JP2001501475A - カンジダ・ウチリスにおけるトランスフォーメーション系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，酵母Candida utilisにおける異種タンパク質の発現に有用なトランスフォーメーションシステムを提供するものであり，これは，この種における栄養素要求突然変異体の取得ならびにその栄養素要求突然変異体を補足するゲノムライブラリーからの異種遺伝子の単離に基づくものである．本発明のトランスフォーメーションシステムは，Candida utilisのＮＲＲＬＹ-1084株から得られた単新規な栄養素要求突然変異株を宿主として使用する．これらの突然変異株は，選択マーカーとして上記酵母の遺伝子ＵＲＡ3ならびにＨＩＳ3を含有するプラスミドでトランスフォームされた主としてウラシルおよびヒスチジン経路における欠損を有する．

Description

【発明の詳細な説明】 カンジダ・ウチリスにおけるトランスフォーメーション系 技術分野 本発明は遺伝子操作およびバイオテクノロジーの分野に関し，さらに詳しくは 酵母，カンジダ・ウチリス（Candida utilis）の遺伝子のトランスフォーメーシ ョンのための宿主-ベクターシステムの開発に関し，これは，この酵母における 異種タンパク質の発現および分泌を可能にし，またさらに数種の目的で使用する ことができる． 従来技術 遺伝子操作およびバイオテクノロジーは，医学的，栄養学的または工業的に興 味のある多くのタンパク質の製造に全く予想されなかったゴールを開き，優れた 利点が報告されている． これらの目的には，細菌の大腸菌が，それらの遺伝子系における知識，操作の 容易性およびそれらの高密度における培養系により，多くのバイオテクノロジー 系の会社で最も頻繁に使用されてきた． しかしながら，この微生物における関心タンパク質の製造の希望は様々な因子 によって影響される．第一に，得られた製品がヒトの医薬または食品としての使 用を意図する場合には，大腸菌の細胞壁における発熱性物質ならびに毒性化合物 がその使用を限定する規制の原因となっている．さらに，大腸菌内で過剰発現さ れるタンパク質は一般に．分泌されない不溶性の型で出現する．他方，転写，翻 訳および翻訳後修飾の機構が真核細胞系の場合とは異なり，天然起源のものとは 何らかの点で異なる組換えタンパク質を生じる． 真核細胞系たとえば酵母における異種タンパク質の製造の可能性は，原核細胞 系に比較してある種の利点がある．とくに，高い細胞密度まで増殖できる能力， およびそれらの培養を連続システムに適用できる可能性を挙げることができる． また，酵母は大腸菌に比較し，培養培地中にかなり大量のタンパク質を分泌する ことが可能であり，しかも酵母の増殖に用いられる増殖培地の方が経済的である （Lemoine,Y.，1988，Heterologous expression in yeast．8th．International Biotechnology Symposium，Paris，July，17-22）．また，これらの系では細菌 系には存在しない他の翻訳後修飾たとえばグリコシル化を実施することができる （Fiers,W.，1988，Engineering Maximal Expression of Heterologous Gene in Microorganism．8th．International Biotechnology Symposium，Paris，July ，17-22）．これに加えて，これらのシステムは一般的に，高等真核細胞系の場 合と同一のコドン使用におけるある種の優先性を有する（Kigsman，S.M．ら，19 90，Heterologous Gene Expression in Saccharomyces cerevisiae，Biotechnol ogy and Genetic Engineering Reviews，3，Ed．G.E.Russell）． このすべてが，新しい真核細胞トランスフォーメーションシステムの開発なら びに普及を招来し，最初にとくに興味のある酵母サッカロミセス属の種，とくに Saccharomyces cerevisiaeについて報告された．しかしながら，サッカロミセス におけるタンパク質の発現は，それらの同種プロモーターを使用して得られる発 現レベルならびに培地中に分泌されるタンパク質の過剰グリコシル化の問題に直 面した．それが近年，あまり慣用されていない酵母を異種タンパク質の発現に使 用する研究を助長することになった主要な理由である．他の非サッカロミセス酵 母たとえばHansenula polymorpha，Pichiapastoris，およびクルイベロミセス（ Kluyveromyces）属の酵母（Sudbery，P.，1994，Yeast 10:1707-1726）における トランスフォーメーションシステムの開発とともに，これらのシステムの知識お よび開発における急速な進歩がもたらされ，またワクチン接種，診断および工業 的目的でこれらのシステムにおいて発現された異種タンパク質の数も増加してき た． カンジダ属内でも，これらの多くはヒトで日和見疾患を起こすことからすべて 医学的にきわめて興味のあるCandida tropicalis，Candida boidiini，Candida glabrata，Candida parapsilosis，Candida maltosaおよびCandida albicansを 含めて数種のトランスフォーメーションおよび発現系が報告されている． カンジダ属においてカンジダ・ウチリス（Candida utilis）はその特殊な特性 によりとくに興味がもたれている．まず第一に，Candida utilisは多様な安価な 炭素源，とくにキシロース，スクロースおよびマルトースを使用する．他の興 味ある特徴はそれが連続培養において大量の細胞を効率的に産生できることであ る．Candida utilisはまた，Saccharomyces cerevisiaeおよびKluyveromyceslac tisと同様に，ＦＤＡ（食品医薬局）によって食品の安全な原料として認可され ている．さらに，Candida utilisはとくに，Ｌ−グルタミン，酢酸エチルおよび インベルターゼの製造に工業的に使用されている． Candida utilisにおけるトランスフォーメーション系の予備的なシステムは19 84年にHo,I．らにより記載されている（Biotechnology and Bioengineering Sym p．14:295-301）．この報告は，薬物抵抗性マーカーの存在およびトランスフォ ーメーション過程の直接的証明が開示されていないことから不完全である．最近 Candida utilisにおけるトランスフォーメーション系に関して新たな戦略がKond o，K.ら，1995によって報告された（J.Bacteriol．177:7171-7177）．彼らはシ クロヘキシミド（ＣＹＨ）抵抗性のトランスフォーマントを，抵抗性を付与する リボソームタンパク質Ｌ41の突然変異型を含有するマーカー遺伝子を使用するこ とにより得て，またＣＹＨ抵抗性トランスフォーマントの選択のためにマーカー を多重コピー中に存在させる必要から，プラスミドの組込みのための多重コピー 標的としてもリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）を使用した． これまでにCandida utilisを異種遺伝子発現のための宿主として用いる多くの 試みがなされてきたにもかかわらず，栄養素要求突然変異株を用いるCandida ut ilisでのトランスフォーメーション操作は現在まで開発されていない． Candida utilisの工業的利用で得られた知識およびその遺伝学における新規性 を考慮すれば，それは異種タンパク質の発現系としての経済的利用性から魅力的 な微生物であると考えられる． 発明の開示 本発明の目的は，酵母Candida utilisにおける異種タンパク質の発現に有用な ，この種の栄養素要求突然変異株の取得ならびにこの栄養素要求突然変異株を補 足するゲノムライブラリーからの異種遺伝子の単離に基づく，トランスフォーメ ーション系を提供することであった． 本明細書に記載のトランスフォーメーション方法はCandida utilis宿主細胞内 にＤＮＡフラグメントまたは配列を導入し，遺伝子発現およびタンパク質製造 用の宿主系としてのCandida utilisの使用を可能にする手段を提供する． さらに，トランスフォームされた酵母細胞は，本発明に記載された方法により 同定し，選択することができる．新規なCandida utilisの株，ベクターおよびサ ブクローンが提供される．新規な酵母株は組換えＤＮＡフラグメントの導入のた めの宿主として使用される． 本発明はさらに，マーカーが酵母のゲノムに相同にインテグレートされる安定 なトランスフォーメーションおよび宿主細胞におけるＤＮＡの維持に関する． 本発明は具体的には，酵母Candida utilis内のトランスフォーメーション系か ら構成され，上記酵母のNRRL Y-1084株から単離される新規な栄養素要求突然変 異株を宿主として使用する．これらの突然変異株は，ウラシルの生合成経路にお ける酵素，オロチジン-5’リン酸デカルボキシラーゼが欠損していて，先行技術 （Sherman，F.ら，1986，Laboratory course:Manual for methods in yeast gen etics．Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY）から既知のＵＶおよび突然 変異試薬ＮＴＧの両者を使用する古典的な突然変異誘発によって得られた．これ らの突然変異株は高い安定性（復帰頻度は約10^-8）を示し，本発明に記載の操作 により効率的にトランスフォームすることができる．加えてそれは，Candida ut ilisの突然変異株の選択マーカーとして，オロチジン-5’リン酸デカルボキシラ ーゼ酵素をコードするＵＲＡ3ならびにイミダゾール-グリセロールリン酸デヒド ラターゼ酵素をコードするＨＩＳ3を単離した．これらはｐＵＣ19中のCandida u tilisの遺伝子ライブラリーから単離されて，大腸菌株ＭＣ1066中でそれぞれpyr Fおよびhisb463突然変異の補足によって同定された．同様に，Sacchromyces cer evisiae株ＳＥＹ2202の突然変異ura3を使用してこの遺伝子がCandida utilisに 由来することを確認した．これらの遺伝子の完全な配列を決定したところ，推定 アミノ酸配列は他の酵母およびカビからの同じ遺伝子の配列と高い類似性を示し ている． トランスフォーメーションシステムに用いられたベクターは，Candida utilis 突然変異体宿主の相同の位置に相同組換えによりインテグレートできるＵＲＡ3 遺伝子からなる，プラスミドｐＵＲＡ5およびｐＵＲＥＣ3であった． 本発明はまた，異種タンパク質を得るためにCandida utilisから単離される 突然変異体のトランスフォーメーションに用いられる以前に記載されたプラスミ ドに基づくプラスミドのセットを提供する． 本発明のトランスフォーメーションシステムは，Candida utilisのNRRL Y-108 4株から得られた新規栄養素要求突然変異株を宿主として使用する．これらは， 主としてウラシルおよびヒスチジン経路に欠損を有し，とくに，それらの特性に より，突然変異体ＣＵＴ-35（ura^-）および突然変異体ＴＭＮ-3（his^-）が選択 された． 実施例： 実施例１：Candida utilisの突然変異誘発 微生物におけるトランスフォーメーションシステムの開発には，一般的に３つ のエレメントが要求される．すなわち， （１）栄養素要求または優性マーカーであり得るトランスフォーマントの選択 のためのマーカー， （２）この選択のための突然変異体または適当な宿主，および （３）宿主に細胞外ＤＭＡを効率的な型で再現性よく導入する方法 である．第二の目的を達成するため，酵母，Candida utilisに古典的な突然変異 誘発が行われた．選択された酵母株（NRRL Y-1084）の培養液をＹＰＧ培地（酵 母エキス１％，ペプトン２％，グルコース２％）100mlに接種し，振盪器中30℃ で10〜20時間インキュベートした．培養液50mlを3000rpmで５分間遠心分離した ．ついで，細胞を滅菌クエン酸緩衝液0.1Ｍ（ｐＨ5.5）で２回洗浄し，同じ緩衝 液50mlに再懸濁した．次に，この懸濁液10mlをＮＴＧの溶液で，終濃度50mg/ml に接種した．懸濁液を30℃に30分間静置してインキュベートした． 懸濁液を蒸留水で２回洗浄してＮＴＧを除去した．細胞をＹＰＧ50mlに再懸濁 し，ついで100mlのＹＰＧを含むエルレンマイヤーフラスコに移した．突然変異 細胞のこの培養液を30℃で48時間インキュベートした． ナイスタチンによる増菌 48時間ＹＰＧ発現培養液約5mlを最小培地100mlの接種に使用した．抗生物質に よる増菌に使用した最小培地（ＹＮＢ，酵母窒素ベース）は欠損が期待さ れる生合成経路によって産生される代謝物を補充しなかった．たとえばウラシル の栄養素要求突然変異株の単離には，ウラシルを培地に添加しない． インキュベーションは培養液の光学密度（ＯＤ）が開始時のＯＤの20〜30％に 達するまで続けた．培養液が所望のＯＤに到達した時点で，細胞液を25単位/ml のナイスタチン溶液で処理した．抗生物質を含む溶液を30℃で30分間攪拌せずに インキュベートした．細胞懸濁液を蒸留水で２回洗浄して培地からナイスタチン を除去し，ついで細胞を150〜200コロニー/プレートになるように適当な容量に 再懸濁した． スクリーニングおよび選択 実施例１による突然変異コロニーを含有するプレートをウラシルの存在下およ び不存在下にＹＮＢ培地中で平板培養した．ウラシルの不存在下に増殖しなかっ たコロニーを採取し，さらに分析に付した． ura3またはura5突然変異体の存在を特異的に同定するためには，細胞を5-フル オロト酸（5-ＦＯＡ）の存在下に増殖させた．抵抗性コロニーはura3またはura5 様突然変異体として選択された． 実施例２：ura3突然変異体の単離 ナイスタチンによる増菌後，培養液を蒸留水で２回洗浄し，0.75μｇ/mlの5- ＦＯＡ（５-フルオロ-オロト酸，Fluka）および40μｇ/mlのウラシルを含有する ＹＮＢプレート上に直接プレーティングした．プレートを４日間インキュベート し，増殖したコロニーをura^-表現型をチェックするために分析した．４×10⁴の 生存細胞から，ナイスタチン増菌後，79のコロニーが5-ＦＯＡに抵抗性を示した ．これらのコロニーはura3，ura5または単に5-ＦＯＡに抵抗性であった．ウラシ ル栄養素要求を確認するために，想定される突然変異体をＹＮＢ培地中にプレー ティングし，30℃で48時間インキュベートして，ウラシルの存在下または不存在 下にＹＮＢプレート中で複製させた．計67のコロニーがウラシルの不存在下にＹ ＮＢ中で増殖できず，ura^-表現型を示した． これらのすべての突然変異体の復帰の頻度は23の突然変異体のグループを観察 することで決定し，10^-8のオーダーの復帰頻度を認めた．これはそれらにトラン スフォーメーション系の宿主として使用できる安定性を付与するものである． ウラシル栄養素要求突然変異株すべてのオロチジン5'-モノリン酸デカルボキ シラーゼ（ＯＤＣase）活性は，Yoshimotoら，1978（Methods Enzymol．51:74-7 9）の方法によって決定し，同時にそれはそれらの増殖条件を決定した．結果は 表１に示す． 実施例３：表現型ura^-の異なる他の突然変異体の単離 ウラシル以外の異なる様々な栄養素要求突然変異体を得ることを目的に，ナイ スタチン増菌によって得られた細胞懸濁液をＹＰＧ中でプレーティングし，30℃ で50時間インキュベートした．次にＹＰＧプレートに含まれるコロニーをＹＮＢ 培地を含むプレート上で複製させ，30℃で48時間インキュベートした．ＹＮＢプ レート中で増殖できなかったコロニーを採取し，さらに分析した． 約2411個のコロニーをスクリーニングした結果，２％の栄養素要求突然変異体 が出現した．これらの突然変異体をHollidayおよびFinchan試験を使用してチェ ックした．90％のhis^-突然変異体が得られ，２％は表現型lys^-に，１％は表現型 leu^-に，１％は表現型met^-に，１％は表現型ade-に応答し，５％は単純な栄養素 要求表現型を示さなかった（Naa）． 復帰頻度10^-7〜10^-8を示す突然変異体を更なる分析のため選択した（表２）． 実施例４：Candida utilisのゲノムライブラリーの構築 Candida utilis NRRL Y-1084から抽出した染色体ＤＮＡを酵素Sau3Aで部分消 化し，低点ゲル温度アガロース（ＬＧＴ）中電気泳動によって6〜9kbの間のサイ ズのフラグメントを単離した．これらのフラグメントを予めBamH Iで消化しアル カリホスファターゼで処理したｐＵＣ19ベクター中にライゲートした．このライ ゲーション混合物を大腸菌ＭＣ1066（Ｆ’,Ｄ Lac×74，hsr，hsm，rpsl，gal U ，ga1K，tripC9030F，leuB，pyrF::tn5）株にトランスフォームした．ゲノムラ イブラリー中にほぼ95％の組換え体が得られた． 実施例５：Candida utilisからのＵＲＡ３遺伝子の単離 Candida utilis ura3宿主のトランスフォーメーションのためのマーカーとし て，Candida utilisからＵＲＡ3遺伝子を単離して，特性を解析した．Candida u tilis URA3遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをCandida utilis ｐＵＣ19ゲノム ライブラリーから，Saccharomyces cerevisiaeからのＵＲＡ３遺伝子が大腸菌の pyrF突然変異を補足することを考慮し，大腸菌内の偶発性のプロモーター活性を 用い，大腸菌のpyrF突然変異を補足する能力により単離した．この ライブラリーをウラシル欠損培地上に播いた場合，12個の独立したpyrF⁺コロニ ーが単離された．これらのクローンの２種（ｐＵＲＡ-2およびｐＵＲＡ-5）には ，HindIIIおよびEcoRＩ制限消化を用いてｐＵＣ19上のＤＮＡに同じ2.6kbゲノム のCandida utilisを挿入させた．両プラスミドからのＤＮＡは，大腸菌ＭＣ1066 からUra⁺に高頻度にトランスフォームされた．Candida utilis ＵＲＡ３遺伝子- ｐＵＣ19組換えプラスミド（ｐＵＲＡ-5）の１つの地図を図１に示す．このプラ スミドをさらに補足および配列分析に使用した． 実施例６：Candida utilis URA3遺伝子の境界および配列の分析 プラスミドｐＵＲＡ５を，数種の制限酵素で消化した．EcoRＩ（1.9kb），Hin cII（1,3kb），SacＩ（1.1kb）消化に相当するフラグメントをそれぞれｐＢlues cript ＳＫ（＋）にサブクローニングして，プラスミドｐＵＲＥc-3,ｐＵＲHinc -1，ｐＵＲSac-4が得られた．プラスミドｐＵＲSac-4に相当するフラグメントは 大腸菌のpyrF突然変異を補足できなかった（図２）． Candida utilisのＵＲＡ3遺伝子を含有する1.9kb EcoRＩフラグメント（ｐＵ ＲＥｃ-3，図３）を，Sangerら（1977，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463-5 467）の方法により完全に二重鎖配列を決定した． この目的では，Ｍ13ｍｐ/ｐＵＣシリーズのユニバーサルオリゴヌクレオチド ならびにその配列由来の内部オリゴヌクレオチドを用いた．1179bpのEcoRＩフラ グメントの完全配列を図４に示す（配列番号：１，２）．このフラグメントは80 0bp（266コドン）のオープンリーディングフレームを含有する．Candida utilis のＵＲＡ3遺伝子は，理論的分子量29,436Daのタンパク質をコードする．ＡＴＧ 開始コドンに隣接するヌクレオチド配列（GAAAATG）は酵母についてCigan & Don ehue，1987（Gene 59:1-18）により報告された配列（A/YAA/YAATG）によく一致 する． 3'-非翻訳領域には，大部分の真核細胞遺伝子の3'-末端領域に存在する推定ポ リアデニル化部位（TATAAAA，コンセンサスAATAAAA）を含有する（Guo,Z．& She rman，F.，1995，Mol.Cell.Biol．15:5983-5990）． 実施例７：Saccharomycescerevisiaeにおける補足の分析 クローン化されたフラグメントがCandida utilis ＵＲＡ3遺伝子に相当し， サプレッサー活性をもつフラグメントではないことを確証するため，ｐＵＲＡ5 プラスミドの2.8kb KpnＩ/XbaＩフラグメントをｐＢＲ322誘導体ベクター（ｐＢ ＳＡＲＴＲ-3）にクローン化した．ｐＢＳＡＲＴＲ-3ベクターはいずれもSaccha romyces cerevisiae由来の自律複製配列（ＡＲＳ１）ならびにＴＲＰ１遺伝子選 択マーカーを有する．したがって，プラスミドｐＵＴ64（図５）を得，これを用 いて，以前にItoら，1983（J.Bacteriol．153:163-168）によって報告された酢 酸リチウム法でSaccharomyces cerevisiae株ＳＥＹ2202（ura-52-,leu2-112，hi s3）をトランスフォームした． トランスフォーメーション後48時間にトランスフォーマントを得た．複製可能 なプラスミドの存在は，コロニーハイブリダイゼーションおよびサザンブロット 実験の両者を用いてチェックした． 得られたトランスフォーメーションの頻度（2〜5×10² transf/mg）は，他の 酵母からの他の栄養素要求マーカーについて文献に報告された値と一致する．す なわちCandida utilisからの遺伝子ＵＲＡ3はSaccharomyces cerevisiaeのura3 突然変異を補足できることが証明された． 実施例８：LiAc法を用いたプラスミドｐＵＲＡ5およびｐＵＣＵＲＡ3によるCa ndida utilis NRRL Y-1084 ＣＵＴ35のトランスフォーメーション Candida utilis ＣＵＴ35のura3突然変異株（寄託番号：未定）をItoら，1983 （J.Bacteriol．153:163-168）によって報告された酢酸リチウム法で，以前にCa ndida utilisから単離されたＵＲＡ3遺伝子を選択マーカーとして使用してトラ ンスフォームした．トランスフォーメーション系に用いられたベクター（ｐＵＲ 5およびｐＵＣＵＲＡ3）は，相同組換えによってCandida utilis突然変異株の相 同位置に直接インテグレートされるように設計された．プラスミドｐＵＣＵＲＡ 3はCandida utilis ＵＲＡ3遺伝子の1.8kb EcoRＩフラグメントをベクターｐＵ Ｃ19の相当部位にクローニングして得られた（図６）．トランスフォーメーショ ン操作の前に，両プラスミドを構造遺伝子の5'プライムに存在するXhoＩで消化 した．プラスミドの線状化がゲノム遺伝子座への相同インテグレーションには好 ましい． 使用した操作は無傷の酵母細胞のアルカリ金属陽イオン処理に基づくもので， 基本的にはSaccharomyces cerevisiaeについて報告されたのと同じ方法により10 0ｍＭに代えて50ｍＭのLiAcで処理した．トランスフォーマントの選択はウラシ ルを欠くＹＮＢ最小培地中で実施した．これらのトランスフォーマントの分裂安 定性は，相同インテグレーションの機構により高かった．トランスフォーメーシ ョンの頻度は．組込み型ベクターを用いSaccharomyces cerevisiaeおよび他の非 慣用酵母について報告された値に一致する（表３）． 実施例９：エレクトロポレーション法を使用したプラスミドｐＵＲＡ5および ｐＵＣＵＲＡ3によるCandida utilis ＣＵＴ35のトランスフォーメーション Candida utilis ＣＵＴ35のura3突然変異株を，以前に単離されたCandida uti lisからのＵＲＡ3遺伝子を選択マーカーとして使用してKondo,K.ら，1995（J.Ba cteriol．177:7171-7177）によって報告されたエレクトロポレーション法でトラ ンスフォームした．トランスフォーメーションシステムに使用したベクター（ｐ ＵＲ5およびｐＵＣＵＲＡ3）は相同組換えによりCandida utilis突然変異株の相 同位置に直接インテグレートされるように設計された． 使用された操作は無傷の酵母細胞の電場での処理に基づくものである．以下の 条件：パルスとして0.7kV（3.5kV/cm），800Ωの抵抗，ならびに静電容量25μＦ を用いた． トランスフォーメーション操作の前に，ゲノム遺伝子座への相同インテグレー ションを容易にするため，両プラスミドを構造遺伝子の5'プライムに存在するXh oＩで消化した． トランスフォーマントの選択はウラシルを欠くＹＮＢ最小培地中で実施した． ｐＵＲ5およびｐＵＣＵＲＡ3の両者を用いたトランスフォーメーションの頻度 はプラスミドの濃度に依存した．両方法（LiAcおよびエレクトロポレーション法 ）の比較を表３に示す． これらのトランスフォーマントの分裂安定性は，インテグレーションの機構に より高かった． トランスフォーメーションの頻度は，組込み型ベクターを用いSaccharomyces cerevisiaeおよび他の非慣用酵母について報告された値に一致する． 図７にはCandida utilisのゲノムにおけるインテグレーション現象の可能性な らびに一部のトランスフォーマントのサザンブロットを示す． 実施例10:Candida utilisのＨＩＳ3遺伝子の単離 Candida utilisからＨＩＳ3遺伝子を単離して，実施例４に前述したライブラ リーから特性を調べた．Candida utilisのＨＩＳ3遺伝子を含有するＤＮＡフラ グメントを，Saccharomyces cerevisiaeからのＵＩＳ３遺伝子が大腸菌のhisb46 3突然変異を補足することを考慮し，大腸菌内の偶発性のプロモーター活性を用 い，大腸菌ＫＣ8（hsd，hisB463，leuB6，pyrF::Tn5 Km^r，trp 9830（lact YA） ，stm，galU，gal）におけるhisb463突然変異を補足する能力によってCandida u tilisのゲノムライブラリーから単離した． ＨＩＳ3遺伝子を単離するためには，10⁵の細胞をウラシル，トリプトファンお よびロイシンを補充した最小培地（Ｍ9）上に播いた．この培地中で増殖が可 能で，したがって大腸菌ＫＣ8突然変異株におけるhisb463突然変異を補足できる コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した．単離されたプラスミドＤＮＡを用い て大腸菌ＫＣ8突然変異株をトランスフォームした．突然変異株のヒスチジン要 求性を補足できるすべてのプラスミドをｐＨＣＵと命名した．his⁺コロニーがCa ndida utilisのＨＩＳ3遺伝子を含有し，サプレッサー活性をもつＡＤＮフラグ メントではないことを確認するため，his⁺トランスフォーマントから得られた２ 種のプラスミド（ｐＨＣＵ37およびｐＨＣＵ40）をＰＣＲ反応に付した．酵母お よびカビからの５種のＩＧＰＤase配列中に高度に保存された２つの領域からの ２種の縮重オリゴヌクレオチドを使用した．縮重オリゴヌクレオチドのオリゴヌ クレオチドならびにアミノ酸配列を図８に示す． Candida utilisからのＨＩＳ3遺伝子のコード配列に相当する約500bpのＰＣＲ バンドを増幅した．サザンブロットによりCandida utilisゲノムＤＮＡにハイブ リダイズすることが示された約500bpのＰＣＲフラグメントをＴ-ベクター（ｐＭ ＯＳＢＬＵＥ，Amersham）中にクローン化し，その配列の推定アミノ酸翻訳が他 の酵母およびカビからのHis3pに高度に一致することを示した．このプラスミド ｐＨＣＵ３７（図９）を用いてCandida utilisからのＨＩＳ3遺伝子の全配列を 決定した． 実施例11：Candida utilisのＨＩＳ3遺伝子の配列決定 Candida utilisからのＨＩＳ3遺伝子はSangerら（1977）の方法を使用して完 全に二重鎖配列を決定した．Ｍ13ｍｐ/ｐＵＣシリーズのユニバーサルオリゴヌ クレオチドを用いた．ＰＣＲフラグメントから採取したプライマーを全遺伝子の 配列決定の開始に使用した．総長1190bpのｐＨＣＵ37の配列を決定した．Candid a utilisからのＨＩＳ3遺伝子の全配列を図10に示す（配列番号：５および６） ． このフラグメントは210コドンのオープンリーディングフレームを含有する．C andida utilisのＨＩＳ3遺伝子は，理論的分子量24,518Daのタンパク質をコード する． 実施例12：Candida utilisのインベルターゼをコードするＩＮＶ1遺伝子の単 離 Candida utilis中の酵素インベルターゼをコードするＩＮＶ1遺伝子を単離す るためには，この酵素のアミノ酸配列が異なる種の間で高度に保存された領域を 提供する事実を利用した．すなわち，酵母からのβ-フルクトフラノシダーゼの 配列をアラインした．上記ＰＣＲに使用した２種の縮重オリゴヌクレオチドはCa ndida utilisのコドン利用性に従って設計された．ポリペプチド配列および縮重 オリゴヌクレオチド配列を図11に示す． ＰＣＲにより417bpのバンドが発生し，それをＴ-ベクター(ｐＭＯＳBlue,Amer sham）にサブクローニングした．上記バンドの配列を完全に決定して，上記ＤＮ Ａフラグメントの翻訳はコンセンサス領域の存在，および文献に報告されている 酵素インベルターゼ中における高いホモロジーの存在を確証した．これは，単離 されたフラグメントがCandida utilis内でこの酵素をコードするＩＮＶ1遺伝子 に属することを証明した．このフラグメントを，Candida utilisからのＩＮＶ1 遺伝子の単離のためのプローブとして用いた． Candida utilisのライブラリーの検索後，ＩＮＶ1遺伝子を有する計６個のク ローンが単離された．これらのクローンの２種を配列決定のためのそれらのサイ ズに選択し（ｐＣＩ-6およびｐＣＩ-12），ＰＣＲのために前工程のオリゴヌク レオチドを用いた．これらのオリゴヌクレオチドを，プラスミドｐＣＩ-6に属す る両鎖からの遺伝子の完全な配列決定の開始に使用した． 実施例13：Candida utilisのＩＮＶ1遺伝子の配列決定 Candida utilisのインベルターゼをコードするＩＮＶ1遺伝子を含有するクロ ーンｐＣＩ-6の計2607bpをSangerら（1977）の方法によって完全に配列決定した ．この目的には，Ｍ13ｍｐ/ｐＵＣシリーズに属するユニバーサルオリゴヌクレ オチドならびにその配列に由来する内部オリゴヌクレオチドを用いた．2607bpフ ラグメントの完全な配列を図12に示す（配列番号：５および６）．このフラグメ ントは1602bp（534コドン）のオープンリーディングフレームを含有する．Candi da utilisのＩＮＶ1遺伝子は理論的分子量60,703Daのタンパク質をコードする． Candida utilis中のインベルターゼがペリプラズム酵素であることを考慮する と，それはそのＮ-末端にシグナルペプチドを有するはずである．この遺伝子 の5'-末端までの配列を分析すると，それらのＮ-末端のサイズのみが異なるタン パク質をコードするＯＲＦに位置を与える２つのコドンＡＴＧ（図12におけるＡ ＴＧ₁およびＡＴＧ₂）が観察される．両ＡＴＧから誘導される成熟タンパク質の ペプチダーゼシグナルの制限部位を予測するためにフォンハイジンのアルゴリズ ム（1986，Nucl.Acids Res．14:4683-4690）を適用すると，両場合についての制 限部位は，ＡＴＧ₁の場合残基Ｓ39とＳ40の間に，ＡＴＧ₂の場合残基Ｓ26とＳ27 の間に位置することが明らかである．これはそれぞれ，39および26アミノ酸のシ グナルペプチドに代えられる．酵母におけるシグナル配列の平均サイズ（約20残 基と推定される）を考慮するとＩＮＶ1遺伝子の開始コドンは第２のＡＴＧであ ると示唆することができる． 一般的な規則Ｎ-Ｘ-Ｔ/Ｓに従い，Ｎ−グリコシル化部位の可能性のある11個 の部位が，位置40，88，141，187，245，277，344，348，365，373，379および3 39のアスパラギンに見出された． 5'-非翻訳領域には領域−18〜−14および−212〜−208に２つの可能性のある ＴＡＴＡボックス（コンセンサスTATAA），また様々な可能性が考えられるリプ レッサーMgil（コンセンサスSYGGRG）のための合同部位が認められる． 図面の簡単な説明 図１．大腸菌ＭＣ1066pyrFならびにSaccharomyces cerevisiae ＳＥＹ2202ura 3突然変異の補足によってCandida utilisゲノムライブラリー中に得られたプラ スミドｐＵＲＡ5． 図２．Candida utilisからのＵＲＡ3遺伝子の制限酵素地図，配列決定戦略お よび補足分析． 図３．プラスミドｐＵＲＡ5の1.9kb EcoRIフラグメントの，ｐＢＬＵＥＳＣＲ ＩＰＴ ＳＫ（＋）中へのクローン化で得られるプラスミドｐＵＲＥＣ3． 図４．ＵＲＡ3遺伝子のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列，およびそれ をコードするＤＮＡのＤＮＡ配列． 図５．Saccharomyces cerevisiae ura3突然変異株における補足実験のために 得られたプラスミドｐＵＴ64． 図６．Candida utilisのトランスフォーメーション実験に用いられたプラス ミドｐＵＣＵＲＡ3． 図７．（Ａ）相同組換えによってＵＲＡ3遺伝子座にインテグレートされた ベクターＤＮＡの推測されるアレンジメント． （Ｂ）一部のトランスフォーマントからのゲノムＤＮＡのＤＮＡ-ブロ ットハイブリダイゼーション． 図８．ＨＩＳ3遺伝子の単離に使用されたプライマーのＤＮＡ配列，およびそ れをコードする推定アミノ酸配列 図９．大腸菌ＫＣ8hisb463突然変異の補足によってCandida utilisゲノムライ ブラリー中に得られたプラスミドｐＨＣＵ37． 図10．ＨＩＳ3遺伝子のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列，およびそれ をコードするＤＮＡのＤＮＡ配列． 図11．Candida utilisのＩＮＶ1遺伝子の単離のためのＰＣＲにおいて使用さ れたオリゴヌクレオチドのアミノ酸配列および相当するＤＮＡ配列． 図12．Candida utilisのＩＮＶ1遺伝子を含有するフラグメントに相当するＤ ＮＡ配列．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャベズ，エスピノザ，フランシソ パブ ロ キューバ国13400 シウダド デ ラ ハ バナ，セロ，カレ ７マ ナンバー 2305 エントレ ４タ イ アラングレン (72)発明者 ゴンザレズ，マルチネズ，マリア エレナ キューバ国12300 シウダド デ ラ ハ バナ，プラザ デ ラ レボリューショ ン，ベダド，カレ 26 ナンバー 1002 (72)発明者 リベロ，バエザ，タニロ キューバ国11300 シウダド デ ラ ハ バナ，プラヤ，レパルト セイバ，カレ 58ビー ナンバー 6703 エントレ 47 イ 49 (72)発明者 ベサベ，ツエロ，リリアナ キューバ国12100 シウダド デ ラ ハ バナ，プラヤ，キューバナキャン，カレ 186 ナンバー 3115 エントレ 31 イ 33，アパートメント ３シー (72)発明者 パイフェル，レイエス，エデニア キューバ国12100 シウダド デ ラ ハ バナ，プラヤ，キューバナキャン，カレ 184 ナンバー 3112 エントレ 31 イ 33，アパートメント 41 (72)発明者 デルガド，ボアダ，ジュリオ マルコス キューバ国12100 シウダド デ ラ ハ バナ，プラヤ，キューバナキャン，カレ 184 ナンバー 3112 エントレ 31 イ 33，アパートメント 52

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．酵母カンジダ・ウチリス（Candida utilis）のトランスフォーメーション システムにおいて，組換えＤＮＡでトランスフォーム可能な宿主酵母細胞を使用 し，この宿主は少なくとも１つの生合成経路が欠損しているシステム． ２．少なくとも１種のアミノ酸の生合成経路が欠損している宿主酵母細胞を使 用する「請求項１」記載の酵母Candida utilisのトランスフォーメーションシス テム． ３．ウラシル生合成経路が欠損している宿主酵母細胞を使用する「請求項２」 記載の酵母Candida utilisのトランスフォーメーションシステム． ４．宿主酵母細胞は酵素オロチジン-5-リン酸デカルボキシラーゼの活性が欠 損している「請求項３」記載のトランスフォーメーションシステム． ５．宿主酵母細胞はCandida utilis NRRL Y-1084 CUT35（寄託番号未定）であ る「請求項４」記載のトランスフォーメーションシステム． ６．少なくともヒスチジンの生合成経路が欠損している宿主酵母細胞を使用す る「請求項２」記載の酵母Candida utilisのトランスフォーメーションシステム ． ７．宿主酵母細胞は酵素イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドロターゼの 活性が欠損している「請求項６」記載のトランスフォーメーションシステム． ８．宿主酵母細胞はCandida utilis NRRL Y-1084 TMN3である「請求項７」記 載のトランスフォーメーションシステム． ９．組換えＤＮＡ材料は宿主に欠損している生合成経路の欠損を補足する機能 性遺伝子を含有する「請求項１」記載のトランスフォーメーションシステム． 10．機能性遺伝子はCandida utilisの遺伝子ＵＲＡ3である「請求項９」記載 のトランスフォーメーションシステム． 11．組換えＤＮＡ材料はプラスミドｐＵＲＡ5ならびにｐＵＣＵＲＡ3である「 請求項10」記載のトランスフォーメーションシステム． 12．機能性遺伝子はCandida utilisのＨＩＳ3遺伝子である「請求項９」記載 のトランスフォーメーションシステム． 13．組換えＤＮＡ材料はプラスミドｐＨＣＵ37ならびにｐＨＣＵ40である「請 求項12」記載のトランスフォーメーションシステム． 14．酵母カンジダ・ウチリス（Candida utilis）の酵母宿主細胞において，組 換えＤＮＡによりトランスフォームが可能であり，その宿主は少なくとも１つの 生合成経路が欠損している酵母宿主細胞． 15．宿主細胞は，少なくとも１種のアミノ酸の生合成経路が欠損している「請 求項14」記載の酵母宿主細胞． 16．宿主細胞は，少なくともウラシルの生合成経路が欠損してい「請求項15」 記載の酵母宿主細胞． 17．宿主細胞は酵素オロチジン-5-リン酸デカルボキシラーゼの活性が欠損し ている「請求項16」記載の酵母宿主細胞． 18．宿主細胞はCandida utilis NRRL Y-1084 CUT35（寄託番号未定）である「 請求項17」記載の酵母宿主細胞． 19．宿主細胞はヒスチジンの生合成経路が欠損している「請求項15」記載の酵 母宿主細胞． 20．宿主細胞は酵素イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドロターゼの活性 が欠損している「請求項19」記載の酵母宿主細胞． 21．宿主細胞はCandida utilis（NRRL Y-1084）TMN3株である「請求項20」記 載の酵母宿主細胞． 22．Candida utilisの酵母宿主細胞をトランスフォームできる組換えＤＮＡ材 料において，この組換えＤＮＡ材料は宿主に欠損している生合成経路の欠損を補 足する機能性遺伝子を含有する組換えＤＮＡ材料． 23．機能性遺伝子はCandida utilisのＵＲＡ3遺伝子である「請求項22」記載 の組換えＤＮＡ材料． 24．組換えＤＮＡ材料はプラスミドｐＵＲＡ5ならびにｐＵＣＵＲＡ3である「 請求項23」記載の組換えＤＮＡ材料． 25．機能性遺伝子はCandida utilisのＨＩＳ3遺伝子である「請求項22」記載 の組換えＤＮＡ材料． 26．組換えＤＮＡ材料はプラスミドｐＨＣＵ37ならびにｐＨＣＵ40である「請 求項25」記載の組換えＤＮＡ材料． 27．酵母Candida utilisのトランスフォーメーション操作において， （ａ）Candida utilisの酵母宿主株をアルカリ金属塩により処理し， （ｂ）工程（ａ）における細胞生成物をトランスフォーメーションに適当な条 件下に組換えＤＮＡ材料と接触させ， （ｃ）酵母宿主株のエレクトロポレーションに適当な条件下にトランスフォー メーションを進行させ． （ｄ）工程（ｃ）の細胞生成物を培養培地の選択条件下にプレーティングする 各工程からなる操作． 28．工程（ａ）において使用されるアルカリ金属塩は濃度50mMの酢酸リチウム である「請求項27」記載の操作． 29．工程（ｂ）におけるトランスフォーメーションに適当な条件は， −酢酸リチウムの塩で処理した細胞懸濁液と組換えＤＮＡの混合物の容量と 等容量の70％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液を加え， −30℃で60分間インキュベートし， −混合物を42℃で５分間処理して熱ショックを起こさせ，ついで −氷で５分間冷却する ことからなる「請求項27」記載の操作． 30．工程（ｃ）における酵母宿主細胞のエレクトロポレーションに適当な条件 は， −3.5kV/cmの電場， −800Ωの抵抗，および −25μＦの静電容量 である「請求項27」記載の操作． 31．酵母Candida utilisのトランスフォーメーション操作において，組換えＤ ＮＡ材料でトランスフォーム可能な酵母宿主細胞を使用し，この宿主は少なくと も１つの生合成経路が欠損している「請求項27」記載のトランスフォーメーショ ン操作． 32．少なくとも１種のアミノ酸の生合成経路が欠損している酵母宿主細胞を使 用する「請求項31」記載の操作． 33．ウラシル生合成経路が欠損している酵母宿主細胞を使用する「請求項32」 記載の操作． 34．酵母宿主細胞は酵素オロチジン-5-リン酸デカルボキシラーゼの活性が欠 損している「請求項33」記載の操作． 35．酵母宿主細胞はCandida utilis NRRL Y-1084 CUT35（寄託番号未定）であ る「請求項34」記載の操作． 36．少なくともヒスチジンの生合成経路が欠損している酵母宿主細胞を使用す る「請求項32」記載の操作． 37．酵母宿主細胞は酵素イミダゾール-グリセロールリン酸デヒドロターゼの 活性が欠損している「請求項36」記載の操作． 38．酵母宿主細胞はCandida utilis NRRL Y-1084 TMN3である「請求項37」記 載の操作． 39．組換えＤＮＡ材料は宿主に欠損している生合成経路の欠損を補足する機能 性遺伝子を含有する「請求項31」記載の操作． 40．機能性遺伝子はCandida utilisの遺伝子ＵＲＡ3である「請求項39」記載 の操作． 41．組換えＤＮＡ材料はプラスミドｐＵＲＡ5ならびにｐＵＣＵＲＡ3である「 請求項40」記載の操作． 42．機能性遺伝子はCandida utilisの遺伝子ＨＩＳ3である「請求項39」記載 の操作． 43．組換えＤＮＡ材料はプラスミドｐＨＣＵ37ならびにｐＨＣＵ40である「請 求項42」記載の操作． 44．Candida utilisのＵＲＡ3遺伝子をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１ ）． 45．Candida utilisのＨＩＳ3遺伝子をコードするＤＮＡ配列（配列番号：３ ）． 46．Candida utilisのＩＮＶ1遺伝子をコードするＤＮＡ配列（配列番号：５ ）．