JP2001506126A - ウイルスの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルスを水性培地中の不純物から精製する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルスの精製方法 発明の背景 ウイルスの培養および精製は、遺伝子治療およびワクチン開発のためにますま す重要になってきている。Huygheら（Human Gene Therapy 6：1403-1416(1995)) は、組換えアデノウイルスの精製のためのいくつかの方法(これにはアニオン交 換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、固定化亜鉛アフィニテ ィークロマトグラフィー、超遠心が包含される)の比較を開示し、組換えアデノ ウイルスの精製のための好ましいプロセスは、細胞溶解物をヌクレアーゼで処理 し、次いでメンブレンフィルターを通して濾過し、次いでDEAEクロマトグラフィ ーにかけ、次いで亜鉛アフィニティークロマトグラフィーにかけることであると 結論している。 精製ウイルスに対する必要性、例えば遺伝子治療のためのウイルス性ベクター としての使用が増え続けていることを考えると、改良された精製方法が非常に所 望される。 発明の要旨 本発明の1つの局面は、ウイルス調製物の精製方法であって： a)ウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって、 ここでウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程；お よび b)工程aのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であ って、ここでウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工程 を包含する、方法である。ウイルス調製物は細胞溶解物であり得、これは工程Ａ の前に濾過され得る。ウイルスは組換えアデノウイルス、例えばACN53(WO95／11 984に開示されている)であり得る。 アニオン交換媒体はジエチルアミノエチル基を架橋アガロース、セルロース、 ポリアクリルアミドまたはポリスチレン骨格上に含み得、例えばFRACTOGELT^TM-D E AEである。サイズ排除媒体は架橋多糖を含み得、そして架橋アガロースとデキス トランとの複合体であり得る。サイズ排除媒体の例はSuperdex-200である。アニ オン交換クロマトグラフィー媒体は、ウイルス調製物を付与する前に、徹底的に 洗浄され得る。 サイズ排除媒体は、イオン強度がカラムの頂部から底部に向かって減少する塩 勾配となるように調製されたカラムの中に提供され、このカラムの頂部は工程a の生成物のイオン強度と実質的に等しいイオン強度を有する緩衝液を有する。 本発明のさらなる局面は、請求項１の方法で精製されるウイルスである。 好適な実施態様の説明 本発明は、ウイルスの精製に関し、このウイルスは例えば、細胞宿主中で培養 され、そして次に細胞の溶解および細胞細片(debris)からの分離によって遊離さ れることによって生成されたものであり得る。用語「ウイルス」は、野生型、変 異体、および組換えウイルスを包含し、特に異種核酸配列の発現のためのアデノ ウイルスベクターである。 本発明の実施態様は、ウイルス調製物の吸着クロマトグラフィーと、それに続 いてのサイズ排除クロマトグラフィーという概略的なストラテジーに分けられる 。典型的には、アニオン交換クロマトグラフィーは、高分子骨格に結合した側鎖 の塩基性基からなるアニオン交換樹脂上で行われる。塩基性基は好ましくは置換 アミノ基であり、特にジ低級アルキルアミノアルキル基であり、ここで各低級ア ルキル基は1個から4個、好ましくは2個の炭素原子を有し、そして各アルキル基 は2個から4個、好ましくは2個の炭素原子を有する。骨格はシリカまたは有機マ トリックス、例えば架橋アガロース、セルロース、ポリアクリルアミドまたはポ リスチレンから構成され得る。架橋アガロース骨格上のジメチルアミノエチル基 (DMAE基)または特にジエチルアミノエチル基(DEAE基)からなるアニオン交換樹脂 の使用が特に好ましく、特に好ましいDEAEタイプの樹脂は商品名「DEAE-Fractog el」として販売されている樹脂であり、例えば「FRACTOGEL^TM EMD DEAE-650M」 および「FRACTOGEL^TMAE」である。本発明のいくつかの実施態様において、「骨 格」はビーズのような固体支持体であり得る。 アニオン交換樹脂は、好ましくは、アジ化ナトリウムおよびエタノールのよう な保存剤ならびに他の外来性物質を除去するために、ウイルス調製物をロードす る前に、約5〜10カラム容量の塩基性溶液(例えば50mM NaOH/1M NaCl)、次に約５ 〜10カラム容量の中和溶液(例えば50mM HCl／1M NaCl)、次に約5〜30容量のロー ディングおよび／または溶離緩衝液でカラムを洗浄することによって、徹底的に 洗浄される。任意に、ローディングおよび／または溶離緩衝液で洗浄する前に、 ローディングおよび／または溶離緩衝液より塩濃度の低い緩衝液でカラムを洗浄 する。 典型的には、細胞溶解物のようなウイルス調製物は、pHが約7.0〜8.5で塩濃度 が約100〜360mMの緩衝溶液中のクロマトグラフィー媒体にロードされる。この塩 は典型的にはNaClである。いくつかの実施態様では、リン酸塩またはTrisのよう な他の緩衝液も使用され得る。混入物(contamination)は、カラムを塩濃度が約2 50〜380mMの緩衝液で洗浄することによって優先的に溶離し得る。次にウイルス を約360〜600mMの塩濃度での溶液で溶離し得る。この塩は典型的にはNaClである 。典型的には、約5〜50,より好ましくは約30容量の緩衝液を用いてウイルスを溶 離する。画分を採取し、そしてA₂₆₀またはA₂₈₀を測定し、そしてピーク画分をプ ールすることによってウイルスの存在についてアッセイする。あるいは、A₂₆₀ま たはA₂₈₀ピークを含む溶離物を単一画分として採取しても良い。この、ウイルス を含む溶離物中の単一のA₂₆₀またはA₂₈₀の画分またはプールした画分を、本明細 書中で「アニオン交換プール」と名付ける。 サイズ排除クロマトグラフィー工程において、分子は、不活性多孔質媒体、特 に不活性ゲル媒体を充填したベッド(bed)中でサイズに従って分離される。この 不活性ゲル媒体は、好ましくは、球形ビーズ状の架橋多糖類の複合体、例えば、 架橋アガロースおよびデキストランである。膨潤したゲルビーズ中の最も大きな 孔よりも大きい分子はゲルビーズ中に進入せず、従って、クロマトグラフィーベ ッドを通って最も速く移動する。より小さな分子は、そのサイズおよび形に応じ て異なる度合いでゲルビーズ中に進入し、ベッドの通過が遅延する。このように して分子は一般に分子サイズが小さくなる順に溶出する。ウイルスはそのサイズ が大きいので、通常、空隙容量で溶出する。例えば、アデノウイルスは直径が約 80nmである。アデノウイルスのサイズ排除クロマトグラフィーに適した媒体とし ては、G6000PWXL(TosoHaas);SB-806(Alltech);Sephacryl S-400HR、Sephacryl S -500HR、Sephacryl S-1000SF、Sephadex G-200、Sepharose CL-2B；Superdex200 分取グレード(prep grade)、Superose６分取グレード(Pharmacia)；TSK6000PWXL (Bodman)、およびUltrahydrogel 2000(Waters)が挙げられるが、これらに限定さ れない。 「サイズ排除」クロマトグラフィーは本明細書で使用される限りにおいて、ゲ ル濾過クロマトグラフィーを包含することを意図する。特に好ましいサイズ排除 媒体は商品名「Superdex200」として販売されているものである(Pharmaciaカタ ログ、1996、第338-339頁、コード番号17-1043-01(バルク)、あるいは17-1069-0 1または17-1071-01(予備充填カラム)参照のこと)。低分子量の不純物からのウイ ルスのグループ分離が達成されるので、アニオン交換樹脂プールからの出発物質 のローディング容量は比較的大量(例えば、ベッド容量の20％まで、より好まし くは15％まで)であり得る。 本発明のアニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー工程の実施のため の物質の例を表Iに示す。変数および制御の例を表IIおよび表IIIに示す。 表I： アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーで使用する物質の例 表II： アニオン交換クロマトグラフィーのインプロセス制御および操作変数 表III： サイズ排除クロマトグラフィーのインプロセス制御および操作変数 本発明の実施態様において、ウイルスをアニオン交換プールからサイズ排除カ ラムへとロードする。いくつかの実施態様においては、カラムは、イオン強度が カラムの頂部から底部へ向かって減少する塩勾配で調製される。ローディングの 後、ウイルスはこの塩勾配を通って下に移動し(なぜならウイルスは優先的に樹 脂に吸着しないので)、そしてイオン強度の穏やかな変化によりウイルスに対す る損傷が避けられる。塩勾配に追いついた後、ウイルスは低塩(例えば、0〜200m M NaCl)緩衝液で溶離する。このような低塩緩衝液は、長期貯蔵または患者への 投与のための処方物を包含するが、これらに限定されない。 いくつかの実施態様において、溶離緩衝液のようなクロマトグラフィー緩衝液 、またはウイルスを含むプールされた画分に、グリセロールを添加する。典型的 にはグリセロールは最終濃度5〜20％、より典型的には10％で存在する。従って 、いくつかの実施態様ではグリセロールはプロセス全体にわたって全ての溶液中 に存在する。さらなる実施態様において、他の賦形剤、例えば約2〜16％のショ 糖をグリセロールの代わりに使用し得る。 好ましい実施態様において、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは低い塩濃 度の緩衝液(例えば、約100〜150mM、特に約130mMのNaCl)で平衡化される。フィ ードをローディングする直前に、塩勾配を与える。これはベッド容量の中間の画 分、例えば10〜20％、好ましくは約15％に等しく、低塩濃度(約130mM NaCl)から 、より高い塩濃度のフィード(例えば、400〜450mMのNaCl、特に約420mMのNaCl) までである。 単純な試験を行ってDEAE-Fractogelプールの品質を決定し、そして次に塩勾配 を使用すべきかどうかを決定する。この試験は、適切なpH7.5の緩衝液で数分間( 例えば５分間)にわたって希釈したDEAE-FractogelプールのA₃₂₀／A₂₆₀比の定常 性に依存する。適切な緩衝液は50mMのリン酸ナトリウム(pH7.5)、２mMのMgCl₂、 2％ショ糖からなり、NaClを含まない。A₃₂₀／A₂₆₀比が５分間にわたって実質的 に一定であるなら(例えば、0.04を越えて増加しないならば)、試料はアイソクラ チック(isocratic)または塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーのいずれかに適 する。A₃₂₀／A₂₆₀比がこの時間の間に約0.04を越えて増加するならば、DEAE-Fra ctogelプールは、収率を上げるために、好ましくは塩勾配サイズ排除クロマトグ ラフィーで行われる。表IVは、塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーの使用のた めの物質およびプロトコルの例を示す。 表IV： 塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーの使用のための物質およびプロト コルの例 本発明の精製方法はスケールアップ(またはスケールダウン)および大規模な混 入物に適する。当該分野で周知の適切な手順およびガイドラインを使用し、それ に従って、ウイルスを制御し、そしてバイオハザード的状況を回避することがで きる：例えば「Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories」 第3版、RichmanおよびMcKinney編、米国厚生省(Department of Health and Huma n Services)、米国疾病管理センター(the Center for Disease Control)および 国立衛生研究所(the National Institute of Health)、Washington DC、米国政 府印刷局(Printing Office)、1993年5月発行を参照のこと。 本発明の方法は広範囲のウイルスに適用しやすく、これらのウイルスにはアデ ノウイルス、ポックスウイルス、イリドウイルス、ヘルペスウイルス、パポーバ ウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レトロウイルス、およ びロタウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスは好ましくは 組換えウイルスであるが、臨床的な単離物、弱毒化ワクチン株などを包含し得る 。 それゆえ、例えば、本発明の方法で精製され得る組換えアデノウイルスの例は ACN53であり、これはPCT出願番号WO 95／11984に開示される。 第1の工程において、ACN53アデノウイルスベクターをアニオン交換クロマトグ ラフィーでDEAEカラムを用いて精製する。このためには、ウイルスは典型的には 293腎細胞中で増殖され、採取され、そして濃縮および限外濾過に供される。濃 縮物を凍結し、そして約-20℃で使用時まで貯蔵する。凍結濃縮物を解凍し、0.4 5μmのフィルターで浄化し、調製物の伝導度を約250〜360mM NaClに調節し、そ してDEAEクロマトグラフィーに供する。このクロマトグラフィーで使用する溶液 は表1に示される。 第2工程において、ACN53アデノウイルスベクターをサイズ排除クロマトグラフ ィーでSuperdex-200カラムを用いて精製する。ウイルスを含む選択された画分を A₂₆₀またはA₂₈₀で同定し、そしてプールする。プールした画分は精製されたバル クのACN53アデノウイルスベクターから構成され、これを次に0.2μmフィルター を通して滅菌濾過し、そして約-20℃で貯蔵する。 DEAE-Fractogelプール中のウイルスは高濃度の塩(約420mM NaCl)の存在のため 、不安定であり得る。これは、好ましくは、すぐに処理されるか、あるいは4〜1 2℃で約24時間を越えない間、保存される。 溶離プロフィールがA₂₆₀またはA₂₈₀で決定されるACN53アデノウイルスベクタ ーピークを示す画分を、さらなる処理のためにプールする。このサイズ排除プー ルを0.2μmフィルターで濾過する。この濾液は最終的な精製されたバルクのACN5 3アデノウイルスベクターであり、これを次に滅菌プラスチックボトル(例えばTe flon)に移し、そして約-20℃で貯蔵する。この工程のインプロセス制御を表III に示す。 この精製方法の各工程でのACN53アデノウイルスベクターの純度の上昇はResou rce Q HPLCによって追跡され得る(Huygheら、Human Gene Therapy，第6巻(1995 年11月)、第1405頁の第1403-1416頁参照)。第1および第2のクロマトグラフィー プール中のウイルスの品質はまた、分光学的方法によってもモニターされる。A_{2 60} ／A₂₈₀の特徴的な比は最終的な精製ウイルスについて1.23〜1.31：１である。 ウ イルスの高分子量の結果である光散乱はA₃₂₀／A₂₆₀nmの比から導出され、そして これもまたクロマトグラフィープールのモニターに使用される。精製された遊離 のウイルス粒子は約0.22〜0.30：1の光散乱比を示す。 以下の実施例は本発明の例示として役立つ。選択されたベクターおよび宿主な らびに他の物質、試薬の濃度、温度、および他の変数の値は、本発明をどのよう に実行し得るかの単に例示であり、その限定と考えられるべきではない。 実験的実施例 A. アデノウイルスの小規模精製 (1)アニオン交換クロマトグラフィー(DEAE-Fractogel) DEAE-EMD Fractogel 650Mカラム(E.Merck)(5×18cnl)を5ベッド容量(B.V.)の0 .5M NaOH／1M NaCl、次いで6B.V.の0.1M HCl／1M NaCl、そして次に20B.V.の緩 衝液A(265mM NaCl、2mM MgCl₂、2％(w/v)ショ糖、50mMリン酸ナトリウム、pH7.5 )で、線形流速2cm/分で予備平衡化した。このカラムのフィードは2リットルの凍 結粗ウイルス溶液から誘導され、これを解凍し、0.45μメンブレンを通して微量 濾過し、そして小容量の4M NaClで調節して伝導度が緩衝液Aのものと等しくなる ようにした。このフィードを線形流速1cm/分でカラムにロードした。カラムを4B .V.の緩衝液Aで洗浄した。次にカラムを8B.V.の94％緩衝液A／6％緩衝液B(NaCl を600mMとしたこと以外は緩衝液Aと同じ)で洗浄した。カラムを30B.V.の、94％ 緩衝液A／6％緩衝液Bから100％緩衝液Bまでの線形勾配で溶離した。実質的なウ イルスを含む画分をプールし、次のカラムのためのフィード(「DEAEプール」)を 形成した。 (2)アイソクラチックサイズ排除クロマトグラフィー(Superdex-200) サイズ排除クロマトグラフィーを、0.5B.V.の0.5M NaOH、1B.V.のH₂O、および 2B.V.の緩衝液C(130mMのNaCl、2mMのMgCl₂、２％(w/v)ショ糖、50mMリン酸ナトリ ウム、pH7.5)で線形流速0.6cm/分で予備平衡化されたSuperdex-200カラム(Pharm acia)、５×73cmで行った。フィードは220mlのDEAEプールから構成され、これを カラムにロードした。ACN53を緩衝液Cで線形流速0.6cm/分で溶離した。実質的な ウイルスを含む画分をプールし、0.2μのミクロフィルターを通し、そして貯蔵 した。ウイルス濃縮物は低温(例えば0〜10℃、好ましくは約4℃)で貯蔵され得、 あるいは容量が小さい(例えば、約5ml未満)場合、-80℃で凍結され得る。 (3)塩勾配サイズ排除クロマトグラフィー (a)．塩希釈試験 DEAE-Fractogelプール(0.4ml)を50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、2mM MgCl₂、2 ％ショ糖から構成され、NaClを含まない緩衝液(0.8ml)と混合し、そしてすぐに 石英キュベット中に入れ、そして260nmおよび320nmの吸光度を光ダイオードアレ イを備えたUV分光器で測定した。試料をキュベットから取り出さずに、読みとり を1〜2分間隔で５分間にわたって繰り返した。A₃₂₀/A₂₆₀の比がこの期間の間実 質的に一定であれば、このDEAE-Fractogelプールはアイソクラチックまたは塩勾 配サイズ排除クロマトグラフィーのいずれかに適する。A₃₂₀/A₂₆₀の比がこの期 間の間に約4％を越えて増加する場合、DEAE-Fractogelプールは、収率を上げる ために、塩勾配サイズ排除クロマトグラフィーを必要とする。 (b)塩勾配サイズ排除クロマトグラフィー 塩勾配クロマトグラフィーを、0.5B.V.の0.5M NaOH、1B.V.のH₂O、および2B.V .の緩衝液C(20mMリン酸ナトリウム、pH8.0、130mM NaCl₂、2mM、MgCl₂、2％ショ 糖)で予備平衡化したSuperdex-200カラム(2.6cm×60cm)を用いて行った。DEAEプ ールをロードする直前に、100％緩衝液Cから100％緩衝液D(20mMリン酸ナトリウ ム、pH8.0、420mM NaCl₂、2mM、MgCl₂、2％ショ糖)の0.15B.V.(48ml)の線形勾配 をSuperdex-200カラムに付与した。上記試験に不合格の20mlのDEAEプールからな るフィードを次にカラムにロードし、そして緩衝液Dで線形流速0.6cm/分で溶離 した。空隙容積内またはその近傍で溶離した、実質的なウイルスを含む画分をプ ールし、滅菌フィルターを通し、そして-80℃で貯蔵した。この工程の収率は60 ％であり、そしてA₃₂₀/A₂₆₀比は0.24：1であった。 B．アデノウイルスの大規模精製 （1）アニオン交換クロマトグラフィー 発酵および回収工程からの凍結ウイルス濃縮物を解凍し、そしてMillipore 10 ”Opticapカプセル中の0.45μm親水性Duraporeメンブレンを通して濾過した。濾 液を閉鎖タンク中に採取した。損失を最小限とするために、フィルターカートリ ッジを、約1.5Lの緩衝液J-1(50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、265mM塩化ナトリウ ム、2mM塩化マグネシウム、2％(w/v)ショ糖)に5.4％(w/w)の溶液J-3(4M塩化ナト リウム)を補充したもので洗浄した。濾液の塩濃度を5.4％(w/v)の溶液J-3(4M塩 化ナトリウム)の添加により調節した。次にこのフィード溶液を、緩衝液J-1(50m Mリン酸ナトリウム(pH7.5)、265mM塩化ナトリウム、2mM塩化マグネシウム、2％( w/v)ショ糖)で予備平衡化したFractogel EMD DEAE-650Mカラム(直径7cm、ベッド 高さ14.8cm、ベッド容量570ml)に付した。アデノウイルスはアニオン交換樹脂に 結合し、他方、培地および宿主細胞の不純物の大部分はこの費やされたチャージ の間にカラムを通過する。カラムを最初に4ベッド容量の緩衝液J-1で洗浄し、次 に第2のアイソクラチック洗浄を8ベッド容量の94％緩衝液J-1および6％緩衝液J- 2(50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)、600mM塩化ナトリウム、2mM塩化マグネシウム 、2％(w/v)ショ糖)で行い、さらなる不純物を除去した。ウイルスはカラムから3 0ベッド容量の6％〜100％緩衝液J-2の線形勾配で溶離した。A₂₈₀で決定される溶 離プロフィールのアデノウイルスピークを採取し、そしてさらなるプロセシング のためにプールした。アニオン交換クロマトグラフィー工程のインプロセス制御 および操作パラメータを表Vにまとめる。 表V： アニオン交換クロマトグラフィーのインプロセス制御および操作パラメ ータ （2）サイズ排除クロマトグラフィー DEAEプールをすぐに、緩衝液K-1(20mMリン酸ナトリウム(pH8.0)、100mM塩化ナ トリウム、2mM塩化マグネシウム、2％(w/v)ショ糖)で予備平衡化したSuperdex-2 00サイズ排除カラム(直径14cm、ベッド高さ77cm、ベッド容量11.9L)に付した。 カラムを緩衝液K-1で溶離した。A₂₈₀で決定される溶離プロフィールのアデノウ イルスピークを採取し、そしてプールした。このクロマトグラフィー工程により 緩衝液の交換およびアデノウイルス生成物からの低分子量不純物の分離が達成さ れる。サイズ排除クロマトグラフィー工程のためのインプロセス制御および操作 パラメータを表VIにまとめる。 表VI： サイズ排除クロマトグラフィーのインプロセス制御および操作パラメー タ （3）最終の0.2μm濾過 Superdex200プールを、2〜15℃で0.2μm親水性Duraporeメンブレン(Stericup 、Milliopore)を通して濾過した。この工程は、生物安全キャビネット(biosafet y cabinet)中で滅菌条件下で行った。いくつかのの濾過装置を使用したので、個 別の濾液をプールし、そして次にオートクレーブにかけた容器中にアリコートを 採った。バルクの薬物物質の溶液の容器をドライアイス／エタノール浴中で凍結 し、そして約-20℃で貯蔵した。 本明細書中で引用された全ての刊行物ならびに特許出願は、個々の刊行物また は特許出願が詳細かつ独立して参考として援用されているのと同じ程度に本明細 書中に参考として援用される。 本発明の改変および変形は当業者に明らかである。本明細書中に記載される特 定の実施態様は例示のみのために提供され、本発明はここで限定されるように解 釈されるべきではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ボンドック，ローレアノ エル．，ジュニ ア アメリカ合衆国 ニュージャージー 08854，ピスカタウェイ，セイント マー クス アベニュー 210

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ウイルス調製物の精製方法であって： a)該ウイルス調製物をアニオン交換クロマトグラフィーに供する工程であって 、ここで該ウイルスがアニオン交換クロマトグラフィー媒体から溶離される工程 ；および b)工程Ａのウイルス生成物をサイズ排除クロマトグラフィーに供する工程であ って、ここで該ウイルスがサイズ排除クロマトグラフィー媒体から溶離される工 程 を包含する、方法。 ２．前記ウイルス調製物が細胞溶解物である、請求項１に記載の方法。 ３．前記細胞溶解物が工程aの前に濾過される、請求項２に記載の方法。 ４．前記ウイルスが組換えアデノウイルスである、請求項１に記載の方法。 ５．前記サイズ排除媒体が、イオン強度がカラムの頂部から底部に向かって減少 する塩勾配となるように調製されたカラムの中に提供され、該カラムの頂部が工 程aの生成物のイオン強度と実質的に等しいイオン強度を有する緩衝液を有する 、請求項１に記載の方法。 ６．前記ウイルスがACN53である、請求項１に記載の方法。 ７．前記アニオン交換クロマトグラフィー媒体が、ウイルス調製物を適用する前 に徹底的に洗浄される、請求項１に記載の方法。 ８．請求項１の方法で精製されるウイルス。