JP2001506139A

JP2001506139A - ICAM-6 materials and methods

Info

Publication number: JP2001506139A
Application number: JP52464099A
Authority: JP
Inventors: ローニー，ケイト; ストーントン，ドナルド，イー．; バゾー，ローズメイ
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1997-10-22
Filing date: 1998-10-22
Publication date: 2001-05-15
Also published as: AU1117099A; CA2274880A1; WO1999020762A1; EP0968289A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ICAM-6をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドをコードする発現構築体、当該発現構築体で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞、ICAM-6ポリペプチドを製造する方法、ICAM-6ポリペプチド、当該ポリペプチドに対して特異的な免疫反応性を有する抗体、当該抗ICAM-6抗体を認識する抗イディオタイプ抗体を提供する。 (57) [Summary] The present invention provides a polynucleotide encoding ICAM-6, an expression construct encoding the polynucleotide, a host cell transformed or transfected with the expression construct, a method for producing an ICAM-6 polypeptide, (6) a polypeptide, an antibody having specific immunoreactivity to the polypeptide, and an anti-idiotype antibody recognizing the anti-ICAM-6 antibody.

Description

【発明の詳細な説明】ＩＣＡＭ−６物質及び方法本願出願は、1997年10月22日に出願され、係属中である米国特許出願第08/955 ,661号の一部継続出願である。発明の技術分野本発明は、一般に細胞接着分子に関し、さらに詳細には、細胞間接着分子のIC AM-1、ICAM-2、ICAM-R、(Landsteiner-Weiner)LW-ICAM-4、及びICAM-5と構造上の関連性を有する、「ICAM-6」と称するこれまでに知られていないポリペプチドをコードするDNAのクローニング及び発現に関する。発明の背景この10年来における研究によって、体内での細胞−細胞間の相互作用に関与する分子現象、特に、免疫系における細胞の挙動及び活性化に関連する現象、そして、さらに近年では、神経系における細胞の発生及び生理的機能に関連する現象が、かなり解明されてきている。概説的には、免疫系の細胞に関してはSpringer 、Nature、346巻、425〜434頁(1990)、ならびに神経系の細胞に関しては、Yoshi haraら、Neurosci.Res.、10巻、83〜105頁(1991)と、Sonderegger及びRathjen、 J.Cell Biol.、119巻、1387〜1394頁(1992)を参照されたい。細胞表面タンパク質、及び、特に所謂細胞接着分子(「CAM」)は、相応じて、炎症部位への白血球溢出及び別異の標的組織への白血球の移動のプロセス、さらには、神経分化及び複雑な神経回路構成の形成のプロセスに介入することを目的とした、製薬学的研究及び開発の主題となっている。細胞接着分子の単離及び特徴付け、かかる分子をコードするDNA配列のクローニング及び発現、ならびに、炎症プロセスや、神経系の発生及び機能に関連する治療及び診断薬の開発もまた、多くの米国及び外国特許出願の主題となっている。Edwards、Current Opinion in Therapeutic Patents、1(1 1)、1617〜1630頁(1991)及び、特にその中で引用されている発行済「参考特許文献」を参照されたい。本発明の背景における重要な事柄は、細胞接着現象の特定のメディエーター、すなわち、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、及び顆粒球上に存在するヘテロダイマーの「インテグリン」細胞表面タンパク質のサブファミリーを形成する、「ロイコインテグリン」、LFA-1、MAC-1及びgp150.95（WHOの命名法によると、CD18/ CD11a、CD18/CD11b、及びCD18/CD11cとそれぞれ称される）の先行する同定及び特徴付けである。例えば、前出のSpringerの文献第429頁の表１を参照のこと。さらに、炎症プロセスに伴う現象である、白血球の活性化、接着、運動性等に影響を与える他の一本鎖接着分子(CAM)も重要事項である。例えば、現在のところ、炎症プロセスを特徴付ける白血球溢出に先駆けて、白血球上で構造的に発現しているインテグリンの活性化が起こり、次に、インテグリン(例えば、LFA-1)と、血管内皮細胞表面上及び白血球細胞上にて発現されているICAM-1及びICAM-2と称される２つの相異なる細胞間接着分子(ICAM)の一方または双方との間に堅固なリガンド／レセプター相互作用が生じると考えられている。今日までに特徴付けられている他のCAM(例えば、1990年11月15日に公開された PCT WO 90/13300号に記載された管接着分子(VCAM-1)；ならびにNewmanら、Scien ce、247巻、1219〜1222頁(1990)及び1991年７月25日に公開されたPCT WO 91/106 83号に記載された血小板内皮細胞接着分子(PECAM-1))と同様に、ICAM-1及びICAM-2は、それぞれの細胞外部分が類似構造を共有する一連のドメインを含むという点において、他の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーと構造的に相同である。「典型的な」免疫グロブリン様ドメインは、通常、各ループ末端の２つのシステイン間のジスルフィド結合によって固定されているループ構造を含んでいる。ICAM-1及びICAM-Rはそれぞれ、５つの免疫グロブリン様ドメインを含んでおり；細胞分布の点でICAM-1と異なるICAM-2及びLW-ICAM-4は、このようなドメインを２つ含んでおり；ICAM-5は９つ含んでおり；PECAM-1は６つ含んでおり；VCA Mは、接合の多様性、その他によって、６つまたは７つを含んでいる、等である。さらに、CAMは、典型的には、細胞表面での分子の配向に関係していると考えられる疎水性「膜貫通」領域、及びカルボキシ末端「細胞質」領域を含んでいる。CAMの作動的配置のグラフィックモデルでは、一般的に、細胞の細胞質にまで仲長している細胞質「テール」と、細胞表面がら外側に向けて伸長している１以上の免疫グロブリン様ループとを備えた膜貫通領域にて細胞膜に固定されている分子が示される。数多くの神経細胞が、細胞外Ig様ドメインを持ち、構造的にICAMと類似した、表面レセプターを発現している。例えば、Yoshiharaら、前出、及びMizunoら、J .Biol.Chem.、272巻、1156〜1163頁(1997)を参照されたい。Ig様ドメインに加えて、神経系の多くの接着分子は、細胞外ドメインにタンデムに反復したフィブロネクチン様配列も含んでいる。ヒト・ライノウイルスに結合するICAM-1の能力を前提とする用途を含んだ、細胞間接着分子に対する様々な治療上の使用が計画されてきている。例えば、1992 年１月29日に公開された欧州特許出願第468 257 A号は、リガンド／レセプター結合活性、特にウイルス、リンバ球関連抗原及びプラスモディウム・フアルシパラム(Plasmodium falcipar um)などの病原体に結合する際の結合活性の向上を示すことが提案された、ICAM- 1の多量体の配置及び形態の改良（全長及び欠失された分子型を包含する）について述べている。同様にして、細胞間接着分子に免疫学的に関連しているタンパク質について様々な使用が計画されてきている。例えば、1991年11月14日に公開されたWO 91/16 928号には、ヒト型化されたキメラ抗ICAM-1抗体、ならびに特異的及び非特異的炎症、ウイルス感染、及び喘息の治療におけるその使用が述べられている。抗IC AM-1抗体及びその断片は、内毒素ショックの治療に有効である旨が、1992年３月 19日に公開されたWO 92/04034号に記載されている。抗ICAM-1抗イディオタイプ抗体及び抗体断片を用いたICAM-1依存性の炎症応答の阻害が、1992年４月16日に公開されたWO 92/06119号に述べられている。 ICAM-1などの細胞間接着タンパク質及びLFA-1などのリンパ球相互作用性インテグリン類の同定及び特徴付けによって細胞接着現象の基本的な洞察が得られているにもかかわらず、その全容解明は程遠い。一般的には、炎症プロセス及び標的となるリンパ球の生体内における挙動には、多くの他のタンパク質が関与していると考えられている。例えば、米国特許出願第07/827,689号、第07/889,724号、07/894,061号ならびに08/009,266号及び対応する公開されたPCT WO 93/14776 号（1993年８月５日公開）に、ICAM-関連タンパク質であるICAM-R（ヒトリンパ球、単球及び顆粒球上で発現されていることが示されているもの）のクローニング及び発現が開示されている。これらの出願における開示は、特に引用することにより本明細書に組み入れるものである。他の例として、本明細書中ではLW-ICAM-4と称している血液群糖タンパク質が報告されている[Baillyら、Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、91巻、53065〜53 10頁(1994)；Baillyら、Eur.J.Immunol.、25巻、3316〜3320頁(1995)］。LW−IC AM-4は、CD11a/CD18及びCD11b/CD18への赤血球細胞の結合を媒介することが示唆され、そしてICAM-2と、この表面タンパク質が２つの細胞外ドメインを含むという点において構造的に類似することが示された。さらに別の例として、既知のいずれのICAM分子とも類似しない組織特異的発現性を有する、ICAM様表面分子が同定されている。Moriら、［Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)、84巻、3921〜3925頁(198 7)］は、モノクローナル抗体271A6との特異的免疫反応性を有する、終脳特異的抗原の同定を報告した。この表面抗原は、テレンセファリン（telencephalin）またはICAM-5と命名された。Yoshiharaらは、Ncuron、12巻、543〜553頁(1994) にて、ウサギのテレンセファリンに対するcDNA及びアミノ酸配列を報告し、これによって、130kDのテレンセファロンが、９つの細胞外免疫グロブリン(Ig)様ドメインを持つ膜内在性タンパク質（integral membrane protein）であることが示唆された。これらのドメインのうち遠位の８つは、他のICAMのIg様ドメインと相同性を示した。ウサギICAM-5に対するヒト相同体のクローニングは、Mizunoら、前出に記載されている。かくして、当該技術分野において、ヒトの細胞−細胞間の相互作用に関与するさらなるタンパク質の発見、特に、かようなタンパク質のアミノ酸配列を特異的に同定しかつ特徴付けるのに役立つ情報が希求されている。さらに、そのような分子が治療薬及び診断薬の開発の基礎を形成する程度に、それらをコードしているDNAが解明されることが必須である。かかる根本的な情報は、とりわけ、それらタンパク質の大量生産に役立ち、それらタンパク質を天然に産生する細胞の同定を許容し、そして抗体物質またはそれらと特異的な反応性を有する他の新規な結合タンパク質及び／もしくは関与するリガンド／レセプター結合反応を阻害する他の新規な結合タンパク質の調製を可能にするであろう。発明の要旨要約すると、本発明はICAM-6と命名された細胞接着分子ファミリーに対するポリペプチド及びその基礎をなすポリヌクレオチドを提供する。本発明には、天然に生じているものと天然に生じていないもの双方の、ICAM-6ポリヌクレオチド及びそのポリペプチド産物が包含される。天然に生じているICAM-6ポリペプチドには、ファミリーに含まれる別異の遺伝子及びポリペプチド種（すなわち、対立変異体及び種相同体）が包含される。各ICAM-6種の中で、本発明はさらに、同じポリヌクレオチドによってコードされているが異なるmRNA転写物より生じるスプライス変異体を提供する。天然に生じていないICAM-6ポリペプチドには、類似体（すなわち、１以上のアミノ酸が付加、置換、または欠失したもの）などの、天然に生じている産物の変異体や、共有結合修飾体（すなわち、融合タンパク質、グリコシル化変異体、Met^-1ICAM-6、Met^-2-Lys^-1ICAM-6、Gly^-1ICAM-6等）を包含するICAM-6ポリペプチドが含まれる。好ましい実施態様において、本発明は配列番号：１に示す配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらにまた配列番号：２に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。現在のところ好ましい本発明のポリペプチドは、配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む。本発明の好ましいポリヌクレオチドをコードするプラスミドは、1997年10 月16日に、20852、メリーランド州、ロックビル12301に在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、受託番号第98557を与えられた。本発明は、ICAM-6をコードする新規の精製及び単離されたポリヌクレオチド（例えば、DNA配列及びmRNA転写物、双方ともセンス及び相補的アンチセンス鎖、さらにそれらのスプライス変異体を含む）を提供する。本発明のDNA配列には、ゲノミック及びcDNA配列のみならず、全体的または部分的に化学合成されたDNA 配列が含まれる。本明細書で用いられ当該技術分野において理解される「合成された」の語は、ポリヌクレオチドを製造するための、酵素的方法に対して純粋に化学的な方法を称するものである。「全体的に」合成されたDNA配列は従って、全体に及んで化学的手段により製造されたものであって、そして「部分的に」合成されたDNAは、得られるDNAの一部分だけが化学的手段によって製造されたもののことである。本発明はさらに、好ましいICAM-6 DNAの種、好ましくは哺乳動物相同体を包含する。本発明はまた、配列番号：１のポリヌクレオチドの非コード鎖、または相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするICAM-6種をコードするDNA配列も含むものである。遺伝コードの縮重がなければそれとハイブリダイズするはずであるICAM-6AポリペプチドをコードするDNA配列が、本発明によって企図される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は以下の通りである：50％ホルムアミド、5X SSCで42℃にて終夜ハイブリダイゼーションを行い、1％SDSを含む0.5X SSC で50℃にて洗浄する。当該技術分野にあっては、Ausebelら（編）Protocols in Molecular Biology 、John Wiley & Sons(1994)6.0.3〜6.4.10頁に記載されるように、温度及び緩衝液、または塩濃度を変更することによって同等のストリンジェンシーの条件にできることは理解されるはずである。ハイブリダイゼーション条件の改変は、経験的に決定するか、またはプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さ及び含有率に基づき正確に算定することが可能である。Sambro okら（編）、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor La boratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（1989）9.47〜9.51頁に記載される通りに、ハイブリダイゼーション条件を算定することができる。 ICAM-6ポリヌクレオチド配列を組み込んだプラスミド及びウイルスDNAベクターなどの、自己複製する組換え発現構築体も提供される。ICAM-6をコードするポリヌクレオチドが、内在性または外来性発現制御DNA配列及び転写ターミネーターに作動可能に連結された発現構築体も提供される。本発明のさらなる特徴によれば、本発明のICAM-6ポリペプチドの発現を許容するように、本発明のDNA配列で安定にまたは一過性に形質転換された、原核細胞及び真核細胞を含む宿主細胞が提供される。本発明の宿主細胞は、ICAM-6と特異的な免疫反応性を有する抗体の開発のための免疫原の貴重な供給元である。本発明の宿主細胞は、ICAM-6ポリペプチドの大量生産のための方法においてきわめて有用なものでもあり、かかる方法では、細胞が好適な培地中で生育され、そして目的のポリペプチドが、細胞からまたは細胞が生育される培地から、例えばイムノアフィニティー精製によって単離される。 ICAM-6 DNA配列の知見により、内在性ICAM-6の発現を許容または増加させるような細胞の修飾が可能となる。細胞がより高いレベルでICAM-6を発現するよう、異種性のプロモーターのすべてまたは一部を用いて、天然に生じているICAM-6プロモーターの全体または一部を置換することによって、ICAM-6の発現増大をもたらすように細胞を修飾することができる（例えば、相同組換えによる修飾）。異種性プロモーターは、ICAM-6をコードする配列に作動可能に連結するように挿入される。例えば、PCT国際公開第WO 94/12650号、PCT国際公開第WO 92/2 0808号、及びPCT国際公開第WO 91/09955号パンフレットを参照されたい。本発明はまた、異種性プロモーターDNAに加えて、増幅可能なマーカーDNA（例えば、ad a、dhfr、ならびにカルバミルホスフェートシンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、及びジヒドロオロターゼをコードする多機能CAD遺伝子など）ならびに／または、イントロンDNAを異種性プロモーターDNAと共に挿入してもよい。ICAM-6コーディング配列に連結される場合、標準的な選択方法によるマーカーDNAの増幅の結果、細胞でのICAM-6コーディング配列の共増幅が導かれる。本発明によって提供されるDNA配列情報はさらに、例えば相同組換えまたは「ノックアウト」戦略［Capecchi、Science、244巻、1288〜1292頁(1989)］による、機能を有するICAM-6を発現しない、またはICAM-6の変異体を発現する動物の開発も可能になる。かかる動物は、in vivoでのICAM-6及びICAM-6のモジュレーターの活性を調べるためのモデルとして有用である。本発明はまた、精製及び単離されたICAM-6ポリペプチドを提供する。現在のところ好ましいICAM-6ポリペプチドは、配列番号：２に示される。本発明のICAM-6 ポリペプチドは、天然の細胞供給源から単離されても、あるいは化学合成されてもよいが、好ましくは本発明の宿主細胞を用いた組換え法によって製造される。哺乳動物宿主細胞の使用によって、本発明の組換え発現産物に対する至適な生物学的活性を付与するのに必要がもしれない転写後修飾（例えば、グリコシレーション、トランケーション、リピデーション及びリン酸化など）が提供されることが予測される。本発明のICAM-6ポリペプチドは、全長のポリペプチド、生物学的に活性を有するその断片、または特異的なICAM-6の生物学的活性を保持している変異体であってもよい。変異体には、（１）ICAM-6に特異的な生物学的活性もしくは免疫学的特性を損失することなく、または（２）ICAM-6の特定の生物学的活性の無力化を伴って、１以上の特定の（すなわち、天然にコードされている）アミノ酸が欠失もしくは置換されているか、または１以上の不特定のアミノ酸が付加されているICAM-6ポリペプチド類似体が含まれうる。本発明の変異体ポリペプチドには、成熟ICAM-6Aポリペプチド、すなわちリーダーまたはシグナル配列が除去され、さらなるアミノ末端残基を有するICAM-6ポリペプチドが含まれる。−１位にさらなるメチオニン残基を有するICAM-6ポリペプチド（Met^-1-ICAM-6）が企図され、同様に−２及び−１位にさらなるメチオニン及びリジン残基を有するICAM-6ポリペプチド（Me^-2-Lys^-1-ICAM-6）も企図される。これらのタイプの変異体は、細菌細胞型での組換えタンパク質の生産に対して特に有用である。本発明はまた、特異な発現系の使用に起因したさらなるアミノ酸残基を有する ICAM-6変異体をも含むものである。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質などの所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用によって、その所望のポリペプチド由来のGST成分の切断の結果、−１位にさらなるグリシン残基を有する目的のポリペプチドが提供される。他のベクター系での発現から得られる変異体もさらに、本発明で企図される。本発明はまた、ポリペプチドの１以上の細胞外ドメインを含むICAM-6断片を企図する。ICAM-6の特に好ましい欠切型には、細胞接着をもたらす特異的リガンド結合に関わるタンパク質の可溶性型のものが包含される。１以上の細胞外ドメインを含むICAM-6の欠切型は、タンパク質の細胞外部分の明確化され且つ識別されたドメインの知見に鑑みて作製される。様々なドメインが、保存されたシステイン残基、ならびに概ね保存された及び／または類似した近接アミノ酸残基の存在によって特徴的に示される。本発明はさらに、通常はICAM-6と会合しているアミノ酸配列に共有結合によって付着されたICAM-6断片を包含する。その結果得られた「キメラ」または「融合」タンパク質は、ICAM-6の生物学的活性をモジュレートするために特に有用であり、またICAM-6アミノ酸配列の抗原性を改善するためにも有用である。「ICAM-6に通常会合しているアミノ酸配列」は、いかなる供給源に由来するものでもよく、そしてそのアミノ酸配列の接着がICAM-6に対して作用しうる特性に基づいて選択することができる。本発明はさらに、１以上の水溶性ポリマー接着物を含むように修飾されたICAM -6ポリペプチドを包含する。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（PEG ）サブユニットで共有結合修飾されたICAM-6ポリペプチドである。水溶性ポリマーは、例えばICAM-6ポリペプチドのアミノ末端などの特定の位置に結合させても、あるいはポリペプチドの１以上の側鎖に無作為に接着させてもよい。さらに本発明によって企図されるのは、ICAM-6ポリペプチドに対して特異的な抗体（例えば、モノクローナル及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体等）またはその断片ならびに他の結合タンパク質である。特異的な結合タンパク質は、単離されたICAM-6産物もしくは組換えICAM-6産物、ICAM-6 変異体、またはこのような産物を発現している細胞を使用して製造することができる。結合タンパク質は、ICAM-6ポリペプチドを精製するため、そして既知の免疫学的方法を使用して体液及び組織試料中のICAM-6ポリペプチドを検出または定量するために有用である。結合タンパク質はまた、ICAM -6の生物学的活性、特にシグナル伝達経路に関与する活性をモジュレートする（すなわち、ブロッキング、阻害する、または抑制する）上で極めて有用である。抗ICAM-6抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体もまた、さらに企図される。本発明のDNA及びアミノ酸配列の開示を通じて寄与される情報の科学的な価値は、明白である。一連の実験にて、ICAM-6に対するcDNAの配列の知見から、ICAM -6や、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッサー等のICAM-6発現制御配列をコードするゲノミックDNA配列の同定が、サザンハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用によって可能となる。中程度から高度のストリンジェント条件下に本発明のDNA配列を用いて行ったDNA/DNAハイブリダイゼーション法で同様に、ICAM-6の対立変異体をコードするDNAの単離が可能となることが予測され；対立変異体とは、当該技術分野においてICAM-6に特異的な生化学的及び／または免疫学的特性の１以上持つ構造的に関連するタンパク質を含むことが知られるものである。同様に、ICAM-6と相同なタンパク質をコードする種の遺伝子も、サザン分析及び／またはPCR分析によって同定することができる。選択手段として、他のICAM-6タンパク質、そのタンパク質をコードするDNAを同定するために相補性試験が有用でありうる。本発明のポリヌクレオチドは、細胞がICAM-6を発現する能力を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明のポリヌクレオチドは、１以上の疾患の原因となっているICAM-6遺伝子座における遺伝的変化（１以上）を同定するための診断方法に対する基礎をなすものとなりうる。さらに本発明によって実現されるのは、ICAM-6をコードするポリヌクレオチドを認識する、またはハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである。全長及び断片のアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。アンチセンスポリヌクレオチドは、ICAM-6m RNAを発現している細胞によるICAM-6の発現調節に特に関連するものである。本発明によって提供されるDNA及びアミノ酸配列情報によりさらに、ICAM-6の構造及び機能の系統的な分析が可能になる。ICAM-6に対するDNA及びアミノ酸情報によってさらに、ICAM-6と相互作用すると考えられる分子の同定が可能となる。ICAM-6結合活性をモジュレートする（すなわち、増加、減少または阻止する）物質は、モジュレーターと推定される物質をICAM-6とインキュベートし、そしてそのモジュレーター推定物質のICAM-6結合活性に対する効果を判定することによって、同定することができる。ICAM-6の生物学的活性をモジュレートする化合物の選択性は、その化合物のICAM-6に対する効果と、他のICAM-6結合タンパク質に対する効果とを比較することによって評価することができる。ジ−ハイブリッドアッセイ及びスプリットハイブリッドアッセイなどの、細胞を用いた方法、さらにポリペプチドまたはその結合パートナーが固定化されるアッセイを含めたインビトロのアッセイ、及び溶液アッセイが本発明によって企図される。選択的モジュレーターには、例えば、抗体及びICAM-6またはICAM-6核酸に特異的に結合する他のタンパク質またはペプチド、ICAM-6またはICAM-6核酸に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、ならびにICAM-6またはICAM-6をコードする核酸と特異的に結合する他の非ペプチド化合物（例えば、単離されたもの、または合成有機分子）などが包含されうる。モジュレーターはさらに、前記のごとき化合物であるがICAM-6の特異的結合パートナーと相互作用する化合物を含んでいる。野生型ICAM-6の酵素活性または細胞局在性に影響を及ぼすICAM-6の変異体型もまた、本発明によって企図される。選択的モジュレーターを開発するための現在のところ好ましい標的には、例えば（１）他のタンパク質と接触する及び／または細胞の特定膜領域内にICAM -6を局在化させる、ICAM-6の細胞質または膜貫通領域、ならびに（２）特異的結合パートナーに結合するICAM-6の細胞外領域が包含される。ICAM-6活性のモジュレーターは、ICAM-6活性が関わる疾患及び病理状態の処置において治療的に有用であるがもしれない。発明の詳細な説明本発明は、ICAM-6ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの単離、さらには、そのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現及び特徴付けに関する以下の実施例によって例証される。実施例１には、新規のICAM cDNA配列を単離するために計画されたESTデータベースの検索を記載する。実施例２は、全長のICAM-6 cDNAを同定するためのマウスライブラリーのスクリーニングに関する。実施例３には、マウスICAM-6発現のノザン組織分析を述べる。実施例４は、マウスICAM-6をコードする5'配列を同定するための、RACE PCRの使用に関する。実施例５には、マウスICAM-6の可溶性型をコードする発現プラスミドの構築を記載する。実施例６は、全長のマウスICAM-6 cDNAの単離に関する。実施例７にはさらなるマウスICAM-6発現構築体を記載する。実施例８には、ICAM-6抗体の製造を述べる。実施例９には、マウスICAM-6の機能分析を記載する。実施例１０には、マウスICAM-6のin situハイブリダイゼーション分析を記載する。実施例１１は、部分的なヒトICAM-6 cDNA の同定に関する。実施例１２は、組織及び細胞でのヒトICAM-6発現のノザン分析を示す。実施例１３には、より完全なヒトICAM-6 cDNAの単離を記載する。実施例１４には、ヒトICAM-6に対し正しいスプライシングを受けた5' cDNAを同定するためのRACE PCRの使用を述べる。実施例１５には、無精子症の男性患者からの ICAM-6ドメイン４及び５のクローニングを記載する。実施例１６は、可溶性ヒト ICAM-6ポリペプチドの発現に関する。実施例１７には、ウェスタン分析及びICAM -6抗体の製造を記載する。実施例１新規ICAMに関するESTデータベースの検索 The National Center for Biotechnology Information（NCBI）の発現配列タグ（EST）データベースのBLASTN検索を、新規な細胞接着分子（CAM）の同定において有用であり得ると考えられるcDNA断片を同定するために行った。そのデータベースには、様々な組織源に由来して集められたcDNAの一末端または両末端を表すDNA配列が含まれている。データベースに提示するためのESTを同定するために、一回の配列決定反応をcDNAの一末端または両末端について行う。従って、DNA の品質は、配列の正確度の点において著しく変動している。本明細書中に記載された検索を行った時点で、ESTデータベースは、様々な生物から得られた860,000 以上のcDNA配列を含んでいた。新規なCAMに関する検索を３段階で行った。最初に、NBCIを通して入手可能なB LASTNプログラムを使用して、既知のCAMをコードするcDNA配列に対する相同性を有するESTを同定した。このプログラムは、データベース内のすべてのヌクレオチド配列に対して、提示したヌクレオチド配列を比較する。今回の検索において、ヒトのICAM-1［Staunton，et al.，Cell 52: 925（1988）］、ICAM-2［Staunton，et al.，Nature 339:61(1989)］、ICAM-R［ Vazeux，et al.，Nature 360:485(1992)］、LW-ICAM-4［Bailly et al.，Proc.N at'l.Acad.Sci.(USA)91:5306(1994)］、ICAM-5［Mizuno et al.，J.Biol.Chem． 272:1156（1997）］、VCAM-1［Osborn，et al.，Cell 59:1203(1989)］、及びMa dCAM［Leung，et al.，Immunogenetics 46:111(1997)］、マウスのICAM-1［Ball antyne，et al.，Nucl.Acids.Res．17:5853(1989)］、ICAM-2［Xu，et al.，J.I mmunology 149:2650(1992)］、ICAM-5［Yoshihara，et al.，Neuron 12:541(199 4)］、VCAM-1[Araki，et al.，Gene 126:261(1993)］、及びMadCAM［Briskin，e t al.，Nature 363:461(1993)］、及びマウスICAM-4の一部（EST W46066）をコードするcDNAを提示して、13回のBLASTN検索を行った。それらの結果から、13個の既知CAMの１つに対応していることが明らかにされたEST配列を同定した。２段階目は、TBLASTN検索を、上記の既知のヒト及びマウスのCAM遺伝子のアミノ酸配列を提示配列として使用して行った。この検索において、EST配列ライブラリー内のポリヌクレオチドを６通りの読み枠で翻訳して、その得られたアミノ酸配列のそれぞれを提示配列と比較する。この検索で同定され、最初の検索で見出されたESTに対応するESTは採用しなかった。３段階目は、TBLASTN検索で同定され、既知CAMに対応しなかった配列をさらに調べた。残った配列の大部分は、細胞接着分子において典型的に見出される保存されたシステイン残基及び細胞外ドメイン構造を含有しなかった。従って、これらの配列もまた採用しなかった。しかし、マウスの精巣から得られ、AA065978（配列番号：46）と呼ばれる250ヌクレオチドのESTは、マウスのICAM-1、ICAM-3及びICAM-5 のアミノ酸配列に相同的なポリペプチド配列をコードするとして同定された。AA 065978の配列は、マウスICAM-5と最も密接に関連していた。AA065978の配列とその対応するマウスICAM-5の領域との配列比較により、全体で47％の同一性が見られた。このESTを、I.M.A.G.E（Lawrence Livermore Laboratory，Livermore，CA ）により同定及び配列決定が行われたESTの寄託物を維持し、その利用を可能にするGenome Systems（St．Louis，MO）から取り寄せた。 ESTのAA065978をコードするプラスミドDNAで形質転換された細菌を、カルベニシリン含有のLB−アガロースに播種して37℃で一晩増殖させた。１つのコロニーを選び、液体のLB−カルベニシリン培地で増殖させた。プラスミドDNAを、18ml の細菌培養物からWizard Mini-Prepキット（Promega，Madison WI）を使用して回収した。そのEST挿入物の配列を、ベクタープライマーのT7.1（配列番号：３）及びT3.1（配列番号：４）、ならびにAA065978のデータベース配列に基づいて設計したプライマーI6MO24（配列番号：５）及びI6MO20（配列番号：６）を使用して決定した。 T7.1 配列番号：３ GTAATACGACTCTCACTATAGGGC T3.1 配列番号：４ AATTAACCCTCACTAAAGGG I6MO20 配列番号：６ TTGCCTGCATCCCAGAGG I6MO24 配列番号：５ CAAGCCAAGGTTTCAGGAATCCCGCTGC 最初の配列分析の後に、プライマーI6MO30（配列番号：７）、I6MO31（配列番号：８）、I6MO32（配列番号：９）、I6MO33（配列番号：10）及びI6MO34（配列番号：11）をさらに設計して、そのEST配列の残り部分を決定した。 I6MO30 TCTTTGCTGGAGTGTGAC 配列番号：７ I6MO31 GTCACACTCCAGCAAAGA 配列番号：８ I6MO32 CAAAGCAAGGGCGAGGAG 配列番号：９ I6MO33 CTCCTCGCCCTTGCTTTG 配列番号：10 I6MO34 TCTAGGTGGGACTCTGTG 配列番号：11 AA065978のDNA配列を、両ストランドについて、上記のDNAオリゴヌクレオチドプライマ一及びPerkin Elmer Applied Biosystems Division 373A DNA Sequence rを使用して製造者の指示プロトコルに従って決定した。テンプレートとして使用したPCR産物の量をそのPCR産物のサイズに基づいて計算し、そしてその配列決定を、AmpliTaq DNA Polymerase，FS（Perkin Elmer，Foster City，CA）及び非対称PCRによるABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Ki tを使用して行った。反応生成物をAGCTスピンカラム（Advanced Genetic Techno logies Corp.，Gaithersburg，MD）で精製し、乾燥した。ローディング緩衝液を精製した各サンプルに加え、混合物を90℃で２分間加熱した。その溶液を氷に移し、４％ポリアクリルアミドゲルで流すまで置いた。データは、データ収集プログラムが始動すると、自動的に収集され、そして配列分析プログラムによって自動的に分析されて読み込まれた。編集はすべて手動で行い、得られた配列の配列比較を行ってコンセンサス配列を決定した。配列分析により、AA065978は長さが1.6kbであることが示され、そしてドメイン４及びドメイン５の間でスプライシングされ、その後に膜貫通領域及び細胞質テイルが続く正しくプロセッシングされた転写物を含むことが示された。AA0659 78の推定アミノ酸配列と他の既知のマウスICAMとの間のタンパク質相同性を下記の表１に示す。他の既知のマウスICAMに対するAA065978のアミノ酸配列の配列類似性のために、このESTをICAM-6と呼ぶこととした。実施例２全長のマウスICAM-6 cDNAに関するマウス精巣ライブラリーのスクリーニングマウスESTのAA065978はマウスの精巣cDNAから得られるとデータベースで同定されたので、ICAM-6をコードする全長のcDNAを単離する目的で、マウス精巣ライブラリーをスクリーニングした。マウスの精巣ライブラリー（Stratagene，La Jolla，CA）からの約１×10⁶プラーク生成単位（pfu）を、PCRにより³²P-dCTPで標識したマウスICAM-6ドメイン５のプローブを用いてスクリーニングした。このプローブを、２回のPCRによって作製した。最初に、AA065978プラスミドをテンプレートとして使用して、I6M0 24（配列番号：５）及びI6MO26（配列番号：12）のプライマーを使用するPCR反応でドメイン５をコードするDNAを増幅した。 I6MO26 AGTAGCTCCCCGTGTGGTTCTGGGTGGC 配列番号：12 PCRをDNAサーマルサイクラー480（Perkin Elmer，Foster City，CA）で行った：各反応には、250mM KCl、100mM Tris pH8.3（Perkin-Elmer PCR緩衝液）、２mM MgCl₂、２mM dNTPs、100μg/mlプライマーが、25μlの反応液あたり0.125μlのT aqポリメラーゼ（Perkin-Elmer，Roche Molecular，Branchburg，N.J）及び２μ lのAA065978プラスミドDNAとともに含まれた。４分間の変性工程を94℃で行い、その後、94℃で１分間の変性、50℃で30秒間のアニーリング及び72℃で１分間の伸長の30サイクルを行った。１つのバンドが、その予想されるサイズでアガロースゲル上を移動することが見出された。この209bpバンドをゲル精製し、１：20 で希釈して、２回目のPCR増幅でのテンプレートとして使用した。第２回目のPCRにおいて、ICAM-6ドメイン５のDNAを、７つの同一の25μlのPCR 反応を行うことによって標識した。この反応において、ヌクレオチド混合物中の２mM dCTPを、20μCiのdCTP³²P（New England Nuclear，Boston，MA）及び0.02m Mの未標識dCTPと置き換えた。それ以外のPCR条件は、１回目の増幅の場合と同じであった。７つの反応物から得られるPCRポリペプチドをまとめて、プローブを、Sephadex G50スピンカラム（5Prime，3 Prime,Inc．Boulder，CO）で取り込まれなかったヌクレオチドから精製した。ライブラリーファージを標準的な方法によりナイロンメンブレンに移し、そのフィルターを、42℃で、一晩、50％ホルムアミド、５×SSC、５×Denhardt溶液及び0.5％SDSにおいて、１×10⁶cpm/mlの標識されたドメイン５プローブを用いてハイブリダイズさせた。翌日、フィルターを、２×SSC及び0.1％SDSにおける室温で15分間の洗浄を３回、そして0.5×SSC及び0.1％SDSにおける50℃で10分間の洗浄を１回行った。次いで、フィルターをフィルムに曝した。１８個の陽性クローンを同定し、これらを精製して配列決定した。３個のクローンはスプライシングされていないことが見出されたが、15個のクローンは正しくスプラシングされ、膜貫通領域及び細胞質領域の両方を含むことが見出された。MT-3と呼ばれる最長クローンは、長さが2.3kbであることが見出され、ICAMポリペプチドに特徴的な５つの細胞外ドメインのうちの４個を有する領域をコードし、そしてポリ(A)⁺テイルをも含んだ。配列決定により、このクローンには5'配列がないことが示された。 MT-3の配列を配列番号：42に示す。実施例３クローンMT-3の組織発現どの組織においてICAM-6が発現しているかを決定するために、マウスの複数の組織のノザンブロット（MTN）（Clontech，Palo Alto，CA）を、³²P標識のICAM- 6プローブを用いてスクリーニングした。このプローブは、ICAM-6のドメイン２の中央部から細胞質テイルまで延びるMT-3由来のゲル精製した1.4kbのPstＩ／Sa cＩ DNA断片であった。このプローブを、³²P-dCTP及び³²P-TTPをRandom-Priming Kit（Boehringer-Mannheim，Indianopolis，IN）とともに使用するランダムプライミング反応によって標識した。ハイブリダイゼーションを製造者の指示プロトコルに従って行った。結果は、精巣において3kbの転写物が認められた一方で、正常な心臓、脳、脾臓、肺、骨格筋及び腎臓から得られたRNAとはハイブリダイズしなかった。実施例４マウスICAM-6の5'末端を決定するためのRACE PCR マウスICAM-6の5'末端を決定するために、RACE PCRをマウス精巣のMarathon-r eady^TMcDNAライブラリー（Clontech，Palo Alto，CA）で行った。cDNAはマウスの精巣RNAサンプルから調製され、マラソン（marathon）cDNAアダプターに連結されていた：このマラソンアダプターによって、相補的なプライマーであるAP-1 （配列番号：13）及びAP-2（配列番号：14）を使用するPCRが可能になる。 AP-1 CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC 配列番号：13 AP-2 ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC 配列番号：14 ICAM-6のリーダー、ドメイン１、ドメイン２及びドメイン３を含むPCR断片を増幅するために、I6MO40（配列番号：15）及びI6MO39（配列番号：16）の２つのプライマーを、MT-3に関して以前に決定された配列に基づいて設計した。 I6MO40 GCTCACAATCTCTGCCTTCCCAACCTCC 配列番号：15 I6MO39 GACAGTGGCGGTGACCTCGGCTCTTTGG 配列番号：16 プライマーI6MO40はMT-3のドメイン３の配列に対応し、プライマーI6MO39はMT-3 ドメイン２の配列に対応した。４個のプライマーを２回のPCRにおいて使用した。１回目において、25μlの反応を、１×Klen Taq緩衝液、２mM dNTPs、0.2μM AP−1、２μg/mlのI6MO40、0. 5μlのKlenTaqポリメラーゼ溶液、及び2.5μlのマウス精巣cDNAライブラリーを用いて、Advantage cDNA PCRキット（Clontech）を製造者の指示プロトコルに従って使用して行った。「タッチダウン」PCR反応を、Gene の反応は、１分間の変性工程、その後の94℃で５秒間の変性及び72℃で２分間のアニーリング／伸長の５サイクル、94℃で５秒間の変性及び70℃で２分間のアニーリング／伸長の５サイクル、そして94℃で５秒間の変性及び68℃で２分間のアニーリング／伸長の25サイクルによって行った。これらの条件では、アガロースゲル上で検出することができる増幅産物が得られなかったため、アニーリング／伸長温度を各サイクルについて２℃低くし、AP -1及びI6MO40のプライマーを使用してPCRを繰り返した。この条件下で、約900bp の１つの増幅産物がアガロースゲルで検出された。両方のPCRから得られた増幅産物を、それぞれ、水で１：50に希釈して、別のP CRに対するテンプレートDNAとして使用した。増幅を、AP-1及びI6MO40またはAP- 2及びI6MO39のプライマー対のいずれが一方を使用して行った。反応を、50μlの容量で、上記と同じ構成により、そして上記のように最も低い温度（70℃、68℃ 及び66℃）で行った。得られたPCR産物を、アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。アガロースゲル電気泳動によって、予想されるサイズで移動する２つのバンドに加えてスメア状のDNAが認められた。約900bpのバントがAP-1及びI6MO40のプライマー対を使用する反応から検出され、そして約700bpのバントがAP-2及びI6MO39のプライマー対を使用する反応から検出された。この900bp断片は、ICAMに由来するリーダー及び３つ以上のドメインをコードすることが予想されるDNAのサイズと一致した。小さい方の700bp断片は、プライマーI6MO40の相補配列と比較して、MT-3における相補配列の位置に基づくプライマーI6MO39の使用から予想されるDNAのサイズと一致した。この断片の配列を、AP-2及びI6MO37（配列番号：17）のプライマーを使用するPCRによって直接決定して、マウスICAM-6 cDNAの全長を推定した。 900bpの増幅産物を、TAクローニングキット（Invitrogen，San Diego，CA）を製造者の指示プロトコルに従って使用してベクターpCR2.1内に連結した。細菌を形質転換し、播種した。プラスミドDNAを、選択したコロニーから回収し、ドメイン２の配列に対応するプライマーI6MO36（配列番号：18）、及びT7.1を使用する PCRによって配列決定した。 I6MO37 AGGAGTGAAGGCACCCAG 配列番号：17 I6MO36 CAGAGCCTCACCCTTACC 配列番号：18 アンチセンスリボプローブ（下記参照）を産生する正しい方向の挿入物を有する１つのクローン（「ICAM-6マウス5'RACEクローン＃６」と呼ぶ）を選択し、その挿入物の配列を再度決定した。配列分析によって、この＃６クローンは、5'非翻訳DNA、ならびにリーダー配列、ドメイン１、ドメイン２、及びドメイン３の一部を含むことが示された。完全な5'RACE配列をMT-3 DNAと組み合わせて、マウスのICAM-6をコードする完全なcDNAを作製した。マウスICAM-6の推定アミノ酸配列が他の既知ICAMと異なることを確認するために、配列比較を、既知のマウスICAMのアミノ酸配列を用いて行った。比較により、マウスICAM-6は、５つの細胞外イムノグロブリンドメインを有し、そして他のマウスICAMポリペプチドに対する配列相同性を有する新規の ICAM分子であることが示された。アミノ酸比較の結果を表２に示す。実施例５可溶性のマウスICAM-6/IgG1発現ブラスミドの構築タンパク質の発現及び精製Ａ．プラスミドpDC1におけるICAM-6 D1-5/IgG1 マウスICAM-6の機能を解析するために、発現構築物を、プラスミドpDC1を使用して作製した。この構築物は、ICAM-6の細胞外ドメイン１〜５（D1〜D5）を、Ig G1由来のヒンジCH2−CH3ドメイン配列と結合したキメラポリペブチドとしてコードした。この発現構築物において、ICAM-6のコード領域の3'末端（MT-3のドメイン３からドメイン５までの配列に対応する）を、I6MO43（配列番号：34）及びI6 MO44（配列番号：19）のプライマー対を使用するPCRによって作製した。 I6MO43 ATGCCCTCGAGCAGGCCTTGGAC 配列番号：34 I6MO44 TCACGGCAGCTCAGCCACCAAGC 配列番号：19 PCRによって得られたICAM-6の3'断片を、IgG1断片をコードする配列に連結することを容易にするために、XhoI部位をI6MO43プライマー内に組み込んだ（下線部、上部参照）。ヒトIgG1のヒンジCH2−CH3［Burto，et al.，Immunol．22:162-2 06(1985)］をコードする903bpの断片を、ICAM−1/IgG1/pDC1から、SalI及びXbaI で消化することによって単離した。Sallの５'突出端は、上記のPRC増幅産物におけるXhoIの3'突出端と適合可能であった。融合DNAのICAM-6成分の（ドメイン３〜ドメイン５をコードする）3'末端の産生において、50μlの２つのPCR反応を、MT-3 DNAをテンプレートとして、プライマーI6MO43及びI6MO44、「高忠実」Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagen，La Jolla ，CA）を、対応するdNTP及び緩衝液とともに用いて、製造者のプロトコル従って行った。PCR反応は、上記のGene Amp^RPCRシステム9700（Perkin Elmer）で実施した。サンプルを、Gene Amp^RPCRシステム9700（Perkin Elmer）において、94℃で５分間保持し、その後、94℃で30秒間；55℃で30秒間；及び72℃で30秒間の30サイクルで処理した。約930bpのPCR産物を、QIAquIck Gel Extraction Kit（QIAGEN ，Chatsworth，GA）を使用してゲル精製し、BglII及びXhoIで消化して、QIAquic kキットを使用してゲル精製した。 ICAM-6ポリペプチドの5'末端をコードするDNA断片を、前記実施例に記載される「5'RACEマウスICAM-6クローン＃６」クローンHndIII/BglII消化物から得た。 ICAM-6配列の5'末端をコードするHindIII/BglII断片、ICAM-6配列の3'末端をコードするBglII/XhoI断片、及びIgG1のヒンジCH2−ＣH3をコードするSalI/XbaI 断片を一緒にして連結し、HindIII及びXbaIで予め消化されたpDC1に挿入した。得られるプラスミドをXL2 Blue Competent Cell（Stratagene，La Jolla，CA ）に形質転換して、形質転換体を、IC6MO36（配列番号：18）及びIC6MO43（配列番号：34）のプライマーを使用するPCRによってスクリーニングした。PCRによって陽性であることが見出されたクローンを配列決定によって確認した。融合タンパク質のICAM-6領域をコードするcDNAの配列分析によって、そのタンパク質配列内の180位のアミノ酸をコードする１つのヌクレオチドが、クローンM T3におけるヌクレオチドと異なっていることが示された。クローンMT3において、180位のアミノ酸はロイシンであるが、「5'RACEマウスICAM-6クローン＃６」を得るためにRACEによって作製されcDNAは、180位でフェニルアラニンをコードした。この変異は、それが多型であるかもしれず、あるいは増幅過程から生じているかもしれないが、ドメイン２とドメイン３の間で、システイン残基により結合しているイムノグロブリン様ドメインの外側に位置していた。そして、その変異は細胞外ドメインの結合機能とって重要でないと考えられた。Ｂ．発現及び精製 COS細胞のトランスフェクションを、ICAM-6/Igをコードする上記のpDC1構築物の20μgを用いて、DEAEデキストラン法を使用して行った。簡単に記すと、0.3mg /mlのDEAEデキストラン（Pharmacia，Uppsala，Sweden）及び0.1mMのクロロキン（Slgma，St．Louis，MO）を含有する2Omlの無血清ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を、15cmプレートにおいて50〜80％コンフルエンスのCOS細胞に加えた。37℃及び５％CO₂で２時間インキュベーションした後、細胞を、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有するDMEM中で１分間インキュベーションして、10％ FBS、１mMピルビン酸ナトリウム、100u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、及び２mM L−グルタミンにより補充されたDMEM中で一晩インキュベーションした。翌日、培地を、５％FBSのみを含む新しい培地と交換した。上清を２〜５日毎に集め、0.2μmのフィルターに通してろ過し、精製するまで４℃で貯蔵した。上清中のICAM-6/Igタンパク質の濃度は、少なくともトランスフェクション後の３週間は大きく減少しなかった。 ICAM-6/Igタンパク質を、COS上清から、HiTrapプロテインＡカラム（Pharmaci a）を使用して回収した。最初に、カラムを、カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（CMF-PBS）の少なくとも100mlで平衡化した。カラムへの添加を、Biorad Econo Systemを使用して行った。COS上清を、１〜２ml /分の速度でカラムに添加した。上清の添加後、カラムを少なくとも100mlのCMF-PBSで洗浄した。タンパク質を、100mMクエン酸（pH3.0）を使用して、１ＭTris（pH9.0）を含有する中和緩衝液中に直接溶出した。溶出したタンパク質を、Slide-a-Lyzerカセット（Pierce，Rockford，IL）を使用して、CMF-PBSに対して、少なくと24時間、少なくとも３回の緩衝液交換によって透析した。透析したタンパク質を、必要な場合には、BIOMAX 30K遠心分離フィルター（Mi llipore，Bedford，MA）を使用して濃縮した。タンパク質濃度を捕獲ELISAによって下記のように測定した。Immulon４プレート（Dynatech）を、0.1Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）で希釈したヤギ抗ヒトイムノグロブリン（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）の３μg/mlで、1.5〜2.5時間 37℃でコーティングした。プレートを0.05％Tweenを含有するCMF-PBSで３回洗浄した。（５％FBSを含むDMEMで希釈した）タンパク質サンプルを加え、37℃で30 分間インキュベーションした。プレートを３回洗浄した。捕獲されたタンパク質を、５％FBSを含むDMEMで１：2000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP ）結合ヤギ抗ヒトイムノグロブリン（Jackson ImmunoResearch）を用いて、プレートで30分間37℃でインキュベーションして検出した。プレートを３回洗浄し、 o-フェニレンジアミン（OPD）（Sigma）で発色させ、Dynatech MR5000プレートリーダーで読み取った。タンパク質の濃度を、ICAM-6/Igコントロールとの比較によって見積もった。タンパク質の純度は、２μgの精製タンパク質を含有するS DS-PAGEゲルのクーマシー染色によって評価した。すべてのICAM-6調製物は50％〜90％の純度であることが見出され、明らかな夾雑物としてウシイムノグロブリンのみを有した。Ｃ．プラスミドpDEF-1におけるICAM-6 D1-5/IgG1 発現レベルを増大させる目的で、ICAM-6/Ig構築物を、CHO細胞での発現のためにpDEP14ベクターで作製した。pDEF14ベクターは、CHO細胞において高レベルの発現を可能にすることが以前に示されたチャイニーズハムスターのEP-1αプロモーターを含む。ICAM-6/Ig配列を、HindIII及びXbaIで消化することによってpDC- 1構築物から取り出した。断片をゲル精製して、pDEF14から得られる738bpのNotI /HindIII断片及び19,723bpのNotI/XbaI断片と連結した。Ｄ．発現及び精製 pDEF14/ICAM-6/IgプラスミドをXL-2 Blueコンピテント細胞（Stratagene）に形質転換して、コロニーをPCRによってスクリーニングした。得られるクローンのpDEF14/ICAM-6/Igを使用して、CHO細胞を安定的なトランスフェクションを行った。簡単に記すと、細胞を、0.05％トリプシン／0.53mM EDTAを使用して50％コンフルエンスのCHO培養物から回収して、10％FBS、１mMピルビン酸ナトリウム、100u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、２mM L-グルタミン、0.1 mMヒポキサンチンナトリウム、及び1.5mMチミジンを含有するDMEM/F12培地（HT ＋DMEM/F12）で処理した。回収した細胞をCMF-PBSで洗浄した。約20×10⁶個の細胞のトランスフェクションを、予めエタノール沈澱し、そして20mM HEPES-NaOH （pH７）、137mM NaCl、５mM KCl、0.7mM Ha₂HPO₄及び６mMデキストロースを含有する800μlのHBS緩衝液中に再懸濁した50μgのDNAを用いて、BioRad GenePuls erエレクトロポレーターを960μFの容量及び290Ｖの電圧で使用して行った。エレクトロポレーション後、細胞を室温で10分間再生させた。細胞を10mlのHT＋DM EM/P12で洗浄し、遠心分離によってペレット化し、そしてHT＋DMEM/P12を含有する２枚の10cmプレートに播種するために再懸濁した。トランスフェクションの２日後、トランスフェクタントをトリプシン／EDTAによって集め、これを使用して、10％FBS、１mMピルビン酸ナトリウム、100u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン及び２mM L-グルタミンを含有するHT＋DMEM/F12培地で、１：８、１：16、１：32及び１：64に希釈して15cmプレートに播種した。２週間後、約300個のコロニーが得られた。コロニーを、上記のようにトリプシン／EDTAを使用して回収し、これを使用して、ウエルあたり１個の細胞になるように計算してプレートウエルに播種した。18日後、 120個の単一コロニーのウエルを、COS産生タンパク質を用いて上記のようにELIS Aによってスクリーニングした。これらのクローンのうち18個を拡大培養し、３日後にELISAによって再度のスクリーニングを行った。４個のクローンを選択し、さらに拡大培養した。これによって、３日間で、ICAM-6/Igが１mlあたり3.7μ gと見積もられる上清が得られた。実施例６全長のマウスICAM-6 cDNAの単離全長のマウスICAM-6 cDNAを単離する目的において、２回目のスクリーニングを、市販のマウス精巣ライブラリー（Stratagene）由来の２×10⁶pfuについて、実施例２に記載されるMT3クローンを使用して行った。ハイブリダイゼーション条件は上記の通りであったが、ライブラリーはICAM-6ドメイン２のプローブとハイブリダイズした。このプローブを、MT-3配列に由来するドメイン２の配列に基づいて設計されたプライマ−I6MO36（配列番号：18）及びI6MO37を使用するPCR で作製した。 I6MO36 CAGAGCCTCACCCTTACC 配列番号：18 I6MO37 AGGAGTGAAGGCACCCAG 配列番号：19 このプローブを２回のPCRを使用して標識して、ハイブリダイゼーションを実施例２に記載されるように行った。 11個のクローンを同定し、MT2-36と呼ぶ１個のみが、全長のICAM-6をコードしているようであった。このクローンは、２つの挿入物を含有した：ホスファターゼをコードする0.8kbの挿入物及びマウスICAM-6をコードする2.8kbの挿入物。2. 8kbのマウスICAM-6挿入物を分析した。配列分析によって、このMT2-36の配列は、MT-3配列から推定されるICAM-6配列、及び実施例４に記載されるRACE増幅産物と同一であることが示された。MT2-36クローン（ICAM-6）のヌクレオチド配列を配列番号：１に示す。それから推定されるアミノ酸配列を配列番号：２に示す。 MT2-36をコードするプラスミドMT2.36を、細菌宿主におけるブタペスト条約の条項の下、American Type Culture Collection（12301 Rockville MD，20852）に1 997年10月16日に寄託し、寄託番号第98557号が与えられた。実施例７さらなるICAM-6発現プラスミドの構築可溶性のマウスICAM-6の発現を改善し、前記のICAM-6/IgG1キメラ（実施例５）において見出されたPhe¹⁸⁰の変異を除去する目的で、pCI-neoベクター（Prome ga，Madison，WI）においてICAM-6のドメイン１〜５／IgG1をコードする発現構築物を作製した。38位におけるグルタミン酸（Glu）からアラニン（Ala）への変異を含有する第２の発現構築物もまた作製した。このGlu³⁸は、ICAM-6のドメイン１（Ile-Glu-Thr-Phe）内における保存されたモチーフの一部であり、この保存モチーフは、ICAM-1及びICAM-3において、LFA- 1との結合に必須であることが明らかにされた。従って、他のICAMとの類推によって、アミノ酸配列におけるこの変化により、ドメイン１内の推定的なLFA-1結合部位が除去されることが予想された。Ａ．機能分析のためのpCI-neoにおけるICAM-6ドメイン１〜５／IgG1 この構築物を作製するために、ドメイン３までのICAM-6のリーダー領域を、MT 2-36クローンをテンプレートとして使用するPCRによって増幅した。２つのプライマーを設計した；I6MO55（配列番号：28）はマウスICAM-6の5'末端に相補的であり、I6MO56（配列番号：29）はドメイン３内の配列に基づいた。 I6MO55 GCGATGCTAGCAAGCTTCACAGCTCATCACCATGGCAATG- CTTCTGTTGGGTGTCTGGACACTGCTGGCC 配列番号：28 I6MO56 GGACCCAGAGACACAAGGCAAGTCAGTTCC 配列番号：29 I6MO55プライマーは、他の構築物において高レベルのICAM発現を誘導することが以前に示された短いコザック配列（斜体字）、及び２つのクローニング部位（Nh eI及びHindIII、下線部）を含有していた。PCR反応は、MT2-36 DNAをテンプレートとして、プライマーI6MO55及びI6MO56、及び「校正」Pwo DNAポリメラーゼ（B oehringer Mannheim，Indianapolis，IN）を使用して製造システム9700（Perkin Elmer）において、95℃で１分間保持し、次いで、94℃で 15秒間、50℃で30秒間、そして72℃で45秒間の30サイクルによって処理した。PC R産物（約880bp）は、ゲル電気泳動において予想されたサイズで移動した。この断片をゲル精製し、NheI及びBglIIで消化し、再度ゲル精製した（Wizard PCR精製キット、Promega、Madiso n、WI）。マウスICAM-6ドメイン１〜５／IgGキメラの構築を２段階で行った。最初に、（リーダーからドメイン３までをコードする）ICAM-6のNheI/BglII断片を、実施例５に記載される（ドメイン３〜ドメイン５をコードする）ICAM-6のBglII/XhoI 断片に連結し、NheI及びXhoIで予め切断されたpCI-neoベクターに挿入した。得られるプラスミドをXL1 Blue Utracompetent細胞（Stratagene，La Jolla，CA）に形質転換し、コロニーを、T3.1（配列番号：４）及びT7.1（配列番号：３）のプライマーを使用するPCRによって正しい挿入物を有するプラスミドの存在について調べた。第２段階で、第１段階の生成プラスミドをXhoI及びXbaIで消化し、ゲル精製した。実施例５に記載される903bpのSalI/XbaIのヒトIgG1ヒンジCH2−CH3断片を前記のICAM-6配列及びベクター配列に連結した。得られるプラスミドを上記のようにE.coli XL1 Blue細胞に形質転換して、細菌を、正しいサイズの挿入物を有するプラスミドの存在についてPCRによってスクリーニングした。クローンの分析を配列決定によって行い、正しい挿入物が存在すること、及びPhe¹⁸⁰の変異が存在しないことを確認した。Ｂ．機能分析に必要なグルタミン酸／アラニン変異を有するpCI-neoにおけるICA M-6 ドメイン１〜６／IgG1 この構築物に関して、Glu³⁸を、推定的なLFA-1結合部位を除去するためにアラニンと置換した。３つのプライマーを設計して変異を作製した。第１のプライマーI6MO57（配列番号：30）は、グルタミン酸のコドンGAGをアラニンのコドンGCG（下線部）によって置換したセンスプライマーであった。第２のプライマーI6MO58（配列番号：31）は、グルタミン酸のアンチセンスコドンCTCをアラニンのアンチセンスコドンCGC（下線部）によって置換したアンチセンスプライマーであった。第３のプライマーI6MO59 （配列番号：36）は、I6MO55の5'末端と同一であるが、短かった。 I6MO57 CCTGGGCCCAGTGGAATCGCGACCTTCTAA 配列番号：30 I6MO58 TAAGAAGGTCGCGATTCCACTGGGCCCAGG 配列番号：31 I6MO59 GCGATGCTAGCAAGCTTCACAGCTCATCACC 配列番号：36 変異を、２回のPCRを使用して作製した。第１回目において、アラニン変異を含有する２つの断片を作製した；217bpの5'断片をプライマーI6MO55及びI6MO58 で作製し、728bpの3'断片をプライマーI6MO57及びI6MO56で作製した。第１回目のPCRを、上記のように、テンプレートとしてのMT2-36 DNA及びPwo DNAポリメラーゼを使用して行った。PCR反応で得られる両方の断片をゲル精製し、次いで1/5 0に希釈して、２回目のPCRでのテンプレートとして使用した。 ICAM-6のリーダーからドメイン３までの領域及びGlu³⁸/Ala³⁸変異を含有する１つのDNA断片を作製するために、２回目のPCRを行った。プライマーI6MO59及び I6MO57を用いた。テンプレートは、第１回目のPCRにおいて得られた217bp及び72 8bpの断片の混合物であった。この２つのDNA断片は30bpが重複し、従ってこれらはPCR反応のアニーリング工程中において互いにアニーリングした。単一ストランド化された領域への伸長によって、ICAM-6のリーダーからドメイン３までの領域を含有し、かつAla³⁸変異を含有する915bpの断片が得られた。PCR反応を、上記のように、Pwo DNAポリメラーゼを用いて行った。得られた915bpのICAM-6断片をNheI及びBglIIで消化してゲル精製した。この断片を、上記のBglII/XhoIのICAM-6断片（ドメイン３〜５）と一緒にし、NheI及び XhoIで予め消化されたpCI-neoベクター内に連結して、pCI-neo ICAM-6（リーダー〜ドメイン５、Ala³⁸）プラスミドを得た。最後に、SalI/XbaIのIgG1-Fc断片を上記のプラスミド内に挿入した。得られるプラスミドはICAM-6 Ala³⁸/IgGキメラをコードした。これは、配列決定によって確認された。 HIS タグのICAM-6ドメイン１〜３マウスICAM-6/IgG1キメラ内のヒトIgG1の存在は、発現したポリペプチドを、免疫組織学に必要なポリクローナル抗体を惹起させるための抗原として使用することを困難にすると考えられた。従って、そのIgG1抗原を有さない可溶性のマウスICAM-6の産生を可能にする発現構築物を調製した。可溶性のICAM-6分子を産生するために、マウスICAM-6の最初の３つのドメインを細菌の発現ベクターpBAR8a内に挿入した。このベクターを使用して発現されるタンパク質は、誘導性のアラビノースプロモーターの制御下で転写される。pBAR 8aプラス番号：17）をそのクローニング部内にコードし、これによってタンパク質の検出及び精製が可能になる。 HISタグ CATCACCATCACCATCAC 配列番号：32 マウスICAM-6の最初の３つのドメインを、２つの理由で選択した。第１に、ICAM -6分子のＮ末端部分との免疫反応が可能であり、そしてICAM-6機能を阻止することができ、組織切片でのICAM-6分子を検出することもできる抗体が所望された。第２に、他のICAMタンパク質を用いた経験に基づいて、最初の３つのドメインの発現により、E.coliにおいて可溶性タンパク質が得られることが可能であると考えられた。びHISタグ配列と読み枠を合わせてpBAR8a内に挿入した。最初に、ICAM-6のドメイン１からドメイン３をコードするDNAをPCRによって作製した。一方のプライマーI6MO52（配列番号：33）を、ドメイン１の5'末端に相補的であるように設計した。このプ読み枠を合わせて位置することを可能にするKpnI（下線部）を含む。別のプライマーI6MO54（配列番号：37）を、ドメイン３の3'末端に相補的であるように、そしてpBAR8aにおけるクローニングを可能にするSpeI部位（下線部）及びICAM-6融合タンパク質の翻訳を停止させる停止コドン（斜体字）を含有するように設計した。 I6MO52 CGAGGAGCTGTTTCAGGTACCTGTCC 配列番号：33 I6MO54 CGTTCACTAGTTTTCTGCTCTCAGGGACC 配列番号：37 PCR増幅を、マウスICAM-6クローンのMT2-36をテンプレートとして、I6MO52及びI 6MO54をプライマーとして、そして「校正」Pwo DNAポリメラーゼ（Boehringer M annheim，Indianapolis，IN ）を使用して製造者のプロトコルに従って行った。反応は、Ge ４分間変性させ、その後94℃で30秒間の変性、52℃で30秒間のアニーリング、及び72℃での１分間の伸長の30サイクルによって行った。予想されるサイズで移動する800bpのPCR断片をゲル精製し（Wizard PCR Purification System)、Promega ）、KpnI及びSpeIで消化し、再度ゲル精製して、KpnI及びSpeIで予め消化されたゲル精製pBAR8aに連結した。得られるプラスミドを、製造者のプロトコルに従って、DH5αコンピテント細胞（Gibco BRL，Gaithersburg，MD）に形質転換し、テトラサイクリンアガ入物の存在を配列決定することにより確認した。 ICAM-6融合タンパク質を産生するために、ICAM-6/pBAR8aプラスミドを、アラビノース代謝が欠損しているE.coli株に形質転換した。少量スケールの実験において、形質転換コロニーを30℃で増殖させ、そしてタンパク質発現を誘導するために、アラビノースを0.5％の最終濃度に添加した。サンプルを誘導の１時間後及び２時間後に採取し、遠心分離によってペレット化して、冷CMP-PBSで再懸濁した。発現タンパク質の存在を、12％SDS-PAGEゲル（Novex，San Diego，CA）で調べた。予想される分子量に対応する約38kDで移動するタンパク質が検出された。このIC AM-6融合タンパク質を、標準的なプロトコルに従って、ニッケル精製カラム（Ni -NTA Silica，QIAGEN，Chatsworth，GA）を使用して精製する。Ｄ．pCI-neo におけるICAM-6のドメイン１〜５別の可溶性ICAM-6構築物を、ICAM-6の５つの細胞外ドメインて、IgG1に対する反応性を有することを所望しない場合、ウサギまたはニワトリのいずれかにおいてポリクローナル抗体を惹起させるために哺乳動物細胞で発現させた。号：39）のプライマーを使用するPCRによってICAM-6の3'末端に取り込んだ。 I6MO44 TCACGGCAGCTCAGCCACCAAGC 配列番号：19 I6MO45 AATTTCTCGAGTCACTTGTCATCGTCGTC- CTTGTAGTCCTCAGGCAGGCCTTGGAC 配列番号：39 これらのプライマーを、MT-3 DNAをテンプレートとする50μlの２つのPCR反応において使用した。サンプルを94℃で５分間保持し、次いで、94℃で30秒間、55℃ で30秒間、及び72℃で30秒間の30サイクルによって処理した。PCR産物（約850bp ）をゲル精製し、XhoI及びBglIIで消化し、再度ゲル精製した（QIAquick Gel Ex traction Kit，QIAGEN，Chatsworth，GA）。ICAM-6の5'末端を、実施例４に記載される「5'RACE ICAM-6クローン＃６」をSpeI及びBglIIで消化して、720bpのDNA 断片をゲル精製することによって単離した。ICAM-6の5'末端及び3'末端を含有するDNA断片を、NheI及びXhoIで予め消化されたpCI-neo内に連結した。連結反応混合物をXL2 Blueコンピテント細胞に形質転換し、形質転換体をPCRによってスクリーニングした。プラスミドのICAM-6配列を、上記のように配列決定することによって確認した。正しい配列を有する３個のクローンを、ICAM-6/Ig構築物に関して前記のようにCOS細胞にトランスフェクションした。体（Eastman Kodak Company，Nwe Haven，CT）を使用するウエスタンブロットにより検出できながった。実施例８抗マウスICAM-6抗体の調製抗マウスICAM-6モノクローナル抗体は、異なる方法で作製することができる。Ａ．マウス脾内注射２匹のマウスを予備採血し、０日目に５μgのICAM-6/IgG1キメラタンパク質を含むPBSを脾内注射することによって免疫化した。免疫化を、以前に報告された方法［Spitz，Meth．Enzymol．121:33-41(1986)］によって行った。11日目に、マウスから採血し、ELISAによって免疫化抗原に対する反応性についてアッセイした。簡単に記すと、Immulon４プレート（Dynatech，Cambridge，MA）を、ウシ及びマウスの血清タンパク質（Jackson ImmunoResearch）に予備吸着させたヤギ抗ヒト抗体でコーティングした。プレートを洗浄して、ICAM-6 IgG1を含有するC OS上清を加えた。陰性コントロールとして、ICAM-1/IgG1融合タンパク質を、10 ％FBSを含むRPMIで２μg/mlに希釈して、同じように固定化した。プレートをインキュベーション及び洗浄した後、免疫前マウス血清及び免疫マウス血清を加えた。ヤギ抗マウスIgG1(fc)西洋ワサビペルオキシダーセ(HRP)結合抗体（Jackson ）を、何らかのマウスの抗ICAM-6抗体を検出するために使用した。結果は、マウスの免疫血清は、免疫前血清と比較して、固定化したICAM-6融合タンパク質またはICAM-1融合タンパク質のいずれに対しても反応性を示さないことを示した。従って、この手順による免疫化はこれ以上行わなかった。Ｂ．ハムスター脾内注射１匹のアルメニアンハムスター（Cytogen Research and Development，West R oxbury，MA）を予備採血し、０日目に、上記のように、５μgのICAM-6/IgG1キメラタンパク質を含むPBS溶液を脾内注射することによって免疫化した。11日目の試験採血を、上記と同様に、ELISAによってアッセイした。しかし、固定化したI CAM-3/IgG1を陰性コントロールとして使用し、そしてヤギ抗アルメニアンハムスターIgG HRP結合抗体（Jackson）を使用して血清の反応性を検出した。結果は、ICAM-3と比較して、固定化ICAM-6との血清の弱い反応性を示した。 14日目に、ハムスターに上記と同じ抗原を脾内に再度注射した。ハムスターは麻酔の最中に死亡したため、脾臓を直ちに取り出し、以前に報告された技法［Bo ss，Meth．Enzymol．121:27-33(1986)］に記載されるように、ICAM-6/IgG1抗原の存在下での単一細胞懸濁物として培養した。４日後、脾臓細胞を集め、標準的な手順を使用してNS-1細胞と融合した。11日後、ハイブリドーマの培養上清を、上記のように、ELISAによって、固定化したICAM-6/IgG1またはICAM-3/IgG1に対してスクリーニングした。結果は、ICAM-6との特異的な反応性を示さなかった。Ｃ．ICAM-6 D1-5/IgG1 を含むフロイントアジュバントを用いたハムスターの免疫化２匹のアルメニアンハムスター（Cytogen Research and Development，West R oxbury，MA）を０日目に予備採血し、50μgの ICAM-6/IgG1融合タンパク質を含む完全フロイントアジュバント（200μlの総容量）で免疫化した。15日目に、ハムスターを、50μgの同じ抗原を含む不完全フロイントアジュバント（IFA）で追加免疫した。25日目に、動物から採血して、抗体力価をELISAにより測定した。 Immulon４プレート（Dynatech，Cambridge，MA）を、ウシ及びマウスの血清タンパク質（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）に予備吸着させたヤギ抗ヒト抗体でコーティングした。ICAM-6/IgG1融合タンパク質を、COSトランスフェクション細胞（実施例２に記載）の上清から捕獲した。ICAM-1/IgG1融合タンパク質を10％FBSを含むRPMIで２μg/mlに希釈して、陰性コントロールとして個々のウエル中で捕獲した。ハムスターから得られた免疫前血清及び免疫血清を希釈し、ICAM-6/IgG1捕獲後の個々のウエルに添加した。ヤギ抗ハムスター西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗体を、ハムスターの抗体を検出するために使用した。２匹のハムスターから得られた免疫血清は、ICAM-6/IgG1及びICAM-1/IgG1のウエルの両方において、試験した最高希釈度（１：1,600）で、免疫前血清を超える反応性を示した。血清の抗体結合の特性を決定するために、別のELISAを行った。この場合、ICAM-1/IgG1を、希釈したハムスター抗体に加え、それによって両方の融合タンパク質のIgG1部分に対する反応性を吸収した。捕獲ICAM-6/IgG1 に対する特異的な反応性は検出されなかった。ハムスターにおける抗原応答性を改善する目的で、追加免疫を、４週間にわたり定期的に、ICAM-6/IgG1含むIFAを使用して投与した。特異的な反応性が検出される場合、ハムスターに、ICAM-6/IgG1を含むリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を腹腔内注射することにより最後の追加免疫を行い、４日後に脾臓を無菌的に取り出した。脾臓細胞を、標準的な手順に従って、NS-1メラノーマ細胞（A. T.C.C.，Rockville，MD）と２：１の比で融合する。培養上清を、捕獲したICAM- 6/IgG1及びICAM-1/IgG1を使用して、上記のようにELISAによってスクリーニングする。Ｄ．ポリクローナル抗血清を産生するためのウサギの免疫化パク質として発現する可溶性ICAM-6を免疫原として使用して、免疫組織学染色に有用なポリクローナル抗血清を産生するため、ニュージーランド白ウサギのそれぞれに、50〜150mgのICAM- トを皮下注射する。その後の注射を、同じような量の免疫原で、ただし不完全フロイントアジュバントで３〜４週間の間隔で行う。ウサギがらの採血を３回目の注射の７〜14日後及び引き続いて行われた各注射時に行い、血清をELISAによって、ICAM-6/IgG1融合タンパク質に対する特異的な反応性についてアッセイする。特異的な反応性が検出される場合、標準的な技術を使用してウエスタン分析及び免疫細胞化学を行う。実施例９マウスICAM-6の機能分析 ICAM-6の生物学的関連性を明らかにする目的で、接着アッセイを、固定化マウスICAM-6/IgG1融合タンパク質（実施例５）と、既知のICAMと結合するインテグリンを発現する細胞とを使用して行った。Ａ．ICAM-6/LPA-1 （CD11a/CD18）結合の分析最初の接着アッセイを、固定化したICAM-6/IgG1と、CD11a/CD18インテグリンを発現するが、他のCD18インテグリンを発現しないことが知られているマウスＴ細胞株のPLPを使用して行った。２つの他の細胞株として、ヒトＢリンバ芽球様細胞株のJY８及びヒト前骨髄性単球細胞のHL-60もまたこのアッセイにおいて使用した。陰性コントロールとして、CD18インテグリンを発現しないマウスのpre- Ｂミエローマ細胞株のNS-1もまたアッセイした。接着アッセイを、96ウエルEasy Washプレート（Corning）において、以前に報告された手順［Morla et al.，Nature 367:193-196(1994)］の改変法を使用して行った。各ウエルを、50μlの５μg/mlマウスICAM-6/Ig融合タンパク質または５ μg/mlヒトICAM-1/Igタンパク質（両方とも、50mM重炭酸塩緩衝液（pH9.6）のストック溶液から得られる）でコーティングした。入れた細胞の100％結合を定量するためのコントロールウエルを、抗CD18モノクローナル抗体でコーティングした：ヒト細胞については抗CD18抗体のM17または22F12Cを使用し、マウス細胞については抗CD11a抗体のM17または抗CD3抗体の145-2C11を使用した。バックグラウンド結合を測定するためのコントロールウエルを、ウシ血清アルブミン（BSA ）でコーティングした。マウスICAM-6融合タンパク質またはマウスICAM-1融合タンパク質のいずれかを加えた後、ウエルを、１％BSAを含むPBSで、１時間、室温でブロッキングした。ウエルを洗浄して、５mM KCl、150mM NaCl、１mM MgCl₂、１mM CaCl₂、20mM HEPES、10mM D-グルコース及び５％FBSを含有する200μlの接着緩衝液を、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）（20ng/ml）の存在下または非存在下のいずれかで加えた。結合の特異性を決定するために、CD18 と免疫反応し得るモノクローナル抗体の抗体2E6、またはヒトCD11aと免疫反応し得るモノクローナル抗体の抗体TS1/22（ATCC）を接着緩衝液に添加した。次いで、細胞（５×10⁶細胞/mlの100μl）を各ウエルに加えて、プレートを、37℃で、５％CO₂中で30分間インキュベーションした。接着性細胞を、50μlのグルタルアルデヒド溶液を添加して固定化し、洗浄して、0.5％クリスタルバイレット（Sigma）溶液で染色した。洗浄し、70％エタノールを添加した後、接着性細胞を、570nmでの吸光度を、SPECTRAmax^TM250マイクロプレート分光光度計システム（Molecular Devices）を使用して測定することによって定量した。接着性細胞の割合を下記の式を使用して求めた：結果は、PLP細胞が、陰性コントロールのNS-1細胞株と比較して、固定化ICAM- 6/IgG1に優先的に結合することを示した。PLPの結合は、固定化ICAM-6/IgG1の濃度に依存し、抗CD18抗体の存在下で阻止された。さらに、PLPの結合は、CD11a/C D18インテグリンを活性化することが知られているPMAの存在下で増大した。PLP 細胞の結合は、ヒトICAM-1/IgG1でコーティングしたウエルでは検出されながった。JY-8細胞及びHL-60細胞もまた、固定化ICAM-6/IgG1に結合し、その結合は抗ヒトCD11a抗体の存在下で阻止された。これらの結果により、マウスICAM-6はマウス及びヒトのCD11a/CD18の両方と結合し得ることが示された。Ｂ．ICAM-6/Mac-1 （CD11b/CD18）及びICAM-6/p150/95（CD11c/CD18）結合の分析 CD11b/CD18及びCD11c/CD18に結合するマウスICAM-6を評価するために、両方のインテグリンを発現するマウス単球細胞株のRAW 264.7、及びCD11b/CD18を発現するヒトHL-60細胞株を上記の接着アッセイに用いた。結合の特異性を、抗マウスCD11b抗体（M1/70）、抗マウスCD11c抗体（N418）、抗マウスCD18抗体（2E6）、抗ヒトCD11b抗体（44AACB）、または抗ヒトCD18抗体（22F12C）を使用して決定した。さらに、抗体阻止の特異性を、非阻止性のマウスCD18抗体（M18）を使用して決定した。結果は、RAW 264.7細胞が固定化ICAM-6と結合し、その結合が、抗マウスCD11b モノクローナル抗体、抗マウスCD11cモノクローナル抗体、及び抗マウスCD18モノクローナル抗体の両方の存在下で阻止されることを示した。しかし、結合は、非結合性の抗CD18抗体によって影響を受けながった。HL-60はまた、ICAM-6/IgG1 がコーティングされたウエルに結合し、その結合は抗ヒトCD11b抗体によって阻止された。これらの結果により、マウスICAM-6は、マウス及びヒトのCD11b/CD18 の両方と結合し、そしてマウスCD11c/CD18に結合することが明らかにされる。Ｃ．ICAM-6/ α-d結合の分析 α_dのICAM-6への接着を、ラットα_d及びヒトCD18をコードするcDNAでトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を用いて試験した。α_d/huCD18 CHO細胞を、上記のように、固定化されたマウスICAM-6/IgG1、ヒトICAM-1/IgG1、またはヒトVCAM-1/1gG1の融合タンパク質のいずれかに対する接着について試験した。α_dに関する結合の特異性を、抗ラットα_dモノクローナル抗体（205C）及び抗ヒトCD18モノクローナル抗体（22F12C）を使用して決定した。非結合性抗体を、ヒトVCAM-1/IgG1のα_d に対する結合の陰性コントロールとして使用した。予備的な結果は、マウスICAM-6がα_d/CD18インテグリンと結合することを示した。実施例１０マウスICAM-6転写のin situハイブリダイゼーション ICAM-6がどの細胞で発現しているかを同定するために、in situハイブリダイゼーションを、マウスICAM-6リボプローブを用いてマウスの精巣組織切片について行つた。ICAM-6のドメイン１及び２のアンチセンスリボプローブを、マウスの精巣組織切片におけるICAM-6 mRNAを検出するために使用した。ICAM-6 mRNAにハイブリダイズしないICAM-6のセンスプローブを陰性コントロールとして使用した。上記のプローブを、製造者のプロトコル（Stratagene）に従って、α^-35Ｓ UT Pを用いるRNA転写により標識した。凍結組織切片を、コーティングしたスライドガラス（Superfrost Plus VWR，Seattle，WA）に置き、パラホルムアルデヒドで固定し、変性し、一連のエタノール洗浄により脱水して乾燥した。組織切片のハイブリダイゼーションを、一晩、50℃で、50％ホルムアミド、0.3ＭNaCl、20mM Tris pH7.5、５mM EDTA）１×Denhardt溶液、10％デキストラン硫酸、0.5mg/ml 酵母RNA、100mMジチオスレイトール（DTT）、及び組織切片あたり５×10⁵cpmのプローブを含む中で行った。スライドガラスを、10mM DTTを含有する４×SSCで室温で１時間洗浄し、その後10mM DTTを含有する50％ホルムアミド１×SSCで60 ℃で40分間洗浄し、そして２×SSCで１回洗浄し、0.1×SSCで１回洗浄した。最後の２回の洗浄は、穏やかに攪拌しながら室温で30分間行った。組織切片を脱水し、風乾し、写真乳剤（Kodak NTB2 Nuclear Emulsion，International Biotechnologies，Hartford ，CT）でコーティングして感光させた。現像後、組織切片をヘマトキシリン−エオシンで対比染色して、銀粒子を暗視野顕微鏡によって可視化した。強いハイブリダイゼーションシグナルが、マウスICAM-6アンチセンスプローブを用いて４日間の感光後、マウス精巣の細管内の第一精母細胞で検出された。それとは著しく対照的に、コントロールのICAM-6センスリボプローブとハイブリダイズした精巣組織は、全くハイブリダイゼーションしなかった。実施例１１部分的なヒトのゲノムICAM-6 DNAの同定マウスAA065987配列を、その配列がGenbank配列のどれとも一致していないことを明らかにするために、２番目のBLASTN検索における提示配列として使用した。Genbankデータベースから、J03071と呼ばれる約66,5kbのヒトのゲノム配列が、AA065987内の対応する配列に対して約70％のヌクレオチド相同性を有し、アミノ酸レベルで約61％の相同性を有する領域を含有するとして同定された。AA0659 87に相同的な配列に加えて、J03071は、ヒト成長ホルモン（GH1及びGH2）及び絨毛性ソマトトロピンポリペプチドホルモン１、２及び５の完全なタンパク質コード領域を含む。J03071の染色体位置（17q22-24）は、PECAM（17q23）及びICAM-2 （17q23-17q25）をコードする遺伝子の近傍であることが決定された。 J03071のゲノムDNA配列内において、既知のICAMに対する相同性を有するタンパク質配列をコードする５つの領域が同定された。DNAのこの５つの領域は、１つの部分的なエキソン及び４つの完全なエキソンを表しているようであった。この５つの領域によりコードされるタンパク質配列を調べることによって、そしてICAM-1のイントロン／エキソンのスプライシングパターンに対する類推によって、この５つのタンパク質コード領域はエキソン２〜６と呼ばれた。最初の領域であるエキソン２（ヌクレオチド 66,422〜66,495）は、ICAMにおけるドメイン１の一部に対して相同性を有する。その配列は、J03071のDNAの末端まで拡がり、従って、エキソン２の一部のみを表してることが十分に考えられた。（エキソン３によってコードされ、ヌクレオチド64,225または66,226からヌクレオチド64,544までの）ドメイン２と呼ばれる領域が翻訳される場合、フレームシフトが、オープンリーディングフレーム及び他のICAMとの相同性を維持するために必要であった。ドメイン３をコードし、ヌクレオチド63,697からヌクレオチド63,975または63,976のいずれかまでのエキソン４は、完全なオープンリーディングフレームをコードし、既知ICAMとの相同性を示した。２つの停止コドンが、エキソン５（ヌクレオチド62,895〜63,163）によってコードされるドメイン４の中に見出された。１つの停止コドンが、エキソン６（ヌクレオチド61,329〜61,569）によってコードされるドメイン５の中に見出された。しかし、すべてのドメインにおいて、そのアミノ酸配列には、保存されたシステイン残基が、ICAMに特徴的なシステインの前後のアミノ酸配列とともに含まれていた。J03071によってコードされる様々なドメインのアミノ酸配列を既知のICAMと比較した場合、計算された同一性の割合は、任意の２つの特定ICAM の配列の比較について特徴的であった。比較分析の結果を表３に示す。「代表的な」アミノ酸の同一性及びタンパク質構造のために、J03071によってコードされるポリペプチドはICAM-6と呼ばれた。ドメイン３におけるフレームシフトならびにドメイン４及び５における停止コドンは配列決定での誤りを反映していることが考えられるが、J03071の推定的なICAM-6コード領域は偽遺伝子であって機能的なポリペプチドをコードしていないと考えることもまた可能である。既知のICAMに対して相同的な５つの領域を含むJ03071の一部を、ESTデータベースのBLASTN検索において使用した。２つのEST（H79158及びH54052）を同定した。この２つのESTは、胎児の肝臓及び脾臓のライブラリーから単離され、そしてそれらがスプライシングされていないcDNAであることを示すエキソン及び隣接イントロンのヌクレオチドを含むとして同定された。マウスのICAM-6配列を使用して、相同的な領域がさらに、J03071のゲノム配列において認められた。この領域は、マウスICAM-6の膜貫通領域及び細胞質テイルに対して48％の相同性を有するアミノ酸配列をコードし、従って対応するヒト配列を表すと考えられた。この推定的な膜貫通／細胞質テイルをコードするこれらの配列は連続しており、そのような配列が同じエキソン内で見出される場合、その推定的な膜貫通／細胞質テイルは他のICAM遺伝子に関して認められる配列と一致する。J03071の膜貫通／細胞質領域は、ヌクレオチド60,912〜61,135に対応する。実施例１２ヒトICAM-6の組織及び細胞での発現２つの方法を利用して、全長のヒトICAM-6クローンの単離を試みるために供給源として適切な細胞または組織を同定した。最初の分析において、いくつかの細胞株及びいくつかのcDNAライブラリーから得られるcDNAサンプルを、ヒトICAM-6 のドメイン１〜３に対応するプライマーを使用するPCRによってスクリーニングした。２番目の方法において、ICAM-6のドメイン３を、PCRによってクローニングし、ヒトRNAサンプルのノザンブロット分析のプローブとして使用した。Ａ．ICAM-6 ドメイン３の試験PCR分析及びクローニング上記の２つの方法の実施を可能にするために、ICAM-6 cDNAの存在を検出し、そしてノザンブロット分析プローブとして使用されるICAM-6ドメインをクローニングする手段として、ICAM-6から得られるドメイン３が増幅されるPCR条件を決定することが必要であった。プライマーI601、I602、I603及びI606を、J030 71の配列から決定されるドメイン３内に位置する配列に基づいて設計した。プライマーI603及びI606はまた、それぞれ、その後のクローニング処理を容易にするために、EcoRI及びXhoIの制限部位（下記の配列内の下線部）が作製されるように設計した。 I601 CTTTTGGAGGCTGGGATG 配列番号：38 I602 CATTGCACCCAGAGATGC 配列番号：20 I603 ATAGAATTCCTTTTGGAGGCTGGGATG 配列番号：21 I606 TAACTCGAGCATTGCACCCAGAGATGC 配列番号：22 最初に、PCR増幅を、末梢血リンパ球から精製されたゲノムDNAをテンプレートして使用して行った。PCR反応は、実施例２に記載されるのと同じ緩衝液を用いて行った。増幅産物の産生を最適にするために、反応条件を、MgCl₂濃度（1.5mM、２mM）及びアニーリング温度（50℃、55℃、60℃）に関して変更した。様々な反応を、同時に、３台のDNAサーマルサイクラー480（Perkin Elmer，Foster City ，CA）で行った。すべての反応の熱条件は、最初に、94℃での４分間の変性工程、その後、94℃で１分間の変性、50℃、55℃または60℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で１分間の伸長の３サイクルであった。得られる増幅産物を、アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。試験したすべてのPCR条件下で、予想されるサイズで移動する断片として、プライマー対I603/I606を使用する210bp断片及びプライマー対I601/I602を使用するより小さな断片が検出された。すべての反応から得られる生成物をまとめて、30μgのキャリア酵母RNAを用いて、0.3Ｍ酢酸ナトリウム及び２容量のエタノールで沈澱させた。増幅産物及びB SII SK+ベクター（Stratage ne）をEcoRI及びXhoIで消化し、断片及び線状化したベクターの両方をゲル精製し（QIAGENキット）、２つのDNAを一緒に連結して、得られたプラスミドを、製造者の指示プロトコルに従って、XL1 Blue Ultracompetent細胞（Stratagene，L a Jolla，CA）に形質転換した。単一コロニーを選択して、テンプレートとして細菌DNAを使用する２系列のPCR 増幅によって、ICAM-6のドメイン３の存在についてPCRによってスクリーニングした。一方のPCRにおいて、正しい330bp挿入物の存在を、プライマーT3.1及びT7 .1を使用して調べた。第２のPCR反応において、同じ細菌におけるICAM-6ドメイン３の存在を、ICAM-6と下記のベクタープライマーとを組み合わせて調べた。T3 .1及びプライマーI608を使用すると、259bpのPCR産物が予想された。プライマー T7.1及びI607を使用すると、215bpの増幅産物が予想された。 I607 GCGAGGTGGCTAGGGTGTTTCCAGC 配列番号：23 I608 CCTGATCACCAGCCTCCATGGTCCG 配列番号：24 すべてのPCR反応を、上記のように、1.5mM MgCl₂を用いて、50℃のアニーリング温度で行った。PCRによって決定された正しい挿入物を有するコロニーを１つ選択した。このクローンからのプラスミドDNAを、Wizardミニプレップ精製キット（Promega）を使用して抽出し、ドメイン３の配列を確認した。結果は、その配列が、完全なオープンリーディングフレームをコードし、J030 71におけるヒトICAM-6のドメイン３のゲノム配列と同一であることを示した。Ｂ．PCR 分析 PCRを使用して、どれがヒトICAM-6 cDNAを含有するかを決定するために、いくつかのcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。スクリーニングを、主として、造血細胞及び内皮細胞について集中して行った。なぜなら、ICAMは、これらの細胞タイプに特徴的に発現しているからである。さらに、スクリーニングを行ったサンプルには、IL-1及び／またはIL-4で刺激されたヒト臍帯血管内皮細胞から得られたcDNAに加え、刺激されていないヒト臍帯血管内皮細胞（HUVEC）から調製されたcDNA、前骨髄性細胞株HL-60から得られたcDNA、ならびに肺、虫垂（a ppendix）及び結腸から得られたcDNAが含まれた。PCRはまた、HUVEC、Jurkat細胞（ヒトＴ細胞株）、末梢血単核細胞（PBMC）、滑膜、及びHeLa細胞（上皮頸部腫瘍細胞株）から調製されたcDNAライブラリーを含むいくつかのヒトcDNAライブラリーについても行った。PCR反応を、上記のように、2mM MgCl₂を用いて、60℃ のアニーリング温度で行った。プライマーI601（配列番号：38）及びI602（配列番号：20）をPCRにおいて使用した。アガロースゲル電気泳動で、210bpのICAM-6ドメイン３のDNAバンドが、HUVEC cDNA、HUVECライブラリーがら、そしてPBMCライブラリーからもまた検出された。PCR反応をさらに、ICAM-6誘導のプライマーの他の組合せを使用してこれらのc DNAサンプルを用いて行い、ライブラリーが、ICAM-6のドメイン１をコードするかを決定し、そしてクローンが正しくスプライシングされているかを決定した。ドメイン１に特異的なプライマーI6011（配列番号：25）、及びドメイン３をコードするDNAに特異的なI602（配列番号：20）またはI608（配列番号：24）のいずれかをPCRにおいて使用した。 I6011 GCAGTGCTTCTTCTCTTGTGCAGGG 配列番号：25 予想されるサイズの増幅産物はPCR反応で見出されなかった。このことは、以下のいずれかを示す。(i)ICAM-6ドメイン１をコードするDNAはライブラリーには存在していなかった、あるいは(ii)クローンはスプライシングされていなかった、あるいは(iii)cDNAサンプルは、最初の反応で検出されたドメイン３のシグナルを生じるゲノムDNAが混入していた。Ｂ．ノザン分析ノザン分析を、HUVEC；A549、HeLa、HL60、Jurkat、Ramos及びU937を含む細胞株；脾臓、胸腺、末梢血白血球、精巣、前立腺、卵巣、結腸、及び小腸を含む組織タイプから単離されたRNAについて行った。ハイブリダイゼーションプローブには、上記のようにクローニングされたICAM-6ドメイン３に対応する配列が含まれた。ヒトICAM-6ドメイン３プラスミドをEcoRIで線状化し、Qiagenキットを使用してゲル精製した。抗アンチセンスICAM-3 RNAプローブを、製造者のプロトコル（ RNA転写キット、Stratagene）に従って、³²P標識UTPを使用してin vitro転写によって標識した。メンブレンを、一晩、65℃で、50％ホルムアミド、５×SSC、5 0mM Tris-HCl（pH7.6）、0.1％ピロリン酸ナトリウム、0.2％ポリビニルピロリドン、0.2％フィコール、５mM EDTA、２％SDS、及び150mg/ml変性サケ精子を含む中でハイブリダイズした。メンブレンの洗浄を、65℃で、0.1％SDSを含有する２×SSCで２回、そして0.1％SDSを含む0.1×SSCで２回、それぞれ15分間行った。結果は、精巣及び前立腺において3kb RNAの高レベルの発現を示した。PBLにおいて、１kb断片が同定された。結腸及び小腸において、7.5kbの転写が認められた。HUVEC及び様々な細胞株において、高レベルのハイブリダイゼーションが、サイズ的には28SリボソームRNAと一致する4.4kb RNAとともに検出された。プローブがrRNAと交差反応するかどうか、あるいはこれらの細胞タイプに特異的な4.4kbの転写物が存在するかどうかは不明である。実施例１３ヒトICAM-6 cDNAの単離 HUVEC及びPBMCのcDNAライブラリーが、ICAM-6ドメイン３に対応するDNAを含むことが明らかとなったので、ICAM-6ドメイン３のPCRプローブを使用して、全長のICAM-6 cDNAを単離する目的で、２つの細胞タイプから得られたcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。さらに、ノザンブロット分析によって精巣における発現が明らかにされたので、ヒトの精巣ライブラリー（Stratagene）もまたスクリーニングした。これらのライブラリーのスクリーニングを、実施例２に記載されるPCRによって標識したヒトICAM-6ドメイン３のプローブを用いて行った。非標識テンプレートを、テンプレートとしてのICAM-6ドメイン３プラスミド及びプライマーI601（配列番号：38）及びI602（配列番号：20）を使用するPCRによって作製した。PCR産物をゲル精製し、希釈し、テンプレートとして使用して、210pbのICAM-6ドメイン３プローブを作製した。ハイブリダイゼーション条件は、実施例２に記載される通りであった。精巣ライブラリーから得られた結果により、13個の陽性クローンが得られた。その中の８個を配列決定して、４個がスプライシングされたICAM-6クローン（クローン13A、20C、5A及び13B）で、４個がスプライシングされていないICAM-6クローンであることを明らかにした。４個のスプライシングされたクローンの中で、20C及び1 3Aの２つはリーダー配列及びドメイン１配列を含むことが見出された。PBMCライブラリーにおいて、１個のスプライシングされていないクローンが同定されただけであった。HUVECライブラリーにおいては、クローンは同定されなかった。ヒトICAM-6配列のより完全な配列を決定するために、リーダー及びドメイン１の一部をコードするヒトICAM-6のコード領域をBLASTN検索における提示配列として利用した。この検索によって、３個のヒトICAM-6クローンを表しているような４個のEST配列が明らかにされた。２つのEST配列AA421394（配列番号：49）及び AA421290（配列番号：50）は、別のクローン731071の5'末端及び3'末端に対応した：このクローン731071は、ヒト精巣ライブラリーから単離され、ICAM-6のリーダー及びドメイン１〜３をコードする。実施例１１で以前に参照されたヒト胎児肝臓−脾臓ライブラリーから得られた２つのESTのH79158（配列番号：47）及びH 54052（配列番号：48）もまた同定され、スプライシングされていないドメイン４をコードしているようであった。精巣ライブラリーから得られた８個のクローンの配列を決定した。それらの結果を組み合わせて、EST J03071のデータベース配列を訂正した。訂正された配列は、リーダーならびにドメイン１、２及び３は、完全なオープンリーディングフレームをコードすることを示した。しかし、ドメイン４の配列は、依然として、停止コドンを含んでいた。ICAM-6のより完全なポリヌクレオチド配列を用いて、他の既知ICAMの配列に対する２回目の比較を、ドメイン４内の停止コドンの存在にもかかわらず、ICAM-6のドメイン４及び５の比較を含めて行った。結果を下記の表４に示す。リーダー及びドメイン１〜３をコードするICAM-6 DNAをさらに分析するために、ESTデータベースから得られたクローン731071の配列を、２つのヒト精巣クローンの13A及び20Cの配列と組み合わせて使用した。この３つのクローンは、同じリーダーと、２つのドメインがオープンリーディングフレームによってコードされた同じドメイン２及びドメイン３のアミノ酸配列とをコードしていることが見出された。従って、Genbankから得られたクローンJ03071のドメイン２において同定されたフレームシフトは、配列決定の誤りから生じたと結論された。しかし、13A、20C及び73101 の３つのクローンのすべてにおいて、ドメイン１は不完全であった。クローン20 は、ドメイン１の5'部分のみをコードし、クローン13A及び73101は3'部分のみをコードしていた。これらの３つのクローンのすべてにおいて、ドメイン１配列のスプライシングは、部分的なドメインの存在及びフレームシフトまたはスプライシング接合部での停止コドンのいずれかの存在によって示されるように異常であった。従って、これらの３つのクローンはいずれも完全にプロセシングされず、そして膜貫通または細胞質のアミノ酸配列をコードしていなかった。各クローンにおいて、ドメイン３をコードする配列は、その後にその対応するイントロンが続いた。４つのスプライシングされたヒト精巣クローンの中で、13A、5A及び13Bは、ドメイン４のアミノ酸をコードした。そのクローンのそれぞれは、J03071のゲノム配列において以前に同定された２つの停止コドンの最初を含有した。この３つのクローンはどれも、J03071で見出された２番目の停止コドンを含んでいなかったので、２番目の停止コドンは配列決定の誤りから生じたと結論した。ヒトICAM-6の訂正されたが、依然としてドメイン４のコード領域内に停止コドンを含む配列により、リーダーならびにドメイン１、２及び３は完全なオープンリーディングフレームをコードすることが示された。これらの観察により、ヒト ICAM-6の精巣でのスプライシングは異常であると結論した：このような出来事は、精巣で発現している他の遺伝子に関して以前に報告されている［Sorrentino， et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）85:2191-2195(1988)］。この結論は、正しくスプライシングされた機能的なヒトICAM-6が他のヒト組織で発現している可能性を除外しない。ドメイン４に関してDNAがコードする停止コドンの同定はまた、そうでなければ、以下の点で説明することができる。(i)オルターナティブスプライシングが起こっていると考えられ、この場合、ドメイン４をコードする配列がそれによって除かれて、マウスICAM-6タンパク質よりも少ない細胞外ドメインを有する機能的なポリペプチドの発現を可能にする；(ii)同定されたヒト ICAM-6遺伝子は集団内で多型であると考えられ、従って特定の個人においては変異し、他では変異していないと考えられる；あるいは(iii)クローンJ03071は、機能的なICAM-6ポリペプチドを発現しない偽遺伝子を表していると考えられる。 J03071が偽遺伝子である場合、機能的なICAM-6（または他の独特のICAM）が同じ染色体位置に位置していることが考えられる（実施例１１）。実施例１４ RACE RCRはスプライシングされた5'ヒトICAM-6 cDNAを同定するヒトICAM-6 cDNAの5'末端を単離するために、RACE PCRを、ヒト精巣のMaratho n-ready^TMcDNA（Clontech）を使用して行った。cDNAを、年齢が22歳〜31歳の範囲の４人の白人から集められた精巣から調製した。集めた供給源は、以前に記載された精巣cDNAライブラリー（Stratagene）を調製するために使用した精巣と異なった。ヒト精巣cDNAを、実施例４に記載したAP-1及びAP-2プライマー（配列番号：13及び14）の部位を含有するMarathonアダプターに連結した。PCRを、AP-1 及び1608（配列番号：２4）のプライマー対を使用して行った：プライマーI608 は、ドメイン３をコードするDNAに特異的である。２回のPCRを、実施例４に記載されるように行った。両方のPCRにおいて、反応混合物を１分間変性し、その後、94℃で５秒間の変性及び72℃で２分間のアニーリング／仲長の５サイクル、そして94℃で５秒間の変性及び70℃で２分間のアニーリング／伸長の５サイクル、最後に94℃で５秒間の変性及び68℃で２分間のアニーリング／伸長の25サイクルを行った。ICAM-6のリーダーからドメイン３までをコードする正しくスプライシングされた断片の予想されるサイズは約0.8〜１kbであった。アガロースゲル電気泳動は、長さが約0.7〜0.8kbで移動するバンドとともにスメア状のDNAを示した。この結果を考慮して、３つの工程を、予想されるサイズの増幅産物を得る目的で行った。最初に、PCR産物をSacI及びNotIで消化した。この手順は、ICAM-6ドメイン３内のSacI部位ならびに5'非翻訳領域内及びcDNAアダプター内のNotI部位の存在が知られていたことに基づいた。SacI/NotI断片の予想されるサイズは約0.8kbであった。２番目に、PCR産物を、ゲル電気泳動を使用して、0.8〜１kbの範囲のサイズ選択を行った。この範囲の断片をゲルから精製して、NotI及びSacIで予め消化されたベクターBSII SK+（Stratagene）内に連結した。得られるプラスミドを、製造者の指示プロトコルに従って、Ultracompetent XL-blue MRF'細胞に形質転換した。３番目に、ハイブリダイゼーションを、ドメイン１のすべてを含有するICAM-6 cDNAを同定するために、³²P標識オリゴヌクレオチドを使用して行った。オリゴヌクレオチドI6047（配列番号：26）及び16048（配列番号：27）を、ドメイン１をコードするDNAの両末端に相補的であるように設計した。 I6047 GTCCCGGAACAGTCGTTTGAGGTTT- CTATTTGGCCAAGTC 配列番号：26 I6048 GATCACTTGCTCTGGTGGCTGATAC- ACAGTGACGCCAAGG 配列番号：27 プライマーI6047はドメイン１の5'末端に対応したが、I6048はドメイン１及び２の間の接合部に対応した。オリゴヌクレオチドを³²P-γATPを用いて、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（New Englang Biolabs，Beverly，MA）を使用して末端標識し、Centrispin 10カラム（Princeton Separation，Adelphia，NJ）を使用して精製した。サイズ選択したPCR産物で形質転換された細菌を、カルベニシリンアガロースプレート上に置いたフィルターに播種して、一晩37℃でインキュベーションした。コロニーを２組のさらなるフィルターに移した。一方のレプリカをI6047プローブでハイブリダイズし、もう一方をI6048プローブでハイブリダイズした。両方のフィルターを、５×SSC、50mMリン酸ナトリウム、５×Denhardt溶液、及び0 .1％SDSを含む中で65℃でハイブリダイズし、室温で15分間、0.1％SDSを含む２ ×SSCで洗浄し、次いで同じ溶液で、65℃で５分間洗浄した。両方のプローブにハイブリダイズした20個のコロニーを拾った。配列分析により、この20個のコロニーはヒトICAM-6挿入物を含有していることが示された。このクローンのいくつかは、SacI部位を含み、ドメイン２またはドメイン１の内部にまで延びていた。５個のクローンは、ドメイン３のSacI部位を含み、5'非翻訳領域内のNotI部位にまで延びていた。このため、この５個のクローンは、ICAM-6 のリーダー及びドメイン１との間のスプライシング接合部の決定を可能にした。全長のヒトICAM-6配列を、以下のクローンから得られる配列情報を組み合わせることによって推定した：（リーダー配列からドメイン３をコードする）ヒトRACEクローンのB1b、（ドメイン２〜４をコードする）ヒト精巣ライブラリーにおいて見出されたクローン、及び（ドメイン５をコードする）ゲノムクローン。ドメイン４内の停止コドンをコードする領域を含むヒトICAM-6配列を、配列番号：40に示す。ポリヌクレオチドに関する停止コドンまでの推定アミノ酸配列を配列番号：41に示す。ヒトICAM-6の細胞外ドメインのアミノ酸配列と、他のマウス及びヒトのICAMの対応する領域との比較を表５に示す。実施例１５不妊患者からのICAM-6のドメイン４及び５のクローニング ICAM-6 mRNAの発現が精巣において観測されることを考慮して、ICAM-6と不妊との考えられる関係を調べた。ICAM-6遺伝子がドメイン４及び５内に停止コドン含む理由を説明するための１つの仮説は、１コピーまたは２コピーの機能的なIC AM-6がヒト染色体に存在することによって男性キャリアを不妊にし得るということである。ICAM-6の発現が、精子形成及び／または精子機能における異常、あるいは精子または精母細胞の破壊のいずれかに導くことがことが考えられる。この仮説を検討するために、ICAM-6のドメイン４及びドメイン５を、選択した患者から得られたゲノムDNAからクローニングした。そのポリヌクレオチド構造を調べて、これらのドメインが停止コドンをまたは完全なオープンリーディングフレームを含有するかどうかを明らかにした。 DNAを、原発性精巣不全の20人の男性患者から得られた血液サンプル及び５人のコントロール血液サンプルから、DANzolRBD試薬（Molecular Research Center ，Inc，Cincinnati，OH）を使用して製造者の指示プロトコルに従って得た。PCR を実施し、ヒトICAM-6配列に基づいて設計した２対のプライマーを使用して、ヒトICAM-6のドメイン４またはドメイン５のいずれかに拡がるゲノム断片を増幅した。最初のプライマー対の16070（配列番号：51）及びI6073（配列番号：52）、ならびに２番目のプライマー対のI6075（配列番号：53）及びI6077（配列番号： 54）は、それぞれ、ICAM-6のドメイン４及びドメイン５の5'末端及び3'末端に対応した。 I6070 CTTCCCTCCACCAATCCTGGAGC 配列番号：51 I6073 GGATATGGAGCTGGATCACAGTGG 配列番号：52 I6075 TGGCTGGAAGGGATGGAACACACG 配列番号：53 I6077 TGACAGAGCCCAGCTGGTTAGTGG 配列番号：54 50μlのPCR反応を、１×KlenTaq緩衝液、２mM dNTPs、ドメイン４プライマー対のI6070及びI6073あるいはドメイン５プライマー対のI6075及びI6077のいずれかの100μg/ml、１μlKlenTaqポリメラーゼ溶液、及び６〜12ngのゲノムDNAを用いて、Advantage cDNA PCRキット（Clontech，Pala Alto，CA）を使用して製造者の指示プロトコルに従って行った。「タッチダウン」PC して行った。反応は、最初に、30秒間の変性工程によって、その後94℃で５秒間の変性及び72℃で30秒間のアニーリング／伸長の５サイクル、94℃で５秒間の変性及び70℃で30秒間のアニーリング／伸長の５サイクル、そして94℃で５秒間の変性及び68℃で30秒間のアニーリング／伸長の25サイクルによって行った。得られるPCR産物を、アガロースゲル電気泳動を使用して分離し、予想されるサイズで移動する２つのバンドを検出した。約260bpのバンドをドメイン４のプライマー対のI6070及びI6073を使用する反応から検出した。約170bpのバンドをドメイン５のプライマー対のI6075及びI6077を使用して検出した。これらの断片を、PC R産物精製キット（Promega，Madison，WI）を使用して製造者の指示プロトコルに従って精製して、対応するプライマーを使用して直接配列決定した。コントロールには、ゴリラまたはサル（Macaque nemestrina）から得られたゲノムDNAが含まれた。 ICAM-6のPCR産物の配列分析により、１つまたは２つのいずれかの停止コドンがすべての患者サンプル及びコントロールサンプルのドメイン４に存在していることが示された。その停止コドンの１つは、実施例１３に記載されたクローンの場合と同じヌクレオチドに位置していた。第２の停止コドンは、それが認められた場合、すべてのサンプルにおいて一定の位置に存在していた。ICAM-6ドメイン５の配列分析により、以前に認められたのと同じヌクレオチド位置における停止コドンまたは不明瞭な配列が明らかにされた。配列の不明確さは、配列決定の際の人為的なこと、または特定の患者におけるIC AM-6の２つの対立遺伝子（第２の停止コドンを有する対立遺伝子とそれを有さない対立遺伝子）の存在から生じたと考えられる。 ICAM-6遺伝子は種間で高度に保存されているので、マカク（macaque）及びゴリラから得られた血液をコントロールとして使用した。そのゲノムDNAを、以前に記載したように抽出し、ヒトサンプルに関する上記と同じ条件下におけるPCR において使用した。配列分析によって、マカクのICAM-6のドメイン４及び５は、そのヒトホモログに対して95％及び97％の同一性を有し、完全なオープンリーディングフレームをコードしていることが明らかにされた。従って、ドメイン４及び５を含むICAM-6は、マカクでは機能的であることが考えられる。ゴリラにおいては、ICAM-6のドメイン４及び５は、ヒトの分子に対して高い相同性を有していることが見出された（ドメイン４、91％及びドメイン５、94％）。停止コドンは、ヒトの配列の場合のようにゴリラのドメイン４において検出されたが、ドメイン５は、完全なオープンリーディングフレームをコードしていた。これらの結果は、停止コドンの存在によって、５つの細胞外イムノグロブリンドメインを有するヒトICAM-6ポリペプチドの正しい発現が妨げられることを示唆する。しかし、このような見解は、５個より少ない細胞外ドメインを有する生物学的に活性なICAM-6の代わりの形態が存在する可能性を除外しない。例えば、ICAM-6は可溶性形態で存在可能であり、ドメイン４内の停止コドンは、膜貫通領域及び細胞質テイルを欠くタンパク質の3'末端を示す。あるいは、ドメイン４はスプライシングされて除かれ、４つのドメインのタンパク質を、停止コドンをドメイン５内に有するゲノムDNAに関してヘテロ接合である患者において表面分子として発現し得る。さらに別の可能性として、ICAM-6の２つのドメインからなり、膜に結合してドメイン１及び２のみを含む形態が存在し得る。実施例１６可溶性ヒトICAM-6の発現ヒトICAM-6の機能を調べるために、発現構築物を作製し、ヒトICAM-6の細胞外ドメイン１及び２（D1-D2）を、IgG4から得られるヒンジCH2-CH3ドメインと結合したキメラポリペプチドとして発現させた。発現プラスミドの構築は、下記のようにして行った。リーダー配列からドメイン２までのICAM-6のコード領域を、プライマー対I607 8（配列番号：55）及びI6079（配列番号：56）を使用するPCRによって増幅した。 I6078 CCCAAGCTTACCGCCACCATGAAAACGCTTCTGTTT 配列番号：55 I6079 CCGCTCGAGAAAGATCCGGACTATTCTGATGGG 配列番号：56 増幅産物のクローニングを容易にするために、HindIII部位がI6078プライマーの 5'末端に含まれ、そしてXhoI部位がI6079プライマーの3'に含まれた（下線部、上記参照）。さらに、翻訳開始に関するコンセンサス配列（斜体字、上記参照）をプライマ -I6078内に作製し、高レベルの可溶性分子の発現を確実にした PCR反応のテンプレートの調製において、実施例１４に記載されるヒトRACEクローンB1bプラスミドをNotI及びSacIで消化し、ICAM-6のリーダー配列からドメイン３までをコードするDNA断片を、QIAquick（Gel Extraction Kit（QIAGEN，V alencia，CA））を使用して精製した。PCRを、精製NotI/SacI断片をテンプレートとして、プライマーI6078及びI6079、「高忠実」Pfu DNAポリメラーゼ（Strat agene，La Jolla，CA）及びデオキシヌクレオチド及び緩衝液を使用して製造者の指示プロトコルに従って mer)において、最初に94℃で５分間の変性し、次いで、94℃で30秒間の変性、50 ℃で30秒間のアニーリング、及び72℃で30秒間の30サイクルにより処理した。約 670bpのPCR産物を、QIAquick^TMGel Extraction Kit(QIAGEN)を使用してゲル精製し、HindIII及びXhoIで消化して、QIAquick^TMGel Extraction Kitを使用してゲル精製した。ICAM-6のドメイン１及び２をコードするHindIII/XhoI断片を、２つの同じ酵素で予め消化されたpDEF2S/IgG4ベクター内に連結した。pDEF2S/IgG4プラスミドは、下記にようにして構築された。 ICAM-6配列に融合した約１kbのXhoI/XbaIのIgG4断片は、ヒトのγ４重鎖ヒンジCH2及びCH3領域が、ヒトγ４遺伝子のゲノムクローンから得られる3'隣接領域の328bpとともにコードされるcDNA配列を含有する。この重鎖配列をコードするc DNAは、市販の脾臓cDNAライブラリー、及び既知のヒトγ４配列［Ellison et al .，DNA 1:11(1981)］から得られる合成オリゴヌクレオチドプローブから得られた。同様に、3'隣接領域を含有するゲノム配列を、市販のゲノムライブラリーから、ヒトのγ４プローブ及び同じクローニング技術を使用して得た。cDNA配列の隣接領域への融合は、適合し得る制限部位を導入した適切なプライマーを用いるPCRを使用し、その後当該分野で周知で日常的に実施されている手順によって、制限消化及び連結することによって行った。得られるプラスミドのICAM-6(D1-D2)/Ig/pDEF2SをXL2 BLu e Competent Cell（Stratagene，La Jolla，CA）に形質転換して、形質転換体を、プライマーI6078（配列番号：55）及びI6079（配列番号：56）を使用するPCR によってスクリーニングした。PCRによって検出される陽性クローンを配列決定により確認した。タンパク質の発現を、ICAM-6(D1-D2)/Ig/pDEP2SでトランスフェクションされたDG44 CHO細胞で行った。DG44 CHO細胞は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）が欠損しており、増殖するためにヒポキンサンチン及びチミジンを培養培地中に要求する。マーカーDHFR遺伝子がベクターpDEF2Sに存在しているため、ICAM-6(D 1-D2)/Ig/pDEF2SでトランスフェクションされたDG44 CHO細胞は選択培養培地で増殖する。細胞を、下記のようにエレクトロポレーションによってトランスフェクションした。約２×10⁷個の細胞を、800μlのHBS緩衝液（20mM HEPES-NaOH(pH7.0)、137mM NaCl、５mM KCl、0.7mM Na₂HPO₄、６mMデキストロース）に懸濁した50μgのICAM -6(D1-D2)/Ig/pDEF2Sと混合した。エレクトロポレーションを、BioRad GenePuls erエレクトロポレーターを使用して960μFの容量及び290Ｖの電圧で行った。エレクトロポレーション後、細胞を室温で10分間再生させ、そして10％FBS、１mM MEMピルビン酸ナトリウム、100u/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、２mM L-グルタミン、0.1mMヒポキサンチンナトリウム、及び1.6mMチミジンを含有する培地（HT＋DMEM/F12）の10mlで洗浄した。細胞を遠心分離によって集め、培地に再懸濁して、HT＋DMEM/F12を含有する２枚の10cmプレートに播種した。エレクトロポレーションの２日後、トランスフェクションした細胞を選択培地（ヒポキサンチンまたはチミジンを含まないDMEM/F12）に移して、トランスフェクションの約12日後、生存コロニーを集めてまとめた。まとめた細胞の半量を液体窒素中に保存し、残りの半分をタンパク質精製のために培養した。タンパク質精製に関して、ICAM-6(D1-D2)/Igタンパク質をCHO上清から、Prose pプロテインＡカラム（BioProcessing LTD）を使用して回収した。カラムを、最初に、１Ｍグリシン＋0.15ＭNaClを含む緩衝液（pH8.6）の少なくとも100mlで、 BioRad Econo Systemを使用して平衡化した。上清をカラムに１ml/分の速度で流し、カラムを少なくとも100m1の上記の緩衝液で洗浄した。タンパク質を、100mM クエン酸（pH3.0）を使用して、中和化１ＭTris（pH9.0）に直接集めた。溶出したタンパク質を、10,000MWカットオフSakeSkin透析チューブ（Pirce，Rockford ，IL）に入れて、カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（CMF-PBS）に対して、少なくとも24時間、使用緩衝液を３回交換しながら透析した。透析したタンパク質を、Centriprep-30遠心分離フィルター（Amicon，B everly，MA）を使用して濃縮した。タンパク質の濃度を、BCA Protein Assay（P ierce）によって測定した。タンパク質の純度を、２μgの精製タンパク質を含有するSDS-PAGEゲルのクーマシー染色によって評価した。すべてのICAM-6(D1-D2)/Ig調製物は50〜90％の純度であり、明らかな夾雑物としてウシIgのみを有していた。精製タンパク質を使用して、ヒトICAM-6の機能検討及びモノクローナル抗体作製を行った。実施例１７ウエスタン分析マウスICAM6ポリクローナル抗体の作製ドメイン１からドメイン３からなり、FLAG/HISタグに融合した可溶性のマウス ICAM-6タンパク質を実施例７及び８に記載されるように産生し、これを免疫原として使用してニュージーランド白ウサギに注射した。間単に記すと、２羽のニュージーランド白ウサギから免疫前血清を得るために予備採血し、次いで、０日目に、約100μgのICAM-6/FLAG-HISタグタンパク質を含む完全フロイントアジュバント（CFA）を皮下に注射した。その後、動物をさらに４回、３〜４週間の間隔で、同量のタンパク質を含む不完全フロイントアジュバントで免疫化した。血清を、免疫細胞化学（下記）によって特異的反応性に関して齧歯類の精巣組織切片で注射の７〜14日後に試験した。血清からポリクローナル抗体を、プロテインＡカラムで、当該分野で日常的に実施されている周知の手順を使用して精製した。強い特異的なICAM-6染色が、４回目の抗原注射の後にマウス精巣で検出された。免疫組織化学正常なマウス精巣を、液体窒素で冷却したIsopentaneで素早く凍結して、-70 ℃保存した。切片をSuperfrostマイクロスライドガラス（Eric Scientific Corp oration，West Chester，PA）上に置き、-20℃で保存した。使用前に、スライドガラスを乾燥して、冷アセトン中で２分間固定した。スライドガラスを、15分間、室温で、0.04％H₂O₂及び0.1％NaN₃を含むTBS中でインキュベーションして、内在性のペルオキシダーゼ活性を除去した。スライドガラスを30分間室温で、２％ウシ血清アルブミン（BSA）（Sigma，St ．Louis，MO）、30％正常ラット血清、及び５％正常ヤギ血清を含むTBS中でブロッキングした。内在性のビオチン部位を、アビジン／ビオチンブロッキングキット(Vector laboratories，Burlingame，CA）を用いて、製造者の指示プロトコルに従ってスライドガラスを処理することによってブロッキングした。マウスICAM-6に対する一次抗体（10μg/mlに希釈）及び／またはコントロール抗体を各組織切片に添加して１時間室温に置いた。非結合抗体を、スライドガラスの洗浄をTBSで３回、各洗浄を５分間行うことによって除いた。ビオチン化ヤギ抗ウサギイムノグロブリン（Vector Laboratories）を各組織切片に添加して3 0分問室温に置いた。洗浄工程の後、切片を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP ）と結合したヤギ抗ビオチンイムノグロブリン（Vector Laboratories）と30分間室温でインキュベーションした。洗浄後、DABペルオキシダーゼ基質キット（V ector Laboratories）を使用して、3'3ジアミノベンジジン-テトラヒドロクロリド（DAB）基質を各切片に添加し、所望の発色が得られるまで置いた。反応を水で停止し、１％オスミウム酸で増強し、直ちに５〜10分間洗浄した。組織切片をヘマトキシリン（Sigma）で対比染色し、水で洗浄し、Aquamount（Lerner Labor atories，Pittsburgh）を使用してカバーガラスで固定した。 ICAM-6抗体を用いた染色により、高レベルの発現が一次精母細胞で明らかになった。免疫前血清を用いたコントロールのスライドガラス及び一次抗体を用いないコントロールのスライドガラスは明らかに陰性であった。ウエスタンブロット in vivoで産生されるICAM-6タンパク質のサイズを決定するために、ポリクローナル抗体を、下記のウエスタンブロッティングによってマウス精巣溶解物について試験した。素早く凍結したマウスの精巣組織を液体窒素中で粉状にすりつぶし、150mMTris（pH6.8）、ブロモフェノールブルー、2.5％β−メルカプトエタノール、４％SDS、及び20％グリセロールの溶液と混合し、５分間煮沸し、21ゲージの針に通して剪断し、遠心分離によってペレット化した。上清を、12％SDS- PAGEを使用して分離した。上清中のタンパク質の量を、SDS-PAGEで数段階の希釈物を泳動し、クーマシーブルーで染色することによって見積もった。約20μgのマウス精巣タンパク質をSDS-PAGEで分離し、Immobilon-Pメンブレン（Millipore ，Bedford，MA）にエレクトロブロッティングした。ブロットを一晩４℃で、0.2 ％Tween-20を含有するTris緩衝化生理食塩水（TBS-Tween）で希釈した３％ウシ血清アルブミン中でインキュベーションした。洗浄後、メンブレンを２μg/mlのマウスICAM-6ポリクローナルウサギ抗体またはコントロール免疫前血清を含むTB S-Tween中で、１時間、室温でインキュベーションした。次いで、メンブレンを洗浄し、ヤギ抗ウサギHRP結合軽鎖特異的二次抗体（Accurate，Westbury，NY）を用いて室温で１時間インキュベーションした。洗浄後、増強化学発光（ECL）ウエスタンブロッティング検出キット（Pierce）を製造者の指示プロトコルに従って使用して、バンドをKodak X-OMAT-ARフィルム上に可視化した。インキュベーション工程間において、メンブレンをTBS-Tweenで５分間３回洗浄した。２つのバンドがICAM-6抗血清によって明らかに検出されたが、コントロールは明らかに陰性であった。60kDaと100kDaとの間で移動する幅広いバンドが検出された。約200〜250kDaで移動する別のバンドが認められた。527アミノ酸の成熟マウスICAM-6タンパク質の予想されるサイズは約58kDaであった。このことにより、発現したタンパク質はグリコシル化されていることが示唆された。配列分析によって、コンセンサス配列As p-Xaa-(Ser/Thr)によって特徴づけられるN-グリコシル化部位と考えられる部位が６カ所存在することが示された。少なくとも３カ所のO-結合グリコシル化部位が、NetOGly、O-結合グリコシル化部位推定シフトウエア［Hansen，et al.，Gly coconjugate J．15:115-130(1998)］を使用して同定された。60kDaと100kDaの間で移動するバンドの広がりにより、いくつかのグリコシル化形態のICAM-6がin v ivoで存在し得ることが示唆される。約200kDaのより大きなバンドは、非常に著しくO-グリコシル化された形態のICAM-6もまた存在し得ることを示唆する。上記の例示的な実施例において示されるように本発明における多数の改変及び変化が、当業者には考えられることが予想される。従って、添付した請求の範囲に現れるような限定のみが本発明に付される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION ICAM-6 materials and methods This application was filed on October 22, 1997 and is pending U.S. Patent Application No. 08/955. No. 661 is a continuation-in-part application. TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION The present invention relates generally to cell adhesion molecules, and more particularly, to ICs for intercellular adhesion molecules. AM-1, ICAM-2, ICAM-R, (Landsteiner-Weiner) LW-ICAM-4, and ICAM-5 A previously unknown polypeptide termed "ICAM-6" Cloning and expression of DNA encoding Background of the Invention Research over the last decade has been involved in cell-cell interactions in the body. Molecular phenomena, particularly those related to the behavior and activation of cells in the immune system, and And more recently, phenomena related to the development and physiological function of cells in the nervous system. However, it has been clarified considerably. In general, Springer Nature, 346, 425-434 (1990), and for cells of the nervous system, see Yoshi. Hara et al., Neurosci. Res., 10, 83-105 (1991); Sonderegger and Rathjen, See J. Cell Biol., 119, 1387-1394 (1992). Cell surface protein Quality, and especially the so-called cell adhesion molecule ("CAM"), correspondingly, leukocytes to the site of inflammation The process of extravasation and migration of leukocytes to different target tissues, as well as neural differentiation and Pharmaceutical research aimed at intervening in the process of forming complex neural circuitry Research and development Has become the subject of. Isolation and characterization of cell adhesion molecules, encoding such molecules Cloning and expression of DNA sequences, as well as inflammatory processes and development of the nervous system And the development of therapeutic and diagnostic agents related to function is also the subject of numerous US and foreign patent applications. Has become the subject of. Edwards, Current Opinion in Therapeutic Patents, 1 (1 1), pp. 1617-1630 (1991), and in particular, the issued `` Reference Patent Contributions ". Important in the context of the present invention are specific mediators of the cell adhesion phenomenon, That is, heterozygous cells present on B lymphocytes, T lymphocytes, monocytes, and granulocytes Form a subfamily of “integrin” cell surface proteins Eicointegrin ", LFA-1, MAC-1 and gp150.95 (according to WHO nomenclature, CD18 / CD11a, CD18 / CD11b, and CD18 / CD11c, respectively)) Characterization. See, for example, Table 1 on page 429 of Springer, supra. In addition, it affects leukocyte activation, adhesion, and motility, which are phenomena associated with the inflammatory process. Other single-stranded adhesion molecules (CAMs) that affect the sound are also important. For example, at the moment Are structurally expressed on leukocytes, prior to leukocyte extravasation that characterizes the inflammatory process Integrin activation occurs, followed by integrin (e.g., LFA-1) ICAM-1 and ICAM-2 expressed on the surface of vascular endothelial cells and on white blood cells Between one or both of the two distinct intercellular adhesion molecules (ICAMs) It is believed that ligand / receptor interactions occur. Other CAMs characterized to date (e.g., published on November 15, 1990 Tube adhesion molecule (VCAM-1) described in PCT WO 90/13300; and Newman et al., Scien ce, 247, 1219-1222 (1990) and PCT WO 91/106 published July 25, 1991. Noted in issue 83 ICAM-1 and ICAM-2, as well as the platelet endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1) In that each extracellular portion contains a series of domains that share similar structures. Structurally homologous to other members of the immunoglobulin gene superfamily. is there. A "typical" immunoglobulin-like domain usually consists of two Contains loop structures anchored by disulfide bonds between cysteines You. ICAM-1 and ICAM-R each contain five immunoglobulin-like domains. ICAM-2 and LW-ICAM-4, which differ from ICAM-1 in cell distribution, ICAM-5 contains 9; PECAM-1 contains 6; VCA M includes 6 or 7 depending on the variety of the junction, etc., etc. . Furthermore, CAMs are typically thought to be related to the orientation of molecules at the cell surface. Contains a hydrophobic "transmembrane" region and a carboxy-terminal "cytoplasmic" region . Graphical models of the operative configuration of the CAM generally extend to the cytoplasm of the cell. The mediating cytoplasmic “tail” and one or more cells extending outward from the cell surface Is fixed to the cell membrane at the transmembrane region with the above immunoglobulin-like loop The molecule is indicated. Many neurons have extracellular Ig-like domains and are structurally similar to ICAM. Expresses a surface receptor. For example, Yoshihara et al.AboveAnd Mizuno et al., J See Biol. Chem., 272, 1156-1163 (1997). In addition to Ig-like domains Thus, many adhesion molecules in the nervous system contain tandemly repeated fibro It also contains a Nectin-like sequence. Details, including uses that assume the ability of ICAM-1 to bind to human rhinovirus Various therapeutic uses for intercellular adhesion molecules have been planned. For example, 1992 Europe released on January 29, 2014 State Patent Application No. 468 257 A discloses ligand / receptor binding activity, particularly viral, Limbocyte related antigens and Plasmodium falcipar um) has been proposed to show improved binding activity when binding to pathogens, such as ICAM- 1 Improvement of the arrangement and morphology of the multimer (including full length and deleted molecular forms) And said. Similarly, for proteins immunologically related to intercellular adhesion molecules Various uses are being planned. For example, WO 91/16 published on November 14, 1991 No. 928 includes a humanized chimeric anti-ICAM-1 antibody, as well as specific and non-specific Its use in treating inflammation, viral infections, and asthma has been described. Anti-IC AM-1 antibody and fragments thereof were shown to be effective in treating endotoxin shock in March 1992. It is described in WO 92/04034 published on the 19th. Anti-ICAM-1 anti-idiotype Inhibition of ICAM-1-dependent inflammatory responses using antibodies and antibody fragments was reported on April 16, 1992. It is described in published WO 92/06119. Intercellular adhesion proteins such as ICAM-1 and lymphocyte-interacting proteins such as LFA-1 Identification and characterization of tegrins provide basic insight into cell adhesion phenomena Despite that, the full picture is far from clear. In general, inflammatory processes and targets Many other proteins are involved in the behavior of targeted lymphocytes in vivo. Is believed to be For example, U.S. Patent Application Nos. 07 / 827,689, 07 / 889,724 No. 07 / 894,061 and 08 / 009,266 and the corresponding published PCT WO 93/14776. Issue (published August 5, 1993), ICAM-R (human lymphoid), an ICAM-related protein. Clonin (shown to be expressed on spheres, monocytes and granulocytes) And expression are disclosed. The disclosures in these applications should be specifically cited Incorporated herein by reference It is. As another example, the blood group glycoprotein referred to herein as LW-ICAM-4 Quality has been reported [Bailly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Vol. 91, 53065-53. 10 (1994); Bailly et al., Eur. J. Immunol., 25, 3316-3320 (1995)]. LW-IC AM-4 suggests mediating red blood cell binding to CD11a / CD18 and CD11b / CD18 And that ICAM-2 and this surface protein contain two extracellular domains It was shown that they were structurally similar. As yet another example, the known An ICAM-like surface molecule with tissue-specific expression that is not similar to the Is defined. Mori et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84, 3921-3925 (198 7)] is telencephalon-specific, having specific immunoreactivity with monoclonal antibody 271A6 The identity of the antigen was reported. This surface antigen is telencephalin Or named ICAM-5. Yoshihara et al., Ncuron, 12, 543-553 (1994). Reported the cDNA and amino acid sequence for rabbit telencephalin at 130-kD telencephalon has been transformed into nine extracellular immunoglobulin (Ig) -like It may be an integral membrane protein with a main It was suggested. The distal eight of these domains share the Ig-like domains of other ICAMs. Showed homology. Cloning of the human homologue to rabbit ICAM-5 has been described by Mizuno et al. , Described above. Thus, it is involved in the art in human cell-cell interactions. Discovery of additional proteins, especially the amino acid sequence of such proteins There is a need for information that will help identify and characterize the Furthermore, such To the extent that molecules form the basis for the development of therapeutic and diagnostic agents, It is indispensable that the DNA is clarified. Such fundamental information, among other things, Is useful for the mass production of proteins. Allow the identification of cells that naturally produce these proteins, and allow the Other novel binding proteins with specific reactivity with them and / or involved Preparation of other novel binding proteins that inhibit ligand / receptor binding reactions Will make it possible. Summary of the Invention In summary, the present invention provides a policy against a family of cell adhesion molecules named ICAM-6. Provided are the polypeptides and their underlying polynucleotides. In the present invention, natural ICAM-6 polynucleotides, both naturally occurring and non-naturally occurring And its polypeptide products. To naturally occurring ICAM-6 polypeptide Are the different gene and polypeptide species contained in the family (ie, allelic variants). Variants and species homologs). Within each of the six ICAMs, the present invention further provides the same Spruals resulting from different mRNA transcripts encoded by oligonucleotides Provide a chair variant. Non-naturally occurring ICAM-6 polypeptides include analogs ( That is, one or more amino acids are added, substituted, or deleted). Product variants or covalent modifications (ie, fusion proteins, Lycosylated mutant, Met^-1ICAM-6, Met^-2-Lys^-1ICAM-6, Gly^-1ICAM-6 etc.) ICAM-6 polypeptides. In a preferred embodiment, the invention relates to a sequence A polynucleotide comprising the sequence set forth in No. 1 is provided. The present invention further provides Includes a polynucleotide encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Current A preferred polypeptide of the present invention has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Including. A plasmid encoding a preferred polynucleotide of the present invention is described in March 16, 20852, Maryland To the American Type Culture Collection in Rockville 12301 Deposit and given accession number 98557. The present invention relates to novel purified and isolated polynucleotides encoding ICAM-6 ( For example, DNA sequences and mRNA transcripts, both sense and complementary antisense strands, And their splice variants). In the DNA sequence of the present invention, Genomic and cDNA sequences as well as fully or partially chemically synthesized DNA Contains an array. As used herein and as understood in the art, The term `` was '' refers to a purely enzymatic method for producing polynucleotides. It refers to a chemical method. The “total” synthesized DNA sequence is therefore Manufactured entirely by chemical means and "partially" The resulting DNA is one in which only a portion of the resulting DNA has been produced by chemical means. That is. The present invention further provides a preferred species of ICAM-6 DNA, preferably a mammal. Includes homologs. The invention also relates to the non-coding strand, or complement, of the polynucleotide of SEQ ID NO: 1. DNA encoding the ICAM-6 species that hybridizes under stringent conditions Also includes columns. If there is no degeneracy of the genetic code, it should hybridize with it DNA sequences encoding the polypeptides are contemplated by the present invention. Stringer Examples of unique hybridization conditions are as follows: 50% formamide Hybridization at 42 ° C overnight with 5X SSC, 0.5X SSC containing 1% SDS And wash at 50 ° C. In the technical field, Ausebel et al.Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons (1994), pages 6.0.3-6.4.10. By changing the temperature and buffer, or salt concentration, E It should be understood that conditions can be met. Hybridization strip The modification of interest is determined empirically or the probe guanosine / cytosine (G C) It can be accurately calculated based on the length and content of base pairs. Sambro ok et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La boratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), pages 9.47-9.51. Hybridization conditions can be calculated as described. Plasmid and viral DNA vectors incorporating the ICAM-6 polynucleotide sequence Also provided is a self-replicating recombinant expression construct, such as a recombinant expression construct. ICAM-6 code The oligonucleotide is an endogenous or exogenous expression control DNA sequence and a transcription terminator Also provided is an expression construct operably linked to the expression construct. According to a further feature of the present invention, there is provided a method for allowing expression of an ICAM-6 polypeptide of the present invention. A prokaryotic cell stably or transiently transformed with a DNA sequence of the present invention as described above. And host cells, including eukaryotic cells. The host cell of the present invention is specific to ICAM-6. It is a valuable source of immunogens for the development of antibodies with specific immunoreactivity. Departure Light host cells are extremely useful in methods for large-scale production of ICAM-6 polypeptides. Also useful, in such a method, the cells are grown in a suitable medium, and The polypeptide of interest is obtained from the cells or from the medium in which the cells are grown, e.g., Isolated by no affinity purification. Knowledge of the ICAM-6 DNA sequence could allow for increased or decreased expression of endogenous ICAM-6. Such cells can be modified. So that cells express higher levels of ICAM-6, Using all or part of the heterologous promoter, the naturally occurring ICAM-6 ICAM-6 expression by replacing all or part of the promoter The cells can be modified to produce a large effect (eg, repair by homologous recombination). Decoration). A heterologous promoter is operably linked to the sequence encoding ICAM-6. Inserted. For example, PCT International Publication No. WO 94/12650, PCT International Publication No. WO 92/2 No. 0808, and PCT Publication No. WO 91/09955. The present invention Can also include, in addition to a heterologous promoter DNA, an amplifiable marker DNA (eg, ad a, dhfr, carbamyl phosphate synthase, aspartate tran Multifunctional CAD gene encoding subcarbamylase and dihydroorotase And / or inserting the intron DNA together with the heterologous promoter DNA Good. When linked to an ICAM-6 coding sequence, Amplification of Kerr DNA leads to co-amplification of the ICAM-6 coding sequence in the cell. The DNA sequence information provided by the present invention may further comprise, for example, homologous recombination or " Knockout "strategy [Capecchi, Science, 244, 1288-1292 (1989)] Of animals that do not express functional ICAM-6 or express a mutant of ICAM-6 Departure is also possible. Such an animal may be an ICAM-6 in vivo and a modulator of ICAM-6. It is useful as a model for examining the activity of a protein. The present invention also provides purified and isolated ICAM-6 polypeptides. Current and A preferred ICAM-6 polypeptide at this time is shown in SEQ ID NO: 2. ICAM-6 of the present invention Polypeptides can be isolated from natural cellular sources or chemically synthesized. Alternatively, it is preferably produced by a recombinant method using the host cell of the present invention. Optimal organisms for the recombinant expression products of the invention by using mammalian host cells Post-transcriptional modifications that may be necessary to confer biological activity (eg, glycosylation , Truncation, lipidation and phosphorylation) Is predicted. ICAM-6 polypeptides of the present invention comprise full-length polypeptides, biological A fragment thereof that is active on, or retains the specific biological activity of ICAM-6 It may be a mutant. Mutants include (1) ICAM-6-specific biological activities Without loss of immunological properties or (2) the specific biological activity of ICAM-6 With one or more specific (ie, naturally encoded) The amino acid is deleted or substituted, or one or more unspecified amino acids are added. Added ICAM-6 polypeptide analogs may be included. Variant polypeptides of the present invention include mature ICAM-6A polypeptides, Header or signal sequence has been removed and the ICAM-6 Lipids. ICAM-6 polypeptide having an additional methionine residue at position -1 Peptide (Met^-1-ICAM-6) is contemplated, as well as additional methionines at positions -2 and -1. ICAM-6 polypeptide having a lysine and lysine residue (Me^-2-Lys^-1-ICAM-6) It is. These types of mutants are not suitable for recombinant protein production in bacterial cell types. It is especially useful. The invention also has additional amino acid residues due to the use of a unique expression system. It also includes ICAM-6 mutants. For example, glutathione-S-transferr Commercially available vectors that express desired polypeptides, such as GST (GST) fusion proteins Results in cleavage of the GST component from the desired polypeptide, resulting in a -1 position And a polypeptide of interest having an additional glycine residue. Other vectors Variants obtained from expression in a system are also contemplated by the present invention. The present invention also contemplates an ICAM-6 fragment comprising one or more extracellular domains of a polypeptide. Figure. Particularly preferred truncated forms of ICAM-6 include specific ligands that effect cell adhesion Of proteins involved in binding Soluble forms are included. The truncated form of ICAM-6 containing one or more extracellular domains In light of the clarification and identification of the extracellular portion of the protein It is made. Various domains have conserved cysteine residues as well as largely conserved Characterized by the presence of similar and / or similar contiguous amino acid residues . The invention further provides for covalent attachment to an amino acid sequence normally associated with ICAM-6. And attached ICAM-6 fragments. The resulting "chimera" or "fusion" Proteins are particularly useful for modulating the biological activity of ICAM-6 It is also useful for improving the antigenicity of the ICAM-6 amino acid sequence. An "amino acid sequence normally associated with ICAM-6" can be from any source. And that the amino acid sequence adhesion can act on ICAM-6 You can choose based on: The present invention further provides an ICAM modified to include one or more water-soluble polymer adhesives. -6 polypeptide. Particularly preferred is polyethylene glycol (PEG 2.) ICAM-6 polypeptide covalently modified with a subunit. Water-soluble polymer Can be attached to a specific position, for example, the amino terminus of the ICAM-6 polypeptide. Alternatively, it may be randomly attached to one or more side chains of the polypeptide. Further contemplated by the present invention are specific for ICAM-6 polypeptides. Antibodies (eg, monoclonal and polyclonal antibodies, single chain antibodies, chimeric antibodies , CDR-grafted antibodies, etc.) or fragments thereof as well as other binding proteins. Specific Various binding proteins include isolated ICAM-6 products or recombinant ICAM-6 products, ICAM-6 Use mutants or cells expressing such products. Can be manufactured using The binding protein purifies the ICAM-6 polypeptide. And use known immunological methods to isolate ICAM-6 poly in body fluids and tissue samples. Useful for detecting or quantifying peptides. The binding protein is also ICAM -6 modulates biological activities, especially those involved in signal transduction pathways ( That is, it is extremely useful in blocking, inhibiting or suppressing). Anti-idiotypic antibodies specific for anti-ICAM-6 antibodies are also contemplated . Scientific value of information contributed through disclosure of DNA and amino acid sequences of the present invention Is obvious. In a series of experiments, knowledge of the sequence of the cDNA for ICAM-6 -6 and ICAM-6 from promoter, operator, enhancer, repressor, etc. Identification of the genomic DNA sequence encoding the current control sequence was determined by Southern hybridization. Or the use of the polymerase chain reaction (PCR). Moderate DNA / DNA primers performed using the DNA sequences of the present invention under highly stringent conditions from Similarly, isolation of DNA encoding allelic variants of ICAM-6 by the hybridization method Allele variants are defined as ICAM-6 in the art. Structurally related tan having one or more specific biochemical and / or immunological properties It is known to contain protein. Similarly, a protein homologous to ICAM-6 Genes of the encoding species can also be identified by Southern and / or PCR analysis. Can be. Other ICAM-6 proteins, encoding that protein, as a means of selection Complementation tests can be useful for identifying DNA that binds. The polynucleotide of the present invention is for detecting the ability of a cell to express ICAM-6. It is also useful in hybridization assays. Polynucleotide of the present invention Pide is a source of one or more diseases To identify genetic changes (one or more) at the ICAM-6 locus It can be the basis for a diagnostic method. Further realized by the present invention is a polynucleotide encoding ICAM-6 Are antisense polynucleotides that recognize or hybridize with Full length and fragment antisense polynucleotides are provided. Antisense poly Nucleotides are specific for regulating ICAM-6 expression by cells expressing ICAM-6 mRNA. It is related to According to the DNA and amino acid sequence information provided by the present invention, Enables systematic analysis of structure and function. DNA and amino acid information for ICAM-6 Report further identifies molecules that may interact with ICAM-6 . Modulates (ie, increases, decreases or blocks) ICAM-6 binding activity The substance is obtained by incubating the putative modulator substance with ICAM-6, and By determining the effect of the putative modulator on ICAM-6 binding activity Thus, it can be identified. Compounds that modulate the biological activity of ICAM-6 Selectivity depends on the effect of the compound on ICAM-6 and on other ICAM-6 binding proteins. It can be evaluated by comparing the effect with the effect. Di-hybrid Cell-based methods, such as assays and split-hybrid assays, Including assays in which the polypeptide or its binding partner is immobilized. In vitro and solution assays are contemplated by the present invention. Selective modulators include, for example, antibodies and ICAM-6 or ICAM-6 nucleic acid-specific Specific for other proteins or peptides that bind specifically, ICAM-6 or ICAM-6 nucleic acids Oligonucleotides that bind to And other non-specifically binding ICAM-6 or nucleic acids encoding ICAM-6. Peptide compounds (eg, isolated or synthetic organic molecules) and the like are included Can be. Modulators may also be compounds as described above, but are specific for ICAM-6. Contains compounds that interact with the binding partner. Enzyme activity of wild-type ICAM-6 Alternatively, mutant forms of ICAM-6 that affect cell localization are also contemplated by the present invention. It is. Currently preferred targets for developing selective modulators include: For example, (1) ICAMs contact with other proteins and / or within specific membrane regions of cells ICAM-6 cytoplasmic or transmembrane domain, and (2) specific binding The extracellular region of ICAM-6 that binds to the binding partner is included. Modulation of ICAM-6 activity Is therapeutically useful in treating diseases and pathological conditions involving ICAM-6 activity Maybe. Detailed description of the invention The present invention relates to the isolation of a polynucleotide encoding an ICAM-6 polypeptide, Expresses and characterizes the polypeptide encoded by the polynucleotide Is illustrated by the following examples. Example 1 includes a novel ICAM cDNA Describes a search of the EST database designed to isolate columns. Example 2 Screens Mouse Libraries to Identify Full-length ICAM-6 cDNA Related. Example 3 describes a Northern tissue analysis of mouse ICAM-6 expression. Example 4 Describes the use of RACE PCR to identify the 5 'sequence encoding mouse ICAM-6. You. Example 5 describes the construction of an expression plasmid encoding a soluble form of mouse ICAM-6. Is described. Example 6 relates to the isolation of full length mouse ICAM-6 cDNA. Example 7 Additional mouse ICAM-6 expression construction Describe the body. Example 8 describes the production of the ICAM-6 antibody. In Example 9, the mouse The functional analysis of ICAM-6 is described. Example 10 includes in situ mouse ICAM-6 Describe the hybridization analysis. Example 11 shows the partial human ICAM-6 cDNA For the identification of Example 12 provides Northern analysis of human ICAM-6 expression in tissues and cells. Is shown. Example 13 describes the isolation of a more complete human ICAM-6 cDNA. Implementation Example 14 identifies the correctly spliced 5 'cDNA for human ICAM-6. Describes the use of RACE PCR to Example 15 includes a male patient with azoospermia. The cloning of ICAM-6 domains 4 and 5 is described. Example 16 shows that soluble human For expression of ICAM-6 polypeptide. Example 17 includes Western analysis and ICAM Describes the production of -6 antibody. Example 1 Search EST database for new ICAM Expression sequences from The National Center for Biotechnology Information (NCBI) BLASTN search of the EST database to identify new cell adhesion molecules (CAMs) Performed to identify cDNA fragments that could be useful. The data The base displays one or both ends of cDNA collected from various tissue sources. Contains the DNA sequence. To identify ESTs for presentation to the database One sequencing reaction is performed on one or both ends of the cDNA. Therefore, DNA Quality varies significantly in terms of sequence accuracy. As described herein At the time the search was performed, the EST database was 860,000 obtained from various organisms. It contained the above cDNA sequence. A search for a new CAM was performed in three stages. First, B available through NBCI Use the LASTN program to code a known CAM ESTs with homology to the cDNA sequence to be loaded were identified. This program is Nucleotide sequence for all nucleotide sequences in the database Compare. In this search, human ICAM-1 [Staunton, et al., Cell 52: 925 (1988)], ICAM-2 [Staunton, et al., Nature 339: 61 (1989)], ICAM-R [ Vazeux, et al., Nature 360: 485 (1992)], LW-ICAM-4 [Bailly et al., Proc. N at'l. Acad. Sci. (USA) 91: 5306 (1994)], ICAM-5 [Mizuno et al., J. Biol. Chem. 272: 1156 (1997)], VCAM-1 [Osborn, et al., Cell 59: 1203 (1989)], and Ma dCAM [Leung, et al., Immunogenetics 46: 111 (1997)], mouse ICAM-1 [Ball antyne, et al., Nucl. Acids. Res. 17: 5853 (1989)], ICAM-2 [Xu, et al., J.I. mmunology 149: 2650 (1992)], ICAM-5 [Yoshihara, et al., Neuron 12: 541 (199 4)], VCAM-1 [Araki, et al., Gene 126: 261 (1993)], and MadCAM [Briskin, e et al., Nature 363: 461 (1993)] and a part of mouse ICAM-4 (EST W46066). The BLASTN search was performed 13 times, presenting the cDNA to be loaded. From those results, 13 An EST sequence that was found to correspond to one of the known CAMs was identified. In the second step, the TBLASTN search is performed using the above-mentioned amino acids of the known human and mouse CAM genes. Noic acid sequence was used as the display sequence. In this search, EST sequence live The polynucleotide in the rally is translated in six reading frames and the resulting amino acid Each of the acid sequences is compared to the displayed sequence. Identified in this search and found in the first search The EST corresponding to the issued EST was not adopted. In the third step, sequences that were identified by TBLASTN search and did not correspond to known CAMs were further added. Examined. Most of the remaining sequences are conserved, typically found in cell adhesion molecules Cysteine residue and extracellular domain structure. So this Array of Also did not adopt. However, it was obtained from the testis of the mouse and was identified as : 46), a 250 nucleotide EST called mouse ICAM-1, ICAM-3 and ICAM-5. Identified as encoding a polypeptide sequence homologous to the amino acid sequence of AA The sequence of 065978 was most closely related to mouse ICAM-5. AA065978 sequence and its Sequence comparison with the corresponding mouse ICAM-5 region showed a total of 47% identity. Was. This EST was transferred to I.M.A.G.E (Lawrence Livermore Laboratory, Livermore, CA ) Maintains and makes available the EST deposits identified and sequenced Genome Systems (St. Louis, MO). Bacteria transformed with the plasmid DNA encoding AA065978 of EST were Inoculated into LB-agarose containing sylin and grown overnight at 37 ° C. One colony Was grown in liquid LB-carbenicillin medium. 18 ml of plasmid DNA From a bacterial culture using the Wizard Mini-Prep kit (Promega, Madison WI) Collected. The sequence of the EST insert was compared with the vector primer T7.1 (SEQ ID NO: 3). ) And T3.1 (SEQ ID NO: 4) and the database sequence of AA065978 Uses designed primers I6MO24 (SEQ ID NO: 5) and I6MO20 (SEQ ID NO: 6) Decided. T7.1 SEQ ID NO: 3 GTAATACGACTCTCACTATAGGGC T3.1 SEQ ID NO: 4 AATTAACCCTCACTAAAGGG I6MO20 SEQ ID NO: 6 TTGCCTGCATCCCAGAGG I6MO24 SEQ ID NO: 5 CAAGCCAAGGTTTCAGGAATCCCGCTGC After the first sequence analysis, primers I6MO30 (SEQ ID NO: 7), I6MO31 (SEQ ID NO: 7) : 8), I6MO32 (SEQ ID NO: 9), I6MO33 (SEQ ID NO: 10) and I6MO34 (SEQ ID NO: No .: 11) was further designed to determine the rest of its EST sequence. I6MO30 TCTTTGCTGGAGTGTGAC SEQ ID NO: 7 I6MO31 GTCACACTCCAGCAAAGA SEQ ID NO: 8 I6MO32 CAAAGCAAGGGCGAGGAG SEQ ID NO: 9 I6MO33 CTCCTCGCCCTTGCTTTG SEQ ID NO: 10 I6MO34 TCTAGGTGGGACTCTGTG SEQ ID NO: 11 AA065978 DNA sequence, for both strands, the above DNA oligonucleotide Primer and Perkin Elmer Applied Biosystems Division 373A DNA Sequence Determined according to the manufacturer's instruction protocol using r. Use as template The amount of PCR product used was calculated based on the size of the PCR product, and the Measurements were performed using AmpliTaq DNA Polymerase, FS (Perkin Elmer, Foster City, CA) and non- ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Ki by symmetric PCR Performed using t. The reaction product is transferred to an AGCT spin column (Advanced Genetic Techno logies Corp., Gaithersburg, MD) and dried. Loading buffer Added to each purified sample, the mixture was heated at 90 ° C. for 2 minutes. Transfer the solution to ice And run on a 4% polyacrylamide gel until run. Data is collected by a data collection pro When the gram is started, it is automatically collected and automatically sequenced by the sequence analysis program. Dynamically analyzed and read. All editing is done manually, A consensus sequence was determined by comparing the sequences obtained. Sequence analysis indicates that AA065978 is 1.6 kb in length, and Splicing between domain 4 and domain 5, followed by a transmembrane region and cytoplasm The tail was shown to contain a correctly processed transcript following. AA0659 The protein homology between the 78 predicted amino acid sequences and other known mouse ICAMs is shown below. Is shown in Table 1. Due to sequence similarity of the amino acid sequence of AA065978 to other known mouse ICAMs I decided to call this EST ICAM-6. Example 2 For full-length mouse ICAM-6 cDNA Screening of mouse testis library Mouse EST AA065978 identified in database as derived from mouse testis cDNA In order to isolate the full-length cDNA encoding ICAM-6, Bullies were screened. Approximately 1 x 10 from mouse testis library (Stratagene, La Jolla, CA)⁶Step Lark-generating unit (pfu) is determined by PCR³²Mouse ICAM-6 domain labeled with P-dCTP Screening was performed using 5 probes. This probe was used in two PCRs. Produced. First, using the AA065978 plasmid as a template, I6M0 PCR using primers 24 (SEQ ID NO: 5) and I6MO26 (SEQ ID NO: 12) In response, the DNA encoding domain 5 was amplified. I6MO26 AGTAGCTCCCCGTGTGGTTCTGGGTGGC SEQ ID NO: 12 PCR was performed on a DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, Foster City, CA): For each reaction, 250 mM KCl, 100 mM Tris pH 8.3 (Perkin-Elmer PCR buffer), 2 mM MgCl_Two2 mM dNTPs, 100 μg / ml primer, 0.125 μl T / 25 μl reaction aq polymerase (Perkin-Elmer, Roche Molecular, Branchburg, NJ) and 2μ 1 AA065978 plasmid DNA included. Performing a 4 minute denaturation step at 94 ° C. Thereafter, denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 50 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute 30 cycles of extension were performed. One band is agarose at its expected size It was found to migrate on the sgel. The 209 bp band was gel purified and And template for the second PCR amplification Used as In the second PCR, the DNA of ICAM-6 domain 5 was replaced with seven identical 25 μl PCRs. Labeling was performed by performing the reaction. In this reaction, in the nucleotide mixture 2 mM dCTP was replaced with 20 μCi dCTP³²P (New England Nuclear, Boston, MA) and 0.02m M was replaced with unlabeled dCTP. Other PCR conditions are the same as for the first amplification Met. By combining the PCR polypeptides obtained from the seven reactions, , Sephadex G50 spin column (5 Prime, 3 Prime, Inc. Boulder, CO) Purified from nucleotides that did not. Transfer library phage to nylon membrane by standard methods Filter at 42 ° C. overnight with 50% formamide, 5 × SSC, 5 × Denhardt solution And 1 × 10 at 0.5% SDS⁶Using cpm / ml labeled domain 5 probe And hybridized. The next day, filters were run in 2 × SSC and 0.1% SDS. 3 washes for 15 minutes at room temperature and 10 minutes at 50 ° C. in 0.5 × SSC and 0.1% SDS Was washed once. The filter was then exposed to the film. Eighteen positive clones were identified, these were purified and sequenced. Three black Were found to be unspliced, but 15 clones were correct. Well-splashed and found to contain both transmembrane and cytoplasmic regions . The longest clone, called MT-3, was found to be 2.3 kb in length, and Encodes a region with four of the five extracellular domains characteristic of a repeptide And poly (A)⁺Also included the tail. By sequencing, this clone has a 5 ' No columns were indicated. The sequence of MT-3 is shown in SEQ ID NO: 42. Example 3 Tissue expression of clone MT-3 To determine in which tissues ICAM-6 is expressed, multiple mice were Northern blot (MTN) of tissue (Clontech, Palo Alto, CA)³²P-labeled ICAM- Screening was performed using 6 probes. This probe is for domain 2 of ICAM-6 Gel-purified 1.4 kb PstI / Sa from MT-3 extending from the center of the to the cytoplasmic tail It was a cI DNA fragment. This probe³²P-dCTP and³²Random-Priming P-TTP Kits (Boehringer-Mannheim, Indianopolis, IN) Labeled by liming reaction. Perform hybridization by the manufacturer's instruction I went according to Tokor. The results indicate that a 3 kb transcript was found in testis, while normal heart, brain, and spleen It did not hybridize with RNA obtained from the gut, lung, skeletal muscle and kidney. Example 4 RACE PCR to determine the 5 'end of mouse ICAM-6 To determine the 5 'end of mouse ICAM-6, RACE PCR was performed on mouse testis Marathon-r eady^TMPerformed with a cDNA library (Clontech, Palo Alto, CA). cDNA is mouse Prepared from testis RNA samples and ligated to marathon cDNA adapter It was: The marathon adapter enabled the complementary primer AP-1 (SEQ ID NO: 13) and PCR using AP-2 (SEQ ID NO: 14). AP-1 CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC SEQ ID NO: 13 AP-2 ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC SEQ ID NO: 14 Increase the PCR fragment containing the ICAM-6 leader, domain 1, domain 2 and domain 3. For the sake of breadth, two platforms, I6MO40 (SEQ ID NO: 15) and I6MO39 (SEQ ID NO: 16) Primers were designed based on the sequence previously determined for MT-3. I6MO40 GCTCACAATCTCTGCCTTCCCAACCTCC SEQ ID NO: 15 I6MO39 GACAGTGGCGGTGACCTCGGCTCTTTGG SEQ ID NO: 16 Primer I6MO40 corresponds to the domain 3 sequence of MT-3, and primer I6MO39 corresponds to MT-3 It corresponded to the sequence of domain 2. Four primers were used in two rounds of PCR. In the first run, 25 μl The reaction was performed with 1 × Klen Taq buffer, 2 mM dNTPs, 0.2 μM AP-1, 2 μg / ml I6MO40, 0. 5 μl KlenTaq polymerase solution and 2.5 μl mouse testis cDNA library Using the Advantage cDNA PCR kit (Clontech) according to the manufacturer's instructions. I went using it. "Touchdown" PCR reaction Reaction is a 1 minute denaturation step followed by a 5 minute denaturation at 94 ° C. and a 2 minute 5 cycles of annealing / extension, denaturation at 94 ° C for 5 seconds and annealing at 70 ° C for 2 minutes. 5 cycles of cooling / extension and denaturation at 94 ° C for 5 seconds and 68 ° C for 2 minutes. Performed by 25 cycles of kneeling / extension. Under these conditions, an amplified product that can be detected on an agarose gel was obtained. The annealing / extension temperature was lowered by 2 ° C. for each cycle and the AP The PCR was repeated using the -1 and I6MO40 primers. Under these conditions, about 900 bp One of Amplification products were detected on agarose gel. The amplification products from both PCRs were each diluted 1:50 with water to give another P Used as template DNA for CR. Amplification was performed with AP-1 and I6MO40 or AP- Either 2 or I6MO39 primer pair was used. The reaction was By volume, by the same configuration as above, and as above at the lowest temperature (70 ° C, 68 ° C And 66 ° C). The resulting PCR products were analyzed using agarose gel electrophoresis. Agarlow By sgel electrophoresis, two bands migrating at the expected size, plus Mear-like DNA was observed. Approximately 900 bp bunt binds the primer pair of AP-1 and I6MO40 Approximately 700 bp of bunt were detected from the reaction used and AP-2 and I6MO39 primers were detected. Detected from reactions using mer pairs. This 900 bp fragment is Matches the size of the DNA expected to encode did. The smaller 700 bp fragment was compared to the complementary sequence of primer I6MO40 to MT-3. DNA size predicted from use of primer I6MO39 based on the position of the complementary sequence Match. The sequence of this fragment was used as a primer for AP-2 and I6MO37 (SEQ ID NO: 17). The full length of the mouse ICAM-6 cDNA was estimated by direct determination using PCR. The 900 bp amplification product was prepared using the TA Cloning Kit (Invitrogen, San Diego, CA). It was ligated into the vector pCR2.1 using according to the manufacturer's instructions protocol. Shape bacteria Transformed and seeded. Plasmid DNA is recovered from selected colonies and Using primer I6MO36 (SEQ ID NO: 18) corresponding to the sequence of step 2 and T7.1 Sequenced by PCR. I6MO37 AGGAGTGAAGGCACCCAG SEQ ID NO: 17 I6MO36 CAGAGCCTCACCCTTACC SEQ ID NO: 18 Has the correct orientation of the insert producing the antisense riboprobe (see below) One clone (called "ICAM-6 mouse 5'RACE clone # 6") was selected and The sequence of the insert was determined again. By sequence analysis, this # 6 clone contained 5 'untranslated DNA, as well as a leader sequence. Column, domain1, domain2, and a portion of domain3. Combining the complete 5 'RACE sequence with MT-3 DNA, the complete coding for mouse ICAM-6 Complete cDNA was prepared. Deduced amino acid sequence of mouse ICAM-6 differs from other known ICAMs To confirm this, a sequence comparison was performed using the known mouse ICAM amino acid sequence. went. By comparison, mouse ICAM-6 has five extracellular immunoglobulin domains. And have sequence homology to other mouse ICAM polypeptides It was shown to be an ICAM molecule. Table 2 shows the results of amino acid comparison. Example 5 Construction of soluble mouse ICAM-6 / IgG1 expression brasmid Protein expression and purification A.ICAM-6 D1-5 / IgG1 in plasmid pDC1 Expression plasmids and plasmid pDC1 were used to analyze the function of mouse ICAM-6 It was produced. This construct incorporates ICAM-6 extracellular domains 1-5 (D1-D5) into Ig Coated as a chimeric polypeptide linked to the hinge CH2-CH3 domain sequence from G1. Did. In this expression construct, the 3 'end of the ICAM-6 coding region (MT-3 domain). (Corresponding to the sequence from step 3 to domain 5) with I6MO43 (SEQ ID NO: 34) and I6MO43 Prepared by PCR using a primer pair of MO44 (SEQ ID NO: 19). I6MO43 ATGCCCTCGAGCAGGCCTTGGAC SEQ ID NO: 34 I6MO44 TCACGGCAGCTCAGCCACCAAGC SEQ ID NO: 19 Ligate the 3 'fragment of ICAM-6 obtained by PCR to the sequence encoding the IgG1 fragment To facilitate this, an XhoI site was incorporated into the I6MO43 primer (underlined , See above). Hinge CH2-CH3 of human IgG1 [Burto, et al., Immunol. 22: 162-2 06 (1985)] from ICAM-1 / IgG1 / pDC1 by SalI and XbaI. And isolated by digestion. The 5 'protruding end of Sall is attached to the above-mentioned PRC amplification product. Was compatible with the 3 'overhang of XhoI. Production of the 3 'end (encoding domain 3 to domain 5) of the ICAM-6 component of the fusion DNA In the raw, 50 μl of the two PCR reactions were primed using MT-3 DNA as a template. Mer I6MO43 and I6MO44, "high fidelity" Pfu DNA polymerase (Stratagen, La Jolla , CA) with the corresponding dNTPs and buffers, using the manufacturer's protocol So we did. The PCR reaction was performed using the Gene Amp^RPCR System 9700 (Perkin Elmer) It was carried out in. Transfer the sample to Gene Amp^RPCR system 9700 (Perkin Elmer) at 94 ° C 30 minutes at 94 ° C for 30 seconds; 55 ° C for 30 seconds; and 72 ° C for 30 seconds. Treated with Kuru. Approximately 930 bp of the PCR product is transferred to the QIAquIck Gel Extraction Kit (QIAGEN , Chatsworth, GA), digested with BglII and XhoI, and Gel purification was performed using the k kit. The DNA fragment encoding the 5 'end of the ICAM-6 polypeptide was described in the previous example. "5'RACE mouse ICAM-6 clone # 6" was obtained from HndIII / BglII digest. HindIII / BglII fragment encoding the 5 ′ end of the ICAM-6 sequence, the 3 ′ end of the ICAM-6 sequence BglII / XhoI fragment encoding, and SalI / XbaI encoding the hinge CH2-CH3 of IgG1 The fragments were ligated together and inserted into pDC1 previously digested with HindIII and XbaI. The resulting plasmid was transformed into XL2 Blue Competent Cell (Stratagene, La Jolla, CA). ), And transformants were transformed with IC6MO36 (SEQ ID NO: 18) and IC6MO43 (sequence Screening was performed by PCR using the primer No. 34). By PCR Clones that were found to be positive were confirmed by sequencing. Sequence analysis of the cDNA encoding the ICAM-6 region of the fusion protein One nucleotide encoding the amino acid at position 180 in the protein sequence is clone M It was shown to be different from the nucleotide in T3. In clone MT3 , The amino acid at position 180 is leucine, but "5'RACE mouse ICAM-6 clone # 6" CDNA produced by RACE to obtain phenylalanine at position 180 did. This mutation may be polymorphic or may result from an amplification process. May be Immunoglobules linked by cysteine residues between main 2 and domain 3 It was located outside the phosphorus-like domain. And the mutation leads to an extracellular domain It was not considered important for the function. B.Expression and purification Transfection of COS cells was performed using the pDC1 construct described above encoding ICAM-6 / Ig. Was performed using the DEAE dextran method. Briefly, 0.3mg / ml DEAE dextran (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and 0.1 mM chloroquine (Slgma, St. Louis, MO) containing 2Oml of serum-free Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) was added to 50-80% confluent COS cells in 15 cm plates . 37 ℃ and 5% CO_TwoAfter incubation for 2 hours in Incubate for 1 minute in DMEM containing sulfoxide (DMSO) and add 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 100 u / ml penicillin, 100 μg / ml streptoma Overnight incubation in DMEM supplemented with isine and 2 mM L-glutamine I did it. The next day, the medium was replaced with fresh medium containing only 5% FBS. Supernatant 2 Collect every 5 days, filter through a 0.2 μm filter and store at 4 ° C. until purification did. The concentration of ICAM-6 / Ig protein in the supernatant should be at least After three weeks, there was no significant decrease. The ICAM-6 / Ig protein was purified from the COS supernatant using a HiTrap protein A column (Pharmaci Collected using a). First, the column is loaded with calcium and magnesium. Equilibrated with at least 100 ml of fresh phosphate buffered saline (CMF-PBS). Mosquito Addition to the ram was performed using the Biorad Econo System. 1-2 ml of COS supernatant Per minute. After addition of the supernatant, remove the column. Washed with at least 100 ml of CMF-PBS. 100 mM citric acid (pH 3.0) Was used to elute directly into neutralization buffer containing 1M Tris (pH 9.0). Elution The purified protein was converted using a Slide-a-Lyzer cassette (Pierce, Rockford, IL). And at least three buffer exchanges with CMF-PBS for at least 24 hours Dialyzed. If necessary, dialyze the protein into a BIOMAX 30K centrifugal filter (Mi llipore, Bedford, MA). Capture protein concentration by ELISA Was measured as follows. Immulon 4 plate (Dynatech) Goat anti-human immunoglobule diluted with lium / sodium bicarbonate buffer (pH 9.6) Phosphorus (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) at 3 μg / ml for 1.5-2.5 hours Coated at 37 ° C. Wash plate 3 times with CMF-PBS containing 0.05% Tween did. Add protein sample (diluted in DMEM with 5% FBS) and add Incubated for minutes. Plates were washed three times. Captured protein Was diluted 1: 2000 with DMEM containing 5% FBS in horseradish peroxidase (HRP ) Pre-conjugated goat anti-human immunoglobulin (Jackson ImmunoResearch) The plate was incubated for 30 minutes at 37 ° C and detected. Wash the plate three times, Color with o-phenylenediamine (OPD) (Sigma) and Dynatech MR5000 plate Read by reader. Compare protein concentration to ICAM-6 / Ig control Estimated by. Protein purity was determined using S containing 2 μg of purified protein. Evaluated by Coomassie staining of DS-PAGE gels. 50% for all ICAM-6 preparations ~ 90% purity, and bovine immunoglobulin as obvious contaminants. Had onlyC. ICAM-6 D1-5 / IgG1 in plasmid pDEF-1 To increase expression levels, the ICAM-6 / Ig construct was used for expression in CHO cells. Was prepared using the pDEP14 vector. The pDEF14 vector has high levels of CHO cells EP-1α promoter from Chinese hamsters previously shown to allow expression Data included. The ICAM-6 / Ig sequence was digested with HindIII and XbaI to obtain pDC- Removed from one construct. The fragment was gel purified and the 738 bp NotI from pDEF14 / HindIII fragment and a 19,723 bp NotI / XbaI fragment. D.Expression and purification Transfer pDEF14 / ICAM-6 / Ig plasmid to XL-2 Blue competent cells (Stratagene) After transformation, colonies were screened by PCR. The resulting clone Perform stable transfection of CHO cells using pDEF14 / ICAM-6 / Ig Was. Briefly, cells were harvested at 50% using 0.05% trypsin / 0.53 mM EDTA. Recovered from confluent CHO cultures, 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate , 100 u / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 0.1 mM hypoxanthine sodium and 1.5 mM thymidine in DMEM / F12 medium (HT + DMEM / F12). The collected cells were washed with CMF-PBS. About 20 × 10⁶Individual details Transfection of the vesicles was pre-ethanol precipitated and 20 mM HEPES-NaOH (PH 7), 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Ha_TwoHPO_FourAnd 6 mM dextrose Using 50 μg of DNA resuspended in 800 μl of HBS buffer with BioRad GenePuls er electroporator with a capacity of 960 μF and a voltage of 290 V. D After lectroporation, cells were allowed to regenerate at room temperature for 10 minutes. Transfer cells to 10 ml of HT + DM Wash with EM / P12 and centrifuge Pellet and inoculate two 10 cm plates containing HT + DMEM / P12 Was resuspended. Two days after transfection, the transfectants are Collected by Psin / EDTA and used with 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate Um, 100 u / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin and 2 mM L-glutami 1: 8, 1:16, 1:32 and 1:64 in HT + DMEM / F12 medium containing And seeded on a 15 cm plate. After two weeks, about 300 colonies were obtained. Colony Is recovered using trypsin / EDTA as described above, and The number of cells was calculated to be one cell per well, and the cells were seeded in a plate well. 18 days later, The wells of 120 single colonies were subjected to ELIS using COS-producing protein as described above. Screened by A. Eighteen of these clones were expanded and 3 One day later, another screening was performed by ELISA. Select four clones And further expanded. As a result, ICAM-6 / Ig was 3.7μ / ml in 3 days. A supernatant estimated at g was obtained. Example 6 Isolation of full-length mouse ICAM-6 cDNA Second screening to isolate full-length mouse ICAM-6 cDNA Was replaced with 2 × 10 5 from a commercially available mouse testis library (Stratagene).⁶About pfu, This was performed using the MT3 clone described in Example 2. Hybridization The conditions were as described above, but the library was probed with ICAM-6 domain 2 and I hybridized. This probe was constructed based on the sequence of domain 2 derived from the MT-3 sequence. PCR using primers I6MO36 (SEQ ID NO: 18) and I6MO37 Prepared. I6MO36 CAGAGCCTCACCCTTACC SEQ ID NO: 18 I6MO37 AGGAGTGAAGGCACCCAG SEQ ID NO: 19 Label this probe using two PCRs and perform hybridization Performed as described in Example 2. Eleven clones were identified and only one, called MT2-36, encoded full-length ICAM-6. It seemed to be. This clone contained two inserts: phosphaters 0.8 kb insert encoding zea and a 2.8 kb insert encoding mouse ICAM-6. 2. The 8 kb mouse ICAM-6 insert was analyzed. By sequence analysis, this MT2-36 sequence , The ICAM-6 sequence deduced from the MT-3 sequence, and the RACE amplification product described in Example 4. Was shown to be identical to The nucleotide sequence of the MT2-36 clone (ICAM-6) It is shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence deduced therefrom is shown in SEQ ID NO: 2. Plasmid MT2.36 encoding MT2-36 was transferred to a bacterial host under the terms of the Budapest Treaty. Under the section, 1 in the American Type Culture Collection (12301 Rockville MD, 20852) Deposited on October 16, 997 and given deposit number 98557. Example 7 Construction of further ICAM-6 expression plasmid The expression of soluble mouse ICAM-6 was improved, and the ICAM-6 / IgG1 chimera (Example 5) was used. Phe found in¹⁸⁰PCI-neo vector (Prome ga, Madison, WI), the expression construct encoding domains 1-5 / IgG1 of ICAM-6. A structure was made. Conversion of glutamic acid (Glu) to alanine (Ala) at position 38 A second expression construct containing the difference was also made. This Glu³⁸Is the domain of ICAM-6 In Ile-Glu-Thr-Phe Part of the motif, and this conserved motif, in ICAM-1 and ICAM-3, It was found to be essential for binding to 1. Therefore, by analogy with other ICAMs Thus, this change in amino acid sequence results in a putative LFA-1 binding in domain 1. It was expected that the joint site would be removed. A.ICAM-6 domains 1-5 / IgG1 in pCI-neo for functional analysis To construct this construct, the leader region of ICAM-6 up to domain 3 was replaced with MT Amplified by PCR using 2-36 clones as template. Two plastic An immer was designed; I6MO55 (SEQ ID NO: 28) was complementary to the 5 'end of mouse ICAM-6. Yes, I6MO56 (SEQ ID NO: 29) was based on the sequence within domain 3. I6MO55 GCGATGCTAGCAAGCTTCACAGCTCATCACCATGGCAATG- CTTCTGTTGGGTGTCTGGACACTGCTGGCC SEQ ID NO: 28 I6MO56 GGACCCAGAGACACAAGGCAAGTCAGTTCC SEQ ID NO: 29 The I6MO55 primer can induce high levels of ICAM expression in other constructs The short Kozak sequence shown earlier (Italic) and two cloning sites (Nh eI and HindIII, underlined). For PCR reaction, template MT2-36 DNA As primers, primers I6MO55 and I6MO56, and “proofreading” Pwo DNA polymerase (B manufactured using oehringer Mannheim, Indianapolis, IN) Hold at 95 ° C. for 1 minute in a System 9700 (Perkin Elmer) then at 94 ° C. Treated by 30 cycles of 15 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 45 seconds. PC R product (about 880 bp) Migrated at the expected size in electrophoresis. This fragment was gel purified and NheI and And BglII and gel purified again (Wizard PCR Purification Kit, Promega, Madiso n, WI). Construction of mouse ICAM-6 domains 1-5 / IgG chimera was performed in two steps. At first, Implement the NheI / BglII fragment of ICAM-6 (encoding from the leader to domain 3) BglII / XhoI of ICAM-6 as described in Example 5 (encoding domain 3 to domain 5) The fragment was ligated and inserted into the pCI-neo vector which had been pre-cut with NheI and XhoI. Profit Plasmids can be transferred to XL1 Blue Utracompetent cells (Stratagene, La Jolla, CA) And colonies were transformed with T3.1 (SEQ ID NO: 4) and T7.1 (SEQ ID NO: 3). The presence of a plasmid with the correct insert is determined by PCR using primers. I checked. In the second step, the resulting plasmid of the first step was digested with XhoI and XbaI and gel purified. Was. The 903 bp SalI / XbaI human IgG1 hinge CH2-CH3 fragment described in Example 5 was It was ligated to the ICAM-6 sequence and the vector sequence described above. The resulting plasmid is Transform E. coli XL1 Blue cells into bacteria with the correct size insert Were screened by PCR for the presence of the plasmid. Analysis of clones By sequencing to confirm that the correct insert is present, and that Phe¹⁸⁰Mutation exists Confirmed that there is not. B.ICA in pCI-neo with glutamate / alanine mutation required for functional analysis M-6 Domain 1-6 / IgG1 For this construct, Glu³⁸To remove putative LFA-1 binding sites. Replaced with nin. Three primers were designed to create mutations. First primer ー I6MO57 (SEQ ID NO: 30) , Glutamate codon GAG was replaced by alanine codon GCG (underlined) It was a sense primer. The second primer I6MO58 (SEQ ID NO: 31) The antisense codon CTC of tamate is replaced with the antisense codon CGC of alanine (underlined part) ) Was replaced by the antisense primer. Third primer I6MO59 (SEQ ID NO: 36) is identical to, but shorter than, the 5 'end of I6MO55. I6MO57 CCTGGGCCCAGTGGAATCGCGACCTTCTAA SEQ ID NO: 30 I6MO58 TAAGAAGGTCGCGATTCCACTGGGCCCAGG SEQ ID NO: 31 I6MO59 GCGATGCTAGCAAGCTTCACAGCTCATCACC SEQ ID NO: 36 Mutations were created using two rounds of PCR. In the first round, the alanine mutation Two fragments were generated containing the 217 bp 5 'fragment with primers I6MO55 and I6MO58. And a 728 bp 3 ′ fragment was prepared with primers I6MO57 and I6MO56. First time PCR, as described above, MT2-36 DNA as template and Pwo DNA polymerase This was performed using a lyse. Gel-purify both fragments from the PCR reaction, then Diluted to 0 and used as template for the second PCR. ICAM-6 region from leader to domain 3 and Glu³⁸/ Ala³⁸Contains mutation A second PCR was performed to produce one DNA fragment. Primer I6MO59 and I6MO57 was used. The template was 217 bp and 72 bp obtained in the first PCR. It was a mixture of 8 bp fragments. The two DNA fragments overlap by 30 bp, Were annealed to each other during the annealing step of the PCR reaction. Single Stra Extension from the ICAM-6 leader to domain 3 Region and Ala³⁸Mutation A 915 bp fragment was obtained. The PCR reaction is performed as described above for the Pwo DNA The procedure was performed using a protease. The obtained 915 bp ICAM-6 fragment was digested with NheI and BglII and gel-purified. This cut The pieces were combined with the BglII / XhoI ICAM-6 fragment (domains 3-5) described above, and NheI and Ligation into the pCI-neo vector pre-digested with XhoI, pCI-neo ICAM-6 (leader -~ Domain 5, Ala³⁸) The plasmid was obtained. Finally, the SalI / XbaI IgG1-Fc fragment was inserted into the above plasmid. can get Plasmid is ICAM-6 Ala³⁸/ IgG chimera encoded. This is done by sequencing confirmed. HIS ICAM-6 domains 1-3 of the tag The presence of human IgG1 in the mouse ICAM-6 / IgG1 chimera caused the expressed polypeptide to Used as an antigen to raise polyclonal antibodies required for immunohistology It was thought to make it difficult. Therefore, soluble mouse without its IgG1 antigen An expression construct was prepared that allowed the production of ICAM-6. First three domains of mouse ICAM-6 to produce soluble ICAM-6 molecules Was inserted into the bacterial expression vector pBAR8a. Expressed using this vector The protein is transcribed under the control of an inducible arabinose promoter. pBAR 8a plus No. 17) is coded in its cloning section, This allows detection and purification of the protein. HIS tag CATCACCATCACCATCAC SEQ ID NO: 32 The first three domains of mouse ICAM-6 were selected for two reasons. First, ICAM Immune response with the N-terminal part of -6 molecules and block ICAM-6 function Thus, an antibody capable of detecting an ICAM-6 molecule in a tissue section was desired. Second, based on experience with other ICAM proteins, the first three domains Expression is thought to allow for the production of soluble proteins in E. coli. I got it. And the HIS tag sequence and the reading frame were inserted into pBAR8a. First, ICAM-6 domain DNA encoding domain 3 from in 1 was prepared by PCR. One primer -I6MO52 (SEQ ID NO: 33) was designed to be complementary to the 5 'end of domain 1. Was. This Includes KpnI (underlined) that allows the reading frame to be aligned. Another ply Mer I6MO54 (SEQ ID NO: 37) was sequenced so that it was complementary to the 3 'end of domain 3. Spel site (underlined) to allow cloning in pBAR8a and ICAM-6 fusion Designed to contain a stop codon (italic) that stops translation of the combined protein Was. I6MO52 CGAGGAGCTGTTTCAGGTACCTGTCC SEQ ID NO: 33 I6MO54 CGTTCACTAGTTTTCTGCTCTCAGGGACC SEQ ID NO: 37 PCR amplification was performed using MT2-36 of mouse ICAM-6 clone as a template, 6MO54 as primer and “proofreading” Pwo DNA polymerase (Boehringer M annheim, Indianapolis, IN ) According to the manufacturer's protocol. The reaction is Ge Denature for 4 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 52 ° C for 30 seconds, and And 30 cycles of 1 minute extension at 72 ° C. Move at expected size Gel purification of the 800 bp PCR fragment (Wizard PCR Purification System) ), Digested with KpnI and SpeI, gel purified again and pre-digested with KpnI and SpeI Ligation to gel purified pBAR8a. Obtain the resulting plasmid according to the manufacturer's protocol. DH5α competent cells (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) Toracyclin Aga The presence of the input was confirmed by sequencing. Plasmid ICAM-6 / pBAR8a was cloned to produce an ICAM-6 fusion protein. E. coli strains deficient in binose metabolism were transformed. For small scale experiments To grow transformed colonies at 30 ° C and induce protein expression. For this, arabinose was added to a final concentration of 0.5%. One hour after induction of the sample And harvested after 2 hours, pelleted by centrifugation and resuspended in cold CMP-PBS did. The presence of expressed protein was determined on a 12% SDS-PAGE gel (Novex, San Diego, CA). Examined.A protein migrating at approximately 38 kD corresponding to the expected molecular weight was detected. This IC The AM-6 fusion protein was transferred to a nickel purification column (Ni -Purify using NTA Silica, QIAGEN, Chatsworth, GA). D.pCI-neo ICAM-6 domains 1-5 Separate soluble ICAM-6 constructs from the five extracellular domains of ICAM-6 If it is not desired to have reactivity to IgG1, rabbits or chickens Expressed in mammalian cells to raise polyclonal antibodies in any of I let it. No .: 39) was incorporated at the 3 'end of ICAM-6 by PCR using the primers. I6MO44 TCACGGCAGCTCAGCCACCAAGC SEQ ID NO: 19 I6MO45 AATTTCTCGAGTCACTTGTCATCGTCGTC- CTTGTAGTCCTCAGGCAGGCCTTGGAC SEQ ID NO: 39 These primers were used in two 50 μl PCR reactions using MT-3 DNA as a template. Used. Hold the sample at 94 ° C for 5 minutes, then at 94 ° C for 30 seconds at 55 ° C. For 30 seconds and 30 seconds at 72 ° C. for 30 seconds. PCR product (about 850 bp ) Was gel purified, digested with XhoI and BglII, and gel purified again (QIAquick Gel Ex traction Kit, QIAGEN, Chatsworth, GA). The 5 'end of ICAM-6 is described in Example 4. The resulting “5′RACE ICAM-6 clone # 6” was digested with SpeI and BglII to obtain a 720 bp DNA. The fragment was isolated by gel purification. Contains the 5 'and 3' ends of ICAM-6 DNA fragments were ligated into pCI-neo that had been previously digested with NheI and XhoI. Ligation reaction mixture The transformant is transformed into XL2 Blue competent cells and transformants are screened by PCR. I was leaning. Placing the ICAM-6 sequence of the plasmid as described above Therefore, it was confirmed. Three clones with the correct sequence were identified for the ICAM-6 / Ig construct. And transfected into COS cells as described above. Blot using Western blot (Eastman Kodak Company, Nwe Haven, CT) I could not detect it more. Example 8 Preparation of anti-mouse ICAM-6 antibody Anti-mouse ICAM-6 monoclonal antibodies can be produced in different ways. A.Intra-spleen injection in mice Two mice were pre-bleed and on day 0 5 μg of ICAM-6 / IgG1 chimeric protein was Immunization was performed by intra-splenic injection of PBS containing PBS. Immunization, previously reported Method [Spitz, Meth. Enzymol. 121: 33-41 (1986)]. On the eleventh day, Blood is collected from mice and assayed for reactivity to immunizing antigen by ELISA did. Briefly, Immulon 4 plates (Dynatech, Cambridge, MA) were And goats pre-adsorbed to mouse serum proteins (Jackson ImmunoResearch) Coated with anti-human antibody. Wash plate to remove C containing ICAM-6 IgG1 OS supernatant was added. As a negative control, ICAM-1 / IgG1 fusion protein was added to 10 Diluted to 2 μg / ml with RPMI containing% FBS and immobilized in the same manner. Plate After incubation and washing, add pre-immune mouse serum and immunized mouse serum. Was. Goat anti-mouse IgG1 (fc) horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody (Jackson ) Was used to detect anti-ICAM-6 antibody in any mouse. The results show that the mouse immune serum was compared to the pre-immune serum and the immobilized ICAM-6 fusion No reactivity with either the protein or the ICAM-1 fusion protein Was shown. Therefore, this No further immunizations were performed by the procedure. B.Hamster spleen injection One Armenian hamster (Cytogen Research and Development, West R oxbury, MA), and on day 0, 5 μg of ICAM-6 / IgG1 Immunization was performed by intrasplenic injection of PBS containing laprotein. Day 11 Test bleeds were assayed by ELISA as described above. However, the immobilized I CAM-3 / IgG1 was used as a negative control, and goat anti-Armenian hams Serum reactivity was detected using a tar IgG HRP conjugated antibody (Jackson). The results showed a weaker reactivity of serum with immobilized ICAM-6 compared to ICAM-3. On day 14, the hamsters were injected again with the same antigens in the spleen. Hamster Because he died during anesthesia, the spleen was removed immediately and a previously reported technique [Bo ss, Meth. Enzymol. 121: 27-33 (1986)], as described in ICAM-6 / IgG1 antigen. As a single cell suspension in the presence of Four days later, spleen cells were collected and standard Was fused with NS-1 cells using the following procedure. After 11 days, the culture supernatant of the hybridoma was As described above, the immobilized ICAM-6 / IgG1 or ICAM-3 / IgG1 And screened. The results showed no specific reactivity with ICAM-6. C.ICAM-6 D1-5 / IgG1 Of hamsters with Freund's adjuvant containing hamster Conversion Two Armenian hamsters (Cytogen Research and Development, West R oxbury, MA) on day 0, pre-bleed and 50 μg Complete Freund's adjuvant containing ICAM-6 / IgG1 fusion protein (200 μl total volume) Volume). On day 15, the hamsters are inoculated with incomplete filters containing 50 μg of the same antigen. Booster immunization was carried out with Reunion adjuvant (IFA). On day 25, blood was collected from the animals, Antibody titers were measured by ELISA. Immulon 4 plates (Dynatech, Cambridge, MA) were used for bovine and mouse serum Goat anti-pre-adsorbed to proteins (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) Coated with human antibodies. Transfer of ICAM-6 / IgG1 fusion protein to COS transfer The cells were harvested from the supernatant of the lysed cells (described in Example 2). ICAM-1 / IgG1 fusion tamper Dilute the protein to 2 μg / ml with RPMI containing 10% FBS. Captured in the wells. Dilute pre-immune serum and immune serum from hamsters And added to individual wells after ICAM-6 / IgG1 capture. Goat anti-hamster western horse Viperoxidase (HRP) conjugated antibody used to detect hamster antibodies did. Immune sera obtained from two hamsters contained ICAM-6 / IgG1 and ICAM-1 / IgG1 In both cases, the highest dilution tested (1: 1,600) exceeded the pre-immune serum Showed high reactivity. Perform another ELISA to characterize the antibody binding of the serum Was. In this case, ICAM-1 / IgG1 was added to the diluted hamster antibody, thereby The reactivity of both fusion proteins to the IgG1 moiety was absorbed. Capture ICAM-6 / IgG1 No specific reactivity to was detected. To improve antigen responsiveness in hamsters, boosters were given for 4 weeks. Administration was performed regularly using IFA containing ICAM-6 / IgG1. Specific reactivity detected Hamsters, receive phosphate-buffered saline (PBS) containing ICAM-6 / IgG1 A final boost was given by intraperitoneal injection and 4 days later the spleen was sterile Was taken out. The spleen cells were transferred to NS-1 melanoma cells (A. T.C.C., Rockville, MD) at a ratio of 2: 1. The culture supernatant was collected using ICAM- Screening by ELISA using 6 / IgG1 and ICAM-1 / IgG1 as above I do. D.Immunization of rabbits to produce polyclonal antisera Using soluble ICAM-6 expressed as protein as an immunogen for immunohistological staining To produce a useful polyclonal antiserum, that of New Zealand white rabbits Each, 50-150 mg of ICAM- Injection subcutaneously. Subsequent injections with similar amounts of immunogen but incomplete Performed at intervals of 3-4 weeks with Reint adjuvant. The third blood sampling of rabbits Serum was performed by ELISA 7-14 days after injection and at each subsequent injection. Assay for specific reactivity to ICAM-6 / IgG1 fusion protein . If specific reactivity is detected, Western analysis and And perform immunocytochemistry. Example 9 Functional analysis of mouse ICAM-6 To determine the biological relevance of ICAM-6, adhesion assays were performed on immobilized mice. ICAM-6 / IgG1 fusion protein (Example 5) This was performed using cells expressing phosphorus. A.ICAM-6 / LPA-1 Analysis of (CD11a / CD18) binding Initial adhesion assays were performed using immobilized ICAM-6 / IgG1 and CD11a / CD18 integrin. Mouse T which expresses but does not express other CD18 integrins This was performed using the cell line PLP. Two other cell lines, human B-limba blast-like The cell line JY8 and the human promyelocytic monocyte HL-60 were also used in this assay. Used. As a negative control, pre-expression of mice that do not express CD18 integrin The B-myeloma cell line NS-1 was also assayed. Adhesion assays were previously reported in 96-well Easy Wash plates (Corning). Using a modification of the procedure described in [Morla et al., Nature 367: 193-196 (1994)]. went. Each well was filled with 50 μl of 5 μg / ml mouse ICAM-6 / Ig fusion protein or 5 μg / ml. μg / ml human ICAM-1 / Ig protein (both in 50 mM bicarbonate buffer, pH 9.6) (Obtained from stock solution). Quantify 100% binding of inserted cells Control wells with anti-CD18 monoclonal antibody. For human cells, use anti-CD18 antibody M17 or 22F12C and Then, the anti-CD11a antibody M17 or the anti-CD3 antibody 145-2C11 was used. Background Control wells for measuring und binding were used for bovine serum albumin (BSA). ). Mouse ICAM-6 fusion protein or mouse ICAM-1 fusion protein After adding any of the proteins, the wells were incubated with PBS containing 1% BSA for 1 hour at room temperature. Blocking. Wash wells, 5 mM KCl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl_Two, 1 mM CaCl_Two200 μl containing 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose and 5% FBS The loading buffer must be in the presence of phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (20 ng / ml). Added either in the presence or absence. CD18 to determine binding specificity A monoclonal antibody capable of immunoreacting with antibody 2E6, or Adhesion and relaxation of monoclonal antibody TS1 / 22 (ATCC) that can immunoreact with human CD11a It was added to the buffer. Then, cells (5 × 10⁶100 μl of cells / ml) to each well Plate at 37 ° C with 5% CO_TwoFor 30 minutes. Adhesive thin The cells are fixed by adding 50 μl of glutaraldehyde solution, washed, and Stained with Listal Villette (Sigma) solution. Wash and add 70% ethanol After that, the adherent cells were measured for absorbance at 570 nm by SPECTRAmax.^TM250 microplate Determined by measuring using a spectrophotometer system (Molecular Devices) Weighed. The percentage of adherent cells was determined using the following formula: The results showed that PLP cells were compared to the negative control NS-1 cell line, 6 / IgG1. PLP binding was determined by the concentration of immobilized ICAM-6 / IgG1. Dependent on degree, blocked in the presence of anti-CD18 antibody. Furthermore, the binding of PLP is CD11a / C Increased in the presence of PMA, which is known to activate D18 integrins. PLP Cell binding was not detected in wells coated with human ICAM-1 / IgG1. Was. JY-8 cells and HL-60 cells also bind to immobilized ICAM-6 / IgG1 and the binding is Blocked in the presence of the human CD11a antibody. These results indicate that mouse ICAM-6 is It has been shown that it can bind to both mouse and human CD11a / CD18. B.ICAM-6 / Mac-1 Analysis of (CD11b / CD18) and ICAM-6 / p150 / 95 (CD11c / CD18) binding To assess mouse ICAM-6 binding to CD11b / CD18 and CD11c / CD18, both Integrin expressing mouse monocyte cell line RAW 264.7 and CD11b / CD18 The human HL-60 cell line was used in the adhesion assay described above. Specificity of binding Anti-CD11b antibody (M1 / 70), anti-mouse CD11c antibody (N418), anti-mouse CD18 antibody (2E6) Using anti-human CD11b antibody (44AACB) or anti-human CD18 antibody (22F12C) Specified. In addition, the specificity of antibody blocking was determined using the non-blocking mouse CD18 antibody (M18). Was determined. The results show that RAW 264.7 cells bound to immobilized ICAM-6 and that binding was to anti-mouse CD11b. Monoclonal antibodies, anti-mouse CD11c monoclonal antibodies, and anti-mouse CD18 It was shown to be blocked in the presence of both noclonal antibodies. But the join is Not affected by unbound anti-CD18 antibody. HL-60 also has ICAM-6 / IgG1 Binds to the coated wells and the binding is blocked by anti-human CD11b antibody. I was stopped. These results indicate that mouse ICAM-6 is compatible with mouse and human CD11b / CD18. And both are shown to bind to mouse CD11c / CD18. C.ICAM-6 / Analysis of α-d bond α_dAdhesion of ICAM-6 to rat α_dAnd transcoding with cDNA encoding human CD18. Tested with transfected Chinese hamster ovary (CHO) cells . α_d/ huCD18 CHO cells were transferred to the immobilized mouse ICAM-6 / IgG1, To either ICAM-1 / IgG1 or human VCAM-1 / 1gG1 fusion protein It was tested for wearing. α_dBinding specificity for anti-rat α_dmonoclonal Antibody (205C) and anti-human CD18 monoclonal Was determined using an antibody (22F12C). Non-binding antibody was converted to human VCAM-1 / IgG1 α_d Used as a negative control for binding to Preliminary results indicate that mouse ICAM-6 is α_d/ CD18 binds to integrin Was. Example 10 In situ hybridization of mouse ICAM-6 transcription To identify in which cells ICAM-6 is expressed, in situ hybridization was performed. Immobilization was performed on mouse testis tissue sections using the mouse ICAM-6 riboprobe. I went. ICAM-6 antisense riboprobes for domains 1 and 2 were It was used to detect ICAM-6 mRNA in testis tissue sections. ICAM-6 mRNA Non-hybridized ICAM-6 sense probe was used as a negative control . The above probe was converted to α according to the manufacturer's protocol (Stratagene).^-35S UT Labeled by RNA transcription using P. Frozen tissue sections on coated slides Place on glass (Superfrost Plus VWR, Seattle, WA) and use paraformaldehyde Fixed, denatured, dehydrated and dried with a series of ethanol washes. C in tissue section The hybridization was carried out overnight at 50 ° C., 50% formamide, 0.3 M NaCl, 20 mM Tris pH7.5, 5 mM EDTA) 1 × Denhardt solution, 10% dextran sulfate, 0.5 mg / ml Yeast RNA, 100 mM dithiothreitol (DTT), and 5 × 10 5 per tissue section^Fivecpm Performed in the presence of the probe. Slide glass with 4 × SSC containing 10 mM DTT Wash for 1 hour at room temperature, then 60% with 50% formamide 1 × SSC containing 10 mM DTT Washed at 40 ° C. for 40 minutes and washed once with 2 × SSC and once with 0.1 × SSC. Most The latter two washes Performed for 30 minutes at room temperature with gentle stirring. Dehydrate tissue sections, air dry, and photographic milk (Kodak NTB2 Nuclear Emulsion, International Biotechnologies, Hartford , CT) and exposed. After development, the tissue sections were hematoxylin- Silver particles were visualized by dark field microscopy with counterstaining with osin. Strong hybridization signal from mouse ICAM-6 antisense probe Was detected in the first spermatocytes in the tubules of the mouse testis after 4 days of exposure. So In marked contrast, the control ICAM-6 sense riboprobe and the hybrid The testis tissue was not hybridized at all. Example 11 Identification of partially human genomic ICAM-6 DNA Make sure that the mouse AA065987 sequence does not match any of the Genbank sequences. Was used as the presentation sequence in the second BLASTN search. . From the Genbank database, a human genome sequence of about 66.5 kb called J03071 was Has about 70% nucleotide homology to the corresponding sequence in AA065987, It was identified as containing a region with about 61% homology at the acid level. AA0659 In addition to the sequences homologous to 87, J03071 is a human growth hormone (GH1 and GH2) and Complete protein coding for hairy somatotropin polypeptide hormones 1, 2 and 5 Includes the storage area. The chromosomal location of J03071 (17q22-24) was PECAM (17q23) and ICAM-2. It was determined to be near the gene encoding (17q23-17q25). Within the genomic DNA sequence of J03071, proteins with homology to known ICAMs Five regions encoding the protein sequence were identified. These five regions of DNA One partial exon and four Seemed to represent a complete exon. Coded by these five regions By examining the protein sequence and the introns / exons of ICAM-1 By analogy to the splicing pattern of The regions were called exons 2-6. The first region, exon 2 (nucleotide 66,422-66,495) have homology to part of domain 1 in ICAM. The sequence extends to the end of the DNA of J03071, thus excluding only part of exon 2. It was thought enough to represent. (Coded by exon 3, nucleo Called domain 2 (from 64,225 or 66,226 to nucleotide 64,544) If the region is translated, the frame shift is determined by the open reading frame and Required to maintain homology with other ICAMs. Code domain 3 Exo from nucleotide 63,697 to any of nucleotides 63,975 or 63,976 4 encodes a complete open reading frame with homology to known ICAMs showed that. Two stop codons at exon 5 (nucleotides 62,895-63,163) Thus found in encoded domain 4. One stop codon is exo Found in domain 5 encoded by nucleotide 6 (nucleotides 61,329-61,569). Was issued. However, the conserved amino acid sequence in all domains Of the cysteine residue, along with the amino acid sequence before and after the cysteine characteristic of ICAM. Was included. Amino acid sequences of various domains encoded by J03071 When compared to known ICAMs, the calculated percent identity is the difference between any two specific ICAMs. The comparison of the sequences was characteristic. Table 3 shows the results of the comparative analysis. "Typical Encoded by J03071 for amino acid identity and protein structure This polypeptide was called ICAM-6. Frame in domain 3 Time shift and stop codons in domains 4 and 5 reverse errors in sequencing. It is thought that the putative ICAM-6 coding region of J03071 is a pseudogene It is also possible to consider that they do not encode a functional polypeptide. You. A portion of J03071 containing five regions homologous to known ICAMs was extracted from the EST database. Used in a BLASTN search for source. Two ESTs (H79158 and H54052) were identified Was. The two ESTs were isolated from fetal liver and spleen libraries and Exons and neighbors indicating that they are unspliced cDNAs Identified as containing intronic nucleotides. Using the mouse ICAM-6 sequence, a homologous region was further added to the genomic sequence of J03071. It was recognized in. This region is the transmembrane region of mouse ICAM-6 and the cytoplasmic tail. Encodes an amino acid sequence having 48% homology to the It was thought to represent a column. Those encoding this putative transmembrane / cytoplasmic tail Are contiguous and if such sequences are found in the same exon, Putative transmembrane / cytoplasmic tails of the sequence are identical to those found for other ICAM genes. Match. The transmembrane / cytoplasmic region of J03071 corresponds to nucleotides 60,912-61,135. You. Example 12 Expression of human ICAM-6 in tissues and cells Supplied to try to isolate a full-length human ICAM-6 clone using two methods Appropriate cells or tissues were identified as sources. In the first analysis, some details CDNA samples obtained from cell lines and several cDNA libraries were prepared using human ICAM-6. By PCR using primers corresponding to domains 1 to 3 did. In the second method, domain 3 of ICAM-6 was cloned by PCR. And used as a probe for Northern blot analysis of human RNA samples. A.ICAM-6 Test PCR analysis and cloning of domain 3 To enable the implementation of the above two methods, the presence of ICAM-6 cDNA was detected, The ICAM-6 domain used as a Northern blot analysis probe was cloned. As a means of performing PCR, determine the PCR conditions under which domain 3 obtained from ICAM-6 is amplified. It was necessary to determine. Primer I601, I602, I603 and I606, J030 Designed based on sequences located within domain 3 determined from 71 sequences. Plastic Imers I603 and I606, respectively, also facilitate subsequent cloning procedures In order to create the restriction sites for EcoRI and XhoI (underlined in the sequence below) Designed to. I601 CTTTTGGAGGCTGGGATG SEQ ID NO: 38 I602 CATTGCACCCAGAGATGC SEQ ID NO: 20 I603 ATAGAATTCCTTTTGGAGGCTGGGATG SEQ ID NO: 21 I606 TAACTCGAGCATTGCACCCAGAGATGC SEQ ID NO: 22 First, PCR amplification was performed by templated genomic DNA purified from peripheral blood lymphocytes. And used. The PCR reaction was performed using the same buffer as described in Example 2. went. To optimize amplification product production, the reaction conditions were adjusted to MgCl_TwoConcentration (1.5 mM, 2 mM) and annealing temperatures (50 ° C., 55 ° C., 60 ° C.). Various anti At the same time, three DNA thermal cyclers 480 (Perkin Elmer, Foster City , CA). The thermal conditions for all reactions were initially a denaturation step at 94 ° C for 4 minutes. Followed by denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 50 ° C, 55 ° C or 60 ° C for 30 seconds , And 72 cycles of 1 minute extension at 72 ° C. The resulting amplification product is Analyzed using gel gel electrophoresis. Under all PCR conditions tested, 210 bp fragment using primer pair I603 / I606 as a fragment that migrates in size And smaller fragments using primer pair I601 / I602 were detected. Combine the products from all reactions and use 30 μg of carrier yeast RNA. And precipitated with 0.3 M sodium acetate and 2 volumes of ethanol. Amplification product and B SII SK + vector (Stratage ne) is digested with EcoRI and XhoI, and both the fragment and the linearized vector are gel purified. (QIAGEN kit), the two DNAs are ligated together, and the resulting plasmid is Following the manufacturer's instructions protocol, XL1 Blue Ultracompetent cells (Stratagene, L a Jolla, CA). Two lines of PCR using single colony selection and bacterial DNA as template Screened by PCR for presence of domain 3 of ICAM-6 by amplification did. In one PCR, the presence of the correct 330 bp insert was determined by primers T3.1 and T7. Investigated using .1. In a second PCR reaction, the ICAM-6 domain in the same bacteria The presence of the protein 3 was examined by combining ICAM-6 with the following vector primers. T3 Using .1 and primer I608, a 259 bp PCR product was expected. Primer Using T7.1 and I607, a 215 bp amplification product was expected. I607 GCGAGGTGGCTAGGGTGTTTCCAGC SEQ ID NO: 23 I608 CCTGATCACCAGCCTCCATGGTCCG SEQ ID NO: 24 All PCR reactions were performed as described above with 1.5 mM MgCl_TwoAnnealing at 50 ° C using Performed at temperature. Select one colony with the correct insert as determined by PCR I chose. Plasmid DNA from this clone is purified using the Wizard Miniprep Purification Kit (Promega) and the sequence of domain 3 was confirmed. The result shows that the sequence encodes a complete open reading frame and J030 It was shown to be identical to the genomic sequence of domain 3 of human ICAM-6 in 71. B.PCR analysis Using PCR to determine which contains the human ICAM-6 cDNA, Several cDNA libraries were screened. Mainly for screening And concentrated on hematopoietic cells and endothelial cells. Because ICAM Is characteristically expressed in these cell types. Further screening Samples contained human umbilical cord vascular endothelial cells stimulated with IL-1 and / or IL-4. In addition to the obtained cDNA, unstimulated human umbilical cord vascular endothelial cells (HUVEC) Prepared cDNA, cDNA obtained from promyelocytic cell line HL-60, and lung, appendix (a ppendix) and cDNA from the colon were included. PCR also includes HUVEC, Jurkat fine Vesicles (human T cell line), peripheral blood mononuclear cells (PBMC), synovium, and HeLa cells (epithelial cervix) Several human cDNA libraries, including cDNA libraries prepared from tumor cell lines) I went to the rally. PCR reactions were performed as described above with 2 mM MgCl_TwoAt 60 ° C At an annealing temperature of Primers I601 (SEQ ID NO: 38) and I602 (sequence No. 20) was used in the PCR. On agarose gel electrophoresis, a 210 bp DNA band of ICAM-6 domain 3 was detected by HUVEC. Detected from cDNA, HUVEC libraries, and also from PBMC libraries . The PCR reaction was further performed using these combinations of ICAM-6 derived primers to Performed using DNA sample, library encodes ICAM-6 domain 1 And that the clone was correctly spliced. Primer I6011 (SEQ ID NO: 25) specific for domain 1 and domain 3 I602 (SEQ ID NO: 20) or I608 (SEQ ID NO: 24) specific to the DNA to be loaded Some were used in PCR. I6011 GCAGTGCTTCTTCTCTTGTGCAGGG SEQ ID NO: 25 No amplification product of the expected size was found in the PCR reaction. This is because Indicates one of the following. (i) DNA encoding ICAM-6 domain 1 is included in the library Was not present, or (ii) the clone was not spliced Or (iii) the cDNA sample contains the domain 3 signal detected in the first reaction. Genomic DNA, which generates the DNA. B.Northern analysis Northern analysis was performed on cells containing HUVEC; A549, HeLa, HL60, Jurkat, Ramos and U937. Strain; group containing spleen, thymus, peripheral blood leukocytes, testis, prostate, ovary, colon, and small intestine Performed on RNA isolated from woven type. Hybridization probe Contains the sequence corresponding to ICAM-6 domain 3 cloned as described above. Was. The human ICAM-6 domain 3 plasmid was linearized with EcoRI and used with the Qiagen kit. And gel purified. Anti-antisense ICAM-3 RNA probe was purchased from the manufacturer's protocol ( RNA transcription kit, Stratagene)³²For in vitro transcription using P-labelled UTP Therefore, it was labeled. The membrane was washed overnight at 65 ° C. with 50% formamide, 5 × SSC, 5 × 0 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.1% sodium pyrophosphate, 0.2% polyvinylpyrroli Don, 0.2% Ficoll, 5 mM EDTA, 2% SDS, and 150 mg / ml denatured salmon sperm Hybridized in the middle. Wash the membrane at 65 ° C, containing 0.1% SDS Twice with 2 × SSC and twice with 0.1 × SSC containing 0.1% SDS for 15 minutes each . The results showed high level expression of 3 kb RNA in testis and prostate. In PBL Thus, a 1 kb fragment was identified. In the colon and small intestine In this case, transcription of 7.5 kb was observed. High levels in HUVEC and various cell lines Hybridization is 4.4 kb, which is consistent with 28S ribosomal RNA in size. Detected with RNA. Whether the probe cross-reacts with the rRNA, or It is unknown whether there is a 4.4 kb transcript specific for these cell types. Example 13 Isolation of human ICAM-6 cDNA HUVEC and PBMC cDNA libraries contain DNA corresponding to ICAM-6 domain 3 Therefore, using the ICAM-6 domain 3 PCR probe, CDNA libraries obtained from two cell types for the purpose of isolating ICAM-6 cDNA Lee was screened. In addition, Northern blot analysis was performed to testis. Human testis library (Stratagene) Screened. Screening of these libraries is described in Example 2. Performed using the human ICAM-6 domain 3 probe labeled by PCR . An unlabeled template was prepared by using the ICAM-6 domain 3 plasmid PCR using primers I601 (SEQ ID NO: 38) and I602 (SEQ ID NO: 20) Therefore, it was produced. Gel purify PCR products, dilute and use as template A 210pb ICAM-6 domain 3 probe was prepared. Hybridization conditions Was as described in Example 2. According to the results obtained from the testis library, 13 positive clones were obtained. Eight of them were sequenced and four spliced ICAM-6 clones (clone). Loans 13A, 20C, 5A and 13B), four of which are unspliced ICAM-6 On a loan Revealed that. Among the four spliced clones, 20C and 1 Two of 3A were found to contain a leader sequence and a domain 1 sequence. PBMC Rye In the library, only one unspliced clone was identified. It was. No clones were identified in the HUVEC library. To determine the more complete sequence of the human ICAM-6 sequence, the leader and domain 1 The coding region of human ICAM-6 encoding a part of Used. This search yields three human ICAM-6 clones. Four EST sequences were revealed. Two EST sequences AA421394 (SEQ ID NO: 49) and AA421290 (SEQ ID NO: 50) corresponds to the 5 'and 3' ends of another clone 731071. This clone 731071 was isolated from a human testis library and And domains 1-3. Human fetus previously referenced in Example 11 Two ESTs, H79158 (SEQ ID NO: 47) and H, obtained from the liver-spleen library 54052 (SEQ ID NO: 48) has also been identified and is an unspliced domain It seemed to code 4. Eight clones from the testis library were sequenced. Those knots The database sequence of EST J03071 was corrected by combining the results. Corrected array Is the leader and domains 1, 2 and 3 are complete open reading Indicated to code the frame. However, the sequence of domain 4 is still It contained a stop codon. Using the more complete polynucleotide sequence of ICAM-6, A second comparison against other known ICAM sequences was performed with the presence of a stop codon in domain 4. Nevertheless, a comparison of domains 4 and 5 of ICAM-6 was performed. The results below Is shown in Table 4. To further analyze ICAM-6 DNA encoding the leader and domains 1-3 The sequence of clone 731071 obtained from the EST database was 13A and 20C sequences. These three clones are the same Leader and two domains encoded by open reading frame And the same amino acid sequences of domain 2 and domain 3 Was issued. Therefore, in domain 2 of clone J03071 obtained from Genbank Identified flames Was concluded to have resulted from a sequencing error. However, 13A, 20C and 73101 In all three clones, domain 1 was incomplete. Clone 20 Encodes only the 5 'portion of domain 1, while clones 13A and 73101 encode only the 3' portion. Had code. In all three of these clones, the domain 1 sequence Splicing depends on the presence of partial domains and frameshifting or splicing. Abnormal as indicated by the presence of any of the stop codons at the single junction. Was. Therefore, none of these three clones were completely processed, It did not encode transmembrane or cytoplasmic amino acid sequences. Each clone Wherein the sequence encoding domain 3 is followed by its corresponding intron Followed. Of the four spliced human testis clones, 13A, 5A and 13B Encoded for the main 4 amino acids. Each of the clones has the genome of J03071 It contained the first of the two stop codons previously identified in the sequence. These three None of the clones contained the second stop codon found in J03071 Therefore, it was concluded that the second stop codon resulted from a sequencing error. Corrected human ICAM-6 but still has a stop code within the coding region of domain 4. The leader and domains 1, 2 and 3 are completely open It was shown to encode a reading frame. These observations suggest that humans We concluded that testicular splicing of ICAM-6 was abnormal: Has been previously reported on other genes expressed in testis [Sorrentino, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2191-2195 (1988)]. This conclusion is Correctly spliced, functional human ICAM-6 is expressed in other human tissues Do not rule out possibilities. Identification of the stop codon encoded by DNA for domain 4 Otherwise, it can be explained in the following points. (i) Alternative Bus splicing is likely to occur, in this case encoding domain 4 Sequence is thereby removed, resulting in less extracellular dosing than the mouse ICAM-6 protein. Allows expression of a functional polypeptide having a domain; (ii) an identified human The ICAM-6 gene is considered to be polymorphic within the population, and therefore is altered in certain individuals. Different and not otherwise mutated; or (iii) clone J03071 It is considered to represent a pseudogene that does not express a functional ICAM-6 polypeptide. If J03071 is a pseudogene, the functional ICAM-6 (or other unique ICAM) is the same It is conceivable that it is located at the chromosomal location (Example 11). Example 14 RACE RCR identifies spliced 5 'human ICAM-6 cDNA To isolate the 5 'end of human ICAM-6 cDNA, RACE PCR was performed using human testis Maratho. n-ready^TMThis was performed using cDNA (Clontech). cDNA can be used in the age range of 22-31 Prepared from testes collected from four white men in the perimeter. Sources gathered previously described Testis used to prepare the isolated testis cDNA library (Stratagene) became. The human testis cDNA was ligated to the AP-1 and AP-2 primers described in Example 4 (SEQ ID NO: No .: 13 and 14). PCR, AP-1 And 1608 (SEQ ID NO: 24) using primer pair I608. Is specific for the DNA encoding domain 3. Two PCRs are described in Example 4. Went to be. In both PCRs, denature the reaction mixture for 1 minute, then Denaturation at 94 ° C for 5 seconds and 72 ° C for 2 minutes 5 cycles of annealing / mediation between, and denaturation at 94 ° C for 5 seconds and 2 cycles at 70 ° C. 5 minute annealing / extension cycle, finally denaturation at 94 ° C for 5 seconds and 68 ° C Twenty-five cycles of annealing / extension for 2 minutes were performed. Domestic from ICAM-6 leader The expected size of a correctly spliced fragment encoding up to in 3 is It was about 0.8-1 kb. Agarose gel electrophoresis was performed with bands moving about 0.7-0.8 kb in length. The DNA in the form of a mear was shown. In consideration of this result, the three steps were changed to the expected size. In order to obtain an amplification product of First, the PCR product was digested with SacI and NotI. This procedure is for ICAM-6 domain 3 The presence of a SacI site and a NotI site in the 5 'untranslated region and in the cDNA adapter Based on what was known. The expected size of the SacI / NotI fragment is approximately 0.8 kb. Was. Second, the PCR products were subjected to size selection in the range of 0.8-1 kb using gel electrophoresis. Made a choice. This range of fragments was purified from the gel and previously digested with NotI and SacI. In the vector BSII SK + (Stratagene). The resulting plasmid is produced Transform Ultracompetent XL-blue MRF 'cells according to the manufacturer's protocol. Was. Third, hybridization was performed on ICAM-6 containing all of domain 1. To identify the cDNA,³²Performed using P-labeled oligonucleotides. Oligo Nucleotides I6047 (SEQ ID NO: 26) and 16048 (SEQ ID NO: 27) Was designed to be complementary to both ends of the DNA encoding I6047 GTCCCGGAACAGTCGTTTGAGGTTT- CTATTTGGCCAAGTC SEQ ID NO: 26 I6048 GATCACTTGCTCTGGTGGCTGATAC- ACAGTGACGCCAAGG SEQ ID NO: 27 Primer I6047 corresponded to the 5 'end of domain 1, while I6048 Corresponding to the joint between Oligonucleotide³²T-polynus using P-γATP End-labeling using nucleotide kinase (New Englang Biolabs, Beverly, MA) Using a Centrispin 10 column (Princeton Separation, Adelphia, NJ) Purified. Bacteria transformed with the size-selected PCR product are purified using carbenicillin agarose. Seed on filter on plate and incubated overnight at 37 ° C . Colonies were transferred to two additional filters. One replica I6047 Pro And the other was hybridized with an I6048 probe. Both One of the filters was filled with 5 × SSC, 50 mM sodium phosphate, 5 × Denhardt solution, and Hybridize at 65 ° C. in 0.1% SDS in 0.1% SDS for 15 minutes at room temperature. Washed with XSSC and then with the same solution at 65 ° C for 5 minutes. Twenty colonies hybridized to both probes were picked. By sequence analysis These 20 colonies were shown to contain the human ICAM-6 insert. This Some clones contain a SacI site and are internal to domain 2 or domain 1. Was extended to. Five clones contain the SacI site of domain 3 and are 5 'untranslated It extended to the NotI site within the region. Therefore, the five clones were ICAM-6 Allowed the determination of the splicing junction between the leader and domain 1. Combine full-length human ICAM-6 sequence with sequence information obtained from the following clones (Coding domain 3 from the leader sequence) B1b of the human RACE clone, human testis (encoding domains 2-4) Clone found in the library and geno (encoding domain 5) Muclones. Human ICAM-6 sequence including the region coding for the stop codon in domain 4 Is shown in SEQ ID NO: 40. Putative amino acids up to the stop codon for polynucleotides The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 41. Amino acid sequence of extracellular domain of human ICAM-6 Table 5 shows a comparison with the corresponding regions of other mouse and human ICAMs. Example 15 Cloning of ICAM-6 domains 4 and 5 from infertile patients Considering that ICAM-6 mRNA expression is observed in testis, And examined the possible relationship. Stop codon for ICAM-6 gene in domains 4 and 5 One hypothesis to explain why includes one or two copies of a functional IC The fact that AM-6 is present on human chromosomes can render male carriers infertile. And ICAM-6 expression is abnormal in spermatogenesis and / or sperm function Or sperm or spermatocyte destruction. this Patients who selected domain 4 and domain 5 of ICAM-6 to test their hypothesis It was cloned from the genomic DNA obtained. Examine the polynucleotide structure These domains have a stop codon or a complete open reading frame. Whether or not it contains DNA was obtained from blood samples obtained from 20 male patients with primary testicular failure and 5 DANzolRBD reagent (Molecular Research Center) , Inc, Cincinnati, OH) according to the manufacturer's instructions protocol. PCR And using two pairs of primers designed based on the human ICAM-6 sequence, Amplify genomic fragments that extend to either domain 4 or domain 5 of ICAM-6 Was. The first primer pair 16070 (SEQ ID NO: 51) and I6073 (SEQ ID NO: 52), And the second primer pair, I6075 (SEQ ID NO: 53) and I6077 (SEQ ID NO: 54) correspond to the 5 'end and 3' end of domain 4 and domain 5, respectively, of ICAM-6. I responded. I6070 CTTCCCTCCACCAATCCTGGAGC SEQ ID NO: 51 I6073 GGATATGGAGCTGGATCACAGTGG SEQ ID NO: 52 I6075 TGGCTGGAAGGGATGGAACACACG SEQ ID NO: 53 I6077 TGACAGAGCCCAGCTGGTTAGTGG SEQ ID NO: 54 50 μl of PCR reaction was performed with 1 × KlenTaq buffer, 2 mM dNTPs, and domain 4 primer Either pair of I6070 and I6073 or domain 5 primer pair I6075 and I6077 100 μg / ml, 1 μl KlenTaq polymerase solution, and 6-12 ng of genomic DNA Manufactured using the Advantage cDNA PCR kit (Clontech, Pala Alto, CA) Was performed according to the manufacturer's instruction protocol. "Touchdown" PC I went. The reaction was first performed by a denaturation step of 30 seconds, then at 94 ° C. for 5 seconds. Denaturation and 5 cycles of annealing / extension at 72 ° C for 30 seconds, denaturation at 94 ° C for 5 seconds. 5 cycles of annealing and extension at 70 ° C. for 30 seconds and 5 seconds at 94 ° C. 25 cycles of denaturation and annealing / extension at 68 ° C. for 30 seconds. Get PCR products are separated using agarose gel electrophoresis and Detected two bands moving with. Approximately 260 bp band for domain 4 primer Detected from reactions using a pair of I6070 and I6073. Approximately 170 bp band Detection was performed using primer pairs I6075 and I6077. Copy these fragments to your PC Manufacturer's instruction protocol using R Product Purification Kit (Promega, Madison, WI) And sequenced directly using the corresponding primers. Control Contains genomic DNA from gorillas or monkeys (Macaque nemestrina). Included. Either one or two stop codons may be determined by sequence analysis of the ICAM-6 PCR product. For all patient samples and control samples It was shown to be present in domain 4 of the pull. One of the stop codons is It was located at the same nucleotide as in the clone described in Example 13. Second The stop codon, if found, is a fixed position in all samples. Existed. The sequence analysis of ICAM-6 domain 5 was the same as previously observed. Stop codons or ambiguous sequences at the same nucleotide position were revealed. Sequence ambiguity can be an artifact of sequencing or the IC in a particular patient. Two alleles of AM-6 (allele with second stop codon and one without Alleles). Because the ICAM-6 gene is highly conserved among species, macaque and Blood obtained from lira was used as a control. The genomic DNA PCR as described above and under the same conditions as above for human samples Used in By sequence analysis, domains 4 and 5 of ICAM-6 in macaque were Complete open readout with 95% and 97% identity to its human homolog Coding frame. Therefore, domain 4 and ICAM-6, which contains 5 and 5, is considered to be functional in macaques. Gorilla smell Thus, domains 4 and 5 of ICAM-6 have high homology to human molecules. (Domain 4, 91% and domain 5, 94%). Stop codon Detected in gorilla domain 4 as in the case of the human sequence, 5 coded for a complete open reading frame. These results indicate that the presence of a stop codon results in five extracellular immunoglobulins. Suggests that correct expression of domain-containing human ICAM-6 polypeptide is prevented I do. However, such a view is that organisms with less than 5 extracellular domains Biologically active This does not exclude the possibility that alternative forms of sexual ICAM-6 may exist. For example, ICAM-6 is acceptable A stop codon in domain 4 that can exist in soluble form, The 3 'end of the protein lacking the quality tail is shown. Alternatively, domain 4 is spliced 4 domain proteins with stop codon in domain 5 As a surface molecule in patients heterozygous for the genomic DNA of the yeast I can do it. Yet another possibility is that it consists of two domains of ICAM-6 and binds to the membrane As a result, a form including only domains 1 and 2 may exist. Example 16 Expression of soluble human ICAM-6 To investigate the function of human ICAM-6, an expression construct was prepared Bind domains 1 and 2 (D1-D2) to hinge CH2-CH3 domain obtained from IgG4 And expressed as a modified chimeric polypeptide. The construction of the expression plasmid is described below. I went there. The coding region of ICAM-6 from the leader sequence to domain 2 was compared with primer pair I607. Amplified by PCR using 8 (SEQ ID NO: 55) and I6079 (SEQ ID NO: 56) . I6078 CCCAAGCTTACCGCCACCATGAAAACGCTTCTGTTT SEQ ID NO: 55 I6079 CCGCTCGAGAAAGATCCGGACTATTCTGATGGG SEQ ID NO: 56 To facilitate cloning of the amplification product, a HindIII site was added to the I6078 primer. The 5 'end was included and an XhoI site was included 3' of the I6079 primer (underlined, See above). In addition, a consensus sequence for translation initiation (italics, see above) The primer Made in -I6078 to ensure high levels of soluble molecule expression In preparing the template for the PCR reaction, the human RACE protein described in Example 14 was used. The lawn B1b plasmid was digested with NotI and SacI, and the DNA fragments encoding up to 3 were purified using QIAquick (Gel Extraction Kit (QIAGEN, V alencia, CA)). PCR, template for purified NotI / SacI fragment As primers, primers I6078 and I6079, "high fidelity" Pfu DNA polymerase (Strat agene, La Jolla, CA) and manufacturers using deoxynucleotides and buffers According to the instruction protocol mer), first denaturation at 94 ° C for 5 minutes, then denaturation at 94 ° C for 30 seconds, 50% Treated by annealing at 30 ° C. for 30 seconds and 30 cycles at 72 ° C. for 30 seconds. about 670 bp PCR product, QIAquick^TMGel purification using Gel Extraction Kit (QIAGEN) Digested with HindIII and XhoI,^TMUse the Gel Extraction Kit to Purified. Two HindIII / XhoI fragments encoding domains 1 and 2 of ICAM-6 In the pDEF2S / IgG4 vector that had been previously digested with the same enzymes. pDEF2S / IgG4 Rasmid was constructed as follows. An approximately 1 kb XhoI / XbaI IgG4 fragment fused to the ICAM-6 sequence is a human γ4 heavy chain hinge. Di CH2 and CH3 regions are 3 'flanking regions obtained from a genomic clone of the human γ4 gene Contains the cDNA sequence encoded with 328 bp. C encoding this heavy chain sequence DNA was obtained from a commercially available spleen cDNA library and a known human γ4 sequence [Ellison et al. ., DNA 1:11 (1981)]. Was. Similarly, a genomic sequence containing the 3 'flanking region may be converted to a commercially available genomic library. Et al., Human γ4 probe And using the same cloning technique. The fusion of the cDNA sequence to the adjacent region Use PCR with appropriate primers introducing compatible restriction sites, then Restriction digestion and ligation by procedures well known and routinely performed in the art By doing that. The resulting plasmid ICAM-6 (D1-D2) / Ig / pDEF2S was converted to XL2 BLu e Competent Cell (Stratagene, La Jolla, CA) Using primers I6078 (SEQ ID NO: 55) and I6079 (SEQ ID NO: 56) Was screened by Sequence positive clones detected by PCR Confirmed by Protein expression was transfected with ICAM-6 (D1-D2) / Ig / pDEP2S. DG44 CHO cells. DG44 CHO cells use dihydrofolate reductase (DHFR) Is lacking, and hypokinsantin and thymidine are added to the culture medium to proliferate. Request. Since the marker DHFR gene is present in the vector pDEF2S, ICAM-6 (D DG44 CHO cells transfected with 1-D2) / Ig / pDEF2S Multiply. Cells are transferred by electroporation as described below. Action. About 2 × 10⁷Cells were added to 800 μl of HBS buffer (20 mM HEPES-NaOH (pH 7.0), 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na_TwoHPO_Four50 μg ICAM suspended in 6 mM dextrose) -6 (D1-D2) / Ig / pDEF2S. Electroporation using BioRad GenePuls The measurement was carried out using a er electroporator with a capacity of 960 μF and a voltage of 290 V. D After lectroporation, the cells were allowed to regenerate for 10 minutes at room temperature, and 10% FBS, 1 mM MEM Sodium pyruvate, 100u / ml penicillin, 100μg / ml streptomycin , 2 mM L-glutamine, 0.1 mM hypoxanthine sodium, and 1.6 mM thymidine The plate was washed with 10 ml of the contained medium (HT + DMEM / F12). Centrifuge cells Collected and resuspended in medium, two 10 cm plates containing HT + DMEM / F12 Seeded. Two days after electroporation, transfected cells Transfer to selective medium (DMEM / F12 without hypoxanthine or thymidine) About 12 days after transfection, surviving colonies were collected and summarized. Cells assembled Were stored in liquid nitrogen and the other half were cultured for protein purification. For protein purification, ICAM-6 (D1-D2) / Ig protein was purified from CHO supernatant Collected using a p Protein A column (BioProcessing LTD). Column First, at least 100 ml of a buffer (pH 8.6) containing 1 M glycine + 0.15 M NaCl, Equilibration was performed using the BioRad Econo System. Flow the supernatant onto the column at a rate of 1 ml / min. The column was washed with at least 100 ml of the above buffer. 100 mM protein It was collected directly into neutralized 1M Tris (pH 9.0) using citric acid (pH 3.0). Elute 10,000 MW cut-off SakeSkin dialysis tubing (Pirce, Rockford) , IL) in calcium- and magnesium-free phosphate-buffered saline Permeate with water (CMF-PBS) for at least 24 hours with 3 changes of buffer used. Was analyzed. The dialyzed protein is centrifuged through a Centriprep-30 centrifugal filter (Amicon, B everly, MA). The protein concentration was determined using the BCA Protein Assay (P ierce). Contains 2μg of purified protein for protein purity The SDS-PAGE gel was evaluated by Coomassie staining. All ICAM-6 (D1-D2) / Ig preparations are 50-90% pure and contain no obvious contaminants. And had only bovine Ig. Functional purification of human ICAM-6 using purified protein And monoclonal antibody production. Example 17 Western analysis Production of mouse ICAM6 polyclonal antibody Soluble mouse consisting of domain 1 to domain 3 and fused to FLAG / HIS tag The ICAM-6 protein was produced as described in Examples 7 and 8 and And used to inject New Zealand white rabbits. In short, two new birds Pre-bleed to obtain pre-immune serum from Zealand white rabbits, then on day 0 Complete Freund's adjuvant containing about 100 μg of ICAM-6 / FLAG-HIS tag protein Injection (CFA) was injected subcutaneously. The animals are then given four more times, 3-4 weeks apart Immunized with incomplete Freund's adjuvant containing the same amount of protein. serum Were used for testicular tissue sections of rodents for specific reactivity by immunocytochemistry (below). At 7-14 days after injection. Polyclonal antibody from serum, protein A The column was purified using well-known procedures routinely practiced in the art. Strong specific ICAM-6 staining was detected in mouse testes after the fourth antigen injection. Immunohistochemistry Normal mouse testes were quickly frozen in liquid nitrogen-cooled Isopentane and Stored at ℃. Sections were taken on Superfrost microslides (Eric Scientific Corp.) oration, West Chester, PA) and stored at -20 ° C. Before use, slide The glass was dried and fixed in cold acetone for 2 minutes. Slide glass for 15 minutes 0.04% H at room temperature_TwoO_TwoAnd 0.1% NaN_ThreeIncubate in TBS containing Removed endogenous peroxidase activity . Slides were incubated at room temperature for 30 minutes at room temperature with 2% bovine serum albumin (BSA) (Sigma, St. . Louis, MO), in TBS containing 30% normal rat serum and 5% normal goat serum. I locked. Replace the endogenous biotin site with the avidin / biotin blocking kit. (Vector laboratories, Burlingame, CA) using manufacturer's instruction protocol The slides were blocked according to the following procedure. Primary antibody against mouse ICAM-6 (diluted to 10 μg / ml) and / or control Antibody was added to each tissue section and left at room temperature for 1 hour. Remove unbound antibody from slide glass The washes were removed by washing three times with TBS, each wash for 5 minutes. Biotinylated Giant anti-rabbit immunoglobulin (Vector Laboratories) was added to each tissue section to add 3 Placed at room temperature for 0 minutes. After the washing step, the sections were removed from horseradish peroxidase (HRP ) And goat anti-biotin immunoglobulin (Vector Laboratories) for 30 minutes At room temperature. After washing, use the DAB peroxidase substrate kit (V 3'3 diaminobenzidine-tetrahydrochloride using (DAB) substrate was added to each section and placed until the desired color was obtained. Water reaction And boosted with 1% osmic acid and immediately washed for 5-10 minutes. Tissue section Counterstain with hematoxylin (Sigma), wash with water, and Aquamount (Lerner Labor atories, Pittsburgh). Staining with ICAM-6 antibody reveals high levels of expression in primary spermatocytes Was. Do not use control slides with pre-immune serum and primary antibodies. The control slide was clearly negative. Western blot To determine the size of the ICAM-6 protein produced in vivo, Antibody to mouse testis lysate by Western blotting as described below. And tested. Grind quickly frozen mouse testis tissue in liquid nitrogen And 150 mM Tris (pH 6.8), bromophenol blue, 2.5% β-mercaptoeta Sol, 4% SDS, and 20% glycerol, boil for 5 minutes, Sheared through a syringe needle and pelletized by centrifugation. The supernatant was used for 12% SDS- Separated using PAGE. Dilute the amount of protein in the supernatant in several steps by SDS-PAGE The products were run and estimated by staining with Coomassie blue. About 20μg Mouse testis proteins were separated by SDS-PAGE, and Immobilon-P membrane (Millipore , Bedford, MA). Blot overnight at 4 ° C for 0.2 3% bovine diluted in Tris buffered saline containing 20% Tween-20 (TBS-Tween) Incubated in serum albumin. After washing, remove the membrane by 2 μg / ml. TB containing mouse ICAM-6 polyclonal rabbit antibody or control pre-immune serum Incubated for 1 hour at room temperature in S-Tween. Next, remove the membrane Wash, goat anti-rabbit HRP binding light chain specific secondary antibody (Accurate, Westbury, NY) For 1 hour at room temperature. After washing, enhanced chemiluminescence (ECL) Western blot detection kit (Pierce) according to manufacturer's instructions Bands were visualized on Kodak X-OMAT-AR film. Incube Between the washing steps, the membrane was washed three times for 5 minutes with TBS-Tween. Two bands were clearly detected by the ICAM-6 antiserum, but the control was Clearly negative. Broad band migrating between 60 kDa and 100 kDa detected Was. Travel at about 200-250kDa Another band was observed. Prediction of mature mouse ICAM-6 protein of 527 amino acids The size obtained was about 58 kDa. This allows the expressed protein to be It was suggested that it was cosylated. Consensus sequence As by sequence analysis Possible N-glycosylation site characterized by p-Xaa- (Ser / Thr) Was shown to be present in six places. At least three O-linked glycosylation sites Is NetOGly, an O-linked glycosylation site putative shiftware [Hansen, et al., Gly. coconjugate J. 15: 115-130 (1998)]. Between 60kDa and 100kDa The spread of the band migrating at, some glycosylated forms of ICAM-6 It is suggested that it may exist in ivo. The larger band at about 200 kDa is very It suggests that a poorly O-glycosylated form of ICAM-6 may also be present. Numerous modifications and variations of the present invention as shown in the above illustrative examples It is anticipated that changes will occur to those skilled in the art. Accordingly, the appended claims Only the limitations appearing in the above are applied to the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ (72)発明者バゾー，ローズメイアメリカ合衆国 98119 ワシントンシアトルダブリュ．レイ 915──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 15/02 C12P 21/08 C12P 21/08 C12N 15/00 B (72) Inventor Bazo, Rosemey United States 98119 Washington Seattle AW. Rei 915

Claims

[Claims] 1. Purified and isolated ICAM-6 polypeptide. 2. Amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 41 The polypeptide according to claim 1, comprising: 3. The polynucleotide according to claim 1, which is a fusion protein. 4. The fusion protein has an ICAM-6 amino acid sequence and an immunoglobulin amino acid. 4. The polypeptide according to claim 3, comprising an acid sequence. 5. A polypeptide encoding the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. Renucleotide. 6. Claims comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 40 6. The polynucleotide according to claim 5, wherein 7. The following groups: a) the polynucleotide of claim 6; and b) high under moderately stringent conditions with the polynucleotide of (a); Bridging DNA A polynucleotide encoding an ICAM-6 polypeptide selected from the group consisting of: . 8. The polynucleotide according to claim 5, which is a DNA molecule. 9. 9. The DNA according to claim 8, which is a cDNA molecule. 10. 9. The DNA according to claim 8, which is a genomic DNA molecule. 11. 9. The method according to claim 8, wherein the DNA molecule is a wholly or partially chemically synthesized DNA molecule. DNA listed above. 12. A hybridizer specifically hybridized with the complement of the polynucleotide according to claim 3. Antisense polynucleotide to be raised. 13. An expression construct comprising the polynucleotide of claim 7. 14． 8. Transformation or transfer with the polynucleotide according to claim 7. Host cell 15. The following steps: a) Claim 14 under conditions suitable for expression of the ICAM-6 polypeptide. Growing the host cell according to the paragraph, and b) isolating the ICAM-6 polypeptide from the host cell or its growth medium A method for producing an ICAM-6 polypeptide, comprising the steps of: 16. A specific immunity with the polypeptide according to any one of claims 1 to 4. Reactive antibodies. 17． 17. The antibody according to claim 16, which is a monoclonal antibody. 18. A hybridoma that secretes the antibody according to claim 17. 19. An anti-idio having specific immunoreactivity with the antibody according to claim 17. Type antibody.