JP2001504799A - Ｈｌａ分子への結合アフィニティーが増加したペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はHLA-A3スーパーモチーフを含む免疫原性ペプチドを提供するものである。本ペプチドは多くの病的状態を治療し、診断しまたは監視するために使用することが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】 HLA分子への結合アフィニティーが増加したペプチド 発明の背景 本発明は種々の病気の状態を予防し、治療し、または診断するための組成物と 方法に関する。より詳細には、選択した主要組織適合複合体（MHC）分子に結合 することができ免疫応答を誘導することができる新規なペプチドを提供する。 MHC分子はクラスＩ分子あるいはクラスII分子のいずれかに分類される。クラ スIIMHC分子はＴリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージその他のような免疫応 答の開始と維持に関係する細胞上に主として発現している。クラスII MHC分子は ヘルパーＴリンパ球に認識されヘルパーＴリンパ球の増殖を誘導し提示されてい る特定の抗原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。クラスI MHC分子 はほとんど全ての有核細胞上で発現しており、細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）に よって認識され、次にCTLは抗原を有する細胞を破壊する。CTLは特に腫瘍の拒絶 およびウイルス、真菌および寄生虫の感染との戦いのために重要である。 MHCクラスＩ分子に対する結合アフィニティーと個々のペプチドエピトープの 免疫原性との関係は２つの実験手法により解析されてきた(Setteら、J.Imlunol ．153:5586-5592(1994))。第１の手法では、MHC結合アフィニティーが10,000倍 の範囲にわたる、潜在的なエピトープの免疫原性がHLA-A^*0201トランスジェニッ クマウスで解析された。第２の手法では、異なる約100種のＢ型肝炎ウイルス（H BV）由来の潜在的なエピトープ、これらは全てA^*0201結合モチーフを有している が、これらの抗原性が急性肝炎の患者のPBLを用いて評価された。両方の場合に おいて、約500nM（好ましくは500nMかそれ以下）の結合閾値がペプチドエピトー プのCTL応答を引き起こす能力を決定していることが明らかにされた。これらの データは、天然にプロセッシングされるペプチドまたは従来記述されていたＴ細 胞エピトープのクラスＩ結合アフィニティー測定とよく一致する。これらのデー タはＴ細胞応答を引き起こす際の、抗原決定基選択の重要な役割を示すものであ る。 通常、CTL応答は全ての潜在的なエピトープに向かうわけではない。そうでは なく、CTLはいくつかの主要抗原決定基に拘束される(Zinkernagelら、Adv．Immu nol．27，51-59(1979);Benninkら、JExp．Med．168，1935-1939(1988);Rawleら 、J．Immunol．146,3977-3984(1991))。かなり前から、免疫優位性（Benacerraf ら、Science．175,273-279(1972)）は、与えられたペプチドの、特定のMHC分子 への選択的結合能によって説明されるか（決定基選択説）(Vitielloら、J．Immu nol．131:1635(1983)、Rosenthalら、Nature267，156−158(1977))、存在してい るTCRの特異性によって選択的に認識されること（レパトワール説）(Klein,J.， Immunology，the Science of Self Nonself Discrimination，John Wiley & Don s，Ney York，pp270-310(1982))で説明できると考えられている。他の補助的な 因子も、それらはほとんどプロセッシングに関連しているものだが、厳密な抗原 性以外に、多数の潜在的な決定基のどれが主要抗原決定基として提示されるかを 決定するのに重要な役割を果たしうることが示されている(Sercarzら、Annu．Re v．Immuinol．11，729-766(1993))。 特定の免疫原性ペプチドの１またはそれ以上のHLA分子に対する結合アフィニ ティーを調節し、それによりそのペプチドによって引き起こされる免疫応答を調 節することが可能であれば、ペプチド-ベースのワクチンおよび治療薬の有用性 を非常に大きくするであろう。本発明は、これらの、及びその他の利益を提供す るものである。 発明の概要 本発明はワクチン及び治療法において使用するペプチドおよびこれをコードす る核酸を提供する。本発明は予め選んだ患者の抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応 答を誘導する方法を提供し、その方法は細胞障害性Ｔ細胞を本発明の免疫原性ペ プチドと接触させることを含むものである。本発明のペプチドは、ウイルス抗原 、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原、真菌抗原その他を含む種々の抗原に由来してよい 。本発明の方法は、in vitroまたはin vivoで行なうことができる。好ましい実 施態様では、このペプチドはこの免疫原性ぺプチドをコードする配列を含む核酸 分子を患者に投与することにより細胞障害性Ｔ細胞と接触させられる。 一つの実施態様では、本ペプチドは約９残基と約１５残基との間であり少なく とも２つのHLA-A3様分子と約500nMより小さな解離定数で結合し細胞障害性Ｔ細 胞応答を誘導する。免疫原性ペプチドはＮ末端からＣ末端までに以下の結合モチ ーフを含む９残基の配列を有している。 結合モチーフ： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｓ、およびＴからなる群より選ばれる、第２位置の第１ の主要アンカー残基および、ＲおよびＫからなる群より選ばれる、第９位置の第 ２の主要アンカ一残基；および 第３位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第６位置がＹ，ＦまたはＷ、第７位置がＹ、Ｆ 、またはＷ、第８位置がＰ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群よ り選ばれる、１またはそれ以上の２次的アンカー。 本発明は更に、HLA-A^*0301遺伝子産物に結合する免疫原性ペプチドを提供する 。これらのペプチドはＮ末端からＣ末端に以下の９残基結合モチーフを含んでい る。 結合モチーフ： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｓ、およびＴからなる群より選ばれる、第２位置の第１ の主要アンカー残基およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置の第２の 主要アンカー残基；および 第１位置がＲ、Ｈ、またはＫ、第３位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第４位置がＰ、 Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＷ、第５位置がＡ、第６位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第 ８位置がＰ、およびこれらの何れかの組み合わせからなる群より選ばれる、１ま たはそれ以上の２次的アンカー残基。 本発明はまたHLA-A^*1101遺伝子産物に結合する免疫原性ペプチドを提供する。 これらの免疫原性ペプチドはＮ末端からＣ末端までに以下の９残基結合モチーフ を含んでいる。 結合モチーフ： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｓ、およびＴからなる群より選ばれる、第２位置の第１ の主要アンカー残基およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置の第２の 主要アンカー残基；および 第１位置がＡ、第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第４位置がＹ、ＦまたはＷ、第５ 位置がＡ、第６位置がＹ、ＦまたはＷ、第７位置がＹ、ＦまたはＷ、第８位置が Ｐ、およびこれらの何れかの組み合わせからなる群より選ばれる２次的アンカー 残基。 本発明はまたHL-A^*3101遺伝子産物に結合する免疫原性ペプチドを提供する。 これらの免疫原性ペプチドはＮ末端からＣ末端までに以下の９残基結合モチーフ を含んでいる。 結合モチーフ： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｓ、およびＴからなる群より選ばれる、第２位置の第１ の主要アンカー残基およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置の第２の 主要アンカー残基；および 第１位置がＲ、ＨまたはＫ、第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第４位置がＰ、第６ 位置がＹ、ＦまたはＷ、第７位置がＹ、ＦまたはＷ、第８位置がＡまたはＰ、お よびこれらの何れかの組み合わせからなる群より選ばれる２次的アンカー残基。 本発明はまたHLA-A^*3301遺伝子産物に結合する免疫原性ペプチドを提供する。 これらの免疫原性ペプチドはＮ末端からＣ末端までに以下の９残基結合モチーフ を含んでいる。 結合モチーフ： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｓ、およびＴからなる群より選ばれる、第２位置の第１ の主要アンカー残基およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置の第２の 主要アンカー残基；および 第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第７位置がＡ、Ｙ、ＦまたはＷ、およびこれらの 何れかの組み合わせからなる群より選ばれる２次的アンカー残基。 本発明はまたHLA-A^*6801遺伝子産物に結合する免疫原性ペプチドを提供する。 これらの免疫原性ペプチドはＮ末端からＣ末端までに以下の９残基結合モチーフ を含んでいる。 結合モチーフ： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｓ、およびＴからなる群より選ばれる、第２位置の第１ の主要アンカー残基およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置の第２の 主要アンカー残基；および 第１位置がＹ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、ＴまたはＣ、第５位置がＹ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ またはＭ、第７位置がＹ、ＦまたはＷ、第８位置がＰ、およびこれらの何れかの 組み合わせからなる群より選ばれる２次的アンカー残基。 本発明はまた、HLA-A3様分子と約500nMより小さい解離定数で結合する免疫原 性ペプチドを同定する方法を提供する。本方法は、抗原タンパク質のアミノ酸配 列を本発明の結合モチーフの存在についてスクリーニングし、結合モチーフを有 する抗原タンパク質中の１またはそれ以上の部分配列を選択することを含む。選 択した部分配列を含む約８〜約１１残基のテストペプチドが調製されテストされ る。次に解離定数が500nMより小さいペプチドが同定される。 定義 本明細書においては「ペプチド」の語は「オリゴペプチド」と互換性をもって 残基の連続、典型的にはL-アミノ酸残基の連続を、それらが互いに結合しており 、典型的には隣り合うアミノ酸のアルファ-アミノ基とカルボニル基間のペプチ ド結合で結合されているものを意味すべく使用される。本発明のオリゴペプチド は約15残基よりも長さが短く、通常約８と約11残基の間であり、好ましくは９ま たは10残基である。 「免疫原性ペプチド」とはアレル特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含 むペプチドで、そのペプチドがMHC分子に結合しCTL応答を誘導するようなペプチ ドをいう。本発明の免疫原性ペプチドは適当なHLA-A3様分子と結合することがで き、その免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する窓外性Ｔ細胞応答を誘導する ことができる。 「主要なアンカー残基」とは、免疫原性ペプチドとMHC分子との接点を与える かもしれない、ペプチド配列中の特異的な位置にあるアミノ酸をいう。特定の長 さの免疫原性ペプチド内の１から３、通常は２つの主要アンカー残基が免疫原性 ペプチドのモチーフを規定する。これらの残基は典型的にはペプチド結合溝のす ぐ近くにあり、その側鎖は溝自体の特異的なポケットに埋まっている。典型的に は、主要なアンカー残基は９残基のペプチドの第２位置および第９位置にある。 「2次的アンカー残基」は主要アンカー以外でペプチド中の特定の位置に、ラ ンダム分布で考えられるよりも有意に高頻度に現れるアミノ酸をいう。あるいは 、2次的アンカーは高アフィニティー結合ペプチドに高頻度で現れる、または高 アフィニティー結合と関連するアンカーとして定義できる。これらの位置に特定 の残基が存在すること、または存在しないことは、特定のモチーフを含むペプチ ドの結合アフィニティーを細かく調節するために利用することができる。 本明細書で使用する「陰性結合残基」とは、特定の（典型的には主要アンカー 位置でない）位置に存在すると、標的HLA分子に対する結合アフィニティーの減 少をもたらすアミノ酸をいう。 「モチーフ」の語は、特定のMHC分子に認識される、一定の長さ、典型的には 約８から約15アミノ酸のペプチド中の残基パターンをいう。ペプチドモチーフは 典型的には各ヒトMHCアレルについて異なっており主要な、および２次的なアン カー残基のパターンについて異なつている。 「スーパーモチーフ」は、免疫原性ペプチド中に存在する場合に、そのペプチ ドが１以上のHLA抗原に結合できるようになるモチーフをいう。スーパーモチー フは少なくとも１つのHLAにより高アフィニティーまたは中アフィニティー（以 下に定義する）で認識されることが好ましく、少なくとも２つのアレルにより認 識されることが好ましく、少なくとも３つのアレルに認識されることがより好ま しく、３つより多くのアレルに認識されることが最も好ましい。 ある程度類似のペプチド結合モチーフを共通とするHLAクラスＩ分子はHLAスー パータイプにグループ分けされる。本明細書で用いる「HLAスーパータイプある いはファミリー」とは、共通するペプチド結合特異性を基礎としてグループ分け された分子集団をいい、共通する抗原決定基に基づく血清学的サブタイプをいう ものではない。 本明細書で用いる「HLA-A3様」HLA分子（アレルともいう）とは、ここで開示 するHLA-A3スーパーモチーフと重なるペプチド結合モチーフを共通にもつHLA-A アレルによってコードされるHLA分子のグループをいう。これらのアレルに共通 する９残基のスパーモチーフは以下の主要アンカー残基を含む：第２位置のＡ、 Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴおよび、第９位置（９merにおいてはＣ末端）のＲ およびＫのような正に帯電した残基。このファミリーのメンバーの例としては、 血清学的に、あるいはDNAタイピングの何れかにより同定されたもので、以下が 含まれる：A3(A^*0301)、A11(A^'1101)、A31(A^*3101)、A^*3301、A^*6801。このファ ミリーの他のメンバーには、A34、A66およびA^*7401が含まれる。以下に詳細に説 明するように、個々のアレルの各々への結合は２次的アンカー位置の置換により 細かく調節することができる。 「HLA-A2様」スーパータイプは第２位置およびＣ末端に小さな、または脂肪族 アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、およびＴ）をもつペプチドリガンドに対する優 先性によって特徴づけられる。このファミリーは少なくとも８つのHLA-Aアレル からなっている(A^*0201、A^*0202、A^*0203、A^*0204、A^*0205、A^*0206、A^*6802、A^* 6901)。 「HLA-B7様」スーパータイプは少なくとも１ダースのHLA-Bアレル産物からな っており（B7、B^*3501-3、B51、B^*5301、B^*5401、B^*5501、B^*5502、B^*5601、BB^* 6701、およびB^*7801）(Sidneyら、J.Immunology 154:247(1995);Barberら、Curr Biol 5:179(1995);Hillら、Nature 360:434(1992);Rammenseeら、Immunogeneti cs 41:178(1995))、かつ、位置２にプロリンを有しＣ末端に疎水性または脂肪族 アミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、Ｗ、およびＹ）を有するペプチドを認識す る分子によって特徴づけられる。 「単離された」あるいは「生物学的に純粋な」とは、天然の状態で見られると きに通常伴っている成分を実質的に、または本質的に含まない物質をいう。従っ て、本発明のペプチドはin situの環境で通常関連する物質、例えば抗原提示細 胞上のMHC I分子、を含まない。タンパク質が均一に、または主要なバンドに単 離される場合でも、求めるタンパク質と共に共精製される天然タンパク質の５〜 10％の微量な不純物が存在する。本発明の単離されたペプチドはそのような内在 性の共精製タンパク質を含まない。 「残基」の語は、アミド結合またはアミド結合類似（amide bond mimetic）結 合によりオリゴペプチド中に取り込まれているアミノ酸またはアミノ酸類似物を いう。 図面の簡単な説明 図１は、５つのA3様アレル、A^*0301、A^*1101、A^*3101、A^*3301およびA^*6801の 微細なアレル特異的モチーフを示すものである。各非-アンカー位置に関連して 、各個別のアレルに対して良く結合し得る、あるいはあまり結合できない個々の 残基または類似の化学的性質の残基群を示した。 図２はA3様スーパーモチーフを示したものである。カッコ内の数字はその残基 または残基群が優先的または阻害的である分子数を示す。 図３はペプチドの結合能に影響を与える２次的効果を要約したものである。 ａ）B^*0702、ｂ）B^*3501、ｃ）B51、ｄ）B^*5301およびｅ）B^*5401に対するもの である。これらのマップはB7様スーパーモチーフ（f）を明らかにするために続 いて用いられた。カッコ内の値は、残基又は残基群が優先的または阻害的である 頻度を示す。 図４は、A^*0101サブモチーフ９merペプチドの相対結合能の平均を、各非-アン カー位置に現れる種々の残基の関数として示したものである。材料と方法に記載 したように、2-9mer(a)、3-9mer(b)サブモチーフペプチド集団からのデータ群を 解析し、表にした。2-9および3-9の集団は各々101および85種の異なるペプチド を含んでいた。2-9mer(c)および3-9mer(d)A^*0101サブモチーフを有する９merペ プチドの結合能に影響を与える２次的効果のマップも示した。 図５は、A^*0101サブモチーフ10merペプチドの相対結合能の平均を、各非-アン カー位置に現れる種々の残基の関数として示したものである。2-l0mer(a)あるい は3-10mer(b)サブモチーフペプチド集団からのデータ群を解析し、表にした。2- 10および3-10の群は各々91および89種の異なるペプチドを含んでいた。2-10(c)m erおよび（1）および3-10mer(d)A1サブモチーフを有する10merペプチドの結合能 に影響を与える２次的効果のマップも示した。 好ましい実施態様の説明 本発明は、ヒトのクラスI MHC（HLAと称される）アレル、特にHLA-A3様アレル に対するアレル特異的ペプチドおよびスパーモチーフを決定することに関する。 次にこれらのモチーフは、なんらかの必要な抗原についての、特にヒトのウイル ス病、寄生虫病、真菌症または癌と関連する抗原のＴ細胞エピトープを調製し修 飾するために使用される。 上述したように、高いHLA結合アフィニティーは高い免疫原性と相関している 。高い免疫原性はいくつかの異なる方法で示すことができる。例えば、より強く 結合するペプチドはより多くの場合に免疫原性である。強く結合するペプチドの 90％近くが免疫原性であり、中アフィニティーで結合するペプチドで約50％であ ることと対比される。より強く結合性するペプチドはまたより激しい応答を引き 起こすであろう。その結果、同様な生物学的効果を現すのにより少ないペプチド しか必要としない。従って、本発明のいくつかの実施態様においては強く結合す るエピトープが特に望まれる。 本発明のいくつかの実施態様では、優性エピトープ（dominant epitope）と対 照的な亜優性(subdominat epitope)エピトープを決定することが望まれる。ここ で採用する命名法では（Sercarzら、上述の文献(1993)）「優性エピトープ」は天 然の抗原全体で免疫したときに応答を誘導する。このような応答はin vitroでペ プチドエピトープと交差反応性である。「潜在的（cryptic）エピトープ」はペ プチド免疫によって応答を引き起こすが、in vitroでインタクトなタンパク質全 体が抗原として使用された場合に交差反応しない。最後に、「亜優性エピトープ 」は抗原全体で免疫してもほとんど又は全く応答を起こさないエピトープである が、ペプチド免疫によってこれに対する応答が得られ、タンパク質全体がin vit roでこの応答を再び起こすために用いられた場合に、この応答が（潜在的エピト ープの場合と異なり）検出される。 優性および亜優性の概念はウイルス病および癌の免疫療法に関連するものであ る。慢性ウイルス病においては、感染をうまく除去するために亜優性のエピトー プを補充することが重要となり得、特に優性CTL特異性が機能トレランス、サプ レッション、ウイルスの変異およびその他の機構によって不活性化されていると きに特に重要である(Francoら、Current Opinion in Immunology，7:524-531,(1 995))。さらに、癌および腫瘍抗原の場合は、少なくともいくつかの最も強く結 合するペプチドを認識するCTLはトレランスおよびサプレッションにより機能的 に不活化されているようであり、より低い結合アフィニティーのペプチドが優先 的に認識されているように見える。 特に、既知の非ウイルス性腫瘍関連抗原（TAA）由来のエピトープのかなりの 数のものがHLAクラスＩと中アフィニティー（50〜500mMの範囲のIC50％）で結合 することが言われている。腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）またはCTLに認識される15 の既知のTAAペプチドのうち８種が50〜500mMの範囲で結合する。これらのデータ は、ペプチドとして認識される既知のウイルス抗原の90％がHLAとIC50％が50μM かそれ以下で結合する一方僅かに約10％が50〜500mMの範囲で結合するという評 価と対照的である(Setteら、J．Immunol.，153:5586-5592(1994))。この現象は おそらく癌の移植において、多分Ｔ細胞トレランスによる、最も強く結合するペ プチドを認識するCTLの除去、または、機能抑制によるものであろう。 本発明は、主要な、および２次的なアンカー位置に、必要な残基を選択するこ とにより免疫原性ペプチドの結合アフィニティーを調節する方法を提供する。以 下に詳しく説明するように、A3-様アレルへの結合を増強するスーパーモチーフ もここで提供される。結合アフィニティーへの求める影響に依存して、必要なペ プチド中のアンカー残基が置換される。本発明を用いて達成されるかもしれない 調節の例には、特定のアレルに対するアフィニティーの増加(例えば、そのアレ ルに対して特異的な２次的アンカー残基の置換による)、種々のアレル間の交差 反応性の増大(例えば、１以上のアレルに共通する２次的アンカー残基の置換に よる)、および亜優性エピトープの作成（例えば、アフィニティーを増大させる が優性エピトープには存在しない残基の置換による）が含まれる。 多数の可能な標的タンパク質のエピトープは本発明で利用することができる。 適切な抗原の例には、前立腺特異的抗原(PSA)、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗 原(HBVc、HBVs)、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン-バーウイルス抗原、メラノーマ 抗原(例えばMAGE-1)、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原およびヒトパピローマ ウイルス（HPV）抗原が含まれる。真菌類抗原の例には、カンジダアルビカンス( Candida alibicans)、クリプトコックスネオフォルマンス(Cryptococcus neofor mans)、コクシドイデス類(Coccidoides spp.)、ヒストプラスマ類（Histoplasma spp)およびアスペルギルスフミガティス（Aspergillus fumigatis）由来の抗原 が含まれる。寄生虫抗原には、マラリア原虫類(Plasmodium spp.)、トリパノゾ ーマ類(Trypanosoma spp.)、住血吸虫類(Schistosoma spp.)、リーシュマ ニア類（Leishmania spp.）その他に由来する抗原が含まれる。 本発明のペプチドの調製と評価はPCT公報WO 94/20127およびWO94/03205に記載 されている。簡単にいうと、特定の抗原のエピトープを含むペプチドを合成し、 例えば精製したクラスＩ分子と放射性ヨードラベルしたペプチド及び／又は空の クラスＩ分子を発現している細胞を用い、例えば免疫蛍光染色とフローミクロフ ルオリメトリー、ペプチド依存性クラスＩアッセンブリアッセイ、およびペプチ ド競合によるCTL認識阻害などにより、適当なMCH分子に対する結合能をアッセイ してテストした。クラスＩ分子に結合するペプチドを、感染個体または免疫され た個体に由来するCTLの標的として機能しうるかについて更に評価し、また、病 気と関連する、選択した標的細胞と反応しうるCTL集団を生じさせることができ る一次CTL応答をin vitroまたはin vivoで誘導し得るかについて更に評価する。 この開示を通して、結果はIC50によって表される。アッセイを行なう条件を与 えると(すなわち、MHCとラベルしたペプチド濃度を限定する)、これらの値はだ いたいＫ_D値となる。IC50値は、アッセイ条件が変わると変動しうるものであり 、しばしば劇的に変動しうるものであり、使用する特定の試薬に依存する（例え ば、MHC調製物その他）ことを記載しておく必要がある。例えば、MHC濃度が過剰 であると与えられたリガンドの、測定される見かけのIC50は増加するであろう。 本明細書では、「高アフィニティー」とは50nMより小さなIC50（あるいはＫ_D） で結合することとして定義される。「中アフィニティー」とは約50から約500nM のIC50（あるいはＫ_D）で結合することである。結合を測定するアッセイ法はPCT 公報WO94/20127およびWO94/03205に詳しく記載されている。 結合データを現すもう一つの方法は、対照ペプチドに対する相対値としてもの である。どのアッセイにおいても対照ペプチドが含まれる。特定のアッセイの感 度が高くなる、または低くなると、テストされるペプチドのIC50はいくらか変化 するかもしれない。しかしながら、対照ペプチドに対する相対的結合は変化しな いであろう。例えば、対照ペプチドのIC50が10倍増加するような条件下でアッセ イを行なった場合には、すべてのIC50値が約10倍シフトするであろう。従って、 不明瞭さを避けるためには、ペプチドが良い結合体であるか、中間的な結 合体であるか、弱い結合体であるか、阻害的な結合体であるかの評価は標準ペプ チドのIC50に対する相対的IC50に基づいていなければならない。 ペプチド化合物を記載するために使用した命名法は各アミノ酸残基のアミノ基 を左に表し（Ｎ末端）、カルボキシル基を右に（Ｃ末端）表す伝統的な慣習に従 った。本発明の選択した特定の実施態様を表す式において、アミノ末端およびカ ルボキシル末端基は、特に示していないが断りのない限り、生理学的ｐＨ値で想 定される型である。アミノ酸構造式において、各残基は通常標準的な３文字また は１文字表記で表されている。アミノ酸残基のＬ型は大文字の１文字または３文 字記号の最初の１文字が大文字で表わされ、Ｄ型を有するそれらのアミノ酸のＤ 型は小文字の１文字または小文字の３文字記号で表わされている。グリシンは不 斉炭素原子を持たないため、単にGlyあるいはＧと参照される。 免疫原性ペプチドは合成的に調製することができ、あるいは組換えDNA技術ま たはウイルス全体または腫瘍のような天然の供給源から調製することができる。 ペプチドは、天然に存在する他の宿主細胞タンパク質およびその断片を実質的に 含まないことが望ましいが、いくつかの実施態様ではペプチドは天然の断片又は 粒子に合成的に結合される。 ポリペプチド又はペプチドはその長さについて様々でよく、中性(電荷のない) 型でも塩の形態でもよく、グリコシル化、側鎖の酸化、リン酸化などの修飾を受 けていないくても、また、その修飾が本明細書に記載する生物学的活性を破壊し ないのであればこれらの修飾を含んでいてもよい。 ペプチドは可能限り小さく、一方、大きなペプチドの生物学的活性の全てを実 質的に維持していることが望ましい。可能ならば、本発明のペプチドを約８から 約20、典型的には９から15、好ましくは９から10アミノ酸残基に最適化すること が望ましいであろう。これは、細胞表面のMHCクラスＩ分子に結合している、内 部プロセッシングされたウイルスペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドの大きさと同 程度である。長さ約９残基のペプチドに適した好ましいスーパーモチーフがここ で開示される。他の長さの（例えば、８、10および11残基）ペプチドに対するス ーパーモチーフ、主要アンカーおよび２次的アンカーの同定もここに記載した技 法を用いて行なうことができる。 求める活性を有するペプチドは、望まれる性質、例えば、改良された薬理学的 性質を与えるために必要により修飾されてもよいが、同時に必要なMHC分子に結 合し適切なＴ細胞を活性化するという未修飾ペプチドの生物学的活性を増大させ あるいは少なくとも実質的にその全てを維持する。例えば、本ペプチドは、それ が保存的であっても非保存的であっても、置換のような種々の変化を受けること があり、そのような変化はその使用において、例えばMHC結合の増強のような利 点を与えるかもしれない。保存的置換とは、アミノ酸残基を生物学的及び／又は 化学的に類似の他のアミノ酸に置き換えること、例えば、疎水性残基を他の残基 に、あるいは極性残基を他の残基に置き換えることを意味する。この置換には、 Gly、Ala；Val、Ile、Leu、Met；Asp、Glu;Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；お よびPhe、Tyrのような組み合わせが含まれる。単一のアミノ酸置換の効果はまた D-アミノ酸を用いて調べてもよい。このような修飾は、例えば、Merrifield，Sc ience 232:341-347(1986)およびStewartおよびYoung,Solid Phase Peptide Syng hesis，(Rockford，III.,Pierce)第２版（1984）に記載されているように、よく 知られたペプチド合成法を用いておこなってもよい。 ペプチドはその化合物のアミノ酸配列を伸長または減少させることにより、例 えばアミノ酸を付加または欠失させることにより修飾することもできる。本発明 のペプチドおよびアナログは特定の残基の順番又は組成を変えることにより修飾 することもできるが、特定のアミノ酸残基、例えば、重要な接触部位の残基また は保存残基は生物学的活性に必須であることが容易に分かり、一般に生物学的活 性に有害な影響を与えずに変えることができないかもしれない。 重要でないアミノ酸は、L-α-アミノ酸、またはいずれかのD型異性体のような 、タンパク質中に天然に見られるアミノ酸に限定する必要は無く、β-γ-δ-ア ミノ酸のような非天然のアミノ酸、およびL-α-アミノ酸の多くの誘導体を含ん でもよい。 典型的には、単一のアミノ酸置換をした一群のペプチドが静電荷、疎水性その 他が結合に与える効果を決定するために使用される。例えば、正の電荷をもつア ミノ酸（例えば、LysまたはArg）または負の電荷を持つアミノ酸（例えばGlu） 置換をペプチドの端から端まで行なうと、種々のMHC分子およびＴ細胞レセプタ ーに対する異なる感受性パターンが明らかになる。加えて、Ala、Gly、Proまた は類似の残基のような小さく、相対的に中性の成分を用いた多置換を行なっても よい。この置換物は、ホモ−オリゴマーでもヘテロ−オリゴマーであってもよい 。 置換される、または付加される残基の数とタイプは、必須の接触点と求められる 機能的属性（例えば疎水性対親水性）との間の必要な間隔に依存する。元のペプ チドのアフィニティーに比較した、MHC分子またはＴ細胞レセプターに対する結 合アフィニティーの増大もこのような置換によって達成されるかもしれない。ど の場合でも、このような置換は例えば、結合を破壊するかもしれない立体配置お よび電荷による干渉を避けるようなアミノ酸残基または他の分子断片を使用しな ければならない。 アミノ酸残基置換は典型的には単一の残基についてである。置換、欠失、挿入 あるいはこれらの何れかの組み合わせ、を組み合わせて最終的なペプチドにたど り着く。置換変異体は、ペプチドの少なくとも１つの残基が取り除かれ異なる残 基がその場所に挿入されたものである。そのような置換は、ペプチドの性質を細 かく調節することが望まれる場合に、以下の表１に従って行なわれる。 表１ 原残基 置換の例 Ala Ser Arg Lys,His Asn Gln Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly pro His Lys;Arg Ile Leu;Val Leu Ile;Val Lys Arg;His Met Leu;Ile Phe Tyr;Trp Ser Thr Thr Ser Trp Tyr;Phe Tyr Trp;Phe Val Ile;Leu 機能（例えば、MHC分子またはＴ細胞レセプターに対するアフィニティー）の 本質的な変化は表１よりもより保存性の少ない置換を選択することによってなさ れる。すなわち、（ａ）置換される領域におけるペプチド骨格の構造、例えばシ ートまたはらせんコンホメーション、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎 水性、または（ｃ）側鎖の大きさを維持することに対する影響について、より大 きく相違する残基を選択することによる。通常、ペプチドの性質について最も大 きな変化を生じさせると考えられる置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリン 残基を疎水性残基、例えばロイシン残基、イソロイシン残基、フェニルアラニン 残基、バリン残基またはアラニン残基へ置換される；(ｂ)静電的に正の側鎖をも つ残基、例えばリジン残基、アルギニン残基またはヒスチジン残基が静電的に負 の残基、例えば、グルタミン酸残基またはアスパラギン酸残基へ置換する(ある いは、逆にそれによって置換される)；あるいは（ｃ）大きな側鎖を持つ残基、 例えば、フェニルアラニンが側鎖を持たないもの、例えばグリシンへ置換する( または、逆にそれによって置換される)、そうした置換である。 本ペプチドは、免疫原性ペプチド中に１または２つの残基のアイソスターを含 んでいてもよい。ここで定義するアイソスターとは、第１の配列の立体配座が第 ２の配列に特異的な結合部位に適合するために第２の配列によって置換すること ができる２またはそれ以上の残基の配列である。この用語は特に当業者によく知 られたペプチド骨格の修飾を含む。そのような修飾には、アミド窒素、α-炭素 、アミドカルボニル、アミド結合の完全な置き換え、伸長、欠失または骨格の架 橋が含まれる。一般的には、Spatola，Chemjstry and Biochemistry of Amino A cids，Peptides amd Proteins，第７巻(Weinstein編集、1983)を参照せよ。 種々のアミノ酸類似体(amino acid mimetics)または非天然アミノ酸によるペ プチドの修飾はin vivoにおけるペプチドの安定性の増大において特に有用であ る。安定性は多くの方法でアッセイできる。例えば、ペプチダーゼおよび、ヒト の血漿及び血清のような生物学的媒体が安定性をテストするために使用されてい る。例えば、Verhoerら、Eur.J．Drug Metab．Pharmacokin 11:291-302(1986)を 参照せよ。本発明のペプチドの半減期は25％ヒト血清（v/v）アッセイを用いて 簡便に決定できる。そのプロトコルは通常以下のとおりである。ヒトの保存血 清（AB型、非−加熱不活化）を使用前に遠心によって脱脂（delipidate）する。 この血清をRPMI組織培養培地で25％に希釈しペプチドの安定性をテストするのに 用いた。所期の時間間隔で反応液の少量を取り６％トリクロロ酢酸かエタノール の何れかに加えた。曇りの出た反応サンプルを15分間冷却し（4℃）スピンして 沈殿した血清タンパク質をペレット化した。ペプチドが存在するかを逆相HPLCに よって、安定性-特異的クロマトグラフィー条件を用いて測定した。 CTL刺激活性のある、本発明のペプチドまたはそのアナログを修飾して、改良 された血清半減期以外の望みの属性を与えてもよい。例えば、CTL活性を誘導す るペプチドの能力は、Ｔへルパー細胞応答を誘導することができる少なくとも１ つのエピトープを含む配列に結合することによって増強することができる。特に 好ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー結合体はスペーサー分子によって結合さ れる。スペーサーは典型的には、アミノ酸またはアミノ酸類似体のような比較的 小さな、中性の分子を含み、生理学的条件下で本質的に電荷がないものである。 スペーサーは典型的には、例えばAla、Gly、または非極性アミノ酸または極性の 中性アミノ酸である他の中性スペーサーから選ばれる。任意的に存在するこのス ペーサーは同じ残基からなる必要はなく、従ってヘテロまたはホモオリゴマーで あってよいのは言うまでもないであろう。スペーサーが存在する場合には、それ は通常少なくとも１または２残基であり、より一般には３から６残基であろう。 もう一方では、CTLペプチドはＴヘルパーペプチドにスペーサー無しで結合され てもよい。 免疫原性ペプチドはＴヘルパーペプチドに、CTLペプチドのアミノ末端かカル ボキシ末端の何れかにおいても、直接にまたはスペーサにより結合していてもよ い。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドの何れのアミノ末端もアシル化 されていてもよい。本発明で用いるＴヘルパーぺプチドはCTLペプチドと同様な やり方で修飾することができる。例えば、それらをD-アミノ酸を含むように修飾 しても、または脂質、タンパク質、糖その他のような他の分子に結合させてもよ い。Ｔヘルパーペプチドの例には、破傷風毒素830-843、インフルエンザ307-319 、マラリア胞子小体382-398および378-389が含まれる。 また、Ｔヘルパーペプチドは集団中の主要なＴヘルパー細胞に認識されるペプ チドである。これは、多くの、ほとんどの、あるいは全てのMHCクラスII分子に 結合するアミノ酸配列を選択することにより達成できる。これらは、「ゆるくMHC -拘束された(loosely MHC-restricted)」あるいは「無差別的(promiscuous)」Ｔ ヘルパー配列として知られている。無差別的であるアミノ酸配列の例には破傷風 毒素の位置830-843(QYIKANSKFIGITE)、マラリア原虫（Plasmodium falciparum） CSタンパク質の位置378-398（DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS）および連鎖球菌（Strept ococcus）18kDタンパク質の位置1-16（GAVDSILGGVATYGAA）のような抗原の配列 が含まれる。 また、天然に見られないアミノ酸配列を用いて、Ｔヘルパーリンパ球をゆるく MHC-拘束されたやり方で刺激することができる合成ペプチドを調製することがで きる(例えば、PCT公報WO 95/07707を参照せよ)。汎-DR-結合エピトープ（PADRE ）と呼ばれるこれらの合成化合物は、ほとんどのHLA-DR（ヒトMHCクラスII）分 子への結合活性に基づいて設計されている。例えば、式：aKXVWANTLKAAa(式中Ｘ ＝シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンであり、ａ＝D-ア ラニンまたはL-アラニン)のペプチドはほとんどのHLA-DRアレルと結合し、そのH LAタイプにかかわらずほとんどの個体のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激するこ とが分かっている。Ｔヘルパーエピトープはその生物学的効力を増大させるよう に修飾することもできる。例えば、Ｔヘルパーエピトープを表現しているペプチ ドはプロテアーゼに対する耐性を増大させるためD-アミノ酸を含むことができ、 それにより血清半減期を延長させることができる。また、Ｔヘルパーペプチドは 脂質、タンパク質または糖あるいは他のなんらかの合成化合物のような他の分子 に結合して、その生物学的活性を増大させることもできる。具体的には、Ｔヘル パーペプチドは１またはそれ以上のパルミチン酸鎖にアミノ末端又はカルボキシ ル末端の何れでも結合させることができる。 いくつかの実施態様においては、本発明の医薬組成物中にCTLをプライミング する少なくとも一つの成分を含むことが望ましいかもしれない。脂質はウイルス 抗原に対してin vitroでCTLをプライミングすることができる試薬として明らか にされている。例えば、パルミチン酸残基はLys残基のαおよびεアミノ基に結 合させることができ、次に、例えば、Gly、Gly−Gly−、Ser、Ser−Serのよ うな１又はそれ以上の結合性残基によって、免疫原性ペプチドに結合してもよい 。こうして脂質結合ペプチド（lipidated peptide）は、リポソームに取り込ま れたあるいはアジュバント中、例えば不完全フロイントアジュバント中で乳化さ れたミセルのかたちで直接に注射することができる。好ましい実施態様において 、特に効果的な免疫原は、Lysのαおよびεアミノ基に結合したパルミチン酸を 含み、それがリンクにより、例えばSer−Serで免疫原性ペプチドのアミノ端に結 合している。 CTL応答をプライミングする脂質の他の例としては、トリパルミトイル-Ｓ-グ リセリルシステイニルセリル-セリン（P₃CSS）Ｉのような大腸菌（E.coli）リポ タンパク質を適切なペプチドに共有結合させれば、ウイルス特異的なCTLをプラ イミングするために使用することができる。Deresら、Nature 342:561−564(198 9)を参照せよ。またこの文献は本明細書に含まれるものとする。本発明のペプチ ドは例えばP₃CSSとカップリングさせることができ、このリポペプチドを標的抗 原に対するCTL応答を特異的にプライミングするために個体に投与することがで きる。さらに、中和抗体の誘導も適当なエピトープを表示しているペプチドに結 合したP₃CSSでプライミングされるので、この２つの成分を組み合わせて感染に 対する液性および細胞媒介応答の両方をより効果的に引き起こすことができる。 これに加えて、ペプチドを互いに容易に結合できるように、担体または、より 大きなペプチドにカップリングするため、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理 的または化学的性質を修飾するため、あるいは、その他のため、追加のアミノ酸 をペプチドの末端に付加することができる。チロシン、システイン、リジン、グ ルタミン酸またはアスパラギン酸、その他のようなアミノ酸はペプチドまたはオ リゴペプチドのＣ末端あるいはＮ末端に導入することができる。ある場合にはＣ 末端における修飾はペプチドの結合特性を変えるかもしれない。加えて、ペプチ ドまたはオリゴペプチド配列は末端−ＮＨ₂アシル化、例えばアルカノイル（Ｃ₁ −Ｃ₂₀）またはチオグリコリルアセチル化、末端カルボキシルアミド化、例えば アンモニア、メチルアミン、その他、によって修飾されて天然の配列と異なって もよい。いくつかの場合には、これらの修飾は支持体または他の分子への結合部 位を提供するかもしれない。 本発明のペプチドは様々な方法で調製することができる。これらのペプチドは 比較的短いサイズのため、従来技法に従って溶液中または固相支持体上で合成す ることができる。種々の自動合成機が商業的に入手可能であり既知のプロトコル に従って使用することができる。例えば、StewartとYoung、Solid Phase Peptid e Synthesis,第２版、Pierce Chemical Co．(1984)上述の文献、を参照せよ。 また、組換えDNA技術を用いてもよく、注目している免疫原性ペプチドをコー ドする核酸配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に形質転換あるいは 軽質移入されて発現に適した条件下で培養される。これらの手順は、Sambrookら 、Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York(1982)に一般的に記載されているように、技術的に一 般に知られている。この文献は本明細書に含まれるものとする。従って、本発明 の１またはそれ以上のペプチド配列を含む融合タンパク質は適当なＴ細胞エピト ープを提示するために用いることができる。 ここで考えている長さのペプチドのコーディング配列は化学的技法、例えば、 Mattuecciら、J．Am．Chem．Soc．103:3185(1981)のリン酸トリエステル法によ り合成できるので、修飾は天然のペプチドをコードしている塩基を適当な塩基に 置換するだけで行なえる。次にこのコーディング配列は適当なリンカーをつけて 提供され、技術的に一般に入手できる発現ベクター中にライゲーションされて、 このベクターは求める融合タンパク質を産生させるために適当な宿主を形質転換 するために使用される。そのようなベクターと適切な宿主システムが現在は数多 く入手可能である。融合タンパク質の発現のために、コーディング配列は開始及 び停止コドン、プロモーターおよびターミネーター領域、および通常は複製シス テムが機能的に結合されて提供され、望みの細胞宿主中で発現させるための発現 ベクターが提供されるであろう。例えば、バクテリア宿主に適合するプロモータ ー配列が、望みのコーディング配列を挿入するために便利な制限酵素部位をもつ プラスミド中で提供されている。得られた発現ベクターは適切なバクテリア宿主 へ形質転換される。もちろん、適切なベクターと制御配列を用いて、酵母や哺乳 動物細胞宿主を用いてもよい。 本発明のペプチドおよび、本発明の医薬組成物およびワクチン組成物は哺乳動 物、特にヒトに投与して、ウイルス感染および癌を治療し、かつ／または予防す るために有用である。本発明の免疫原性ペプチドを用いて治療することができる 病気の例には、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、AIDS、腎癌、子宮頚癌、リンパ 腫、CMVおよび尖圭コンジローマが含まれる。加えて、本ペプチドはウイルス、 真菌および寄生虫感染のような感染症のかなり多くのものを治療するために使用 することができる。適切な抗原は、例えば、WO94/20127およびWO94/03205に開示 されている。 上述したように、本発明のペプチドは、ペプチド上のエピトープに特異的なCT Lと接触させるとCTL免疫応答を誘導する。しかながら、本ペプチドがCTLと接触 する様式は本発明に重要ではない。例えば、本ぺプチドはin viroあるいはin vi toroのいずれでも接触させることができる。接触がin vivoで起こる場合は、ペ プチド自体を患者に投与することもできるし、以下に記載するように、他のビヒ クル（例えば、１またはそれ以上のペプチドをコードするDNAベクター、ペプチ ドをコードするウイルスベクター、リポソームその他）を用いることもできる。 医薬組成物に関しては、免疫原性ペプチドまたはそれらをコードするDNAは既 に癌に苦しんでいる個体、または注目している病原体に感染している個体に投与 される。ペプチドまたはそれらをコードするDNAは個々に、または、ここで開示 されている１またはそれ以上のペプチド配列の融合体として投与することもでき る。 感染の潜伏期にある患者または急性期にある患者は免疫原性ペプチドで別個に 治療すること、または他の治療と共に、適切に治療することができる。治療的使 用においては、組成物はウイルスまたは腫瘍抗原に対して効果的なCTL応答を引 き起こすに充分で、症状および／または合併症を治療あるいは少なくとも部分的 に止めるのに充分な量で患者に投与される。これを達成するのに充分な量は「治 療効果用量」として定義される。この使用のために効果的な量は、例えば投与さ れる特定の組成物、投与の方法、治療される病気のステージと重篤性、患者の体 重と一般的な健康状態、および指示を出す医者の判断に依存するであろうが、一 般には初期免疫（すなわち治療または予防的投与のため）には70kgの患者に対 して約1.0μgから約5000μgのペプチドであり、続くブースト投与量は、患者の 血液中の特異的CTL活性を測定することにより患者の応答と状態に依存して１週 間から１か月にわたるブースト療法に従って約1.0μgから約1000μgのペプチド である。本発明のペプチドと組成物は通常、病気の重症な状態、すなわち命に危 険があるあるいは命に危険がある可能性がある状態で使用されるかもしれないこ とは覚えておかなければならない。そのような場合には、外来物質を最小限にす ること、およびペプチドが比較的無毒性であるという性質に照らして、これらの ペプチド組成物をかなり過剰に投与することが可能であり、治療する医師にとっ ても望ましく感じられるかもしれない。 治療的使用については、ウイルス感染の最初の徴候時に、または腫瘍の検出あ るいは外科的切除のときに、または急性感染の場合には診断の直後に投与するべ きである。これに続いて、少なくとも症状が実質的に和らぐまで、かつ、その後 暫くブースト投与する。慢性感染では、負荷量とそれに続くブースト投与量が必 要である。 本発明の組成物で感染個体を治療することは、急性感染した個体における感染 除去を早めるであろう。慢性感染になり易い（または、なりつつある）個体につ いては、本組成物は急性感染から慢性感染に発展することを防止する方法におい て特に有用である。例えばここで記載したように、感染前に、あるいは感染中に 、そうなりやすい個体が明らかになった場合には、本組成物はその人たちを標的 にすることができ大きな集団に対して投与する必要性を最小限にすることができ る。 本ペプチドあるいは他の組成物はまた、慢性感染の治療に用いることができ、 保因者の病原体感染細胞を除去するための免疫システムを刺激するために使用す ることができる。細胞障害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するに充分な製剤形で免 疫強化ペプチドの一定量、および、そうした投与形態を提供することは重要であ る。従って、慢性感染の治療のためには、代表的な投与量は70kgの患者への１回 の投与量あたり、約1.0μgから約5000μgの範囲であり、好ましくは約５μgから 1000μgである。免疫量に続くブースト投与量が特定した個体で必要なことがあ り、例えば１から４週間にわたることが必要なことがあり、個体を効果的に免疫 するにはおそらく更に長い時間が必要であろう。慢性感染の場合は、少なく とも臨床的症状あるいは試験室での検査によりウイルス感染が除去されるか本質 的に和らいだことが示されるまで、かつ、その後しばらく投与されるべきである 。 治療処置のための医薬組成物は、非経口的、局所的、経口的または局部的投与 を予定している。好ましくは、本医薬組成物は非経口的に、例えば、静脈内に、 皮下に、皮内に、または筋肉内に投与される。こうして、本発明は許容できる担 体、好ましくは水性担体中に溶解したあるいは懸濁した免疫原性ペプチドの溶液 を含む、非経口投与のための組成物を提供する。さまざまな水性担体、例えば、 水、緩衝化された水、0.8％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸その他を 用いてもよい。これらの組成物は従来からよく知られた滅菌技術によって滅菌さ れてもよく、あるいはフィルター滅菌されてもよい。生じた水性溶液はそのまま 使用のため包装されてもよく、あるいは凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥品は投 与の前に滅菌溶液と一緒にされる。本組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、張度調 整剤、湿潤剤その他、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウ ム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸ト リエタノールアミンその他のような、適当な生理学的条件に必要とされる製薬的 に許容できる補助物質を含んでいてもよい。 本発明のCTL刺激性ペプチドの医薬製剤中の濃度は幅広く変動しうるものであ り、すなわち、重量％にして、約0.1％より低いところから、通常約２％あるい は少なくとも約２％から、20％から50％までかそれ以上であり、選択した特定の 投与形態に従い、主として液量、粘度その他によって選ばれるであろう。 本発明のペプチドはリポソームによっても投与することができ、リポソームは このペプチドがリンパ組織のような特定の組織を標的とするように、または、感 染細胞を選択的に標的とするように働き、かつペプチド組成物の半減期を増大さ せるように働く。リポソームにはエマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単分 子層、液晶、リン脂質分散体、ラメラ層その他が含まれる。これらの調製物では デリバリーされるペプチドは、単独で、あるいは、例えばCD45抗原に結合するモ ノクローナル抗体のようなリンパ細胞で一般的なレセプターと結合する分子に結 合して、または治療用あるいは免疫原性組成物と結合して、リポソームの一部と して取り込まれる。従って、必要な本発明のペプチドで満たされた、または、 修飾されたリポソームはリンパ細胞の部位に向けることができ、そこでそのリポ ソームは選択した治療用／免疫原性ペプチドをデリバリーする。本発明で使用す るためのリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され、これには一般に中性 または負電荷を持つリン脂質およびコレステロールのようなステロールが含まれ る。脂質の選択は一般に例えばリポソームのサイズ、酸不安定性および血流中で のリポソームの安定性を考慮して定まる。Szokaら、An Rev．Biophys．Bioeng． 9:467(1980),米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、および 第5,019,369号に記載されているように、リポソームを調製するために種々の方 法が入手可能である。これらの文献は本明細書中に含まれるものとする。 免疫細胞を標的とするために、リポソームに取り込まれるべきリガンドには例 えば、望みの免疫系細胞の細胞表面抗原決定基に特異的な抗体あるいはその断片 が含まれる。ペプチドを含むリボソーム懸濁液は静脈内、局部的、局所的その他 に、投与方法、デリバリーされるペプチドおよび治療される病気のステージに特 に従って変動する用量で投与されてもよい。 固体組成物については、通常の非毒性固体担体を用いてもよく、それには例え ば医薬品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム 、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグ ネシウムその他が含まれる。経日投与のためには、従来列挙されている担体のよ うな通常使用されるなんらかの賦形剤を含むことにより、製薬的に許容できる非 毒性の組成物が形成され、その賦形剤は活性成分、すなわち本発明の１またはそ れ以上のペプチドの10〜95％であり、より好ましくは25％〜75％の濃度である。 エーロゾル投与のためには、免疫原性ペプチドは界面活性剤および噴霧剤とと もに細かく分かれた形で供給されるのが好ましい。ペプチドの典型的なパーセン テージは0.01重量％〜20重量％であり好ましくは１％〜10％である。界面活性剤 は、勿論非毒性でなければならず、噴霧剤に可溶であるのが好ましい。このよう な薬剤の例示としては、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、 ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸(olesteric acid)、お よびオレイン酸と脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのような、６か ら22の炭素原子を含む脂肪酸エステルまたは部分エステルが挙られる。混合 または天然グリセリドのような混合エステルを使用してもよい。界面活性剤は重 量で組成物の0.1〜20％、好ましくは0.25〜５％を構成するであろう。組成物の 残りは通常噴霧剤である。望みであれば、担体を含めることができ、例えば鼻腔 内デリバリのためにはレシチンを含めることができる。 他の特徴においては、本発明は本明細書に記載する１又はそれ以上の免疫原性 ペプチドを免疫原的に効果的な量で活性成分として含むワクチンに関する。この ペプチドは、それ自体の担体に結合して、または活性ペプチド単位のホモポリマ ーあるいはヘテロポリマーとしてヒトを含む宿主に導入される。そのようなポリ マーは免疫的反応が増強されるという利点があり、ポリマーを作成するために異 なるペプチドが使用されるためウイルスあるいは腫瘍細胞の種々の抗原決定基と 反応する抗体及び／又はCTLを誘導することがさらにできるという利点がある。 有用な担体は技術的によく知られており、例えば、チログロブリン、ヒト血清ア ルブミンのようなアルブミン、破傷風毒素、ポリ （リジン：グルタミン酸）の ようなポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型 肝炎ウイルス組換えワクチンその他が含まれる。ワクチンは水、リン酸緩衝生理 食塩水、または生理食塩水のような、生理学的に寛容な（許容できる）希釈剤を 含めることもでき、更に典型的にはアジュバントを含む。不完全フロイントアジ ュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのよう なアジュバントは技術的によく知られた物質である。また、上述したように、CT L応答は、本発明のペプチドをP₃CSSのような脂質に結合することによりプライミ ングできる。本明細書で記載したように、ペプチド組成物で注射、エーロゾル、 経口、経皮的、あるいは他の経路により免疫すると、宿主の免疫系は望みの抗原 に対して特異的なCTLを多量に作り出すことによってワクチンに応答し、宿主は その後の感染に対して少なくとも部分的に免疫を有し、あるいは慢性感染への発 展に対して耐性となる。 本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、ウイルス感染しやすいまたは癌に なりやすい患者、あるいは投与しなければその危険のある患者に投与され、抗原 に対する免疫応答を引き起こし、それにより患者自身の免疫応答能を増強する。 そのような量は、「免疫原的効果量」として定義される。こうした使用では、正 確な量はやはり患者の健康状態と体重、投与方法、製剤の性質その他に依存する が、一般には７０キログラムの患者に対して約1.0μgから約５０００μg、より 一般には70kgの体重あたり約10μgから約500μgである。 ある場合には、本発明のペプチドワクチンを、注目しているウイルスに対する 、特にウイルスエンヴェロープ抗原に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと 組み合わせるのが望ましいかもしれない。 治療または免疫目的のためには、本発明のペプチドはワクチニアや鶏痘のよう は弱毒化ウイルス宿主によって発現させることもできる。この手法には、本発明 のペプチドをコードする核酸配列を発現させるベクターとしてワクチニアウイル スを使用することが含まれる。急性または慢性感染した宿主あるいは悲感染の宿 主に導入すると、組換えワクチニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それ により宿主のCTL応答を引き起こす。免疫プロトコルに有用なワクチニアベクタ ーと方法は、例えば米国特許第4,722,848号に記載されており、この文献は本明 細書中に含まれるものとする。他のベクターはBCG（カルメット-ゲラン杆菌）で ある。BCGベクターはStoverら（Nature 351:456-460）に記載されており、これ は本明細書中に含まれるものとする。本発明のペプチドの治療用投与または免疫 に有用な他の多くの種々のベクター、例えば腸チフス菌(Salmonella Typhi)ベク ターその他は本明細書の記載から当業者には明らかであろう。 抗原性ペプチドもCTLをex vivoで誘導するために使用してもよい。生じたCTL は、他の通常の治療形態に応答しない患者、あるいはペプチドワクチン療法に応 答しないであろう患者において慢性感染（ウイルスまたはバクテリアの）または 腫瘍の治療に使用することができる。特定の病原体（感染性因子または腫瘍抗原 ）に対するex vjvo CTL応答は患者のCTL前駆細胞（CTLp）を抗原提示細胞（APC ）の供与源および適当な免疫原性ペプチドと一緒に組織培養でインキュベーショ ンすることによって誘導される。適当なインキュベーション期間(典型的には１ 〜４週間)、CTLpが活性化され成熟してエフェクターCTLに拡張する期間の後、細 胞は患者に再注入され、そこで特異的標的細胞（感染細胞または腫瘍細胞）を破 壊するであろう。 本発明の１またはそれ以上のペプチドをコードするDNAを患者に投与すること ができる。この方法は例えばWolffら、Science 247:1465-1468(1990)および米国 特許第5,580,859号および第5,589,466号に記載されている。 本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい方法は本発明の多エピ トープをコードするミニ遺伝子構築物（minigene constructs）を使用するもの である。ヒト細胞中で発現させるための、選択したCTLエピトープ（ミニ遺伝子 ）をコードするDNA配列を作成するために、そのエピトープのアミノ酸配列が逆 翻訳（reverse transtate）される。ヒトのコドン頻度表が各アミノ酸のコドン 選択を決めるのに使用される。これらのエピトープをコードするDNA配列は直接 結合され、連続したポリペプチド配列を作り出す。発現及び／又は免疫原性を最 適化するために、ミニ遺伝子設計中に付加的な断片を取り込むこともできる。逆 翻訳されてミニ遺伝子配列に取り込まれ得る配列には、ヘルパーＴリンパ球エピ トープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体滞留シグナルが含まれる。加 えて、CTLエピトープのMHC提示はCTLエピトープに隣接する合成配列（例えばポ リアラニン）または天然に存在する側方配列を含むことにより改良されるかもし れない。 ミニ遺伝子配列は、そのミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードする オリゴヌクレオチドをアッセンブリすることによってDNAに変換される。重複す るオリゴヌクレオチド（30〜100塩基の長さ）が合成され、リン酸化され、精製 されて、適当な条件下でよく知られた技術を用いてアニーリングされる。オリゴ ヌクレオチドの末端はT4 DNAリガーゼによって結合される。この合成ミニ遺伝 子は、CTLエピトープポリペプチドをコードしており、望みの発現ベクター中に クローニングすることができる。 当業者によく知られた標準的な制御配列が標的細胞中での発現を保証するため にベクターに含まれる。いくつかのベクター素片が必要とされる：ミニ遺伝子挿 入のために下流にクローニング部位を有するプロモータ；効率的な転写終結のた めのポリアデニル化シグナル；大腸菌での複製開始点；大腸菌用の選択マーカー (例えばアンピシリンまたはカナマイシン耐性)。この目的のためには多くのプロ モーターが使用可能であり、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（hCMV）プロモ ータが使用できる。他の適切なプロモーター配列については米国特許第5,580, 859号および第5,589,466号を参照せよ。 ミニ遺伝子の発現と免疫原性を最適化するために補助的なベクター修飾が必要 なことがある。ある場合には、効率的な遺伝子発現のためにイントロンが必要で あり、ミニ遺伝子の転写領域に１またはそれ以上の合成または天然のイントロン を含めることができる。ミニ遺伝子発現を増大させるためにmRNA安定化配列を含 めることも考慮される。DNAワクチンの免疫原性に関して免疫刺激配列（ISSまた はCpG）が重要な役割を果たすと最近言われている。免疫原性を増強するという ことが分かれば、これらの配列はベクター中、ミニ遺伝子コード配列の外側に含 めることができる。 いくつかの実施態様ではミニ遺伝子にコードされるエピトープと免疫原性を増 強しあるいは減少させるために含められた第２のタンパク質を産生することがで きるような、２シストロン性発現ベクター（bicistronic expression vector） を用いることができる。共発現された場合に免疫応答を有益に増強することがで きるタンパク質またはポリペプチドにはサイトカイン(例えばIL2、IL12、GM-CSF )、サイトカイン誘導分子（例えばLeIF）または共刺激性分子が含まれる。ヘル パー（HTL）エピトープは細胞内標的シグナルに結合することができ、CTLエピト ープとは別に発現される。これによりHTLエピトープをCTLエピトープと異なる細 胞区画に向かわせることができる。必要であれば、これによりHTLエピトープをM HCクラスII経路に、より効果的に入れることが容易になり、それによりCTL誘導 が増強される。CTL誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えばTGF-β）の共発現 による免疫応答の特異的減少がある種の病気では有益かもしれない。 発現ベクターが選ばれると、ミニ遺伝子はプロモーター下流のポリリンカー領 域にクローン化される。このプラスミドは適当な大腸菌株に形質転換され、DNA が標準的な技術を用いて調製される。ミニ遺伝子およびベクター中に含まれる他 の全ての要素の方向とDNA配列は制限酵素地図及びDNA配列解析を用いて確認され る。正しいプラスミドを有するバクテリア細胞はマスター細胞バンクとしておよ び作業用細胞バンクとして保存することができる。 プラスミドDNAの治療的量は大腸菌内での増殖により産生され、続いて精製さ れる。作業用細胞バンクから適当量を使用して（テリフィック培地（Terrific B roth）のような）増殖培地に植え、よく知られた技術により振盪フラスコまたは バイオリアクター中で飽和するまで増殖させる。プラスミドDNAはQuiagenから供 給される固相陰イオン交換樹脂のような標準的な分離技術を用いて精製すること ができる。必要であれば、ゲル電気泳動あるいは他の方法で超らせんDNAを開環 状および直線状型から単離することができる。 精製したプラスミドDNAはさまざまな製剤形を用いて注射用に調製することが できる。これらの最も簡単なものは、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中 で凍結乾燥DNAを再構成することである。この方法は「裸のDNA」として知られ、 現在臨床試験で筋肉内（IM）投与のために使用されている。ミニ遺伝子ワクチン の免疫治療的効果を最大にするために、精製したプラスミドDNAを製剤する別の 方法が望まれるかもしれない。種々の方法が述べられており、新しい技術が入手 可能になるかもしれない。この製剤には陽イオン脂質も用いることができる(例 えば、DebsとZhu(1993)WO93/24640；ManninoとGould-Fogerite(1988)BioTechniq ues6(7):682-691;Rose米国特許第5,279,833:Brigham(1991)WO91/06309;およびFe lgnerら、(1987)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413-7414に記載されているよ うに、これらを参照せよ)。加えて、糖脂質、融合性リポソーム、ペプチドおよ び保護的、相互作用的、非-凝集性（PINC）と言われる化合物を精製したプラス ミドDNAに混ぜることができ、安定性、筋肉内の分散性、または特定の器官また は細胞のタイプへの指向性（trafficking）のような変数に影響を与えることが できる。 核酸は例えば、米国特許第5,204,253号に記載されているようにバリスティッ クデリバリー（ballistic delivery）によって投与することもできる。DNAのみ を含む粒子を投与することができる。また、DNAは金粒子のような粒子に接着さ れうる。 ミニ遺伝子にコードされるCTLエピトープの発現およびMHCクラスＩ提示の機能 アッセイとして標的細胞の感作を利用することができる。プラスミドDNAは標準 的なCTLクロム放出アッセイの標的として適した哺乳動物細胞株に導入される。 使用する形質転換方法は最終的な製剤形に依存するであろう。エレクトロポレー ションは「裸の」DNAに使用することができ、一方陽イオン脂質は直接in vitro 形質転換を可能とする。緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現しているプラスミド は共形質転換することができ、これにより蛍光標識セルソーター（FACS）を用い て形質転換細胞を濃縮することができるようになる。これらの細胞は次にクロム 51ラベルされ、エピトープ特異的CTL株の標的細胞として使用される。⁵¹Cr放出 によって検出される細胞溶解はミニ遺伝子にコードされるCTLエピトープのMHC提 示が起こったことを示す。 In vivo免疫原性はミニ遺伝子DNA製剤の機能テストの第２のアプローチである 。適当なヒトMHC分子を発現しているトランスジェニックマウスがこのDNA産物で 免疫される。投与量と投与経路は製剤形依存性である(例えば、PBS中のDNAに対 してはIM、脂質混合DNAについてはIP)。免疫後21日に、脾細胞が集められ、テス トする各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激される。これ らのエフェクター細胞（CTL）は標準的な技術を用いて、ペプチド装荷クロム51 ラベル標的細胞の細胞溶解についてアッセイされる。ミニ遺伝子にコードされる エピトープに対応するペプチドを装荷したMHCによつて感作された標的細胞が溶 解することは、CTLのin vivo誘導に関するDNAワクチン機能を証明するものであ る。 本発明のペプチドは診断薬として使用できるかもしれない。例えば、本発明の ペプチドは、そのペプチドまたは関連するペプチドを用いる治療方式にたいする 特定個体の感受性を決定するために使用してもよく、それによって、今の治療プ ロトコルを修正するのに有用であるかも知れず、病気の個体の予後を決定するの に有用かもしれない。加えて、本ペプチドはどの患者が慢性感染へ発展する本質 的危険があるかを予測するために用いてもよい。 以下の実施例は説明のために提供されるものであり、限定するためではない。 実施例１ A3様スーパータイプ結合 この実施例は各A3様アレルA3、A11、A^*3101、A^*3301およびA^*6801の微細なモ チーフを提供するものであり、２次的アンカー結合特異性を概説する。このモチ ーフは、ペプチド配列に沿った各非-アンカー位置において、個々の化学的類 似性に従ってグループ分けした20種の一般的アミノ酸をそれぞれ有するペプチド の、平均相対結合能を計算することによって導かれた。 材料と方法 クラスＩ精製 以下のエプスタイン-バーウイルス（EBV）でトランスフォームされたホモ接合 細胞株をクラスＩ分子の供与源として使用した：GM3107（A3、B7；Human Geneti c Mutant Repository）；BVR（A11、B35.3、Cw4；Human Genetic Mutant Reposi tory）；SPACH(A31、B62、Cw1/3；ASHI Repository Collection)およびLWAGS（A^* 3301、B41、Cw8；ASHI Repository Coleection）(Bodmerら、Hum Immunol 43:1 49(1995))。Walter Storkus博士（Pittsburgh大学）によって特性が明らかにさ れたC1RトランスフェクタントをA^*6801の単離に使用した。細胞株は従来記載さ れているように維持した（Sidneyら、J．Immunol 154:247(1995);Setteら、Mol Immunol 31:813(1994))。 従来記載されているように（Sydenyら、J Immunol 154:247(1995)；Setteら、 Mol Immunol 31:813(1994)細胞可溶化物を調製し、クラスＩ分子を精製した。簡 単に言えば、１％NP-40（Fluka Biochemika,Buchs,Switzerland）を含む50mMTri s-HCl、pH8.5、150mM NaCl、5mM EDTAおよび2mM PMSF中で10⁸細胞/mlの濃度で細 胞を溶解した。この可溶化物を0.45μmのフィルターに通し、10,000gで20分間遠 心することにより核と細片を除去した。次に主要組織適合複合体（MHC）分子を アフィニティークロマトグラフィーで精製した。不活性化したセファロースCL4B およびプロテインＡセファロースのカラムを前段カラムとして使用した。抗HLA （B、C）抗体B1.23.2（Rebaiら、Tjssue Antigens 22:107(1983)）を結合したプ ロテインＡセファロースビーズに繰り返し通すことにより細胞可溶化物からHLA- BおよびHLA-Cを取り除いた。典型的には効果的な除去のためには通常２から４回 の通過が必要である。続いて、HLA-A分子を捕らえるため抗HLA（A、B、C、抗体W 6/32（Barnstableら、Cell 14:9(1978)）を用いた。タンパク質の純度、濃度、 および除去段階の効率はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に よって調べた。 結合アッセイおよびスパーモチーフの同定 放射ラベルした標準プローブペプチドの界面活性剤可溶化MHC分子に対する結 合の阻害に基づいて、可溶化クラスＩ分子に対するペプチドの結合能についての 定量的アッセイを、以前に記載されている様に行なった（Kuboら、J Immunol 15 2:3913(1994);Kastら、J Immunol 152:3904(1994);Sidneyら、J Immnunol 154:2 47(1995);Setteら、Mol Immunol 31:813(1994)；Ruppertら、Cell 74:929(1993) )。簡単に言うと、1〜10nMの放射ラベルしたプローブペプチド、これはクロラミ ンＴ法によってヨード化したものだが（Greenwoodら、Biochem J 89:114(1963)) 、これを１μMヒトβ₂−ミクログロブリン（Scripps Laboratories,San Diego,C A,USA）存在下に室温で種々の量のMHCおよびタンパク質阻害剤の混合液と共イン キュベーションした。２日間のインキュベーション期間の終了後、TSK2000カラ ムによるサイズ排除ゲル濾過クロマトグラフィーによってMHC-結合放射活性のパ ーセンテージを測定した。 A3CON1ペプチド（配列KVFPYALINK）（Kuboら、J Immunol 152:3913(1994)）は A3、A11、A31およびA^*6801アッセイのための放射ラベルプローブとして使用した 。HBVc141-151（配列STLPETYVVRR）のＴ₇−Ｙアナログ（Missaleら、J Exp Med 177:751(1993)）をA^*3301アッセイのための放射ラベルプローブとして使用した 。競合アッセイにおいて、放射ラベルしたプローブペプチドの結合の50％阻害を 起こすペプチド濃度（IC50）を計算した。通常、ペプチドは１回又は２回高濃度 でテストし、続く実験において必要に応じて更に２から６回希釈して、正の阻害 を引き起こすペプチドのIC50を決定した。放射ラベルしたプローブペプチドのほ ぼ15％の結合を起こすMHC濃度を全ての競合阻害アッセイにおいて使用した。こ うした条件下では、（ラベル）＜（MHC）でありIC50＞（MHC）であるため、測定 したIC50は真のk_D値の合理的な近似値である。各競合ペプチドは、完全に独立し た２から４回の実験でテストした。正の対照としては、各実験において、放射ラ ベルプローブに関連する未ラベル版をテストし、そのIC50を測定した。A3、A11 、A31およびA^*6801アッセイについてのA3CON1の平均IC50は各々、11、６、18お よび8nMであった。A^*3301アッセイにおけるHBVc141-151ペプチドは29nMであった 。 HLA-A特異的２次アンカーモチーフの明確化 A*0201の２次的アンカーモチーフを明らかにするためにRuppertらによって用 いられた方法（Ruppertら、Cell 74:929(1993)）を修正した。簡単に言うと、9m er配列の各非アンカー位置における20種の一般的に存在するアミノ酸の、HLA結 合に与える効果を評価することによって、アレル特異的２次アンカーモチーフを 決定した。評価は、各位置のアミノ酸の組み合わせ（例えば、位置１、アラニン ；位置２、アラニンなど）について平均相対結合値を計算することによって行な った。あるアミノ酸が低頻度であるという問題を克服するため、いくつかの残基 を、以前に記載されているように（Ruppertら、Cell 74:929(1993)）他の類似の 性質を持つものと共にグループ分けした。200のペプチド集合全体の平均結合能 よりも４倍高い（あるいは低い）平均結合能を有する、特定の位置に関する残基 のタイプは、高（低）結合能に関するものと考えられる。 ペプチド合成 ペプチドは以前に記載されているように（Ruppertら、Cell 74:929(1993)）合 成したかまたはChiron Mimotopes（Chiron Corp.、Australia）から粗精製物と して購入した。合成したペプチドは逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）に よって＞95％の均一性にまで精製した。これらのペプチドの純度は分析用逆相カ ラムでアッセイしその構成成分はアミノ酸解析、シーケンシング、及び／又は質 量分析解析によって確かめた。 いろいろな民族的背景におけるHLAスーパータイプの表現型頻度の計算 および推定される人口割合（projected population coverage） 各HLAアレルの遺伝子頻度は抗原又はアレル頻度(Imanishiら、Proceedings of the Eleventh International Histocompatibility Wrkshop and Conference, ol 33:163(1992))から、２項分布式gf=1−(SQRT(1-af))を用いて計算した(Tiwar iら、The HLA complex，In:HLA and Djsease Associates，NY，Springer-Verlag (1985))。全体の表現型頻度を得るために、累積遺伝子頻度を計算し、逆関数 式（af=1−(1-Cgf)²）を用いて抗原頻度を導いた。以下で議論するように、頻度 データはDNAタイピングレベルで得たものではなく、血清学的に明らかにした抗 原頻度との一致が仮定されている。推定される全体の人口割合を得るために、連 鎖不平衡は仮定せず各スーパータイプに属すると確認されるアレルのみを含めた (最小評価値)。遺伝子座間組換えによって起こる、推定される全体の割合の評価 は、Ｂアレルによってカバーされると考え得る非Ａ範囲の集団の割合をＡの割合 に加えることによっておこなった(例えば、全体＝A+B^*(1-A))。A3系列スーパー タイプの確認されているメンバーはA3、A11、A31、A^*3301およびA^*6801である。A 3様スーパータイプはA32、A66およびA^*7401を含む可能性があるが、これらのア レルは全体の頻度計算には含めなかった。同様に、A2様スーパータイプファミリ ーの確立したメンバーは、A^*0201、A^*0202、A^*0203、A^*0204、A^*0205、A^*0206、 A^*6802、およびA^*6901(またA^*3001もありうる)。最後に、確認されているB7様ス ーパータイプアレルは、B7、B^*3501-3、B51、B^*5301、B^*5401、B^*5501-2、B^*560 1、B^*6701、およびB^*7801(またB^*1401、B^*3504-06、B^*4201およびB^*5602もあり える)。 結果 種々のHLAアレルのペプチド結合ポケットの構造解析 上述したように、HLA分子A3、A11およびA*6801は、位置２に小さなまたは疎水 性残基と正電荷のＣ末端を持つリガンドに対する特異性と関連していることが従 来の研究で示されている(Kuboら、J Immmunol 152:3913(1994);Guoら、Nature 3 60:364(1994);Falkら、Immunogenetics 40:238(1994)；Dibrinoら、J Immunol 1 51:5930(1993)；DiBrinoら、Proc Natl Acad Sci USA 90:1508(1993);Zhangら、 Proc Natl Acad Sci USA 90:2217(1993);Setteら、Mol Immunol 31:813(1994)) 。我々は、これらのリガンド特異性に関する一見した類似性に対して推定される 構造的基礎をより詳細に評価することにした。この目的のため、免疫原性ペプチ ドの位置２およびＣ末端の残基の側鎖が種々のHLAクラスＩ分子のＢおよびＦポ ケットを構成する残基と接触することが知られているので(Maddenら、Cell 75:6 93(1993);Saperら、J Mol Biol 219:277(1991))、これらの多様なポ ケットを構成する残基を種々のHLAクラスＩ分子について表にした。ペプチドリ ガンドの位置２の小さいまたは疎水性残基を認識することが知られているHLAタ イプ（例えば、A^*0101、A^*0201、A^*0301、A^*1101、A^*6801およびA^*6802）および Ｃ末端に正電荷を持つ残基を認識することが知られているHLAタイプ（例えば、A^* 0301、A^*1101、A^*6801およびB^*2705）はある種の鍵となる構造的性質を共通に している。より詳しくは、HLA分子の位置２の小さいまたは疎水性残基を結合す るHLA分子は位置45および67に脂肪族残基（MまたはV）を有し、NおよびK、ある いはHおよびQのような水素結合形成性残基をそれぞれ位置67および70に有してい る。これらの分子は全て位置99にY残基を有している。これに対して異なる結合 特異性を示すクラスＩ分子はこれらの位置の１またはそれ以上が異なっている。 同様に、正電荷を持つＣ末端に優先的であるクラスＩ分子のみがD、T、LおよびD をそれぞれ位置77、80、81および116に有している。結論として、この解析によ り、HLAクラスＩ分子の組（A3、A11およびA^*6801）はそのＢおよびＦポケットに おいてある種の鍵となる構造的性質を共通にしており、位置２の小さい、または 疎水性残基とＣ末端の正電荷の残基によって特徴づけられる共通のペプチドリガ ンドモチーフを有していることが示された。ここで、我々はこれらのHLAクラス Ｉ分子を仮にA3様スーパータイプの一部と称し、対応するモチーフをA3様スーパ ーモチーフと称することにする。 モチーフが不明なクラスＩ分子の解析の結果、A^*3101、A^*3301、A^*3401、A^*66 01およびA^*7401もＢおよびＦポケットにこれらの同じ保存配列を共通に持つこと が明らかになった。従ってこれらの分子はA3様スーパータイプの一部であること が予測された。最近のデータ（Falkら、Immunogenetics 40:238(1994)）はA31お よびA33が実際A3お様ペプチドモチーフによって特徴づけられることを独立に示 している。 A3-様分子はオーバーラップする主要アンカー特異性およびペプチド結合 レパトワールを示す 最も頻度の高いA3様分子のいくつか（A3、A11、A31、A^*3301およびA^*6801） によって認識されるモチーフの範囲を比較するために、これらの分子の主要アン カー（位置２およびＣ末端）結合特異性についてのより詳細な分子的解析を行な つた。放射ラベルプローブペプチドのアフィニティー精製HLAクラスＩ分子に対 する結合を阻害する、未ラベルの合成ペプチドの能力を測定したA3-およびA11- 特異的ペプチド結合アッセイが、以前に記載されている(Kuboら、J Immunol 152 :3913(1994);Kastら、J Immunol 152:3904(1994)；Setteら、Mol Immunol 31:81 3(1994))。A31、A^*3301およびA^*6801に特異的な結合アッセイは同様な手法を用い て開発された(Kuboら、J Immunol 152:3913(1994);Kastら、J Immunol 152:3904 (1994)；del Guercioら、J Immunol 154:685(1995)；Sidneyら、J Immunol 154: 247(1995);Setteら、Mol Immunol 31:813(1994)；Ruppertら、Cell 74:929(1993 ))。 続いてA3様分子の主要アンカー特異性を、プロトタイプポリ-AペプチドAXAAAA AAXの位置２または位置９における置換を含むペプチドの一団を、A3、A11、A31 、A^*3301およびA^*6801に対する阻害能についてテストすることによって調ベた。 各分子はそれぞれ特有の優先性を示したが、考慮した例の大部分において、位置 ２がＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＶのいずれかで占められ、Ｃ末端がＲまたは Ｋの何れかである場合に顕著な結合性が得られた。これらのデータは、我々（Ku boら、J Immunol 152:3913(1994)）および他の者（Falkら、Immnunogenetics 40 :238(1994);Dibrinoら、J Immunol 151:5930(1993);DiBrinoら、Proc Natl Acad Sci USA 90:1508(1993)）によって得られたプールシーケンシングデータとよく 一致し、A31、A^*3301，およびA^*6801の場合に主要アンカーモチーフの定義を拡 張する。結論として、これらのデータはA3様主要アンカースーパーモチーフは位 置２のA，Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、またはＶおよびＣ末端のＲあるいはＫによって 定義できることを示唆している。 A3様分子オーバーラップするペプチド結合レパトワールを共有する 次にA3様スーパータイプ主要アンカーモチーフがA3様スーパータイプ分子の中 で許される縮退結合の程度を調べた。第２位置にＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔまたは Ｖの残基を有し第９位置にＫまたはＲを有する200種類の天然に存在する９merペ プチド配列の組を集めた。それぞれの潜在的なアンカーの組み合わせは個々 のアミノ酸の天然の頻度に比例して表されるべきだという制約とは別に、この組 を含むペプチドはウイルスおよび腫瘍抗原配列からランダムに選んだ。各ペプチ ドを精製したA3、A11、A31、A^*3301およびA^*6801分子への結合能についてテスト すると、各アレル型に関連する特有の結合パターンが明らかになった(データは 示していない）。例えば、ある種のペプチドは選択的で唯ひとつのクラスＩタイ プにしか結合しないが、一方ある種の他のペプチドはかなり広範囲に交差反応し 、調べた分子の４または５種に結合した。 一般に、任意の与えられたアレルに対して、ペプチド-HLAの組み合わせの約10 ％（5％〜16％）は強い結合（IC50≦50nM）と関連し約17％（11％〜24％）が中 間的結合（IC50 50〜500nM）と関連していることが分かった。これらの高結合 および中間的結合の頻度はA^*0201モチーフ含有ペプチドプールシーケンシングに ついて以前に述べられていたことと似ている(Ruppertら、Cell 74:929(1993))。 しかしながら最も注目に値するのは観察されたかなり高い交差反応性である。少 なくとも１つのA3様分子に結合しうる127のペプチドのうち、その43（34％）がA 3様スーパータイプ分子の３種かそれ以上と結合した。４種のペプチドはテスト した５種のA3様分子の全てに結合した。これに比較して、関連のない５種のクラ スＩ分子（A^*0101、A3、A24およびB7）に対する結合を調べた39のペプチドから なる集団では僅かに３種（８％）が２種の分子に結合し、３種又はそれ以上の分 子に結合するものはなかった。テストした５種のA3様分子のうち少なくとも４種 に対して高結合体または中間的結合体として同定されたぺプチドを表２に列挙し た。表中、強い結合能または中間的結合能はIC50≦500nMとして定義され、網掛 けして強調した。まとめると、これらのデータはA3様スーパータイプ分子の結合 レパトワールにはかなりの重なりがあることを示し、A3様スーパータイプ主要ア ンカーモチーフの確認となるものである。 A3様スーパーモチーフは潜在的なペプチドリガンドに対する縮退性を与 える２次アンカー残基を明らかにする 上に述べたように、A3様スーパータイプ分子の結合レパトワールの重なりはか なりなものであるが、完全には程遠い；各A3様分子はまたかなりの程度の特異性 を維持していもいる。観察される交差反応性の基礎を理解するため、A3様 スーパータイプの縮退と関連し、A3様縮退結合体を予測するのに有用であり得る ペプチドリガンドの性質を説明するであろうA3様スーパーモチーフを明らかにす ることを試みた。 まず、ここで解析したA3様アレル（A3、A11、A31、A^*3301およびA^*6801）の微 細な各モチーフを、２次的アンカー結合特異性の概略とともに、材料と方法で説 明したように導いた。この方法はA*0201の微細なモチーフを明らかにするために 以前に用いられたものと似ている(Ruppertら、Cell 74:929(1993))。このモチー フは、ペプチド配列に沿った各非アンカー位置において、個々の化学的類似性に 従ってグループ分けした20種の一般的なアミノ酸の各々を有するペプチドの平均 相対結合能を計算することによって導いた。この手順によって得られたデータの 代表例として、A3についての計算値を表3Aに示した。これを例として、続いて、 その配列の第３位置に芳香族残基（Ｆ，Ｗ、Ｙ）を有する異なる21種のペプチド をテストした。これらのペプチドはA3に対して、200種のペプチドの組の全体平 均よりも31.7倍高い相対結合能を有していた。A*0201の場合に以前に記載された ことと同様に、優先的及び阻害的残基を、それぞれ全体平均よりも４倍強い、あ るいは４倍低い結合能と関連する残基として定義した。これに従って、位置３に おける芳香族残基はA3結合について「優先的」残基であると考えられた。 同様な解析を各アレル（A3、A11、A31、A^*3301）について行い、各位置に対す るアレル特異的２次アンカー要求性の地図を作るのに使用した(表３Ｂ−Ｅ)。調 べたA3様スーパータイプの各アレルについて得られた修正モチーフの概略を図１ に示した。各分子は自身の特有の２次アンカー要求性を示した。例えば位置４の 正電荷を持つ残基（Ｒ、Ｈ、Ｋ）はA3で優先的であったが、他のいずれのA3様分 子ではそうではなかった。同様に位置８ではグリシン（Ｇ）はA11についてのみ 低い結合能と関連しており、一方、負電荷を持つもの（Ｄ、Ｅ）はA31について のみ阻害的であった。これらの固有のアレル特異的性質を別にして、ある種の残 基はA3スーパータイプの分子の大部分において低い結合性あるいは強い結合性の いずれかに関連していた。例えば、位置１のプロリン（Ｐ）はテストした５種全 てのA3様分子に阻害的であった。位置７の芳香族残基（Ｆ，Ｗ、Ｙ）および位置 ８のプロリンはテストした５種の分子の４種に優先的であった(図１）。 個々のいろいろな微細モチーフに基づいて、A3様スーパーモチーフを構築した 。考慮した５種のアレルのうち少なくとも３種に阻害的である残基はそのスーパ ーモチーフおいて阻害的な残基であると定義した。これに対して、考慮した５種 のアレルの少なくとも３種に優先的であって、かつどのアレルについても阻害的 でない残基は優先的残基として定義した。この手法に従って導かれたA3様スーパ ーモチーフは図２に示した。 高交差反応ペプチドの予測におけるA3スーパーモチーフの効力テスト 上で定義したA3様スーパーモチーフの妥当性をテストするために、前のスーパ ーモチーフの解析には含まれていない１０８種のペプチドからなる追加の組をA3 、A11、A31、A^*3301およびA^*6801への結合についてテストした。この組は少なく とも１つの優先的スーパーモチーフ残基を有し、かつ阻害的残基をもたない（ス ーパーモチーフ陽性の）30種のペプチド、少なくとも１種の阻害的残基を有する （スーパーモチーフ陰性）43種のペプチド、優先的残基も阻害的残基も有しない 35種のペプチド（スーパーモチーフ中立）を含んでいた。30種のスーパーモチー フ陽性ペプチドのうち27種（90％）が２種またはそれ以上のA3様分子に結合し16 種（53％）が３種またはそれ以上の分子に結合した。これに対し て、35種のスーパーモチーフ中立ペプチドのうち18種（51％）が２種又はそれ以 上のA3タイプと結合し８種（23％）が３種又はそれ以上の分子と結合した。最後 に、スーパーモチーフ陰性ペプチドは多アレル結合に関して、より能力が低く、 ６種（14％）が２種のA3様分子に結合し、３種またはそれ以上の分子に結合する ペプチドはなかった。これらの結果は、スーパーモチーフの定義するのに用いた 元のペプチドに対して同じタイプの解析を行った場合と定性的に類似しており、 元の拘束されている素片以外のアレルには少数のペプチド（８％）のみが結合す るという、無関係のHLAアレルへ結合させた、前に述べた対照ペプチドの組の場 合に観察された交差反応レベルと非常に対照的である。A3様スーパーモチーフの 有効性を示すために用いたペプチドの組から、テストした５種のA3様分子のうち 少なくとも４種に高アフィニティーまたは中間的アフィニティーで結合するペプ チドをさらに10種同定した(表２Ｂ)。 全ての主要な民族集団においてHLAスーパータイプの高い表現型頻度が 保存されている 一般のHLAスーパータイプ、特にA3様スーパータイプの潜在的適切性を評価す るために、種々のHLAクラスＩアレル又は抗原の発生率を調べた。これまで、HLA -AおよびHLA-Bの手に入る人口データの大部分は血清学的タイピングに基づいて いた。これらのデータはDNA配列によって定義されるアレルのレベルでの解答を 与えるものでなく、従って、サブタイプ間の区別が出来ない。しかしながら、ペ プチドの結合の検討(del Guercioら、J Immunol 154:685(1995)；Tanigakiら、H um Immunol 39:155(1994))、プールシーケンシング(pool sequencing)解 ol 22:2453(1992)）あるいは１次配列に基づくポケット構造の解析を通してサブ タイプのペプチド結合特異性を比較すると、ほとんどの場合にサブタイプは、同 一ではないにしろ、類似のペプチド主要アンカー特異性を有しているであろうこ とが示唆される。従って、以後の解析においては、DNAサブタイプレベルの人口 データが入手できなくても、結合データ、公表されたモチーフあるいは配列解析 によりサブタイプはオーバーラップするペプチド結合特異性を有するであろうこ とが示唆されるので、サブタイプアレルと血清学的に定義された抗原との間に１ 対１の相関があると仮定した。 異なる民族的背景における種々のA3様アレルまたは抗原の発生率を調べると、 個々のそれぞれのアレルまたは抗原の頻度は民族間で大きく変動し得る一方(Ima nishiら、Proceedings of the Eleventh International Histocompatibility Wo rkshop and Conference第１巻、Tokyo，Oxford University Press(1992))、５種 のA3様アレルの累積頻度は驚くほど一定である（37％から53％の範囲）ことが明 らかになった。例えば、A3は白人、北米黒人、スペイン人では一般的だが、日本 人にはほとんど存在しない。これに対してA31は日本人ではよく見られが、白人 と北米黒人では希である。対照的に、調べた５つの民族集団のそれぞれにおいて A3様スーパータイプはそれぞれの少なくとも37％、かつ53％程度まで存在した。 このような情況で、我々が最近A2様スーパータイプ（del Guercioら、J Immun ol 154:685(1995)およびB7様スーパータイプ（Sidneyら、J Immunol 154:247(19 95)）の存在を報告したように、A3様スーパータイプの存在は孤立した事象では ない。これらの更なるスーパータイプのそれぞれも顕著で、異なる民族的背景間 でかなり保存された累積頻度（40％から60％の範囲）を示す。実際、現在存在し ているHLA-Aまたは-B遺伝子の全コピーの少なくとも半分は遺伝子レベルでこれ らの３つのスーパータイプの１つに属するように思えることが容易に計算できる 。 考察 ここに提示したデータは少なくとも５種の異なるHLAアレル（A3、A11A、A31、 A^*3301およびA^*6801）の産物および、おそらくポケット解析に基づいて予測され る少なくとも３種の他のもの（A^*3401、A^*6601、およびA^*7401）の産物は単一の 機能的A3様スーパータイプにグループ分けされ得ることを示すものである。これ は多くの観察から決定されたものである。一つのグループとして、これらの分子 は（ａ）ペプチドの結合領域内に、ある種の鍵となる構造を共通にし、（ｂ）そ の主要アンカー残基について類似の優先性を有し、かつ（ｃ）大きくオーバーラ ップする結合レパトワールを共通にもつ。ペプチドの大集団の結合活性をそれ らのアレル分子に優先的であるアンカー残基をたたきつぶしながら調べることに より、A3様スーパーモチーフも同定した。このスーパーモチーフは、A3様スーパ ータイプ分子の２次アンカー要求性の詳細な地図に基づくものであり、このモチ ーフによりA3様縮退結合ペプチドを効率的に予測できる。最後に、A3様スーパー タイプ、およびスーパータイプ一般、は全ての主な民族集団において驚くほど高 い表現型頻度で現れていることが示された。このように、ペプチドの結合特異性 に基づくHLAクラスＩスーパータイプはHLAクラスＩ分子間の関係を理解するため の、血清学的および系統学的分類に役に立つもう一つの方法を示すものである。 A3様スーパーモチーフを作る用途以外に、本研究において開示した個々の２次 的アンカー地図はそれ自体クラスＩ分子に対するペプチドの結合の理解に大きく 貢献するものである。これらの地図は均一なサイズのペプチドを用いて導かれて いるため、各２次的位置における優先性の決定は、天然にプロセッシングされた ペプチドプールの配列から導かれるものよりも正確かもしれない。また、ここで 明らかにしたモチーフによりペプチドの結合に阻害的な効果を有する残基を決定 できる。 Barberとその共同研究者（Barberら、Curr Biol 5:179(1995)）は、我々がＨL A-B7様スーパータイプに含めた２つの分子と関連してペプチドが認識され得るこ とを示し、かつ、２つの他のペプチドが１より多くのA3様アレルとの関連で認識 されることが報告されている（Missaleら、J Exp Med 177:751(1993);Koenigら 、J Immunol 145:127(1990)；Culmannら、J Immunol 146:1560(1991)）(表４を 参照せよ)。１次CTLをin vitroで誘導する方法（Wentworthら、Mol Immunol 32: 603(1995)）を用いて、我々はペプチドがA3およびA11の双方との関連で認識され うる場合をいくつか観察した。我々はA3様スーパータイプに拘束されたエピトー プのA3様スーパータイプ分子に対する結合能を調べ、かなり高度の縮退に気がつ いた。表４に掲げた７種のエピトープの中で、一つだけが図2Aで提唱されている スーパーモチーフについて解析できるノナマーである(９merより長いペプチドに スーパーモチーフを拡張する将来の研究が予定されている)。このペプチドはス ーパーモチーフ陽性であり、５種のA3様分子のうちの３種に 結合した。それでもなお各エピトープがA3様スーパータイプ主要アンカー特異性 に従ったということは重要である。 我々がペプチド結合性に基づいて提唱したスーパータイプ分類をDNA配列（お よび血清学的反応性）に基づく分類（Ishikawaら、Hum Immunol 39:220(1994);F irgairaら、Immunogenetics 40:445(1994)；Karoら、J Immunol 143:3371(1989) ）と比較すると、類似点および相違点が明らかになる。例えば、HLA-A3およびA1 1は密接に関係し共通の祖先遺伝子に由来するように見える(48-50)。しかしなが ら、A31およびA33はA2/A10/A19グループを含む祖先系統に由来し、それはA3およ びA1の系統と異なる。最後に、LHA-A^*6901はA28 HLA進化系統グ Hum Immunol 39:220(1994)；Lawlorら、Annu rev Immunol 8:23(1990)]、このグ ループはHLA-A^*6802およびHLA-A^*6901アレルも含んでいる。さらに、そのペプチ ドの結合特異性に基づけばHLA A^*6801はA3様スーパータイプのメンバーだが、一 方A^*6802およびA^*6901はA2様スーパータイプに属することが示されている[del G uercioら、J Immunol 154:685(1995)]。従って、入手できるHLA遺伝子の系統樹 ［Ishikawaら、Hum Immunol 39:220(1994)；Figairaら、Immunogenetics 40:445 (1994)；Karoら、J Immunol 143:3371(1989)］に基づくと、A3様アレルは両方の HLA祖先系統に見られる：A3およびA11を含むA1/A9、およびA31、A33およびA^*680 1を含むA2/A10/A19である。HLA-A3様スーパータイプの存在が共通の祖先を反映 するものであるなら、A3様モチーフは事実上原始的なヒトHLAクラスＩペプチド の結合特異性を示すものかもしれず、他の特異性は変化する病原体環境への適応 を表すものかもしれない。 しかしながら、これらの観察により、集団レベルで、共通の祖先あるいは収斂 性の進化によつて作り出される種々のHLAクラスＩスーパータイプアレルを高頻 度に維持することには選択的な利点が存在するかもしれないという興味深い可能 性がでてくる。この利点というのは集団レベルで効果的なペプチド結合レパトワ ールを作り出すことに関係しているかもしれない。この所見は同じ系統ファミリ ーの異なる分子が異なる結合スーパーファミリーに属しうるという事実から明ら かである。これらの現象は一部には、疎水性、芳香族性、あるいは正電荷を持つ Ｃ末端のようなある種の配列上の特徴を有するペプチドを優先的に輸送すること で知られているヒトの抗原プロセッシング分子と関連するトランスポーター（TA P）（Androlewiczら、Proc Nat1 Acad Sci USA 90:9130(1993);Androlewicazら 、Immunity 1:7(1994)；van Endertら、Immunity 1:491(1994)；Heemelsら、Imm nunity 1:775(1994)；Momburgら，Curr Opin Immunol 6:32(1994);Neefjesら、S cience 261:769(1993)）のペプチド特異性の最適利用と関係するものかも知れな い。我々のグループとの共同によるvan Endertとその同僚によって行われた最近 の研究では、広範囲のペプチドコレクションについてTAPに対する相対アフィニ ティーが評価され、拡張されたTAP結合モチーフが記述されている。驚くべきこ とに、このモチーフは、ノナマーペプチドの位置３および７における芳香族残基 に対する優先性および位置１および３における負の電荷を持つ残基が存在しない こと、および位置１のＰのような、A3様スーパーモチーフと関連する構造的特徴 の多くを含んでいる。 本明細書で示した実験的証拠に基づくと、血清学的または系統発生論的関連性 に基づく分類に加えて、HLAクラスＩアレルはまたそのリガンド特異性に基づい てスーパータイプに（再）分類することができる。３つのスーパータイプ、A2様 、A3様およびB7様スーパータイプが現在同定されており、B44様スーパータイプ のような他のスーパータイプが文献から示唆されている(Fleischerら、Tissue A ntigen 44:311(1994)；Harrisら、J Immunol 151:5966(1993)；Thorpeら、Immun ogenetjcs 40:303(1994);Falkら、Immunogenetics 41:162(1994);Falkら、Immun ogenetics 41:165(1994))。いくつのスーパータイプが同定されるのか、および それらがどの程度包括的なのかは未知のままだが、入手できるデータは、HL AクラスIIに限られると以前は考えられていた(Panina-Bordignonら、Eur J Immu nol 19:2237(1989);O'Sullivanら、J Immunol 145:1799(1990)；Buschら、Int I mmunol 2:443(1990))ペプチドの結合特異性の縮退という現象はHLAクラスＩに対 するペプチドの結合の特徴でもあるということを証明している。HLA Iスーパー タイプが生ずる理由がなんであれ、それらの潜在的実用的適切さは強調されるべ きである。定量的結合アッセイができること、および詳しいスーパーモチーフに より高交差反応性ペプチドの同定が可能になるに違いない。次には、これにより 少数のCTLエピトープ混合物で広範囲の集団をカバーすることができ、これはワ クチン開発のためのペプチドベースの研究の利用性について非常に重要になりう る(Vitielloら、J Clin Invest 95:341(1995))。 実施例２ B7様スーパータイプ結合性 従来の研究において（Sidneyら、J．Immunol.，154，247-259(1995);Hillら、 Nature 360，434-439(1992);Falkら、Immunogenetics 38，161−162(1993b); 58(1995))HLAＢ特異性のかなり大きなファミリーが、B7様結合スーパータイプと して集合的に定義され、共通のペプチド結合モチーフ（位置２のＰおよびＣ末端 の疎水性および芳香族残基）によって特徴づけられることが示された。この実施 例では、最も頻度の高い５種のB7様アレル（B^*0702、B^*3501、B51、B^*5301およ びB^*5401）の主要アンカー（位置２およびＣ末端）を詳しく調べるために上述し た分子結合アッセイを用いる。 これを行うために、FHV nef 84-92ペプチド（配列FPVRPQVPL）の単一置換アナ ログの一団を合成し結合についてテストした。HIV nef 84-92はB^*0702、B^*3501 、B51、B^*5301およびB^*5401と高アフィニティー（IC50≦50nM）または中間的ア フィニティー（IC50 50-500nM）で結合する。B7様スーパータイプ分子は位置２ 特異性を共通とし、かなり厳密であることが分かった。５つのアレル全てについ て、プロリンは優先的残基であった。唯一つの例外を除いて（B^*3501の場合のA ）、位置に２についてテストした置換の全ては、親ペプチドのＣ末端アン カープロリン含有物に比較した結合アフィニティーの１０倍以上の減少と結びつ いていた。これに対して、結合特異性を解析すると、各HLA-BタイプはＣ末端に ついてかなり特有の特異性パターンを示した。例えば、B^*0702はＭ，ＦおよびＬ に優先的であり、一方B^*5101はＬ、ＩおよびＶに優先的であった。こうした相違 にもかかわらず、全体的なＣ末端特異性パターンはかなりの程度の重なり合いを 示した。脂肪族残基ＩおよびＶは５種の分子のうち少なくとも４種で優先的であ り、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、およびＷはこれらの例の大部分で優先的または許容的であ った。ＹまたはＴのような他の残基は僅かな例でのみ許容的であり、一方、いく つか（例えばＫまたはＤ）は全然許容的ではなかった。 主要アンカー特異性に関するこのデータはSideneyら、J．Immunol.,154,247-2 59(1995)に開示されていることとよく一致する。縮退B7様スーパータイプ結合し 得るペプチドは位置２にプロリンを有しＣ末端に疎水性あるいは芳香族残基（Ｖ ，Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ａ）を有していなければならない。B7様スーパータイプ 主要アンカーモチーフの形式上の定義において、われわれは、あまり縮退してい ないが、Ｙも消極的ながら含めることとする。なぜなら、ＹはB^*501のプールシ ーケンシング解析（Hillら、Nature 360,434-439(1992)；Falkら、Imm 995))において主要なシグナルを構成するからである。要約すると、B7様スーパ ータイプの主要アンカーモチーフは位置２のＰ、およびＣ末端のＡ、Ｉ、Ｌ、Ｍ 、Ｖ、Ｆ、ＷおよびＹで定義される。 B7様スーパータイプリガンドに優先的なサイズ クラスＩ分子は、長いペプチドも結合することが知られているものの（Masale ら、J．Exp．Med．177:751(1993)；Chenら、J．Immunol．152:2874(1994)；Coll insら、Nature 371:626(1994)）長さが８から１０残基のペプチドに通常優先的 である(Falkら、Nature 351，290-296(1991))。B7様スーパータイプに最適なペ プチド長を決定するために、天然に存在するウイルス、腫瘍あるいはバクテリア の配列、かつ、それぞれが上述したB7様スーパータイプ主要アンカー特異性を表 す８mer、９mer、10mer、および11merのペプチドの集団を合成し、B7様 の６タイプについて結合能をアッセイした。調べたB7様分子の全てに対して９残 基が最適なペプチド長を表すと結論づけられた。この評価はどの分子にも結合す る各サイズのペプチドの割合という点でも、観察される交差反応性という点でも （データは示していない）正しい。 B7様アレルの２次的アンカーモチーフおよびB7様スーパーモチーフ 他の残基は２次的アンカーとして働くことができ、従ってペプチドに補助的な 結合エネルギーを与える(Ruppertら、Cell 74:929-937(1993);Maddenら、Cell 7 5，693-708(1993)；Saitoら、J．Biol．Chem．268,21309(1993)；Sidneyら、Hu ．Immunol．45,79-93(1996)；Kondoら、J．Immunol．155:4307-4312(1995)；Par kerら、J．Immnunol．152,163-175(1994))。ある種の残基はクラスＩ分子へのペ プチドの結合に負の影響を与えうることも示されている(Ruppertら、Cell74:929 -937(1993)；Sidneyら、Hu．Immunol.,45,79-93(1996)；Kondoら、Immunol．155 :4307-4312(1995)、Boehnckeら、J．Immunol．150，331−341(1993))。 縮退したB7様結合能を有するペプチドを効果的に選択できるようなB7様スーパ ーモチーフを開発するために、本明細書で記載した方法を用いてB7様分子へのペ プチドの結合に関係する２次的アンカー及び２次的効果を明らかにしようと我々 は試みた。最も一般的な５種のB7様分子、B^*0702、B^*3501、B51、B^*5301およびB^* 5401に対する、B7様スーパータイプ主要アンカー（位置２にプロリン、および Ｃ末端にＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＦおよびＷ）を含む天然に存在するウイルス配列 を表す１９９種のノナマーペプチドの大集団の結合能を測定し、そのデータを解 析した。各位置について２０種のアミノ酸の各々を有するペプチドの平均相対結 合能（ARBC）を計算し、ペプチドの組全体のARBCと比較した。ある種のアミノ酸 は希にしか出現しないため、以前に記載されたように個々の化学的類似性に従っ て残基をグループ分けした(Ruppertら、Cell 74:929-937(1993))。この解析はB^* 0702、B^*3501、B51、B^*3501およびB^*5401について別々に行った。 各分子によって示される２次的アンカーに関する優先性および忌避性のパター ンは、かなり特有のものであることが明らかになった。例えば、テストした集団 のうち、１８種のペプチドが位置１に正の電荷を持つ残基（Ｒ、ＨまたはＫ）を 有していた。これらのペプチドは、グループとして、ARBCが21というB^*0702の強 い結合体であった。しかしながら、B51に対しては、同じペプチドはARBCが0.25 というかなり弱い結合体であった。しかしながら、優先性における深い類似性も また注目される。例えば、芳香族残基（Ｆ、ＷおよびＹ）を位置１に有するペプ チドは、グループとして、B7様スーパータイプ分子の組にわたって強い結合体で あり、B^*0702、B^*3501、B51、B^*5301、およびB^*5401に対してARBCはそれぞれ4.2 、17、16、20および70であった。 次に上で議論した値を各位置に対するアレル特異的な２次的アンカー要求性地 図を導くために用いた。これを行うため優先的および阻害的残基を、全体の平均 よりも３倍高い、あるいは３倍低いARBCと関連する残基として、それぞれ定義し た。これらの優先的および阻害的効果は図３にまとめた。これらの２次的アンカ ー地図は、各分子はその固有の２次的アンカー要求性を示す一方、ある種の特徴 はB7様分子間で高度に保存されていることをより明瞭にする。例えば、上に示し たように、位置１の芳香族残基（Ｆ，ＷおよびＹ）はB7様分子５種の全てで優先 された。逆に、位置８における酸性残基（Ｄ，Ｅ）は５種の全ての分子に対する 低い結合能と関連していた。 考慮した５種のアレルのうち３種又はそれ以上で優先的であるがどの分子に対 しても阻害的でない２次効果、また一方、５種の分子のうち３種またはそれ以上 で阻害的である２次効果を、共通のものとして定義した。この共通の性質を、B7 様スーパータイプ分子の大部分において弱い、あるいは強い結合に関連する残基 を定める、拡張されたB7様スーパーモチーフに取り込んだ。 この論理に従うと、スーパーモチーフ優先的２次残基を有するペプチドはその 残基を含まない、あるいは阻害的残基を含むものよりも大きな程度のB7様スーパ ータイプ縮退を示すことが期待されるであろう。この仮説をB7様主要アンカー特 異性を有するペプチドの独立した組の結合交差性を測定することによってテスト した。予想されるように、スーパーモチーフ陽性のペプチド（すなわち、少なく とも一つのスーパーモチーフ優先的２次残基を含み、阻害的残基を含まないペプ チド）はスーパーモチーフ陰性ペプチド（少なくとも１つのスーパーモチーフ阻 害的残基を含む）よりも、B7様スーパータイプ内で本質的により大きな程 度の交差反応性をを示した（データは示していない）。 結合能を増強するためのスーパーモチーフの使用 HLAスーパーモチーフは本明細書で示したように、高度に縮退したペプチドを 予測する点で価値がある。しかしながら、もっとも興味深いのは、HLAスーパー モチーフを明らかにすることにより、ペプチド配列内でどの残基がアナログされ (analoged)、あるいは「調整」され得るかを明らかにすることにより高度に交差 反応性のエピトープを操作して、スーパータイプ内でより大きな縮退をペプチド に与えることができるようになる。 この可能性を評価するため、B7様スーパータイプ内で高度に縮退していること が示されている６種のペプチドを選んだ(表５)。各ペプチドは５種の一般的なＢ ７様分子のうち少なくとも３種に高アフィニティー（IC50＜50nM）または中間的 なアフィニティー（IC50 50-500nM）ですでに結合するものである。これらのペ プチドをB7様スーパーモチーフおよび上述したアレル特異的な２次アンカーモチ ーフの両方との関係で解析してそれらの配列内の特定の残基がB7様スーパータイ プ分子に対する結合をさらに増強するために「調整」できるかどうかを決定した 。この評価により、考えた特定のペプチドのどの一つもスーパーモチーフ陰性残 基を含まないことが分かった。３種のペプチド（HCVコア168、MAGE 2170、およ びMAGE 3 169）の各々は１種のB7様分子に対して阻害的な残基を１つ有していた (表５)。 次に、単一置換アナログの集団を合成した。スーパーモチーフ陽性あるいは、 他のいかなる置換についても阻害的でなく特定のアレルとの関係において陽性で ある２次アンカー置換を含むいくつかのアナログを、本明細書に開示した値に基 づいて選んだ。Ｃ末端の主要アンカーに対する優先性は各アレルに固有のもので あるため、この位置の置換も考慮した。こうして、たとえば、縮退度が増加し得 るかをテストするため、位置１の天然の残基に対してスーパーモチーフ陽性のＦ で置換することにより多数のペプチドを作成した。B^*0702およびB^*5401に対する 親ペプチドの結合性の低さに向けてHBV pol541のＣ末端のＹをＬにするような他 の置換を行った。 この集団をB7様スーパータイプ分子への結合能についてテストして、表５に示 したデータが作られた。どの場合にも、位置１におけるＦ置換は親配列に比ベて 増加した結合性及び/又は縮退度を示した。例えば、MAGE 2 170はB^*0702に対し て高アフィニティーで結合し、B^*3501、B51、およびB^*5301には中間のアフィニ ティーで結合したが、B^*5401には弱くしか結合しなかった。このペプチドのＦ１ アナログはこれらの分子の５種全てに高アフィニティーで結合した。 特定の分子に向けた置換を成功させるのはより困難であった。例えば、HBV po 1541のＣ末端において天然のＹをＬに置換することはB^*0702へ結合されることに 関しては成功するが、一方、他の分子に対する結合アフィニティーを増大させる (B51およびB^*5401の場合にはかなり）。他の例では、HBV env 313の場合に示さ れるように、観察される効果は期待されるものではない。このペプチドはB^*0702 、B^*3501、B51およびB^*5301に高アフィニティーで結合するがB^*5401には弱くし か結合しなかった。位置５の脂肪族残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、およびＭ）がB^*5401に対 して陽性であり、他の分子に対しては比較的中立であることに基づいて５つのア ナログにＭをいれた。しかしながら表５に示したようにＭ５アナログによって得 られた著しく増大したB*5401結合はB^*0702、B51およびB^*5301に対して結合が弱 くなることを代償とするものであった。 個々のアナログについての成功性はいろいろであったが、各場合について少な くとも１つのアナログが結合アフィニーティーを改善することができたか、また は、親ペプチドの縮退度を拡張することができた。こうして、すでに縮退してい たペプチドを別々に「調整」してその結合能を強化し縮退度を拡張することがで きる。 結論として、本明細書で示したデータから、高アフィニティー結合ペプチドは その配列の「陰性」あるいは中立の残基を、中立あるいは優先的な残基に置換す ることによって作り出せることが明らかである。これらのペプチドは固有の免疫 学的特性を有するかもしれない、すなわち、野生型の配列となお交差反応する一 方、野生型配列に対して反応するCTLを不活性化するトレランス、欠失または抑 制的機構を受けず、その結果として癌または慢性感染を起こさないかもしれない 。同じ知見は高度の交差反応性を持ち、それにより集団をカバーするのにより適 したペプチドを作り出すために利用することができる。 実施例３ A2様スーパータイプ結合 A2.1結合の構造的要求に関するさらなる情報も引き出した。これを行うため に、アンカー位置２および９の許容程度をまず決定しようと試みた。この目的の ために以前に報告されている、A2.1のモチーフ位置２のＬおよび位置９のＶ（Ru ppertら、Cell 74:929-937(1993)）を含むモデルポリ（Ａ）9merペプチドの位置 ２あるいは位置９における単一置換を有するアナログ集団を合成し、その結合能 を測定した。アンカー位置２および９の双方について、異なる１３種のアナログ を合成した。 以前に報告されているA2.1モチーフと良く一致し、位置２にＬまたはメチオニ ン（Ｍ）を有するペプチドは最良の結合体であった。イソロイシン（Ｉ）、Ｖ、 アラニン（Ａ）、およびスレオニン（Ｔ）のような比較的保存性の置換であって も結合能の著しい減少（10倍から100倍）が明らかとなった。より根本的な変異 （すなわち、Ｄ、Ｋ、Ｆ、Ｃ、Ｐ，Ｇ、ＮおよびＳ残基）は結合能を完全に失わ せた。位置９についても同様な結果が得られ、ＬおよびＩのような保存的置換体 のみが未置換のポリＡ A2.1ペプチド結合体の10倍の範囲で結合した。Ａまたは Ｍ置換を有するアナログも結合したが、強度は低かった(10倍〜100倍減少した） 。最後に、テストした他の全ての置換（Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｓ、Ｇ、ＰおよびＲ） はA2.1結合能の完全な喪失と関連していた。従って、これらのデータに基づき、 かつ、以前の研究（19-20）とよく一致して、「模範的」なA2.1モチーフは位置 ２のＬまたはＭおよび位置９のＬ、ＶまたはＩとして定義することができる。 これらの結果から、位置２または位置９（または10）の残基に「模範的でない 」（しかし許容される）残基（例えば位置２にＩ、Ｖ、ＡまたはＴ、または位置 ９若しくは10にＭまたはＴ）を有するどのペプチドのA2結合能も、より「模範的 」なアンカーでこれを置き換えることにより増強されることを導いた。これを実 際にどのように行うかのいくつかの例を以下に示す。 例えば、配列（LWVTVYYGV）のFHV Env 2181ペプチドはA2.1と12,500nMのIC50 ％で結合するが、位置２アンカー置換アナログLMVTVYYGVは3.3nMのIC50%で結合 する。HBVc 1８-27の天然の配列FLPSDFFPSIはIC50%22nMでA2.1に結合するが、そ のＣ末端アンカー置換Ｖ₁₀変異体はA2.1と2.5nMのKdで結合する。最後に、HBV p ol538ペプチド（YMDDVVLGA）はA2.1に200nMのIC50%で結合するが、 一方、Ｖ₉変異体は5.1nMのIC50%で結合する。調整されたアンカーペプチドの他 の例は表６に示した。調整したペプチドのいくつかをCTL応答を誘導する能力に ついてテストした。例えば、HIV Env 2181ペプチドおよびHBV pol721ペプチドを １次CTLアッセイ（21）でテストし、陽性であることが分かった。陽性のCTL認識 データはHBVc18-27およびHBV pol538ペプチドについても存在する。 更なる実験により、結合能の決定において非アンカー残基の重要な役割が明ら かになった。これらの解析の結果もRuppertらの上述の文献に記載されている。 我々の解析では、A2.1結合体の与えられたアミノ酸グループの頻度を非結合体の 頻度で割って、度数比を得た。この比は残基のあるグループが特定の位置に結合 体（比＞１）においてまたは非結合体（比＜１）において優先的に現れるかどう かを示すものである。解析を簡単にするために、この比に対する閾値レベルを定 め、非結合体に比較して結合体において４倍より高い頻度を有する残基を、好ま れる、あるいは優先的な残基と考え、結合体において非結合体よりも１／４より 低い頻度を有する残基を、好まれない、あるいは阻害的残基と考えた。この手法 に従い、A2.1結合能またはその欠如に顕著に関連する残基群を明らかにした。一 般には、最も有害な効果は電荷を持つアミノ酸で見られた。位置１においてＰお よび酸性残基（ＥおよびＤ）残基はA2.1結合性ペプチドではいずれも希であった 。位置６においては塩基性残基（Ｈ、ＲおよびＫ）は非結合性ペプチドと関連し ており、一方酸性残基及び塩基性残基は、強い結合体における位置３および７で はどちらも希であった。その逆に、芳香族残基は位置１、３および５において高 アフィニティー結合と関連していた。さらに、例えばＳ，ＴまたはＣのようなＯ Ｈ-またはＳＨ-を含む側鎖をもつ残基は位置４に好まれ、一方Ａは位置７に好ま れ、Ｐは位置８に好まれた。結論として、種々のアミノ酸グループの頻度解析に より、アンカー位置２および９以外の位置のA2.1結合アフィニティーに与える影 響が考慮された、より正確なA2.1モチーフを明らかにすることができるようにな った。 10mer A2.1リガンドの解析 ９merペプチドについて上述した同じ手法を10merペプチドの組で得られたデー タを解析するのに用いた。このペプチドのN-およびC-末端において、観察さ れたパターンは９merについて見られたものとかなり似ていた。たとえば、10mer の組において、９merペプチドの場合のように、結合体の組では芳香族残基の頻 度が増加しているということで位置１は特徴づけられ、ここでも負電荷およびＰ は結合性の低さと関連していた。位置３においてもまた、負電荷は低い結合性と 関連していた。興味深いことに、この位置において（芳香族残基でなく）脂肪族 残基が高アフィニティー結合と関連していた。このペプチドのＣ末端で、ある程 度の類似性も観察された。10merにおいて、末端から２番目の位置９の残基（９m erの位置８に対応する）は非常に寛容で、非結合体で塩基性残基がより高頻度に 見られただけである。９merにおける位置７の状況と同様に、10merの末端から３ 番目の位置８において正電荷も負電荷も許容的でなかった。また、９merにおい て位置６について前に観察されたように、位置７は10merにおいては正電荷の残 基は好まれなかった。しかしながら、位置３において観察されたことと同様に、 強い結合体と関連する残基は異なっていた。芳香族残基および疎水性残基は（９ merでは位置７においてＡのみが頻度が高いということと対照的に）高アフィニ ティー結合体の位置８において頻度が高かった。 最後に、ペプチドの中央部においてかなり特徴的なパターンが観察された。位 置４において、Ｇが高結合体で好まれ、一方Aおよび正電荷が非結合体において 非常に頻度が高かった。位置５においてＰはA2.1結合体には全く存在しなかった 。10merの組の位置４および５においてみられたは傾向のいずれも、９merの組に ついての位置４または５におけるいかなるカウンターパートをもたないことは注 目すべきである。 要約するとA2.1 ９merペプチドについて上述したのと同様なストラテジーに従 って、10merペプチドについて詳細なモチーフを作成することができる。９meｒ および10merの組をこれらの非アンカー位置で比較すると重要な相違及び驚くべ き類似性の両方に注目することができる。 結論として、ここで示したデータから、その配列の「陰性」または中立残基を 中立または優先的残基で置換することにより、より高アフィニティー結合性のペ プチドを作り出せることが明らかである。これらのペプチドは特有の免疫学的性 質、すなわち、それらは、野生型配列となお交差反応性であるが、野生型配列に 対して応答するCTLを不活性化するトレランス、欠失または抑制的機構を受けず 、その結果として癌または慢性感染を起こさないかもしれない。 複数のHLAアレルへのペプチド抗原の結合性はA2様スーパータイプの同定を可能 にする 放射ラベルペプチドと、EBV―形質転換Ｂ細胞株のような、HLAクラスＩ発現哺 乳動物細胞と、PHA活性化幼若細胞を用いた直接MHC結合アッセイ法が開発されて いる。標的細胞をβ₂-ミクログロブリン存在下26℃で一晩プレインキュベーショ ンすると放射ラベルしたプローブの有意な結合が得られるであろう。この条件下 では、いずれかの細胞タイプによって発現されているHLA分子の数パーセントま でがラベルされたペプチドに結合され得るだろう。これらのアッセイにより、A^* 0201拘束性Ｂ型肝炎ウイルスコア18-27ペプチドと他のA2サブタイプとの交差反 応性を調べた。このペプチドエピトープはA^*0202、A^*0205およびA^*020６サブタ イプにも結合するがA^*0207サブタイプには結合しないことがはっきりした。合成 ペプチドアナログ集団での阻害実験により、HLA-A^*0201、A^*0202およびA^*0205ア レルの類似したリガンド特異性が強調された。種々のHLAアレルのＢおよびＦポ ケットの形成を助ける多様な残基を解析することにより他の２種のHLAアレル（H LA-A^*6802およびA^*6901）に対するＢ型肝炎ウイルスコア18-27エピトープの結合 を予測できた。このように、少なくとも６種の異なるHLA-A分子ファミリーが集 合的にA2スーパータイプとして定義され、重なり合うリガンド特異性（位置２お よびＣ末端の脂肪族残基）を共通にするかもしれないように見える。これらの結 果は、広範囲に交差反応性のペプチドエピトープを同定することができ、ペプチ ドベースのワクチン接種アプローチの将来の可能性を非常に大きくし得ることを 示唆する。 更に、これらのデータは置換アナログのさらなる使用法について示唆するもの である。具体的には、A2スーパータイプのいくつかのメンバーの結合アフィニテ ィーを同時に増大させることである。 どのようにしてこれを達成するかの例はペプチドHPV16、EF.86-93、TLGIVCPI およびそのアナログTLGIVXPI（Ｘはαアミノブチル酸を表す）によって与えら れる。これらの２つのペプチドのA2様アレルに対する結合パターンを次にテスト した。Ｘ置換は全てのA2様アレルに対する結合アフィニティーを大きく増加させ 、元の親配列より強い結合能と広い交差反応性によって特徴づけられる、より有 用なペプチドを生じることは明らかであった。A2/Kbトランスジェニックマウス を用いた続いての実験により、Ｘ置換ペプチドによって誘導されるCTLは野生型 配列と完全な交差反応をし、Ｘペプチドはより高いその結合アフィニティーの結 果として、より強い免疫原であることが示された。 実施例４ A24およびA1結合性 ２次効果およびA24結合性 われわれは位置２にＹおよび位置９にＦというA24特異的モチーフを含むモデ ルポリ（Ａ）９merペプチドを利用した。位置２においてはＹだけでなくＦ，Ｍ も、そしておそらくはＷも許容されることが分かった。９あるいは10残基のリガ ンドのＣ末端ではＦおよびＷが最も優先的であるがＬおよびＩも許容的であった 。Ｍもこの位置で許容的であると予測されるであろう(Kuboら、Immunol 152:391 3(1994))。これらの結果からわれわれは位置２または９（あるいは10）に非模範 的であるがなお許容的である残基を有するどんなペプチドの（例えば、位置２に Ｆ、Ｍ、Ｗまたは位置９（あるいは10）にＬ、Ｉ、Ｍ）A24結合性も、その残基 をより模範的なアンカーに置き換えることによって増強しうるということを結論 した。 A24結合能を決定している非アンカー残基の重要な役割を説明するさらなる実 験の結果が、Kondoら、J．Immunol．155:4307-4312(1995)によって記載されてい る。全体的なA24結合データベースを編集し、各位置に対して特定の残基を有す るペプチドの相対平均結合アフィニティーを計算した。 ９merペプチドの場合、例えば、位置１にＧまたは負の電荷を持つ残基（Ｄ， Ｅ）を有するペプチドは、解析した141種の９merペプチドの組全体の平均アフィ ニティーよりも平均アフィニティーが10倍低く、結合が弱い傾向がある。これに 対して、位置１に芳香族残基（Ｆ，Ｙ、Ｗ）を有するペプチドは平均アフィ ニティーが全体の平均よりも11.8倍高く、非常によく結合した。位置１に正の電 荷をもつ残基（Ｒ，Ｋ、Ｍ）を有するペプチドもよく結合する傾向があり、全体 の平均よりも4.6倍高い平均アフィニティーを有する。 A24結合能への負の２次的効果も他のいくつかの位置において検出された：位 置３および６におけるＤまたはＥ、位置４および７におけるＧ、位置６の正電荷 （ＫＲ、Ｈ）、位置８のＡ、位置５のＰ、位置５および８のアミド（ＱおよびＮ ）である。逆に、位置７および８に芳香族残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ）が見られる場合は A24結合に都合よく、位置４には（Ｓ，Ｔ，Ｃ）のような小さな、水素結合性残 基があるときは正の効果を有することが分かった。 ９mer配列に沿うそれぞれの単一位置がA24結合性に影響を与えるということは 明らかである。疎水性残基（Ｆ，Ｗ，Ｙ、Ｌ、Ｉ、ＶおよびＭ）が結合性の低さ と全く関連しないことも興味深い。 同様な解析を10merペプチドから得たデータについて行なった。前の節で示し たことと同様に、いくつかの２次効果が10merの場合にも認められた。 ９merペプチドの場合のように、位置３および６の負電荷残基（Ｄ、Ｅ）は結 合の低さと関連していた。しかしながら、一般には、10merについての２次効果 の地図は９merについてのものとはっきり区別された。例えば、９merペプチドの 場合にＰはどの位置においても顕著な結合性の増加と関連しておらず位置５にお いては結合性の減少にまで関連していた。10merについては、Ｐは10merペプチド リガンドの位置４，５または７に見られるときは結合能の増大と関連していた。 10merペプチドにおいては位置５は２次効果の点で最も重要であるように見え 、（既に述べたＰを別にして）Ｙ、ＦおよびＷはA24の強い結合性と関連し、か つ、Ｒ、ＨおよびＫは低い結合能と関連している。位置７および位置９における Ａの、および位置４および８のアミド残基（Ｑ、Ｎ）の存在も低い結合能と関連 していた。 ２次効果およびA1結合性 A24について上述したのと同様な解析をHLA-A^*0101分子について記載した。 簡単に言うと、先の研究においてHLA-A^*0101に特異的な異なる２種のペプチド結 合モチーフが明らかにされている。９merおよび10mer２次的相互作用の地図は両 方のA^*0101サブモチーフから導かれた。このような２次的相互作用の地図を導く ため、２種の各々のサブモチーフに対応するペプチド集合の適切なA^*010１結合 データを集めた。各位置についてそれぞれの特定の残基を有するペプチドの相対 平均結合アフィニティーを計算した。ある特定の残基の出現頻度が低いことを補 償するため、および、より意味のある資料標本を得るため、化学的に類似した側 鎖をもつアミノ酸をRuppertらの上述の文献のように、一緒にした。９merペプチ ドに関するこうした種類の解析により得られた結果を図４ａおよび図４ｂに、そ れぞれ2-9および3-9サブモチーフについて示した。この解析によって検出された ２次効果を説明した図式を図４ｃおよび４ｄに（それぞれ2-9および3-9サブモチ ーフに関して）示した。４倍より大きな平均アフィニティーの増加または減少を 、上述のように有意であると考えた。 一般に、大部分の位置に関して、特定の残基タイプの存在により、結合能は負 または正の何れかの影響を受けた。例えば、2-9サブモチーフの場合には、位置 １のＤまたはＥを有するペプチドはA^*0101分子にはあまり結合せず、平均相対結 合能（ARBC）は0.20であった。逆に、同じ位置（位置１）に芳香族残基（Ｙ、Ｆ またはＷ）を有するペプチドは、平均として、ペプチド集合全体の全体的平均結 合能よりも４倍高い（ARBC4.0）アフィニティーで結合した。 図表をよく見ると、A^*0101に結合するペプチドのいくつかの興味深い特徴が明 らかになる。第１に、上に記載したように位置２および３における２つのアンカ ーが互いに相乗的に働く。位置２にＭ、ＳまたはＴアンカーを有するペプチドの アフィニティーは位置３にＤまたはＥ（かつ、それより程度は低いがＡ）が存在 することにより劇的に増加した。逆に、位置３にＤまたはＥアンカーを有するペ プチドのアフィニティーはＳ、Ｔ、およびＭ（但しＬ，Ｖ，Ｉ、ＣおよびＡのよ うな疎水性または短い鎖の分子も）の存在により劇的に増加した。 A^*0101分子との相互作用においてこの２つのモチーフを有するペプチドが相 違する程度は、他の位置を調べることによって明らかになった。図４ａおよび４ ｂの値を比較すると、ひとつのモチーフとの関係で中立の残基が他のモチーフ との関係では正の効果または負の効果を有する例が沢山あることが明らかである 。例えば、2-9モチーフの位置１においてGおよび芳香族残基(Y、FおよびW)が優 先的(ARBC>4.0)であり、Ａおよび正電荷を持つ残基(Ｒ、ＨおよびＫ)は比較的中 立であり（ARBCは4.0と0.25の間）、負の電荷を持つ残基（ＤおよびＥ）は阻害 的である(ARBC＜0.25)。3-9サブモチーフを有するペプチドの場合は異なるパタ ーンが注目され、ここでも優先的であるＧを除いて優先性はばらばらであった。 位置１の正電荷をもつ残基はペプチドの結合性に有意な正の影響を有しており（ ARBCが8.3）、負電荷を持つ残基および芳香族残基は中立（ARBCは、それぞれ1.3 および0.61）であり、かつＡは阻害的である(ARBCが0.15)。同様な型の調節がモ チーフに沿った各位置において観察される。全体として、サブモチーフからサブ モチーフへの２次アンカー優先性におけるシフトは図３に示した要約図式に最も よく表されている。この点について、位置１におけるＧに対する共通の優先性と いう唯一つの例外、および位置２と３の共-アンカーを除いて、２つのA^*0101 9m erサブモチーフの２次モチーフは実際完全に異なっていることがわかる。このよ うに、定量的に理解すると、２つの９merモチーフは27のうちたった１つの２次 効果（3.7％）を共通にする。これらのA^*0101モチーフが相違する程度は、どの ２つの拡張モチーフ間でも３から５（13〜26％）の２次効果が共通であることが 観察されたという、A24、A^*0201およびA3様分子の拡張されたモチーフ間で記述 された多くの類似性と驚くほど対照的である(20)。 10merリガンドに関する２次アンカー残基の定義 ９merリガンドについて上記の節で説明したことと同様に、２次アンカー残基 および２次効果を2-10および3-10サブモチーフについて明らかにした。これらの 解析結果を図５ａ〜ｄに示した。ここでもまた、位置２および３に存在するアン カーが互いに相乗的に働くように見えた。2-10サブモチーフについて、位置３に Ｄ、Ｅ（および、より程度が低いがＡ、Ｑ、Ｎ）が存在すること、および、３-1 0サブモチーフについて位置２の疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ）または短い鎖の 残基は平均結合能の著しい増大と関連していた。 ２つの10merモチーフを２，３およびＣ末端以外の位置で比較すると、９mer ペプチドの場合のように、２次アンカー特異性の調節は主要アンカー残基に依存 して起こっていることが示された。例えば、位置７においては、ＡおよびＳ，Ｔ およびＣが2-10モチーフでは好まれるが、3-10モチーフでは中立である。逆に、 Ｇは3-10モチーフでは優先的であるが、2-10モチーフでは中立である。しかしな がら、9merサブモチーフとは対照的に10merで見られたこれらの相違はそれほど 著しいものでないこともはっきりしている。実際２つの10merサブモチーフは多 くの優先性を共通にしている。位置１および５のＹ、ＦおよびＷ、位置４のＡ、 位置７のＰ、および位置８のＧはどちらのサブモチーフに対しても正の効果を有 していた。同様に、位置８のＲ，ＨおよびＫは両方の10merサブモチーフおいて 阻害的であった（図５ｃおよび５ｄ）。まとめると、２つの10merモチーフは25 のうち６つの２次効果（24％）を共通にしていた。 上述の実施例は本発明を説明するために提供したものであり、発明の範囲を限 定するためではない。本発明の他の変形は当業者には容易に理解し得るであろう し、それらは添付の請求の範囲に含まれる。本明細書で引用した全ての文献、特 許および特許出願はあらゆる目的のため本明細書に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/10 Ａ６１Ｐ 31/10 31/12 31/12 33/00 33/00 35/00 35/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 シドニー ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ ヴィラ ラ ジョラ ドライヴ 8541ディー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．あらかじめ選択した抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を患者において誘導 する方法であって、細胞障害性Ｔ細胞を、少なくとも２種のHLA-A3様分子に約50 0nMよりも小さな解離定数で結合して細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する、約９か ら約15残基の免疫原性ペプチドに接触させることを含み、その免疫原性ペプチド がＮ末端からＣ末端までに以下の結合モチーフを含む９残基の配列を有するもの である方法： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置における 第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置の 第２主要アンカー残基；および 第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第６位置がＹ、ＦまたはＷ、第７位置がＹ、Ｆまた はＷ、第８位置がＰ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選ば れる１またはそれ以上の２次的アンカー残基。 ２．ペプチドが９から10残基からなる、請求項１の方法。 ３．ペプチドがウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原または真菌抗原に由来 する、請求項１の方法。 ４．接触させるステップがin vitroで行なわれる、請求項１の方法。 ５．接触させるステップが、免疫原性ペプチドをコードする配列を含む核酸分子 を患者に投与することによって行なわれる、請求項１の方法。 ６．予め選択した抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を患者において誘導する方 法であって、細胞障害性Ｔ細胞を、HLA-A^*0301遺伝子産物に約500nMよりも小さ な解離定数で結合して細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する、約９から約15残基の免 疫原性ペプチドに接触させることを含み、その免疫原性ペプチドがＮ末端からＣ 末端までに以下の結合モチーフを含む９残基の配列を有するものである方法： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置における 第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置の 第２主要アンカー残基；および 第１位置がＲ、ＨまたはＫ、第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第４位置がＰ、Ｒ、Ｈ 、 Ｋ、Ｙ、ＦまたはＷ、第５位置がＡ、第６位置がＹ、ＦまたはＷ、第８位置がＰ 、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選ばれる１またはそれ以 上の２次アンカー残基。 ７．ペプチドが９から10残基からなる、請求項６の方法。 ８．ペプチドがウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原または真菌抗原に由来 する、請求項６の方法。 ９．接触させるステップがin vitroで行なわれる、請求項６の方法。 １０．接触させるステップが、免疫原性ペプチドをコードする配列を含む核酸分 子を患者に投与することによって行なわれる、請求項６の方法。 １１．予め選択した抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を患者において誘導する 方法であって、細胞障害性Ｔ細胞を、HLA-A^*1101遺伝子産物に約500nMよりも小 さな解離定数で結合して細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する、約９から約15残基の 免疫原性ペプチドに接触させることを含み、その免疫原性ペプチドがＮ末端から Ｃ末端までに以下の結合モチーフを含む９残基の配列を有するものである方法： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置におけ る第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置 の第２主要アンカー残基；および 第１位置がＡ、第３位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第４位置がＹ、ＦまたはＷ、第５ 位置がＡ、第６位置がＹ、ＦまたはＷ、第７位置がＹ、ＦまたはＷ、第８位置が Ｐ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選ばれる２次アンカー 残基。 １２．ペプチドが９から10残基からなる、請求項11の方法。 １３．ペプチドがウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原、または真菌抗原に 由来する、請求項１１の方法。 １４．接触させるステップがin vitroで行なわれる請求項11の方法。 １５．接触させるステップが、免疫原性ペプチドをコードする配列を含む核酸分 子を患者に投与することによって行なわれる、請求項１１の方法。 １６．予め選択した抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を患者において誘導する 方法であって、細胞障害性Ｔ細胞を、HLA-A^*3101遺伝子産物に約500nMよりも小 さな解離定数で結合して細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する、約９から約15残基の 免疫原性ペプチドに接触させることを含み、その免疫原性ペプチドがＮ末端から Ｃ末端までに以下の結合モチーフを含む９残基の配列を有するものである方法： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置におけ る第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置 の第２主要アンカー残基；および 第１位置がＲ、Ｈ、またはＫ、第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第４位置がＰ、第 ６位置がＹ、Ｆ，またはＷ、第７位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第８位置がＡまたは Ｐおよびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選ばれる２次的アンカー 残基。 １７．ペプチドが９から10残基からなる、請求項１６の方法。 １８．ペプチドがウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原、または真菌抗原に 由来する、請求項１６の方法。 １９．接触させるステップが、in vitroで行なわれる、請求項16の方法。 ２０．接触させるステップが、免疫原性ペプチドをコードする配列を含む核酸分 子を患者に投与することによって行なわれる、請求項１６の方法。 ２１．予め選択した抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を患者において誘導する 方法であって、細胞障害性Ｔ細胞を、HLA-A^*3301遺伝子産物に約500nMよりも小 さな解離定数で結合して細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する、約９から約15残基の 免疫原性ペプチドに接触させることを含み、その免疫原性ペプチドがＮ末端から Ｃ末端までに以下の結合モチーフを含む９残基の配列を有するものである方法： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置におけ る第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置 の第２主要アンカー残基；および 第３位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第７位置がＡ、Ｙ、ＦまたはＷ、およびこれら のいずれかの組み合わせからなる群より選ばれる２次的アンカー残基。 ２２．ペプチドが９から10残基からなる、請求項２１の方法。 ２３．ペプチドがウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原、または真菌抗原に 由来する、請求項２１の方法。 ２４．接触させるステップが、in vitroで行なわれる、請求項２１の方法。 ２５．接触させるステップが、免疫原性ペプチドをコードする配列を含む核酸分 子を患者に投与することによって行なわれる、請求項２１の方法。 ２６．予め選択した抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を患者において誘導する 方法であって、細胞障害性Ｔ細胞を、HLA-A^*6801遺伝子産物に約500nMよりも小 さな解離定数で結合して細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する、約９から約15残基の 免疫原性ペプチドに接触させることを含み、その免疫原性ペプチドがＮ末端から Ｃ末端までに以下の結合モチーフを含む９残基の配列を有するものである方法： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置におけ る第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置 の第２主要アンカー残基；および 第１位置がＹ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、ＴまたはＣ、第５位置がＹ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ またはＭ、第７位置がＹ、ＦまたはＷ、第８位置がＰ、およびこれらのいずれか の組み合わせからなる群より選ばれる、２次的アンカー残基。 ２７．ペプチドが９から10残基からなる、請求項２６の方法。 ２８．ペプチドがウイルス抗原、腫瘍関連抗原、寄生虫抗原、または真菌抗原に 由来する、請求項２６の方法。 ２９．接触させるステップが、in vitroで行なわれる、請求項２６の方法。 ３０．接触させるステップが、免疫原性ペプチドをコードする配列を含む核酸分 子を患者に投与することによって行なわれる、請求項２６の方法。 ３１．少なくとも２種のHLA-A3様分子に約500nMより小さな解離定数で結合し、 細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導する、約９から約15残基の免疫原性ぺプチドを含む 組成物であって、その免疫原性ペプチドがＮ末端からＣ末端までに以下の結合モ チーフを含む９残基の配列を有している組成物： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置におけ る第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置 の第２主要アンカー残基；および 第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第６位置がＹ、ＦまたはＷ、第７位置がＹ、Ｆま たはＷ、第８位置がＰ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選 ばれる１またはそれ以上の２次的アンカー残基。 ３２．HLA-A^*0301遺伝子産物に約500nMより小さな解離定数で結合し、細胞障害 性Ｔ細胞応答を誘導する約９から約15残基の免疫原性ペプチドを含む組成物であ って、その免疫原性ペプチドがＮ末端からＣ末端までに以下の結合モチーフを含 む９残基の配列を有している組成物： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置におけ る第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置 の第２主要アンカー残基；および 第１位置がＲ、ＨまたはＫ、第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第４位置がＰ、Ｒ、 Ｈ、Ｋ、Ｙ、ＦまたはＷ、第５位置がＡ、第６位置がＹ、ＦまたはＷ、第８位置 がＰ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選ばれる１またはそ れ以上の２次アンカー残基。 ３３．HLA-A^*1101遺伝子産物に約500nMより小さな解離定数で結合し、細胞障害 性Ｔ細胞応答を誘導する約９から約15残基の免疫原性ペプチドを含む組成物であ って、その免疫原性ペプチドがＮ末端からＣ末端までに以下の結合モチーフを含 む９残基の配列を有している組成物： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置におけ る第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置 の第２主要アンカー残基；および 第１位置がＡ、第３位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第４位置がＹ、ＦまたはＷ、第 ５位置がＡ、第６位置がＹ、ＦまたはＷ、第７位置がＹ、ＦまたはＷ、第８位置 がＰ、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選ばれる２次アンカ ー残基。 ３４．HLA-A^*3101遺伝子産物に約500nMより小さな解離定数で結合し、細胞障害 性Ｔ細胞応答を誘導する約９から約15残基の免疫原性ペプチドを含む組成物 であって、その免疫原性ペプチドがＮ末端からＣ末端までに以下の結合モチーフ を含む９残基の配列を有している組成物： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２位置におけ る第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位置 の第２主要アンカー残基；および 第１位置がＲ、Ｈ、またはＫ、第３位置がＹ、ＦまたはＷ、第４位置がＰ、第６ 位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第７位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第８位置がＡまたはＰ 、およびこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選ばれる２次的アンカー 残基。 ３５．HLA-A^*3301遺伝子産物に約500nMより小さな解離定数で結合し、細胞障害 性Ｔ細胞応答を誘導する約９から約15残基の免疫原性ペプチドを含む組成物であ って、その免疫原性ペプチドがＮ末端からＣ末端までに以下の結合モチーフを含 む９残基の配列を有している組成物： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２番位置にお ける第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位 置の第２主要アンカー残基；および 第３位置がＹ、Ｆ、またはＷ、第７位置がＡ、Ｙ、ＦまたはＷ、およびこれら のいずれかの組み合わせからなる群より選ばれる２次的アンカー残基。 ３６．HLA-A^*6801遺伝子産物に約500nMより小さな解離定数で結合し、細胞障害 性Ｔ細胞応答を誘導する約９から約15残基の免疫原性ペプチドを含む組成物であ って、その免疫原性ペプチドがＮ末端からＣ末端までに以下の結合モチーフを含 む９残基の配列を有している組成物： Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳおよびＴからなる群より選ばれる、第２番位置にお ける第１の主要アンカー残基、およびＲおよびＫからなる群より選ばれる第９位 置の第２主要アンカー残基；および 第１位置がＹ、Ｆ，Ｗ、Ｓ、ＴまたはＣ、第５位置がＹ、Ｆ，Ｗ，Ｌ，Ｉ、Ｖ またはＭ、第７位置がＹ、Ｆ，またはＷ、第８位置がＰ、およびこれらのいずれ かの組み合わせからなる群より選ばれる、２次的アンカー残基。 ３７．HLA-A3様分子と約500nMよりも小さい解離定数で結合する免疫原性ペプ チドを同定する方法であって、 請求項３１、３２、３３、３４、３５および３６に記載の結合モチーフが存在 するかについて抗原性タンパク質のアミノ酸配列をスクリーニングし； 結合モチーフを有する前記抗原タンパク質中の、１またはそれ以上の部分配列 を選択し； 選択した部分配列を含む約８から約11残基のテストペプチドを調製し； テストペプチドの、遺伝子産物に対する結合能を測定し； 解離定数が500nMよりも小さいペプチドを同定するステップを含む方法。