とにより選択し得る。メトトレキセート（MTX）耐性細胞内のDHFR遺伝子の増幅
については、文献に詳しく記載されている（例えば、Alt,F.W.，Kellems,R.M，B
ertino，J.R.およびSchimke，R.T.，1978，Biol．Chem．253:1357〜1370，Hamli
n，J.L.およびMa,C.1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:107〜143頁、M.J.
およびSydenham，M.A．1991，Biotechmology 9:64〜68を参照）。MTXの濃度を上
げて増殖させた細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果、標的酵素、DHFRを過剰に産生
することにより、この薬物に対して耐性を示す。第２の遺伝子をDHFR遺伝子に連
結した場合、通常、これは同時増幅および過剰発現される。当該分野において、
このアプローチを、1,000を超えるコピーの増幅遺伝子を保有する細胞株を得る
ために用い得ることは周知である。メトトレキセートを除去すると、宿主細胞の
１以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含有する細胞株が得られる。
プラスミドpC4は、目的遺伝子発現のため、ラウス肉腫ウィルスの長い末端反
復配列（LTR）の強力なプロモーター（Cullenら、Molec．Cell．Biol．5:438〜4
47(1985)）に加え、ヒトサイトメガロウィルス（CMV）の前初期遺伝子のエンハ
ンサーから単離したフラグメント（Boshartら、Cell 41:521〜530(1985)）を含
有する。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にする、BamHI、XbaI
およびAsp718制限酵素切断部位である。このプラスミドは、これらのクローンニ
ング部位の後方に、3'イントロンおよびラットプレプロインスリン遺伝子のポリ
アデニル化部位を含有する。他の高効率プロモーター（例えば、ヒトβアクチン
プロモーター、SV40初期プロモーターまたは後期プロモーター、あるいは他のレ
トロウィルス（例えば、HIVおよびMTLVI）由来の長い末端反復配列）もまた、発
現に使用し得る。また、ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子発現系および類
似の系も、規定された様式により、哺乳動物細胞でのI-FLICE-2の発現に使用し
得る（Gossen,M.およびBujard，H.1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5547
〜5551）。mRNAのポリアデニル化には、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモ
ンまたはグロブリン遺伝子から）もまた使用し得る。さらに、染色体に組み込ま
れた目的遺伝子を保有する安定細胞株もまた、gtp、G418またはハイグロマイシ
ン等の選択マーカーで同時トランスフェクションすることにより選択し得る。最
初に１より多くの選択マーカー、例えば、G418とメトトレキセートを用いるのが
よい。
プラスミドpC4を、制限酵素BamHI/Asp718で切断した後、当該分野において周
知の方法により、ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化する。このベクター
を次いで、１％アガロースゲルから単離する。
完全なI-FLICE-2タンパク質配列をコードするDNA配列を、遺伝子の5'および3'
配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。5'プライ
マーは以下の配列：
を有し、真核生物細胞での翻訳開始の有効なシグナルである下線のBamHI制限酵
素部位（Kozak，M.、J．Mol．Biol．196:947〜950(1987)に記載）、続いて、図4
A〜4Cに示される完全なI-FLICE-2タンパク質の配列に基づく、AUG開始コドンで
始
まる17(304〜321)塩基を含有する。3'プライマーは、以下の配列：
5'CGCGGTACCAGAGCATGCAGTGTCAG3'（配列番号22）を有し、下線のＡｓｐ７１８制
限部位、続いて、図4A〜4C（配列番号５）の3'非コード配列に相補的なヌクレオ
チド（すなわち、1400〜1416）を含有する。
増幅フラグメントを、エンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718で消化し、次い
で再度１％アガロースゲルで精製する。次に、この単離フラグメントおよび脱リ
ン酸化ベクターを、T4 DNAリガーゼで連結し、E.coli HB101またはXL-1 Blue細
胞を次いで形質転換し、細菌がプラスミドpC4に挿入したフラグメントを含有す
るすることを、例えば、制限酵素分析により確認する。
活性DHFR遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクシ
ョンに使用する。５μｇの発現プラスミドpC4を、リポフェクチンを用い、０．
５μｇのプラスミドpSV2-neoで同時トランスフェクトする（Felgnerら、上述）
。プラスミドpSVneoは、優性選択マーカー、Ｇ４１８含有抗生物質の群に耐性を
付与する酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子を含有する。細胞を、１mg/mlのG
418を補充したアルファマイナスMEMに導入する。２日後、細胞をトリプシン処理
し、10、25または50ng/mLのメトトレキセートおよび１mg/mLのG418を補充したア
ルファマイナスMEMを添加したハイブリドーマクローニングプレート（Greiner、
ドイツ）に入れる。約10〜14日後、単一クローンをトリプシン処理した後、異な
る濃度（50nM、100nM、200nM、400nM、800nM）のメトトレキセートを使用した６
ウェルペトリ皿または10mLフラスコに入れる。最高濃度のメトトレキセートで増
殖させたクローンを、次いでさらに濃度の高い（1μM、2μM、5μM、10μM、20
μM）メトトレキセートを含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、100
〜200μMの濃度で増殖するクローンを得るまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発
現を、例えば、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットまたは逆相HPLC分析により分
析する。
実施例４(a)：I-FLICE-1 mRNA発現の組織分布
ヒト組織におけるI-FLICE-1遺伝子の発現を調べるため、とりわけ上述のSambr
ookらにより記載された方法を採用し、ノーザンブロット分析を行った。I-FLICE
-1タンパク質（配列番号１）の全ヌクレオチド配列を含有するcDNAプローブを、
rediprimeTMDNA標識システム（Amersham Life Science）を用い、製造元マニュ
アルに従って32Pで標識した。標識後、CHROMA SPIN−100TMカラム（Clontech La
boratories,Inc）を用い、製造元プロトコル番号PT1200-1に従ってプローブを精
製した。次に、精製標識プローブを、I-FLICE-1 mRNAについて種々のヒト組織を
試験するために使用した。
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（IM）を含むMultiple Tissue No
rthern（MTN）ブロットをClontechから入手し、ExpressHybTMハイブリダイゼー
ション溶液（Clontech）を用い、製造元プロトコル番号PT1190-1に従って標識プ
ローブで検出した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、ブロットを−７０
℃で一晩でフィルムにマウントおよび曝露し、そして標準的な手順に従ってフィ
ルムを感光した。
２つの転写物（7.5kbおよび6kb）が観察され、これらは、I-FLICE-1およびI-F
LICE-2をコードするmRNA配列を示すと思われる。I-FLICEの発現は、脳およびリ
ンパ芽球性白血病株MOLT4を除き、調べた組織および細胞株のほとんどで同定さ
れた。特に、I-FLICEの発現は、末梢血白血球、脾臓、胎盤および心臓で顕著で
あった。
実施例４(b)：I-FLICE-2 mRNA発現の組織分布
ヒト組織におけるI-FLICE-2遺伝子の発現を調べるため、とりわけ上述のSambr
ookらにより記載された方法を採用し、ノーザンブロット分析を行う。I-FLICE-2
タンパク質（配列番号６）の全ヌクレオチド配列を含有するcDNAプローブを、re
diprimeTMDNA標識システム（Amersham Life Science）を用い、製造元マニュア
ルに従って32Pで標識する。標識後、CHROMA SPIN-100TMカラム（Clontech Labor
atories,Inc）を用い、製造元プロトコル番号PT1200-1に従ってプローブを精製
する。次に、精製標識プローブを、I-FLICE-2 mRNAについて種々のヒト組織を試
験するために使用する。
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（IM）を含むMultiple Tissue No
rthern（MTN）ブロットをClontechから入手し、ExpressHybTMハイブリダイゼー
ション溶液（Clontech）を用い、製造元プロトコル番号PT1190-1に従って、標識
プローブで検出する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、ブロットを−７
０℃で一晩でフィルムにマウントおよび曝露し、そして標準的な手順に従ってフ
ィルムを感光した。
実施例５：I-FLICE-1のFLICEおよびMch4/FLICE-2との関連性
これまでの研究で、DEDドメインは、アダプター分子FADDのエフェクタープロ
テアーゼ、FLICEおよびMch4/FLICE2への結合を媒介するタンパク質相互作用モチ
ーフであることが示されている（Muzioら、Cell、85:817〜27(1996);Chinnaiyan
ら、Cell、81:505〜12(1995)）。構造的に非常に類似していることから、以下の
実験を行い、I-FLICE-1がFADDまたは他のFLICE様カスパーゼのいずれかと相互作
用を行うか否かについて調べた。
材料および方法
細胞株および発現ベクターヒト胚性腎臓293,293Tおよび293-EBNA細胞を、１０
％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、L-グルタミンおよびペニシリン／ストレプト
マイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地で培養した。発現構築物を、
標準的な組換え方法論（Sambrook,J.ら、Molecular Cloning第２版、Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press）を用い、pcDNA３またはｐcDNA3.1/MycHisA(Invitr
ogen)において構築した。
I-FLICE-1のクローニング−I-FLICE-1のオープンリーディングフレームに一部
に対応するcDNAを、確立されたEST法（Adams,M.D.ら、Science 252:1651〜1656(
1991)およびAdams,M.D.ら、Nature 355:632〜634(1992)）を用いてHuman Genome
Sciencesのデータベースの検索に基づいて、FLICEおよびMch4/FLICE2の配列相
同性について同定した。全長cDNAを、pcDNA１ベクター（Invitrogen）で構築し
たランダムプライム法によるヒト臍血管内皮細胞cDNAライブラリーのスクリーニ
ングにより得た。I-FLICE-1の配列を、改変Ｔ７DNAポリメラーゼ（Sequenase,U.
S.Biochemical Corp.）を用いたジデオキシ鎖終結法による両鎖上のプラスミドD
NA鋳型の配列決定により確認した。
トランスフェクション、免疫共沈降およびウエスタン分析−293T細胞の一過性
トランスフェクションを、上述のようにして行った（O'Rourkeら、J．Biol．Che
m．267:24921〜24924(1992)）。トランスフェクションの40時間後、細胞を回収
し、α-FLAGまたはαmyc抗体で免疫沈降を行い、イムノブロッティングにより分
析した。
結果および考察
全長cDNA配列の分析の結果、推定分子量55.3kDa（図1A〜1B）の新規タンパク
質をコードする1443塩基対のオープンリーディングフレームが明らかにされた。
このタンパク質は、FLICEおよびMVch4/FLICE2と顕著な相同性を有するが、活性
部位を欠くので、強力な優性ネガティブインヒビターとし、I-FLICE（FLICEのイ
ンヒビター）と命名した。
I-FLICE-1の構造は、FLICEおよびMch4/FLICE2と非常に類似し、２つのＮ末端D
ED様タンデム反復およびカスパーゼ触媒ドメインに似た領域を含んだ。重要なこ
とは、I-FLICE-1が、通常、既知のすべてのカスパーゼに存在する保存ペンタペ
プチドQACRGまたはQACQGモチーフに固定されている触媒性システインを含んでい
なかったことである。ペンタペプチド配列はQNYVVであった。さらに、カスパー
ゼ−１（およびカスパーゼ−３）のＸ線結晶解析に基づいて、アミノ酸残基His2 37
（His121）、Gly238（Gly122）およびCys285（Cys163）は触媒に関与し、一方
で、残基Arg179（Arg64）、Gln283（Gln161）、Arg341（Arg207）およびSer347
（Ser213）がP1アスパラギン酸のカルボキシル側鎖の結合ポケットを構成する（
Wilson,K.P.ら、Nature 379:270〜274(1994)、Rotonda,J.ら、Nat．Struct．Bio
l．3:619〜625(1996)およびFraser,A.ら、Cell 85:781〜784(1996)）。これらの
７残基はすべてのカスパーゼに保存されているが、このうち３つ（Gly、Glnおよ
びSer）のみはI-FLICE-1に見出される。触媒作用および基質結合に関与する重要
な残基が保存されていないことから、I-FLICE-1はシステインプロテアーゼでは
なく、P1位でのAsp結合能を持たないと結論づけることができる。興味深いこと
は、I-FLICE-1のDEDドメインは、ウイルスDED含有インヒビターK13、MC159およ
びE8に存在する対応ドメインとより関連し、それぞれ、34％、31％および３３％
の同一性を共有した（類似性は56％、51％および44％）（Hu,S.ら、J.Biol．Che
m．272.9621〜9624
(1997)およびThorne,M.ら、Nature 386:517〜521(1997)）。
免疫共沈降分析の結果、I-FLICE-1は、FADDではなくFLICEおよびMch4/FLICE2
との結合能を明らかにした。これについて、I-FLICE-1は、FLICEと結合するがFA
DDとは結合しない点で、ウイルスDED含有分子E8と類似する（Huら、J．Biol．Ch
em．272:9621〜9624(1997)；Bertinら、Proc.Natl.Acad.Sci．94:1172〜1176(19
97)）。I-FLICE-1とFADDとが結合しなかったことから、I-FLICE-1は、ＣＤ−９
５またはＴＮＦＲ−１シグナリング複合体に再結合しなかった。これは、これら
のレセプターと同時沈澱し得ないことにより裏付けられる。
実施例６：細胞死アッセイ
FLICE様カスパーゼと複合体形成する触媒的に不活性なI-FLICE-1の能力により
、本発明者らは、すべてのカスパーゼの活性形態が２つのチモーゲン形態から４
鎖凝集体へのプロセスに由来する四量体であることから、I-FLICE-1が優性ネガ
ティブインヒビターとして作用し得ると理由づけた。その後、触媒的に不活性な
チモーゲン、例えばI-FLICE-1は、不活性なサブユニットにプロセスされ、非機
能性四量体プロテアーゼが生成する。この機構により、I-FLICE-1は、FLICE様カ
スパーゼが重要な役割を担うTNFR-1およびCD-95誘導性アポトーシスを阻害する
はずであることが予測される。以下の細胞死アッセイを行った。
材料および方法
細胞死アッセイ−ヒト胚性腎臓293（TNFR-1死滅）または293EBNA細胞（CD-95
死滅）を、0.1μgのレセプタープラスミドpCMVβ-ガラクトシダーゼおよび0.5μ
gのテストプラスミドで、2.0μg阻害プラスミドの存在下または非存在下で一過
性トランスフェクションした。トランスフェクトの22〜24時間後、細胞を、0.5
％グルタルアルデヒドで固定し、X-galで染色した。アポトーシス細胞のパーセ
ントを、全青色細胞の関数として気泡形成（blebbed）青色細胞の割合を計算す
ることにより決定した。すべてのアッセイを２回行い、平均と標準偏差を算出し
た。
結果
予測した機構に一致して、I-FLICE-1の過剰発現は、先に同定されたインヒビ
ター、CrmA、MC159、優性ネガティブFLICE（DNFLICE）およびMch4/FLICE2(DNFLI
CE2)に匹敵するTNFR-1誘導細胞死の実質的な阻害を生じた（図6A参照）。しかし
、本実験条件下では、I-FLICE-1は、CD-95誘導細胞死のインヒビターとしての効
果は低く、おそらくこのレセプターからより強力な死のシグナルが出ている（図
6B参照）。
本発明は、特に、上記詳細な説明および実施例に記載された以外で実施され得
ることは明らかである。本発明は、上記の教示に鑑み、多くの変更および変形が
可能であり、従ってそれらは、添付の請求の範囲に含まれる。
本明細書中において援用されたすべての出版物（特許、特許出願、雑誌の記事
、研究室マニュアル、書籍または他の文献）の全開示内容は、本明細書中で参考
として援用される。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/64
1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
5/10 Ａ６１Ｋ 45/00
9/64 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ
// Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ
(72)発明者 ニ，ジアン
アメリカ合衆国 メリーランド 20853,
ロックビル，マノアフィールド ロード
5502
(72)発明者 ローゼン，クレイグ エイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20882,
レイトンズビル，ローリング ヒル ロー
ド 22400
(72)発明者 ディキシット，ビシュバ エム.
アメリカ合衆国 カリフォルニア 94022,
ロス アルトス ヒルズ，シャディ オー
クス コート 26750
(72)発明者 ジェンツ，ライナー エル.
アメリカ合衆国 メリーランド 20904,
シルバー スプリング，フェアランド パ
ーク ドライブ 13404
(72)発明者 ケニー，ジョセフ ジェイ.
アメリカ合衆国 メリーランド 20851,
ロックビル，ボルチモア ロード2014，ア
パートメント エイチ12