JP2001506489A

JP2001506489A - 組換えタンパク質の製造方法

Info

Publication number: JP2001506489A
Application number: JP52490498A
Authority: JP
Inventors: ムカージ，プラデイツプ; ハーズ，ロバート・ジヨージ; サーモンド，ジエニフアー・マリー; レオナルド，アマンダ・ユン−ヨング
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-24
Publication date: 2001-05-22
Also published as: EP0941347A2; NO992531D0; US6071718A; WO1998023762A2; CA2272988A1; NO992531L; WO1998023762A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、組換えタンパク質、例えば組換えリン酸化ベータ−カゼインを生体内（ｉｎｖｉｖｏ）でプロセシング及び産生する方法に関する。本発明はまた、これらの方法によって産生されたタンパク質及びこれらのタンパク質の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】組換えタンパク質の製造方法発明の背景技術分野本発明は、組換えタンパク質、例えば組換えリン酸化ヒトベータ−カゼインをｉｎｖｉｖｏ（生体内）でプロセシング及び産生する方法に関する。本発明はまた、これらの方法によって産生されたタンパク質、及び、これらのタンパク質の使用に関する。背景情報人乳がヒト乳児の最も優れた宋養源であることは普遍的に認識されている。人乳は、発育期の乳児の理想的な栄養源であるだけでなく、種々の微生物による感染から乳児を保護する免疫グロブリン及び非免疫性因子を含有している。人乳はまた、消化し易く、牛乳を主成分とする乳児用調合乳に比べてアレルギー反応を生じることが少ない。人乳は牛乳及びその他の哺乳動物種の乳とは種々の面で違っている。特に、人乳と牛乳とは総タンパク質含量が違っている。また、牛乳は５種類のカゼイン（即ち、２つのアルファーカゼイン、１つのベータ−カゼイン、１つのカッパーカゼイン及び１つのガンマ−カゼイン）を含有している。対照的に、人乳はベータ−カゼインとカッパ−カゼインとだけを含有している。更に、人乳タンパク質のアミノ酸配列は他の哺乳動物の乳タンパク質のアミノ酸配列とは違っている。人乳の有利な特性のいくつかを有し、しかもアレルギー反応または乳児による消化不良のような牛乳を主成分とする乳児用調合乳に伴う欠点が解消された乳児用調合乳を開発する努力が続けられている。この目標に到達する望ましい方法は、天然形態の人乳タンパク質のような人乳の数種の既知成分を乳児用調合乳に添加することである。ヒトのカゼインは重要な物質の代表であり、天然形態で乳児用調合乳に添加されると、調合乳の栄養価を高め、人乳に由来しない乳タンパク質に固有の欠点を軽減する。人乳のカゼインはまた、カルシウムの吸収を増進し、アンギオテンシンＩ変換酵素を阻害し、オピオイドアゴニストとして作用し、免疫促進作用及び免疫調節作用を有すると考えられている。人乳はまた、乳児の成長及び発育に必要なタンパク質の合成に必要なアミノ酸源となり更に他の重要な生物機能を有するタンパク質、例えばカゼインなどのタンパク質を含有することが認識されている。例えば上記のベータ−カゼインは、哺乳動物の乳腺で最も多量に合成される乳タンパク質である。このタンパク質は、ゴルジ装置で翻訳後修飾された後、ミセルと呼ばれるカルシウム依存性の大凝塊として分泌される。ベータ−カゼインは単一の物質ではない。むしろ、授乳中に乳腺刺激ホルモンに応答して分泌される不均一なリンタンパク質群である。ヒトベータ−カゼインの一次構造はＧｒｅｅｎｂｅｒｇらによって決定された（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２５９：５１３２−３８（１９８４））。ヒトカゼインは大量の（＞８０％）ベータ形態と少量のカッパ形態とから成る。天然型ベータ−カゼインは２５ｋＤａのタンパク質である。人乳中でベータ−カゼイン分子は、１つのポリペプチド鎖あたり０〜５個の範囲のリン酸基を含む種々の程度の翻訳後リン酸化を示す（図１；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，前出（１９８４）；Ｈａｎｓｓｏｎら，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ４：３７３−８１（１９９３））。天然型タンパク質中のリン酸基は、アミノ末端の近傍に局在するセリン残基及びトレオニン残基に結合する（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら，前出（１９８４））。ヒト及びウシのベータ−カゼインは４７％のアミノ酸配列一致を示す。ベータ−カゼインの利点から考えて、前記に指摘したようにこのタンパク質を乳児用調合乳または他の栄養調合乳に添加することは極めて有利である。従って、このタンパク質及び特にべータ−カゼインを組換えによって作製し発現させる方法を考案する必要がある。しかしながら、細菌系中でタンパク質を発現させた場合には、Ｎ末端がメチオニン残基によって伸長されたタンパク質が得られる。細菌の成熟サイトゾルタンパク質の有意な画分中では、Ｎ末端メチオニンは、隣接のアミノ酸残基の種類に依存する特異性をもつメチオニンアミノペプチダーゼによって開裂されている（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１６９：７５１−５７（１９８７））。大腸菌中で組換えヒトベータ−カゼインを産生する場合、余分なＮ末端メチオニンはこのペプチダーゼによって隣接アルギニン残基から開裂されない(Ｈａｎｓｓｏｎら，前出（１９９３）)。メチオニンは精製中にスルホニルメチオニンに酸化され、このイベントはタンパク質の免疫原性／アレルゲン性を増強するので、この末端メチオニンの除去が望ましい。所望のＮ末端残基をもつ組換えタンパク質を産生させる１つの方法では、Ｎ末端でシグナルペプチドに融合したタンパク質を発現させる。この方法では、シグナルペプチドを外的に開裂し、処理した天然型タンパク質をグラム陰性細菌の細胞周辺腔またはグラム陽性細菌のサイトゾルに蓄積させる。タンパク質は酵母、真菌類または哺乳類細胞のサイトゾルに分泌及び／または蓄積され得る。しかしながら、シグナルペプチドを開裂するペプチダーゼの特異性次第で、Ｎ末端が不均一になる（Ｌｉｎｇａｐｐａら，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅＵＳＡ，７４：２４３２−３６（１９７７）；Ｈｉｒｔｚｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２１９：６２０ −２５（１９８３））。また、シグナルペプチドが開裂されない残留サイトゾルタンパク質も有意量で存在し得る。組換えタンパク質からＮ末端メチオニンを除去する別の方法では、精製した組換えタンパク質をｉｎｖｉｔｒｏプロセシングするために精製アミノペプチダーゼ（例えば、メチオニンアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＭ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ）を使用する（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｒ．Ｓｅｅｔｈａｒａｍ＆Ｓ．Ｋ．Ｓｈａｒｍａ編，ｐｐ．１４８−５９，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ.，Ｎ．Ｙ．(１９９１)）。しかしながら、この方法は多段階精製を必要とし、経済性がよくないので大規模生産に向かない。また、Ｎ末端がプロリンで始まるタンパク質の産生方法はドイツ特許出願Ｐ３８１１９２１．８に記載されている。この方法は、アミノペプチダーゼ−Ｐによる酵素開裂を含む。更に、オーストラリア特許出願ＡＵ−Ａ−３７１７０／８９に記載されているように、所望のタンパク質を遊離するためにプロリンイミノペプチダーゼも使用されている。これらの方法はいずれも本発明に記載の方法とは全く違っている。実際、本発明は、これらの２つの方法、上述の方法並びに従来使用されていた同様のすべての方法の多くの欠点を解消する。発明の概要本発明は組換えタンパク質のｉｎｖｉｖｏ産生方法を提供する。方法は、（ａ）（ｉ）タンパク質をコードする核酸配列と、（ｉｉ）ペプチダーゼをコードする核酸配列とを含み、タンパク質がその天然形態には存在しない少なくとも１つのＮ末端アミノ酸を含み、タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動的に連結されているようなベクターを作製する段階と、（ｂ）組換えタンパク質を発現させるために十分な時間及び条件でベクターを宿主細胞に導入する段階とから成り、宿主細胞が、タンパク質の１つまたは複数のＮ末端アミノ酸を開裂する内因性ペプチダーゼをコードしていることを特徴とする。上記の方法において、段階（ａ）の核酸配列によってコードされているペプチダーゼは例えばイミノペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼである。イミノペプチダーゼはｐｅｐＩと呼ばれる遺伝子によってコードされ、アミノペプチダーゼはｐｅｐＸＰと呼ばれる遺伝子によってコードされ得る。内因性ペプチダーゼは例えばメチオニンアミノペプチダーゼである。産生される組換えタンパク質は例えば、乳タンパク質、インスリンまたは成長促進因子である。本発明の方法を使用して産生され得るこのような乳タンパク質の一例は、組換えリン酸化ヒトベータ−カゼインである。本発明の方法で使用される宿主細胞は例えば真核細胞でもよくまたは原核細胞でもよい。本発明の方法で使用され得る原核細胞の一例は大腸菌である。Ｎ末端アミノ酸は例えばメチオニンまたはプロリンであろう。本発明はまた、例えば組換えリン酸化ヒトベータ−カゼインのような本発明の方法に従って産生される組換えタンパク質を提供する。更に、本発明は、（ａ）タンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）ペプチダーゼをコードする核酸配列とを含み、タンパク質がその天然形態には存在しない少なくとも１つのＮ末端アミノ酸を含み、タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動的に連結されているベクターを提供する。”少なくとも１つのＮ末端アミノ酸”は例えばメチオニンまたはプロリンであろう。ベクターは例えばプラスミド、バクテリオファージまたはコスミドでよい。更に、本発明はまた、（ａ）タンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）ペプチダーゼをコードする核酸配列とを含み、タンパク質がその天然形態には存在しない少なくとも１つのＮ末端アミノ酸を含み、タンパク質をコードする核酸配列がプロモーターに作動的に連結されているベクターによって形質転換された宿主細胞であって、内因性ペプチダーゼをコードしている宿主細胞を提供する。核酸配列によってコードされているペプチダーゼは例えばイミノペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼである。イミノペプチダーゼはｐｅｐＩ遺伝子によってコードされ、アミノペプチダーゼはｐｅｐＸＰ遺伝子によってコードされ得る。内因性ペプチダーゼは例えばメチオニンアミノペプチダーゼでよい。宿主細胞は例えば真核細胞でもよくまたは原核細胞でもよい。前述のように、大腸菌は本発明で使用され得る原核細胞の一例である。少なくとも１つのＮ末端アミノ酸は例えばメチオニンまたはプロリンであろう。更に、本発明はまた、本発明の方法を使用して産生される組換えタンパク質を含有する乳児用調合乳または医療用栄養物を提供する。本文中で引用された米国特許及び刊行物はいずれもその記載内容全体が参照によって本発明に含まれるものとする。図面の簡単な説明図１は、人乳から検出されるベータ−カゼインの最初の１０個のアミノ酸を表し、リン酸化残基は太字体で示す。図２は、本発明の方法またはプロセスを示す。ヒトベータ−カゼインをＨＢで表し、ヒトカゼインキナーゼ１１をＣＫＩＩβαで表す。図３は、組換えヒトベータ−カゼインをコードする遺伝子にプロリンコドンが付加されたベクターｐＲＡＢ−２８の説明図である。図４は、組換えヒトベータ−カゼイン中のＭｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｃｌｕ．．．のコーディング配列がヒトカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩβα）遺伝子に結合されたベクターｐＲＡＢ−３０の説明図である。図５は、組換えヒトベータ−カゼインをコードする遺伝子のメチオニンの直後の第二及び第三のアミノ酸として２つのプロリンコドンが付加されたベクターｐＲＡＢ−４８の説明図である。図６は、ｐｅｐＩ遺伝子のクローニングを示す。図７は、ｐｅｐＩ遺伝子に対するＰｒａｃプロモーターの付加を示す。図８は、ベクターｐＲＡＢ−４８とｐＲＪＢ−２２との要素の組合せによって得られる２つの追加プロリンをもつヒトベータ−カゼイン遺伝子とｐｅｐＸＰ遺伝子とを含む発現ベクターｐＲＡＢ−４９の作製を示す。図９は、ｐｅｐＸＰ遺伝子に連結されたＰｔａｃプロモーターを含むベクターｐＲＡＢ−５０を示す。ｐＲＡＢ−５１は２つの追加プロリンをもつヒトベータ −カゼイン配列を含み、ｐＲＪＢ−２６はｐｅｐＸＰ遺伝子に連結されたＰｔａｃを含む。図１０は、組換えベータ−カゼインの産生レベルを、ヒトベータ−カゼイン抗体によって展開したウェスタンブロットによって示す。Ｎは人乳から単離した天然型ヒトベータ−カゼインを表す。Ｒは精製された非リン酸化組換えヒトベータ −カゼインを表す。番号は使用したプラスミドを表し、３３は（ｐＲＪＢ−３３）、３６は（ｐＲＪＢ−３６）である。各レーンに等容量の溶菌液を充填した。図１１は、２つの追加プロリンコドンを含む組換えヒトベータ−カゼインの産生を、ヒトベータ−カゼイン抗体によって展開したウェスタンブロットによって示す。Ｎは人乳から単離した天然型ヒトベータ−カゼインを表す。Ｒは精製された非リン酸化組換えヒトベータ−カゼインを表す。番号は使用したプラスミドを表し、２６／５１は（ｐＲＪＢ−２６／ｐＲＡＢ５１）、５０は（ｐＲＡＢ−５０）である。総細胞タンパク質が少なかったのでｐＲＡＢ−５０にはほぼ２倍の量の溶菌液を使用した。図１２は、イオン交換クロマトグラフィーによるｐＲＪＢ−３６及びｐＲＪＢ −３３に由来の組換えリン酸化ベータ−カゼインのリン酸化形態の分離を示す。リン酸化レベルは人乳のベータ−カゼインのリン酸化形態のピークで表される。図１３は、構築物ｐＲＪＢ−２６／ｐＲＡＢ−５１の同時発現によって産生された組換えヒトベータ−カゼインの種々のリン酸化形態を示す。乳中に検出されるベータ−カゼインの６つの異なるリン酸化形態と同じ保持時間をもつピークが組換えベータ−カゼイン調製物にも存在する。図１４は、ｐＲＪＢ−３６に由来の組換えヒトベータ−カゼイン（上段パネル）、及び、二リン酸化天然型ベータ−カゼイン（下段パネル）のエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を表し、タンパク質のＮ末端が適正にプロセシングされたことが確認される。図１５は、ｐＲＡＢ−３０／ｐＲＡＢ−２７の同時発現から単離された二リン酸化組換えヒトベータ−カゼインのＥＳＩを表し、タンパク質のＮ末端でメチオニンをプロリンから開裂した内因性大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼの活性が確認される。発明の詳細な説明前述のように、本発明は、宿主細胞中で組換えタンパク質を産生させる方法、該方法によって得られたタンパク質及びこれらのタンパク質の使用に関する。より特定的には本発明は、ヒトベータ−カゼインのような組換えヒトタンパク質を原核細胞中で産生させる方法であって、得られたタンパタ質が天然型タンパク質中で検出されるアミノ酸配列に等しいアミノ酸配列をもつことを特徴とする方法に関する。本発明は特に、タンパク質、例えば組換えリン酸化ヒトベータ−カゼインタンパク質のｉｎｖｉｖｏプロセシング及び産生に関する。これは、目的タンパク質をコードする核酸配列と例えばペプチダーゼのような異種酵素をコードする核酸配列とを含むベクターを作製することによって達成される。タンパク質は、タンパク質の天然形態には存在しない少なくとも１つのＮ末端アミノ酸を含む。更に、双方の配列を調節するために少なくとも１つのプロモーターが使用される。次にベクターを宿主細胞に導入する。ベクター中に存在するペプチダーゼに加えて、宿主細胞によってコードされた酵素、例えばメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の開裂活性を使用して、タンパク質のＮ末端配列をプロセシングする。本発明方法によって産生されるベータ−カゼインタンパク質は、人乳で検出されるベータ−カゼインタンパク質と同一であり、例えば乳児用調合乳に添加できる。本発明方法に使用される諸要素の特性を以下に概説し、より詳細に後述する。タンパク質：タンパク質をコードする核酸配列に３個またはそれ以上のヌクレオチドが付加されるように、特定のタンパク質をコードする遺伝子配列を操作する。これらの３個またはそれ以上のヌクレオチドは１つまたは複数の特定アミノ酸をコードする。翻訳後、異種タンパク質は１つまたは複数の付加アミノ酸を含むように改変されたＮ末端を有している。これらのアミノ酸は宿主細胞によってコードされている１つまたは複数のペプチダーゼの（１つまたは複数の）開裂部位に対応する。ベクター（構築物）：宿主細胞の形質転換に使用されるベクターは、異種タンパク質をコードする遺伝子配列と異種ペプチダーゼをコードする遺伝子配列とを含む。異種ペプチダーゼは、宿主細胞のペプチダーゼによる開裂後に、翻訳されたタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸を開裂する。宿主細胞：内部でタンパク質の発現が生じまた内部にベクターが挿入される宿主細胞は、翻訳されたタンパク質が宿主細胞自体の内部で酵素的に修飾されるような内因性酵素活性を有している。宿主細胞は原核性であっても真核性であってもよい。方法：上述のように、上記の諸成分が本発明の方法で使用される。方法は、以下の基本段階、即ち、（１）Ｎ末端に追加のアミノ酸を有しているタンパタ質をコードする核酸配列とペプチダーゼをコードする核酸配列とを構築物またはベクターに導入する段階、（２）内因性ペプチダーゼ活性を有している宿主細胞に構築物またはベクターを挿入する段階、（３）増殖中及びその後のタンパク質発現の誘発中に、改変されたＮ末端を有する異種タンパク質を産生させる段階、（４）宿主の内因性ペプチダーゼが例えば異種タンパク質のＮ末端の第一アミノ酸を開裂して異種ペプチダーゼのアミノ酸認識部位を作製する段階、及び、（５）次いでＮ末端の第二または直後のアミノ酸を異種ペプチダーゼによって開裂し、これによって天然型ヒトタンパク質と同一のアミノ酸配列をもつ組換えヒトタンパク質を産生する段階、から成る。本発明の方法及び該方法を構成する個々の段階を以下に詳細に説明する。タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む構築物（ベクター）の作製先ず、目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列を同定し単離する。適当なタンパク質は、例えば以下の特性、即ち、（１）タンパク質が原核性または真核性の起原である、（２）Ｎ末端アミノ酸がメチオニンでない、（３）天然型タンパク質は、細胞質の内因性プロテアーゼによって後で除去されるペプチド配列をＮ末端に伴って合成される、（４）天然型タンパク質は、分泌前に細胞性プロテアーゼによって除去されるシグナルペプチド配列を伴って合成された分泌タンパク質である、などの特性を有している任意のタンパク質でよい。次に、タンパク質をコードするヌクレオチド配列にヌクレオチド（３個またはそれ以上）を標準遺伝子操作技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９）によって付加する。これらのヌクレオチドは異種酵素の活性によって開裂され得る１つまたは複数のアミノ酸を（タンパク質のアミノ末端またはＮ末端に）有しており、このアミノ酸のヌクレオチド配列は、修飾されたタンパタ質のヌクレオチド配列と共に構築物（例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはコスミド）中に配置される。また、これらのアミノ酸の１つが、宿主細胞によってコードされている内因性酵素によって開裂されてもよい。これらのヌクレオチド、従って最終的にはタンパク質をコードする遺伝子配列に付加されるアミノ酸は例えば、メチオニン、プロリン、アラニン及びグリシンのいずれか１つ以上である。本発明の目的のためには付加アミノ酸がメチオニン及び／またはプロリンであるのが好ましい。所望のタンパク質のＮ末端に付加すべきアミノ酸の選択は、構築物に挿入された配列によってコードされている酵素の開裂特性及び宿主細胞が有している内因性酵素の開裂特性に依存する。内因性酵素（例えばメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ））の開裂特異性、例えば第二アミノ酸の開裂に特異的なプロテアーゼの可用性、プロテアーゼ遺伝子のクローニング適性、などを考慮する必要がある。後述するように、例えばＭＡＰがＭｅｔ−ＸからＭｅｔを開裂するという条件で配列Ｍｅｔ−Ｘ−ＰｒｏをｐｅｐＸＰ遺伝子と共に使用し得る。修飾されたタンパク質をコードするヌクレオチド配列を構築物に挿入し、プロモーターに作動的に連結させた後、特定の異種酵素をコードするヌクレオチド配列を構築物に挿入する。適当な異種酵素は例えばペプチダーゼであり、好ましくはイミノペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼである。より好ましくは、Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉに由来のイミノペプチダーゼまたはＬ．ｌａｃｔｉｓに由来のアミノペプチダーゼを使用する。本文中では、前者をコードする遺伝子をｐｅｐＩと呼び、後者をコードする遺伝子をｐｅｐＸＰと呼ぶ。イミノペプチダーゼの使用は、Ｎ末端配列：ＮＨ２−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ．．．を有するタンパク質に限定されているが、アミノペプチダーゼはＮ末端配列：ＮＨ２− Ｍｅｔ−Ｘ−Ｐｒｏを有するタンパク質に使用され得る。Ｍｅｔ−Ｘタンパク質については、他のアミノペプチダーゼを使用してもよい。勿論、イミノペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼと同様に作用する（即ち同じ開裂特異性をもつ）他の酵素も本発明の目的に使用し得る。適当なプロモーターは、修飾された目的タンパク質をコードする遺伝子と所望の異種酵素をコードする遺伝子とを認識する能力を有している少なくとも１つのプロモーターを意味する。当業者はこのようなプロモーターを容易に判断し得る。本発明に使用できるプロモーターの非限定例は、λＰＬ、Ｐｔａｃ、Ｔ７、ＳＰ６及びＴ３である。Ｔ７及び／またはＰｔａｃを使用するのが好ましい。更に、目的の組換えタンパク質を産生させるために宿主細胞に１つまたは複数の構築物を添加し得る。構築物を１つだけ使用するのが好ましい。２つの構築物を使用する場合、宿主細胞内に構築物を維持するために２つの抗体が必要であり、このため大規模発酵のコストが高くなる。この点に関してはより詳細に後述する。更に、本発明の方法を使用して実質的にいかなる組換えタンパク質の作製も可能であることに注目されたい。上記では組換えヒトベータ−カゼインに関して説明した。しかしながら、本発明の方法を使用して産生できる他の組換えタンパク質として例えばインスリン、成長因子及び人乳タンパク質がある。宿主細胞構築物を作製した後、構築物を適当な宿主細胞に当業界で公知の技術によって導入する（例えば、Ｓａｍｂｏｏｋら，前出（１９８９）参照）。適当な宿主細胞は好ましくは、例えばメチオニンをタンパク質から高い効率で除去し、且つ、例えばカナマイシンまたはトリプトファンのような選択可能マーカーを含む。本発明の方法に使用できる宿主細胞の例としては、大腸菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ)種、乳酸桿菌(Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ)種及び桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種のような原核細胞、酵母菌(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)種、ハンゼヌラ( Ｈａｎｓｅｎｕｌａ)種及び哺乳類細胞のような真核細胞がある。使用され得る哺乳類細胞の代表例はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。好ましくは大腸菌細胞を使用する。上述のように、宿主細胞は、目的タンパク質が最終的に得られるように、修飾されたタンパク質の１つまたは複数の付加アミノ酸を開裂する能力をもつペプチダーゼをコードしていなければならない。大腸菌を使用する場合、すべての細胞がメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）活性を有していなければならない。他の原核細胞及び真核細胞はＭＡＰ＋であると報告されている。しかしながら、合成基質を使用し当業界で公知の技術の１つ（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら，前出（１９８７））によって、すべての細胞溶解液についてそのＭＡＰ活性の有無を試験し得る。更に、特定のアミノ酸配列の開裂に特異的な１つまたは複数の内因性ペプチダーゼをコードする他の宿主細胞も使用し得る。宿主細胞が所望のタンパク質、例えば組換えベータ−カゼインを発現させた後、タンパク質を精製し、所望の製品に添加する。例えば、上記のように、本発明の方法によって産生させた組換えベータ−カゼインを乳児用調合乳または医療用栄養物に添加し得る。組換えによって産生されたタンパク質が天然型タンパク質中で検出されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有しているので、牛乳中で検出されるタンパク質を主成分とする調合乳または製品のアレルギー反応の発生率に比べてアレルギー反応の発生率が少ない。従って、例えば新生児に授乳することを選ばない女性でも、本発明の方法によって産生された１つまたは複数の組換えタンパク質を含有する調合乳を乳児に与えることによってアレルギー応答の危険を増すことなく母乳と同じ効果を得ることが可能である（米国特許第５，５０６，２０９号及び第５，５３８，９５２号参照）。本発明方法によって更に他の多くの利点が得られる。例えば、本発明方法を使用して任意の組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を変更し、Ｎ末端に（１つまたは複数の）追加のアミノ酸のコドンを組込ませ、”新しい”または修飾されたタンパク質が同じ構築物に組込まれたペプチダーゼによって開裂されるようにしてもよい。これによって、所望のＮ末端をもつタンパク質が一回だけの発酵によって一段階で産生され得る。本発明方法はまた、所望のＮ末端をもつ目的の組換えタンパク質の大規模商業生産を可能にする。このような大規模生産はしばしば、コストを削減し最大効率を与えるという利点を有している。更に、上述のように、必要な発酵は一回だけである。従って、所望のタンパク質を産生するために、発酵後段階のｉｎｖｉｔｒｏ酵素処理のような修飾は全く不要である。更に、構築物またはベクターを１つだけ使用するので、発酵中にベクターを宿主内に維持するためには１つの抗生物質をコードする１つの遺伝子だけが必要である。このように、１種類だけの抗生物質を使用するので、大規模発酵のコストが有意に削減される。これは、２つのプラスミドを使用する従来方法に比べて改良されている。より詳細には、例えば大腸菌のような宿主内に２つのプラスミドを維持するためには、抗生物質耐性のような選択圧力を使用しなければならない。従って、発酵に２つの抗生物質が必要であり、これは本発明の方法に比べてコスト高になる。以下の非限定実施例によって本発明を更に詳細に説明する。実施例Ｉ大腸菌中の異種タンパク質のＮ末端操作構築物ｐＲＪＢ−９に由来の組換えヒトベータ−カゼインは、Ｎ末端にアルギニンを含む人乳ベータ−カゼインに比べて遺伝子のＮ末端に追加のメチオニンを含む。母乳中で検出されるタンパク質と同一の組換えタンパク質を作製するために、メチオニンをプロセシングしなければならない。タンパク質のメチオニンの直後に（即ち、メチオニンとアルギニンとの間に）アミノ酸プロリンを付加すると、大胞菌のメチオニンアミノペプチダーゼがメチオニンをプロリンから開裂するであろう。Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのｐｅｐＩに由来のイミノペプチダーゼはＮ末端のプロリンの直後を開裂する（図２）。従って、コードされているタンパク質中の第二のアミノ酸として追加のプロリンコドンを付加するために、合成リンカーＲＯ７７／７８： 5’--TATGCCGCGTGAAACCATCGAATCCCTGAGCT--3’ 3’--ACGGCGCACTTTGGTAGCTTAGGGAC--5’ （注：下線を付したコドンがプロリン配列）を使用して中間構築物ｐＲＡＢ−２８（図３）を作製した。リンカーをキナーゼで処理し、次いでｐＳ６３７のＮｄｅＩ／ＳａｃＩ部位にクローニングした。プロリンコドンの存在を確認するためにＡＢＩ３７３Ａ全自動ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて新しいクローンを配列決定した。構築物ｐＲＪＢ−９のＢｇｌＩＩフラグメントを、ｐＲＡＢ−２８の付加プロリンコドンを含むＢｇｌＩＩフラグメントで置換した。アンピシリン耐性遺伝子、ＣＫＩＩβα遺伝子とコーディング配列Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ．．．をもつヒトベータ−カゼイン遺伝子とを含む新しい構築物をｐＲＡＢ−３０と命名した（図４）。上記戦略に加えて、適正にプロセシングされたベータ−カゼインを産生するための第二の戦略は、Ｎ末端配列として5’Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ．．．をもつタンパク質をコードする修飾されたヒトベータ−カゼイン遺伝子配列を合成することであった。大腸菌の内因性メチオニンアミノペプチダーゼがＭｅｔの直後を開裂したとき、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ．．．配列はアミノペプチダーゼｐｅｐＸＰによって第二プロリンの直後で開裂され、アルギニンが第一アミノ酸として残存した（図２）。合成リンカーＲ０１１３／１１４： 5’--TATGCCGCCGCGTGAAACCATCGAATCCCTGAGCT--3’ 3’--ACGGCGGCGCACTTTGGTAGCTTAGGGAC--5’ （注：下線を付した部分がプロリン配列）をｐＳ６３７のＮｄｅＩ／ＳａｃＩ部位にクローニングすることによって中間構築物ｐＲＡＢ−４８を作製した。この場合にも、第二のプロリンの存在を確認するために新しい構築物を配列決定した（図５）。ｐＲＡＢ−３０中のマーカー遺伝子をアンピシリン耐性からカナマイシン耐性に変更した。カナマイシン耐性をコードするＥｃｏＲＩＧｅｎｂｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）のＥｃｏＲＩをクレノウ酵素（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）で埋め戻し、平滑末端を形成した。ｐＲＡＢ−３０をＰｖｕＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を形成し、平滑末端化したカナマイシンＧｅｎｂｌｏｃｋに結合させた。得られたクローンをｐＲＪＢ−１８と命名した（図６参照）。実施例１１プロリンイミノペプチダーゼ遺伝子（ｐｅｐＩ）及びアミノペプチダーゼ遺伝子（ｐｅｐＸＰ）の単離及びクローニングＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種に由来のプロリンイミノペプチダーゼの遺伝子配列は既に公表されている（Ｋｌｅｉｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４０：１１３３−３９（１９９４））。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種ｌａｃｔｉｓＡＴＣＣ４７９７を、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓＭＲＳブイヨン（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ）中、３７℃で、Ａ６６０の光学密度（０．Ｄ．）が０．５〜０．６になるまで増殖させた。５０ｍｌのＬ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉに由来の染色体ＤＮＡをＬｅｅｎｈｏｕｔｓらによって記載された方法（Ａｐｐｌ．ａｎｄＥｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏ．５５：３９４−４００（１９８９））によって抽出した。分光光度法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９）を用いてＤＮＡを定量した。遺伝子フラグメントを増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の最適反応条件を、種々の量のＤＮＡを用いて決定した。２つのプライマーのセット、即ち、遺伝子の５’端にＥｃｏＲＩを導入したＲＯ１１７（５’−−ＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＴＧＣＡＡＡＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＴＡ−−３’）と、ｐｅｐＩ遺伝子の３’端にＳａｌＩ部位を組込んだＲＯ１１８（５’−−ＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＴＡＡＣＣＡＧＴ−−３’）を使用した。標準反応（Ａｕｓｕｂｅｌら，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌ．Ａｓｓｏｃｓ．ａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９２）中のＤＮＡの再生精度を確保するために、ＰＣＲ反応にはＵ１ＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を使用した。９５℃で５分間の初期融解段階、次いで９４℃で３０秒、５５℃で２分及び７２℃で２分のサイクルを２５回繰返す反応条件を用いた。最適反応を大規模で繰返し、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いてアガロースゲルから９００塩基のｐｅｐＩ遺伝子フラグメントを精製した。ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで切断しベクターｐＥＴ−２４ａ（＋）に結合したＴ７プロモーターのコントロール下のＰＣＲフラグメント（ｐｅｐＩ）をｐＲＪＢ−３１と命名した。ｐｅｐＩ遺伝子フラグメントをその中間ベクターｐＲＪＢ−３１からＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩＤＮＡフラグメントとして切出し、アガロースゲル電気泳動によって分離し、フラグメントをＱｉａＱｕｉｃｋＧｅｌ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって精製した。フラグメントの末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で処理して平滑末端を形成した。ｐＲＪＢ−１８をＳｃａＩで切断し、ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で処理し、ＢｌｕｎｔＬｉｇａｔｉｏｎ簡易キット（５’→３’、Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）を平滑ｐｅｐＩフラグメントと共に使用することによって最終発現クローンを作製した。得られたクローンをｐＲＪＢ−３３と命名した（図６参照）。細胞中で産生されるプロリンアミノペプチダーゼの量を増加させるために、大陽菌プロモーターを使用すべきであると判断した。ＰｔａｃプロモーターをｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からＢａｍＨＴフラグメントとして単離し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって処理して平滑末端を形成した。中間クローンｐＲＡＢ−５２は、ｐＲＪＢ−３１（ｐｅｐＩ）をＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を形成し、これを平滑末端をもつＰｔａｃフラグメントに結合させることによって作製した（図７参照）。ｐＲＡＢ−５２からＰｔａｃ／ｐｅｐＩをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメントとして単離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を形成し、ｐＲＪＢ−１８のＳｃａＩに結合させてｐＲＪＢ−３６を作製した（図７参照）。ｐｅｐＸＰ遺伝子を単離するために、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓＡＴＣＣ７９６２の培養物を、ラクトースを補充したＭ−１７（Ｄｉｆｃｏ）培地に３０℃でＡ６６０の光学密度が０．６に達するまで接種した。Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓら（Ａｐｐｌ．ａｎｄＥｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏ．５５：３９４−４００（１９８９））に記載されている染色体ＤＮＡ単離のために約５０ｍｌの培養物を使用した。ＤＮＡ濃度を分光光度法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９）によって測定した。遺伝子フラグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ａｕｓｕｂｅｌら，前出（１９９２））の最適反応条件を種々の量のＤＮＡを用いて決定した。標準反応中のＤＮＡ配列の再生精度を確保するためにＵ１ＴｍａＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用した。先ず９５℃で５分間の融解段階、次いで７２℃で３分、９５℃で１分、４７℃で２分のサイクルを２５回繰返す反応条件を使用した。ｐｅｐＸＰ単離に使用したプライマーは、遺伝子の５’端にＢａｍＨＩ部位を含むＲＯ３７：５’−−ＡＡＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＧＧＡＧＧＡＴＴＴＡＡ−ＡＡＴＧＣＧ−−３’、及び、遺伝子の３’端にＳａｌＩ部位を組込んだＲＯ３５：５’−−ＧＴＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＣＴＴＴＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴ−−３’であった。２，４００塩基の推定ｐｅｐＸＰフラグメント（Ｍａｙｏら，ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５７：３８−４４（１９９１））をアガロースゲルから精製した。ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断したＰＣＲフラグメントを中間ベクターｐＵＣ１８に結合し、得られた構築物をｐＲＪＢ−１４と命名した。ｐｅｐＸＰをｐＲＪＢ−１４からＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメントとして切出し、ｐＥＴ−２４ａ（＋）ベクターにクローニングした。この新しい構築物をｐＲＡＢ− ２７と命名した。中間発現構築物ｐＲＪＢ−２２を作製するために、平滑末端を形成するように処理したｐｅｐＸＰＳｍａＩ／ＳａｌＩフラグメントを、ｐＲＪＢ−１８のＳｃａＩ部位にクローニングした（図８）。発現構築物ｐＲＡＢ− ４９（図８）を、ＢｇｌＩＩで切断することによってｐＲＪＢ−２２から作製し、ヒトベータ−カゼカゼイン遺伝子を含むフラグメントをｐＲＡＢ−４８に由来のＢｇｌＩＩフラグメントによって置換した。ｐｅｐＸＰの産生を最適化するために、追加のプロモーターＰｔａｃを使用した。ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から単離したＰｔａｃＢａｍＨＩフラグメントをｐＲＪＢ−１４のＢａｍＨＩ部位にクローニングしてｐＲＪＢ −２６を作製した。ｐＲＪＢ−２６に由来のＰｔａｃ／ｐｅｐＸＰＳｓｔＩ／ＳａｌＩ平滑末端フラグメントをプラスミドｐＲＪＢ−１８のＳｃａＩ部位に配置することによってｐＲＪＢ−２８を作製した。構築物ｐＲＡＢ−５０（図９）を作製するために、ｐＲＪＢ−２８をＢｇｌＩＩで切断し、得られたフラグメントを、２つの追加プロリンを含むｐＲＡＢ−４８に由来のＢｇｌＩＩフラグメントによって置換した。ｐＲＡＢ−５１と命名した追加の構築物（図９）は、ｐＲＪＢ−１８のベータ−カゼイン遺伝子からＢｇｌＩＩフラグメントを除去し、ｐＲＡＢ−４６に由来のＢｇｌＩＩフラグメントで置換することによって作製した。ｐＲＡＢ−５１（追加の２つのプロリンをもつカナマイシン耐性のヒトベータ− カゼイン遺伝子）をｐＲＪＢ−２６（アンピシリン耐性、Ｐｔａｃプロモーターのコントロール下に発現されるｐｅｐＸＰを有している）と共に２プラスミド系として使用して大腸菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を同時形質転換した。実施例ＩＩＩ大腸菌Ｋ−１２株中のベータ−カゼインの発現構築物ｐＲＡＢ−３０、ｐＲＪＢ−３３及びｐＲＪＢ−３６を用いて大胞菌Ｋ −１２宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）(Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ)を形質転換した。プラスミドを含む大腸菌宿主を３０℃でＡ６００のＯ．Ｄ．が０．５〜０．９になるまで増殖させた。組換えタンパク質の産生を誘発するために、ラクトースを最終濃度１．７％（ｗ／ｖ）まで添加し、増殖を１６〜２０時間継続した。１ｍｌのアリコートを微量遠心管で１１，０００×ｇで遠心して細菌をペレット化し、上清を傾瀉し、ペレットを２００μｌまたは１ｍｌの１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５（１９７０））に再懸濁させた。１０〜２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドプレキャストゲル上の不連続系（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＳｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）中で細胞溶解液をゲル電気泳動によって分離した。ｐＲＪＢ−３３及びｐＲＪＢ−３６からの組換えベータ−カゼインの産生レベル（図１０のレーン２及び３）は等しいと考えられる。ベータ−カゼインに対する抗体を用いて展開させたウェスタンブロット（図１０）は、人乳から単離した天然型ヒトベータ−カゼイン（レーン１参照）及び組換え非リン酸化ベータ−カゼイン（レーン４参照）に酷似した分子量をもつ強力なバンドを示した。ベータ−カゼイン配列のＮ末端に２つのプロリンコドンを付加した発現系の適性を、大腸菌中の単一プラスミド系及び２プラスミド系の発現を比較することによって試験した。構築物ｐＲＪＢ−２６（ｐｅｐＸＰ）及びｐＲＡＢ−５１（ヒトベータ−カゼインとＣＫＩＩβα）を同時に用いてＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を同時形質転換させた。また、ｔ７プロモーターのコントロール下のヒトベータ− カゼイン遺伝子及びＣＫＩＩβα遺伝子と、Ｐｔａｃプロモーターのコントロール下のｐｅｐＸＰとを含む単一プラスミド系である構築物ｐＲＡＢ−５０でＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を形質転換した。２つの構築物ｐＲＪＢ−１６／ｐＲＡＢ−５１の誘発培養物に由来の大脳菌溶解液を単一構築物ｐＲＡＢ−５０の溶菌液に比較した。天然型ヒトベータ−カゼインに対する抗体を用いてこれらの溶菌液をウェスタンブロット分析（図１１）すると、ｐＲＪＢ−２６／ｐＲＡＢ−５１の溶菌液に比較してｐＲＡＢ−５０の溶菌液のベータ−カゼインが劇的に少ないことが判明した（レーン２及び３）。実施例ＩＶ組換えベータ−カゼインのリン酸化形態の単離及びキャラクタリゼーション７，０００×ｇで４℃で１０分間遠心することによって採集した細胞をドライアイス／エタノールで凍結させ、３回解凍して組換えタンパク質を遊離させた（Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：１３５７−１３６０（１９９４））。この方法は、組換えヒトベータ−カゼインの比較的純粋なサンプルを遊離すると考えられた。０．４５μの膜で濾過した後、上清をアニオン交換ＭｏｎｏＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填した。組換えヒトベータ−カゼインの種々のリン酸化形態の分析は、２０ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ９．５）、６Ｍの尿素中のＮａＣｌの０から０．５Ｍまでの直線勾配を５０分間用いることによって行った（Ｈａｎｓｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｅｘｐ．ａｎｄＰｕｒｉｆ．４：３７３−３８１（１９９３））。リン酸化形態を、精製した天然型人乳ベータ−カゼインに比較した夫々の溶出時間によって同定した。推定リン酸化形態の画分中の組換えベータ−カゼインの存在を、１２．５％のＳＤＳ− ＰＡＧＥＰｈａｓｔゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分離し、クーマシーブルーで染色することによって確認した。リン酸化形態の確認後、適切な画分を水に透析し、乾燥し、Ｎ末端配列を解析した。ｐＲＪＢ−３３及びｐＲＪＢ−３６に由来の組換えリン酸化ベータ−カゼインのリン酸化形態のキャラクタリゼーションを行うために、上述のように調製した溶菌液をアニオン交換カラムで分析した。組換えヒトベータ−カゼインについては、五リン酸化形態を除く全部で６つのリン酸化形態が検出された。リン酸化レベルは図１２の人乳ベータ−カゼインのリン酸化形態のクロマトグラムのピークで示される（２つのリン酸化０のピークが存在することに注目されたい）。非リン酸化ベータ−カゼインの２つのアイソフォームが存在すると考えられる。これはＨａｎｓｓｏｎら、前出（１９９３）によっても観察されていた。天然型ヒトベータ−カゼインと組換えベータ−カゼインとのクロマトグラムを比較することによって、各ピークが各１つのリン酸化レベルに対応すると推定された。図１３は、２構築物系ｐＲＪＢ−２６／ｐＲＡＢ−５１から産生された組換えヒトベータ−カゼインの種々のリン酸化形態を示す。人乳中で検出されたベータ −カゼインの６つの異なるリン酸化形態と同じ保持時間をもつピークが組換えベータ−カゼイン調製物にも存在した。実施例Ｖプロリンイミノペプチダーゼアッセイカナマイシンを含有する５０ｍｌの新しいルリア−ベルタニブイヨンに対して１：５０の一夜培養物から細胞を接種した。３０℃でＡ６００のＯ．Ｄ．が０．７〜１に達するまで細胞を増殖させた。ｐＲＡＢ−５２は誘導プロモーターＰｔａｃを含んでいたので、ｐＲＡＢ−５２で形質転換した大腸菌培養物に細菌の対数増殖期にラクトースを添加した。プラスミドｐＲＪＢ−３３はｐｅｐＩの構成性プロモーターを含んでいた。１０，０００×ｇで４℃で５分間遠心することによって各ペレットを採集した。５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）中で氷上でペレットを音波処理した。イミノペプチダーゼ基質Ｌ−プロリル−ｐ−ニトロアニリド（ｐｒｏ−ｐＮＡ；ＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，ＫｉｎｇｏｆＰΓｕｓｓｉａ，ＰＡ）を脱イオン水中で６ｍＭの溶液となるように音波処理を用いて調製した。４０μｌの基質溶液を、９２０μｌの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を入れたキュベットに添加し、キュベットを転倒させて中味を混合した。温度調節した分光光度計でキュベットを３０℃で５分間インキュベーション後、４０μｌの細胞抽出物をキュベットに添加し、再度キュベットを転倒させて中味を混合した。４１０ｎｍの吸光度の増加を追跡することによって３０℃の反応を１分間モニターした。９６００の吸光係数を用いて反応速度を計算した（Ｚｅｖａｃｏら，Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．６８：３５７−３６６（１９９０））。ｐＲＪＢ−３３及びｐＲＡＢ−５２のプロリンイミノペプチダーゼ活性の測定値はそれぞれ０．０００５３及び０．００００４２ミリモル／分／ｍｇであった。実施例ＶＩＸ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼアッセイ所望の構築物を含むＨＭＳ１７４（ＤＥ３）の誘発培養物を、１００ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．２ｍＭのＰＭＳＦ中で音波処理によって破壊し、粗抽出物を遠心して落屑を除去した。ｐＲＡＢ−２７を含有する細胞の場合、得られた上清を同じバッファで１ｍｇ／ｍｌに希釈した。１００ｍｌのトリス（ｐＨ８．０）、２．８ｍＭのＰｈｅ−Ｐｒｏ−β−ナフチルアミン（ＢａｃｈｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．，ＫｉｎｇｏｆＰｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）と４５３μｇ以下の抽出物とを含む８４０μｌの最終容量で２３℃で反応を実施した。Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−β−ナフチルアミン基質の添加によって反応を開始させ、１分間の期間の３４０ｎｍの吸光度の増加によって反応の進行をモニターした。ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＲＡＢ−２７）から調製した抽出物は、合成基質Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−β−ナフチルアミンのＰｈｅ−Ｐｒｏジペプチドを開裂することが観察され、これは、ｉｎｖｉｔｒｏで活性のＸ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼが０．０１５＋／−０．００１ミリモル／分／ｍｇで存在することを示す。ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＲＡＢ−４９）から調製した５２μｇの抽出物を合成基質Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−β−ナフチルアミンに対して試験したが、酵素活性はｉｎｖｉｔｒｏアッセイの検出限度を下回っていた。実施例ＶＩＩタンパク質の配列決定ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＡＢＩ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）のオンラインＡＢＩアナライザーを備えた４７０Ａまたは４７３Ａタンパク質シータエンサーを用いた全自動エドマン分解によってＮ末端配列が得られた。各サンプルに５〜６サイクルの試験を行った。ミシガン大学医学部付属のタンパク質及び糖質の構造研究施設（ＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅＦａｃｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉｃｈｉｇａｎＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ）で分析を行った。以下の表１は、ＭｏｎｏＱカラムで精製した組換え溶菌液の配列決定によって得られた結果を示す。表１組換えリン酸化ヒトベータ−カゼインのＮ末端配列Ｘ＝複数のアミノ酸；＊＝正しいプロセシングアミノペプチダーゼのｐｅｐＸＰを含有していたＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＲＡＢ−２７／ｐＲＡＢ−３０）から単離した組換えヒトベータ−カゼインの二リン酸化形態のＮ末端アミノ酸の配列決定によって、組換えヒトベータ−カゼインのＮ末端がメチオニンでなくプロリンであることが判明した。アミノペプチダーゼ活性が欠失していたＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ｐＲＡＢ−３０）から得られた二リン酸化組換えヒトベータ−カゼインのＮ末端アミノ酸配列はＮ末端プロリンをメチオニンの代わりに含んでいた。従って、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）大腸菌株中では、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−組換えヒトベータ−カゼインからＭｅｔを開裂する内因性メチオニンアミノペプチダーゼが存在すると考えられる。単一構築物ｐＲＪＢ−３３は予想された配列Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ −Ｇｌｕを産生した。ｐＲＪＢ−３３のＮ末端配列パターンは、正しくプロセシングされた配列Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒが存在するときは、第二サイクルも同じ配列で始まると考えられることを示した。不完全なプロセシングは配列：Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅを生じるであろう。このように、組換えベータ−カゼイン分子の必ずしも全部がイミノペプチダーゼによるＮ末端プロセシングで処理されるとは限らないので、Ｎ末端の完全プロセシングを達成するために増殖条件を変更する必要も生じるかもしれない。（ｐＲＪＢ−３６）の溶菌液に由来の二リン酸化組換えベータ−カゼインのＮ末端配列はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ．．．であった。これは、ＭＡＰとプロリンイミノペプチダーゼとの組合せが組換えベータ−カゼインのＮ末端からメチオニン及びプロリンをそれぞれ完全に開裂したことを示す。ｐＲＪＢ−２６／ｐＲＡＢ−５１によって産生されたベータ−カゼインの二リン酸化種はＮ末端配列：Ａｒｇ−Ｇｌｕ．．．を生じた。この配列解析の第一サイクルは複数のアミノ酸を含んでいたが、これはサンプル中に存在する遊離アミノ酸の溶出を起因するものであり、このような状態は頻繁に観察される。従って、第一アミノ酸に関する完全な同定は可能でなかった。しかしながら、第二アミノ酸から始まる配列はＧｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ −Ｓｅｒ−Ｓｅｒ．．．であり、これは人乳ベータ−カゼインに対応する。これはまた、ＭＡＰとｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼが組換えヒトベータ−カゼインのＮ末端をプロセシングしたことを示す。ｐＲＡＢ−５０から単離した画分はベータ−カゼインの産生レベルが低かったのでＮ末端配列について解析しなかった。実施例ＶＩＩＩエレクトロスプレーイオン化質量分析エレクトロスプレーイオン化ソースを備えたＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴ（ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）のＴＳＱ−７００タンデム四重極質量分析計でサンプルを分析した。ｍ／ｚ２００−２５００の四重極マスフィルターを７秒間走査する＋Ｑ１ＭＳモードで器具を作動させた。第二及び第三の四重極マスフィルターは全部のイオンを透過させるｒｆ−ｏｎｌｙモードで作動させた。０．１％のトリフルオロ酢酸を含む５：９５のＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ中に約１μｇ／μＬ（４２ピコモル／μＬ）のサンプルを調製した。この溶液の２０μＬのアリコートを、３５℃に維持した逆相カラム（Ｖｙｄａｃ、Ｃ１８、２．１ｍｍ× ２５０ｍｍ、３００Å）を含むＨＰＬＣ系に注入した。０．１％のトリフルオロ酢酸を含むＨ₂Ｏ中のＣＨ₃ＣＮの５％から７０％までの勾配を２００μＬ／分で７０分間用いてタンパク質を溶出させた。流出液をカラム残渣から分離し、４．５ｋＶで作動し５５ｐｓｉの窒素シースガスで２００℃に維持したＥＳＩソースに８μＬ／分で配給した。図１４に示した質量は、一次ＨＰＬＣピークから測定したエレクトロスプレー質量スペクトルのデコンホリューション後に得られた値である。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、ｐＲＪＢ−３６からプロセシングされた溶菌液に由来の精製二リン酸化組換えヒトベータ−カゼインが正しくプロセシングされたことを確認した。図１４に示すように、組換え型（上段パネル）及び天然型（下段パネル）の双方の二リン酸化ヒトベータ−カゼインは、２４０１８ダルトンという理論的重量に実験誤差の範囲内で一致する２４０１９ダルトンのシグナルを生じた。２４０１９ダルトン以外のシグナルは画分中の付加的タンパク質の存在の指標となる。残りのサンプルを、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌｏｆＢｒａｎｆｏｒｄ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）のエレクトロスプレーイオン化ソースを備えたＦｉｎｎｉｇａｎ（ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）のＭＡＴＴＳＱ７０タンデム四重極質量分析計で分析した。四重極マスフィルターをｍ／ｚ２００−１９００から４秒間走査する＋Ｑ３ＭＳモードで器具を作動させた。第一及び第二の四重極マスフィルターは全部のイオンを透過させるｒｆ−ｏｎｌｙモードで作動させた。０．５％のＨＯＡｃを含有する１：１のＭｅＯＨ：Ｈ₂Ｏ中に約４ピコモル／μｌでサンプルを調製し、ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ２２シリンジポンプを用いて０．８μｌ／分で質量分析計に注入した。記録した分子量は、測定されたエレクトロスプレー質量スペクトルのデコンボリューション後に得られた。エレクトロスプレーイオン化はまた、単離された組換えヒトベータ−カゼイン画分のリン酸化状態がｐＲＡＢ−２７／ｐＲＡＢ−３０の同時発現によって得られること及び３つの画分にＮ末端プロリンが存在することを確認した。図１５に示すように、画分２４は２４，１１５ダルトンのシグナルを生じ、これは１つの追加プロリン残基を有する二リン酸化組換えヒトベータ−カゼインの予測分子量に実験誤差の範囲内で一致する。スペクトル中の２４，１１５ダルトン以外のシグナルは、分析物の人為構造を表す。画分２７及び２８のＥＳＩスペクトルは、それぞれ平均分子量（Ｎ＝２）２４，２７２．５及び２４，３５３．５ダルトンのタンパク質の存在を示した（データ示さず）。これらの分子量もまた、１つの追加プロリン残基をもつ四リン酸化または五リン酸化組換えヒトベータ−カゼインの予測分子量に誤差の範囲内で一致する。ｐＲＡＢ−４９のＮ末端プロセシングの程度をＥＳＩを使用して決定した。二リン酸化分子を分析すると、ＭＡＰによるＭｅｔ除去後に大腸菌由来のタンパク質配列：Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ．．．に一致する平均分子量（Ｎ＝６）２４，２２２＋／−２５ダルトンが得られた（データ示さず）。低レベルのアミノペプチダーゼは、ｐＲＡＢ−４９から産生された組換えヒトベータ−カゼインのＮ末端のプロセシングの欠如の原因となった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/48 9/48 Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｐ 21/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者サーモンド，ジエニフアー・マリーアメリカ合衆国、オハイオ・43231、コロンブス、アデイロンダツク・アベニユー・ 3072 (72)発明者レオナルド，アマンダ・ユン−ヨングアメリカ合衆国、オハイオ・43230、ガハーナ、シエイドウツド・コート、581

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）（ｉ）タンパク質をコードする核酸配列と、（ｉｉ）ペプチダーゼをコードする核酸配列とを含み、前記タンパク質が前記タンパク質の天然形態には存在しない少なくとも１つのＮ末端アミノ酸を含み、前記タンパク質をコードする前記核酸配列がプロモーターに作動的に連結されているようなベクターを作製する段階と、（ｂ）前記ベクターを、前記組換えタンパク質が発現するために十分な時間及び条件下で宿主細胞に導入する段階とから成り、前記宿主細胞が、前記タンパク質の１つまたは複数の前記Ｎ末端アミノ酸を開裂する内因性ペプチダーゼをコードしていることを特徴とする組換えタンパク質の生体内産生方法。２．段階（ａ）の前記核酸配列によってコードされている前記ペプチダーゼがイミノペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．前記イミノペプチダーゼがｐｅｐＩ遺伝子によってコードされており、前記アミノペプチダーゼがｐｅｐＸＰ遺伝子によってコードされていることを特徴とする請求項２に記載の方法。４．前記内因性ペプチダーゼがメチオニンアミノペプチダーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。５．前記組換えタンパク質が乳タンパク質、インスリン及び成長促進因子から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。６．前記乳タンパク質がリン酸化ヒトベータ−カゼインであることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．前記宿主細胞が真核細胞及び原核細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。８．前記原核細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項７に記載の方法。９．前記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸がメチオニン及びプロリンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。１０．請求項１に記載の方法によって産生された組換えタンパク質。１１．前記組換えタンパク質がリン酸化ヒトベータ−カゼインであることを特徴とする請求項10に記載の組換えタンパク質。１２．（ａ）タンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）ペプチダーゼをコードする核酸配列とを含み、前記タンパク質が前記タンパク質の天然形態には存在しない少なくとも１つのＮ末端アミノ酸を含み、前記タンパク質をコードする前記核酸配列がプロモーターに作動的に連結されていることを特徴とするベクター。１３．前記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸がメチオニン及びプロリンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。１４．前記ベクターがプラスミド、バクテリオファージ及びコスミドから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。１５．（ａ）タンパク質をコードする核酸配列と、（ｂ）ペプチダーゼをコードする核酸配列とを含み、前記タンパク質が前記タンパク質の天然形態には存在しない少なくとも１つのＮ末端アミノ酸を含み、前記タンパク質をコードする前記核酸配列がプロモーターに作動的に連結されていることを特徴とするベクターを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が内因性ペプチダーゼをコードしていることを特徴とする宿主細胞。１６．前記核酸配列によってコードされている前記ペプチダーゼがイミノペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の宿主細胞。１７．前記イミノペプチダーゼがｐｅｐＩ遺伝子によってコードされており、前記アミノペプチダーゼがｐｅｐＸＰ遺伝子によってコードされていることを特徴とする請求項１６に記載の宿主細胞。１８．前記内因性ペプチダーゼがメチオニンアミノペプチダーゼであることを特徴とする請求項１５に記載の宿主細胞。１９．前記宿主細胞が真核細胞及び原核細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の宿主細胞。２０．前記原核細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項１９に記載の宿主細胞。２１．前記少なくとも１つのＮ末端アミノ酸がメチオニン及びプロリンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。２２．請求項１０に記載の前記組換えタンパク質を含む乳児用調合乳または医療用栄養物。