[go: up one dir, main page]

JP2001509663A - Human tumor necrosis factor receptor-like gene - Google Patents

Human tumor necrosis factor receptor-like gene

Info

Publication number
JP2001509663A
JP2001509663A JP51461098A JP51461098A JP2001509663A JP 2001509663 A JP2001509663 A JP 2001509663A JP 51461098 A JP51461098 A JP 51461098A JP 51461098 A JP51461098 A JP 51461098A JP 2001509663 A JP2001509663 A JP 2001509663A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
receptor
polypeptide
amino acid
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP51461098A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
エム． グリーン，ジョン
ディー． フレイシュマン，ロバート
ニ，ジアン
Original Assignee
ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド filed Critical ヒューマン ジノーム サイエンシーズ，インコーポレイテッド
Publication of JP2001509663A publication Critical patent/JP2001509663A/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明者らは、腫瘍壊死因子（TNF）レセプターファミリーの新規のレセプターを発見した。特に、２型TNFレセプター（TNF-RII）に相同性を有するレセプターが提供される。本発明の新規のレセプターをコードする単離された核酸分子もまた提供される。レセプターポリペプチド、ならびにこれを産生するためのベクター、宿主細胞、および組換え法が、さらに提供される。   (57) [Summary] The present inventors have discovered a novel receptor of the tumor necrosis factor (TNF) receptor family. In particular, a receptor having homology to the type 2 TNF receptor (TNF-RII) is provided. Also provided is an isolated nucleic acid molecule encoding a novel receptor of the present invention. Further provided are receptor polypeptides, and vectors, host cells, and recombinant methods for producing the same.

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト腫瘍壊死因子レセプター様遺伝子 発明の背景 発明の分野 本発明者らは、腫瘍壊死因子（TNF）レセプターファミリーの新規のレセプタ ーを発見した。特に、２型TNFレセプター（TNF-RII）に相同性を有するレセプタ ーが提供される。本発明の新規のレセプターをコードする単離された核酸分子も また提供される。レセプターポリペプチド、ならびにこれを産生するためのベク ター、宿主細胞、および組換え法がさらに提供される。 関連技術 ヒト腫瘍壊死因子α（TNF-α）およびβ（TNF-βまたはリンホトキシン）は、 ポリペプチド媒介物の広範なクラスの関連するメンバーである。ポリペプチド媒 介物には、インターフェロン、インターロイキン、および成長因子（集合的にサ イトカインと呼ばれる）が含まれる(Beutler，B.およびCerami，A.，Annu．Rev. Immunol.，7:625-655(1989))。 腫瘍壊死因子（TNF-αおよびTNF-β）は、元々、その抗腫瘍活性の結果として 発見されたが、現在は、生物学的なプロセスおよび病理学の宿主における重要な 役割を演じる多面的なサイトカインとして認識される。現在までに、TNF関連サ イトカインファミリー、TNF-α、TNF-β（リンホトキシン-α）、LT-β、TRAIL ならびにFasレセプター、CD30、CD27、CD40、OX40、および4-1BBレセプターのリ ガンドの10個の公知のメンバーが存在する。これらのタンパク質は、TNF-βを除 き、膜アンカーとしてしばしば使用される保存Ｃ末端配列および可変Ｎ末端配列 を有する。TNF-αおよびTNF-βの両方が、TNFレセプターに結合した場合、ホモ トリマーとして機能する。 TNFは、多くの細胞型（単球、線維芽細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（NK） 細胞を含む）によって、そして主に、活性化されたマクロファージによって産生 される。TNF-αは、腫瘍の迅速な壊死、免疫刺激、自己疾患、移植片拒絶、抗ウ イルス応答の生成、敗血症性ショック、大脳マラリア、細胞傷害性、化学治療の 間に生成される電離放射線の有害な効果（例えば、酵素の変性、脂質の過酸化、 およびDNA損傷）に対する防御(Nataら、J．Immunol．136(7):2483(1987))、成長 調節、脈管内皮効果、および代謝効果における役割を有することが報告されてい る。TNF-αはまた、内皮細胞による種々の因子（PAI-1、IL-1、GM-CSF、IL-6を 含む）の分泌を誘発して、細胞増殖を促進する。さらに、TNF-αは、Ｅセレクチ ン、ICAM-1、およびVCAM-1のような種々の細胞接着分子をアップレギュレートす る。TNF-αおよびFasリガンドはまた、プログラムされた細胞死を誘導すること が示されている。 TNF-βは、抗ウイルス状態および肺瘍壊死の誘導、多形核白血球の活性化、ク ラスI主要組織適合性複合体抗原の内皮細胞上への誘導、接着分子の内皮上への 誘導、ならびに成長ホルモン刺激を含む多くの活性を有する(Ruddle，N.およびH omer，R.，Prog．Allergy，40:162-182(1988))。 「ノックアウト」マウスを用いた最近の研究は、TNF-β産生に欠損があるマウ スが、末梢リンパ器官の異常な発達および脾臓の構造における形態学的な変化を 示すことを示した(Aggarwalら、Eur Cytokine Netw，7(2)：93-124(1996)で概説 )。リンパ器官に関して、膝窩の、鼠径部の、大動脈傍の、腸間膜の、腋窩の、 および子宮頸部のリンパ節は、TNF-β-/-マウスにおいて発達しなかった。さら に、TNF-β-/-マウスからの末梢血は、正常マウスに比較して白血球が３倍減少 していた。しかし、TNF-β-/-マウス由来の末梢血は、その正常の対応物に比較 して４倍多いＢ細胞を含んでいた。さらに、TNF-βは、TNF-αと比較して、EBV 感染Ｂ細胞の増殖を誘導することが示されている。これらの結果は、TNF-βが、 リンパ球の発達に関与することを示す。 TNFまたはLTによって媒介される種々の細胞性応答の誘導における第一の工程 は、特定の細胞表面または可溶性レセプターへの結合である。約55kDa（TNF-RI ）および75kDa（TNF-RII）の２つの異なるTNFレセプターが同定されており(Hohm anら、J．Biol．Chem.，264:14927-14934(1989))、両方のレセプター型に対応す るヒトおよびマウスcDNAが、単離され、そして特徴づけられている(Loetsche rら、Cell，61:351(1990))。両方のTNF-Rは、細胞外領域、膜貫通領域、および 細胞内領域を含む細胞表面レセプターの典型的な構造を共有する。 これらの分子は、細胞に結合した形態においてだけでなく、インタクトなレセ プターの切断された細胞外ドメインからなる可溶性形態(Nopharら、EMBO Journa l，9(10):3269-76(1990))、およびさもなくば膜貫通ドメインが欠失したインタ クトなレセプターにおいても存在する。TNF-RIおよびTNF-RIIの細胞外ドメイン は、28％の同一性を共有し、そして有意なサブユニット間配列相同性を有する４ つの反復システインリッチモチーフによって特徴づけられる。大部分の細胞型お よび組織は、両方のTNFレセプターを発現するようであり、そして両方のレセプ ターが、シグナル伝達において活性であるが、それらは異なる細胞性応答を媒介 し得る。さらに、TNF-RIIは、PCT WO 94/09137に示されるように、TNFによるヒ トＴ細胞増殖のみを媒介する。 TNF-RI依存性応答には、C-FOS、IL-6、およびマンガンスーパーオキシドジス ムターゼmRNAの蓄積、プロスタグランジンE2合成、IL-2レセプターおよびMHCク ラスIおよびII細胞表面抗原の発現、成長阻害、ならびに細胞傷害性が含まれる 。TNF-RIはまた、ホスホリパーゼA2、プロテインキナーゼＣ，ホスファチジルコ リン特異的ホスホリパーゼＣ、およびスフィンゴミエリナーゼのようなセカンド メッセンジャー系を誘発する(Pfefferkら、Cell，73:457-467(1993))。 いくつかのインターフェロンおよび他の因子が、TNF-Rの発現を調節すること が示されている。例えば、レチノイン酸は、いくつかの細胞型においてTNFレセ プターの産生を誘導する一方、他の細胞において産生をダウンレギュレートする ことが示されている。さらに、TNF-αは、両方の型のレセプターの局在化をもた らすことが示されている。TNF-αは、TNF-RIの内部移行およびTNF-RIIの分泌を 誘導する（Aggarwalら、前出において総説される）。従って、両方のTNF-Rの産 生および内部移行は、種々の因子によって調節される。 酵母ツーハイブリッド系は、両方の型のTNF-Rに会合するリガンドを同定する ために使用されてきた（Aggarwalら、前出において総説される）。いくつかのタ ンパク質が同定されており、それらは、マウスTNF-Rの細胞質ドメインと相互作 用する。これら２つのタンパク質は、アポトーシスのバキュロウイルスインヒビ ターに関連するようであり、これはプログラムされた細胞死の調節におけるTNF- Rの直接的役割を示唆する。 発明の要旨 本発明の新規の腫瘍壊死因子（TNF）ファミリーレセプターは、本明細書中で 「TR1レセプター」と呼ばれる。従って、本発明の１つの局面にしたがって、本 発明のTR1ポリペプチドをコードする単離された核酸分子（mRNA、DNA、cDNA、ゲ ノムDNA、ならびにそのアンチセンスアナログおよび生物学的に活性でありそし て診断的または治療的に有用なそのフラグメントを含む）が提供される。これら の単離された核酸分子には、図１（配列番号２）に示すアミノ酸配列、またはAT CC受託番号75899として1994年９月29日に細菌性宿主中で寄託されたcDNAクロー ンによってコードされるアミノ酸配列を有するネイティブTR1レセプターポリペ プチドをコードするポリヌクレオチド分子が含まれる。寄託されたネイティブTR 1レセプタークローンを配列決定することによって決定されたヌクレオチド配列 は、図１（配列番号１）に示され、401アミノ酸残基のポリペプチドをコードす るオープンリーディングフレーム（図１の46〜48位の開始コドンを含み、約21ア ミノ酸残基のリーダー配列を有し、そして推定分子量は全タンパク質について約 46kDa、および非グリコシル化成熟タンパク質について44kDaである）を含む。推 定の成熟ネイティブTR1レセプタータンパク質のアミノ酸配列は、図１のアミノ 酸残基約22位から約401位（配列番号２）に示される。 図２（配列番号４）に示すアミノ酸配列を有するカルボキシ末端を改変された TR1レセプターポリペプチドをコードする単離された核酸分子もまた本発明に含 まれる。図２（配列番号３）に示されるカルボキシ末端を改変されたTR1レセプ ターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、395アミノ酸残基のポリぺ プチドをコードするオープンリーディングフレーム（図２の１〜３位に開始コド ンを含み、約21アミノ酸残基のリーダー配列を有し、そして非グリコシル化成熟 タンパク質について約43kDaの推定分子量を有する）を含む。成熟カルボキシ末 端改変TR1レセプタータンパク質のアミノ酸配列は、図２の約22位〜約395位のア ミノ酸残基（配列番号４）に示される。 さらなる局面において、本発明は、(a)図１（配列番号２）または図２（配列 番号４）の全アミノ酸配列を有するTR1レセプターポリペプチドをコードするヌ クレオチド配列；(b)図１（配列番号２）の約22位〜約401位のアミノ酸配列を有 する推定成熟ネイティブTR1レセプターポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列または図２（配列番号４）の約22位から約395位までのアミノ酸配列を有す る推定成熟カルボキシ末端改変TR1レセプターポリペプチドをコードするヌタレ オチド配列；(c)ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクローンによってコードされ る全アミノ酸配列を有するネイティブTR1レセプターポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列；(d)ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクローンによってコー ドされるアミノ酸配列を有する成熟ネイティブTR1レセプターポリペプチドをコ ードするヌクレオチド配列；および(e)上記の(a)、(b)、(c)、または(d)のヌク レオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、からなる群より選択され るヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提 供する。 本発明のさらなる実施態様は、上記の(a)、(b)、(c)、(d)、もしくは(e)のヌ クレオチド配列のいずれかに、少なくとも90％同一、より好ましくは少なくとも 95％、96％、97％、98％、もしくは99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌ クレオチド、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記の (a)、(b)、(c)、(d)、もしくは(e)のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポ リヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。このハイブリダイズするポリ ヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ａ残基 のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハ イブリダイズしない。本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の(a)、(b)、(c )、または(d)のアミノ酸配列を有するTR1レセプターポリペプチドのエピトープ 保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分 子に関する。 本発明の別の局面によれば、新規の成熟ポリペプチドが提供される。これらは 、TR1レセプター、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体である 。本発明のポリペプチドは、ヒト起源であり、そして：(a)図１（配列番号２） に 示すリーダー配列を含む全401アミノ酸配列を有するネイティブTR1レセプターポ リペプチドのアミノ酸配列、または図２（配列番号４）に示すリーダー配列を含 む全395アミノ酸配列を有するカルボキシ末端改変TR1レセプターポリペプチドの アミノ酸配列：(b)図１（配列番号２）の約22位〜約401位のアミノ酸配列を有す る成熟ネイティブTR1レセプターポリペプチド（リーダーを有さない）のアミノ 酸配列、または図２（配列番号４）に示す約22位から約395位までのアミノ酸配 列を有するカルボキシ末端改変TR1レセプターポリペプチド（リーダーを有さな い）のアミノ酸配列；(c)ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクローンによってコ ードされるリーダーを含む全アミノ酸配列を有するネイティブTR1レセプターポ リペプチドのアミノ酸配列；および(d)ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクロー ンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟ネイティブTR1レセプターポ リペプチドのアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。 本発明のポリペプチドはまた、上記の(a)、(b)、(c)、もしくは(d)に記載される アミノ酸配列に、少なくとも90％の類似性、より好ましくは少なくとも95％の類 似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列 に少なくとも80％同一、より好ましくは少なくとも90％同一、そしてさらにより 好ましくは95％、96％、97％、98％、または99％同一のアミノ酸配列を有するポ リペプチドを含む。 上記の可溶性TR1レセプターポリペプチドは、膜貫通ドメインを含むアミノ酸 を含まないと考えられている。従って、さらなる局面において、本発明は、この ような膜貫通ドメイン含有アミノ酸配列を含むTR1レセプターポリペプチドを提 供する。このようなポリペプチドは、ネイティブであるか、または本明細書に記 載されるTR1レセプターから構築され得る。 本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の(a)、(b)、(c)、もしくは(d) に記載されるアミノ酸配列を有するTR1レセプターポリペプチドのエピトープ保 有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドに関する。本発明の TR1レセプターポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプ チドまたはポリペプチドは、少なくとも６または７、好ましくは少なくとも９、 そしてより好ましくは少なくとも約30アミノ酸〜約50アミノ酸を有するこのよう なポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチドのアミノ酸配列全 体までの、そしてこのアミノ酸配列を含む任意の長さのエピトープ保有ポリペプ チドもまた本発明に含まれる。別の実施態様では、本発明は、上記の(a)、(b)、 (c)、または(d)に記載されるアミノ酸配列を有するTR1レセプターポリペプチド に特異的に結合する単離された抗体を提供する。 本発明はまた、本発明の可溶性TR1レセプターポリペプチドの機能的ドメイン を提供する。これらのドメインは、図１（配列番号２）および図２（配列番号４ ）の約22位から約261位までのアミノ酸残基を含む。本発明者らは、図１および ２の約22位から約261位までのアミノ酸残基が、公知のTNF-RIIの細胞外ドメイン （図３）に相同であることを発見した。図１（配列番号２）の約262位から約401 位までのアミノ酸残基および図２（配列番号４）の約262位から約395位までのア ミノ酸残基がさらに含まれ、本発明者らは、これらが、公知のTNF-RIIの細胞内 ドメイン（図３）に相同であることを発見した。 本発明は、本明細書中に記載されるアミノ酸配列を有するTR1レセプターポリ ペプチドに特異的に結合する抗体を単離するための方法をさらに提供する。この ような抗体は、以下に記載するように、診断的または治療的に有用である。 本発明のなおさらなる局面に従って、組換え技術によってこのようなポリペプ チドを産生するためのプロセスが提供される。このプロセスは、本発明のポリペ プチドをコードする核酸配列を含有する組換え原核生物宿主細胞および/または 真核生物宿主細胞を、上記タンパク質の発現およびそのタンパク質の引き続く回 収を促進するための条件下で、培養する工程を包含する。従って、本発明はまた 、このようなベクターおよび宿主細胞を作製する方法、ならびにこれらをTR1レ セプターポリペプチドまたはペプチドの組換え技術による産生のために使用する 方法に関する。 本発明のなおさらなる局面に従って、このようなポリペプチドまたはこのよう なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して、レセプターアンタゴ ニストおよび/またはアゴニストならびに/またはレセプターリガンドをスクリー ニングするためのプロセスが提供される。TR1レセプターによって誘導される細 胞性応答を増強または阻害し得る化合物を同定するためのこのようなスクリーニ ング法は、TR1レセプターを発現する細胞を候補化合物と接触させる工程、細胞 性応答をアッセイする工程、およびこの細胞性応答を標準的な細胞性応答と比較 する工程を包含する。標準は、接触が候補化合物の非存在下でなされる場合にア ッセイされる；これにより、標準に対して増大した細胞性応答は、その化合物が アゴニストであることを示し、そして標準に対して減少した細胞性応答は、その 化合物がアンタゴニストであることを示す。 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリペプチドに特異的にハイブ リダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブが提供される。 別の局面において、TR1レセプター媒介性応答を誘発し得るか、または阻害し 得る細胞性リガンドの結合に対して候補化合物が有する効果を決定する工程を含 む、アゴニストおよびアンタゴニストのためのスクリーニングアッセイが提供さ れる。特に、この方法は、TR1レセプターポリペプチドを候補化合物と接触させ る工程、および細胞性リガンドに結合するTR1レセプターポリペプチドが、候補 化合物の存在によって、増大されるかまたは減少されるか否かを決定する工程を 包含する。さらに、このようなアッセイは、TR1レセプター媒介性応答を直接誘 発する化合物を同定するために使用され得る。 本発明のなお別の局面に従って、不十分なTR1レセプター活性に関連する状態 を処置するため（例えば、腫瘍の増殖を阻害するため、ヒト細胞性増殖（例えば 、Ｔ細胞増殖）を刺激するため、免疫応答および抗ウイルス応答を制御するため 、電離放射線の効果に対して防御するため、クラミジア感染に対して防御するた め、増殖を調節するため、およびHIVに見られるような免疫不全を処置するため ）にこのようなアゴニストを使用するプロセスが提供される。 本発明の別の局面に従って、TR1レセプターの過剰発現に関連する状態（例え ば、AIDSのようなＴ細胞媒介性自己免疫疾患、敗血症性ショック、大脳マラリア 、移植片拒絶、細胞傷害性、悪液質、アポトーシス、および炎症を処置するため のアンタゴニストを使用するプロセスが提供される。 本発明者らは、TR1レセプターが、肺組織、海馬、成体の心臓、腎臓、肝臓、 胎盤、平滑筋、胸腺、前立腺、卵巣、小腸、ならびに骨芽細胞腫および線維芽細 胞の細胞株において発現されることを発見した。さらに、本発明者らは、検出可 能な量のTR1レセプターmRNAが、胎児の脳、滑膜、滑膜肉腫、Ｔ細胞、内皮細胞 、活性化マクロファージ、リンパ節、胸腺、好中球、および活性化された好中球 に存在しないことを示した。多くの疾患について、「標準」TR1レセプター遺伝 子発現レベル（例えば、異常なTR1レセプター機能に関連する疾患の１つを有さ ない個体由来の組織または体液におけるTR1レセプター発現レベル）に比較して 、有意に高いかまたは低いレベルのTR1レセプター遺伝子発現の１つまたは両方 が、特定の組織（例えば、癌、アポトーシス、および炎症）またはこのような疾 患の患者から採取した体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、もしくは髄液）に おいて検出され得ると考えられる。従って、本発明は、異常なTR1レセプター機 能に関連する疾患の診断の間に有用な診断的方法であって、以下：（a）個体の 細胞または体液におけるTR1レセプター遺伝子発現レベルをアッセイする工程； （b）TR1レセプター遺伝子発現レベルを標準的なTR1レセプター遺伝子発現レベ ルと比較する工程であって、それにより標準の発現レベルと比較して、アッセイ されたTR1レセプター遺伝子発現のレベルの増加または減少が、異常なTR1レセプ ター機能に関連する疾患の指標である、工程を提供する。 図面の簡単な説明 図１（Ａ〜Ｂ）は、本発明のネイティブTR1レセプターポリペプチドの、cDNA 配列（配列番号１）および対応する推定のアミノ酸配列（配列番号２）を示し、 これは、膜貫通ドメインを欠いていると考えられる。最初の21アミノ酸は、推定 のリーダー配列を提示し、そして下線を付す。アミノ酸の標準的な一文字略号を 使用する。配列決定は、373自動化DNA配列決定機（Applied Biosystems，Inc.） を使用して行った。配列の正確性は、97％を超える正確であると予想される。 図２（Ａ〜Ｂ）は、本発明のＣ末端改変TR1レセプターポリペプチドの、cDNA 配列（配列番号３）および対応する推定のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。 上記と同様に、最初の21アミノ酸は、推定のリーダー配列を提示し、そして下線 を付す。配列決定および略号は、図１と同様である。 図３は、本発明のネイティブTR1レセプターポリペプチド（上段）と、公知の ヒト２型TNFレセプター（ヒトTNF-RII、下段に示される、(配列番号５)）との アミノ酸配列アラインメントを示す。 図４は、ネイティブTR1レセプターアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ター ン、およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原 性指数ならびに表面確率が示される。「抗原性指数-Jameson-Wolf」グラフにお いて、図１の20〜52、66〜203、229〜279、297〜378のアミノ酸残基は、ネイテ ィブTR1レセプタータンパク質の示される高度に抗原性の領域に対応する。 図５は、ヒトTNF-RIおよびTNF-RIIおよび本発明のネイティブTR1レセプターに 特異的なポリクローナル抗体の結合アッセイを示す。精製したネイティブTR1レ セプター（HSABH13タンパク質）を、96ウェルプレート中のウェルに添加し（100 μl／ウェル）、そして２時間インキュベートした。インキュベーション後、プ レートを３回洗浄し、そしてヒトTNF-RIおよびTNF-RIIに対するホスファターゼ 標識したヤギポリクローナル抗体（200μl）を各ウェルに添加した。さらなる２ 時間のインキュベーション後、レセプター-抗体結合体を３回洗浄し、そして200 μlの基質溶液を各ウェルに添加した。プレートをさらに１時間インキュベート した。次いで、得られた溶液のO.D.をELISAリーダーを使用して測定した（試験 波長450nm、較正波長590nm）。全ての試薬は、R&D System（Minneapolis，MN 55 413）によるものであり、そしてこれらを、製造業者の説明書に従って使用した 。 図６は、Ｉ型およびII型TNFレセプターに特異的なモノクローナル抗体に対す る、ネイティブTR1レセプターの結合アッセイを示す。精製したネイティブTR1レ セプター（HSABH13タンパク質）（100ul／ウェル）を、sTNFRIまたはsTNFRIIに 対するmAbでコートした、R&Dシステムから提供される96ウェルプレートに添加し 、そして２時間インキュベートした。洗浄緩衝液での３回の洗浄後、sTNF-RIま たはsTNF-RIIに対するホスファターゼ標識したポリクローナル抗体（200ml）を 添加した。２時間のインキュベーションおよび３回の洗浄後、200mlの基質溶液 を各ウェルに添加し、そしてプレートを１時間インキュベートした。ODをELISA リーダーを使用して測定した（試験波長450nm、較正波長590nm）。全ての試薬は 、R&D System（Minneapolis，MN 55413）によるものであった。 図７は、本発明のネイティブTR1レセプターとTNF-αまたはTNF-βの新規のTNF リガンド様タンパク質（HUVEO19）との間の、競合結合アッセイを示す。精製し たネイティブTR1レセプタータンパク質（100μl／ウェル）を、96ウェルプレー トのウェルに添加し、そして２時間インキュベートした。インキュベーション後 、プレートを３回洗浄し、10ngのTNF-αまたはTNF-βをウェルに添加し、そして プレートをさらに２時間インキュベートし、続いてさらに３回洗浄した。２連の プレートで、10ngの新規のTNFリガンド様タンパク質（HUVEO19）を、最初にネイ ティブTR1レセプターと共にインキュベートし、そして最初の３回の洗浄後、10n gのTNF-αまたはTNF-βのいずれかを第２回目のインキュベーションのためにウ ェルに添加した。各プレートについて、ウェルを３回洗浄し、そしてTNF-αまた はTNF-βに対するホスファターゼ標識したポリクローナル抗体（200μl）を添加 した。さらに２時間のインキュベーション後、ウェルを３回洗浄し、そして200 μlの基質溶液を各ウェルに添加した。次いで、プレートを１時間インキュベー トし、そしてO.D.をELISAリーダーを使用して測定した（試験波長450nm、較正波 長590nm）。全ての試薬は、上記のように、R&D System（Minneapolis，MN 55413 ）によるものであった。 図８は、本発明のネイティブTR1レセプターと、TNF-αおよび上記の新規のTNF リガンド様タンパク質のヒトTNF-RIおよびTNF-RIIとの間の、競合結合アッセイ を示す。精製したネイティブTR1レセプタータンパク質（100μl／ウェル）を、T NF-αまたは新規のTNFリガンド様タンパク質（HUVEO19）で予めコートした96ウ ェルプレートのウェルに添加し、そして２時間インキュベートした。インキュベ ーション後、プレートを３回洗浄し、10ngのヒトTNF-RIまたはTNF-RIIをプレー トに添加した。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートした。２時間の インキュベーション後、ウェルを３回洗浄した。２連のプレートで、ネイティブ TR1レセプターを除去し、10ngのヒトTNF-RIまたはTNF-RIIのいずれかを添加した 。２回目の２時間のインキュベーション後、プレートを３回洗浄し、そしてヒト TNF-RIまたはTNF-RIIに対するホスファターゼ標識したポリクローナル抗体（200 μl）を各ウェルに添加した。さらに２時間のインキュベーション後、プレート を３回洗浄し、200μlの基質溶液を各ウェルに添加し、そしてプレートを１時間 インキュベートした。次いで、O.D.をELISAリーダーを使用して測定した（試験 波長450nm、較正波長590nm）。全ての試薬は、上記のように、R&D System（Minn ea polis，MN 55413）によるものであった。 図９は、ポリクローナルウサギ抗-TR1抗体のスクリーニングアッセイ（ELISA ）を示す。ポリクローナルウサギ抗TR1抗体を、標準的なプロトコールに従ってP ocono Rabbit Farm & Laboratory，Inc．（Canadensis，PA 18325）によって調 製した。ウサギの血清を、ELISAによって試験した。詳細には、プレートをTR1で 、室温で２時間または４℃で一晩コートした（TNFr batch HG02900-1-Bとして標 識した）。PBSでの洗浄後、これらを１％のBSAおよび0.5％のアジ化ナトリウム を含有するPBSで４℃で一晩ブロックした。PBS-BSAを、ウェルを軽くはじき、そ して試験上清を添加し、そして室温で１時間インキュベートした。PBSでの３回 の洗浄後、50mlの抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（１％のBSAを 含有するPBSでの1:1000希釈）を添加し、そして0.5〜１時間、室温でインキュベ ートした。PBSでの３回の洗浄後、IgG西洋ワサビペルオキシダーゼの基質溶液を プレートに添加し、そして10〜30分間室温でインキュベートした。反応を、50ml の0.1ＭのEDTAの添加によって停止させた。吸光度を450nmで読みとった。 好ましい実施態様の詳細な説明 核酸分子 他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定 されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied B iosystems，Inc.からのModel 373）を用いて決定され、そして本明細書中で決定 されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、 上記のように決定されるDNA配列の翻訳によって予想された。従って、この自動 化アプローチによって決定された任意のDNA配列について当該分野において公知 のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを 含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるDNA 分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90％の同一、 より代表的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9％の同一である。実際の 配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のアプローチに よってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配 列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、 ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定 されるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、配列 決定されるDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なり 、挿入または欠失のような点にて始まる。 他に示されない限り、本明細書中に示される各「ヌクレオチド配列」は、デオ キシリボヌクレオチド(A，G，C，およびTと省略される)の配列として示される。 しかし、核酸分子またはポリヌクレオチドの「核酸配列」によって、DNA分子ま たはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そしてRN A分子またはポリヌクレオチドにはリボヌクレオチド(A，G，C，およびU)の対応 する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオ キシヌクレオチド(T)は、リボヌクレオチドのウリジン(U)によって置き換えられ る）が意図される。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される 配列番号１の配列を有するRNA分子との言及は、配列番号１の各デオキシヌクレ オチドA，GまたはCが、対応するリボヌクレオチドA，G，またはCによって置き換 えられ、そして各デオキシヌクレオチドTが、リボヌクレオチドUによって置き換 えられる配列を有するRNA分子を示すことが意図される。 用語「遺伝子」または「シストロン」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するDN Aのセグメントを意味し；これは、コード領域の前および後の領域（リーダーお よびトレイラー）、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配 列（イントロン）を含む。 本発明の１つの局面に従って、以下を有する推定の成熟したネイティブTR1レ セプターポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される：図１（配列番 号２）の推定のアミノ酸配列、または1994年９月28日にアメリカンカルチャータ イプコレクション（12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852）に寄 託本号75899で寄託されたクローンのcDNAによってコードされる成熟ネイティブT R1レセプターポリペプチドのアミノ酸配列を有するhuXAG-2ポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド。図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、 ATCCに寄託されたHASBH13を配列決定することによって得られる。寄託されたク ローンは、pBluescript SK(-)プラスミド（Stratagene，LaJolla，Ca）に含まれ ている。 図２の推定のアミノ酸配列を有する成熟したカルボキシ末端改変TR1レセプタ ーポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）がまた、提供 される。これは、図１（配列番号１）に示されるカルボキシ末端アミノ酸残基で フレームシフトを含む。このフレームシフトの存在ために、当業者に理解される ように、改変されたカルボキシ末端を有する機能的なTR1レセプターは、図２（ 配列番号３）によってコードされる。この結論は、配列の残りが実質的に変化し ないままであるという事実に基づく。 当業者は、図２（配列番号４）に示されるこのようなカルボキシ末端改変TR1 レセプターの、ATCC寄託番号75899に含まれるcDNAクローンから、または単離さ れた天然に存在するポリヌクレオチドからの標準的な産生を、組換えDNA技術を 使用して容易に行い得る。これは、Molecular Cloning，A Laboratory Manual, 第２版、Sambrook，J.，Fritsch，E．F.およびManiatis，T.編、Cold Spring Ha rbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．(1989)を含む多くの出典に 記載されている。 本明細書中で提供される情報を使用して、図１（配列番号１）または図２（配 列番号＃）のヌクレオチド配列のような、本発明のポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含むcDNA分子は、多数のヒト組織（肺組織、海馬、成体の心臓 、腎臓、肝臓、胎盤、平滑筋、胸腺、前立腺、卵巣、小腸組織、および骨芽細胞 腫、ならびに線維芽細胞株を含む）から得ることができる。本発明者らは、本発 明のネイティブTR1レセプターが上記の組織および細胞型のそれぞれで発現され ることを発見した。 ATCC寄託番号75899に含まれるcDNAクローンは、ヒト初期継代線維芽細胞（HSA 172細胞）由来のcDNAライブラリーから単離され、そして先行技術のヒトTNF-RII レセプターと構造的に関連する。図３（配列番号５）を参照のこと。図１（配列 番号１）のTR1レセプターcDNAの決定されたヌクレオチド配列は、図１（配列番 号１）のヌクレオチド配列の46〜48位に開始コドンを含み、そして401アミノ酸 残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、その最 初の約21アミノ酸残基は推定のリーダー配列であり、その結果成熟タンパク質は 約380アミノ酸を含む。タンパク質は、TNF-R2に対して最も高い程度の相同性を 示し、タンパク質の全長にわたって約27％の同一性および約43％の類似性を有す る。全てのTNFレセプター中の40残基のモジュール中に存在する６つの保存され たシステインは、このレセプターで保存されている。 示されるように、本発明はまた、本発明のTR1レセプタータンパク質の成熟し た形態を提供する。１つの仮説に従って、哺乳動物細胞から分泌されるタンパク 質は、シグナルまたは分泌リーダー配列を有し、これは、一旦、粗雑な内質の網 状組織を通過する成長しつつあるタンパク質鎖の輸送開始されると、成熟タンパ ク質から切断される。ほとんどの哺乳動物細胞および昆虫細胞もなお、同じ特異 性で分泌されたタンパク質を切断する。しかし、いくつかの場合、分泌されたタ ンパク質の切断は、完全には同一ではなく、これによってタンパク質について２ つ以上の成熟種が生じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断の特異性が完全 なタンパク質の一次構造によって究極的に決定される、すなわち、切断の特異性 はポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが知られている。従って、本発 明は、ATCC寄託番号75899として同定された宿主中に含まれる、そして図１（配 列番号２）および図２（配列番号４）に示されるcDNAクローンによってコードさ れるアミノ酸配列を有する成熟したTR1レセプターポリペプチドをコードするヌ クレオチド配列を提供する。ATCC寄託番号75899として同定された宿主中に含ま れるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟したTR1レセ プターは、寄託された宿主中のベクターに含まれるcDNAクローンのヒトDNA配列 によってコードされる完全なオープンリーディングフレームの哺乳動物細胞中で の発現によって産生される、TR1レセプタータンパク質の成熟した形態をいう。 以下に示されるように、ATCC寄託番号75899に含まれるcDNAクローンによってコ ードされるアミノ酸配列を有する成熟したTR1レセプターは、コンピューター分 析に基づく推定の切断部位の正確性に依存して、図１に示される推定の「成熟し た」TR1レセプタータンパク質（約22から約401までのアミノ酸）とは異なってい てもいなくてもよい。 タンパク質が分泌リーダーならびにこのリーダー配列のための切断点を有する か否かを予測する方法が利用可能である。なぜなら、シグナル配列内および成熟 タンパク質のＮ末端の特定のアミノ酸残基、特に切断部位のごく周囲の残基に存 在する分泌タンパク質に対する多くの切断特異性が公知であるからである。例え ば、McGeoch(Virus Res．3:271-286(1985))の方法は、完全（切断されていない ）タンパク質の短いＮ末端荷電領域および続く非荷電領域からの情報を使用する 。von Heinje(Nucleic Acids Res．14:4683-4690(1986))の方法は、切断部位、 代表的には残基-13〜+2（ここで、+1は成熟タンパク質のアミノ末端を示す）の 周囲の残基からの情報を使用する。これらの各方法についての既知の哺乳動物分 泌タンパク質の切断点を予測することの正確さは、75〜80％の範囲である。von Heinje、前出。しかし、２つの方法は、所定のタンパク質の同じ予測される切断 点を常に生じるわけではない。 本発明の場合において、本発明の完全TR1レセプターポリペプチドの予測され るアミノ酸配列は、コンピュータープログラム（「PSORT」）によって分析され た。このプログラムは、Institute for Chemical Research，Kyoto University のDr．Kenta Nakaiから入手可能であり(K.NakaiおよびM.Kanehisa，Genomics l4 :897-911(1992)を参照のこと)、これはアミノ酸配列に基づくタンパク質の細胞 性局在化を予測するための熟練したシステムである。局在化のこのコンピュータ ーによる予測の一部として、McGeochおよびvon Heinjeの方法が組み込まれてい る。PSORTプログラムによる分析は、図１（配列番号２）および図２（配列番号 ４）のアミノ酸21と22との間の切断部位を予測した。その後、完全なアミノ酸配 列が、von Heineの(-1,-3)の規則の簡単な形態を適用される視覚的検査によって さらに分析された。von Heinje、前出。従って、ネイティブTR1レセプタータン パク質についてのリーダー配列は、図１（配列番号２）のアミノ酸残基１〜21か らなることが予測されるが、予測される成熟ネイティブTR1レセプタータンパク 質は、残基22〜401からなり、そして、カルボキシ末端が改変されたTR1レセプタ ータンパク質についてのリーダー配列は、図２（配列番号４）のアミノ酸残基１ 〜21からなることが予測されるが、予測される成熟ネイティブTR1レセプタータ ンパク質は、図２（配列番号４）の残基22〜395からなる。 従って、上記を鑑みれば、当業者は理解するように、本発明のTR1レセプター タンパク質の実在のリーダー配列は、約21アミノ酸長と予測されるが、約16〜約 27アミノ酸の範囲のどこででもあり得る。本発明のTR1レセプターは、可溶性レ セプターであり、そして分泌される。しかし、これらはまた、膜貫通領域ならび に細胞内領域および細胞外領域を有する膜結合レセプターとしても存在し得る。 本発明のポリペプチドは、TNFおよびリンホトキシンリガンドまたは他のTNFリガ ンドファミリーメンバーと結合し得る。 本発明の局面に従って、RNAの形態であり得るかまたはDNA（DNAはcDNA、ゲノ ムDNA、および合成DNAを含む）の形態であり得るポリヌクレオチドが提供される 。DNAは、二本鎖または一本鎖であり得、一本鎖はコード鎖でまたは非コード（ アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図 １（配列番号１）、図２（配列番号３）に示されるコード配列、もしくは寄託さ れたクローンの配列と同一であり得るか、または遺伝子コードの重複もしくは縮 重の結果として、コード配列が、図１（配列番号１）、図２（配列番号３）、も しくは寄託されたcDNAのDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード 配列であり得る。 図１（配列番号２）、図２（配列番号４）の成熟ポリペプチドをコードするか 、または寄託されたcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドは、以下を含む：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリ ペプチドのコード配列およびリーダー配列もしくは分泌配列またはプロタンパク 質配列のようなさらなるコード配列；成熟ポリペプチドに対するコード配列（お よび必要に応じてさらなるコード配列）ならびに非コード配列（例えば、イント ロンまたは成熟ペプチドのコード配列の5'および／もしく3'の非コード配列）。 従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチ ドに対するコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコードお よび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 本発明はさらに、図１（配列番号２）、図２（配列番号４）の推定アミノ酸配 列を有するポリペプチド、または寄託されたクローンのcDNAによってコードされ るポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体をコードする本明細書中 上記のポリヌクレオチドの変異体に関する。このポリヌクレオチドの変異体は、 ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体またはこれらのポリヌクレ オチドの天然に存在しない変異体であり得る。 寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）もしくは図２（ 配列番号４）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグ メントによって、本明細書中で考察される診断プローブおよびプライマーとして 有用である、少なくとも約15nt、より好ましくは少なくとも約20nt、なおより好 ましくは少なくとも約30nt、およびさらにより好ましくは少なくとも約40ntの長 さのフラグメントが意図される。もちろん、50〜1000ntの長さのより長いフラグ メントはまた、図１（配列番号１）図２（配列番号３）に示されるヌクレオチド 配列、寄託されたcDNAの全てではないがほとんどに対応するフラグメントとして 、本発明に従って有用である。例えば、少なくとも20ntの長さのフラグメントに よって、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）もしくは 図２（配列番号３）に示されるようなヌクレオチド配列からの20より多い連続し た塩基を含むフラグメントが意図される。寄託された遺伝子ならびに図１（配列 番号１）図２（配列番号３）に示されるヌクレオチド配列が提供されるので、こ のようなDNAフラグメントを生成することは当業者には日常的である。例えば、 制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波処理による剪断は、種々のサイズのフ ラグメントを生成するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグ メントは合成的に生成される。 本発明の好ましい核酸フラグメントは、TR1レセプタータンパク質のエピトー プを有する部分をコードする核酸分子を含む。詳細には、本発明のこのような核 酸フラグメントは、以下をコードする核酸分子を含む：図１（配列番号２）また は図２（配列番号４）中のアミノ酸残基約20〜約52を含むポリペプチド；図１（ 配列番号２）または図２（配列番号４）中のアミノ酸残基約66〜約203を含むポ リペプチド；図１（配列番号２）または図２（配列番号４）中のアミノ酸残基約 229〜約279を含むポリペプチド；および図１（配列番号２）のアミノ酸残基約29 7〜約378を含むポリペプチド。図４に示されるJameson-Wolfグラフを用いて、本 発明者らは、TR1レセプタータンパク質の抗原領域である上記のポリペプチドフ ラグメントを決定した。 従って、本発明は、図１（配列番号２）に示されるような同じ成熟ポリペプチ ドまたは寄託されたクローンのcDNAによってコードされる同じ成熟ポリペプチド 、ならびに変異体が、図１（配列番号２）のポリペプチドもしくは寄託されたク ローンのcDNAによってコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、また はアナログをコードする、そのようなポリヌクレオチドの変異体をコードするポ リヌクレオチドを含む。このようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変 異体、および付加変異体または挿入変異体を含む。 本明細書中上記に示されるように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１） 、図２（配列番号３）に示されるコード配列、または寄託されたクローンのコー ド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得る。示され るように、１つの特に好ましい変異体は、図１または図２において、アミノ酸残 基約260または261の後に挿入された膜貫通ドメインを含むTR1レセプターである 。当該分野で公知のように、対立遺伝子変異体は、１つ以上のヌクレオチドの置 換、欠失、または付加を有し得る（コードされるポリペプチドの機能を実質的に 改変しない）ポリヌクレオチド配列改変型である。変異体は、天然の対立遺伝子 変異体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色 体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの改変型の１つが意図される。 Genes II，Lewin，B.編，John Wiley & Sons，New York(1985)。天然に存在しな い変異体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて産生され得る。 そのような変異体は、ヌクレオチド置換、欠失、または添加によって生成され る変異体を含む。置換、欠失、または添加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得 る。変異休は、コード領域もしくは非コード領域、またはその両方において変化 され得る。コード領域における変異は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、 欠失、または付加を生成し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレント 置換、付加、および欠失であり、これらは、TR1レセプタータンパク質またはそ の一部の特性および活性を変化しない。これらの点においてまた特に好ましいも のは、保存的置換である。最も非常に好ましいものは、図１（配列番号２）にお いて示されるアミノ酸配列をコードする成熟ネイティブTR1レセプタータンパク 質、寄託されたcDNAクローンによってコードされる成熟ネイティブTR1レセプタ ーアミノ酸配列、または図２（配列番号４）において示されるアミノ酸配列を有 する成熟カルボキシ末端改変TR1レセプタータンパク質をコードする核酸分子で ある。 本発明はまた、ポリヌクレオチドを含み、ここで成熟ポリペプチドに対するコ ード配列は、宿主細胞由来のポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレ オチド配列（例えば、細胞由来のポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列 として機能するリーダー配列）と同じリーディングフレームで融合され得る。リ ーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、そして宿主細胞によ って切断されてポリペプチドの成熟型を形成するリーダー配列を有し得る。ポリ ヌクレオチドはまた、さらなる5'アミノ酸残基を加えた成熟タンパク質であるプ ロタンパク質をコードし得る。プロ配列を有する成熟タンパク質は、プロタンパ ク質であり、そしてタンパク質の不活性型である。一旦プロ配列が切断されると 、活性成熟タンパク質のままである。このような単離された分子（特にDNA分子 ）は、遺伝子マッピング、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによ る、および例えば、ノーザンブロット分析によるヒト組織におけるTR1レセプタ ー遺伝子の発現を検出するのためにプローブとして有用である。 従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質あるいはプロ 配列を有するタンパク質またはプロ配列およびプレ配（リーダー配列）の両方を 有するタンパク質をコードし得る。 「単離された」核酸分子によって、ネイティブな環境から取り出された核酸分 子（DNAまたはRNA）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えDNA分 子は、本発明の目的のために単離されることが意図される。単離されたDNA分子 のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えDNA分子、または溶 液中の（部分的または実質的に）精製されたDNA分子を含む。単離されたRNA分子 は、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明 に従って単離された核酸分子は、合成的に生成されるような分子をさらに含む。 本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にする マーカー配列へインフレームで融合されたコード配列を有し得る。そのマーカー 配列は、細菌宿主の場合に、マーカーへ融合される成熟ポリペプチドの精製を提 供するpQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであり得るか、 または、例えば哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合に、マー カー配列は赤血球凝集素(HA)タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ赤血球 凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する（Wilsonら、Cell 37：767(1984) ）。コード配列はまた、IgG Fc融合タンパク質のような融合タンパク質をコード する配列に融合され得る。 用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を生成することに関わるDNAのセグメント を意味する；それは、コード領域に先立つおよび後続する領域（リーダーおよび テイラー）、ならびに別々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イン トロン）を含む。 本発明の全長遺伝子のフラグメントは、全長のcDNAを単離するため、および遺 伝子と高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他のcDNAを単離するた めにcDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用され 得る。この型のプローブは、好ましくは少なくとも30塩基を有し、そして例えば 50以上の塩基を含み得る。プローブはまた、全長の転写物に対応するcDNAクロー ンならびに制御領域およびプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロンを 含む完全な遺伝子を含むゲノムクローンを同定するために使用され得る。スクリ ーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために既知のDNA配列 を用いることによって遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝 子の配列と相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、ライブラリーのメ ンバーがプローブとハイブリダイズするか否かを決定するために、ヒトcDNA、ゲ ノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするために使用される。 本発明はさらに、配列間に少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、およ びより好ましくは95％、96％、97％、98％、または99％同一性が存在する場合、 本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明 は、特にストリンジェントな条件下で本明細書中上記のポリヌクレオチド（例え ば、ATCC寄託番号75899に含まれるcDNAクローン）とハイブリダイズするポリヌ クレオチドに関する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によ って、以下の溶液において42℃での一晩のインキュベーション、その後約65℃に て0.1×SSCにおいてフィルターを洗浄することが意図される：50％ホルムアミド 、５×SSC（150mM NaCl、15mMクエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム( pH7.6)、５×Denhardt溶液、10％硫酸デキストラン、および20g/mlの変性剪断サ ケ精子DNA。 あるいは、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、本明細書中上記の ように、それらと同一性を有し、そして活性を保持するかまたはしないかもしれ ないポリヌクレオチドは、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、およびより好 ましくは少なくとも50塩基を有し得る。例えば、このようなポリヌクレオチドは 、例えば、ポリヌクレオチドの回収のためかまたは診断プローブとしてかもしく はPCRプライマーとして、配列番号１のポリヌクレオチドに対するプローブとし て用いられ得る。 当然のことながら、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたcDNAクローン ）のより大きな部分（例えば、長さが50〜750ntの部分）、または参照ポリヌク レオチドの完全長とまでもハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、奇託さ れたcDNAのヌクレオチド配列または図１（配列番号１）に示されるようなヌクレ オチド配列のすべてではなくともほとんどに対応するポリヌクレオチドのように 、本発明に従ったプローブとして有用である。例えば、「長さが少なくとも20nt 」のポリヌクレオチドの部分によって、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配 列（例えば、寄託されたcDNA、または図１（配列番号１）に示されるようなヌク レオチド配列）からの20以上の連続したヌクレオチドが意図される。示されるよ うに、そのような部分は、従来のDNAハイブリダイゼーション技術に従ったプロ ーブとして、または例えば、Sambrook，J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.編 、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor Lab oratory Press，(1989)（その全開示は、本明細書中において参考として援用さ れる）に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的配列の増幅の ためのプライマーとしてのいずれかで診断的に有用である。 TR1レセプターcDNAクローンは寄託されており、そしてその決定されたヌクレ オチド配列が図１（配列番号１）において提供されるので、TR1レセプターcDNA 分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを生成することは、当業者に 日常的である。例えば、TR1レセプターcDNAクローンの制限エンドヌクレアーゼ 切断または超音波による剪断は、TR1レセプターcDNA分子の一部にハイブリダイ ズするポリヌクレオチドである種々のサイズのDNA部分を生成するために容易に 使用され得る。あるいは、本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、公 知の技術に従って合成的に生成され得る。当然のことながら、ポリA配列（例え ば、図１（配列番号１）に示されるTR1レセプターcDNAの3'末端ポリ(A)付加物） にのみ、またはＴ(またはＵ)残基（reside）の相補的な部分(stretch)にハイブ リダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするた めに使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、そのような ポリヌクレオチドは、poly(A)伸長またはその相補物を含む任意の核酸分子（例 えば、特に任意の二本鎖cDNAクローン）にハイブリダイズする。 本発明のさらなる実施態様は、(a)推定されたリーダー配列を含む図１（配列 番号２）の完全なアミノ酸配列を有するか、もしくは図２（配列番号４）の完全 なアミノ酸配列を有する全長のカルボキシ末端改変TR1レセプターポリペプチド をコードするヌクレオチド配列；(b)図１（配列番号２）中の約22位から約401位 のアミノ酸配列を有する成熟ネイティブTR1レセプターポリペプチドをコードす るヌクレオチド配列、または図２（配列番号４）の約22位から約395位のアミノ 酸配列を有する成熟カルボキシ末端改変TR1レセプターポリペプチド（リーダー 配列を除いた全長ポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列；(c)ATCC受託 番号75899に含まれるcDNAクローンによってコードされるリーダー配列を含む完 全なアミノ酸配列を有する全長のネイティブTR1レセプターポリペプチドをコー ドするヌクレオチド配列；(d)ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクローンによっ てコードされるアミノ酸配列を有する成熟したネイティブTR1レセプターポリペ プチドをコードするヌクレオチド配列；または（e）(a)、(b)、(c)、もしくは(d )のヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列と、少なくとも90 ％同一のヌクレオチド配列を有し、そしてより好ましくは少なくとも95％、96％ 、97％、98％、または99％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを 含む単離された核酸分子を含む。 TR1レセプターポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも 、 例えば、95％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、 ポリヌクレオチド配列が、TR1レセプターポリペプチドをコードする参照ヌクレ オチド配列の各100ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除い て、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図 される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であるヌク レオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％ま でのヌクレオチドが欠失され得るかもしくは別のヌクレオチドで置換され得るか 、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが、 参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列 の5'もしくは3'末端位置でか、または参照配列内のヌクレオチドの中で個々に、 もしくは参照配列内の１つ以上の連続した群でのいずれかで散在されて、これら の末端位置の間のどこかで生じ得る。 実際には、任意の特定の核酸分子が、図１（配列番号１）、図２（配列番号３ ）に示されるヌクレオチド配列または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配 列に少なくとも90％、95％、97％、98％、または99％同一であるかどうかは、例 えば、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 f or Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)のような公知のコンピュータープログラムを用いて 従来通りに決定され得る。Bestfitは、SmithおよびWaterman，Advances in Appl ied Mathematics 2:482-489(1981)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つ の配列間の相同性の最適のセグメントを見出す。Bestfitまたは任意の他の配列 整列プログラムを使用して、特定の配列が、例えば本発明による参照配列に95％ 同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が 、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の 総ヌクレオチド数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、設 定される。 本出願は、TR1レセプタータンパク質活性を有するポリペプチドをコードする か否かに関係なく、図１（配列番号１）、図２（配列番号３）に示される核酸配 列または寄託されたcDNAの核酸配列と少なくとも90％、95％、96％、97％、98％ 、 または99％同一であるこのような核酸分子に関する。これは、特定の核酸分子が TR1レセプター活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は 、核酸分子をどのようにして、例えば、ハイブリダイゼーションプローブ、また はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして使用するかをなお知っている からである。TR1レセプター活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の 核酸分子の使用としては、とりわけ(1)TR1レセプター遺伝子またはその対立遺伝 子変異体をcDNAライブラリーから単離すること；(2)Vermaら，Human Chromosome s:a Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)に記載の、 TR1レセプター遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開 物に対するインサイチュハイブリダイゼーション(FISH)；および、特定の細胞型 （例えば、活性化単球）におけるTR1レセプターmRNA発現を検出するためのノー ザンブロット分析、が挙げられる。 しかし、実際に、TR1レセプタータンパク質活性を有するポリペプチドをコー ドする図１（配列番号１）、図２（配列番号３）、あるいは寄託されたcDNAの核 酸配列に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列 を有する核酸分子が好ましい。「TR1レセプター活性を有するポリペプチド」に よって、特定の生物学的アッセイにおいて測定される場合に、本発明のTR1レセ プタータンパク質（全長タンパク質、または好ましくは成熟タンパク質のいずれ か）の活性と類似する（しかし、必ずしも同一ではない）活性を示すポリペプチ ドが意図される。例えば、TR1レセプタータンパク質活性は、TR1-βリガンドま たはネイティブTR1レセプタータンパク質に結合することが示された他の分子へ の結合親和性を用いて測定され得る。例えば、図７に示される競合結合アッセイ は、候補ポリペプチドが、本明細書中に記載されるネイティブTR1レセプターの それに類似する結合親和性を有するかどうかを決定するために使用され得る。 従って、「TR1レセプタータンパク質活性を有するポリペプチド」は、上記の アッセイにおいてTR1レセプター活性を示すポリペプチドを含む。結合活性の程 度は、TR1レセプタータンパク質の活性と同一である必要はないが、好ましくは 、「TR1レセプタータンパク質活性を有するポリペプチド」は、TR1レセプタータ ンパク質と比較して実質的に類似の活性を示す。 もちろん、遺伝子コードの縮重のために、当業者は、寄託されたcDNAの核酸配 列、または図１（配列番号１）、または図２（配列番号３）に示される核酸配列 に少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一である配列を有す る多数の核酸分子が「TR1レセプタータンパク質活性を有する」ポリペプチドを コードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌクレオチド配列の縮重改 変体の全ては同じポリペプチドをコードするので、これは上記の比較アッセイを 実施することなしでさえ当業者に明らかである。縮重改変体でないそのような核 酸分子について、合理的な数がまたTR1レセプタータンパク質活性を有するポリ ペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、当業者が 、タンパク質の機能により低い有意性で影響しそうであるか、または有意には影 響しそうにないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族アミノ酸の 第二の脂肪族アミノ酸への置換）を完全に知っているからである。 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換をどのように作製するかに関す るガイダンスは、Bowieら，「Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions」，Sclence247:1306-1310(1990)に提 供される。ここで著者らは、アミノ酸配列の変化に対する寛容を研究するための ２つの主要なアプローチが存在することを示す。第一の方法は、進化のプロセス に依存し、ここで変異は、自然淘汰によって受容されるか拒絶されるかのいずれ かである。第二のアプローチは、クローン化遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化 を導入するために遺伝子操作を、そして機能を維持する配列を同定するために選 択またはスクリーニングを用いる。著者らが述べるように、これらの研究は、タ ンパク質が、アミノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにしている。著者 らは、どのアミノ酸の変化が、タンパク質の特定の位置で許容性でありそうであ るかをさらに示している。例えば、大部分の埋没したアミノ酸残基は非極性側鎖 を必要とし、一方表面の側鎖の特性は一般的にわずかしか保存されていない。他 のこのような表現型的にサイレントな置換は、Bowieら,Science 247:1306-1310( 1990)およびその中に引用される参考文献に記載される。 本明細書中に援用される寄託物は、特許手続の目的のために、微生物の寄託の 国際認識におけるブダペスト条約に基づいて維持される。これらの寄託物は、 単に当業者への簡便さのために提供されるものであり、寄託物が米国特許法の下 に必要とされることを承認するわけではない。寄託物質に含まれるポリヌクレオ チドの配列、ならびにそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は 、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の任意の記載との いかなる矛盾の事象をも制御している。寄託物質を作製、使用、または販売する ために許可が必要とされ得、そしてそのような許可は本明細書によっては与えら れない。 TR1レセプターポリペプチドおよびフラグメント 本発明はさらに、図１（配列番号２）、図２（配列番号４）の推定のアミノ酸 配列を有するか、または奇託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよ び誘導体に関する。 用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、図１（配列番号２ ）、図２（配列番号４）のポリペプチド、または寄託したcDNAにコードされるポ リペプチドをいう場合、そのようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能ま たは活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、アナログは、プロタンパ ク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタ ンパク質を包含する。 本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成 ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。 TR1レセプターポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列が、このタンパク質の 構造または機能に有意に影響することなく改変され得ることが、当該分野で認識 される。配列内のこのような差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質 の重要な領域が存在することを覚えておくべきである。一般的に、類似の機能を 実行する残基が使用される場合、三次構造を形成する残基の置換が可能である。 他の例において、残基の型は、変化がタンパク質の重要でない領域で生じる場合 、全く重要でないかもしれない。 従って、本発明は、さらに、実質的なTR1レセプターポリペプチド活性を示す か、または下記に考察されるタンパク質部分のようなTR1レセプタータンパク質 の領域を含むTR1レセプターポリペプチドの改変体を含む。このような変異体は 、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残 基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない ）を含む。小さな変化、またはこのような「中性」アミノ酸置換は、一般的にほ とんど活性に影響しない。 代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu、およびI leの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基Serおよ びThrの交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGlnの間の置 換、塩基性残基LysおよびArgの交換、ならびに芳香族残基Phe、Tyrの間の置換で ある。 上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントで ありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に 関するさらなるガイダンスは、Bowie，J.U．ら「Deciphering the Message in P rotein Sequences:Tolerance to Amino Acid Substitutions」,Science 247:130 6-1310(1990)に見出され得る。 従って、図１（配列番号：２）、図２（配列番号４）のポリペプチドまたは寄 託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナ ログは、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸 残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換される アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるアミノ酸残基であってもよく、ま たはそうでなくてもよいもの、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を 含有するもの、あるいは(iii)成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増 加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合 されているもの、あるいは(iv)さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの精製のため に成熟ポリペプチドに融合されているもの、あるいは(v)ポリペプチドのフラグ メントが可溶であり（すなわち膜結合でない）、なおさらに膜結合レセプターに リガンドを結合するものであり得る。このようなフラグメント、誘導体およびア ナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。 特に興味深いものは、別の荷電したアミノ酸での、および中性または負電荷の アミノ酸での荷電したアミノ酸の置換である。後者は減少した正電荷を有するタ ンパク質を生じ、TR11レセプタータンパク質の特徴を改良する。凝集の防止が高 度に所望される。タンパク質の凝集は、活性の損失を生じるだけでなく、それら は免疫原性であり得るので、薬学的処方物を調製する場合にも問題であり得る（ Pinckardら、Clin Exp.Immunol．2:331-340（1967）;Robbinsら、Diabetes 36:8 38-845（1987）;Clelandら、Crit.ReV.Therapeutic Drug Carrier Systems 10:3 07-377（1993））。 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへの結合の選択性を変化し得る。 Ostadeら、Nature 361:266-268（1993）は、２つの既知の型のTNFレセプターの １つのみへのTNF-αの選択的な結合を生じる特定の変異を記載する。従って、本 発明のTR1レセプターは、天然の変異または人工操作のいずれかに由来する１つ 以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。 タンパク質の折り畳みまたは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換のよ うな、小さな性質の変化が好ましい（表１を参照のこと）。 表１。保存的アミノ酸置換体。 機能に必須である、本発明のTR1レセプターにおけるアミノ酸は、部位特異的 変異誘発またはアラニン走査型変異誘発のような当該分野に公知の方法により同 定され得る（CunninghamおよびWells,Science 244:1081-1085（1989））。後者 の手順は、分子内の全ての残基に１つのアラニン変異を導入する。次いで得られ る変異分子は、レセプター結合あるいはインビトロまたはインビトロ増殖活性の ような生物学的活性について試験される。リガンド-レセプター結合に重要な部 位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識のような構造分析により決 定され得る（Smithら、J.Mol.Biol．224:899-904（1992）およびde Vosら、Scie nce 255:306-312（1992））。 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ま しくは実質的に精製される。TR1レセプターポリペプチドの組換え生成した型は 、SmithおよびJohnson，Gene 67:31-40(1988)において記載される１工程の方法 によって、実質的に精製され得る。 本発明のポリペプチドは、リーダー配列を含む寄託されたcDNAによってコード されるポリペプチド、寄託されたcDNAによってコードされるポリペプチドからリ ーダーを除いたポリペプチド（すなわち成熟タンパク質）、リーダーを含む図１ （配列番号２）または図２（配列番号４）のポリペプチド、リーダーを除いた図 １（配列番号２）または図２（配列番号４）のポリペプチド、ならびに上記のポ リペプチドと少なくとも90％の類似性、より好ましくは少なくとも95％の類似性 、およびさらにより好ましくは少なくとも96％、97％、98％、または99％の類似 性を有するポリペプチドを含む。さらに本発明のポリペプチドは、寄託されたcD NAによってコードされるポリペプチド、配列番号２のポリペプチドと、少なくと も80％同一、より好ましくは少なくとも90％または95％同一、さらにより好まし くは少なくとも96％、97％、98％、または99％同一であるポリペプチドを含み、 そしてまた、少なくとも30アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも50アミノ 酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。 当該分野において知られる、２つのポリペプチド間の「類似性」は、あるポリ ペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換物と第２のポリペプチド の配列とを比較することによって決定される。２つのポリペプチドについての「 ％類似性」によつて、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Packag e，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park ，575 Science Drive，Madison，WI 53711)および類似性を決定するための初期 設定(default setting)を用いて２つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較する ことによって生じる類似性の値が意図される。Bestfitは、SmithおよびWaterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981))の局所的相同性アルゴリ ズムを、２つの配列間の類似性の最適のセグメントを見出すために使用する。 TR1レセプターポリペプチドの参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、95％ 「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチド配列がTR1 レセプターポリペプチドの参照アミノ酸配列の各100アミノ酸毎に５つまでのア ミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と 同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に少なくとも95 ％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において ５％までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは別のアミノ酸で置換され得、 または参照配列における５％までの総アミノ酸残基の多数のアミノ酸が参照配列 に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位 置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列の残基間で個々に、もしくは 参照配列内で１つ以上の近接したグループ内のいずれかで末端位置の間のどこか で、起こり得る。 実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１（配列番号２）、図２ （配列番号４）に示されるアミノ酸配列、または寄託されたcDNAクローンにより コードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも90％、95％、96％、97％、98％ 、または99％同一であるかどうかは、Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix用バージョン８、Genetics Computer Group，Universit y Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711)のような公知のコン ピュータープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の配列が、例えば 、本発明の参照配列に95％同一であるかどうかを決定するために、Bestfitまた は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、同一性の百 分率が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ 酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようなパラメー ターが設定される。 本発明のポリペプチドのフラグメントまたは一部は、ペプチド合成によって対 応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る；それゆえ、フラグメン トは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明の ポリヌクレオチドのフラグメントまたは一部は、本発明の全長ポリヌクレオチド を合成するために使用され得る。 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるSDS-PAGEゲルまたは分 子篩いゲル濾過カラムでの分子量マーカーとして使用され得る。 下記に詳細に示すように、本発明のポリペプチドはまた、ポリクローナル抗体 およびモノクローナル抗体を惹起するために使用され得る。これらは、下記のよ うにTR1レセプタータンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて有用であ るか、またはTR1レセプタータンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニス トおよびアンタゴニストとして有用である。さらに、このようなポリペプチドは 、本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるTR1タンパク質の結合 タンパク質を「捕獲する」ための酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用さ れ得る。酵母ツーハイブリッドシステムは、FieldsおよびSong,Nature 340:245- 246（1989）に記載されている。 示されるように、上記のTR1レセプターポリペプチドは、膜貫通ドメインを含 まないと考えられる。従って、さらなる実施態様において、本発明は、膜貫通ド メインをさらに含むアミノ酸配列を有する本発明のTR1レセプターポリペプチド に関する。このようなレセプターポリペプチドは、ネイティブであるか、または 組換え技術に従って本明細書中に記載されるTR1レセプターから構築され得る。 膜貫通ドメインを含むTR1レセプターをコードするヌクレオチド配列を単離する ための方法は、図１（配列番号１）または図２（配列番号３）に提供される配列 から構築されるヌクレオチドプローブを、１以上の上記の組織供給源から得られ るcDNAライブラリーとハイブリダイズさせる工程を含む。 組換え的または合成的に産生される場合、アミノ酸配列にかかる膜貫通ドメイ ンの挿入に適切な部位は、当業者に明らかである。本発明者らは、図１（配列番 号２）に示される約22〜約261のアミノ酸残基がヒトTR1-RII（図３；配列番号５ ）の細胞外ドメインにかなりの相同性を有することを発見した。さらに、図１（ 配列番号２）に示される約262〜約401のアミノ酸残基は、ヒトTR1-RII（図３； 配列番号５）の細胞内ドメインにかなりの相同性を有する。従って、当業者は、 図１（配列番号２）または図２（配列番号４）のいずれかのアミノ酸残基261と2 62（またはそれらの近位（約１〜10アミノ酸以内））との間が、膜貫通ドメイン を含むアミノ酸配列の挿入に適切な部位であることを理解する。膜貫通ドメイン を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチドは、他のTR1レセプター遺伝子か ら単離され（またはそのヌクレオチド配列から構築され）、そして組換え技術に よって寄託されたクローンの適切な部位に挿入される。さらに、このようなドメ インは、合成的に構築され、そして本発明の可溶性TR1レセプターに挿入され得 る。本発明のTR1レセプターへのこのような膜貫通ドメインを含むアミノ酸の挿 入は、膜にインテグレートする不溶性レセプターを生じるようである。本発 明の有用である膜貫通ドメインの具体例は、図３(一番下の配列)(配列番号５)の 約258〜約287のアミノ酸残基で示されるTNF-R2膜貫通ドメインである。他のこの ようなTR1レセプター膜貫通ドメインは、当業者に明らかである。 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を 含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ 部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免 疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発す るタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上 の２、３の位置に制限されると考えられている。一方では、抗体が結合し得るタ ンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免 疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例え ば、Geysenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3998-4002（1983）を参照のこ と。 抗原性エピトープを保有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が 結合し得るタンパク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一 部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応 する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Sutcli ffeら、Science 219:660-666(1983)を参照のこと。タンパク質-反応性血清を誘 発し得るペプチドは、しばしばタンパク質の一次配列で頻繁に示され、そして単 純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク質 の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ）にも、アミノ末端またはカル ボキシル末端にも、制限されない。極度に疎水性であるペプチドおよび６以下の 残基のペプチドは、一般には、模倣タンパク質に結合する抗体の誘導に効果がな く；より長い、可溶性ペプチド、特にプロリン残基を含むペプチドは、通常は有 効である。Sutcliffeら、前出、661。例えば、これらのガイドラインに従って設 計された20のペプチドのうち18（インフルエンザウイルス赤血球凝集素HA1ポリ ペプチド鎖の配列の75％を覆う8-39残基を含む）は、HA1タンパク質またはイン タクトなウイルスと反応する抗体を誘導した；そしてMuLVポリメラーゼからの12 /12ペプチドおよび狂犬病糖タンパク質からの18/18はそれぞれのタンパク質を沈 澱する抗体を誘導した。 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、それゆえ、本 発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起す るのに有用である。従って、抗原エピトープ保有ペプチドで免疫されたドナーか らの脾臓細胞の融合により得られるハイブリドーマの大部分は、一般に、ネイテ ィブタンパク質と反応性がある抗体を分泌する。Sutcliffeら、前出、663。抗原 性エピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドにより惹起された抗体は、模倣タ ンパク質を検出するのに有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体が、翻 訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の末路を追跡するため に使用され得る。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド（例えば、約９アミ ノ酸）でさえ、より長いペプチドに結合しそして置換し得ることが示されている ので、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性 的または定量的アッセイ、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。例え ば、Wilsonら、Cell 37:767-778（1984）。本発明の抗ペプチド抗体はまた、模 倣タンパク質の精製（例えば、当該分野で周知の方法を使用して、吸着クロマト グラフィーにより）に有用である。 上記のガイドラインに従って設計された本発明の抗原性エピトープ保有ペプチ ドおよびポリペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に 含まれる少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、そして最も好ましくは約 15〜約30アミノ酸の間の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸 配列の約30〜約50アミノ酸または全体までの任意の長さおよび全体を含む、本発 明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大部分を含むペプチドまたはポリペプチ ドもまた、本発明のエピトープ保有ペプチドまたはポリペプチドであると考えら れ、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ま しくは、エピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解 性を提供するように選択され（すなわち、その配列は、比較的親水性残基を含み 、そして高度な疎水性配列は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含 む配列が特に好ましい。 TR1レセプター特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチド の非限定的な例には、図１（配列番号2）または図２（配列番号４）における約2 0〜約52のアミノ酸残基を含むポリペプチド：図１（配列番号２）または図２（ 配列番号４）における約66〜約203のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および 図１（配列番号２）または図２（配列番号４）における約229〜約279のアミノ酸 残基を含むポリペプチド；および図１（配列番号２）における約297〜約378のア ミノ酸残基を含むポリペプチドが挙げられる。上記に示されるように、本発明者 らは、上記ポリペプチドフラグメントがTR1レセプタータンパク質の抗原性領域 であることを決定した。 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明の核酸分子を 使用する組換え手段を含むペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の 従来の手段により産生され得る。例えば、短いエピトープ保有アミノ酸配列は、 組換え体産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化 の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エピト ープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例え ば、Houghtenは、４週間未満で、調製されそして特徴付けられた（ELISA-タイプ 結合研究により）HA1ポリペプチドのセグメントの単一のアミノ酸改変体を示す1 0〜20mgの248の異なる13残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡 単な方法を記載している。Houghten，R.A.(1985)．General method for the rap id solid-phase synthesis of large numbers of peptides:specificity of ant igen-antibody interaction at the level of individual amino acids。この「 Simultaneous Multiple Peptide Synthesis（SMPS）」プロセスは、さらにHough tenら（1986）の米国特許第4,631,211号に記載される。この手順において、種々 のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含ま れ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全な マニュアル手順は、500〜1000以上の合成が同時に行われるのを可能にする。Hou ghtenら、前出、5134。 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野に周知の方 法によって抗体を誘導するために使用される。例えば、Sutcliffeら、前出；Wil sonら、前出；Chow，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:910-914;およびBittleら，J.G en.Virol．66:2347-2354(1985)を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで 免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例 えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）または破傷風トキソイド）に カップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有する ペプチドは、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（M BS）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペ プチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリア にカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離 またはキャリア-カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約100μgのペプ チドまたはキャリアタンパク質およびFreundのアジュバントを含むエマルジョン の腹腔内および/または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射 が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してELISAアッセイによ り検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週 間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力 価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体 支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。 本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド、すなわち、全体のタンパク質が免 疫原性である場合、抗体応答を惹起するタンパク質の部分は、当該分野で公知の 方法により同定される。例えば、Geysenら（1984）前出は、酵素-結合免疫吸着 アッセイにおける反応に十分に純粋な何百というペプチドの固体支持体上の迅速 な同時合成の手順を開示する。合成ペプチドの抗体との相互作用は、次いで、そ れらを支持体から除去することなく容易に検出される。この様式において、所望 のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは、当業者により日常的 に同定され得る。例えば、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質における免疫学的 に重要なエピトープは、タンパク質の213のアミノ酸配列全体を覆う全ての208の 可能なヘキサペプチドの重複セットの合成による７アミノ酸の解明によりGeysen らによって位置付けされた。次いで、全ての20アミノ酸が順にエピトープ内の各 位置で置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応 のための特異性を与える特定のアミノ酸が決定された。従って、本発明のエピト ープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法により日常的に作成され得る 。Geysen（1987）の米国特許第4,708,781号は、所望のタンパク質の免疫原性エ ピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載している。 さらになお、Geysen（1990）の米国特許第5,194,392号は、目的の抗体の特定 のパラトープ（抗原結合部位）に相補的であるエピトープの位相幾何学的等価物 （すなわち、「ミモトープ」）であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の 配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Geysen（ 1989）の米国特許第4,433,092号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部 位に相補的であるリガンドの位相等価であるモノマーの配列を検出または決定す る方法を記載する。同様に、Peralkylated Oligopeotide MixturesにおけるHoug hten，R．A．ら（1996）の米国特許第5,480,971号は、直鎖C1-C7-アルキル過ア ルキル化（peralkylated）オリゴペプチドおよびセットおよびこのようなペプチ ドのライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過ア ルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセッ トおよびライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ 保有ペプチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成さ れ得る。 「TR1レセプターポリペプチドおよびフラグメント」におけるこのセクション に引用される各文献の全体の開示が、参考として本明細書中に援用される。 当業者が理解するように、本発明のTR1レセプターポリペプチドおよび上記の そのエピトープ保有フラグメントは、免疫グロブリン（IgG）の定常ドメインの 一部と結合し得、キメラペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を 促進し、そしてインビボで増加した半減期を示す。これは、例えば、ヒトCD4-ポ リペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または 軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されてい る（EPA394,827；Trauneckerら、Nature 331:84-86（1988））。IgG部分による ジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、他の分子の結合 および中和において、モノマーT1Rレセプタータンパク質またはタンパク質フラ グメント単独よりも効率的であり得る（Fountoulakisら、J．Biochem．270:3958 -3964（1995））。 ベクターおよび宿主細胞 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター で遺伝子操作される宿主細胞、および本発明のポリペプチドの組換え技術による 生成に関する。 宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまた は発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作（形質導入、形質転換、または トランスフェクト）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、 ファージなどの形熊であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターの活性化 、形質転換体の選択、または本発明の核酸配列の増幅に適切であるように改変さ れた従来の栄養培地中で培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、 発現について選択された宿主細胞に関して以前に使用された培養条件であり、そ して当業者に明らかである。 本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によってポリペプチドを生成するた めに用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現 するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクタ ーは、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列（例えば、SV40の 誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド； プラスミドとファージDNA、ウイルスDNA（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ ウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス）との組み合わせ由来のベ クター）を含む。しかし、任意の他のベクターが、それが宿主において複製可能 かつ生存可能である限り、使用され得る。 適切なDNA配列は、種々の手順によってベクター中へ挿入され得る。一般に、D NA配列は、当該分野で公知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中 へ挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内にあると考え られる。 発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指向する適切な発現制御配列（プロ モーター）に作動可能に連結される。このようなプロモーターの代表的な例とし て、以下のものに言及され得る：LTRまたはSV40プロモーター、E．coli．lacま たはtrp、λファージPLプロモーター、原核生物細胞もしくは真核生物細胞また はそれらのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが公知の他のプロモーター 。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミ ネーターを含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含み得る 。 さらに、発現ベクターは、好ましくは、１つ以上の選択マーカー遺伝子を含み 、形質転換された宿主細胞の選択のために表現型形質（例えば、真核生物細胞培 養についてのジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性、または例え ば、E．coli.におけるテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性）を提供 する。 上記のような適切なDNA配列、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を 含むベクターを用いて、宿主がタンパク質を発現することを可能にするように適 切な宿主を形質転換し得る。 適切な宿主の代表的な例としては、以下のものに言及され得る：細菌細胞（例 えば、E，coli、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば 、酵母）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9）；動物細 胞（例えば、CHO、COS、またはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など 。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えら れる。 より詳細には、本発明はまた、先に広く記載されたように、１つ以上の配列を 含む組換え構築物を含む。構築物は、本発明の配列が前方向または逆方向で挿入 されるベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）を含む。この実施態様の 好ましい局面において、構築物はさらに、調節配列（例えば、配列に作動可能に 連結されたプロモーターを含む）を含む。多数の適切なベクターおよびプロモー ターが当業者に公知であり、そして市販されている。以下のベクターが例示のた めに提供される。細菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescrip t、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Strata gene）；pTRC99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）。真核生 物：pWLNE0、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSG、pS VL（Pharmacia）。しかし、任意の他のプラスミドまたはベクターが、それらが 宿主において複製可能かつ生存可能である限り、使用され得る。 プロモーター領域が、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して任意の所望の遺伝子か ら選択され得る。２つの適切なベクターは、pKK232-8およびpCM7である。特に命 名された細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpL、λPR、PL、およびtrp を含む。真核生物プロモーターは、CMV前初期、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40 および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、ならびにマウスメタロチオネイン- Iを含む。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベル内に十 分にある。 さらなる実施態様において、本発明は、上記の構築物を含む宿主細胞に関する 。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物 細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は、原核生物細胞（ 例えば、細菌細胞）であり得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウ ムトランスフェクション、DEAE-Dextran媒介トランスフェクション、またはエレ クトロポレーションによって達成され得る(Davis，L.、Dibner，M.、Battey，I. 、Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。 宿主細胞における構築物を、従来の様式で使用して、組換え配列によってコー ドされる遺伝子産物を生成し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来の ペプチド合成機によって合成的に生成され得る。 成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌 、または他の細胞で発現され得る。無細胞翻訳系もまた用いて、本発明のDNA構 築物由来のRNAを使用してこのようなタンパク質を生成し得る。原核生物宿主お よび真核生物宿主での使用のために適切なクローニングおよび発現ベクターは、 Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)（この開示は本明細書によって参考として援用される）に よって記載される。 本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクタ ー中にエンハンサー配列を挿入することによって増大する。エンハンサーは、そ の転写を増大させるようにプロモーターに作用する、DNAのシス作用エレメント であり、通常、約10〜300bpである。例として、複製起点の後期側bp100〜270上 のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複 製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサ ーが挙げられる。 一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能に する選択マーカー（例えば、E．coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS．cerevi siae TRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指向する高発現遺伝子由 来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、とりわけ、解糖系酵素（ 例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK））、α-因子、酸性ホスファター ゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導され得る。異種 構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに好ましくは、細胞周辺 腔または細胞外培地への翻訳されたタンパク質の分泌を指向し得るリーダー配列 を用いて適切な段階でアセンブリされる。必要に応じて、異種配列は、所望の特 徴（例えば、発現させた組換え生成物の安定化または単純化された精製）を与え るＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。 細菌使用のために有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造 DNA配列を、機能的なプロモーターに関して作動可能なリーディングフェーズ（r eading phase）で適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと一緒に挿入 することによって構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカーおよ び宿主内でのベクターの維持を確実にし、そして所望の場合、増幅を提供するた めの複製起点を含む。形質転換に適切な原核生物宿主は、E．coli、Bacillus su btilis、Salmonella typhimurium、ならびにPseudomonas属、Streptmyces属、お よびStaphylococcus属内の種々の種を含むが、他の宿主もまた、選択の問題とし て用いられ得る。 代表的ではあるが、限定的でない例として、細菌使用のために有用な発現ベク ターは、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝子エレメント を含む市販のプラスミド由来の選択マーカーおよび細菌の複製起点を含み得る。 このような商業的なベクターには、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemica ls，Uppsala，Sweden）およびGEM1（Promega Biotec，Madison，WI，USA）を含 む。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき 構造配列と組み合わされる。 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖後、選択さ れたプロモーターを、適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的な誘導）に よって誘導し、そして細胞をさらなる期間培養する。 細胞を、代表的には、遠心分離によって回収し、物理的手段または化学的手段 によって破壊し、そして得られた粗抽出物をさらなる精製のために維持する。 タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、任意の従来の方法（凍結 解凍サイクル、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用）によって破壊さ れ得、このような方法は、当業者に周知である。 種々の哺乳動物培養系はまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得 る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell 23:175(1981)によって記載される サル腎臓繊維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞 株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が挙げられる。哺乳動 物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、およびエンハンサーを含み 、そしてさらに、任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプ ライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、ならびに 5'隣接非転写配列を含む。SV40スプライス由来のDNA配列およびポリアデニル化 部位を使用して、必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供し得る。 本発明のポリペプチドは、硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸性抽出、陰イオ ン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル ロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレ クチンクロマトグラフィーを含む方法によって組換え細胞培養物から回収および 精製され得る。タンパク質再折りたたみ工程は、必要な場合、成熟タンパク質の コンフィギュレーションの完成において使用され得る。最後に、高速液体クロマ トグラフィー（HPLC）が、最終的な精製工程のために用いられ得る。本発明のポ リペプチドは、天然に精製された生成物、もしくは化学合成手順の生成物であり 得るか、または原核生物宿主もしくは真核生物宿主（例えば、培養下の細菌、酵 母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞による）から組換え技術によって生成 され得る。組換え生成手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペ プチドはグリコシル化されてもよいし、または非グリコシル化されてもよい。本 発明のポリペプチドはまた、開始メチオニンアミノ酸残基を含み得る。 小胞体の内腔へ、細胞周辺腔へ、または細胞外環境への翻訳されたタンパク質 の分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチド中へ組み込ま れ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性であり得るか、またはそれら は異種のシグナルであり得る。 ポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質）で発現され得、 そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的な領域を含み得る。例え ば、さらなるアミノ酸（特に、荷電したアミノ酸）の領域が、精製の間、または 後続の操作取扱いおよび貯蔵の間、宿主細胞における安定性および持続性を改善 させるためにポリペプチドＮ末端に付加され得る。さらに、ペプチド部分は、精 製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペ プチドの最終的な調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じさ せるために、安定性を改善させるために、そして精製を促進するためにポリペプ チドへのペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られ、そして日常的な技術で ある。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するに有用な免疫グロブ リン由来の異種領域を含む。例えば、EP-A-0 464 533（カナダの対応、2045869 ）は、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を別のヒトタンパク質または それらの一部とともに含む融合タンパク質を開示する。多く場合において、融合 タンパク質におけるFc部分は、治療および診断での使用について完全に有利であ り、従って、例えば、改善された薬物動態学的特性を生じる（EP-A 0232 262） 。一方、いくつかの使用のために、記載された有利な様式で、融合タンパク質が 、発現、検出、そして精製された後、Fc部分を欠失し得ることが望ましい。これ は、Fc部分が治療および診断での使用に障害になることがわかっている場合、例 えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用されるべき場合である。 薬物開発において、例えば、ヒトタンパク質（例えば、hIL-5）が、hIL-5のアン タゴニストを同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的のために Fc部分と融合された。Bennettら、Journal of Molecular Recognition，8:52-58 (1995)およびJohansonら、The Journal of Biological Chemistry，270(160):94 59-9471(1995)を参照のこと。 TR1レセプタータンパク質は、硫安沈澱またはエタノール沈澱、酸性抽出、陰 イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホ セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニ ティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およ びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から 回収および精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HP LC」）が、精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは、天然に精製され た生成物、化学合成手順の生成物、および原核生物宿主もしくは真核生物宿主（ 例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含む）から組換え 技術によって生成された生成物を含む。組換え生成手順において用いられる宿主 に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化されてもよいし、または非グ リコシル化されてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場 合において宿主媒介プロセスの結果として開始改変メチオニン残基を含み得る。 TR1レセプター：疾患状態の検出のための使用 本発明は、本発明のTR1レセプターがTNF-αおよびTNF-βの両方と結合するが 、TNF-βに対してより高い親和性を有することを示す。図７を参照のこと。TNF- β（TNFレセプタータンパク質の強力なリガンド）は、多くの生物学的プロセス （リンパ球発生、腫瘍壊死、抗ウイルス状態の誘導、多形核白血球の活性化、内 皮細胞上での主要組織適合性複合体抗原クラスＩの誘導、内皮細胞上での接着分 子の誘導、および増殖ホルモン刺激を含む）に関与することが知られている（Ru ddleおよびHomer、Prog．Allergy，40:162-182(1988))。本発明のTR1レセプター のリガンドでもある、TNF-αは、腫瘍の迅速な壊死、免疫賦活、自己免疫疾患、 移植片拒絶、抗ウイルス応答の生成、敗血症ショック、大脳マラリア、細胞傷害 性、化学療法の過程の間に生成されるイオン化放射線の有害な効果（例えば、酵 素の変性、脂質の過酸化、およびDNA損傷）に対する保護(Nataら、J．Immunol.1 36(7):2483(1987))、増殖調節、血管内皮効果、および代謝効果において役割を 有することが報告されている。TNF-αはまた、内皮細胞が細胞増殖を促進する種 々の因子（PAI-1、IL-1、GM-CSF、およびIL-6を含む）を分泌することを誘発す る。さらに、TNF-αは種々の細胞接着分子（例えば、E-セレクチン、ICAM-1、お よびVCAM-1）を上方制御する。TNF-αおよびFasリガンドはまた、プログラムさ れた細胞死を誘導することが示されている。 特定のガンを有する哺乳動物中の特定の組織は、対応する「標準的」哺乳動物 （すなわち、ガンを有さない同じ種の哺乳動物）と比較した場合、有意に変化し たレベルのTR1レセプタータンパク質およびTR1レセプタータンパタ質をコードす るmRNAを発現すると考えられる。例えば、本発明者らは、骨肉腫、卵巣ガン、単 球白血病、および肺気腫細胞が、本発明のTR1レセプタータンパク質を発現する ことを見出した。さらに、本タンパク質は分泌されるので、上昇したレベルのTR 1レセプタータンパク質が、ガンを有さない同じ種の哺乳動物由来の血清と比較 した場合、ガンを有する哺乳動物由来の特定の体液（例えば、血清、血漿、尿、 および脊髄液）において検出され得ると考えられる。従って、本発明は、腫瘍診 断および、おそらく他の疾患状態の間に有用な診断方法を提供する。これは、哺 乳動物細胞または体液中のTR1レセプタータンパク質をコードする遺伝子の発現 レベルをアッセイし、そして遺伝子発現レベルを標準的なTR1レセプター遺伝子 発現レベルと比較することを含み、それによって標準に対する遺伝子発現におけ る増大または減少が特定の腫瘍を示す。 肺瘍診断が従来方法に従って既に作製されているので、本発明は予後指標とし て有用である。これにより、増加したTR1レセプター遺伝子発現を示す患者はよ り低いレベルで遺伝子を発現する患者と比較してより悪い臨床結果を得る。 「TR1レセプタータンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする こと」により、最初の生物学的サンプルにおけるTR1レセプタータンパク質のレ ベルまたはTR1レセプタータンパク質をコードするmRNAレベルを、直接的（例え ば、絶対タンパク質レベルまたは絶対mRNAレベルを測定また評価することにより ）または間接的（例えば、第二の生物学的サンプルにおけるTR1レセプタータ ンパク質のレベルまたはmRNAレベルと比較することにより）のいずれかで、定性 的または定量的に測定および評価することが意図される。 好ましくは、第一の生物学的試料におけるTR1レセプタータンパク質のレベル 、またはmRNAレベルは、標準のTR1レセプタータンパク質のレベル、またはmRNA レベルと比較して測定または評価される。標準は、ガンを有さない個体から得ら れた第二の生物学的サンプルから採取される。当該分野において理解されるよう に、一旦、標準のTR1レセプタータンパク質のレベル、またはmRNAレベルが知ら れると、それは比較のための標準として繰り返し使用され得る。 「生物学的サンプル」によって、個体、体液、細胞株、組織培養物、あるいは TR1レセプタータンパク質またはmRNAを含む他の供給源から得られる任意の生物 学的サンプルが意図される。生物学的サンプルは、分泌された成熟TR1レセプタ ータンパク質を含む哺乳動物の体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および随 液）、ならびに胸腺、前立腺、心臓、胎盤、筋肉、肝臓、脾臓、肺、腎臓、およ び臍帯組織を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分 野で周知である。生物学的サンプルがmRNAを含む場合、組織生検が好ましい供給 源である。 本発明は、哺乳動物のガン及び他の疾患状態の検出に有用である。詳細には、 本発明は、骨芽細胞肺細胞の増殖によって生じるガンの診断に有用である。実施 例７に記載されるように、ノーザンブロット分析は、多数の正常な組織に加えて 、骨芽細胞腫細胞が本発明のTR1レセプターを発現することが見出されたことを 示す。この結果は、滑液肉腫細胞が検出可能なレベルのTR1レセプターmRNAを生 じないという事実と連関し、このことは、本発明によって提供される分子が特定 の疾患状態を検出すること、およびこのような状態の処置を提供することの両方 に有用であり得ることを示す。好ましい哺乳動物として、モンキー、類人猿、ネ コ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、およびヒトが挙げられる。特に好ましい のはヒトである。 全細胞RNAが、任意の適切な技術（例えば、ChomczynskiおよびSacchi，Anal.B iochem．162:156-159(1987)に記載されている一工程のグアニジン-チオシアネー ト-フェノール-クロロホルム法）を使用して生物学的サンプルから単離され得 る。次いで、TR1レセプタータンパク質をコードするmRNAのレベルが、任意の適 切な方法を用いてアッセイされる。これらは、ノーザンブロット分析、S1ヌクレ アーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、ポリメラーゼ連鎖反応と組 み合わせた逆転写（RT-PCR）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ RT-LCR）を含む。 ノーザンブロット分析は、以下の実施例７およびHaradaら、Cell 63.303-312( 1990)に記載されているように行われ得る。簡潔には、全RNAが上記のような生物 学的サンプルから調製される。ノーザンブロットのためには、RNAは適切な緩衝 液（例えば、グリオキサール／ジメチルスルホキシド／リン酸ナトリウム緩衝液 ）中で変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニトロセルロースフ ィルターに移される。RNAがUVリンカーによってフィルターに結合された後、フ ィルターは、ホルムアミド、SSC、デンハルト溶液、変性させたサケ精子、SDS、 およびリン酸ナトリウム緩衝液を含有する溶液中で予備ハイブリダイゼーション される。任意の適切な方法（例えば、32PマルチプライムDNA標識システム(Amers ham)）に従って標識されたTR1レセプタータンパク質cDNAが、プローブとして使 用される。一晩のハイブリダイゼーション後、フィルターは洗浄され、そしてＸ 線フィルムに曝される。本発明に従うプローブとしての使用のためのcDNAは、上 記の節に記載されており、そして少なくとも15bpの長さが好ましい。 S1マッピングは、Fujitaら、Cell 49:357-367（1987）に記載されているよう に行われ得る。S1マッピングでの使用のためのプローブDNAを調製するために、 上記のcDNAのセンス鎖がテンプレートとして使用され、標識されたアンチセンス DNAが合成される。次いで、アンチセンスDNAが、適切な制限エンドヌクレアーゼ を使用して消化され、所望の長さのさらなるDNAプローブが生成され得る。この ようなアンチセンスプローブは、標的mRNA（すなわち、TR1レセプタータンパク 質をコードするmRNA）に対応する保護されたバンドを可視化するために有用であ る。ノーザンブロット分析が、上記のように行われ得る。 好ましくは、TR1レセプタータンパク質をコードするmRNAのレベルは、Makino ら、Technique 2:295-301（1990）に記載されているRT-PCR法を使用してアッセ イされる。この方法によれば、ポリアクリルアミドゲルバンド中の「アンプリコ ン」の放射活性は、標的mRNAの初期濃度に直線的に相関する。簡潔には、この方 法は、RTプライマーおよび適切な緩衝液を含む反応混合物中の生物学的サンプル から単離された全RNAを添加する工程を包含する。プライマーのアニーリングの ためのインキュベーション後、混合物はRT緩衝液、dNTP、DTT、RNaseインヒビタ ー、および逆転写酵素を補充され得る。RNAの逆転写を達成するためのインキュ ベーション後、次いで、RT産物は標識されたプライマーを使用するPCRに供され る。あるいは、プライマーを標識するよりもむしろ、標識されたdNTPがPCR反応 混合物中に含まれ得る。PCR増幅は、従来技術に従ってDNAサーマルサイクラー中 で行われ得る。増幅を達成するための適切な数のラウンド後、PCR反応混合物は ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動される。ゲルの乾燥後、適切なバンド（TR 1レセプタータンパク質をコードするmRNAに対応する）の放射活性は、画像解析 機を使用して定量される。RTおよびPCR反応の成分および条件、試薬およびゲル 濃度、ならびに標識方法は、当該分野で周知である。RT-PCR法の変形は当業者に 明らかである。 逆転写された標的mRNAを増幅する任意のオリゴヌクレオチドプライマーのセッ トが使用され得、そして上記の節で記載されるように設計され得る。 生物学的サンプル中のTR1レセプタータンパク質レベルのアッセイは、任意の 当該分野で公知の方法を使用して行われ得る。抗体に基づく技術が、生物学的サ ンプル中のTR1レセプタータンパク質レベルをアッセイするために好ましい。例 えば、組織中でのTR1レセプタータンパク質の発現は、伝統的な免疫組織学的方 法で研究され得る。これらの場合、特異的認識は一次抗体（ポリクローナルまた はモノクローナル）によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、または 他の結合された二次抗体を利用し得る。結果として、病理学試験のための組織切 片の免疫組織学的染色が得られる。組織はまた、ウェスタンブロットまたはドッ ト／スロットアッセイ（Jalkanen，M．ら、J．Cell．Biol．101:976-985(1985); Jalkanen，Mら、J．Cell．Biol．105:3087-3096(1987)）のためのTR1レセプター タンパク質の遊離のために、例えば、尿素および中性の界面活性剤を用いて抽出 され得る。陽イオン性固相の使用に基づくこの技術において、TR1レセプタータ ンパク質の定量は、単離されたTR1レセプタータンパク質を標準として使用し て達成され得る。この技術はまた、体液にも適用され得る。これらのサンプルに 関して、TR1レセプタータンパク質のモル濃度は、血清、血漿、尿、随液などの ような異なる体液について、TR1レセプタータンパク質含量の標準値の設定を補 助する。次いで、TR1レセプタータンパク質の量の正常値は、健常な個体に由来 する値を使用して設定され得、これは、試験被検体から得られる値と比較され得 る。 従って上記から、本発明は、本発明のポリペプチドの可溶性形態の変化したレ ベルを検出する診断アッセイにさらに関し、ここで宿主に由来するサンプル中の 上昇したレベルは、特定の疾患の指標である。 可溶性レセプターのレベルを検出するために有用なアッセイは当業者に周知で ある。例えば、放射免疫アッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析 、そして好ましくはELISAアッセイが使用され得る。 EKISAアッセイは、最初に、本発明のポリペプチドに対する抗原に特異的な抗 体（好ましくは、モノクローナル抗体）を調製する工程を包含する。さらに、レ ポーター抗体は、モノクローナル抗体に対して調製される。レポーター抗体には 、放射活性物質、蛍光物質、または本実施例における西洋ワサビペルオキシダー ゼ酵素のような検出可能な試薬が結合される。サンプルは、ここで宿主から取り 出され、そしてサンプル中のタンパク質に結合する固体支持体上（例えば、ポリ スチレンディッシュ）でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の 有利のタンパク質結合部位が、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミ ン）と共にインキュベートすることによって覆われる。次いで、モノクローナル 抗体が、モノクローナル抗体がポリスチレンディッシュに結合させられた本発明 の任意のタンパク質に結合する時間、ディッシュ中でインキュベートされる。全 ての結合していないモノクローナル抗体は緩衝液で洗い流される。西洋ワサビペ ルオキシダーゼに結合させたレポーター抗体はここで、ディッシュ中におかれ、 本発明のポリペプチドに結合された任意のモノクローナル抗体に対するレポータ ー抗体の結合を生じる。次いで、結合していないレポーター抗体が、洗い流され る。次いで、ペルオキシダーゼ基質がディッシュに添加され、そして所定の時間 に発祥された色素の量が、標準曲線と比較した場合の所定の容量の患者のサンプ ル中に存在する目的のタンパク質の量が測定される。 競合アッセイが使用され、ここで本発明のポリペプチドに特異的な抗体が固体 支持体に結合される。標識されたTR1レセプターポリペプチド、および宿主由来 のサンプルが、固体支持体上を通過させられ、そして固体支持体上に結合した検 出された標識の量は、サンプル中の量に相関し得る。レセプターの可溶性の形態 もまた、アゴニスト及びアンタゴニストを同定するために使用され得る。 適切な酵素標識は、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒する オキシダーゼ群由来のものを含む。グルコースオキシダーゼは、それが良好な安 定性を有し、そしてその基質（グルコース）が容易に入手できるために、特に好 ましい。オキシダーゼ標識の活性は、酵素-標識抗体／基質反応によって形成さ れる過酸化水素の濃度を測定することによってアッセイされ得る。酵素に加えて 、他の適切な標識として、放射性同位元素（例えば、ヨウ素（125I、121I）、炭 素（14C）、イオウ（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）、および テクネチウム（99mTc））、ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよび ローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。 個体から得られる生物学的サンプル中のTR1レセプタータンパク質レベルをア ッセイすることに加えて、TR1レセプタータンパク質はまた、画像解析によって インビボで検出され得る。TR1レセプタータンパク質のインビボでの画像解析の ための抗体標識またはマーカーとして、Ｘ線撮影法、NMR、またはESRによって検 出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影法については、適切な標識として、検出可 能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムま たはセシウムのような放射性同位元素が挙げられる。NMRおよびESRのための適切 なマーカーとして、関連のハイブリドーマの栄養分の標識によって抗体中に取り 込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴的な回転を有するものが挙げられる 。 放射性同位元素（例えば、131I、112In、99mTc）、放射性不透過基質、または 核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像解析部分で標 識されている、TR1レセプタータンパク質-特異的抗体または抗体フラグメントが 、ガンについて試験される哺乳動物中に（例えば、非経口的、皮下、または静脈 内）導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析システムによって、 診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定されることが 、当該分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、 注射される放射活性の量は、通常約５〜20ミリキュリーの範囲の99mTcである。 次いで、標識抗体または抗体フラグメントは、TR1レセプタータンパク質を含む 細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、S.W．Burchiel ら、「Immunopharmacokinetics of Radiolabelled Antibodies and Their Fragm ents」（Tumer Imaging第13章：The Radiochemical Detection of Cancer，S.W ．BurchielおよびB.A．Rhodes編、Masson Publishing Inc．(1982)）に記載され ている。 本発明での使用のためのTR1レセプタータンパク質特異的抗体は、完全なTR1レ セプタータンパク質またはその抗原性ポリペプチドフラグメントに対して惹起さ れ得る。これは、アルブミンのようなキャリアタンパク質と共に、またはそれが 充分に長い（少なくとも約25アミノ酸）場合はキャリアを伴わずに、動物系（例 えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得る。 本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（Ab）または「モノクローナル抗 体」（Mab）は、TR1レセプタータンパク質に特異的に結合し得る完全な分子およ び抗体フラグメント（例えば、FabおよびF(ab')2フラグメントのような）を含む ことを意味する。FabおよびF(ab')2フラグメントは完全な抗体のFcフラグメント を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異 的組織結合をほとんど有し得ない（Wahlら、J．Nucl．Med．24:316-325(1983)） 。従って、これらのフラグメントが好ましい。 本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、TR1レセ プタータンパク質またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクロー ナル抗体を含む血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法 において、TR1レセプタータンパク質の調製物は、それが天然の混入物を実質的 に含まないように調製され、そして精製される。次いで、このような調製物は、 より大きな特異的活性のポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入され る。 最も好ましい方法において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（あるいはそ のTR1レセプタータンパク質結合フラグメント）である。このようなモノクロー ナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Kohlerら、Nature 256:495(1975)；Kohlerら 、Eur．J．Immunol．6:511(1976)；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6:292(1976)； Hammerlingら：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas，Elsevier,N.Y. ，(1981)pp563-681）を用いて調製され得る。一般に、このような手順は、TR1レ セプタータンパク質抗原、またはより好ましくはTR1レセプタータンパク質発現 細胞で動物（好ましくは、マウス）を免疫する工程を包含する。適切な細胞は、 抗TR1レセプタータンパク質抗体に結合するそれらの能力によって認識され得る 。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地中で培養され得る；しかし、10 ％ウシ胎児血清（約56℃で不活化した）を補充し、約10g/lの非必須アミノ酸、 約1,000U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプトマイシンを補充した Earle改変イーグル培地中で細胞を培養することが好ましい。このようなマウス の脾細胞が抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合される。任意の適切な骨 髄腫細胞株が、本発明に従って使用され得る；しかし、アメリカンタイプカルチ ャーコレクション，Rockville，Marylandから入手可能な親骨髄腫細胞株（SP2O ）を使用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞はHAT培地 中で選択的に維持され、次いでWandsら（Gastroenterology 80:225-232(1981)） に記載されているような限界希釈によってクローニングされる。次いで、このよ うな選択によって得られたハイブリドーマ細胞は、TR1レセプタータンパク質抗 原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。 単鎖抗体の産生について記載される技術（米国特許第4,946,778号）が、本発 明の免疫原性ポリペプチド生成物に対する単鎖抗体を産生するために適用され得 る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性ポリペプチド生成物 の対するヒト化抗体を発現させるために使用され得る。 あるいは、TR1レセプタータンパク質抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イ ディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は 、抗体はそれ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合す る抗体を得ることが可能である。この方法に従って、TR1レセプタータンパク質 特異的抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次い で、 このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そし てハイブリドーマ細胞は、TR1レセプタータンパク質-特異的抗体に結合する能力 が、TR1レセプタータンパク質抗原によってブロックされ得る抗体を産生するク ローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、TR1レセプ タータンパク質-特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさら なるTR1レセプタータンパク質-特異的抗体の形成を誘導するために動物を免疫す るために使用され得る。 本発明の抗体のFabフラグメントおよびF(ab')2フラグメントおよび他のフラグ メントが、本明細書中に開示される方法に従って用いられ得ることが認識される 。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Fabフラグメントを生成 するため）またはペプシン（F(ab')2フラグメントを生成するため）のような酵 素を用いるタンパク質分解切断により生成される。あるいは、TR1レセプタータ ンパク質結合フラグメントは、組換えDNA技術の適用を通して、または合成化学 を通して生成され得る。 ヒトにおける腫瘍の診断のために、インビボでの画像化を用いて、増強された レベルのTR1レセプタータンパク質を検出する場合、「ヒト化」キメラモノクロ ーナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノ クローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成さ れ得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。総説につ いては、Morrison，Science 229:1202(1985);Oiら，BioTechniques 4:214(1986) ;Cabillyら，米国特許第4,816,567号;Taniguchiら，EP 171496;Morrisonら，EP 173494;Neubergerら，WO 8601533;Robinsonら，WO 8702671;Boulianneら，Natur e 312:643(1984);Neubergerら，Nature 314:268(1985)を参照のこと。 本発明のTR1レセプタータンパク質特異的抗体にさらに適切な標識は、以下に 提供される。適切な酵素標識の例は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコ ッカスヌクレアーゼ、Δ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロ ゲナーゼ、α-グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメ ラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グル コースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、 カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およ びアセチルコリンエステラーゼを含む。 適切な放射性同位体標識の例は、3Ｈ、111In、125Ｉ、131Ｉ、32Ｐ、35Ｓ、14 Ｃ、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Ｙ、67Cu、217Ci、211At、212pb 、47Sc、109Pdなどを含む。111Inおよびは、インビボでの画像化が用いられる場 合に好ましい同位体である。なぜなら、これは、125Ｉまたは131Ｉで標識したモ ノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲン化の問題を回避するからである。さら に、この放射性核種（radionucleotide）は、画像化のためにより好ましいγ放 出エネルギーを有する（Perkinsら，Eur．J．Nucl．Med．10:296-301(1985);Car asquilloら，J．Nucl．Med．28:281-287(1987)）。例えば、1-(p-イソチオシア ネートベンジル)-DPTAを用いてモノクローナル抗体にカップリングした111Inは 、非腫瘍性組織（特に肝臓）における取り込みをほとんど示さなかった。それゆ え、腫瘍局在化の特異性を増強する（Estebanら，J．Nucl．Med．28:861-870(19 87)）。 適切な非放射性同位体標識の例は、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、および56Feを 含む。 適切な蛍光標識の例は、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネー ト標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフ ィコシアニン標識、o-フタルアルデヒド（o-phthaldehyde）標識、およびフルオ レサミン標識を含む。 適切な毒素標識の例は、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素を含む。 化学発光標識の例は、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジ ニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エス テル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識を含 む。 核磁気共鳴コントラスト剤の例は、Gd、Mn、および鉄のような重金属原子核を 含む。 上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、Kennedyら，Clin．Chlm ．Acta 70:1-31(1976)およびSchursら，Clin．Chim．Acta 81:1-40(1977)により 提供される。後者において言及されるカップリング技術は、グルタルアルデヒ ド方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロ キシ-スクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参 考として援用される。 TR1レセプター：TR1レセプター機能のアゴニストおよびアンタゴニストについて のスクリーニングのための使用 ひとつの局面において、本発明は、本発明のTR1レセプターの活性（例えば、 細胞増殖、造血性発生、アポトーシス）を増強するための方法に関し、この方法 は、TR1レセプターポリペプチドを発現する細胞に、TR1レセプター媒介シグナリ ングを増加し得る有効量のアゴニストを投与する工程を含む。好ましくは、TR1 レセプター媒介シグナリングを、疾患を処置するために増加させる。 さらなる局面において、本発明は、本発明のTR1レセプターの活性を阻害する ための方法に関し、この方法は、TR1レセプターポリペプチドを発現する細胞に 、TR1レセプター媒介シグナリングを減少し得る有効量のアンタゴニストを投与 する工程を含む。好ましくは、TR1レセプター媒介シグナリングもまた、疾患を 処置するために減少させる。 「アゴニスト」によって、本発明のTR1レセプターの活性を宜進または増強し 得る、天然に存在する化合物および合成化合物が意図される。「アンタゴニスト 」によって、TR1レセプターの活性を阻害し得る、天然に存在する化合物および 合成化合物が意図される。本発明の任意の候補の「アゴニスト」または「アンタ ゴニスト」が活性を増強または阻害し得るか否かは、当該分野で公知のTR1ファ ミリーリガンド／レセプター細胞応答アッセイ（以下でより詳細に記載されるも のを含む）を用いて決定され得る。 別の方法は、標識したリガンドの、細胞の表面上にレセプターを有する細胞へ の結合の阻害を定量することによって、本発明のレセプターポリペプチドの活性 化を阻害する化合物についてスクリーニングする工程を含む。そのような方法は 、膜貫通アミノ酸配列を含む本発明のTR1レセプターに特に有用であり、そして 細胞が細胞の表面上でレセプターを発現するように、真核生物細胞を、レセプタ ーをコードするDNAでトランスフェクトする工程、および標識形態の公知のリガ ン ドの存在下で細胞を化合物と接触させる工程を含む。リガンドは、例えば放射能 によって標識され得る。レセプターに結合した標識リガンドの量を、例えば、レ セプターの放射能を測定することによって測定する。レセプターに結合する標識 したリガンドの減少によって決定されるように化合物がレセプターに結合する場 合、標識したリガンドのレセプターへの結合は、阻害される。 本発明のアゴニストおよびアンタゴニストについてのさらなるスクリーニング アッセイは、TartagliaおよびGoeddel，J．Biol．Chem．267(7):4304-4307(1992 )において記載される。 従って、さらなる局面において、候補アゴニストまたはアンタゴニストがTR1 レセプターリガンドに対する細胞応答を増強または阻害し得るか否かを決定する ためのスクリーニング方法が提供される。本方法は、TR1レセプターポリペプチ ドを発現する細胞を候補化合物およびリガンドと接触させる工程、細胞応答をア ッセイする工程、ならびに細胞応答を標準的な細胞応答（標準は、候補化合物の 非存在下でリガンドとの接触がなされる場合にアッセイされる）と比較する工程 を含み、それによって標準を越えて増加した細胞応答は、候補化合物がリガンド ／レセプターシグナリング経路のアゴニストであることを示し、そして標準と比 較して減少した細胞応答は、候補化合物がリガンド／レセプターシグナリング経 路のアンタゴニストであることを示す。「細胞応答をアッセイする工程」によっ て、候補化合物および／またはTR1レセプターリガンドに対する細胞応答を定性 的または定量的に測定すること（例えば、Ｔ細胞増殖における増加もしくは減少 、またはトリチウム化チミジン標識を決定あるいは評価すること）が意図される 。本発明によって、TR1レセプターポリペプチドを発現する細胞は、内因的また は外因的のいずれかで投与されたレセプターリガンドと接触され得る。 本発明によるアゴニストは、例えばTNFファミリーリガンドペプチドフラグメ ント、トランスフォーミング増殖因子β、神経伝達物質（例えば、グルタミン酸 、ドーパミン、N-メチル-D-アスパラギン酸）、腫瘍サプレッサー(p53)、細胞溶 解性Ｔ細胞、および代謝拮抗物質のような天然に存在する化合物および合成化合 物を含む。好ましいアゴニストは、例えばシスプラチン、ドキソルビシン、ブレ オマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキセ ー ト、およびビンクリスチンのような化学療法剤を含む。他のものは、エタノール およびβ-アミロイドペプチドを含む(Science 267:1457-1458(1995))。さらに好 ましいアゴニストは、TR1レセプターポリペプチドに対して惹起されるポリクロ ーナル抗体およびモノクローナル抗体、またはそれらのフラグメントを含む。TN Fファミリーレセプターに対して惹起されるそのようなアゴニスト抗体は、Tarta gliaら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9292-9296(1991)；およびTartagliaお よびGoeddel，J．Biol．Chem．267(7):4304-4307(1992)に開示される。PCT出願W O 94/09137もまた参照のこと。 本発明によるアンタゴニストは、例えば、CD40リガンド、中性アミノ酸、亜鉛 、エストロゲン、アンドロゲン、ウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルスElB 、バキュロウイルスp35およびLAP、牛痘ウイルスcrmA、エプスタイン・バーウイ ルスBHRF1、LMP-1、アフリカ豚コレラウイルスLMW5-HL、およびヘルペスウイル スγl 34.5）、カルパインインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター 、および腫瘍プロモーター（例えば、PMA、フェノバルビタール、およびα-ヘキ サクロロシクロヘキサン）のような天然に存在する化合物および合成化合物を含 む。他のアンタゴニストは、TR1レセプターポリペプチドまたはそれらのフラグ メントに対して惹起されるポリクローナルおよびモノクローナルのアンタゴニス ト抗体を含む。TNFファミリーレセプターに対して惹起されるそのようなアンタ ゴニスト抗体は、TartagliaおよびGoeddel，J．Biol．Chem．267(7):4304-4307( 1992)；ならびにTartagliaら、Cell 73:213-216(1993)に記載される。PCT出願WO 94/09317もまた参照のこと。 他の可能性のあるアンタゴニストはアンチセンス分子を含む。アンチセンス技 術は、アンチセンスDNAもしくはRNAを介してか、または三重らせん形成を介して 遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えばOkano, J．Neurochem．56:560(1991);Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988)において考察される。 三重らせん形成は、例えばLeeら、Nucleic Acids Research 6:3073(1979);Coone yら、Science 241:456(1988);およびDervanら、Science 251:1360(1991)におい て考察される。本方法は、相補的なDNAまたはRNAへのポリヌクレ オチドの結合に基づく。 例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5'コード 部分は、長さが約10〜40塩基対のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計す るために使用され得る。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関する遺伝子の領域 に相補的であるように設計され、それによってレセプターの転写および産生を妨 げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、インビボでmRNAにハイブリダイ ズし、mRNA分子の、レセプターポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオ リゴヌクレオチドはまた細胞に送達され得、その結果アンチセンスRNAまたはDNA がインビボで発現されてレセプターの産生を阻害し得る。 本発明によるさらなるアンタゴニストは、可溶性のTR1レセプターフラグメン ト（例えば、完全長レセプターの細胞外領域由来のリガンド結合ドメインを含む TR1レセプターフラグメント）を含む。レセプターのそのような可溶性形態は、 天然に存在するか、または合成であり得、TNFファミリーリガンドに結合するた めのTR1レセプターの細胞表面形態と競合することによって、TR1レセプター媒介 シグナリングと拮抗する。従って、そのようなアンタゴニストは、本発明のポリ ペプチドのリガンド結合ドメインを含む可溶性形態のレセプターを含む。 示されるように、本発明によるポリクローナルおよびモノクローナル抗体のア ゴニストまたはアンタゴニストは、TartagliaおよびGoeddel，J．Biol．Chem．2 67(7):4304-4307(1992);Tartagliaら、Cell 73:213-216(1993)、およびPCT出願W O 94/09137において開示される方法に従って惹起され得る。本明細書中で使用さ れるように用語「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(mAb)は、抗原に結 合し得るインタクトな分子ならびにそのフラグメント（例えば、FabおよびF(ab' )2フラグメント）を含むことが意味される。FabおよびF(ab')2フラグメントは、 インタクトな抗体のFcフラグメントを欠き、循環からより迅速にクリアランスさ れ、そしてインタクトな抗体のより少ない非特異的組織結合を有し得る（Wahlら 、J．Nucl．Med．24:316-325(1983)）。 本発明による抗体は、本発明のTR1レセプター免疫原を用いる任意の種々の方 法によって調製され得る。示されるように、そのようなTR1レセプター免疫原は 、完全長TR1レセプターポリペプチド（リーダー配列を含むかまたは含まなくと も よい）およびTR1レセプターポリペプチドフラグメント（例えば、リガンド結合 ドメイン、細胞外ドメイン、および細胞内ドメイン）を含む。 好ましい方法において、本発明による抗体はmAbである。そのようなmAbは、ハ イブリドーマ技術を用いて調製され得る(KohlerおよびMillstein，Nature 256:4 95-497(1975)および米国特許第4,376,110号;Harlowら、Antibodies:A Laborator y Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1 988;Monoclonal Antibodies and Hybridomas:A New Dimension in Biological A nalyses，Plenum Press，New York，NY，1980;Campbell，「Monoclonal Antibod y Technology」，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biol ogy，第13巻（Burdonら編）、Elsevier，Amsterdam(1984))。 本発明のTR1レセプターを発現することが示されている胸腺細胞を、増殖アッ セイにおいて用いて、本発明のポリペプチドに対するリガンド、ならびに潜在的 なアゴニストおよびアンタゴニストの両方を同定し得る。例えば、胸腺細胞を、 組織からばらばらにし、そして培養培地において増殖させる。DNA前駆体（例え ば、3H-チミジンまたは5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)）の取り込みを、D NA合成および細胞増殖についてのパラメーターとしてモニターする。DNA中にBrd Uを組み込んだ細胞を、BrdUに対するモノクローナル抗体を用いて検出し、そし て酵素または蛍光色素結合二次抗体によって測定し得る。反応を、蛍光定量法に よってか、または分光光度法によって定量する。２つのコントロールウェルおよ び実験ウェルをセットする。TNF-βをすべてのウェルに添加し、一方で本発明の 可溶性レセプターを実験ウェルに添加する。スクリーニングするべき化合物もま た、実験ウェルに添加する。次いで、スクリーニングするべき化合物が本発明の レセプターポリペプチドとTNF-βとの相互作用を阻害する能力を定量し得る。ア ゴニストの場合において、化合物がこの相互作用を増強する能力を定量する。 本発明のポリペプチドに結合し得ることが知られていないリガンドが、本発明 のポリペプチドに結合し得るか否かの決定がなされ得、それは、本発明のポリペ プチドに結合することが知られているリガンドの結合を可能にする条件下で、本 発明のポリペプチドをコードする単離した分子を含む哺乳動物細胞をリガンドと 接触させる工程、任意の結合したリガンドの存在を検出する工程、それによって そのようなリガンドが本発明のポリペプチドに結合するか否かを決定する工程を 包含する。また、可溶性形態のレセプターを上記のアッセイにおいて利用し得る 。ここでレセプターは、細胞外培地中に分泌され、そしてどれが可溶性形態のレ セプターに結合するかを決定するためにリガンドと接触させられる。 他のアゴニストおよびアンタゴニストスクリーニング手順は、レセプターを細 胞の表面上に発現する適切な細胞を提供する工程を包含する。詳細には、本発明 のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いて、細胞をトランスフェク トし、それによってポリペプチドを発現する。そのようなトランスフェクション は、本明細書中の上記のような手順によって達成され得る。 従って、例えば、本発明のポリペプチドをコードする細胞を、レセプターリガ ンドおよびスクリーニングされるべき化合物の両方と接触させることによって、 レセプターアンタゴニストについてスクリーニングするために、そのようなアッ セイを使用し得る。リガンドによって生成されるシグナルの阻害は、化合物がレ セプターについて潜在的なアンタゴニストである（すなわち、レセプターの活性 化を阻害する）ことを示す。 TR1レセプタードメインを結合するタンパク質および他の化合物もまた、本発 明による候補アゴニストおよびアンタゴニストである。そのような結合化合物を 、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて「捕獲」し得る（FieldsおよびSong， Nature 340:245-246(1989)）。改変型の酵母ツーハイブリッドシステムは、Roge r Brentおよび共同研究者によって記載されている(Gyurisら、Cell 75:791-803( 1993);Zervosら、Cell 72:223-232(1993))。手短には、TR1レセプターポリペプ チドのドメインを、結合する化合物についてのおとり(bait)として使用する。次 いで、陽性を、ロイシンを欠いたプレート上で増殖する能力によって選択し、次 いで以前に非常に詳細に記載されたように（Gyurisら、前出）、X-galを有する プレート上で青色になる能力についてさらに試験する。好ましくは、本発明に従 って、酵母ツーハイブリッドシステムを用いて、TR1レセプターリガンド結合ド メインまたはTR1レセプター細胞内ドメインのいずれかに結合する化合物を捕獲 する。そのような化合物は、本発明の良好な候補アゴニストおよびアンタゴニス トである。このシステムは、以前に、p55およびp75 TNFレセプターの細胞 内ドメインに結合するタンパク質を単離するために使用されている(WO 95/31544 )。一旦、TR1レセプターに結合するアミノ酸配列を同定すると、例えば上記の胸 腺細胞増殖アッセイを用いて、これらの配列をアゴニストまたはアンタゴニスト 活性についてスクリーニングし得る。 本発明のTR1レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために 行われ得る別のアッセイは、次いで結合親和性TR1レセプターおよびアゴニスト 効果またはアンタゴニスト効果の両方についてスクリーニングされ得るランダム なペプチドを生成する組み合わせ化学の使用を含む。最近、そのようなアッセイ の１つが、バクテリオファージの表面上で発現されるランダムなペプチドを用い て実施されている。Wu，Nature Biotechnology 14:429-431。この例において、 ファージの表面上に莫大なペプチドを提示するファージディスプレーライブラリ ーが生成された。次いで、このライブラリーのファージは、マウス中に注入され 、次いで種々の器官に結合したペプチドを発現するファージが同定された。次い で、器官に結合したファージ中に含まれるDNAが配列決定されて、各器官におい て細胞の表面と相互作用し得るペプチドモチーフを同定した。当業者は、そのよ うなランダムなペプチドライブラリーはまた、本発明のTR1レセプターの表面に 結合するモチーフについてスクリーニングされ得ることを認識する。そのような モチーフを同定した後、次いでこれらのペプチドを、本明細書中に記載のアッセ イを用いてアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性についてスクリーニングし 得る。 他のスクリーニング技術は、本発明のポリペプチドを発現する細胞（例えば、 トランスフェクトしたCHO細胞）の、レセプター活性化によって引き起こされる 細胞外pH変化を測定するシステム（例えば、Science，246:181-296(1989)に記載 されるような）における使用を含む。別の例において、可能性のあるアゴニスト またはアンタゴニストを、本発明のポリペプチドを発現する細胞と接触させ得、 そして第２メッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達）を測定して、可能性の あるアンタゴニストまたはアゴニストが有効であるか否かを決定し得る。 TR1レセプターアンタゴニストはまた、TR1レセプターに結合してそれを占有し 、それによってレセプターを、それに結合するリガンドと接近不可能にし、その 結果正常な生物学的活性が妨げられる小分子を含む。小分子の例は、小ペプチド ま たはペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。 TR1レセプターアゴニストを用いて、リガンド活性（例えば、腫瘍増殖の阻害 、および特定の移植可能な腫瘍の壊死）を刺激し得る。また、アゴニストを用い て、細胞分化（例えば、Ｔ細胞、線維芽細胞、および造血細胞の分化）を刺激し 得る。TR1レセプターに対するアゴニストはまた、微生物に対する宿主の防御に おけるTR1の役割を増大し得、そして関連する疾患（L．monocytogenesからの感 染のような感染）およびChlamidiaeを予防し得る。また、アゴニストを用いて、 放射線治療の過程で生成される電離放射線の有害な効果（例えば、酵素の変性、 脂質の過酸化、およびDNA損傷）に対して保護し得る。 また、アゴニストを用いて、抗ウイルス応答を媒介し、増殖を調節し、免疫応 答を媒介し、そしてHIVのような疾患に関連する免疫不全症を処置し得る。 TR1レセプターに対するアンタゴニストを用いて、自己免疫疾患（例えば、対 宿主性移植片反応、および同種移植拒絶、およびＴ細胞媒介自己免疫疾患）を処 置し得る。Ｔ細胞増殖は２型TNFレセプターを介して刺激されることが示されて いる。従って、レセプターを拮抗することは、Ｔ細胞の増殖を妨げ、そしてＴ細 胞媒介自己免疫疾患を処置し得る。 また、アンタゴニストを使用して、ウイルス感染、慢性関節リウマチ、全身性 エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、および移植片拒絶のような疾患の 基礎であるアポトーシスを妨げ得る。同様に、アンタゴニストを用いて細胞傷害 性を妨げ得る。 また、TR1レセプターに対するアンタゴニストを用いて、TR1によって刺激され るＢ細胞ガンを処置し得る。 また、TR1レセプターに対するアンタゴニストを用いて、臨界臨床状態のまま である敗血症性ショックを処置および／または予防し得る。敗血症性ショックは 、病原体から直接的にではなく、TNFおよびIL-1のようなタンパク質因子によっ て媒介される悪化した宿主応答から生じる。例えば、リポポリサッカライドは、 その血清濃度の強力かつ一過性の増加を導くTNFの遊離を誘発することが示され ている。TNFは、過剰な量で投与される場合、ショックおよび組織傷害を引き起 こす。従って、TR1レセプターに対するアンタゴニストは、TNFの作用をブロック し、 そして敗血症性ショックを処置／予防すると考えられる。また、これらのアンタ ゴニストを用いて、TNFの高血清レベルと相関する小児における髄膜炎菌血症を 処置し得る。 TR1レセプターに対するアンタゴニストによって処置され得る他の障害のうち 、TNFレセプターリガンドによって媒介される炎症、ならびに細菌感染性悪液質 および大脳マラリアが含まれる。また、TR1レセプターアンタゴニストを用いて 、TNFのようなレセプターに対するリガンドによって媒介される炎症を処置し得 る。さらに、TR1レセプターはまた、TNF-βが、リンパ球の発生に関連するとい う点で、AIDSについての処置を提供するために有用であり得る。 治療薬：投与様式 可溶性TR1レセプターならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、適切な薬 学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療的有効量 の可溶性レセプターまたはアゴニストもしくはアンタゴニスト、および薬学的に 受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアは、生理食塩水、 緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそ れらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。処方物は、投与様式に適合 すべきである。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で充填された１つ以上 の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器と共に、医 薬品もしくは生物製品の製造、使用または販売を統括する政府機関により規定さ れた形式の注意書きが含まれ得、この注意書きは、ヒト投与についての製造、使 用、または販売の機関による認可を反映している。さらに、本発明のレセプター ならびにアゴニストおよびアンタゴニストの可溶形態がまた、他の治療化合物と 共に用いられ得る。 薬学的組成物は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋内、皮下、鼻内、または皮 内経路のような都合の良い様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の適応症 の処置および／または予防に有効な量で投与される。一般に、これらは、少なく とも約10μg/kg体重の量で投与され、そしてほとんどの場合、１日当たり約８mg /Kg体重を超過しない量で投与される。ほとんどの場合、投与量は、投与経路、 症状などを考慮して、日に約10μg/kgから約１mg/kg体重である。 TR1レセプターポリペプチドはまた、持続放出システムにより適切に投与され る。持続放出組成物の適切な例は、成形物品の形態（例えば、フィルムまたはマ イクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリック スは、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP58,481）、L-グルタミン酸お よびγ-エチル-L-グルタミン酸のコポリマー（Sidmanら、Biopolymers 22:547-5 56(1983)）、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）（Langerら、J．Biome d．Mater．Res．15:167-277(1981)およびLanger、Chem．Tech．12:98-105(1982) ）、エチレンビニルアセテート（Langerら、同書）またはポリ-D-(-)-3-ヒドロ キシ酪酸（EP 133,988）を含む。持続放出TR1レセプターポリペプチド組成物は また、リポソームで捕捉されたTR1レセプターポリペプチドを含む。TR1レセプタ ーポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体既知の方法によって調製され る：DE 3,218,121；Epsteinら、Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）82:3688-3692( 1985);Hwangら、Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）77:4030-4034(1980)；EP 50,3 22；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,161；日本特許出願83-118008 ；米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号；ならびにEP 102,324。通常、 リポソームは、小さな（約200〜800オングストローム）単層タイプのものであり 、脂質含量は約30mol％コレステロールより多く、選択された割合は、至適なTR1 レセプターポリペプチド療法のために調整される。 非経口投与について、１つの実施態様では、TR1レセプターポリペプチドが、 単位投与量注射可能形態（溶液、懸濁液、または乳濁液）で、これを所望の純度 で薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、用いられる投与量および濃度でレシ ピエントに非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）と混合 することにより一般的に処方される。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤お よびポリペプチドに対して有害であると知られる他の化合物を含まない。 一般に、処方物は、TR1レセプターポリペプチドを均一かつ密に液体キャリア もしくは微細分割された固体キャリアまたは両方と接触させることにより調製さ れる。次いで、必要ならば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キ ャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくは、レシピエントの血液と等張 性の溶液である。このようなキャリアビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲ ル溶液、およびデキストロース溶液を含む。非水性ビヒクル（例えば、固定油お よびオレイン酸エチル）もまた、リポソームと同様に、本明細書中で有用である 。 キャリアは、微量の添加剤（例えば、等張性および化学的安定性を増強する物 質）を含有する。用いた投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン 酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩；酸化防止 剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド（例え ば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミ ン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニル ピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、 またはアルギニン）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（セルロースおよび その誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート 剤（例えば、EDTA）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール ）；対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性界面活性 剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー(poloxamer)、またはPEG）またはを 包含する。 TR1レセプターポリペプチドは、代表的には、約0.1mg/ml〜100mg/ml、好まし くは、１〜10mg/mlの濃度で、約３〜８のpHで、このようなビヒクル中に処方さ れる。前出の特定の賦形剤、キャリア、または安定剤の使用が、TR1レセプター ポリペプチド塩の形成を生じることが理解される。 治療投与のために用いられるTR1レセプターポリペプチドは、無菌でなければ ならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、0.2ミクロン膜）による濾過によっ て容易に達成される。治療TR1レセプターポリペプチド組成物は、一般に、無菌 アクセス口を有する容器、例えば、皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有 する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に置かれる。 TR1レセプターポリペプチドは、通常、単位または多数回投与容器、例えば、 密封アンプルまたはバイアル中で、水性溶液または再構成用凍結乾燥処方物とし て貯蔵される。凍結乾燥処方物の一例として、10mlバイアルを5mlの滅菌濾過し た１％(w/w)水性TR1レセプターポリペプチド溶液で満たし、そして得られた混合 物を凍結乾燥する。注入溶液を、静菌性注射用水(Water-For-Injection)を用い て凍結乾燥TR1レセプターポリペプチドを再構成することにより調製する。 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で充填された１つ以上 の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器と共に、医 薬品もしくは生物製品の製造、使用または販売を統括する政府機関により規定さ れた形式の注意書きが含まれ得、この注意書きは、ヒト投与についての製造、使 用、または販売の機関による認可を反映している。さらに、本発明のポリペプチ ドは、他の治療化合物と共に用いられ得る。 TR1レセプターならびにアゴニストおよびアンタゴニスト（これらはポリペプ チドである）はまた、インビボでのこのようなポリペプチドの発現（しばしば、 「遺伝子治療」と称される）によって本発明に従って用いられ得る。 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで、ポリペプチドをコードす るポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）を用いて操作され得、操作された細胞とも に、次いで、処置される患者にポリペプチドを提供される。このような方法は、 当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRN Aを含有するレトロウイルス粒子の使用により当該分野で公知の手順により操作 され得る。 同様に、細胞は、例えば、当該分野で公知の手順によって、インビボでのポリ ペプチドの発現のためにインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本 発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生する ためのプロデューサー細胞は、インビボでの細胞の操作およびインビボでのポリ ペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポ リペプチドを投与するためのこれらおよび他の方法は、本発明の教示から、当業 者に明らかなはずである。例えば、細胞の操作のための発現ビヒクルは、レトロ ウイルス以外（例えば、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後インビボでの細胞 の操作のために用いられ得るアデノウイルス）であり得る。 本明細書中上述のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイ ルスは、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス （例えば、ラウス肉腫ウイルス）、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス 、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増 殖性肉腫ウイルス（Myeloproliferative Sarcoma Virus）、および乳癌ウイルス を含むが、これらに限定されない。１つの実施態様では、レトロウイルスプラス ミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス由来である。 ベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。用いられ得る適切なプロモータ ーは、レトロウイルスLTR；SV40プロモーター；Millerら、Biotechniques，7(9) :980-990(1989)に記載のヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、また は任意の他のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーターのような細胞プ ロモーター（ヒストン、pol III、およびβ-アクチンプロモーターを含むがこれ らに限定されない）。用いられ得る他のウイルスプロモーターは、アデノウイル スプロモーター、チミジンキナーセ（TK）プロモーター、およびB19パルボウイ ルスプロモーターを含むがこれらに限定されない。適切なプロモーターの選択は 、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。 本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下 にある。用いられ得る適切なプロモーターは、アデノウイルスプロモーター（例 えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例え ば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター；RSウイルス（RSV）プロモーター ；誘導可能プロモーター（例えば、MMTプロモーター、メタロチオネインプロモ ーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモー ター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例 えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスLTR（本 明細書中上記の改変レトロウイルスLTRを含む）；β-アクチンプロモーター；お よびヒト成長ホルモンプロモーターを含むが、これらに限定されない。プロモー ターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御するネイティブなプロモー ターであり得る。 レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して プロデューサー細胞株を形成するために用いられ得る。トランスフェクトされ得 るパッケージング細胞株の例は、PE501、PA317、Ψ-2、Ψ-AM、PA12、T19-14X、 VT-19-17-H2、ΨCRE、ΨCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、およびDAN細胞株を含むが 、これらに限定されない（Miller、Human Gene Therapy 1:5-14(1990)に記載、 この文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。ベクターは、当 該分野に公知の任意の手段によって、パッケージング細胞を形質導入し得る。こ のような手段は、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO4沈 澱を含むが、これらに限定されない。１つの代替法では、レトロウイルスプラス ミドベクターは、リポソーム中にカプセル化され得るか、または脂質に結合され 得、次いで宿主に投与され得る。 プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レ トロウイルスベクター粒子を生成する。次いで、このようなレトロウイルスベク ター粒子は、インビボまたはインビトロのいずれかで真核生物細胞を形質導入す るために用いられ得る。形質導入真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核 酸配列を発現する。形質導入され得る真核生物細胞は、胚幹細胞、胚癌細胞、な らびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞 、および気管支上皮細胞を含むが、これらに限定されない。 染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定に有用である。配列は、特異的に標的化され 、そして個々のヒト染色体における特定の位置とハイブリダイズし得る。さらに 、現在、染色体において特定の部位を同定する必要性がある。現時点では、実際 の配列データ（反復多型）に基づく染色体マーカー試薬のほとんどが、染色体位 置をマーカーづけするために利用可能ではない。本発明による染色体へのDNAの マッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づけることにおけ る重要な第一歩である。 簡潔にいえば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは、15〜25bp）を 調製することにより、染色体にマッピングされ得る。3'非翻訳領域のコンピュー ター分析が、ゲノムDNAにおいて１つを超えるエキソンにまたがらず、従って、 増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために用いられる。次 いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッド のPCRスクリーニングのために用いられる。プライマーに対応するヒト遺伝子を 含有するこれらのハイブリッドのみが、増幅フラグメントを生じる。 体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定のDNAを特定の染色体に割り当て るための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に本発明を 用いて、より細かな位置決め（sublocation）は、類似の様式で、特定の染色体 由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールによって達成 され得る。その染色体にマップするために同様に用いられ得る他のマッピングス トラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別染色体 での予備スクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するため のハイブリダイゼーションによる予備選択を含む。 cDNAクローンの中期染色体拡散への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション （FISH）は、一工程で、正確な染色体位置を提供するために用いられ得る。この 技術は、50または60塩基程度の短さのcDNAと共に用いられ得る。この技術の概説 については、Vermaら、Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques，Per gamon Press，New York(1988)を参照のこと。 例えば、本発明者らは、ネイティブTR1遺伝子を染色体領域8q23-24.1でマップ した。 一旦、配列が正確な染色体位置にマップされると、染色体における配列の物理 的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例 えば、V．McKusick，Mendelian Inheritence in Man（Johns Hopkins Universit y Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である）に見出され得る。 次いで、同じ染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との間の関連が、連鎖分析 （物理学的に隣接した遺伝子の共遺伝）によって同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間でのcDNAまたはゲノム配列における差異を 決定することが必要である。変異が罹患個体のいくらかまたは全部において見ら れるが、いずれの正常個体でも見られない場合、変異は、疾患の原因因子のよう である。 物理的マッピングおよび遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、疾患と関 連した染色体領域に正確に局在したcDNAは、50〜500の間の潜在的原因遺伝子の １つであり得る。（これは、１メガ塩基マッピング解像度および20kb当たり１遺 伝子であると仮定している。） 本発明は、以下の実施例に関してさらに記載される。しかし本発明はこのよう な実施例に制限されないことが理解されるべきである。全ての部または量は、他 に特定されない限り、重量基準である。 以下の実施例の理解を容易にするために、特定の頻繁に登場する方法および／ または用語を記載する。 「プラスミド」は、先行する小文字ｐおよび／または後の大文字および／また は数字で称される。本明細書中の出発プラスミドは、市販されているか、規制な しに公に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミ ドから構築され得る。さらに、記載されるものと等価なプラスミドは、当該分野 で公知であり、そして当業者に明らかである。 DNAの「消化」は、DNAにおける特定の配列のみに作用する制限酵素でのDNAの 触媒切断をいう。本明細書中で用いられる種々の制限酵素は、市販されており、 そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は、当業者に公知である ように用いた。分析目的のためには、代表的には、１μgのプラスミドまたはDNA フラグメントを、約20μlの緩衝溶液中約２単位の酵素と共に用いる。プラスミ ド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的には、代表的には、より大きな 容積中５〜50μgのDNAを20〜250単位の酵素で消化する。特定の制限酵素のため の適切な緩衝液および基質量は、製造者によって特定される。約１時間37℃での インキュベーション時間が通常用いられるが、供給者の指示に従って種々であり 得る。消化後、反応物を、所望のフラグメントを単離するために、ポリアクリル アミドゲル上に直接電気泳動する。 切断されたフラグメントのサイズ分離は、Goeddelら、Nucleic Acids Res.,8: 4057(1980)により記載の８％ポリアクリルアミドゲルを用いて実施する。 「オリゴヌクレオチド」は、一本の標準的なポリデオキシヌクレオチド鎖また は二つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいう。これらは、化 学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、5'リン酸を有さず 、従って、キナーゼの存在下でホスフェートをATPに添加しなければ、別のオリ ゴ ヌクレオチドとは連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されてい ないフラグメントに連結する。 「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形 成するプロセスをいう。他に提供されなければ、連結は、連結され得るDNAフラ グメントのほぼ等量である、0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ 」）と、公知の緩衝液および条件を用いて達成され得る。 他に示されない限り、形質転換は、GrahamおよびVan der，Virology，52:456- 457(1973)の方法に記載のように実施した。 実施例１ TR1レセプターの細菌性発現および精製 TR1レセプターをコードするDNA配列、ATCC寄託番号第75899号を、プロセシン グされたTR1レセプター核酸配列（シグナルペプチド配列を減ずる）の5’および 3’末端配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて最初に増幅し た。末端TR1レセプター遺伝子に対応するさらなるヌクレオチドを、それぞれ5' および3'の配列に付加した。5'オリゴヌクレオチドプライマーは、5’GCCAGAGGA TCCGAAACGTTTCCTCCAAAGTAC 3'（配列番号６）の配列を有し、そしてBamHI制限酵 素部位（太字）を含む。3'配列5’CGGCTTCTAGAATTACCTATCATTTCTAAAAAT 3'（配 列番号７）は、HindIII部位（太字）に対して相補的な配列を含み、そしてTR1レ セプターの18ヌクレオチドが続く（図2）。制限酵素部位は、細菌性発現ベクタ ーpQE-9（Qiagen Inc．Chatsworth，CA）の制限酵素部位に対応する。pQE-9は、 抗生物質耐性（Ampr）、細菌複製起点（ori）、IPTG調節可能プロモーターオペ レーター（P/O）、リボゾーム結合部位（RBS）、6-Hisタグ、および制限酵素部 位をコードする。次いで、pQE-9を、BamHIおよびXbaIで消化する。増幅した配列 をpQE-9に連結し、そしてヒスチジンタグおよびRBSをコードする配列にインフレ ームに挿入する。次いで、連結混合物を使用して、Sambrookら、Molecular Clon ing:A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，（1989）に記載さ れる手順によりE.coli株M15/rep4（Qiagen，Inc.）を形質転換する。M15/rep4は 、複数コピー数のプラスミドpREP4をふくみ、これは、lacIリプレッサーを 発現し、そしてまた、カナマイシン耐性（Kanr）を付与する。形質転換体を、LB プレート上で増殖するそれらの能力により同定し、そしてアンピシリン／カナマ イシン耐性コロニーを選択する。プラスミドDNAを単離して、そして制限分析に より確認する。所望の構築物を含むクローンを一晩（O/N）、Amp（100μg/ml） およびKan（25μg/ml）の両方を補充したLB培地中の液体培養で増殖させる。O/N 培養物を用いて1:100〜1:250の比率で大規模培養に接種する。細胞を、0.4と0.6 との間の600nmでの吸光度（「O.D.600」）にまで増殖させる。次いで、IPTG（イ ソプロピル-B-D-チオガラクトピラノシド）を加えて1mMの最終濃度にする。IPTG は、lacIリプレッサーを不活性化することにより、P/Oを解除することを誘導し 、遺伝子発現の増加を導く。細胞をさらに3〜4時間インキュベートした。次いで 、細胞を、遠心分離により採集する。細胞ペレットをカオトロピック剤である６ モル濃度グアニジンHCl中で可溶化する。明澄化後、溶解されたTR1レセプターを ニッケルキレートカラム上のクロマトグラフィーにより、6-Hisタグを含むタン パク質による強固な結合を可能にする条件下で、この溶液から精製する（Hochul iら、J.Chromatography 411:177-184(1984)）。TR1レセプター（90％純粋）を6 モル濃度グアニジンHCl pH5.0中のカラムから溶出し、そして再生の目的のため3 モル濃度グアニジンHCl,100mMリン酸ナトリウム、10mMグルタチオン（還元）お よび２mMグルタチオン（酸化）に調整する。この溶液中での12時間のインキュベ ーション後、タンパク質を10ミリモル濃度のリン酸ナトリウムに透析する。 実施例２ バキュロウイルス発現系を用いたネイティブおよびカルボキシ末端改変TR1レセ プターのクローニングおよび発現 全長ネイティブTR1レセプタータンパク質をコードするDNA配列、ATCC受託番号 第75899号を、この遺伝子の5'配列および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチ ドプライマーを用いて増幅する：5'プライマーは、配列5’cgc GGA TCC gccatc ATGAACAAGTTGCTGTG 3'（配列番号８）を有し、これは、BamHI制限部位、続いて 図1における配列をコードするネイティブTR1レセプターの配列の最初の17塩基対 を含む。 3'プライマーは、配列5’cgc GGT ACC CAATTGTGAGGAAACAG 3'（配列番号９） を有し、これは、Asp718制限部位、続いて逆の向きに、図1における1270〜1286 に相補的な配列を含む。 カルボキシ末端改変TRレセプターについて、5'プライマーは、配列5'GCGCGGAT CCATGAACAAGTTGCTGTGCTGC 3'（配列番号10）を有し、これは、BamHI制限酵素部 位（太字）を含み、そしてこの部位は図２に示される改変TR1レセプター遺伝子 （翻訳開始コドン「ATG」に下線を付す）の最初の21ヌクレオチドの直前である 。 3’プライマーは、配列5'GCGCTCTAGATTACCTATCATTTCTAAAAATAAC 3'（配列番号 11）を有し、そして制限エンドヌクレアーゼXbaIの切断部位および図２に示され る改変TR1レセプター遣伝子の3’配列に相補的な21ヌクレオチドを含む。 増幅された改変TR1レセプター配列を、市販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、1％アガロースゲルより単離した。次いで、こ のフラグメントをエンドエンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIで消化し、次いで1 ％アガロースゲルで再び精製した。このフラグメントを、F2と命名する。 ベクターpRG1(pVL941ベクターの改変体、以下に記載)を、TR1レセプタータン パク質のバキュロウイルス発現系を用いる発現のために、用いた（概説について は、SummersおよびSmith、A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletln No．1555（1987）を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa Californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター 、それに続く制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIの認識部位を含む。シミ アンウイルス40（SV40）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のた めに用いた。組換えウイルスの容易な選択のために、E.coli由来のβガラクトシ ダーゼ遺伝子をポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続くポリヘドリ ンプロモーターと同方向に挿入した。ポリヘドリン配列を、同時トランスフェク トした野生型ウイルスDNAとの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配列を両 端に隣接させた。多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、pAc373、pVL9 41、およびpAcIM1）が、pRG1の代わりに用いられ得る（LuckowおよびSummers、V irol ogy，170.31-39）。 プラスミドを制限酵素BamHIおよびXbaIで消化した。次いで、市販のキット(「 Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca）を用いてDNAを1％アガロースゲルか ら単離した。このベクターDNAを、V2と命名する。 フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4 DNAリガーゼで連結した 。次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、そして酵素BamHIおよびXbaIを用い てTR1レセプター遺伝子を有するプラスミド（pBac TR1レセプター）を含む細胞 を同定した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。 5μgのプラスミドpBacTR1レセプターを、リポフェタション法（FelgnerらProc ．Natl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の直線 状化バキュロウイルス（「BaculoGoldTMbaculovirus DNA」，Pharmingen,San Di ego，CA.）とともに同時トランスフェクトした。 1μgのBaculoGoldTMウイルスDNAおよび5μgのプラスミドpBacTR1レセプターを 、50μlの無血清グレース培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD） を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合した。その後、10μlの リポフェクチンおよび90μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて1 5分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、無血 清グレース培地1mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ ATCC CRL 1711）に滴下した。プレートを、新たに添加した溶液を混合するため に、前後に振盪した。次いで、プレートを、27℃で5時間インキュベートした。5 時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児 血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加した。プレートをインキュベータ ーに戻し、そして27℃で4日間培養を続けた。 4日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様 にプラークアッセイを行った。改変として、青色染色されたプラークの容易な同 定を可能にするために、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg ，MD）を有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な説明 はまた、Life Technologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養お よびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る ）。 系列希釈の4日後、ウイルスを細胞に添加し、そして青色染色されたプラーク をエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒 天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフチューブ中に再懸濁した。寒 天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上 清を用いて、35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させ、4日後、これらの 培養ディッシュの上清を回収し、次いでそれらを4℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したグレース培地中で増殖させた。細胞を 、２の感染多重度（「MOI」）で組換えバキュロウイルスV-TR1レセプターで感染 させた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除 いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42 時間後、5μCiの35Ｓ-メチオニンおよび5μCiの35Ｓ-システイン（Amersham）を 添加した。細胞をさらに16時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により 収集し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィー により可視化した。 実施例３ 哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現 哺乳動物細胞における、TR1レセプタータンパク質遺伝子配列の一過的発現に 使用されるベクターのほとんどは、SV40複製起点を有するべきである。このこと は、ウイルスDNA合成の開始に必要なＴ抗原を発現する細胞（例えば、COS細胞） において、高コピー数のベクターの複製を可能にする。任意の他の哺乳動物細胞 株もまた、この目的に利用され得る。 代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（mRNAの転写の開 始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物のポ リアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エンハン サー、Kozak配列、ならびにRNAスプライシングのためのドナー部位およびアクセ プター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写を、SV40由来 の初期および後期プロモーター、レトロウイルス由来の長末端反復（LTR）（例 えば、RSV、HTLVI、HIVI）ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プロモ ーターで達成し得る。しかし、細胞シグナルもまた使用され得る（例えば、ヒト アクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適切な発現ベクターとし ては、例えば、pSVLおよびpMSG（Pharmacia，Uppsala，Sweden）、pRSVcat（ATC C 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、ならびにpBC12MI（ATCC 67109）のような ベクターが挙げられる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトHela、28 3、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1、 アフリカミドリザル細胞、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、ならびにチャイニー ズハムスター卵巣細胞が挙げられる。 あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株に おいて発現され得る。選択マーカー（例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイ グロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクト細胞の同定 および単離を可能にする。 トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて大量のコードされるタンパ ク質を発現し得る。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）は、目的の遺伝子の数百 または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用なマーカーである。別 の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（GS）である（Murphyら、 Biochem J．227:277-279(1991)；Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(19 92)）。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖さ せ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組 み込まれる増幅遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞は、タ ンパク質の産生にしばしば使用される。 発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（LT R）（Cullenら、Molecular and Cellular Biology，438-447（1985年３月））お よびCMV-エンハンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530（1985）） を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、お よびAsp718を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクター はさらに、ラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロン、ポリアデニル化 、および終結シグナルを含む。 実施例３（a） COS細胞における組換えネイティブTR1レセプターの発現 発現プラスミドTR1レセプターHAは、以下を含むベクターpcDNAIAmp(Invitroge n)に由来する：1）SV40複製起点、2）アンピシリン耐性遺伝子、3）E.coli複製 起点、4）CMVプロモーター、続いてポリリンカー領域、SV40イントロンおよびポ リアデニル化部位。TR1レセプター前駆体の全体およびその3’末端にインフレー ムに融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカ ー領域にクローン化し、したがって組換えタンパク質発現は、CMVプロモーター の発現制御下で指向される。HAタグは、以前に記載されるように（Wilsonら、Ce ll 37:767(1984)）インフルエンザ血液凝集素タンパク質に由来するエピトープ に対応する。標的タンパク質へのHAタグの融合体は、HAエピトープを認識する抗 体を用いて組み換えタンパク質の容易な検出および回収を可能にする。 ネイティブTR1レセプター（図１）について、プラスミド構築ストラテジーは 以下のように記載される： ネイティブTR1レセプターをコードするDNA配列、ATCC受託番号第75899号を、 以下の２つのプライマーを用いるPCRによって構築する：5'プライマーは、配列5 'cgc GGA TCC gccatc ATGAACAAGTTGCTGTG 3'（配列番号12）を有し、そしてBamH I制限部位、続いて図１のネイティブTR1レセプターコード配列の最初の17塩基対 を含む。 3'プライマーは、配列5’cgc GGT ACC CAATTGTGAGGAAACAG 3'（配列番号13） を有し、そしてAsp718制限部位および逆向きの方向に、図１におけるヌクレオチ ド1270〜1286に相補的な配列を含む。 それゆえ、PCR産物は、BamHI部位、TR1レセプターコード配列、続いてインフ レームに融合されたHAタグ、HAタグに隣接する翻訳終結終止コドン、およびAsp7 18部位を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNAI/Ampを、BamHIお よびAsp718制限酵素で消化し、次いで連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(S tratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)へ形質転換し、そして形質転換培養 物を、アンピシリン培地プレートへプレーティングし、耐性コロニーを選択する 。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正確なフラグメントの存在に つ いて制限分析により試験する。組換えTR1レセプターの発現のために、COS細胞を 、DEAE-DEXTRAN法（J．Sambrook、E．Fritsch，T.Maniatis，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)）により発現ベ クターを用いてトランスフェクトする。TR1レセプターHAタンパク質の発現を、 放射標識化および免疫沈降法（HarlowおよびLane，Antibodies:A Laboratory Ma nual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988)）によって検出する。ト ランスフェクション２日後に、細胞を、35S-システインで８時間標識する。次い で、培養培地を回収し、そして細胞を、界面活性剤（RIPA緩衝液（150mM NaCl、 0.1％SDS、１％NP-40、0.5％DOC、50mM TR1S、pH7.5））（Wilsonら、前出）で 溶解する。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体で 沈降させる。沈降されたタンパク質を15％SDS-PAGEゲルで分析する。 実施例３(b) CHO細胞におけるネイティブレセプターのクローニングおよび発現 ベクターpC1を、ネイティブTR1レセプタータンパク質の発現のために使用する 。プラスミドpC1は、プラスミドpSV2-dhfr[ATCC受託番号37146]の誘導体である 。 この両プラスミドは、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含 む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如する チャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサー トを補充した選択培地（αマイナスMEM、Life Technologies）中で細胞を増殖さ せることによって選択され得る。メトトレキサート（MTX）に耐性である細胞に おけるDHFR遺伝子の増幅は、よく考証されている。（例えば、Alt，F.W.，Kelle ms，R.M.，Bertino，J.R.およびSchimke，R.T.，1978，J．Biol．Chem．253:135 7-1370、Hamlin，J.L.およびMa，C.1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:10 7-143、Page，M.J.およびSydenham，M.A.，Biotechnology 9:64-68（1991）を参 照のこと）。漸増濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果とし て、標的酵素DHFRを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第二の遺 伝子がDHFR遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現され る。遺伝子の1,000を越えるコピーを有する細胞株を開発することは最先端技術 である。続いて、メトトレキサートが取り除かれる場合、細胞株は、染色体に組 み込まれる増幅遺伝子を含む。 プラスミドpC1は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Culle nら、Molecular and Cellular Biology，1985年３月：438-4470）の長末端反復 （LTR）の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（CMV）（Bosh artら、Cell 41:521-530,1985）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離された フラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを可能にするBa mHI、PvuIIおよびNruIの単一の制限酵素切断部位である。これらのクローニング 部位の後ろに、プラスミドは、３つ全てのリーディングフレーム中の翻訳終止コ ドン、続いてラットプレプロインシュリン遺伝子の3'イントロンおよびポリアデ ニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のために使用され得る （例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、 または他のレトロウイルス（例えば、HIVおよびHTLVI）からの長末端反復）。mR NAのポリアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたは グロビン遺伝子由来）も同様に使用され得る。 染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する安定な細胞株もまた、選択マーカ ー（例えば、gpt、G418、またはハイグロマイシン）での同時トランスフェクト に基づいて選択され得る。開始における２つ以上の選択マーカー（例えば、G418 およびメトトレキサート）を使用することが有用である。 プラスミドpC1を制限酵素BamHIで消化し、次いでウシ腸ホスファターゼ(phosp hate)を用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベク ターを、１％アガロースゲルから単離する。 ネイティブTR1レセプターをコードするDNA配列、ATCC75899を、以下の遺伝子 の5'および3'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅す る： 5'プライマーは、配列5'cgc GGA TCC gccatc ATGAACAAGTTGCTGTG 3'（配列番 号14）を有し、そしてBamHI制限部位、続いて図１のネイティブTR1レセプターコ ード配列の最初の17塩基を含む。 3'プライマーは、配列5'cgc GGT ACC CAATTGTGAGGAAACAG 3'（配列番号15）を 有し、そしてAsp718制限部位、および逆方向に、図１のヌクレオチド1270〜1286 に相補的な配列を含む。 以下に記載する発現ベクターに挿入されている、ヒトTR1レセプターをコード する増幅フラグメントの5'末端は、効率的なシグナルペプチドを提供する。真核 生物細胞における効率的な翻訳開始シグナル（Kozak,Mol.Biol.196:947-950（19 87）に記載される）を、構築物のベクター部分に適切に配置する。 増幅させたフラグメントを、上記のように１％アガロースゲルから単離し、次 いでエンドヌクレアーゼBamHIおよびAsp718で消化し、次いで１％アガロースゲ ルで再び精製する。 次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターをT4 DNAリガーゼで 連結する。次いで、E.coli HB101細胞を形質転換し、そして制限酵素BamHIを用 いて正しい配向に挿入されたプラスミドpC1を含む細菌を同定する。挿入した遺 伝子の配列を、DNA配列決定によって確認する。 CHO-DHFR細胞のトランスフェクション 活性なDHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェ クションのために使用する。５μgの発現プラスミドC1を、リポフェクチング方 法（Felgnerら、前出）を用いて、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トラ ンスフェクトする。プラスミドpSV2-neoは優性選択マーカー（G418を含む一群の 抗生物質への耐性を与える酵素をコードするTn5由来の遺伝子neo）を含む。細胞 を、１mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。２日後、細胞をトリプ シン処理し、ハイブリドーマクローニングプレート（Greiner，Germany）に播種 し、そして10〜14日培養する。この期間の後、単一のクローンをトリプシン処理 し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（25nM、50nM、100nM、200nM、400nM ）を用いて、６ウェルペトリ皿に播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサー トで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（500nM、１μM、２ μM、５μM）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を、クローンが10 0μMの濃度で増殖するまで繰り返す。 所望の遺伝子産物の発現を、ウエスタンブロット分析およびSDS-PAGEによって 分析する。 実施例４ 可溶性ネイティブTR1レセプターの精製 ネイティブTR1レセプターのアミノ酸配列の分析により、比較的高い理論的pI が示される。クロマトグラフィー手順を、pH7.0での（このpHでは他のタンパク 質のほとんどがカラムに結合しない）陽イオン交換カラム（poros 50HS）へのこ のタンパク質を捕捉するこの特徴に基づき開発する。この単一ステップ精製によ り、組換えバキュロウイルスで感染させたSf-9細胞上清から80〜90％純粋なタン パク質を得る。精製タンパク質をＮ末端アミノ酸配列分析によりTNFレセプター 相同体であることを確認した。TR1レセプターは、さらに、ヘパリン結合クロマ トグラフィーを通して＞95％純度にまで精製し得る。 17mgの精製可溶性TR1レセプターを、２リットルのバキュロウイルス上清から 調製した。2mgのタンパク質を抗体産生に使用した。図５〜８を参照のこと。 実施例５ 遺伝子治療を介する発現 線維芽細胞を被験体から皮膚生検により得る。得られる組織を組織培養培地に 配置し、そして小片に分離する。組織の小さな塊を組織培養フラスコの湿潤面に 配置し、およそ10片を各フラスコに配置する。フラスコを上下反転させ、きつく 閉め、そして室温で一晩放置する。室温で24時間後、フラスコを反転させ、そし て組織の塊をフラスコの底部に固定させたままにし、そして新鮮な培地（例えば 、10％FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するHam's F12培地）を 添加する。次いで、これを37℃でおよそ一週間インキュベートする。この時に、 新鮮な培地を加え、続いて数日毎に交換する。培養のさらに２週間後、単層の線 維芽細胞が出現する。単層は、トリプシン処理して、そしてより大きなフラスコ へと大型化するする。 Moloneyマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接するpMV-7(Kirschmeierら、DN A、7:219-25(1988))を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、続いてウシ腸ホスファ ターゼで処理した。直線状ベクターをアガロースゲル上で分画し、そしてガラス ビーズを用いて精製する。 本発明のポリペプチドをコードするcDNAは、それぞれ5'末端配列および3'末端 配列に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。5'プライマーはEcoRI部位を含 み、そして3'プライマーは、さらにHindIII部位を含む。等量のMoloneyマウス肉 腫ウイルス直線状骨格ならびに増幅されたEcoRIおよびHindIIIフラグメントを、 T4 DNAリガーゼの存在下で合わせる。得られた混合物を２つのフラグメントの連 結に適切な条件で維持する。連結混合物を使用して、E.coli株HB101を形質転換 し、次いで、これを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを 確認する目的のためにカナマイシンを含む寒天上にプレートした。 両指向性pA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10％ウシ血清（CS）、ペ ニシリン、およびストレプトマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地（DM EM）中での組織培養でコンフルエント密度にまで増殖させる。次いで、遺伝子を 含むMSVベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターで形質 導入する。パッケージング細胞は、ここで遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産 生する（パッケージング細胞をここで産生細胞と称する）。 新鮮な培地を形質導入された産生細胞に添加し、続いて培地を10cmプレートの コンフルエント産生細胞から採集する。感染性ウイルス粒子を含む使用した培地 を、ミリポアフィルターを通して濾過して剥離した産生細胞を除去し、次いでこ の培地を線維芽細胞を感染させるために使用する。培地を、サブコンフルエント の線維芽細胞のプレートから除去し、そして産生細胞からの培地と素早く置換す る。この培地を除去し、そして新鮮な培地と置換する。ウイルス力価が高い場合 、実質的にすべての線維芽細胞が感染されており、そして選択は必要とされない 。力価が非常に低い場合、選択可能なマーカー（例えば、neoまたはhis）を有す るレトロウイルスベクターを使用することが必要である。 次いで、操作された線維芽細胞を、単独でまたはcytodex3マイクロキャリアビ ーズ上でコンフルエンスに増殖させた後のいずれかで宿主に注入する。線維芽細 胞は、ここでタンパク質産物を産生する。本発明の多数の改変および変種が、上 記の教示に照らして可能であり、それゆえ、添付の請求の範囲内で、本発明は、 特定に記載されるのとは異なる方法で実施され得る。 実施例６ TR1レセプター活性についての骨形成原細胞増殖アッセイ TR1レセプター機能の候補アゴニストおよび候補アンタゴニストの増殖効果に ついてのアッセイを、造骨細胞細胞株HG63を用いて以下のように実施した：精製 ネイティブTR1レセプタータンパク質の1000ng/mlから出発する２倍毎の系列希釈 を、0.5〜10％FBSを有するRPMIl640培地中に作製した。接着標的細胞をコンフル エント培養物からPBS中のトリプシン処理により調製し、そして非接着標的細胞 を定常培養物から採集し、そして一度新鮮な培地で洗浄した。標的細胞を１×105 細胞/mlで0.5％FBSを含む培地中に懸濁し、そして0.1mlのアリコートを0.1mlの 系列希釈した試験サンプルを含む96ウェルの平底マイクロタイタープレートに分 配した。インキュベーションを70時間継続した。活性をMTS（3(4,5-ジメチル-チ アゾイル-2-イル)5(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-（4-スルホフェニル）-2 H-テトラゾリウム)）アッセイまたは細胞数および／または活性についての任意 の他のアッセイを用いて定量した。MTSアッセイを、20μlのMTSおよびフェナジ ンメトスルフェート（PMS）溶液の96ウェルプレートへの添加により実施した（ ストック溶液をPromega Technical Bulletin No.169により記載されるように調 製した）。３時間のインキュベーションの間、生存細胞がMTSを水溶性のホルマ ザン産物へと転換させる。培地のみを有するウェル（細胞なし）を残りのウェル と正確に同じ様式で処理し、そしてブランクコントロールのために使用した。培 地および細胞を有するウェルをベースラインコントロールとして使用した。490n mでの吸収は、ELISA読み取り器を用いて記録し、そしてウェル中の生存細胞数に 比例する。ベースラインコントロールウェル（3つのベースラインコントロール ウェル間の偏差は５％未満である）と比較したパーセントとして、式：実験O.D. ／O.D.ベースラインコントロール×100-100により各サンプル濃度について計算 された、細胞増殖（正のパーセント）または阻害（負のパーセント）。すべての 決定を３連で行った。平均およびSDはMicrosoft Excelにより計算した。 実施例７ ノーザンブロット分析 ノーザンブロット分析を行って、ヒト組織におけるTR1レセプターを遺伝子の 発現レベルを試験した。図１に示す配列を含むcDNAプローブを、Amersham Life ScienceからのrediprimeTMDNA標識系を用いて、製造業者の説明書に従って、32P で標識した。取り込まれなかったヌクレオチドを標識プローブから、CHROMA SPI N-100（Clontech）を用いて、除去した。種々のヒト組織からのレーンあたりお よそ２mgのポリ（A）＋RNAを含む２種の多組織ノーザン（MTN）ブロット（一方 をヒト組織についてＨとして表記し、他方をヒト免疫系についてH2として表記し た）をClontechから購入した。異なる細胞株由来の20ngの総RNAを含む２つのCel llineブロットもまた使用した。ノーザンブロッティングを、ClontechからのExp resshyb Hybridization Solution(PT1190-1)を用いて、製造業者のマニュアルに 従って、実施した。 遺伝子発現を、心臓、胎盤、肺、肝臓、および腎臓組織で検出した。低レベル のmRNAを、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、および小腸で検出した。発現はまた、骨 芽細胞腫、平滑筋、線維芽細胞、卵巣ガン、静脈内皮細胞、単球白血病細胞、肝 臓細胞、および肺気腫細胞でも検出された。発現はまた、以下の細胞型において も検出され得る：ヒト海馬、腎臓間質、マクロファージ、造骨細胞、ヒト膵臓腫 瘍、胎児蝸牛、および成人肺。 本明細書中で引用したすべての刊行物の開示全体が、本明細書により参考とし て援用される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                    Human tumor necrosis factor receptor-like gene                                Background of the Invention Field of the invention   The present inventors have developed a novel receptor for the tumor necrosis factor (TNF) receptor family. -Was found. In particular, receptors having homology to type 2 TNF receptor (TNF-RII) Is provided. Isolated nucleic acid molecules encoding the novel receptors of the present invention Also provided. Receptor polypeptide and vector for producing the same Further provided are monitor cells, host cells, and recombinant methods. Related technology   Human tumor necrosis factor α (TNF-α) and β (TNF-β or lymphotoxin) It is a related member of a broad class of polypeptide mediators. Polypeptide medium Vehicles include interferons, interleukins, and growth factors (collectively (Referred to as Itokine) (Beutler, B. and Cerami, A., Annu. Rev. Immunol., 7: 625-655 (1989)).   Tumor necrosis factors (TNF-α and TNF-β) originally originated as a result of their antitumor activity It has been discovered, but is now important in the host of biological processes and pathology. It is recognized as a pleiotropic cytokine that plays a role. To date, TNF-related services Itokine family, TNF-α, TNF-β (lymphotoxin-α), LT-β, TRAIL And the Fas receptor, CD30, CD27, CD40, OX40, and 4-1BB receptors. There are ten known members of Gand. These proteins exclude TNF-β. C-terminal and variable N-terminal sequences often used as membrane anchors Having. When both TNF-α and TNF-β bind to the TNF receptor, Functions as a trimmer.   TNF has many cell types (monocytes, fibroblasts, T cells, natural killers (NK) Produced mainly by activated macrophages Is done. TNF-α is used for rapid tumor necrosis, immune stimulation, autologous disease, transplant rejection, Generation of ills response, septic shock, cerebral malaria, cytotoxicity, chemotherapy The detrimental effects of ionizing radiation generated in between (eg, enzyme denaturation, lipid peroxidation, And DNA damage) (Nata et al., J. Immunol. 136 (7): 2483 (1987)), growth Has been reported to have a role in regulatory, vascular endothelial, and metabolic effects You. TNF-α also activates various factors (PAI-1, IL-1, GM-CSF, IL-6) by endothelial cells. ) To promote cell proliferation. In addition, TNF-α is Up-regulates various cell adhesion molecules such as ICAM-1, ICAM-1 and VCAM-1 You. TNF-α and Fas ligand may also induce programmed cell death It is shown.   TNF-β induces antiviral conditions and induces pulmonary necrosis, activates polymorphonuclear leukocytes, Induction of ras I major histocompatibility complex antigen on endothelial cells, adhesion molecule on endothelium Has many activities, including induction and growth hormone stimulation (Ruddle, N. and H. omer, R., Prog. Allergy, 40: 162-182 (1988)).   Recent studies using “knockout” mice have shown that mice with defective TNF-β production Cause abnormal development of peripheral lymphoid organs and morphological changes in the structure of the spleen. (Reviewed in Aggarwal et al., Eur Cytokine Netw, 7 (2): 93-124 (1996)). ). Regarding lymphoid organs, popliteal, groin, paraaortic, mesenteric, axillary, And cervical lymph nodes did not develop in TNF-β − / − mice. Further In addition, peripheral blood from TNF-β-/-mice has a 3-fold decrease in white blood cells compared to normal mice Was. However, peripheral blood from TNF-β-/-mice is not comparable to its normal counterpart Contained 4 times more B cells. In addition, TNF-β is compared to TNF-α by EBV It has been shown to induce the proliferation of infected B cells. These results indicate that TNF-β It is involved in the development of lymphocytes.   First steps in the induction of various cellular responses mediated by TNF or LT Is binding to a particular cell surface or soluble receptor. About 55kDa (TNF-RI ) And 75 kDa (TNF-RII) have been identified (Hohm an et al. Biol. Chem., 264: 14927-14934 (1989)), corresponding to both receptor types. Human and mouse cDNAs have been isolated and characterized (Loetsche r et al., Cell, 61: 351 (1990)). Both TNF-Rs have extracellular, transmembrane, and Shares the typical structure of cell surface receptors, including intracellular regions.   These molecules are not only in cell-bound form, but also in intact receptors. Soluble form consisting of the truncated extracellular domain of the sputer (Nophar et al., EMBO Journa 1, 9 (10): 3269-76 (1990)), and other It is also present in sensitive receptors. Extracellular domains of TNF-RI and TNF-RII 4 share 28% identity and have significant intersubunit sequence homology. It is characterized by one repetitive cysteine-rich motif. Most cell types And tissues appear to express both TNF receptors, and both receptors Are active in signaling, but they mediate distinct cellular responses I can do it. In addition, TNF-RII, as shown in PCT WO 94/09137, Mediates T cell proliferation only.   TNF-RI dependent responses include C-FOS, IL-6, and manganese superoxide dis Mutase mRNA accumulation, prostaglandin E2 synthesis, IL-2 receptor and MHC Includes Las I and II cell surface antigen expression, growth inhibition, and cytotoxicity . TNF-RI is also phospholipase ATwo, Protein kinase C, phosphatidylco Phosphorus-specific phospholipase C and second such as sphingomyelinase Induces the messenger system (Pfefferk et al., Cell, 73: 457-467 (1993)).   Some interferons and other factors regulate TNF-R expression It is shown. For example, retinoic acid is a TNF receptor in some cell types. Induces the production of putters while down-regulating production in other cells It has been shown. Furthermore, TNF-α has localization of both types of receptors. Is shown. TNF-α regulates TNF-RI internalization and TNF-RII secretion Induce (reviewed in Aggarwal et al., Supra). Therefore, the production of both TNF-Rs Raw and internalization is regulated by various factors.   The yeast two-hybrid system identifies ligands that associate with both types of TNF-R (Reviewed in Aggarwal et al., Supra). Some ta Proteins have been identified that interact with the cytoplasmic domain of mouse TNF-R. To use. These two proteins are baculovirus inhibitors of apoptosis. This is likely to be related to TNF- Suggests a direct role for R.                                Summary of the Invention   The novel tumor necrosis factor (TNF) family receptors of the present invention are described herein It is called "TR1 receptor". Thus, according to one aspect of the present invention, An isolated nucleic acid molecule (mRNA, DNA, cDNA, gene, etc.) encoding a TR1 polypeptide of the invention. Nome DNA, and its antisense analogs and biologically active Including fragments thereof useful diagnostically or therapeutically). these The amino acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) CDNA clone deposited in a bacterial host on September 29, 1994 as CC Accession No. 75899 Native TR1 receptor polypeptide with an amino acid sequence encoded by Polynucleotide molecules that encode the peptide are included. Deposited native TR Nucleotide sequence determined by sequencing one receptor clone Encodes a polypeptide of 401 amino acid residues shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Open reading frame (including the start codon at positions 46 to 48 in FIG. Has a leader sequence for amino acid residues, and a predicted molecular weight of about 46 kDa, and 44 kDa for the unglycosylated mature protein). Push The amino acid sequence of a given mature native TR1 receptor protein is the amino acid sequence of FIG. It is shown from about position 22 to about position 401 of the acid residue (SEQ ID NO: 2).   The carboxy terminus having the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) was modified An isolated nucleic acid molecule encoding a TR1 receptor polypeptide is also included in the invention. I will. Carboxy-terminal modified TR1 receptor shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 3) The nucleotide sequence encoding the ter polypeptide comprises a 395 amino acid residue polynucleotide. Open reading frame encoding the peptide (starting code at position 1-3 in Figure 2) And has a leader sequence of about 21 amino acid residues and is non-glycosylated (Having a predicted molecular weight of about 43 kDa for the protein). Mature carboxy powder The amino acid sequence of the truncated TR1 receptor protein is shown in FIG. Shown in the amino acid residue (SEQ ID NO: 4).   In a further aspect, the invention relates to (a) FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. No. 4) encoding a TR1 receptor polypeptide having the entire amino acid sequence of A nucleotide sequence; (b) having an amino acid sequence of about position 22 to about position 401 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); Encoding a predicted mature native TR1 receptor polypeptide Has the sequence or amino acid sequence from about position 22 to about position 395 of FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Encoding a putative mature carboxy-terminally modified TR1 receptor polypeptide Otide sequence; (c) encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 75899 Encodes a native TR1 receptor polypeptide having the entire amino acid sequence Nucleotide sequence; (d) coding by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 75899; A mature native TR1 receptor polypeptide having the amino acid sequence And (e) the nucleotide sequence of (a), (b), (c), or (d) above. A nucleotide sequence complementary to any of the leotide sequences. Providing an isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence Offer.   A further embodiment of the present invention is a nucleic acid according to (a), (b), (c), (d) or (e) above. At least 90% identical to any of the nucleotide sequences, more preferably at least A polynucleotide having a nucleotide sequence that is 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical. Nucleotides or the above under stringent hybridization conditions A polynucleotide that hybridizes to the polynucleotide (a), (b), (c), (d), or (e). Includes an isolated nucleic acid molecule containing a nucleotide. This hybridizing poly Nucleotides are synthesized under stringent hybridization conditions at the A residue To a polynucleotide having a nucleotide sequence consisting of Do not hybridize. Further nucleic acid embodiments of the present invention include the above (a), (b), (c) ), Or an epitope of a TR1 receptor polypeptide having the amino acid sequence of (d). An isolated nucleic acid sequence containing a polynucleotide encoding the amino acid sequence of the retained moiety About the child.   According to another aspect of the present invention, a novel mature polypeptide is provided. They are , TR1 receptor, and fragments, analogs, and derivatives thereof . The polypeptide of the invention is of human origin and: (a) FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) To Native TR1 receptor polypeptide with a total 401 amino acid sequence including the indicated leader sequence Including the amino acid sequence of the polypeptide or the leader sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). Of a carboxy-terminal modified TR1 receptor polypeptide with a total 395 amino acid sequence Amino acid sequence: (b) has the amino acid sequence of about position 22 to about position 401 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) Amino acid of mature native TR1 receptor polypeptide (without leader) Acid sequence or amino acid sequence from about position 22 to about position 395 shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Carboxy-terminally modified TR1 receptor polypeptide with a sequence (without leader) (C) the amino acid sequence of (c) contained in the cDNA clone contained in ATCC accession no. Native TR1 receptor polypeptide with the entire amino acid sequence including the leader The amino acid sequence of the repeptide; and (d) the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 75899. Mature native TR1 receptor polypeptide with an amino acid sequence encoded by And an amino acid sequence of a polypeptide. The polypeptide of the present invention is also described in (a), (b), (c), or (d) above. At least 90% similarity in amino acid sequence, more preferably at least 95% similarity; Polypeptide having an amino acid sequence having similarity, and amino acid sequence described above At least 80% identical, more preferably at least 90% identical, and even more Preferably, a polypeptide having an amino acid sequence that is 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical. Including repeptides.   The soluble TR1 receptor polypeptide is an amino acid containing a transmembrane domain. Is considered not to contain. Accordingly, in a further aspect, the present invention provides To provide a TR1 receptor polypeptide containing such a transmembrane domain-containing amino acid sequence. Offer. Such polypeptides may be native or described herein. It can be constructed from the listed TR1 receptor.   A further embodiment of this aspect of the present invention is directed to the above (a), (b), (c), or (d). Preserving the epitope of a TR1 receptor polypeptide having the amino acid sequence described in The present invention relates to a peptide or polypeptide having a partial amino acid sequence. Of the present invention Pep having the amino acid sequence of the epitope-bearing portion of a TR1 receptor polypeptide The tide or polypeptide is at least 6 or 7, preferably at least 9, And more preferably such having at least about 30 amino acids to about 50 amino acids And the entire amino acid sequence of the polypeptide of the present invention described above. Epitope-bearing polypeptide of any length up to and including the amino acid sequence Tides are also included in the present invention. In another embodiment, the present invention provides the above (a), (b), (c) or a TR1 receptor polypeptide having the amino acid sequence described in (d) An isolated antibody that specifically binds to is provided.   The present invention also provides a functional domain of the soluble TR1 receptor polypeptide of the present invention. I will provide a. These domains are shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. ) From about position 22 to about position 261. We have shown in FIG. 1 and The amino acid residues from about position 22 to about position 261 of SEQ ID NO: 2 are the known extracellular domains of TNF-RII (FIG. 3). From about position 262 to about 401 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) Amino acid residues up to position 262 and positions 262 to 395 in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). Further included are amino acid residues, which we have identified as known TNF-RII intracellular It was found to be homologous to the domain (FIG. 3).   The present invention provides a TR1 receptor polymorph having the amino acid sequence described herein. Further provided are methods for isolating antibodies that specifically bind to a peptide. this Such antibodies are diagnostically or therapeutically useful, as described below.   According to a still further aspect of the present invention, such polypeptides are obtained by recombinant technology. A process for producing a tide is provided. This process is based on the polypeptide of the present invention. A recombinant prokaryotic host cell containing a nucleic acid sequence encoding the peptide and / or Eukaryotic host cells can be used to express the protein and subsequent rounds of the protein. Culturing under conditions to promote yield. Therefore, the present invention also And methods for producing such vectors and host cells, and the Used for recombinant production of sceptor polypeptides or peptides About the method.   According to a still further aspect of the invention, such a polypeptide or such a polypeptide Using a polynucleotide encoding a novel polypeptide Screen for nysts and / or agonists and / or receptor ligands A process for training is provided. Cells induced by TR1 receptor Such a screen to identify compounds that can enhance or inhibit vesicular responses The contacting method involves contacting cells expressing a TR1 receptor with a candidate compound, Assaying the cellular response and comparing this cellular response to a standard cellular response The step of performing Standards are used when contact is made in the absence of the candidate compound. This increases the cellular response to the standard, indicating that the compound Indicating an agonist and a reduced cellular response to the standard indicates that Indicates that the compound is an antagonist.   According to a still further aspect of the present invention, a hybrid A nucleic acid probe is provided that includes a nucleic acid molecule of sufficient length to redisy.   In another aspect, the TR1 receptor-mediated response can be elicited or inhibited. Determining the effect of the candidate compound on the binding of the resulting cellular ligand. Screening assays for agonists and antagonists are provided It is. In particular, this method involves contacting a TR1 receptor polypeptide with a candidate compound. The TR1 receptor polypeptide that binds to a cellular ligand is a candidate Determining whether the presence or absence of the compound increases or decreases Include. In addition, such assays directly elicit a TR1 receptor-mediated response. It can be used to identify compounds that emit.   According to yet another aspect of the invention, a condition associated with insufficient TR1 receptor activity (Eg, to inhibit tumor growth, to inhibit human cellular proliferation (eg, , T cell proliferation), to regulate immune and antiviral responses To protect against the effects of ionizing radiation and to protect against chlamydial infection To regulate proliferation, and to treat immunodeficiencies such as those found in HIV ) Are provided processes for using such agonists.   According to another aspect of the invention, conditions associated with overexpression of the TR1 receptor (e.g., For example, T cell-mediated autoimmune diseases such as AIDS, septic shock, cerebral malaria To treat transplant rejection, cytotoxicity, cachexia, apoptosis, and inflammation Provided is a process using an antagonist of   The present inventors have found that TR1 receptors are expressed in lung tissue, hippocampus, adult heart, kidney, liver, Placenta, smooth muscle, thymus, prostate, ovary, small intestine, and osteoblastoma and fibroblast Was found to be expressed in the vesicle cell line. In addition, we have found that Effective amount of TR1 receptor mRNA in fetal brain, synovium, synovial sarcoma, T cells, endothelial cells Activated macrophages, lymph nodes, thymus, neutrophils, and activated neutrophils Is not present. "Standard" TR1 receptor inheritance for many diseases Child expression levels (eg, having one of the diseases associated with abnormal TR1 receptor function) TR1 receptor expression level in tissues or body fluids from individuals without One or both of significantly higher or lower levels of TR1 receptor gene expression Is a specific tissue (eg, cancer, apoptosis, and inflammation) or In body fluids (eg, serum, plasma, urine, synovial fluid, or cerebrospinal fluid) collected from affected patients It can be detected in Therefore, the present invention relates to abnormal TR1 receptor Diagnostic methods useful during the diagnosis of a function-related disease, comprising: (a) Assaying the TR1 receptor gene expression level in the cell or body fluid; (B) The TR1 receptor gene expression level is compared to the standard TR1 receptor gene expression level. Comparing the expression level with the standard expression level. Increased or decreased levels of altered TR1 receptor gene expression indicate an abnormal TR1 receptor A process that is indicative of a disease associated with the function of a protein.                             BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 (A-B) shows the cDNA of the native TR1 receptor polypeptide of the present invention. SEQ ID NO: 1 shows the sequence (SEQ ID NO: 1) and the corresponding deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) This is thought to lack the transmembrane domain. The first 21 amino acids are putative The leader sequence is presented and underlined. Standard one-letter abbreviations for amino acids use. Sequencing was performed on a 373 automated DNA sequencer (Applied Biosystems, Inc. ) Performed using Sequence accuracy is expected to be greater than 97% accurate.   FIG. 2 (AB) shows the cDNA of the C-terminally modified TR1 receptor polypeptide of the present invention. Figure 2 shows the sequence (SEQ ID NO: 3) and the corresponding deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 4). As before, the first 21 amino acids represent the putative leader sequence and are underlined Is attached. Sequencing and abbreviations are as in FIG.   FIG. 3 shows a native TR1 receptor polypeptide of the present invention (upper) and a known TR1 receptor polypeptide. With human type 2 TNF receptor (human TNF-RII, shown at the bottom, (SEQ ID NO: 5)) 2 shows an amino acid sequence alignment.   FIG. 4 shows an analysis of the native TR1 receptor amino acid sequence. α, β, tar And coil regions; hydrophilic and hydrophobic regions; amphiphilic regions; flexible regions; The gender index as well as the surface probability are indicated. The “Antigenicity Index-Jameson-Wolf” graph shows The amino acid residues 20 to 52, 66 to 203, 229 to 279, and 297 to 378 in FIG. Corresponds to the highly antigenic region of the active TR1 receptor protein.   FIG. 5 shows human TNF-RI and TNF-RII and the native TR1 receptor of the present invention. Figure 2 shows a specific polyclonal antibody binding assay. Purified native TR1 Scepter (HSABH13 protein) was added to wells in a 96-well plate (100 μl / well) and incubated for 2 hours. After incubation, The rate is washed three times and phosphatase against human TNF-RI and TNF-RII Labeled goat polyclonal antibody (200 μl) was added to each well. 2 more After a one hour incubation, the receptor-antibody conjugate is washed three times and μl of substrate solution was added to each well. Incubate plate for another hour did. Then the O. of the resulting solution. D. Was measured using an ELISA reader (test Wavelength 450 nm, calibration wavelength 590 nm). All reagents are from the R & D System (Minneapolis, MN 55 413) and these were used according to the manufacturer's instructions .   FIG. 6 shows monoclonal antibodies specific for type I and type II TNF receptors. 1 shows a binding assay for native TR1 receptor. Purified native TR1 Scepter (HSABH13 protein) (100ul / well) is converted to sTNFRI or sTNFRII To the 96-well plate provided by the R & D system, coated with the corresponding mAb. And incubated for 2 hours. After three washes with wash buffer, sTNF-RI or Or phosphatase-labeled polyclonal antibody (200 ml) against sTNF-RII Was added. After 2 hours incubation and 3 washes, 200 ml of substrate solution Was added to each well and the plate was incubated for 1 hour. ELISA OD Measured using a reader (test wavelength 450 nm, calibration wavelength 590 nm). All reagents , R & D System (Minneapolis, MN 55413).   FIG. 7 shows a novel TNF of the native TR1 receptor of the present invention and TNF-α or TNF-β. FIG. 2 shows a competitive binding assay with a ligand-like protein (HUVEO19). Purified 96-well plate with native TR1 receptor protein (100 μl / well) Were added to the wells and incubated for 2 hours. After incubation Wash the plate three times, add 10 ng of TNF-α or TNF-β to the wells, and The plate was incubated for an additional 2 hours, followed by another 3 washes. Double On the plate, 10 ng of the novel TNF ligand-like protein (HUVEO19) is first Incubate with the active TR1 receptor and, after the first three washes, 10n g of either TNF-α or TNF-β for the second incubation. Was added to the well. For each plate, wash the wells three times and remove TNF-α or Added a phosphatase-labeled polyclonal antibody against TNF-β (200 µl) did. After an additional 2 hours of incubation, the wells were washed three times and μl of substrate solution was added to each well. The plate is then incubated for 1 hour. And O. D. Was measured using an ELISA reader (test wavelength 450 nm, calibration wave Length 590 nm). All reagents are as described above in the R & D System (Minneapolis, MN 55413). ).   FIG. 8 shows the native TR1 receptor of the present invention, TNF-α and the novel TNF described above. Competitive binding assay between ligand-like proteins human TNF-RI and TNF-RII Is shown. Purified native TR1 receptor protein (100 μl / well) 96 cells pre-coated with NF-α or a novel TNF ligand-like protein (HUVEO19) Added to the wells of the well plate and incubated for 2 hours. Incube After washing, wash the plate 3 times and play with 10ng of human TNF-RI or TNF-RII. Added to the sample. The plate was then incubated for a further 2 hours. 2 hours After the incubation, the wells were washed three times. Native in two plates TR1 receptor was removed and 10 ng of either human TNF-RI or TNF-RII was added . After a second 2 hour incubation, the plates were washed three times and Phosphatase-labeled polyclonal antibodies against TNF-RI or TNF-RII (200 μl) was added to each well. After an additional 2 hours incubation, plate Were washed three times, 200 μl of substrate solution was added to each well, and the plate was incubated for 1 hour. Incubated. Then, O. D. Was measured using an ELISA reader (test Wavelength 450 nm, calibration wavelength 590 nm). All reagents are as described above in the R & D System (Minn ea polis, MN 55413).   FIG. 9 shows a screening assay for polyclonal rabbit anti-TR1 antibody (ELISA ). Polyclonal rabbit anti-TR1 antibody was conjugated to P according to standard protocols. ocono Rabbit Farm & Laboratory, Inc. (Canadensis, PA 18325) Made. Rabbit sera were tested by ELISA. For details, plate with TR1 For 2 hours at room temperature or overnight at 4 ° C. (labeled as TNFr batch HG02900-1-B). Knowledge). After washing with PBS, these were combined with 1% BSA and 0. 5% sodium azide Was blocked overnight at 4 ° C. with PBS containing Flick PBS-BSA gently over the wells, The test supernatant was then added and incubated for 1 hour at room temperature. 3 times with PBS After washing, 50 ml of anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugate (1% BSA (1: 1000 dilution in PBS containing) and add 0. Incubate at room temperature for 5 to 1 hour I did it. After three washes with PBS, the substrate solution of IgG horseradish peroxidase was added. Added to plate and incubated for 10-30 minutes at room temperature. Reaction, 50ml 0. Stopped by the addition of 1 M EDTA. Absorbance was read at 450 nm.                       Detailed Description of the Preferred Embodiment Nucleic acid molecule   Unless otherwise indicated, determined by sequencing a DNA molecule herein. All sequenced nucleotide sequences are automatically sequenced by an automated DNA sequencer (eg, Applied B iosystems, Inc. Determined using Model 373) and determined herein. The entire amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA molecule Predicted by translation of the DNA sequence determined as described above. Therefore, this automatic Known in the art for any DNA sequence determined by the optimization approach As described herein, any nucleotide sequence determined herein introduces some errors. May be included. The nucleotide sequence determined by automation is the DNA to be sequenced Typically at least about 90% identical to the actual nucleotide sequence of the molecule, More typically at least about 95% to at least about 99. 9% identical. Real Sequences are subject to other approaches, including manual DNA sequencing methods well known in the art. Therefore, it can be determined more accurately. As is also known in the art, the actual A single insertion or deletion in the determined nucleotide sequence compared to the sequence Causes a frameshift in the translation of the nucleotide sequence, and consequently The predicted amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence Completely different from the amino acid sequence actually encoded by the determined DNA molecule , Insertions or deletions.   Unless otherwise indicated, each "nucleotide sequence" set forth herein is a Shown as the sequence of xyribonucleotides (abbreviated A, G, C, and T). However, depending on the "nucleic acid sequence" of the nucleic acid molecule or polynucleotide, the DNA molecule or the Or for polynucleotides the sequence of deoxyribonucleotides and RN Correspondence of ribonucleotides (A, G, C, and U) to A molecule or polynucleotide Sequence (each thymidine deo in the deoxynucleotide sequence specified herein) The xynucleotide (T) is replaced by the ribonucleotide uridine (U) Is intended. For example, indicated using abbreviations for deoxyribonucleotides Reference to an RNA molecule having the sequence of SEQ ID NO: 1 refers to each deoxynucleotide of SEQ ID NO: 1. Otide A, G or C is replaced by the corresponding ribonucleotide A, G or C And each deoxynucleotide T is replaced by a ribonucleotide U It is intended to indicate an RNA molecule having the resulting sequence.   The term "gene" or "cistron" refers to a DN involved in the production of a polypeptide chain. Means the segment of A; this is the region before and after the coding region (leader and And trailers), and intervening arrangements between individual code segments (exons). Includes columns (introns).   According to one aspect of the present invention, a putative mature native TR1 receptor having the following: An isolated nucleic acid encoding a sceptor polypeptide is provided: FIG. 1 (SEQ ID NO: No. 2) deduced amino acid sequence, or American Culture Stop at the Ip Collection (12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852) Mature native T encoded by the cDNA of the clone deposited in deposit 75899 HuXAG-2 polypeptide having the amino acid sequence of R1 receptor polypeptide The polynucleotide to be loaded. The nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) Obtained by sequencing HASBH13 deposited with the ATCC. Deposited ku The loan is contained in the pBluescript SK (-) plasmid (Stratagene, LaJolla, Ca) ing.   Mature carboxy-terminally modified TR1 receptor having the deduced amino acid sequence of FIG. -An isolated nucleic acid (polynucleotide) encoding the polypeptide is also provided. Is done. This is the carboxy terminal amino acid residue shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Including frame shift. Understood by those skilled in the art due to the presence of this frameshift Thus, a functional TR1 receptor with a modified carboxy terminus is shown in FIG. SEQ ID NO: 3). The conclusion is that the rest of the sequence Based on the fact that it remains.   One of skill in the art will appreciate such carboxy-terminally modified TR1 shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). Or isolated from the cDNA clone contained in ATCC Deposit No. 75899 for the receptor. Standard production from selected naturally occurring polynucleotides using recombinant DNA technology. Easy to use and perform. This is Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, J. Fritsch, E .; F. And Maniatis, T. Hen, Cold Spring Ha rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) Has been described.   Using the information provided herein, FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or FIG. A polypeptide encoding a polypeptide of the invention, such as the nucleotide sequence of SEQ ID NO: #). CDNA molecules, including oligonucleotides, are found in many human tissues (lung tissue, hippocampus, adult heart). , Kidney, liver, placenta, smooth muscle, thymus, prostate, ovary, small intestinal tissue, and osteoblasts Tumors, as well as fibroblast cell lines). The present inventors Light native TR1 receptor is expressed on each of the above tissues and cell types I discovered that.   The cDNA clone contained in ATCC Deposit No. 75899 was derived from human early passage fibroblasts (HSA 172 cells) and a prior art human TNF-RII Structurally related to the receptor. See FIG. 3 (SEQ ID NO: 5). Figure 1 (array The determined nucleotide sequence of the TR1 receptor cDNA of No. 1) is shown in FIG. No. 1) containing an initiation codon at positions 46-48 of the nucleotide sequence and 401 amino acids Includes an open reading frame that encodes the protein The first approximately 21 amino acid residues are the putative leader sequence so that the mature protein Contains about 380 amino acids. Protein has the highest degree of homology to TNF-R2 And has about 27% identity and about 43% similarity over the entire length of the protein You. 6 conserved residues present in a 40 residue module in all TNF receptors Cysteine is conserved at this receptor.   As shown, the present invention also provides for mature TR1 receptor proteins of the invention. To provide the form. According to one hypothesis, proteins secreted from mammalian cells The quality has a signal or secretory leader sequence that, once Initiation of transport of growing protein chains through the dendritic tissue Cut from the substrate. Most mammalian and insect cells still have the same specificity Cleave sexually secreted proteins. However, in some cases, secreted Cleavage of the protein is not completely identical, which results in 2 One or more mature species result. In addition, the specificity of cleavage of secreted proteins is complete Is ultimately determined by the primary structure of a particular protein, that is, the specificity of cleavage Is known to be unique to the amino acid sequence of the polypeptide. Therefore, Is contained in the host identified as ATCC Deposit No. 75899, and FIG. (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). Encoding a mature TR1 receptor polypeptide having a defined amino acid sequence Provides a nucleotide sequence. Included in host identified as ATCC Deposit No. 75899 Mature TR1 receptor having the amino acid sequence encoded by the cDNA clone Is the human DNA sequence of the cDNA clone contained in the vector in the deposited host Complete open reading frame encoded by mammalian cells in Refers to the mature form of the TR1 receptor protein produced by the expression of As shown below, the cDNA clone contained in ATCC deposit no. The mature TR1 receptor with the amino acid sequence Depending on the accuracy of the estimated cleavage site based on the analysis, the "mature" Different from the TR1 receptor protein (about 22 to about 401 amino acids) You don't have to.   The protein has a secretory leader and a breakpoint for this leader sequence A method of predicting whether or not is available. Because in signal sequence and maturation A specific amino acid residue at the N-terminus of the protein, especially at the residue immediately around the cleavage site Many cleavage specificities for existing secretory proteins are known. example For example, McGeoch (Virus Res. 3: 271-286 (1985)) is completely (uncut) ) Uses information from the short N-terminal charged region of the protein and the subsequent uncharged region . von Heinje (Nucleic Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)), the cleavage site, Typically, residues -13 to +2 (where +1 indicates the amino terminus of the mature protein) Use information from surrounding residues. Known mammalian components for each of these methods The accuracy of predicting the breakpoint of a secretory protein ranges from 75-80%. von Heinje, supra. However, the two methods use the same predicted cleavage of a given protein. Points do not always occur.   In the case of the present invention, the predicted total TR1 receptor polypeptide of the present invention is Amino acid sequences are analyzed by a computer program ("PSORT"). Was. This program is organized by Institute for Chemical Research, Kyoto University Dr. Available from Kenta Nakai (K. Nakai and M. Kanehisa, Genomics l4 : 897-911 (1992)), which is a cell of a protein based on an amino acid sequence. A skilled system for predicting sexual localization. Localization of this computer The methods of McGeoch and von Heinje have been incorporated as part of You. The analysis by the PSORT program is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. The cleavage site between amino acids 21 and 22 in 4) was predicted. Then, complete amino acid distribution By visual inspection the row is applied a simple form of the von Heine (-1, -3) rule Further analysis. von Heinje, supra. Therefore, the native TR1 receptor tan The leader sequence for the protein is amino acid residues 1 to 21 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). But the predicted mature native TR1 receptor protein The quality consists of residues 22-401, and the carboxy-terminally modified TR1 receptor The leader sequence for the protein is amino acid residue 1 in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). ~ 21, but the predicted mature native TR1 receptor The protein consists of residues 22 to 395 of FIG. 2 (SEQ ID NO: 4).   Thus, in view of the above, as those skilled in the art will appreciate, the TR1 receptor of the present invention The actual leader sequence of the protein is predicted to be about 21 amino acids long, but from about 16 to about It can be anywhere in the 27 amino acid range. The TR1 receptor of the present invention It is a scepter and is secreted. However, these also imply transmembrane regions and It can also exist as a membrane-bound receptor with an intracellular region and an extracellular region. The polypeptides of the present invention may be TNF and lymphotoxin ligands or other TNF triggers. And can bind to family members.   According to aspects of the invention, it may be in the form of RNA or DNA (DNA is cDNA, Polynucleotides, including synthetic DNA and synthetic DNA) are provided. . DNA can be double-stranded or single-stranded, with single-stranded being the coding strand or non-coding ( Antisense) strand. The coding sequence encoding the mature polypeptide is shown in the figure. 1 (SEQ ID NO: 1), the coding sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 3), or May be identical to the sequence of the clone that was As a result of the duplication, the coding sequence was changed in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and FIG. Or a different code encoding the same mature polypeptide as the DNA of the deposited cDNA It can be an array.   Whether it encodes the mature polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Or a polynucleotide encoding the mature polypeptide encoded by the deposited cDNA. The oligonucleotides include: only the coding sequence for the mature polypeptide; Peptide coding sequence and leader or secretory sequence or proprotein Additional coding sequence, such as a coding sequence; coding sequence for a mature polypeptide (eg, And, optionally, additional coding sequences) and non-coding sequences (eg, Non-coding sequence 5 'and / or 3' of the coding sequence of the long or mature peptide).   Thus, the term "polynucleotide encoding a polypeptide" refers to a polypeptide. A polynucleotide containing only the coding sequence for the And / or polynucleotides containing non-coding sequences.   The present invention further relates to the deduced amino acid sequences of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. Encoded by the polypeptide having the sequence, or the cDNA of the deposited clone Herein encoding fragments, analogs and derivatives of the polypeptide It relates to variants of the above polynucleotides. A variant of this polynucleotide is Naturally occurring allelic variants of the polynucleotide or polynucleotides thereof. It may be a non-naturally occurring variant of otide.   The nucleotide sequence of the deposited cDNA or FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or FIG. Flag of an isolated nucleic acid molecule having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4) The diagnostic probes and primers discussed herein. Useful, at least about 15 nt, more preferably at least about 20 nt, even more preferably Preferably at least about 30 nt, and even more preferably at least about 40 nt long Fragments are intended. Of course, longer flags of 50-1000nt length The sequence also includes the nucleotides shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 3). Sequence, as a fragment corresponding to most, but not all, of the deposited cDNA Useful according to the present invention. For example, for fragments at least 20 nt long Thus, the nucleotide sequence of the deposited cDNA or Figure 1 (SEQ ID NO: 1) or More than 20 contiguous sequences from the nucleotide sequence as shown in Figure 2 (SEQ ID NO: 3) Fragments containing the bases are contemplated. Deposited gene and Figure 1 (sequence No. 1) Since the nucleotide sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 3) is provided, It is routine for those skilled in the art to generate DNA fragments such as For example, Shearing by restriction endonuclease cutting or sonication can result in different sized It can be easily used to create a fragment. Or a flag like this Mentions are generated synthetically.   A preferred nucleic acid fragment of the present invention is an epitope of the TR1 receptor protein. A nucleic acid molecule encoding a moiety having a loop. In particular, such a core of the present invention Acid fragments include nucleic acid molecules that encode: Figure 1 (SEQ ID NO: 2) or Is a polypeptide comprising about 20 to about 52 amino acid residues in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4); SEQ ID NO: 2) or a polypeptide comprising about 66 to about 203 amino acid residues in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). Repeptide; about amino acid residues in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) A polypeptide comprising 229 to about 279; and about 29 amino acid residues of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising from 7 to about 378. Using the Jameson-Wolf graph shown in FIG. The inventors have determined that the above polypeptide polypeptide, which is the antigenic region of the TR1 receptor protein, Lagment was decided.   Thus, the present invention provides the same mature polypeptide as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Or the same mature polypeptide encoded by the cDNA of the deposited clone , As well as the variant is the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or the deposited Fragments, derivatives, or polypeptides encoded by the loan cDNA Is a polynucleotide encoding an analog that encodes a variant of such a polynucleotide. Contains nucleotides. Such nucleotide variants include deletion variants, substitution variants. Variants, and addition or insertion variants.   As set forth herein above, the polynucleotide comprises the polynucleotide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) , The coding sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 3), or the code of the deposited clone. Have a coding sequence that is a naturally occurring allelic variant of the coding sequence. Shown As such, one particularly preferred variant is the amino acid residue in FIG. 1 or FIG. TR1 receptor containing a transmembrane domain inserted after about 260 or 261 groups . As is known in the art, an allelic variant has one or more nucleotide substitutions. May have substitutions, deletions, or additions (substantially altering the function of the encoded polypeptide). (No modification) modified polynucleotide sequence. Variants are natural alleles It can occur naturally, such as a variant. "Allelic variants" stain organisms One of several modified forms of the gene occupying a given locus on the body is contemplated. Genes II, Lewin, B. Ed., John Wiley & Sons, New York (1985). Does not exist in nature Mutants can be produced using mutagenesis techniques known in the art.   Such variants are generated by nucleotide substitutions, deletions, or additions. Mutants. Substitutions, deletions, or additions may involve one or more nucleotides You. Mutational changes may be in the coding or non-coding region, or both Can be done. Mutations in the coding region may be conservative or non-conservative amino acid substitutions, Deletions, or additions may be generated. Particularly preferred of these are silent Substitutions, additions, and deletions, which may be TR1 receptor proteins or Does not alter some properties and activities of Also preferred in these respects Are conservative substitutions. Most highly preferred is that in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Mature TR1 receptor protein encoding the amino acid sequence Quality, mature native TR1 receptor encoded by the deposited cDNA clone Has the amino acid sequence or the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 4); Nucleic acid molecule encoding a mature carboxy-terminally modified TR1 receptor protein is there.   The present invention also includes polynucleotides, wherein the Sequence is a polynucleotide sequence that assists in the expression and secretion of the polypeptide from the host cell. Otide sequences (eg secretory sequences for controlling the transport of polypeptides from cells) (A leader sequence that functions as a). Re A polypeptide having a leader sequence is a preprotein and is And a leader sequence that is cleaved to form the mature form of the polypeptide. Poly Nucleotides are also mature proteins that have additional 5 'amino acid residues. Roprotein can be encoded. Mature proteins with prosequences And an inactive form of the protein. Once the pro sequence has been cut , Remains the active mature protein. Such isolated molecules (especially DNA molecules) ) By gene mapping, in situ hybridization with chromosomes And TR1 receptors in human tissues by Northern blot analysis, for example -Useful as a probe to detect gene expression.   Thus, for example, the polynucleotides of the present invention may A protein with a sequence or both a pro-sequence and a pre-sequence (leader sequence) May be encoded.   The nucleic acid fraction removed from its native environment by "isolated" nucleic acid molecules Offspring (DNA or RNA) are intended. For example, the amount of recombinant DNA contained in the vector The offspring is intended to be isolated for the purposes of the present invention. Isolated DNA molecule Further examples of recombinant DNA molecules maintained in heterologous host cells, or Contains (partially or substantially) purified DNA molecules in solution. An isolated RNA molecule Include in vivo or in vitro RNA transcripts of a DNA molecule of the present invention. The present invention Nucleic acid molecules isolated according to the above further include those molecules that are produced synthetically.   The polynucleotide of the present invention also allows for purification of the polypeptide of the present invention. It may have the coding sequence fused in frame to the marker sequence. The marker The sequence provides for the purification of the mature polypeptide fused to the marker in the case of a bacterial host. May be a hexahistidine tag supplied by the pQE-9 vector provided, Alternatively, if a mammalian host (eg, COS-7 cells) is used, The Kerr sequence can be a hemagglutinin (HA) tag. HA tag for influenza red blood cells Corresponds to an epitope derived from an agglutinin protein (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) ). The coding sequence also encodes a fusion protein, such as an IgG Fc fusion protein. Can be fused.   The term "gene" is a segment of DNA involved in producing a polypeptide chain. Means that the region preceding and following the coding region (leader and Taylor), as well as intervening sequences (in) between separate coding segments (exons). TRON).   The fragments of the full-length gene of the present invention can be used to isolate full-length cDNA and Isolate other cDNAs with high sequence similarity or similar biological activity to the gene Used as a hybridization probe for cDNA libraries obtain. Probes of this type preferably have at least 30 bases, and It may contain more than 50 bases. The probe also contains a cDNA clone corresponding to the full-length transcript. And control and promoter regions, exons, and introns Can be used to identify genomic clones containing the complete gene. Screw An example of a known DNA sequence is known for synthesizing oligonucleotide probes. And isolating the coding region of the gene by using Genetics of the present invention Labeled oligonucleotides having a sequence complementary to the sequence of the To determine whether a member hybridizes to a probe, a human cDNA, gene Used to screen libraries of nome DNA or mRNA.   The invention further provides that at least 80%, preferably at least 90%, and And more preferably 95%, 96%, 97%, 98% or 99% identity, The present invention relates to polynucleotides that hybridize to the above sequences. The present invention Can be a polynucleotide as described herein under particularly stringent conditions (eg, For example, a polynucleotide that hybridizes with the cDNA clone contained in ATCC Deposit No. 75899) Regarding nucleotides. "Stringent hybridization conditions" Overnight incubation at 42 ° C in the following solution, then to about 65 ° C 0. It is intended to wash the filters in 1 × SSC: 50% formamide 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate ( pH 7. 6) 5 × Denhardt solution, 10% dextran sulfate, and 20 g / ml denaturing shear Kesperm DNA.   Alternatively, it hybridizes with the polynucleotide of the present invention, and As may have identity with them and retain or not activity No polynucleotides have at least 20 bases, preferably 30 bases, and more preferably Preferably it may have at least 50 bases. For example, such a polynucleotide For example, for polynucleotide recovery or as a diagnostic probe Is a PCR primer and a probe for the polynucleotide of SEQ ID NO: 1. Can be used.   It will be appreciated that the reference polynucleotide (eg, the deposited cDNA clone ) Or a larger part (eg, 50-750 nt in length), or a reference polynucle Polynucleotides that hybridize to the full length of the leotide are also Nucleotide sequence of the cDNA or the nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Like polynucleotides that correspond to most, if not all, of the nucleotide sequences Useful as a probe according to the present invention. For example, "Length is at least 20nt ), The nucleotide sequence of the reference polynucleotide. Column (eg, the deposited cDNA, or a nucleic acid as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1)). 20 or more contiguous nucleotides from the (reotide sequence) are contemplated. Will be shown As such, such portions may be processed in accordance with conventional DNA hybridization techniques. Or as described in, for example, Sambrook, J .; Fritsch, E. F. And Maniatis, T. Edition , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Lab oratory Press, (1989), the entire disclosure of which is incorporated herein by reference. Amplification of the target sequence by polymerase chain reaction (PCR) as described in Diagnostically useful as any of the primers.   The TR1 receptor cDNA clone has been deposited and its determined Since the otide sequence is provided in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), the TR1 receptor cDNA Generating a polynucleotide that hybridizes to a portion of a molecule is well within the skill of the art. Everyday. For example, the restriction endonuclease of the TR1 receptor cDNA clone Cutting or shearing by ultrasound hybridizes to a portion of the TR1 receptor cDNA molecule. To produce various sized DNA segments that are Can be used. Alternatively, the hybridizing polynucleotide of the present invention is a publicly available polynucleotide. It can be produced synthetically according to known techniques. Not surprisingly, the poly A sequence (eg For example, the 3'-terminal poly (A) adduct of the TR1 receptor cDNA shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) Only or to the complementary stretch of the T (or U) residue (reside) Polynucleotides that hybridize may hybridize to some of the nucleic acids of the invention. It is not included in the polynucleotide of the present invention used for the present invention. Because such A polynucleotide is any nucleic acid molecule (e.g., containing a poly (A) extension or its complement, e.g., For example, it hybridizes to any double-stranded cDNA clone.   A further embodiment of the present invention is directed to FIG. 1 (a) containing the putative leader sequence. No. 2) or the complete amino acid sequence of FIG. -Length carboxy-terminally modified TR1 receptor polypeptide having a unique amino acid sequence (B) from about position 22 to about position 401 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) Encodes a mature native TR1 receptor polypeptide having an amino acid sequence of Nucleotide sequence, or amino acids from about position 22 to about position 395 of FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Mature carboxy-terminally modified TR1 receptor polypeptide with acid sequence (leader Nucleotide sequence encoding the full-length polypeptide excluding the sequence); (c) ATCC contract No. 75899 contains the leader sequence encoded by the cDNA clone contained in Encoding the full-length native TR1 receptor polypeptide with the full amino acid sequence (D) the nucleotide sequence of the cDNA sequence contained in ATCC accession no. Mature TR1 receptor polypeptide having an encoded amino acid sequence A nucleotide sequence encoding the peptide; or (e) (a), (b), (c), or (d) ) A nucleotide sequence complementary to any of the nucleotide sequences of at least 90 % Identical nucleotide sequence, and more preferably at least 95%, 96% A polynucleotide having a nucleotide sequence that is 97%, 98%, or 99% identical. Including isolated nucleic acid molecules.   A reference nucleotide sequence encoding a TR1 receptor polypeptide and at least , For example, by a polynucleotide having 95% "identical" nucleotide sequence, The polynucleotide sequence is a reference nucleic acid encoding a TR1 receptor polypeptide. Except that it may contain up to 5 point mutations for each 100 nucleotides of the otide sequence Intended that the nucleotide sequence of the polynucleotide be identical to the reference sequence. Is done. In other words, a nucleotide that is at least 95% identical to the reference nucleotide sequence To obtain a polynucleotide having a leotide sequence, up to 5% of the reference sequence The nucleotide at the position can be deleted or replaced by another nucleotide? Or a large number of nucleotides, up to 5% of all nucleotides in the reference sequence, It can be inserted into a reference sequence. These variants of the reference sequence are At the 5 'or 3' terminal position of, or individually within a nucleotide within the reference sequence, Or interspersed with one or more contiguous groups within the reference sequence, May occur anywhere between the terminal positions of   In practice, any particular nucleic acid molecule can be found in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), FIG. ) Or the nucleotide sequence of the deposited cDNA clone Whether the columns are at least 90%, 95%, 97%, 98%, or 99% identical is an example For example, the Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 f or Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) using known computer programs. It can be determined conventionally. Bestfit is Smith and Waterman, Advances in Appl Using the local homology algorithm in ied Mathematics 2: 482-489 (1981), two Find the best segment of homology between the sequences. Bestfit or any other array Using an alignment program, a particular sequence is, for example, 95% identical to a reference sequence according to the invention. When determining whether they are identical, the parameter, of course, is the percentage of identity. As calculated over the entire length of the reference nucleotide sequence, and Set up to allow for gaps in homology of up to 5% of the total number of nucleotides. Is determined.   The present application encodes a polypeptide having TR1 receptor protein activity 1 (SEQ ID NO: 1) and 2 (SEQ ID NO: 3) At least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% with the nucleic acid sequence of the sequence or deposited cDNA , Or to such nucleic acid molecules that are 99% identical. This is because a specific nucleic acid molecule Even if they do not encode a polypeptide having TR1 receptor activity, How nucleic acid molecules can be used, for example, hybridization probes, Still knows what to use as a primer in the polymerase chain reaction (PCR) Because. The invention does not encode a polypeptide having TR1 receptor activity. Uses of nucleic acid molecules include, among others, (1) TR1 receptor gene or alleles thereof. Isolation of offspring mutants from a cDNA library; (2) Verma et al., Human Chromosome s: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988) Metaphase chromosome spread to provide accurate chromosomal location of TR1 receptor gene In situ hybridization (FISH) to the product; and specific cell types (Eg, activated monocytes) to detect TR1 receptor mRNA expression. Zan blot analysis.   However, actually, a polypeptide having TR1 receptor protein activity is not encoded. 1 (SEQ ID NO: 1), FIG. 2 (SEQ ID NO: 3), or the nucleus of the deposited cDNA A sequence that is at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to the acid sequence Are preferred. "Polypeptides with TR1 receptor activity" Thus, when measured in a particular biological assay, the TR1 receptor of the invention Puter protein (either full-length protein or, preferably, mature protein) Polypeptides exhibiting activities similar (but not necessarily identical) to Is intended. For example, TR1 receptor protein activity is Or other molecules that have been shown to bind to the native TR1 receptor protein Can be measured using the binding affinity of For example, the competitive binding assay shown in FIG. Indicates that the candidate polypeptide is a native TR1 receptor as described herein. It can be used to determine if it has a similar binding affinity.   Therefore, the "polypeptide having TR1 receptor protein activity" Includes polypeptides that exhibit TR1 receptor activity in the assay. About binding activity The degree need not be the same as the activity of the TR1 receptor protein, but is preferably , "A polypeptide having TR1 receptor protein activity" It shows substantially similar activity compared to proteins.   Of course, due to the degeneracy of the genetic code, those skilled in the art will appreciate the nucleic acid sequence of the deposited cDNA. Or the nucleic acid sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 3) Have sequences that are at least 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identical to Numerous nucleic acid molecules produce polypeptides with "TR1 receptor protein activity" Recognize immediately to code. In fact, degenerate alterations of these nucleotide sequences Since all of the variants encode the same polypeptide, It will be apparent to one skilled in the art even without implementation. Such nuclei that are not degenerate variants For acid molecules, a reasonable number of polymorphs also have TR1 receptor protein activity. Encoding a peptide is further recognized in the art. This can be Are likely to affect protein function with less significance, or Any amino acid substitution that is unlikely to affect (eg, the replacement of one aliphatic amino acid) (Substitution with a second aliphatic amino acid).   For example, how to make phenotypically silent amino acid substitutions. Guidance is provided by Bowie et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions ", Sclence247: 1306-1310 (1990). Provided. Here, the authors sought to study tolerance to amino acid sequence changes. We show that there are two main approaches. The first is the process of evolution Where the mutation is either accepted or rejected by natural selection. Is. The second approach involves amino acid changes at specific positions in the cloned gene. Genetic engineering to introduce DNA, and to identify sequences that maintain function. Use selection or screening. As the authors state, these studies are It has been shown that proteins are surprisingly tolerant of amino acid substitutions. Author Say that which amino acid changes are likely to be permissive at certain positions in the protein Is further shown. For example, most buried amino acid residues are nonpolar side chains While the properties of the surface side chains are generally poorly conserved. other Such phenotypically silent substitutions of are described in Bowie et al., Science 247: 1306-1310 ( 1990) and references cited therein.   Deposits incorporated herein by reference for depositing microorganisms are for patent processing purposes. Maintained under the Budapest Treaty on International Awareness. These deposits are: It is provided merely for convenience to those skilled in the art and the deposit Does not acknowledge that it is needed. Polynucleotides in deposited materials The sequence of the tide, as well as the amino acid sequence of the polypeptide encoded thereby, , Incorporated herein by reference, and with any description of the sequences herein. It controls any contradictory events. Create, use, or sell deposited materials Permission may be required for such purposes, and such permission is not granted herein. Not. TR1 receptor polypeptides and fragments   The invention further relates to the deduced amino acids of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). Has a sequence or has an amino acid sequence encoded by a deposited cDNA Polypeptides, as well as fragments, analogs and And derivatives.   The terms "fragment", "derivative" and "analog" are shown in FIG. ), The polypeptide encoded by the polypeptide of FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), or the deposited cDNA. When referring to a polypeptide, substantially the same biological function as such a polypeptide. Or a polypeptide that retains its activity. Therefore, analog Prota that can be activated by cleavage of the protein moiety to produce an active mature polypeptide Includes proteins.   The polypeptide of the present invention may be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide. It can be a polypeptide, preferably a recombinant polypeptide.   Some amino acid sequences of the TR1 receptor polypeptide Recognition in the art that modifications can be made without significantly affecting structure or function Is done. If such differences in sequence are intended, the protein that determines the activity It should be remembered that there is an important area of. In general, similar functions Where a performing residue is used, substitution of residues that form a tertiary structure is possible. In other examples, the type of residue is where the change occurs in a non-critical region of the protein May not matter at all.   Thus, the present invention further exhibits substantial TR1 receptor polypeptide activity. Or a TR1 receptor protein such as the protein portion discussed below And variants of the TR1 receptor polypeptide comprising the region Such mutants , Deletions, insertions, inversions, repeats, and type substitutions (eg, another residue of a hydrophilic residue) Substitution, but usually does not replace strongly hydrophilic residues with strongly hydrophobic residues )including. Small changes or such "neutral" amino acid substitutions are generally Has almost no effect on activity.   Typically seen as conservative substitutions are the aliphatic amino acids Ala, Val, Leu, and I substitution of one amino acid for another in le; hydroxyl residues Ser and Exchange of Thr and Thr, exchange of acidic residues Asp and Glu, substitution between amide residues Asn and Gln With the exchange of the basic residues Lys and Arg, and the substitution between the aromatic residues Phe, Tyr is there.   As detailed above, which amino acid changes are phenotypically silent Probable (ie, likely to have a significant detrimental effect on function) Further guidance on Bowie, J. U. `` Deciphering the Message in P rotein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, '' Science 247: 130. 6-1310 (1990).   Therefore, the polypeptide or the polypeptide of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) and FIG. Fragments, derivatives or analogs of the polypeptide encoded by the deposited cDNA The log shows that (i) one or more amino acid residues are conserved or non-conserved amino acids Residues, preferably conserved amino acid residues, and such substitutions The amino acid residue may be an amino acid residue encoded by the genetic code, or Or (ii) one or more amino acid residues may substitute for a substituent. Or (iii) the mature polypeptide increases the half-life of the polypeptide. Fused with another compound, such as a compound to be added (eg, polyethylene glycol) Or (iv) additional amino acids for purification of the polypeptide. To the mature polypeptide, or (v) the polypeptide flag Is soluble (ie, not membrane-bound), yet further binds to membrane-bound receptors It can bind a ligand. Such fragments, derivatives and Nalog is considered to be within the purview of those skilled in the art from the teachings herein.   Of particular interest are those with another charged amino acid and neutral or negatively charged Replacement of a charged amino acid with an amino acid. The latter has a reduced positive charge Produces proteins and improves the characteristics of the TR11 receptor protein. High prevention of aggregation Desired every time. Aggregation of proteins not only results in loss of activity, Can be immunogenic, which can also be a problem when preparing pharmaceutical formulations ( Pinckard et al., Clin Exp. Immunol. 2: 331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36: 8 38-845 (1987); Cleland et al., Crit. ReV. Therapeutic Drug Carrier Systems 10: 3 07-377 (1993)).   Amino acid substitutions can also alter the selectivity of binding to cell surface receptors. Ostade et al., Nature 361: 266-268 (1993) describe two known types of TNF receptors. Particular mutations that result in selective binding of TNF-α to only one are described. Therefore, the book The TR1 receptor of the invention is one that is derived from either natural mutations or artificial manipulation. Such amino acid substitutions, deletions, or additions may be included.   Conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the folding or activity of the protein Such small property changes are preferred (see Table 1). Table 1. Conservative amino acid substitutions.   Amino acids in the TR1 receptor of the present invention that are essential for function are site-specific The same can be achieved by methods known in the art, such as mutagenesis or alanine scanning mutagenesis. (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). the latter This procedure introduces one alanine mutation at every residue in the molecule. Then obtained Mutated molecules may have receptor binding or in vitro or in vitro proliferative activity. Tested for such biological activity. Important part for ligand-receptor binding Position is also determined by structural analysis such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or photoaffinity labeling. (Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904 (1992) and de Vos et al., Scie. nce 255: 306-312 (1992)).   The polypeptides of the present invention are preferably provided in an isolated form, and are preferably Or substantially purified. Recombinant forms of TR1 receptor polypeptide , Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988). Can be substantially purified.   The polypeptide of the present invention is encoded by the deposited cDNA comprising a leader sequence. From the polypeptide encoded by the deposited cDNA, Figure 1 including the leader-free polypeptide (ie mature protein) and leader (SEQ ID NO: 2) or the polypeptide of FIG. 2 (SEQ ID NO: 4), excluding the leader 1 (SEQ ID NO: 2) or the polypeptide of FIG. At least 90% similarity to the polypeptide, more preferably at least 95% similarity And even more preferably at least 96%, 97%, 98%, or 99% similar Includes polypeptides that have sex properties. Further, the polypeptide of the present invention may comprise a deposited cD A polypeptide encoded by NA, the polypeptide of SEQ ID NO: 2, at least Also 80% identical, more preferably at least 90% or 95% identical, even more preferred Or at least 96%, 97%, 98%, or 99% identical, And also at least 30 amino acids, and more preferably at least 50 amino acids Include portions of such polypeptides that have an acid.   The "similarity" between two polypeptides, as known in the art, is that of a certain polypeptide. Amino acid sequence of peptide and conservative amino acid substitutions thereof and second polypeptide Is determined by comparing the sequence of For two polypeptides, % Similarity ", the Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Packag e, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park , 575 Science Drive, Madison, WI 53711) and initials to determine similarity. Compare the amino acid sequences of two polypeptides using a default setting The resulting similarity value is intended. Bestfit is Smith and Waterman (Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)) Mechanism is used to find the best segment of similarity between two sequences.   At least, for example, 95% A polypeptide having an "identical" amino acid sequence results in a polypeptide having a TR1 No more than five amino acids for each 100 amino acids of the reference amino acid sequence of the receptor polypeptide Except that it may include amino acid changes, the amino acid sequence of the polypeptide may be different from the reference sequence. It is intended to be identical. In other words, at least 95 % To obtain a polypeptide having the same amino acid sequence in the reference sequence Up to 5% of amino acid residues may be deleted or replaced with another amino acid, Or a number of amino acids of up to 5% of the total amino acid residues in the reference sequence Can be inserted. Modifications of these reference sequences are based on the amino terminal position of the reference amino acid sequence Or at the carboxy-terminal position or individually between residues of the reference sequence, or Anywhere between terminal positions in one or more contiguous groups within the reference sequence And it can happen.   In practice, any particular polypeptide may be used, for example, in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), FIG. By the amino acid sequence shown in (SEQ ID NO: 4) or the deposited cDNA clone At least 90%, 95%, 96%, 97%, 98% of the encoded amino acid sequence Or 99% identity is determined by the Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, Universit y Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). It can be determined conventionally using a pewter program. If a particular sequence is, for example, Bestfit, to determine if it is 95% identical to a reference sequence of the invention, When using any other sequence alignment program, of course, The fraction is calculated over the entire length of the reference amino acid sequence, and Parameters that allow gaps in homology of up to 5% of the total number of acid residues Is set.   Fragments or portions of a polypeptide of the present invention can be bound by peptide synthesis. Can be used to produce the corresponding full-length polypeptide; Can be used as an intermediate to produce a full-length polypeptide. Of the present invention A fragment or portion of a polynucleotide may be a full-length polynucleotide of the invention. Can be used to synthesize   The polypeptides of the present invention can be applied to SDS-PAGE gels or separations using methods well known to those skilled in the art. It can be used as a molecular weight marker on a sieve gel filtration column.   As described in detail below, the polypeptides of the present invention also include polyclonal antibodies. And for raising monoclonal antibodies. These are: Useful in assays to detect TR1 receptor protein expression Or an agonist that can enhance or inhibit TR1 receptor protein function And are useful as antagonists. In addition, such polypeptides Binding of TR1 proteins that are also candidate agonists and antagonists of the invention Used in a yeast two-hybrid system to "capture" proteins Can be The yeast two-hybrid system is described in Fields and Song, Nature 340: 245- 246 (1989).   As shown, the TR1 receptor polypeptide described above contains a transmembrane domain. It is considered impossible. Thus, in a further embodiment, the present invention provides a transmembrane TR1 receptor polypeptide of the invention having an amino acid sequence further comprising a main About. Such receptor polypeptides may be native or It can be constructed from the TR1 receptor described herein according to recombinant techniques. Isolate the nucleotide sequence encoding the TR1 receptor containing the transmembrane domain The method for providing the sequence provided in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 3) From one or more of the above tissue sources. And a step of hybridizing with a cDNA library.   When produced recombinantly or synthetically, the transmembrane domain Suitable sites for insertion of the protein will be apparent to those skilled in the art. The present inventors, FIG. 1 (sequence number No. 2) contains about 22 to about 261 amino acid residues of human TR1-RII (FIG. 3; SEQ ID NO: 5). ) Has significant homology to the extracellular domain. Further, FIG. The amino acid residues from about 262 to about 401 shown in SEQ ID NO: 2 are human TR1-RII (FIG. 3; It has considerable homology to the intracellular domain of SEQ ID NO: 5). Therefore, those skilled in the art Amino acid residues 261 and 2 of either FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Between 62 (or their proximal (within about 1-10 amino acids)) It is understood that this is a suitable site for insertion of an amino acid sequence containing Transmembrane domain A polynucleotide encoding an amino acid containing (Or constructed from its nucleotide sequence) and applied to recombinant technology Therefore, it is inserted into an appropriate site of the deposited clone. In addition, such a domain Can be synthetically constructed and inserted into the soluble TR1 receptor of the present invention. You. Insertion of amino acids containing such transmembrane domains into the TR1 receptor of the present invention The entry appears to result in an insoluble receptor that integrates into the membrane. Departure A specific example of a transmembrane domain that is useful is described in FIG. 3 (bottom sequence) (SEQ ID NO: 5). A TNF-R2 transmembrane domain represented by about 258 to about 287 amino acid residues. Other this Such TR1 receptor transmembrane domains will be apparent to those skilled in the art.   In another aspect, the present invention provides an epitope-bearing portion of a polypeptide of the present invention. Or a peptide or polypeptide. Epitope of this polypeptide A moiety is an immunogenic or antigenic epitope of a polypeptide of the invention. "Exempt Epidemiological epitope "elicits an antibody response when the whole protein is an immunogen Is defined as part of a protein. These immunogenic epitopes are It is considered that the position is limited to a few positions. On the one hand, the A region of a protein molecule may be defined as an "antigenic epitope." Protein free The number of epidemiological epitopes is generally less than the number of antigenic epitopes. example See, for example, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1983) When.   A peptide or polypeptide bearing an antigenic epitope (ie, an antibody (Including regions of protein molecules that can bind). Relatively short synthetic peptide mimicking part reacts with partially mimicked protein It is well known in the art that antisera can be routinely induced. For example, Sutcli See ffe et al., Science 219: 660-666 (1983). Induces protein-reactive serum Possible peptides are frequently represented in the primary sequence of the protein, and Intact proteins that can be characterized by a pure set of chemical laws Also have an amino-terminal or CAL at the immunodominant region (ie, immunogenic epitope). There is no restriction on the boxyl end. Extremely hydrophobic peptides and no more than 6 Residue peptides are generally ineffective at inducing antibodies that bind to the mimetic protein. Longer, soluble peptides, especially those containing proline residues, are usually It is effective. Sutcliffe et al., Supra, 661. For example, design according to these guidelines. 18 of the 20 peptides measured (influenza virus hemagglutinin HA1 poly Contains 8-39 residues covering 75% of the peptide chain sequence) Induced antibodies that react with tact virus; and 12 from MuLV polymerase. 18/18 from / 12 peptide and rabies glycoprotein precipitate their respective proteins Precipitating antibodies were induced.   The antigenic epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are therefore Elicit antibodies, including monoclonal antibodies, that specifically bind to a polypeptide of the invention Useful for Therefore, a donor immunized with a peptide carrying an antigenic epitope? Most of the hybridomas obtained by fusion of their spleen cells are generally Secretes antibodies reactive with live proteins. Sutcliffe et al., Supra, 663. antigen Antibodies elicited by a peptide or polypeptide bearing a neutral epitope Useful for detecting proteins, and antibodies against different peptides To track the end of various regions of post-translationally processed protein precursors Can be used for In immunoprecipitation assays, short peptides (eg, about 9 amino acids) were used. It has been shown that even non-acidic acids can bind and displace longer peptides Because peptides and anti-peptide antibodies have different qualities for mimetic proteins Can be used in quantitative or quantitative assays, such as competitive assays. example See, eg, Wilson et al., Cell 37: 767-778 (1984). The anti-peptide antibodies of the present invention also Purification of mimetic proteins (e.g., by adsorption chromatography using methods well known in the art). (By photography).   Antigenic epitope-bearing peptides of the invention designed according to the above guidelines And polypeptides are preferably within the amino acid sequence of the polypeptides of the invention. At least 7, more preferably at least 9, and most preferably about Includes sequences between 15 and about 30 amino acids. However, the amino acids of the polypeptides of the invention The present invention includes any length and up to about 30 to about 50 amino acids or the entire sequence. Peptides or polypeptides comprising a greater portion of the amino acid sequence of the light polypeptide Are also considered to be epitope-bearing peptides or polypeptides of the invention. And is also useful for inducing antibodies that react with the mimetic protein. Like Alternatively, the amino acid sequence of the epitope-bearing peptide is substantially soluble in an aqueous medium. (Ie, the sequence contains relatively hydrophilic residues). And highly hydrophobic sequences are preferably avoided); and include proline residues. Particularly preferred is an arrangement of   Antigenic polypeptides that can be used to raise TR1 receptor-specific antibodies Non-limiting examples include about 2 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4). A polypeptide comprising 0 to about 52 amino acid residues: FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. A polypeptide comprising about 66 to about 203 amino acid residues in SEQ ID NO: 4); About 229 to about 279 amino acids in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) A polypeptide comprising residues; and about 297 to about 378 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Polypeptides containing amino acid residues are included. As shown above, the present inventor Et al. Show that the polypeptide fragment is an antigenic region of the TR1 receptor protein. Was decided.   The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention are used for the nucleic acid molecules of the present invention. Any of the methods for making a peptide or polypeptide, including the recombinant means used. It can be produced by conventional means. For example, a short epitope-bearing amino acid sequence Immunization during recombinant production and purification, and to produce anti-peptide antibodies During this time, it can be fused to a larger polypeptide that acts as a carrier. Epito Loop-bearing peptides can also be synthesized using known methods of chemical synthesis. example Houghten was prepared and characterized (ELISA-type) in less than 4 weeks 1 shows a single amino acid variant of a segment of the HA1 polypeptide (by binding studies) A simple method for the synthesis of large numbers of peptides such as 0-20 mg of 248 different 13 residue peptides A simple method is described. Houghten, R.A. (1985). General method for the rap id solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of ant igen-antibody interaction at the level of individual amino acids. this" Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS) process Ten, et al. (1986) in U.S. Patent No. 4,631,211. In this procedure, Individual resins for solid phase synthesis of peptides included in separate solvent permeable packets This allows for optimal use of many of the same iterative steps associated with the solid phase method. Complete Manual procedures allow 500-1000 or more syntheses to be performed simultaneously. Hou ghten et al., supra, 5134.   The epitope-bearing peptides and polypeptides of the present invention can be prepared by methods known in the art. Used to induce antibodies by the method. For example, Sutcliffe et al., Supra; Wil. Son et al., supra; Chow, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914; and Bittle et al., J. G. en.Virol. 66: 2347-2354 (1985). Generally, animals are free peptides Can be immunized; however, anti-peptide antibody titers can bind peptides to macromolecular carriers (eg, For example, keyhole limpet hemocyanin (KLH) or tetanus toxoid) Boosting can be achieved by coupling. For example, contain cysteine The peptide was m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (M BS) can be coupled to the carrier using a linker such as Peptides are used as carriers by using more common linking agents such as glutaraldehyde. Can be coupled. Animals such as rabbits, rats, and mice are free Or carrier-coupled peptide, e.g., about 100 μg Emulsions containing tide or carrier protein and Freund's adjuvant Is immunized by intraperitoneal and / or intradermal injection. Some booster injections Can be used, for example, in an ELISA assay using the free peptide adsorbed on a solid surface. For example, to provide a useful titer of anti-peptide antibody that can be detected May be required at intervals in between. Potency of anti-peptide antibodies in serum from immunized animals The titer may be determined by the choice of anti-peptide antibody, for example, by solid methods well known in the art. It can be increased by adsorption to the peptide on the support and elution of the selected antibody.   The immunogenic epitope-bearing peptide of the present invention, that is, the whole protein is isolated. If epidemiological, the portion of the protein that elicits the antibody response is known in the art. Identified by the method. For example, Geysen et al. (1984) supra provide an enzyme-linked immunosorbent. Rapid on a solid support of hundreds of peptides pure enough to react in the assay A simple simultaneous synthesis procedure is disclosed. The interaction of the synthetic peptide with the antibody then They are easily detected without removing them from the support. In this manner, desired Peptides carrying immunogenic epitopes of proteins of Can be identified. For example, immunological studies on the coat protein of foot-and-mouth disease virus Key epitopes are all 208 of the entire 213 amino acid sequence of the protein. Geysen by elucidating 7 amino acids by synthesizing overlapping sets of possible hexapeptides And others. Then, all 20 amino acids are in turn, each within the epitope A complete substitution set of peptides substituted at positions is synthesized and reacted with the antibody The specific amino acids that confer specificity for were determined. Therefore, the present invention Peptide analogs of loop-bearing peptides can be made routinely by this method . Geysen (1987) U.S. Pat. No. 4,708,781 discloses the immunogenicity of a desired protein. This method of identifying peptides carrying pitopes is further described.   Still further, Geysen (1990) US Pat. No. 5,194,392 describes the identification of antibodies of interest. Topological equivalent of an epitope that is complementary to the paratope (antigen binding site) of Escherichia coli Of monomers (amino acids or other compounds) that are (ie, “mimotopes”) A general method for detecting or determining a sequence is described. More generally, Geysen ( U.S. Pat. No. 4,433,092 (1989) discloses a ligand binding site for a particular receptor of interest. Detect or determine the sequence of monomers that are topologically equivalent to a ligand that is complementary to a position Method is described. Similarly, Houg in Peralkylated Oligopeotide Mixtures hten, R .; A. (1996) US Pat. No. 5,480,971 discloses a linear C1-C7-Alkyl Peralkylated oligopeptides and sets and such peptides Library that binds preferentially to the acceptor molecule of interest. To determine the sequence of the alkylated oligopeptide, such an oligopeptide And methods of using libraries. Therefore, the epitope of the present invention Non-peptide analogs of the retained peptide can also be routinely made by these methods. Can be   This section in "TR1 receptor polypeptides and fragments" The entire disclosure of each of the documents cited in is incorporated herein by reference.   As those skilled in the art will appreciate, the TR1 receptor polypeptides of the present invention and The epitope-bearing fragment consists of the constant domain of an immunoglobulin (IgG). It can bind to some, resulting in a chimeric peptide. These fusion proteins require purification. Accelerated and show increased half-life in vivo. This is, for example, the human CD4-po The first two domains of the repeptide and the heavy chain of a mammalian immunoglobulin or Illustrated for a chimeric protein consisting of various domains of the constant region of the light chain. (EPA 394,827; Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)). By IgG part Fusion proteins with disulfide-bonded dimer structures can also bind other molecules. In neutralization and neutralization, monomeric T1R receptor protein or protein May be more efficient than fragment alone (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958). -3964 (1995)). Vectors and host cells   The present invention also provides a vector comprising the polynucleotide of the present invention, a vector of the present invention. Host cells genetically engineered with, and recombinant polypeptides of the invention Regarding generation.   A host cell is a vector of the present invention (for example, a cloning vector or Can be an expression vector using genetic engineering (transduction, transformation, or Transfected). Vectors include, for example, plasmids, viral particles, It can be a form such as a phage. The engineered host cell activates the promoter Modified as appropriate for selection of transformants, or amplification of nucleic acid sequences of the invention. Can be cultivated in conventional nutrient media. Culture conditions (eg, temperature, pH, etc.) Culture conditions previously used for the host cell selected for expression, And will be apparent to those skilled in the art.   The polynucleotides of the present invention can be used to produce polypeptides by recombinant techniques. Can be used for Thus, for example, a polynucleotide expresses a polypeptide To be included in any one of various expression vectors. Vector like this Are the chromosomal, non-chromosomal, and synthetic DNA sequences (eg, SV40 Derivatives; bacterial plasmids; phage DNA; baculovirus; yeast plasmids; Plasmid and phage DNA, viral DNA (eg, vaccinia virus, adeno Virus, fowlpox virus, and pseudorabies virus) ). However, any other vector can replicate in the host It can be used as long as it is viable.   The appropriate DNA sequence can be inserted into the vector by various procedures. In general, D The NA sequence is placed in an appropriate restriction endonuclease site by procedures known in the art. Inserted into Such and other procedures are deemed to be within the purview of those skilled in the art. Can be   The DNA sequence in the expression vector contains appropriate expression control sequences (pro- Motor). Representative examples of such promoters In addition, the following may be mentioned: LTR or SV40 promoter, E. coli. coli. lac Or trp, lambda phage PLPromoter, prokaryotic or eukaryotic cell or Is another promoter known to regulate gene expression in those viruses . Expression vectors also provide a ribosome binding site for translation initiation and a transcription terminator. Including the Noether. The vector may also include appropriate sequences for amplifying expression. .   Further, the expression vector preferably contains one or more selectable marker genes. Phenotypic traits (eg, eukaryotic cell cultures) for selection of transformed host cells. Dihydrofolate reductase or neomycin resistance for nutrition, or even If E. E. coli (tetracycline resistance or ampicillin resistance) I do.   Appropriate DNA sequences as described above, as well as appropriate promoter or regulatory sequences Vector containing the protein to allow the host to express the protein. Can transform a severe host.   As representative examples of suitable hosts, the following may be mentioned: bacterial cells (eg For example, E, coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium); fungal cells (eg, , Yeast); insect cells (eg, Drosophila S2 and Spodoptera Sf9); Vesicles (eg, CHO, COS, or Bowes melanoma); adenovirus; plant cells, etc. . The selection of a suitable host is deemed to be within the skill of the art in light of the teachings herein. It is.   More particularly, the present invention also relates to one or more sequences as broadly described above. Including recombinant constructs. The construct is inserted with the sequence of the invention in a forward or reverse orientation (Eg, a plasmid or virus). Of this embodiment In a preferred aspect, the construct further comprises a regulatory sequence (eg, operably linked to the sequence). (Including linked promoters). Many suitable vectors and promoters These are known to those skilled in the art and are commercially available. The following vectors are examples Provided for Bacteria: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescrip t, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Strata gene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eukaryotic Products: pWLNE0, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pS VL (Pharmacia). However, if any other plasmid or vector It can be used as long as it is replicable and viable in the host.   The promoter region is CAT (chloramphenicol transferase) vector Any desired gene using a vector or other vector with a selectable marker. Can be selected from Two suitable vectors are pKK232-8 and pCM7. Especially life The named bacterial promoters are lacI, lacZ, T3, T7, gpL, λPR, PL, And trp including. Eukaryotic promoters include CMV immediate early, HSV thymidine kinase, early SV40 And late SV40, LTR from retrovirus, and mouse metallothionein- Including I. Selection of the appropriate vector and promoter is well within the level of ordinary skill in the art. In minutes.   In a further embodiment, the present invention relates to a host cell comprising the above-described construct. . The host cell can be a higher eukaryotic cell (eg, a mammalian cell) or a lower eukaryotic cell. Can be a cell (eg, a yeast cell) or the host cell is a prokaryotic cell (eg, For example, bacterial cells). Introduction of the construct into the host cell can be accomplished by using calcium phosphate Transfection, DEAE-Dextran-mediated transfection, or (Davis, L., Dibner, M., Battey, I.). , Basic Methods in Molecular Biology, (1986)).   The construct in the host cell is coded by the recombinant sequence using conventional techniques. Gene product to be generated. Alternatively, the polypeptides of the present invention can It can be produced synthetically by a peptide synthesizer.   Mature proteins can be used in mammalian cells, yeast, and bacteria under the control of appropriate promoters. , Or in other cells. Cell-free translation systems are also used to produce the DNA constructs of the present invention. Such proteins can be produced using RNA from the premises. Prokaryotic host Cloning and expression vectors suitable for use in and eukaryotic hosts include Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring. Harbor, N.Y., (1989), the disclosure of which is hereby incorporated by reference. Therefore, it is described.   Transcription of a DNA encoding a polypeptide of the present invention by higher eukaryotes may be a vector It is increased by inserting an enhancer sequence into the gene. The enhancer Cis-acting element of DNA that acts on the promoter to increase transcription of DNA And is usually about 10-300 bp. For example, on the late bp 100-270 on the origin of replication SV40 enhancer, cytomegalovirus early promoter enhancer, multiple Polyoma enhancer on the late side of the origin of origin and adenovirus enhancer -.   In general, recombinant expression vectors enable the origin of replication and the transformation of host cells. Selectable markers such as the ampicillin resistance gene of E. coli and S. cerevi siae TRP1 gene) and highly expressed genes that direct transcription of downstream structural sequences. Including the original promoter. Such promoters are, inter alia, glycolytic enzymes ( For example, 3-phosphoglycerate kinase (PGK)), α-factor, acid phosphatase Or an operon encoding a heat shock protein. Heterogeneous Structural sequences include translation initiation and termination sequences, and preferably, Leader sequence capable of directing secretion of translated protein into the luminal or extracellular medium And assembled at the appropriate stage. If necessary, the heterologous sequence can be modified as desired. Provide a signature (eg, stabilization or simplified purification of the expressed recombinant product). A fusion protein comprising the N-terminal identification peptide.   Expression vectors useful for bacterial use include structures encoding the desired protein. The DNA sequence is converted into a operable reading phase (r eading phase) with appropriate translation initiation and termination signals It is built by doing. The vector contains one or more phenotypic selectable markers and And maintain the vector in the host and, if desired, provide for amplification. Including the origin of replication. Prokaryotic hosts suitable for transformation include E. coli. coli, Bacillus su btilis, Salmonella typhimurium, and Pseudomonas, Streptmyces, And various species within the genus Staphylococcus, but other hosts are also a matter of choice. Can be used.   As a representative, but not limiting example, an expression vector useful for bacterial use. Is a gene element of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC 37017). And a selectable marker from a commercially available plasmid containing and a bacterial origin of replication. Such commercial vectors include, for example, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemica) ls, Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). No. These pBR322 "backbone" portions are compatible with a suitable promoter and to be expressed. Combined with the structural sequence.   After transformation of the appropriate host strain and propagation of the host strain to the appropriate cell density, The promoter in place by appropriate means (eg, temperature shift or chemical induction) Thus induced and the cells are cultured for an additional period.   Cells are harvested, typically by centrifugation, by physical or chemical means. And the resulting crude extract is maintained for further purification.   Microbial cells used in protein expression can be prepared by any conventional method (freezing). Destroyed by thawing cycles, ultrasound, mechanical disruption, or use of cell lysing agents) Such methods can be known to those skilled in the art.   Various mammalian culture systems can also be used to express the recombinant protein. You. Examples of mammalian expression systems are described by Gluzman, Cell 23: 175 (1981). COS-7 strain of monkey kidney fibroblasts and other cells capable of expressing compatible vectors Strains (eg, C127, 3T3, CHO, HeLa, and BHK cell lines). Feeding Product expression vectors contain an origin of replication, an appropriate promoter, and an enhancer. And, in addition, any necessary ribosome binding sites, polyadenylation sites, sp Rice donor and splice acceptor sites, transcription termination sequences, and Includes 5 'flanking non-transcribed sequences. DNA sequence and polyadenylation from SV40 splice The site may be used to provide the required non-transcribed genetic element.   The polypeptide of the present invention can be prepared by ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acidic extraction, anion extraction. Exchange or cation exchange chromatography, phosphocell Loose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity Chromatography, hydroxylapatite chromatography, and Recovered from recombinant cell culture by methods including Kuching chromatography and It can be purified. The protein refolding step, if necessary, Can be used in completing the configuration. Finally, high performance liquid chromatography Chromatography (HPLC) can be used for the final purification step. The present invention Lipids are naturally purified products or products of chemical synthesis procedures. Obtained or obtained from prokaryotic or eukaryotic hosts (e.g., bacteria, Produced by recombinant techniques from mother, higher plants, insects, and mammalian cells) Can be done. Depending on the host used in the recombinant production procedure, the polypeptides of the invention Peptides may be glycosylated or non-glycosylated. Book The polypeptides of the invention may also include an initial methionine amino acid residue.   Translated protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space, or into the extracellular environment Appropriate secretion signal is incorporated into the expressed polypeptide for secretion of Can be The signal may be endogenous to the polypeptide or Can be a heterologous signal.   The polypeptide can be expressed in a modified form (eg, a fusion protein), And it may contain not only secretion signals but also additional heterologous functional regions. example If, for example, regions of additional amino acids (especially charged amino acids) are Improves stability and persistence in host cells during subsequent handling and storage May be added to the polypeptide N-terminus. In addition, the peptide moiety Can be added to the polypeptide to facilitate its production. These areas are It can be removed before final preparation of the peptide. Notably, secretion or excretion To improve stability and to facilitate purification. The addition of peptide moieties to tides is well known in the art and is there. Preferred fusion proteins are immunoglobules useful for solubilizing proteins. Contains heterologous regions from phosphorus. For example, EP-A-0 464 533 (Canada correspondence, 2045869 ) Binds various parts of the constant region of the immunoglobulin molecule to another human protein or Disclosed are fusion proteins that include along with some of them. In many cases, fusion The Fc portion of the protein is completely advantageous for use in therapy and diagnostics And thus, for example, result in improved pharmacokinetic properties (EP-A 0232 262) . On the other hand, for some uses, the fusion protein is After expression, detection, and purification, it is desirable to be able to delete the Fc portion. this If the Fc portion is known to interfere with therapeutic and diagnostic uses, For example, when the fusion protein is to be used as an antigen for immunization. In drug development, for example, human proteins (eg, hIL-5) For the purpose of high-throughput screening assays to identify agonists It was fused with the Fc part. Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, 8: 52-58. (1995) and Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, 270 (160): 94. See 59-9471 (1995).   TR1 receptor protein is prepared by ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acidic extraction, Ion exchange or cation exchange chromatography, phospho Cellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity Tea chromatography, hydroxylapatite chromatography, and From recombinant cell culture by well-known methods, including lectin chromatography It can be recovered and purified. Most preferably, high performance liquid chromatography ("HP LC ”) is used for purification. The polypeptides of the present invention can be naturally purified Products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts For example, from bacteria, yeast, higher plants, insects, and mammalian cells) Includes products produced by technology. Hosts used in recombinant production procedures The polypeptides of the present invention may be glycosylated or It may be lycosylated. In addition, the polypeptides of the present invention may also In some cases, it may contain an initial modified methionine residue as a result of a host-mediated process. TR1 receptor: use for detection of disease states   The present invention provides that the TR1 receptor of the present invention binds to both TNF-α and TNF-β. Has a higher affinity for TNF-β. See FIG. TNF- β (a potent ligand of the TNF receptor protein) is involved in many biological processes. (Lymphocyte development, tumor necrosis, induction of antiviral status, activation of polymorphonuclear leukocytes, Induction of major histocompatibility complex antigen class I on skin cells, adhesion on endothelial cells (Including the induction of offspring and growth hormone stimulation) (Ru ddle and Homer, Prog. Allergy, 40: 162-182 (1988)). TR1 receptor of the present invention TNF-α is also a ligand for rapid tumor necrosis, immunostimulation, autoimmune diseases, Graft rejection, generation of antiviral response, septic shock, cerebral malaria, cytotoxicity Harmful effects of ionizing radiation produced during the course of sex, chemotherapy (eg Protection from elemental denaturation, lipid peroxidation, and DNA damage (Nata et al., J. Immunol. 1). 36 (7): 2483 (1987)), play a role in growth regulation, vascular endothelial effects, and metabolic effects. Reported to have. TNF-α is also a species in which endothelial cells promote cell proliferation. Triggers secretion of various factors, including PAI-1, IL-1, GM-CSF, and IL-6 You. In addition, TNF-α is used for various cell adhesion molecules (eg, E-selectin, ICAM-1, and And VCAM-1) are up-regulated. TNF-α and Fas ligand are also programmed Have been shown to induce severe cell death.   Certain tissues in a mammal having a particular cancer are identified in the corresponding "standard" mammal. (Ie, mammals of the same species without cancer) Encoding high levels of TR1 receptor protein and TR1 receptor protein MRNA may be expressed. For example, we consider osteosarcoma, ovarian cancer, Leukemia and emphysema cells express the TR1 receptor protein of the present invention I found that. In addition, because the protein is secreted, elevated levels of TR 1Receptor protein compared to serum from mammals of the same species without cancer If done, certain body fluids from mammals with cancer (eg, serum, plasma, urine, And spinal fluid). Therefore, the present invention And useful diagnostic methods during and possibly other disease states. This is Expression of the gene encoding the TR1 receptor protein in milk cells or body fluids Assay levels and gene expression levels to the standard TR1 receptor gene Comparison with the expression level, and thereby the level of gene expression relative to the standard. An increase or decrease indicates a particular tumor.   The present invention has been used as a prognostic indicator since lung And useful. This will help patients with increased TR1 receptor gene expression Obtain worse clinical results compared to patients expressing lower levels of the gene.   "Assay the expression level of the gene encoding the TR1 receptor protein The TR1 receptor protein in the first biological sample. MRNA levels encoding bell or TR1 receptor proteins can be measured directly (eg, For example, by measuring and evaluating absolute protein or mRNA levels ) Or indirectly (eg, a TR1 receptor in a second biological sample). Qualitative (either by comparing to protein level or mRNA level) It is intended to measure and evaluate quantitatively or quantitatively.   Preferably, the level of the TR1 receptor protein in the first biological sample , Or mRNA level, is the level of standard TR1 receptor protein, or mRNA Measured or evaluated relative to the level. Standards are obtained from individuals without cancer. From a second biological sample obtained. As understood in the art Once the level of the standard TR1 receptor protein or mRNA level is known, When done, it can be used repeatedly as a standard for comparison.   Depending on the "biological sample", an individual, body fluid, cell line, tissue culture, or Any organism obtained from other sources, including the TR1 receptor protein or mRNA A biological sample is intended. Biological samples contain secreted mature TR1 receptor -Mammalian body fluids containing proteins (eg, serum, plasma, urine, synovial fluid, and Fluid), and thymus, prostate, heart, placenta, muscle, liver, spleen, lung, kidney, And umbilical cord tissue. Methods for obtaining tissue biopsies and body fluids from mammals Well known in the field. Tissue biopsy is preferred if biological sample contains mRNA Source.   The invention is useful for detecting cancer and other disease states in mammals. For details, INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful for diagnosing cancer caused by proliferation of osteoblast lung cells. Implementation As described in Example 7, Northern blot analysis was performed in addition to a number of normal tissues. That osteoblastoma cells were found to express the TR1 receptor of the present invention. Show. This result indicates that synovial sarcoma cells produce detectable levels of TR1 receptor mRNA. Linked to the fact that the molecules provided by the invention Both detecting disease states and providing treatment for such conditions It may be useful for Preferred mammals include monkeys, apes and ne Ko, dog, cow, pig, horse, rabbit, and human. Especially preferred Is a human.   Total cellular RNA can be obtained by any suitable technique (eg, Chomczynski and Sacchi, Anal. B. iochem. 162: 156-159 (1987), one-step guanidine-thiocyanate Tri-phenol-chloroform method). You. The level of mRNA encoding the TR1 receptor protein is then Assays are performed using sophisticated methods. These were Northern blot analysis, S1 Peptide mapping, polymerase chain reaction (PCR), polymerase chain reaction Reverse transcription combined (RT-PCR) and reverse transcription combined with ligase chain reaction ( RT-LCR).   Northern blot analysis was performed as described in Example 7 below and Harada et al., Cell 63.303-312 ( 1990). Briefly, the total RNA is Prepared from biological samples. For Northern blots, RNA should be buffered appropriately Liquid (eg, glyoxal / dimethylsulfoxide / sodium phosphate buffer) ), Subjected to agarose gel electrophoresis, and Moved to the filter. After the RNA is bound to the filter by the UV linker, Filters include formamide, SSC, Denhardt's solution, denatured salmon sperm, SDS, Hybridization in solutions containing sodium and sodium phosphate buffers Is done. Any suitable method (eg,32P Multiprime DNA Labeling System (Amers ham)) is used as a probe. Used. After overnight hybridization, the filters are washed and X Exposure to line film. CDNA for use as a probe according to the invention is described above. And a length of at least 15 bp is preferred.   S1 mapping is as described in Fujita et al., Cell 49: 357-367 (1987). Can be performed. To prepare probe DNA for use in S1 mapping, The sense strand of the above cDNA is used as a template and labeled antisense DNA is synthesized. The antisense DNA is then replaced with the appropriate restriction endonuclease. To produce additional DNA probes of the desired length. this Such an antisense probe is used to target mRNA (ie, TR1 receptor protein). Useful for visualizing the protected band corresponding to the quality-encoding mRNA). You. Northern blot analysis can be performed as described above.   Preferably, the level of mRNA encoding the TR1 receptor protein is Et al., Using the RT-PCR method described in Technique 2: 295-301 (1990). It is done. According to this method, “amplico” in the polyacrylamide gel band was used. Radioactivity linearly correlates with the initial concentration of target mRNA. Briefly, this one The method uses a biological sample in a reaction mixture containing RT primers and an appropriate buffer. And adding the total RNA isolated from the DNA. Primer annealing After incubation for the mixture, the mixture was mixed with RT buffer, dNTP, DTT, RNase inhibitor. , And reverse transcriptase. Incubation to achieve reverse transcription of RNA After incubation, the RT product is then subjected to PCR using labeled primers. You. Alternatively, rather than labeling the primers, labeled dNTPs It can be included in a mixture. PCR amplification is performed in a DNA thermal cycler according to the prior art. Can be done. After the appropriate number of rounds to achieve amplification, the PCR reaction mixture is Electrophoresed on polyacrylamide gel. After the gel has dried, the appropriate band (TR 1) The radioactivity of (corresponding to the mRNA encoding the receptor protein) is analyzed by image analysis Quantified using a machine. RT and PCR reaction components and conditions, reagents and gels Concentrations, as well as labeling methods, are well known in the art. Variations of the RT-PCR method are available to those skilled in the art. it is obvious.   Set of any oligonucleotide primers to amplify the reverse transcribed target mRNA Can be used and can be designed as described in the section above.   Assays for TR1 receptor protein levels in biological samples This can be done using methods known in the art. Antibody-based technology is Preferred for assaying TR1 receptor protein levels in samples. An example For example, expression of the TR1 receptor protein in tissues is a traditional immunohistological approach. Can be studied by law. In these cases, specific recognition is based on the primary antibody (polyclonal or Is monoclonal), but the secondary detection system can be fluorescent, enzyme, or Other conjugated secondary antibodies may be utilized. As a result, tissue sections for pathology testing An immunohistological staining of the strip is obtained. Tissue can also be obtained by Western blot or G / slot assay (Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985); Jalkanen, M et al. Cell. Biol. 105: 3087-3096 (1987)) for the TR1 receptor For protein release, for example, extraction using urea and neutral detergent Can be done. In this technology, based on the use of a cationic solid phase, the TR1 receptor For protein quantification, the isolated TR1 receptor protein was used as a standard. Can be achieved. This technique can also be applied to body fluids. For these samples With regard to the molar concentration of the TR1 receptor protein, serum, plasma, urine, For such different body fluids, supplement the setting of the standard value of TR1 receptor protein content. Help. Next, the normal value of the amount of TR1 receptor protein is derived from a healthy individual. Values that can be compared to values obtained from the test subject. You.   Accordingly, from the above, the present invention provides an altered level of a soluble form of a polypeptide of the present invention. Further related to a diagnostic assay for detecting bells, where a host-derived sample Elevated levels are indicative of a particular disease.   Assays useful for detecting soluble receptor levels are well known to those of skill in the art. is there. For example, radioimmunoassay, competitive binding assay, western blot analysis , And preferably an ELISA assay may be used.   The EKISA assay initially comprises an antigen-specific antibody against the polypeptide of the invention. Preparing a body (preferably, a monoclonal antibody). In addition, Porter antibodies are prepared against monoclonal antibodies. Reporter antibodies , Radioactive substance, fluorescent substance, or horseradish peroxidase in this example A detectable reagent such as an enzyme is bound. Samples are taken here from the host Released on a solid support that binds to proteins in the sample (eg, poly Styrene dish). Then any on the dish Advantageous protein binding sites may include non-specific proteins (eg, bovine serum albumin). Covered by incubating with Then the monoclonal The present invention wherein the antibody is a monoclonal antibody bound to a polystyrene dish Incubate in the dish for a time to bind to any protein. all Any unbound monoclonal antibody is washed away with the buffer. Horseradish The reporter antibody bound to luoxidase is now placed in the dish, Reporter for any monoclonal antibody conjugated to a polypeptide of the invention -Resulting in antibody binding. Next, unbound reporter antibody is washed away. You. The peroxidase substrate is then added to the dish and for a predetermined time The amount of dye originated in a given volume of a patient's sample in a given volume compared to a standard curve The amount of the protein of interest present in the kit is measured.   A competition assay is used in which antibodies specific for a polypeptide of the invention are solid Bound to the support. Labeled TR1 receptor polypeptide, and host-derived Samples were passed over the solid support and the test bound to the solid support The amount of label issued can be correlated to the amount in the sample. Soluble form of the receptor Can also be used to identify agonists and antagonists.   Suitable enzyme labels, for example, catalyze the production of hydrogen peroxide by reaction with a substrate Including those from the oxidase group. Glucose oxidase is a good cheap Qualitative and its substrate (glucose) is readily available. Good. The activity of the oxidase label is formed by the enzyme-labeled antibody / substrate reaction. Can be assayed by measuring the concentration of hydrogen peroxide. In addition to enzymes , As other suitable labels, radioisotopes (eg, iodine (125I,121I), charcoal Element (14C), sulfur (35S), tritium (ThreeH), indium (112In), and technetium(99mTc)), and fluorescent labels (eg, fluorescein and Rhodamine) and biotin.   Determine TR1 receptor protein levels in biological samples obtained from individuals. In addition to analysis, TR1 receptor proteins can also be It can be detected in vivo. In vivo image analysis of TR1 receptor protein For detection by X-ray imaging, NMR, or ESR What can be issued. For radiography, detectable as an appropriate marker Barium, which emits useful radiation but is not obviously harmful to the subject Or a radioisotope such as cesium. Suitable for NMR and ESR Of the relevant hybridoma nutrients in the antibody Include those that have detectable characteristic rotation, such as deuterium .   Radioisotopes (for example,131I,112In,99mTc), radiopaque substrate, or Mark with a suitable detectable image analysis part, such as a substance detectable by nuclear magnetic resonance. Known TR1 receptor protein-specific antibodies or antibody fragments In the mammal being tested for cancer (eg, parenterally, subcutaneously, or intravenously). Inside) will be introduced. Depending on the size of the subject and the image analysis system used, The amount of image analysis needed to produce a diagnostic image may be determined Is understood in the art. In the case of radioisotopes, for human subjects, The amount of radioactivity injected is usually in the range of about 5-20 millicuries.99mTc. The labeled antibody or antibody fragment then contains the TR1 receptor protein Accumulates preferentially at cell locations. In vivo tumor image analysis is described in SW. Burchiel `` Immunopharmacokinetics of Radiolabelled Antibodies and Their Fragm ents "(Tumer Imaging Chapter 13: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. . Burchiel and B.A. Rhodes, Masson Publishing Inc. (1982)) ing.   An antibody specific for a TR1 receptor protein for use in the present invention comprises a complete TR1 receptor. Raised against a sceptor protein or an antigenic polypeptide fragment thereof Can be This may be with or without a carrier protein such as albumin. If it is long enough (at least about 25 amino acids), it can be used in animal systems (eg, (E.g., rabbit or mouse).   As used herein, the term "antibody" (Ab) or "monoclonal antibody" The “body” (Mab) is a complete molecule or molecule that can specifically bind to the TR1 receptor protein. And antibody fragments (eg, Fab and F (ab ')TwoIncluding fragments) Means that. Fab and F (ab ')TwoFragment is the Fc fragment of the complete antibody Depleted, more rapidly removed by circulation, and nonspecific Can have very little tissue binding (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). . Therefore, these fragments are preferred.   The antibodies of the present invention can be prepared by any of a variety of methods. For example, TR1 Cells expressing the puter protein or antigenic fragment thereof may be polyclonal. An animal can be administered to induce the production of serum containing null antibodies. Preferred method In a preparation of the TR1 receptor protein, it substantially eliminates natural contaminants. And purified. Such a preparation is then: Introduced into animals to produce polyclonal antisera of greater specific activity You.   In the most preferred method, the antibody of the present invention is a monoclonal antibody (or TR1 receptor protein binding fragment). Such a monochrome Null antibodies are obtained using hybridoma technology (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al. , Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al .: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y. , (1981) pp563-681). Generally, such a procedure is Scepter protein antigen, or more preferably, TR1 receptor protein expression Immunizing an animal (preferably a mouse) with the cells. Suitable cells are Can be recognized by their ability to bind anti-TR1 receptor protein antibodies . Such cells can be cultured in any suitable tissue culture medium; Supplemented with 10% fetal bovine serum (inactivated at about 56 ° C.), about 10 g / l of non-essential amino acids, Supplemented with about 1,000 U / ml penicillin and about 100 μg / ml streptomycin Preferably, the cells are cultured in Earle's modified Eagle's medium. Mouse like this Splenocytes are extracted and fused with a suitable myeloma cell line. Any suitable bone Myeloma cell lines can be used in accordance with the present invention; Parental myeloma cell line (SP) available from the Cell Collection, Rockville, MarylandTwoO ) Are preferably used. After the fusion, the obtained hybridoma cells were cultured in HAT medium. In Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (1981)). Cloned by limiting dilution as described in Then this Hybridoma cells obtained by such selection are used for TR1 receptor protein anti- Assays are made to identify clones secreting antibodies capable of binding to the original.   The technology described for the production of single-chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) Can be applied to produce single-chain antibodies to a light immunogenic polypeptide product You. Also, the transgenic mouse may be an immunogenic polypeptide product of the invention. Can be used to express humanized antibodies to   Alternatively, additional antibodies capable of binding to the TR1 receptor protein antigen It can be produced in a two-step procedure through the use of diotype antibodies. Such a method , The antibody uses the fact that it is itself an antigen, and thus binds to a secondary antibody Antibodies can be obtained. According to this method, the TR1 receptor protein The specific antibody is used to immunize an animal, preferably a mouse. Next so, The spleen cells of such animals are used to produce hybridoma cells, and Hybridoma cells have the ability to bind to TR1 receptor protein-specific antibodies Produce antibodies that can be blocked by the TR1 receptor protein antigen. Screened to identify the loan. Such antibodies are And anti-idiotype antibodies to the Immunize animals to induce the formation of specific TR1 receptor protein-specific antibodies Can be used to   Fab fragments and F (ab ') of the antibodies of the inventionTwoFragments and other flags It is recognized that the statement can be used in accordance with the methods disclosed herein. . Such fragments are typically prepared from papain (producing Fab fragments). Or pepsin (F (ab ')TwoYeast to produce fragments) Produced by proteolytic cleavage using an element. Alternatively, TR1 receptor Protein binding fragments can be obtained through the application of recombinant DNA technology or by synthetic chemistry. Can be generated through   Enhanced for diagnosis of tumors in humans using in vivo imaging When detecting high levels of TR1 receptor protein, a "humanized" chimeric monochrome It may be preferable to use a local antibody. Such an antibody is Produced using a genetic construct from a hybridoma cell producing a clonal antibody. Can be Methods for producing chimeric antibodies are known in the art. About the review Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4: 214 (1986). ; Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al., EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WO 8702671; Boulianne et al., Natur e 312: 643 (1984); Neuberger et al., Nature 314: 268 (1985).   Further suitable labels for the TR1 receptor protein-specific antibodies of the present invention are: Provided. Examples of suitable enzyme labels include malate dehydrogenase, staphyloco Cass nuclease, Δ-5-steroid isomerase, yeast alcohol dehydro Genase, α-glycerol phosphate dehydrogenase, triose phosphate isomer Rase, peroxidase, alkaline phosphatase, asparaginase, glue Course oxidase, β-galactosidase, ribonuclease, urease, Catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucoamylase, and And acetylcholinesterase.   Examples of suitable radioisotope labels areThreeH,111In,125I,131I,32P,35S,14 C,51Cr,57To,58Co,59Fe,75Se,152EU,90Y,67Cu,217Ci,211At,212pb ,47Sc,109Including Pd.111In and where in vivo imaging is used Are preferred isotopes. Because this is125I or131Model labeled with I This is because the problem of liver dehalogenation of noclonal antibodies is avoided. Further In addition, this radionucleotide is more favorable for gamma release for imaging. With an exit energy (Perkins et al., Eur. J. Nucl. Med. 10: 296-301 (1985); Car asquillo et al. Nucl. Med. 28: 281-287 (1987)). For example, 1- (p-isothiocyan Benzyl) -DPTA coupled to monoclonal antibody111In Showed little uptake in non-neoplastic tissues, especially the liver. Soy sauce And enhances the specificity of tumor localization (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28: 861-870 (19 87)).   Examples of suitable non-radioactive isotope labels include157Gd,55Mn,162Dy,52Tr, and56Fe Including.   Examples of suitable fluorescent labels are152Eu label, fluorescein label, isothiocyanate Label, rhodamine label, phycoerythrin label, phycocyanin label, aloph Lycocyanine labeling, o-phthaldehyde labeling, and fluorinated Includes resamine label.   Examples of suitable toxin labels include diphtheria toxin, ricin, and cholera toxin.   Examples of chemiluminescent labels are luminal label, isoluminal label, aromatic acridi Label, imidazole label, acridinium salt label, oxalate Includes Tel, Luciferin, Luciferase, and Aequorin labels No.   Examples of nuclear magnetic resonance contrast agents include heavy metal nuclei such as Gd, Mn, and iron. Including.   Representative techniques for coupling the above labels to antibodies are described in Kennedy et al., Clin. Chlm . Acta 70: 1-31 (1976) and Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81: 1-40 (1977) Provided. The coupling technique mentioned in the latter is glutaraldehyde. Method, periodate method, dimaleimide method, m-maleimidobenzyl-N-hydro Xy-succinimide ester methods, all of which are referred to herein. It is used as an idea. TR1 receptor: agonists and antagonists of TR1 receptor function Use for screening   In one aspect, the present invention relates to the activity of the TR1 receptor of the present invention (eg, Cell proliferation, hematopoietic development, apoptosis). Provides TR1 receptor-mediated signaling to cells that express a TR1 receptor polypeptide. Administering an effective amount of an agonist that is capable of increasing prognosis. Preferably, TR1 Receptor-mediated signaling is increased to treat disease.   In a further aspect, the present invention inhibits the activity of the TR1 receptor of the present invention This method is directed to cells expressing the TR1 receptor polypeptide. Administers an effective amount of an antagonist capable of reducing TR1 receptor-mediated signaling The step of performing Preferably, TR1 receptor-mediated signaling also Reduce to treat.   `` Agonist '' to enhance or enhance the activity of the TR1 receptor of the present invention The resulting naturally occurring and synthetic compounds are contemplated. "Antagonists '' Can inhibit the activity of the TR1 receptor, a naturally occurring compound and Synthetic compounds are contemplated. Any candidate "agonist" or "antha" of the invention The ability of a `` gonist '' to enhance or inhibit activity is determined by TR1 files known in the art. Millie ligand / receptor cell response assay (also described in more detail below) ).   Another approach is to transfer the labeled ligand to cells that have the receptor on the surface of the cell. By quantifying the inhibition of the binding of Screening for a compound that inhibits activation. Such a method is Are particularly useful for the TR1 receptor of the invention comprising a transmembrane amino acid sequence, and Eukaryotic cells are treated with receptors so that the cells express the receptor on the surface of the cells. Transfection with DNA coding for N Contacting the cell with the compound in the presence of the compound. The ligand is, for example, radioactivity Can be labeled by The amount of labeled ligand bound to the receptor, for example, It is determined by measuring the activity of the scepter. Label binding to receptor Where the compound binds to the receptor as determined by reduced ligand loss In this case, the binding of the labeled ligand to the receptor is inhibited.   Further Screening for Agonists and Antagonists of the Invention The assay is described in Tartaglia and Goeddel, J .; Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992 ).   Thus, in a further aspect, the candidate agonist or antagonist is TR1 Determining whether a cell response to a receptor ligand can be enhanced or inhibited A screening method is provided. This method uses the TR1 receptor polypeptide. Contacting cells expressing the cadmium with a candidate compound and a ligand; The cell response as well as the standard cellular response (the standard Assayed when contact with the ligand is made in the absence) And thereby increasing the cellular response above the standard, when the candidate compound is a ligand / Receptor signaling pathway agonist and ratio to standard A reduced cellular response, as compared to a candidate compound that has undergone ligand / receptor signaling. Is an antagonist of the tract. The step of assaying the cellular response To qualify cellular responses to candidate compounds and / or TR1 receptor ligands Or quantitatively (eg, an increase or decrease in T cell proliferation) Or to determine or evaluate tritiated thymidine label) . According to the present invention, cells expressing a TR1 receptor polypeptide can be endogenous or Can be contacted with a receptor ligand, either administered exogenously.   The agonist according to the present invention is, for example, a TNF family ligand peptide fragment. , Transforming growth factor β, neurotransmitters (eg, glutamate , Dopamine, N-methyl-D-aspartate), tumor suppressor (p53), cell lysis Degradable T cells and naturally occurring compounds and synthetic compounds such as antimetabolites Including things. Preferred agonists include, for example, cisplatin, doxorubicin, Omycin, cytosine arabinoside, nitrogen mustard, methotrexe ー And chemotherapeutic agents such as vincristine. The other is ethanol And β-amyloid peptide (Science 267: 1457-1458 (1995)). Even better Preferred agonists are polyclones raised against the TR1 receptor polypeptide. And monoclonal antibodies, or fragments thereof. TN Such agonistic antibodies raised against the F family receptors include Tarta glia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9292-9296 (1991); and Tartaglia and And Goeddel, J .; Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 (1992). PCT application W See also O 94/09137.   Antagonists according to the invention include, for example, CD40 ligand, neutral amino acids, zinc Estrogens, androgens, viral genes (eg, adenovirus ElB , Baculovirus p35 and LAP, cowpox virus crmA, Epstein-Berwi Luz BHRF1, LMP-1, African swine fever virus LMW5-HL, and herpes virus Γl 34.5), calpain inhibitor, cysteine protease inhibitor , And tumor promoters (eg, PMA, phenobarbital, and α-hex Including naturally occurring and synthetic compounds such as (sachlorocyclohexane). No. Other antagonists include TR1 receptor polypeptides or their flags. Polyclonal and monoclonal antagonis raised against Antibody. Such anant triggered against TNF family receptors Gonist antibodies are described in Tartaglia and Goeddel, J .; Biol. Chem. 267 (7): 4304-4307 ( 1992); and Tartaglia et al., Cell 73: 213-216 (1993). PCT application WO  See also 94/09317.   Other potential antagonists include antisense molecules. Antisense technique Surgery is via antisense DNA or RNA or via triple helix formation It can be used to control gene expression. Antisense technology is, for example, Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors  of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). Triple helix formation is described, for example, by Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Coone y et al., Science 241: 456 (1988); and Dervan et al., Science 251: 1360 (1991). Is considered. This method allows for the production of polynucleotides into complementary DNA or RNA. Based on otide linkage.   For example, the 5 'code of a polynucleotide encoding the mature polypeptide of the present invention. Portions design antisense RNA oligonucleotides about 10-40 base pairs in length Can be used to DNA oligonucleotides are the region of the gene involved in transcription Designed to be complementary to, thereby preventing transcription and production of the receptor I can. Antisense RNA oligonucleotides hybridize to mRNA in vivo And block translation of the mRNA molecule into the receptor polypeptide. The above e Ligonucleotides can also be delivered to cells so that the antisense RNA or DNA May be expressed in vivo to inhibit receptor production.   Further antagonists according to the invention are soluble TR1 receptor fragments. (Eg, containing a ligand binding domain from the extracellular region of a full-length receptor TR1 receptor fragment). Such a soluble form of the receptor is Can be naturally occurring or synthetic and bind to TNF family ligands Compete with cell surface morphology of TR1 receptor for Antagonizes signaling. Therefore, such antagonists are Includes a soluble form of the receptor that includes the ligand binding domain of the peptide.   As shown, the polyclonal and monoclonal antibodies of the present invention Gonists or antagonists are described in Tartaglia and Goeddel, J. Mol. Biol. Chem. Two 67 (7): 4304-4307 (1992); Tartaglia et al., Cell 73: 213-216 (1993), and PCT application W O 94/09137. Used herein The term `` antibody '' (Ab) or `` monoclonal antibody '' (mAb) as Compatible intact molecules and fragments thereof (eg, Fab and F (ab ' )TwoFragment). Fab and F (ab ')TwoThe fragment is Lacks the Fc fragment of the intact antibody, allowing faster clearance from circulation And may have less non-specific tissue binding of intact antibodies (Wahl et al. J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)).   Antibodies according to the present invention can be used in any of a variety of ways using the TR1 receptor immunogens of the present invention. Can be prepared by the method. As shown, such TR1 receptor immunogens A full-length TR1 receptor polypeptide (with or without a leader sequence) Also Good) and TR1 receptor polypeptide fragments (eg, ligand binding Domain, extracellular domain, and intracellular domain).   In a preferred method, the antibodies according to the invention are mAbs. Such mAbs are It can be prepared using hybridoma technology (Kohler and Millstein, Nature 256: 4 95-497 (1975) and U.S. Pat.No. 4,376,110; Harlow et al., Antibodies: A Laborator y Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1 988; Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological A nalyses, Plenum Press, New York, NY, 1980; Campbell, "Monoclonal Antibod y Technology ”, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biol ogy, Vol. 13 (ed. by Burdon et al.), Elsevier, Amsterdam (1984)).   Thymocytes that have been shown to express the TR1 receptor of the present invention are expanded For use in ligands for polypeptides of the invention, as well as potential Both potent agonists and antagonists can be identified. For example, thymocytes Separate from the tissue and grow in culture medium. DNA precursor (e.g. IfThreeIncorporation of H-thymidine or 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) Monitor as parameters for NA synthesis and cell growth. Brd in DNA U-incorporated cells are detected using a monoclonal antibody against BrdU, and Enzyme or fluorescent dye-conjugated secondary antibody. Reaction to fluorimetry Thus, or quantified by spectrophotometry. Two control wells and And set the experimental wells. TNF-β was added to all wells, while Add soluble receptor to experimental wells. The compounds to be screened Add to the experimental wells. Then, the compound to be screened is The ability to inhibit the interaction between the receptor polypeptide and TNF-β can be quantified. A In the case of gonists, the ability of the compound to enhance this interaction is quantified.   Ligands that are not known to be capable of binding to the polypeptides of the invention A determination can be made as to whether the polypeptide of the invention can bind to the polypeptide of the invention. Under conditions that allow binding of ligands known to bind peptides, A mammalian cell comprising an isolated molecule encoding a polypeptide of the invention may be designated as a ligand. Contacting, detecting the presence of any bound ligand, thereby Determining whether such a ligand binds to a polypeptide of the invention. Include. Also, soluble forms of the receptor may be utilized in the assays described above. . Here, the receptor is secreted into the extracellular medium and which is in soluble form It is contacted with a ligand to determine if it binds to the sceptor.   Other agonist and antagonist screening procedures are Providing appropriate cells for expression on the surface of the vesicle. Specifically, the present invention Transfect cells with a polynucleotide encoding the polypeptide of And thereby express the polypeptide. Such transfection Can be achieved by a procedure as described herein above.   Thus, for example, cells encoding the polypeptides of the present invention can By contacting both the compound and the compound to be screened, Such screens are used to screen for receptor antagonists. Say can be used. Inhibition of the signal produced by the ligand Are potential antagonists for the sceptor (ie, the activity of the receptor) Inhibition of the formation).   Proteins and other compounds that bind the TR1 receptor domain have also Akira is a candidate agonist and antagonist. Such a binding compound Can be "captured" using the yeast two-hybrid system (Fields and Song, Nature 340: 245-246 (1989)). The modified yeast two-hybrid system is Roge r Brent and coworkers (Gyuris et al., Cell 75: 791-803 ( 1993); Zervos et al., Cell 72: 223-232 (1993)). Briefly, TR1 receptor polypeptide The tide domain is used as a bait for the binding compound. Next Positives were selected by their ability to grow on plates lacking leucine, Has X-gal as described in great detail earlier (Gyuris et al., Supra). Further test for the ability to turn blue on the plate. Preferably, according to the invention Therefore, using the yeast two-hybrid system, Capture compounds that bind to either the main or TR1 receptor intracellular domain I do. Such compounds are good candidate agonists and antagonis of the present invention. It is. This system has previously been used in cells with p55 and p75 TNF receptors. Has been used to isolate proteins that bind to internal domains (WO 95/31544 ). Once the amino acid sequence that binds to the TR1 receptor has been identified, Using a gland cell proliferation assay, these sequences can be used as agonists or antagonists. One can screen for activity.   To identify agonists and antagonists of the TR1 receptor of the present invention Another assay that can be performed is then the binding affinity TR1 receptor and agonist Random that can be screened for both effects or antagonist effects Including the use of combinatorial chemistry to produce unique peptides. Recently, such assays One uses random peptides expressed on the surface of bacteriophage Has been implemented. Wu, Nature Biotechnology 14: 429-431. In this example, Phage display library that displays huge peptides on the surface of phage Was generated. The phages of this library are then injected into mice. Then, phage expressing peptides bound to various organs were identified. Next The DNA contained in the phage bound to the organs is sequenced and We have identified peptide motifs that can interact with the cell surface. Those skilled in the art Such random peptide libraries are also available on the surface of the TR1 receptor of the present invention. Recognize that one can screen for binding motifs. like that After identifying the motifs, these peptides are then converted to the assays described herein. Screening for agonist or antagonist activity using obtain.   Other screening techniques include cells expressing a polypeptide of the invention (eg, Caused by receptor activation of transfected CHO cells) A system for measuring extracellular pH change (for example, described in Science, 246: 181-296 (1989)) ). In another example, a potential agonist Alternatively, an antagonist can be contacted with a cell expressing the polypeptide of the invention, And measure the second messenger response (eg, signaling) to determine the potential One can determine whether an antagonist or agonist is effective.   TR1 receptor antagonists also bind to and occupy the TR1 receptor , Thereby rendering the receptor inaccessible to the ligand that binds to it, Includes small molecules that interfere with normal biological activity. Examples of small molecules are small peptides Ma Or peptide-like molecules, but is not limited thereto.   Using TR1 receptor agonists, ligand activity (eg, inhibition of tumor growth) , And necrosis of certain implantable tumors). Also, using an agonist To stimulate cell differentiation (eg, differentiation of T cells, fibroblasts, and hematopoietic cells) obtain. Agonists for the TR1 receptor also protect the host against microorganisms. May increase the role of TR1 in related diseases (L. monocytogenes Infections such as staining) and Chlamidiae. Also, using an agonist, The detrimental effects of ionizing radiation produced during the course of radiation therapy (eg, enzyme denaturation, Lipid peroxidation, and DNA damage).   In addition, agonists are used to mediate antiviral responses, regulate proliferation, and It can mediate the response and treat immunodeficiencies associated with diseases such as HIV.   Using antagonists to the TR1 receptor, autoimmune diseases (eg, To treat host graft reactions, and allograft rejection, and T-cell mediated autoimmune disease) Can be placed. T cell proliferation has been shown to be stimulated through type 2 TNF receptor I have. Thus, antagonizing the receptor impedes T cell proliferation and reduces T cell proliferation. Vesicle-mediated autoimmune diseases can be treated.   Also, using antagonists, viral infections, rheumatoid arthritis, systemic For diseases such as lupus erythematosus, insulin-dependent diabetes, and graft rejection May interfere with underlying apoptosis. Similarly, cytotoxicity using antagonists May interfere with sex.   It is also stimulated by TR1 using an antagonist to the TR1 receptor. B cell carcinomas can be treated.   In addition, by using antagonists for TR1 receptor, Can be treated and / or prevented. Septic shock Not directly from the pathogen but by protein factors such as TNF and IL-1 Resulting from a worsened host response. For example, lipopolysaccharide is Has been shown to induce the release of TNF leading to a strong and transient increase in its serum concentration ing. TNF causes shock and tissue damage when administered in excess Rub Therefore, antagonists to the TR1 receptor block the action of TNF And And it is thought to treat / prevent septic shock. Also these anta Using gonists to increase meningococcal bacteremia in children correlates with high serum levels of TNF Can be treated.   Among other disorders that can be treated by antagonists to the TR1 receptor , Inflammation mediated by TNF receptor ligands, and bacterial infectious cachexia And cerebral malaria. Also, using a TR1 receptor antagonist Can treat inflammation mediated by ligands for receptors such as TNF You. In addition, TR1 receptors also indicate that TNF-β is involved in lymphocyte development. In that regard, it may be useful to provide treatment for AIDS. Therapeutic agent: mode of administration   Soluble TR1 receptors and agonists and antagonists Can be used in combination with a biological carrier. Such a composition may comprise a therapeutically effective amount Soluble receptors or agonists or antagonists of Includes an acceptable carrier or excipient. Such carriers include saline, Buffered saline, dextrose, water, glycerol, ethanol, and Including but not limited to these combinations. The formulation is adapted to the mode of administration Should.   The invention also relates to one or more components filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the invention. A pharmaceutical pack or kit comprising the container of Along with such containers, Regulated by the governmental authority governing the manufacture, use or sale of a drug or biological product. May include a written notice in the form of Or the approval of the agency of sale. Further, the receptor of the present invention And soluble forms of the agonists and antagonists are also compatible with other therapeutic compounds. Can be used together.   Pharmaceutical compositions may be orally, topically, intravenously, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, intranasally, or dermally. It may be administered in a convenient manner, such as by an internal route. Pharmaceutical compositions may have certain indications Is administered in an amount effective for treatment and / or prevention of In general, these Doses of about 10 μg / kg body weight, and in most cases, about 8 mg / day / Kg dose not to exceed body weight. In most cases, the dosage will depend on the route of administration, The dose is about 10 μg / kg to about 1 mg / kg body weight per day in consideration of symptoms and the like.   The TR1 receptor polypeptide may also be suitably administered by a sustained release system. You. Suitable examples of sustained release compositions include those in the form of a shaped article (eg, a film or a matrix). Microcapsules). Sustained release matrix Are polylactide (US Pat. No. 3,773,919, EP 58,481), L-glutamic acid and And copolymers of gamma-ethyl-L-glutamic acid (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-5 56 (1983)), poly (2-hydroxyethyl methacrylate) (Langer et al., J. Biome. d. Mater. Res. 15: 167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982) ), Ethylene vinyl acetate (Langer et al., Ibid.) Or poly-D-(-)-3-hydro Contains xybutyric acid (EP 133,988). The sustained release TR1 receptor polypeptide composition comprises It also includes the TR1 receptor polypeptide captured by the liposome. TR1 receptor Liposomes containing polypeptides are prepared by methods known per se. DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 ( 1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4030-4034 (1980); EP 50,3 EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,161; Japanese Patent Application 83-118008. U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and EP 102,324. Normal, Liposomes are small (about 200-800 angstroms) unilamellar type , The lipid content is more than about 30mol% cholesterol, and the proportion selected is the optimal TR1 Tailored for receptor polypeptide therapy.   For parenteral administration, in one embodiment, the TR1 receptor polypeptide comprises: In a unit dose injectable form (solution, suspension, or emulsion), it can be purified to the desired purity. In a pharmaceutically acceptable carrier (ie, the dosage and concentration used). Non-toxic to the pient and compatible with the other ingredients of the formulation) It is generally prescribed by: For example, the formulation preferably includes an oxidizing agent and And other compounds known to be harmful to polypeptides.   Generally, the formulation will provide a uniform and dense TR1 receptor polypeptide in a liquid carrier Or prepared by contacting with a finely divided solid carrier or both It is. The product is then shaped, if necessary, into the desired formulation. Preferably, the key Carrier is a parenteral carrier, and more preferably isotonic with the blood of the recipient. Solution. Examples of such carrier vehicles are water, saline, Ringe Solution, and dextrose solution. Non-aqueous vehicles such as fixed oils And ethyl oleate) are also useful herein, as are liposomes. .   Carriers may contain trace amounts of additives (eg, those that enhance isotonicity and chemical stability). Quality). It is non-toxic to recipients at the dosages and concentrations Acids, citric acid, succinic acid, acetic acid, and other organic acids or their salts; antioxidants Agents (eg, ascorbic acid); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides (eg, For example, polyarginine or tripeptide); proteins (eg, serum albumin) Hydrophilic polymers (eg, polyvinyl, gelatin, or immunoglobulins); Pyrrolidone); amino acids (eg, glycine, glutamic acid, aspartic acid, Or arginine); monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates (cellulose and Derivatives thereof, including glucose, mannose, or dextrin); chelates Agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol) ); Counterions (eg, sodium); and / or nonionic surfactants Agent (eg, polysorbate, poloxamer, or PEG) or Include.   The TR1 receptor polypeptide is typically about 0.1 mg / ml to 100 mg / ml, preferably Or at a concentration of 1-10 mg / ml, at a pH of about 3-8, in such a vehicle. It is. The use of certain excipients, carriers, or stabilizers described above may It is understood that this results in the formation of polypeptide salts.   TR1 receptor polypeptides used for therapeutic administration must be sterile No. Sterility is achieved by filtration through a sterile filtration membrane (eg, a 0.2 micron membrane). Easily achieved. Therapeutic TR1 receptor polypeptide compositions are generally sterile It has a container with an access port, for example, a stopper that can be punctured by a hypodermic injection needle. Placed in an intravenous solution bag or vial.   TR1 receptor polypeptide is usually a unit or multi-dose container, for example, Aqueous solutions or lyophilized formulations for reconstitution in sealed ampoules or vials Stored. As an example of a lyophilized formulation, a 10 ml vial is sterile filtered to 5 ml. Filled with 1% (w / w) aqueous TR1 receptor polypeptide solution and the resulting mixture Lyophilize the material. Injection solution using bacteriostatic water for injection (Water-For-Injection) To reconstitute the lyophilized TR1 receptor polypeptide.   The invention also relates to one or more components filled with one or more components of the pharmaceutical composition of the invention. A pharmaceutical pack or kit comprising the container of Along with such containers, Regulated by governmental agencies that govern the manufacture, use or sale of pharmaceuticals or biological products. May include a written notice in the form of Or the approval of the agency of sale. Further, the polypeptide of the present invention Can be used with other therapeutic compounds.   TR1 receptor and agonists and antagonists (these are polypep Are also expressed in vivo (often by (Referred to as "gene therapy").   Thus, for example, cells from a patient may encode a polypeptide ex vivo. Can be manipulated using polynucleotides (DNA or RNA) The polypeptide is then provided to the patient to be treated. Such a method It is well known in the art. For example, a cell may be an RN encoding a polypeptide of the invention. Operated by procedures known in the art by use of retroviral particles containing A Can be done.   Similarly, cells may be transformed in vivo by, for example, procedures known in the art. It can be manipulated in vivo for expression of the peptide. As is known in the art, Producing retroviral particles containing RNA encoding a polypeptide of the invention Producer cells for in vivo manipulation of cells and in vivo poly It can be administered to a patient for expression of the peptide. By such a method, the po These and other methods for administering a polypeptide are described in the art from the teachings of the present invention. Should be evident to others. For example, expression vehicles for cell manipulation are retro Non-viral (eg, cells in vivo after combination with a suitable delivery vehicle) Adenovirus that can be used for the operation of   The retrovirus from which the retroviral plasmid vector described above can be derived Lus, Moloney mouse leukemia virus, spleen necrosis virus, retrovirus (Eg, Rous sarcoma virus), Harvey sarcoma virus, avian leukemia virus , Gibbon leukemia virus, human immunodeficiency virus, adenovirus, bone marrow augmentation Sarcoma virus (Myeloproliferative Sarcoma Virus) and breast cancer virus Including, but not limited to. In one embodiment, the retrovirus plus The mid vector is derived from Moloney murine leukemia virus.   Vectors include one or more promoters. Suitable promoters that can be used -: Retrovirus LTR; SV40 promoter; Miller et al., Biotechniques, 7 (9) : 980-990 (1989), the human cytomegalovirus (CMV) promoter, Can be any other promoter (eg, a cell promoter such as a eukaryotic cell promoter). Motors (including histone, pol III, and β-actin promoters But not limited to them). Other viral promoters that can be used are adenovirus Promoter, thymidine kinase (TK) promoter, and B19 parbowie Including but not limited to the Ruth promoter. Choosing the right promoter , Will be apparent to those skilled in the art from the teachings contained herein.   The nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention may be under the control of a suitable promoter. It is in. Suitable promoters that can be used include adenovirus promoters (eg, For example, the adenovirus major late promoter); or a heterologous promoter (eg, For example, cytomegalovirus (CMV) promoter; RS virus (RSV) promoter Inducible promoters (eg, MMT promoter, metallothionein promoter; Heat shock promoter; albumin promoter; ApoAI promoter Human globin promoter; viral thymidine kinase promoter (eg For example, herpes simplex thymidine kinase promoter); retroviral LTR (this The modified retrovirus LTR described above in the specification); β-actin promoter; And the human growth hormone promoter. Promo Also provide native promoters that control the gene encoding the polypeptide. Can be   Retroviral plasmid vector transduces packaging cell line Can be used to form producer cell lines. Can be transfected Examples of packaging cell lines include PE501, PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X, Including VT-19-17-H2, ΨCRE, ΨCRIP, GP + E-86, GP + envAm12, and DAN cell lines But not limited thereto (Miller, Human Gene Therapy 1: 5-14 (1990), This reference is incorporated by reference herein in its entirety). Vector The packaging cells can be transduced by any means known in the art. This Means such as electroporation, the use of liposomes, and CaPOFourSinking Including but not limited to lees. In one alternative, Retrovirus Plus The mid vector can be encapsulated in a liposome or attached to a lipid. And can then be administered to a host.   The producer cell line is an infectious agent that contains a nucleic acid sequence encoding a polypeptide. Generate torovirus vector particles. Then, such a retroviral vector Tar particles transduce eukaryotic cells either in vivo or in vitro Can be used to A transduced eukaryotic cell is a nucleus that encodes a polypeptide. Express the acid sequence. Eukaryotic cells that can be transduced include embryonic stem cells, embryonic cancer cells, and the like. Hebipoietic stem cells, hepatocytes, fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells , And bronchial epithelial cells. Chromosome assay   The sequences of the present invention are also useful for chromosome identification. Sequences are specifically targeted And can hybridize to specific locations on individual human chromosomes. further Currently, there is a need to identify specific sites on a chromosome. At the moment, actually Most chromosome marker reagents based on sequence data (repeated polymorphisms) Not available for marker placement. DNA to chromosome according to the present invention Mapping is the process of correlating those sequences with disease-related genes. This is an important first step.   Briefly, the sequence consists of a PCR primer (preferably 15-25 bp) from the cDNA. By preparation, it can be mapped to a chromosome. 3 'untranslated domain computer Analysis does not span more than one exon in genomic DNA, and therefore Used to rapidly select primers that do not complicate the amplification process. Next These primers are used for somatic cell hybrids containing individual human chromosomes. Used for PCR screening. The human gene corresponding to the primer Only those hybrids that contain will give rise to amplified fragments.   PCR mapping of somatic hybrids assigns specific DNA to specific chromosomes A quick procedure for The invention with the same oligonucleotide primer Using finer sublocations, in a similar manner, specific chromosomes Achieved by a panel of derived fragments or a pool of large genomic clones Can be done. Other mappings that can also be used to map to that chromosome Strategies include in situ hybridization, labeled flow-selected chromosomes Pre-screening and construction of chromosome-specific cDNA libraries Preselection by hybridization.   Fluorescence in situ hybridization of cDNA clones to metaphase chromosomal spread (FISH) can be used to provide accurate chromosomal location in one step. this The technique can be used with cDNAs as short as 50 or 60 bases. Overview of this technology For details, see Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Per. See gamon Press, New York (1988).   For example, we mapped the native TR1 gene at chromosome region 8q23-24.1. did.   Once a sequence has been mapped to the exact chromosomal location, the physical Location can be correlated with genetic map data. Such data is For example, V. McKusick, Mendelian Inheritence in Man (Johns Hopkins Universit y available online from the Welch Medical Library). The association between the gene mapped to the same chromosomal region and the disease is then analyzed by linkage analysis. (Co-inheritance of physically adjacent genes).   Next, the differences in the cDNA or genomic sequence between affected and unaffected individuals were determined. It is necessary to decide. The mutation is found in some or all of the affected individuals Mutation, but not found in any of the normal individuals, the mutation is likely to be a causative agent of the disease. It is.   At the current resolution of physical and genetic mapping techniques, The cDNA, which is precisely located in the contiguous chromosomal region, is between 50 and 500 potential causative genes. There can be one. (This is one megabase mapping resolution and one residue per 20 kb. It is assumed to be a gene. )   The present invention is further described with reference to the following examples. However, the present invention It should be understood that the present invention is not limited to a specific embodiment. All parts or quantities are other Unless otherwise specified on a weight basis.   To facilitate understanding of the following examples, certain frequently occurring methods and / or Or describe the term.   “Plasmids” are preceded by a lowercase p and / or an uppercase letter and / or Are referred to numerically. The starting plasmids herein are either commercially available or unregulated. Plasmids that are publicly available without further notice or that are available in accordance with published procedures Can be built from In addition, plasmids equivalent to those described are described in the art. And will be apparent to those skilled in the art.   "Digestion" of DNA is the digestion of DNA with restriction enzymes that act only on specific sequences in the DNA. Refers to catalytic cleavage. The various restriction enzymes used herein are commercially available, And their reaction conditions, cofactors, and other requirements are known to those skilled in the art. Used as follows. For analytical purposes, typically 1 μg of plasmid or DNA The fragment is used with about 2 units of enzyme in about 20 μl of buffer solution. Plasmi For the purpose of isolating DNA fragments for Digest 5-50 μg DNA in volume with 20-250 units of enzyme. For certain restriction enzymes Suitable buffers and substrate amounts for are specified by the manufacturer. About 1 hour at 37 ° C Incubation times are usually used, but vary according to the supplier's instructions. obtain. After digestion, the reaction was run on polyacrylic acid to isolate the desired fragment. Perform electrophoresis directly on an amide gel.   Size separation of the cleaved fragments is described by Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: Performed using 8% polyacrylamide gel as described by 4057 (1980).   An "oligonucleotide" is a single standard polydeoxynucleotide chain or Refers to either of two complementary polydeoxynucleotide chains. These are Can be chemically synthesized. Such synthetic oligonucleotides do not have a 5 'phosphate Therefore, unless phosphate is added to ATP in the presence of kinase, another Go Does not link to nucleotides. Synthetic oligonucleotides are not dephosphorylated. Ligation to no fragment.   "Ligation" forms a phosphodiester bond between two double-stranded nucleic acid fragments. Process. Unless otherwise provided, ligation is performed on DNA fragments that can be 10 units of T4 DNA ligase per 0.5 μg ("ligase ") And known buffers and conditions.   Unless otherwise indicated, transformation was performed using Graham and Van der, Virology, 52: 456-. 457 (1973).                                 Example 1 Bacterial expression and purification of TR1 receptor   A DNA sequence encoding the TR1 receptor, ATCC Deposit No. 75899, 5 'of the labeled TR1 receptor nucleic acid sequence (reducing the signal peptide sequence) and First amplify using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 3 'terminal sequence Was. Additional nucleotides corresponding to the terminal TR1 receptor gene are each 5 ′ And added to the 3 'sequence. The 5 'oligonucleotide primer is 5' GCCAGAGGA Has the sequence TCCGAAACGTTTCCTCCAAAGTAC 3 '(SEQ ID NO: 6) and Includes elementary parts (bold). 3 'sequence 5' CGGCTTCTAGAATTACCTATCATTTCTAAAAAT 3 '(location Column no. 7) contains the sequence complementary to the HindIII site (bold) and Followed by the 18 nucleotides of the scepter (FIG. 2). Restriction enzyme sites are used for bacterial expression vectors -Corresponds to the restriction enzyme site of pQE-9 (Qiagen Inc. Chatsworth, CA). pQE-9 is Antibiotic resistance (Ampr), Bacterial origin of replication (ori), IPTG regulatable promoter operation (P / O), ribosome binding site (RBS), 6-His tag, and restriction enzyme Code the place. Then, pQE-9 is digested with BamHI and XbaI. Amplified sequence Ligated into pQE-9 and inflation into the sequence encoding the histidine tag and RBS. Into the room. The ligation mixture was then used to prepare the Sambrook et al., Molecular Clon ing: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989) E. coli strain M15 / rep4 (Qiagen, Inc.) according to the procedure described. M15 / rep4 is , Containing multiple copies of plasmid pREP4, which harbors the lacI repressor. Expressed and also kanamycin resistant (Kanr). Transformants are transformed into LB Identified by their ability to grow on plates, and ampicillin / kanama Select Isin resistant colonies. Isolate plasmid DNA for restriction analysis Check more. Clones containing the desired constructs are removed overnight (O / N), Amp (100 μg / ml) And grown in liquid culture in LB medium supplemented with both Kan (25 μg / ml). O / N The culture is used to inoculate a large culture at a ratio of 1: 100 to 1: 250. Cells at 0.4 and 0.6 Absorbance at 600 nm ("O.D.600"). Next, IPTG Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside) to a final concentration of 1 mM. IPTG Induces the release of P / O by inactivating the lacI repressor. , Leading to increased gene expression. Cells were incubated for an additional 3-4 hours. Then The cells are harvested by centrifugation. The cell pellet is treated with the chaotropic agent 6 Solubilize in molar guanidine HCl. After clarification, the dissolved TR1 receptor Chromatography on a nickel chelate column revealed that the Purify from this solution under conditions that allow tight binding by the protein (Hochul i et al., J. Chromatography 411: 177-184 (1984)). 6 TR1 receptors (90% pure) Elution from the column in molar guanidine HCl pH 5.0 and for regeneration purposes 3 Molar guanidine HCl, 100 mM sodium phosphate, 10 mM glutathione (reduced) and And 2 mM glutathione (oxidized). Incubate for 12 hours in this solution After the solution, the protein is dialyzed against 10 mM sodium phosphate.                                 Example 2 Native and carboxy-terminal modified TR1 receptor using baculovirus expression system Cloning and expression of putters   DNA sequence encoding full-length native TR1 receptor protein, ATCC accession number No. 75899, the PCR oligonucleotides corresponding to the 5 ′ and 3 ′ sequences of this gene Amplify using primers: The 5 'primer has the sequence 5'cgc GGA TCC gccatc ATGAACAAGTTGCTGTG 3 ′ (SEQ ID NO: 8), which is a BamHI restriction site followed by The first 17 base pairs of the sequence of the native TR1 receptor encoding the sequence in FIG. including.   The 3 'primer has the sequence 5'cgc GGT ACC CAATTGTGAGGAAACAG 3' (SEQ ID NO: 9) This is the Asp718 restriction site, followed by the opposite orientation, 1270-1286 in FIG. And a sequence complementary to   For the carboxy-terminal modified TR receptor, the 5 'primer has the sequence 5'GCGCGGAT CCATGAACAAGTTGCTGTGCTGC 3 ′ (SEQ ID NO: 10), which contains the BamHI restriction enzyme Position (bold), and this site is the modified TR1 receptor gene shown in FIG. Immediately before the first 21 nucleotides (underline translation initiation codon "ATG") .   The 3 'primer has the sequence 5'GCGCTCTAGATTACCTATCATTTCTAAAAATAAC 3' (SEQ ID NO: 11) and has the restriction endonuclease XbaI cleavage site and is shown in FIG. 21 nucleotides complementary to the 3 'sequence of the modified TR1 receptor gene.   The amplified modified TR1 receptor sequence was converted to a commercially available kit (“Geneclean” BIO101). Inc., La Jolla, Ca.) from a 1% agarose gel. Then, Digested with the endoendonucleases BamHI and XbaI, then Purified again on a% agarose gel. This fragment is named F2.   The vector pRG1 (a modified version of the pVL941 vector, described below) was Used for expression of the protein using the baculovirus expression system. Are described in Summers and Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletln No. 1555 (1987)). This expression vector is Strong polyhedrin promoter of Californica nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) , Followed by recognition sites for the restriction endonucleases BamHI and XbaI. Stain The polyadenylation site of an virus 40 (SV40) is used for efficient polyadenylation. Used for For easy selection of recombinant viruses, β-galactosidase from E. coli Polyhedrin followed by polyadenylation signal of polyhedrin gene Inserted in the same direction as the promoter. The polyhedrin sequence is Virus sequences for cell-mediated homologous recombination with the isolated wild-type viral DNA. Adjacent to the edge. Many other baculovirus vectors (eg, pAc373, pVL9 41, and pAcIM1) can be used instead of pRG1 (Luckow and Summers, V irol ogy, 170.31-39).   The plasmid was digested with restriction enzymes BamHI and XbaI. Then, a commercially available kit (" Geneclean ”BIO 101 Inc., La Jolla, Ca). Isolated. This vector DNA is designated as V2.   Fragment F2 and dephosphorylated plasmid V2 were ligated with T4 DNA ligase . E. coli HB101 cells are then transformed and using enzymes BamHI and XbaI Containing a plasmid having a TR1 receptor gene (pBac TR1 receptor) Was identified. The sequence of the cloned fragment was confirmed by DNA sequencing.   5 μg of plasmid pBacTR1 receptor was ligated using the lipofetation method (Felgner et al., Proc. . Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)) to obtain 1.0 μg of a commercially available straight line. Baculovirus ("BaculoGoldTMbaculovirus DNA ", Pharmingen, San Di ego, CA.).   1 μg BaculoGoldTMViral DNA and 5 μg of plasmid pBacTR1 receptor , 50 μl serum-free Grace's medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) Were mixed in sterile wells of a microtiter plate containing Then 10 μl Add Lipofectin and 90 μl Grace's medium, mix, and add Incubated for 5 minutes. The transfection mixture is then Sf9 insect cells seeded in a 35 mm tissue culture plate with 1 ml of clear Grace's medium ( ATCC CRL 1711). Plate to mix newly added solution Was shaken back and forth. The plate was then incubated at 27 C for 5 hours. Five After time, the transfection solution is removed from the plate and 10% fetal calf 1 ml of Grace's insect medium supplemented with serum was added. Plate incubator And the culture was continued at 27 ° C. for 4 days.   After 4 days, the supernatant is collected and as described by Summers and Smith (supra) A plaque assay was performed. As a modification, the blue stained plaques "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) , MD) was used. (Detailed description of "plaque assay" Insect cell culture and distribution from Life Technologies Inc., Gaithersburg. And can also be found in the Baculovirology User's Guide (pages 9-10) ).   Four days after serial dilution, virus was added to cells and blue-stained plaques Was picked up with the tip of an Eppendorf pipette. Then the cold containing the recombinant virus The supernatant was resuspended in an Eppendorf tube containing 200 μl Grace's medium. Cold The sky is removed by brief centrifugation and containing the recombinant baculovirus. Sf9 cells seeded on a 35 mm dish were infected with Qi, and 4 days later, these Culture dish supernatants were collected and then they were stored at 4 ° C.   Sf9 cells were grown in Grace's medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. Cells Infected with recombinant baculovirus V-TR1 receptor at a multiplicity of infection ("MOI") of 2 I let it. After 6 hours, the medium was removed and methionine and cysteine were removed. SF900 II medium (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 After hours, 5μCi35S-methionine and 5 μCi35S-cysteine (Amersham) Was added. Incubate the cells for a further 16 hours, then centrifuge the cells Collect and label proteins on SDS-PAGE and autoradiography Was visualized.                                 Example 3 Cloning and expression in mammalian cells   Transient expression of TR1 receptor protein gene sequence in mammalian cells Most of the vectors used should have the SV40 origin of replication. this thing Are cells expressing T antigen required for initiation of viral DNA synthesis (eg, COS cells) Enables the replication of high copy number vectors. Any other mammalian cells Strains can also be used for this purpose.   A typical mammalian expression vector is a promoter element (an mRNA transcription opener). Mediating initiation), protein coding sequences, and termination of transcription and transcription of transcripts. Contains signals required for liadenylation. A further element is Enhan , Kozak sequences, and donor sites and accessories for RNA splicing. Intervening sequences adjacent to the puter site are included. Very efficient transcription from SV40 Early and late promoters, long terminal repeats (LTRs) from retroviruses (eg For example, the early promoters of RSV, HTLVI, HIVI) and cytomegalovirus (CMV) Can be achieved with data. However, cellular signals can also be used (eg, human Actin promoter). Suitable expression vectors for use in the practice of the present invention For example, pSVL and pMSG (Pharmacia, Uppsala, Sweden), pRSVcat (ATC C37152), pSV2dhfr (ATCC 37146), and pBC12MI (ATCC 67109) Vector. Mammalian host cells that can be used include human Hela, 28 3, H9 and Jurkat cells, mouse NIH3T3 and C127 cells, Cos1, Cos7 and CV1, African green monkey cells, quail QC1-3 cells, mouse L cells, and Chinese Hamster ovary cells.   Alternatively, the gene is transferred to a stable cell line containing the gene, which integrates into the chromosome. Can be expressed in Selectable markers (eg, dhfr, gpt, neomycin, high Co-transfection with glomycin) identifies transfected cells And allows for isolation.   Transfected genes can also be amplified to encode large amounts of encoded protein. Can be expressed. DHFR (dihydrofolate reductase) contains hundreds of genes of interest Or a marker useful for developing cell lines with thousands of copies. Another A useful selectable marker for is the enzyme glutamine synthase (GS) (Murphy et al., Biochem J. 227: 277-279 (1991); Bebbington et al., Bio / Technology 10: 169-175 (19 92)). Using these markers, mammalian cells can be grown in selective media. And select the cells with the highest resistance. These cell lines are chromosomally integrated. Includes amplified genes that are incorporated. Chinese hamster ovary (CHO) cells Often used for protein production.   The expression vectors pC1 and pC4 contain the strong promoter of Rous sarcoma virus (LT R) (Cullen et al., Molecular and Cellular Biology, 438-447 (March 1985)) And fragments of the CMV-enhancer (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)) including. Multiple cloning sites (eg, restriction sites BamHI, XbaI, And Asp718) facilitate cloning of the gene of interest. vector In addition, 3 'intron of rat preproinsulin gene, polyadenylation , And termination signal.                               Example 3 (a) Expression of recombinant native TR1 receptor in COS cells   The expression plasmid TR1 receptor HA is a vector pcDNAIAmp (Invitroge From n): 1) SV40 origin of replication, 2) Ampicillin resistance gene, 3) E. coli replication Origin, 4) CMV promoter, followed by polylinker region, SV40 intron and Riadenylation site. Inflation of the entire TR1 receptor precursor and its 3 'end The DNA fragment encoding the HA tag fused to the The recombinant protein expression, and Are directed under the control of expression. HA tags are described as previously described (Wilson et al., Ce ll 37: 767 (1984)) Epitope derived from influenza hemagglutinin protein Corresponding to The fusion of the HA tag to the target protein The body allows for easy detection and recovery of the recombinant protein.   For the native TR1 receptor (Figure 1), the plasmid construction strategy Described as follows:   A DNA sequence encoding a native TR1 receptor, ATCC Accession No. 75899, Constructed by PCR using the following two primers: has 'cgc GGA TCC gccatc ATGAACAAGTTGCTGTG 3' (SEQ ID NO: 12) and BamH I restriction site followed by the first 17 base pairs of the native TR1 receptor coding sequence of FIG. including.   The 3 'primer has the sequence 5'cgc GGT ACC CAATTGTGAGGAAACAG 3' (SEQ ID NO: 13) And with the Asp718 restriction site and the reverse orientation, 1270-1286.   Therefore, the PCR product contains a BamHI site, the TR1 receptor coding sequence, HA tag fused to frame, translation termination stop codon adjacent to HA tag, and Asp7 Including 18 sites. Transfer the PCR amplified DNA fragment and the vector pcDNAI / Amp to BamHI And digested with Asp718 restriction enzyme and then ligated. The concatenated mixture was transformed with E. coli strain SURE (S tratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) Plate to ampicillin medium plate and select resistant colonies . Isolate plasmid DNA from transformants and check for the presence of the correct fragment One And tested by restriction analysis. For expression of recombinant TR1 receptor, COS cells , DEAE-DEXTRAN method (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)) Transfect using a vector. Expression of TR1 receptor HA protein Radiolabeling and immunoprecipitation (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Ma nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). G Two days after transfection, the cells are35Label with S-cysteine for 8 hours. Next The culture medium is harvested and the cells are washed with detergent (RIPA buffer (150 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50 mM TR1S, pH 7.5)) (Wilson et al., Supra). Dissolve. Both cell lysate and culture medium are treated with HA-specific monoclonal antibodies. Let it settle. The precipitated protein is analyzed on a 15% SDS-PAGE gel.                                Example 3 (b) Cloning and expression of native receptor in CHO cells   Use vector pC1 for expression of native TR1 receptor protein . Plasmid pC1 is a derivative of plasmid pSV2-dhfr [ATCC Accession No. 37146] . Both plasmids contain the mouse DHFR gene under the control of the SV40 early promoter. No. Lack of dihydrofolate activity transfected with these plasmids Chinese hamster ovary cells or other cells are Cells in selective medium (α-min MEM, Life Technologies) supplemented with Can be selected. For cells that are resistant to methotrexate (MTX) Amplification of the DHFR gene in mice has been well documented. (For example, Alt, F.W., Kelle ms, R.M., Bertino, J.R. and Schimke, R.T., 1978, J.A. Biol. Chem. 253: 135 7-1370, Hamlin, J.L. and Ma, C. 1990, Biochem. et Biophys. Acta, 1097: 10 7-143, Page, M.J. and Sydenham, M.A., Biotechnology 9: 64-68 (1991). See). Cell growth at increasing concentrations of MTX was a consequence of DHFR gene amplification. Thus, overproduction of the target enzyme DHFR results in resistance to the drug. Second remains When a gene is linked to a DHFR gene, it is usually co-amplified and overexpressed. You. Developing cell lines with more than 1,000 copies of genes is state-of-the-art It is. Subsequently, when methotrexate is removed, the cell line is integrated into the chromosome. Includes amplified genes that are incorporated.   Plasmid pC1 contains the Rous sarcoma virus (Culle) for expression of the gene of interest. n et al., Molecular and Cellular Biology, March 1985: 438-4470). (LTR) strong promoter and human cytomegalovirus (CMV) (Bosh art et al., Cell 41: 521-530, 1985). Including fragments. Downstream of the promoter is Ba, which allows for gene integration. Single restriction enzyme cleavage site for mHI, PvuII and NruI. These cloning Behind the site, the plasmid contains translation termination codons in all three reading frames. Don followed by the 3 'intron and polyadenylate of the rat preproinsulin gene. Includes a nylation site. Other high efficiency promoters can also be used for expression (Eg, human β-actin promoter, SV40 early or late promoter, Or long terminal repeats from other retroviruses (eg, HIV and HTLVI). mR Due to polyadenylation of NA, other signals (eg, human growth hormone or Globin gene) can be used as well.   Stable cell lines with the gene of interest integrated into the chromosome can also be used as selection markers. -(Eg, gpt, G418, or hygromycin) co-transfection May be selected based on Two or more selectable markers at the start (eg, G418 And methotrexate) are useful.   Plasmid pC1 is digested with the restriction enzyme BamHI, followed by bovine intestinal phosphatase (phosp hate) and is dephosphorylated by procedures known in the art. Then, Is isolated from a 1% agarose gel.   The ATCC75899 DNA sequence encoding the native TR1 receptor is Amplify using PCR oligonucleotide primers corresponding to the 5 'and 3' sequences of RU:   The 5 'primer has the sequence 5'cgc GGA TCC gccatc ATGAACAAGTTGCTGTG 3' (sequence number No. 14) and a BamHI restriction site followed by the native TR1 receptor Contains the first 17 bases of the base sequence.   The 3 'primer has the sequence 5'cgc GGT ACC CAATTGTGAGGAAACAG 3' (SEQ ID NO: 15) 1 and nucleotides 1270-1286 of FIG. And a sequence complementary to   Encodes the human TR1 receptor inserted into the expression vector described below The 5 'end of the amplified fragment provides an efficient signal peptide. Eukaryotic Efficient translation initiation signals in biological cells (Kozak, Mol. Biol. 196: 947-950 (19 87)) is appropriately placed in the vector portion of the construct.   The amplified fragment was isolated from a 1% agarose gel as described above, And digested with endonucleases BamHI and Asp718, then 1% agarose Again.   The isolated fragment and the dephosphorylated vector are then digested with T4 DNA ligase. connect. Then, E. coli HB101 cells are transformed and the restriction enzyme BamHI is used. Bacteria containing the plasmid pC1 inserted in the correct orientation. Inserted remains The sequence of the gene is confirmed by DNA sequencing. Transfection of CHO-DHFR cells   Transferring Chinese hamster ovary cells lacking active DHFR enzyme Used for action. 5 μg of the expression plasmid C1 was transferred to a lipofecting method. Simultaneous tracing with 0.5 μg of plasmid pSVneo using the method (Felgner et al., Supra). Transfect. Plasmid pSV2-neo contains a dominant selectable marker (a group of It contains the gene neo) from Tn5 which encodes an enzyme that confers resistance to antibiotics. cell Is seeded in α-min MEM supplemented with 1 mg / ml G418. After 2 days, try to remove cells Shin-treated and seeded on hybridoma cloning plates (Greiner, Germany) And culture for 10-14 days. After this period, a single clone is trypsinized And then different concentrations of methotrexate (25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM ) And seed in a 6-well Petri dish. Then the highest concentration of methotrexer Clones growing in a higher concentration of methotrexate (500 nM, 1 μM, 2 Transfer to a new 6-well plate containing (μM, 5 μM). Do the same for 10 clones Repeat until grown at a concentration of 0 μM.   Expression of the desired gene product was determined by Western blot analysis and SDS-PAGE. analyse.                                 Example 4 Purification of soluble native TR1 receptor   Analysis of the amino acid sequence of the native TR1 receptor reveals a relatively high theoretical pI Is shown. The chromatographic procedure was performed at pH 7.0 (at which pH other protein (Most of the quality does not bind to the column) Cation exchange column (poros 50HS) Developed based on this feature of capturing proteins. This single-step purification 80-90% pure protein from Sf-9 cell supernatants infected with recombinant baculovirus Get Parkin. The purified protein was analyzed for TNF receptor by N-terminal amino acid sequence analysis. It was confirmed to be a homolog. TR1 receptor is also a heparin-binding chroma It can be purified to> 95% purity through chromatography.   17 mg of purified soluble TR1 receptor from 2 liters of baculovirus supernatant Prepared. 2 mg of protein was used for antibody production. See FIGS.                                 Example 5 Expression via gene therapy   Fibroblasts are obtained from the subject by skin biopsy. Transfer the resulting tissue to a tissue culture medium Place and separate into small pieces. Small mass of tissue on wet surface of tissue culture flask Place and place approximately 10 pieces into each flask. Turn the flask upside down and tighten Close and leave at room temperature overnight. After 24 hours at room temperature, invert the flask and To keep the mass of tissue fixed to the bottom of the flask and add fresh medium (eg, F's medium with 10% FBS, penicillin, and streptomycin) Added. It is then incubated for approximately one week at 37 ° C. At this time, Fresh medium is added and subsequently changed every few days. After another two weeks of culture, a monolayer line Fibroblasts appear. Monolayers should be trypsinized and larger flasks To be larger.   PMV-7 adjacent to the long terminal repeat of Moloney mouse sarcoma virus (Kirschmeier et al., DN A, 7: 219-25 (1988)), digested with EcoRI and HindIII, followed by bovine intestinal phosphorylation. Treated with Tase. The linear vector is fractionated on an agarose gel and Purify using beads.   The cDNA encoding the polypeptide of the present invention has a 5 ′ terminal sequence and a 3 ′ terminal, respectively. Amplify using PCR primers corresponding to the sequence. 5 'primer contains EcoRI site And the 3 'primer further contains a HindIII site. Equal amount of Moloney mouse meat The tumor virus linear scaffold and the amplified EcoRI and HindIII fragments Combine in the presence of T4 DNA ligase. The resulting mixture is combined with a series of two fragments. Maintain conditions appropriate for the conclusion. Transform E. coli strain HB101 using the ligation mixture This is then confirmed that the vector has the gene of interest properly inserted. Plated on agar containing kanamycin for confirmation purposes.   Bidirectional pA317 or GP + am12 packaging cells were transferred to 10% bovine serum (CS), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMC) with Nisillin and Streptomycin Grow to confluent density in tissue culture in EM). Then, the gene Containing MSV vector to the medium and packaging cells transformed with the vector. Introduce. The packaging cells now produce infectious virions containing the gene. (The packaging cells are referred to herein as producer cells).   Fresh medium is added to the transduced producer cells, and then the medium is added to a 10 cm plate. Collect from confluent producer cells. Used media containing infectious virus particles Is filtered through a Millipore filter to remove detached producer cells, and then Medium is used to infect fibroblasts. Medium is subconfluent From the plate of fibroblasts and quickly replace with medium from producer cells You. The medium is removed and replaced with fresh medium. If the virus titer is high , Virtually all fibroblasts are infected, and no selection is required . Has a selectable marker (eg, neo or his) if the titer is very low It is necessary to use a retroviral vector.   The engineered fibroblasts are then used alone or in cytodex3 microcarrier Either after being grown to confluence on the host, and injected into the host. Fibroblast The vesicles now produce a protein product. Numerous modifications and variations of the present invention have been described above. The present invention is possible in light of the above teachings and, therefore, within the scope of the appended claims, It may be implemented in a different way than specifically described.                                 Example 6 Osteogenic cell proliferation assay for TR1 receptor activity   Proliferation effect of candidate agonists and antagonists of TR1 receptor function The assay was performed using the osteoblast cell line HG63 as follows: Purification Serial 2-fold dilutions starting from 1000 ng / ml of native TR1 receptor protein Was made in RPMI640 medium with 0.5-10% FBS. Confluent adherent target cells Prepared from tryptic treatment in PBS from the end cultures and use the non-adherent target cells Was harvested from the stationary culture and washed once with fresh medium. 1 x 10 target cellsFive Suspend cells / ml in medium containing 0.5% FBS, and aliquot 0.1 ml to 0.1 ml Dispense into 96-well flat-bottom microtiter plates containing serially diluted test samples. Arranged. Incubation was continued for 70 hours. MTS activity (3 (4,5-dimethyl-thio) Azoyl-2-yl) 5 (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2 H-tetrazolium)) assay or any for cell number and / or activity Quantified using other assays. MTS assay was performed using 20 μl MTS and This was carried out by adding a methsulfate (PMS) solution to a 96-well plate ( Stock solutions were prepared as described by Promega Technical Bulletin No. 169. Made). During the 3 hour incubation, viable cells remove MTS from the water-soluble Convert to Zan product. Wells with medium only (no cells) to remaining wells And processed in exactly the same manner and used for blank control. Culture Wells with ground and cells were used as baseline controls. 490n The absorbance at m was recorded using an ELISA reader and the number of viable cells in the wells was Proportional. Baseline control wells (3 baseline controls The deviation between wells is less than 5%). /O.D. Baseline control x 100-100 for each sample concentration Cell proliferation (positive percent) or inhibition (negative percent) performed. All The decision was made in triplicate. Mean and SD were calculated by Microsoft Excel.                                 Example 7 Northern blot analysis   Northern blot analysis was performed to detect TR1 receptor in human tissue The expression levels were tested. A cDNA probe containing the sequence shown in FIG. Rediprime from ScienceTMUsing a DNA labeling system, according to the manufacturer's instructions,32P Labeled with. Unincorporated nucleotides can be extracted from labeled probes using the CHROMA SPI It was removed using N-100 (Clontech). Per lane from various human tissues Two multi-tissue Northern (MTN) blots containing approximately 2 mg of poly (A) + RNA Is expressed as H for human tissues, and the other is expressed as H for human immune system.TwoNotation as Was purchased from Clontech. Two Cels containing 20 ng of total RNA from different cell lines lline blots were also used. Northern blotting with Exp from Clontech Using the resshyb Hybridization Solution (PT1190-1), Therefore, it was implemented.   Gene expression was detected in heart, placenta, lung, liver, and kidney tissue. Low level MRNA was detected in thymus, prostate, testis, ovary, and small intestine. Expression is also bone Blastoma, smooth muscle, fibroblasts, ovarian cancer, venous endothelial cells, monocyte leukemia cells, liver It was also detected in kidney cells and emphysema cells. Expression is also observed in the following cell types: Can also be detected: human hippocampus, renal interstitium, macrophages, osteoblasts, human pancreatic tumor Tumors, fetal cochlea, and adult lung.   The entire disclosure of all publications cited herein is hereby incorporated by reference. Used.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者 フレイシュマン，ロバート ディー. アメリカ合衆国 メリーランド，20878, ガイザースバーグ，ティフェリー スクウ ェア ロード 470 (72)発明者 ニ，ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853, ロックビル，マノーフィールド ロード 5502──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 5/10 C12P 21/08 C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA // C12P 21/08 5/00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, E , ES, FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, VN (72) Inventor Fleischmann, Robert Dee. United States Maryland, 20878, Geysersburg, Tiffery Square Road 470 (72) Inventor N, Jian United States Maryland 20853, Rockville, Manorfield Road 5502

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．以下からなる群から選択される配列に少なくとも95％の同一であるヌクレオ チド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子： （a）図１（配列番号２）または図２（配列番号４）の全アミノ酸配列を有す るTR1レセプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （b）図１（配列番号２）の約22位から約401位まで、または図２（配列番号４ ）の約22位から約395位までのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列； （c）ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクローンによってコードされる全アミ ノ酸配列を有するTR1レセプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （d）ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ 酸配列を有する成熟TR1レセプターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 ； （e）図１（配列番号２）または図２（配列番号４）の約22位から約261位まで のアミノ酸配列を有するTR1ポリペプチドフラグメントをコードするヌクレオチ ド配列； （f）図１（配列番号２）の約262位から約410位まで、または図２（配列番号 ４）の約262位から約395位までのアミノ酸配列を有するTR1ポリペプチドフラグ メントをコードするヌクレオチド配列； （g）(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、または(f)のいずれかのヌクレオチド配列に 相補的なヌクレオチド配列。 ２．請求項１に記載の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、または(g)のヌクレオチ ド配列に同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェン トなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含 む単離された核酸分子であって、該ハイブリダイズするポリヌクレオチドが、Ａ 残基のみ、またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ ドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下ではハイブリダイズし ない、単離された核酸分子。 ３．請求項１に記載の(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、または(f)のアミノ酸配列を有 するネイティブTR1レセプターポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配 列をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子。 ４．請求項３に記載の単離された核酸分子であって、以下： 図１（配列番号２）の約20位から約52位までのアミノ酸残基を含むポリペプチ ド；図１（配列番号２）の約66位から約203位までのアミノ酸残基を含むポリペ プチド；図１（配列番号２）の約229位から約279位までのアミノ酸残基を含むポ リペプチド；および図１（配列番号２）の約297位から約378位までのアミノ酸残 基を含むポリペプチド、 からなる群から選択されるネイティブTR1レセプターポリペプチドのエピトー プ保有部分をコードする、単離された核酸分子。 ５．膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記 載の単離された核酸分子。 ６．前記膜貫通ドメインが、TNFファミリーレセプターに含まれるアミノ酸配列 を有する、請求項５に記載の単離された核酸分子。 ７．前記膜貫通ドメインが、図３（配列番号５）の約258位から約287位までに示 すTNF-R2アミノ酸配列を含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。 ８．請求項１に記載の単離された核酸分子をベクターに挿入する工程を包含する 、組換えベクターを作製するための方法。 ９．請求項８に記載の方法によって産生される組換えベクター。 １０．請求項９に記載の組換えベクターを宿主細胞に導入する工程を包含する、 組換え宿主細胞を作製するための方法。 １１．請求項１０に記載の方法によって産生される組換え宿主細胞。 １２．TR1レセプターポリペプチドを産生するための組換え法であって、請求項 １１に記載の組換え宿主細胞を、該ポリペプチドが発現されるような条件下で培 養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。 １３．以下からなる群から選択される配列に少なくとも95％の同一であるアミノ 配列を有する単離されたTR1レセプターポリペプチド： （a）図１（配列番号２）または図２（配列番号４）の全アミノ酸配列を有す るTR1レセプターポリペプチドのアミノ酸配列； （b）図１（配列番号２）の約22位から約401位まで、または図２（配列番号４ ）の約22位から約395位までのアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸配 列； （c）ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクローンによってコードされる全アミ ノ酸配列を有するネイティブTR1レセプターポリペプチドのアミノ酸配列； （d）ATCC受託番号75899に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ 酸配列を有する成熟ネイティブTR1レセプターポリペプチドのアミノ酸配列； （e）図１（配列番号２）または図２（配列番号４）の約22位から約261位まで のアミノ酸配列を有するTR1ポリペプチドフラグメントのアミノ酸配列； （f）図１（配列番号２）の約262位から約410位まで、または図２（配列番号 ４）の約262位から約395位までのアミノ酸配列を有するTR1ポリペプチドフラグ メントのアミノ酸配列； （g）(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、または(f)のいずれかのポリペプチドのエピ トープ保有部分のアミノ酸配列。 １４．膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１３に記載の単離されたポリペプチ ド。 １５．前記膜貫通ドメインが、TNFファミリーレセプターに含まれるアミノ酸配 列を有する、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。 １６．前記膜貫通ドメインが、図３（配列番号５）の約258位から約287位に示す TNF-R2アミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の単離されたポリペプチド。 １７．ネイティブTR1レセプタータンパク質のエピトープ保有部分を含む単離さ れたポリペプチドであって、前記部分が、以下： 図１（配列番号２）の約20位から約52位までのアミノ酸残基を含むポリペプチ ド；図１（配列番号２）の約66位から約203位までのアミノ酸残基を含むポリペ プチド；図１（配列番号２）の約229位から約279位までのアミノ酸残基を含むポ リペプチド；および図１（配列番号２）の約279位から約378位までのアミノ酸残 基を含むポリペプチド、 からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。 １８．請求項１３に記載のTR1レセプターポリペプチドに特異的に結合する、単 離された抗体。[Claims] 1. A nucleoprotein that is at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of: An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide having a nucleotide sequence:   (A) having the entire amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) A nucleotide sequence encoding a TR1 receptor polypeptide;   (B) from about position 22 to about position 401 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) ) Encodes a polypeptide having an amino acid sequence from about position 22 to about position 395 of Nucleotide sequence;   (C) All amino acids encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 75899 A nucleotide sequence encoding a TR1 receptor polypeptide having a noic acid sequence;   (D) amino acid encoded by the cDNA clone contained in ATCC accession number 75899 Nucleotide sequence encoding mature TR1 receptor polypeptide with acid sequence ;   (E) from about position 22 to about position 261 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Encoding a TR1 polypeptide fragment having the amino acid sequence of Array;   (F) from about position 262 to about position 410 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), or FIG. 4) TR1 polypeptide flag having the amino acid sequence of about position 262 to about position 395 of A nucleotide sequence encoding a fragment;   (G) the nucleotide sequence of any of (a), (b), (c), (d), (e), or (f) Complementary nucleotide sequence. 2. The nucleotidic of (a), (b), (c), (d), (e), (f) or (g) according to claim 1. A polynucleotide having a nucleotide sequence identical to the Contains polynucleotides that hybridize under mild hybridization conditions. An isolated nucleic acid molecule, wherein said hybridizing polynucleotide is A Polynucleotide having a nucleotide sequence consisting of only residues or only T residues Hybridized under stringent hybridization conditions. No, isolated nucleic acid molecule. 3. It has the amino acid sequence of (a), (b), (c), (d), (e), or (f) according to claim 1. Amino acid sequence of the epitope-bearing portion of a native TR1 receptor polypeptide An isolated nucleic acid molecule comprising a polynucleotide encoding a sequence. 4. 4. An isolated nucleic acid molecule according to claim 3, wherein:   Polypeptide comprising amino acid residues from about position 20 to about position 52 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) C. a polypeptide containing amino acid residues from about position 66 to about position 203 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). A peptide containing amino acid residues from about position 229 to about position 279 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); A repeptide; and amino acid residues from about position 297 to about position 378 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising a group,   Of a native TR1 receptor polypeptide selected from the group consisting of An isolated nucleic acid molecule that encodes a carrier-bearing moiety. 5. 2. The method of claim 1, further comprising a nucleotide sequence encoding a transmembrane domain. An isolated nucleic acid molecule as described above. 6. The transmembrane domain is an amino acid sequence contained in a TNF family receptor 6. The isolated nucleic acid molecule of claim 5, having the formula: 7. The transmembrane domain is shown from about position 258 to about position 287 of FIG. 3 (SEQ ID NO: 5). 7. The isolated nucleic acid molecule of claim 6, comprising the TNF-R2 amino acid sequence. 8. Inserting the isolated nucleic acid molecule of claim 1 into a vector. , A method for producing a recombinant vector. 9. A recombinant vector produced by the method of claim 8. 10. Introducing a recombinant vector according to claim 9 into a host cell. A method for producing a recombinant host cell. 11. A recombinant host cell produced by the method of claim 10. 12. A recombinant method for producing a TR1 receptor polypeptide, comprising: Culturing the recombinant host cell according to item 11 under conditions such that the polypeptide is expressed. And recovering the polypeptide. 13. An amino acid that is at least 95% identical to a sequence selected from the group consisting of: An isolated TR1 receptor polypeptide having the sequence:   (A) having the entire amino acid sequence of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) Amino acid sequence of a TR1 receptor polypeptide;   (B) from about position 22 to about position 401 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) The amino acid sequence of the polypeptide having the amino acid sequence from about position 22 to about position 395 of Column;   (C) All amino acids encoded by the cDNA clone contained in ATCC Accession No. 75899 An amino acid sequence of a native TR1 receptor polypeptide having a noic acid sequence;   (D) amino acid encoded by the cDNA clone contained in ATCC accession number 75899 An amino acid sequence of a mature native TR1 receptor polypeptide having an acid sequence;   (E) from about position 22 to about position 261 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) or FIG. 2 (SEQ ID NO: 4) An amino acid sequence of a TR1 polypeptide fragment having the amino acid sequence of   (F) from about position 262 to about position 410 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), or FIG. 4) TR1 polypeptide flag having the amino acid sequence of about position 262 to about position 395 of Amino acid sequence of the statement;   (G) epitaxy of any of the polypeptides (a), (b), (c), (d), (e), or (f). Amino acid sequence of the toep holding part. 14． 14. The isolated polypeptide of claim 13, further comprising a transmembrane domain. De. 15. The transmembrane domain is an amino acid sequence contained in a TNF family receptor. 15. The isolated polypeptide of claim 14, having a sequence. 16. The transmembrane domain is shown from about position 258 to about position 287 of FIG. 3 (SEQ ID NO: 5). 16. The isolated polypeptide of claim 15, which comprises a TNF-R2 amino acid sequence. 17． Isolated containing the epitope-bearing portion of the native TR1 receptor protein Wherein the moiety is:   Polypeptide comprising amino acid residues from about position 20 to about position 52 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) C. a polypeptide containing amino acid residues from about position 66 to about position 203 in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). A peptide containing amino acid residues from about position 229 to about position 279 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); And amino acid residues from about position 279 to about position 378 of FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). A polypeptide comprising a group,   An isolated polypeptide selected from the group consisting of: 18. A single binding agent that specifically binds to the TR1 receptor polypeptide according to claim 13. Antibody released.
JP51461098A 1996-09-18 1996-09-18 Human tumor necrosis factor receptor-like gene Withdrawn JP2001509663A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US1996/015003 WO1998012344A1 (en) 1996-09-18 1996-09-18 Human tumor necrosis factor receptor-like genes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001509663A true JP2001509663A (en) 2001-07-24

Family

ID=22255819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51461098A Withdrawn JP2001509663A (en) 1996-09-18 1996-09-18 Human tumor necrosis factor receptor-like gene

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0961832A4 (en)
JP (1) JP2001509663A (en)
AU (1) AU7364696A (en)
WO (1) WO1998012344A1 (en)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (en) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa NOVEL BIOLOGICALLY ACTIVE POLYPEPTIDES, THEIR PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS CONTAINING THEM.
US7632922B1 (en) 1995-12-22 2009-12-15 Amgen, Inc. Osteoprotegerin
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
EP1009431A4 (en) * 1997-05-12 2000-09-27 Smithkline Beckman Corp Human tumor necrosis factor receptor-like 2 (tr2) antibodies
WO2000021554A1 (en) * 1998-10-09 2000-04-20 Sankyo Company, Limited Preventives or remedies for cachexia
EP2067488A1 (en) * 2000-04-12 2009-06-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7507413B2 (en) 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002097033A2 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to trail receptors
CA2471363C (en) 2001-12-21 2014-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
KR101184391B1 (en) 2004-02-09 2013-03-14 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 Albumin fusion proteins
US8334365B2 (en) 2006-06-07 2012-12-18 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL117175A (en) * 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
WO1996028546A1 (en) * 1995-03-15 1996-09-19 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998012344A1 (en) 1998-03-26
EP0961832A1 (en) 1999-12-08
EP0961832A4 (en) 2003-02-26
AU7364696A (en) 1998-04-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU768475B2 (en) Interleukin 17-like receptor protein
KR100497017B1 (en) Highly induced molecule II
US7049402B2 (en) Tumor necrosis factor receptor-5
US7094564B1 (en) Human tumor necrosis factor receptor
JP2001501453A (en) Human tumor necrosis factor δ and ε
US5942417A (en) CD44-like protein and nucleic acids
PT970213E (en) Death domain containing receptor 5
JP2001510035A (en) Interleukin-20
JP2002500043A (en) Apoptosis-inducing molecule II
JP2002522041A (en) Tumor necrosis factor γ
CA2211003A1 (en) Human tumor necrosis factor receptor
JP2002537796A (en) Human glycosylation enzyme
JP2001509663A (en) Human tumor necrosis factor receptor-like gene
JP2002504333A (en) Apoptosis-inducing molecule II and method of use
US20030166097A1 (en) Human tumor necrosis factor receptor
JP2001500724A (en) T1 receptor-like ligand II
JP2001524308A (en) Chemokine α-5
JP2001504336A (en) Connective tissue growth factor-3
JP2001513641A (en) T1 / ST2-receptor ligand III
US8110659B1 (en) Human tumor necrosis factor receptor-like genes
US6130061A (en) Human stem cell antigen 2
US20040047864A1 (en) Apoptosis inducing molecule I
US20060142199A1 (en) CD-44 like protein
JP2003024089A (en) Human tumor necrosis factor receptor
MXPA01002677A (en) Interleukin 17-like receptor protein

Legal Events

Date Code Title Description
A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20041104