JP2001500740A

JP2001500740A - 大きな反復ｄｎａ配列を安定にクローニングする方法

Info

Publication number: JP2001500740A
Application number: JP10514951A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ハリントン，ジョン; ボッケレン，ギルビー．バン; エフ．ウィラード，ハンティントン
Original assignee: ケースウエスタンリザーブユニバーシティ
Priority date: 1996-09-20
Filing date: 1997-09-22
Publication date: 2001-01-23
Also published as: EP0929666A1; AU743150B2; HUP9904203A3; HUP9904203A2; CA2266426A1; AU4429497A; US5869294A; WO1998012316A1; NZ334808A

Abstract

(57)【要約】反復DNAの大きな整列を安定にクローニングする方向性方法が開示される。この方法は、αサテライトDNAの安定なクローニングに特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】大きな反復DNA配列を安定にクローニングする方法合衆国に後援された研究および開発のもとで行われる発明に対する権利についての陳述本発明の開発中に行われた作業の一部は米国政府基金を利用した。米国政府は本発明の一定の権利を有する。発明の分野本発明は、遺伝子治療および遺伝子治療ベクター技法の分野に関する。本発明は、合成ヒト染色体、または関連の霊長類もしくは他の哺乳動物における合成染色体の開発および使用に関する。本発明は、一般的に、反復DNAの大きな整列の開発および使用に関する。発明の背景大きな反復DNAをクローニングする能力は、人工染色体および遺伝子治療ベヒクルの開発および構築に対する重要な段階である。さらに、微生物における反復 DNAの安定なクローニングは、哺乳動物染色体の高解像物理的マップを作成するために重要である。種々のクローニングシステムが、微生物における外来DNAのクローニングおよび繁殖を容易にするために開発されてきた。プラスミド、バクテリオファージ、および酵母人工染色体（YAC）が、多くの哺乳動物DNA配列をクローニングするためにうまく使用されてきた。しかし、いくつかのタイプの反復DNAは、これらのベクターで不安定なようである（Schalkwykら，Curr．Opin．Biotechnol．6(1): 37-43(1995)；Brutlag，D.ら，Cell 10:509-519(1977)）。これは、物理的ゲノムマップ中にギャップを生じ、そして反復DNA、特に非常に反復性の哺乳動物セントロメアDNAを繁殖する手段としてのこれらのベクターの使用を妨害する。細菌人工染色体（BAC）は、E．coliにおいて大きなDNAフラグメントのクローニングを可能にするように構築されている（O'Connerら，Science 244(4910):13 07-12(1989)；Shizuyaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89(18):8794-7(1992)； Hosodaら，Nucleic Acids Res．18(13):3863-9(1990)）。このシステムは少なくとも300kbまでの哺乳動物DNAを安定に拡大し得るようであるが、比較的少ない独立した哺乳動物DNAフラグメントが分析されている（Shizuyaら，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 89(18):8794-7(1992)）。さらに、BACベクターにおいて安定性についてテストされている２、３のフラグメントは、各フラグメントに存在する配列のタイプに関して広く特徴づけられていない。したがって、これらのフラグメントが反復DNAエレメントを含むかどうかは不明である。特に、制限部位およびサザン分析に基づくと、これらのフラグメントがαサテライトDNAを含まないことが明らかである。多くの哺乳動物DNA配列は、酵母人工染色体（YAC）ベクター中で安定であり、そして類似の長さのさらにいくつかの反復エレメントでは安定ではない（Neilら，Nucleic Acids Res．18(6):1421-8(1990)）。したがって、YACシステムに由来するDNA特性の知見は、非反復DNAから構成される類似のサイズのDNAが安定である条件下でさえ、反復ユニットの大きな整列が本来は不安定であることを示唆する。したがって、本発明の前には、BACベクターにおけるαサテライトDNAのような、反復ユニットの大きな(20〜100kb以上)整列の安定性は、どのような合理的な確実性でも予測できなかった。さらに、いくつかのαサテライト整列が先験的に BACベクター中で安定であったならば、セントロメア機能を容易にするために十分なサイズおよび配列組成の整列が、このベクター中で安定に繁殖され得ないかどうかは明らかではなかった。反復したDNAをクローニングおよび増殖させるために適する差異は、文献上で認識されている。さらに、文献は、反復の数とプラスミド不安定性との間の関連を明確に記載する。したがって、本明細書に記載されそして請求される本発明に対する参照の関連を考慮すると、DNA反復のタイプ、その配列組成、反復ユニットのサイズ、および反復整列の全体サイズを説明しなければならない。 Hoferら，Eur．J．Biochem．167:307-313(1987)は、69bp反復の６コピーまでの縦列整列のクローニングを記載する。２および４反復の縦列整列を安定であることが見い出された。しかし、６反復の整列は、この研究で使用されるプラスミド中で不安定であった。整列のサイズと安定性との間の関係を確立することに加えて、著者らは、「一旦ヘキサマー遺伝子が形質転換の明らかに致命的な段階を生き残ると、これはrecA、recBC、およびrec＋宿主で安定に複製される」ことに注目する。これは、プラスミドベクターにおいて反復DNA自体によって生じる不安定性の他に、直接反復を含むプラスミドのE．coliへの形質転換もまた縦列整列の不安定性を生じることを示す。発明者らの本明細書での開示の前には、本明細書に記載されるものと類似のサイズの大きな縦列整列の形質転換から生じるプラスミド不安定性に関する決定的なデータはなかった。したがって、このような整列が形質転換プロセス中にどのように不安定であるかを予測することは不可能であった。したがって、プラスミドベクターへの大きな整列をクローニングする可能性に適する証拠の不足の他に、Hoferらに記載された研究は、使用したベクターに関係なく、組換えを促進することなくE．coliにもとのままの大きな縦列整列を導入することが可能でなかったことを示唆する。 Sindenら，Genetics 129:991-1005(1991)は、間接的反復を含むプラスミドの構造不安定性を議論する。直接反復については、この研究および他の研究は、間接的反復のサイズと構造不安定性の程度との間の相互関係があることを示す。Si ndenらは、「E．coliにおけるプラスミドDNA中の150bpを超える長さの逆方向反復を維持することが困難である」ことおよび「長い逆方向反復をクローニングすることができないことおよび逆方向反復と関連する遺伝子不安定性が、多数の研究者によって報告されている」ことに注目する。したがって、これらの研究は、種々のクラスの反復DNAが種々の安定性特性を有すること、およびこの特性が反復整列のサイズ（および反復ユニットコピーの数）に相関することを示す。それぞれの場合、不安定性は、この出願に記載されるよりもはるかに小さい縦列整列サイズで観察された。 Leonhardtら，Gene 103:107-111(1991)は、直接および間接的反復を含むプラスミドの安定性を分析する。しかし、本明細書に開示されそして請求された反復整列とは逆に、記載された直接的反復は小さく（7bpくらい）そして２コピーのみで存在した。これらの反復は、プラスミド上で縦列に配置されなかった。これらは、介在するプラスミドDNA配列をしばしば数kbの長さによって分離された。直接的反復については、間接的反復は、大量の介在するプラスミド配列によって分離された。したがって、この研究で使用されるプラスミドは、大きな反復整列がプラスミドを使用してクローニングされ得たなんらかの証拠を提供しない。発明の要旨したがって、本発明の目的は、反復DNA、特にαサテライトDNAの均一またはハイブリッド合成整列を構築する方法を記載することである。本発明のさらなる目的は、反復DNA、特に天然に存在するまたは合成αサテライト整列のクローニング、繁殖、および安定な組換え産生の方法を記載することである。したがって、本発明は、大きな反復DNA配列を安定にクローニングする（すなわち、導入しそして増幅する）方法、上記の整列を含むベクター、このようなベクターで形質転換された宿主、および増幅されたベクターおよび／または配列を含む組成物に関する。図面の簡単な説明図１は、本発明の方法の概略図である。数字「１〜16」は、直線整列で縦列に整列された、αサテライトDNAのモノマーユニット（約171bp）の１〜16コピーを表す。「Ｘ」は、所望のサイズまで伸長中の整列を有するベクターの骨格における所望の制限酵素部位を表す。図２は、（50世代後の）組換え割合と整列サイズ（kb）との相互関係のグラフ表示である。好ましい実施態様の詳細な説明「安定に形質転換された」とは、反復ユニットを含むクローニングされたDNA 整列が、１世代当たり0.6％未満の組換え頻度(174kb整列について)および0.2％未満の組換え頻度（130kb整列について）で、少なくとも50世代の増殖について所望の宿主細胞で繁殖され得ることを意味する。130kbより小さい整列は、本発明の方法によってクローニングされる場合に、組換えがほとんどまたは全くない組換えを示す。「より高次数の反復」とは、より小さい（モノマー）反復ユニットから構成されるそれ自体である反復ユニットを意味する。αサテライト整列の基本的編制ユニットは、約171bpアルフォイドモノマーである。モノマーは、染色体特異的なより高次数の反復ユニットに編制され、これはまた、縦列に反復する。所定のより高次数の反復における構成モノマーの数は、わずか２（例えば、ヒト第１染色体）から30以上（ヒトＹ染色体）まで変化する。構成モノマーは、互いの相同性の程度が約60％から事実上配列同一まで変化することを示す。しかし、より高次数の反復は、所定のアルフォイド整列のほとんど全体を通して高い程度の相同性を保持する。本発明の方法は、微生物において、反復性、特にDNAの非常に反復性の領域を安定にクローニングする方法を提供する。所定の長さ、組成、配向、および適切な同調の整列が可能である。「適切な同調」とは、整列において何らかの所定のより高次数の反復の正確な長さおよび配向が、整列の構築によって天然に存在する配列から変化されないこと、および反復ユニットの連結部に非反復DNAがないこともまた意味する。アルフォイド配列については、例えば、より高次数の反復ユニットの長さおよび配向は、天然に存在するより高次数の反復と正確に同じであり、そして制限部位を生成するために改変された塩基を除いては、より高次数の反復の連結部に存在する非アルフォイド配列はない。したがって、DNAの反復縦列整列をクローニングする方法が提供され、ここで、第１のDNAユニットは、DNAユニットの反対末端が相補的であるが非アイソシゾマーの制限部位を含むように調製される。このDNAは、ベクターに連結され、そしてベクターは、制限部位の１つで直線化される。次いで、工程(a)のように調製された第２のDNAユニットは、指向性の反復整列を形成するように、上記第１のユニットと縦列に連結される。この整列は、宿主細胞、特に細菌宿主細胞中に形質転換され、そしてこの整列を含む安定なクローンが選択される。ベクターの直線化で開始して、これらの工程は、所望の整列サイズが達成されるまで反復される。本発明の指向性クローニングスキームは図１に示され、ここでは、αサテライトDNAのより高次数の反復のクローニングが示される。図に示されるように、本発明の方法は、「ビルドアップ」アプローチを利用し、ここでは、より短いユニット、好ましくはより高次数の反復が、反復ユニットのより長い縦列整列を生成するためにともに付加される。ユニットは、所定の配向を生じる方法で互いに付加され、これは、２つの異なる制限部位−各反復ユニットの各末端での１つによって確立される。好ましくは、縦列整列の基礎である反復ユニット、特により高次数の反復ユニットは、反対末端で、相補的であるが非アイソシゾマーの制限部位を含む。このような末端は、ポリメラーセ連鎖反応（PCR）のような方法を使用してユニット中に設計され得る。本発明の方法では、相補的末端によって、相補的突出末端と平滑末端の両方を含むことが意図される。好ましい実施態様では、DNA整列はアルフォイドDNAである。実施例１に示すように、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、相補的制限部位（BamHIおよびBglII）がヒト第17染色体からのαサテライト反復のより高次数の整合（register）の反対末端で生成されるように、単一の2.7kb DNAアルフォイドユニット（実際の長さ2.712kb）を増幅するために使用され得る。より高次数の反復の末端は、相補的制限部位が各反復の反対末端で生成されるようにポリメラーゼ連鎖反応媒介部位特異的変異誘発を使用して改変され得る。改変されたより高次数の反復は、次いで、ミニ-ＦクローニングベクターpBAC108L中にクローニングされる（参考として本明細書に援用される、Shizuya，Hら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:87 94-8797(1992)）。これらの相補的制限部位は、単一の改変されたより高次数の反復に由来するαサテライトDNAの合成整列を直接的にクローニングするために、非相補的フランキング制限部位とともに使用される（図１）。合成整列は、第 17染色体、Ｙ染色体、または他の染色体に由来するこのようなアルフォイドDNA を含む、任意のより高次数のアルフォイド反復から生成され得る。さらに、両方の染色体からのより高次数の反復からなるハイブリッド整列が調製され得る。好ましい実施態様では、DNAはヒトDNAである。 200〜215kbまでの整列は、本発明のベクターおよび宿主中で安定である。１つの実施態様では、87kb〜215kbの長さの整列が構築される。好ましい実施態様では、少なくとも100kbの長さの整列が構築される。非常に好ましい実施態様では、少なくとも140kb、特に少なくとも174kbの長さの整列が構築され；174kbの整列は、機能的αサテライト整列の最小の公知の観察される長さを越える。このような部位を生成することに有用である、有用で相補的であるが非アイソシゾマーの制限酵素の例には、以下が含まれる：SalIおよびXhoI；MunIおよびEc oRI；AflIIIおよびNcoI/StyI（アイソシゾマー：いずれか１つが非アイソシゾマーパートナーに対するパートナーであり得る）；NheIおよびXbaIおよびStyI/Avr II（アイソシゾマー）およびSpeI（任意の組み合わせ）；ClaIおよびBstBIおよびAccI（任意の組み合わせ）；MluI/AflIII（アイソシゾマー）およびBssHIIおよびAscI；ならびにNotIおよびEagI。BclIは、BamHIおよびBglIIの両方の相補的／非アイソシゾマーである。増幅されたDNAを、次いで、例えば、(1)BamHI＋SfiIまたは(2)BglII＋SfiIを使用して切断する。例えば、ゲル電気泳動のような、このようなDNAを分離し得る物理的方法を使用して、切断されたDNA中のバンドを分離した後、１つの切断物からのDNAバンドを切り出し、そして他の切断物から切り出したDNAバンドに連結する。上記の実施例では、BglIIおよびBamHIが適合性突出を生成し、そしてSf iIが特定の配向でのみ再連結し得る非対称突出を生成するので、これらの部位に隣接するDNAはベクターDNAに連結して、先端−末尾様式で整列した縦列ダイマーを生成する。次いで、このDNAは、微生物中に形質転換され得る。この方策の第２のバリエーションでは、平滑切断制限酵素は、BamHIおよびBgl Iに置換され得る。例えば、SmaIおよびEcoRVは、それぞれBamHIおよびBglIIに置換され得る。切断およびフラグメント単離は、次いで、上記のように行われる。平滑および相補的／非アイソシゾマー改変の両方に共通の、この方策の重要な特徴は、整列の生理学的同調が、所望であれば正確に維持され得ることである。使用され得る追加の平滑切断酵素の例には、SspI、StuI、ScaI、PmlI、PvuII、Ecl 136II、NaeI、EheI、HincII、HpaI、SnaBI、NruI、FspI、DraI、MscI、Bst107I 、AluI、Asp700/XmnI、AviII、BbrPI、Bstl107I、Eco47III、DpnI、HaeIII、Hin dII、NamI、MluMI、MvnI、RsaI、SwaI、Bsh1236I、Eco72I、PalI、およびSrfIが挙げられる。合成αサテライトDNAの大きな縦列整列を含むクローニングされたプラスミドの安定性は、実施例２に記載のように単純増殖および希釈実験を使用して決定され得る。例えば、安定性は、50世代の継代および構造完全性についてのプラスミドDNAのその後の分析によって決定され得る。プラスミド構造は、制限分析、およびアガロースゲル電気泳動によって分析され得る。これらのクローンについて組換えはほとんどまたは全く観察されず、これは、方向性クローニングスキームが、ミニ-Ｆクローニングベクター（例えば、pBAC108Lベクター）および適切なE ．coli宿主に関して合成αサテライト整列を構築および繁殖するために用いられ得ることを示す。本発明の方法は、任意の所望の反復DNAユニットまたはユニットの組み合わせを構築するために使用され得る。例えば、任意の真核生物染色体、特にヒトDNA からのαサテライトDNAがクローニングされ得る。非常に反復性のDNAの大きな縦列整列の他の例には、免疫グロブリンDNA遺伝子座、ヘテロクロマチン反復の領域、およびテロメアが挙げられる。本発明の方向性クローニング方法は、内因性（非改変）整列をクローニングする場合に必要なように、多型制限酵素の存在を必要としない。存在する場合でさえ、これらの部位は、整列の正確なサイズの制御を可能にしない。さらに、本発明の方法（図１を参照のこと）で使用されるような単一のより高次数の反復を使用し、そのサイズを連続して倍にすることによって、元のより高次数の反復の配列が公知であるので、完全な整列の正確な配列は公知である。例えば、内因性αサテライト整列のような内因性整列をクローニングする場合、所定の整列の正確な組成は確信され得ない。特に、非反復DNAによる整列の中断は、E．coliにおける安定性に著しい影響を有し得る。さらに、遺伝子治療のためのベクターとして適切であるために、このような治療のレシピエントに提供されるベクターの正確な配列が知られていなければならない。本発明の方法は、その問題を取り除き、そして当業者が公知の反復配列から新たに有用な整列を構築するために、天然のままのαサテライト整列の配列決定を回避することを可能にする。構造的に異なるより高次数の反復は、一般的に、より同種の整列に対してE．c oliで増加した構造安定性を示す。したがって、本発明の方法による同種合成整列を利用することによって、ベクター中の反復DNAの最小安定性の正確な決定が得られ得る。しかし、異種整列を構築することが所望され得る。この場合、本発明の有利点は、さらに異種ユニットの構築に適用される。ユニットの特定の数および次数は制御され得る。ベクターが安定に維持される任意の所望の細菌宿主は、宿主として使用され得る。特に、E．coliは、BACベクターおよびBAC系を利用する場合に有用である。合成αサテライト整列は、以下の様式で合成ヒト染色体の構築に利用され得る：(1)ヒトまたは他の哺乳動物細胞株への、合成αサテライト整列を含むエピソームのトランスフェクション；(2)ヒトまたは他の哺乳動物細胞株への、ランダムにクローニングされたヒトDNAまたは特異的DNAフラグメントとともに合成αサテライト整列を含むエピソームのトランスフェクション；(3)ヒトまたは他の哺乳動物細胞株への、αサテライト含有エピソームDNAの分裂安定性を増強するテロメアDNA、マトリクス付着領域、および／または他の染色体遺伝子座のような連結されていない特異的染色体成分と、合成αサテライト整列との同時トランスフェクション。連結されていない形態でのこれらの成分の同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞株が無数の構造置換を構築することを可能にし、保持されたほとんど安定な形態を可能にし、一方、不安定な形態は経時的に喪失する。安定なコンホメーションは、その後標準的方法および手順を利用して回収され得る。選択圧の非存在下でエピソーム安定性を示すこれらの構築物は、単離され、続いて遺伝子、リボザイム、またはアンチセンス転写物のような１つ以上の治療的に有用な実体を含む遺伝子治療ベクターの調製に利用され得る。本発明のさらなる局面では、本発明者らは、反復DNAの大きな整列がプラスミドベクターで安定に増幅され得ることを発見した。これは、当該技術分野でのこれまでの結果から予測されない。本発明者らは、プラスミドにおいて大きな反復インサートの安定なクローニングについて、挿入サイズとプラスミドコピー数との間に逆関連があることを発見した。したがって、本発明の代わりの実施態様では、反復DNAは、隣接する制限酵素部位での制限なしに、プラスミドベクターに直接挿入される。DNAは、天然の配列（例えば、ゲノムDNAを切断することによって産生されるゲノム反復配列）、上記のおよび本明細書で例示される「ビルドアップ」アプローチによって産生される整列、合成整列、またはこれらの組み合わせであり得る。したがって、任意の反復ヌクレオチド配列が、プラスミドベクターへのクローニングに潜在的に利用可能である。本発明の非常に好ましい実施態様は縦列方向反復からなる反復DNAに関するが、本発明は、反復DNAの他の形態を包含する。これらには、散在した反復配列および逆方向反復が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、同じ反復ユニットだけでなく、異種反復ユニット、例えば、分枝した反復配列を包含する。さらに、反復配列のこれらのタイプの任意の組み合わせも、本発明に包含される。さらに、本発明は、天然または合成反復配列を包含する。本発明はまた、任意のおよびすべての生物学的機能を有する反復配列を包含するが、好ましい実施態様では、セントロメア機能（すなわち、キネトコアとの同時局在化）が包含される。これらには、任意の生物から、特に哺乳動物からのセントロメア配列が挙げられるが、これらに限定されず、これには、ヒトおよび霊長類供給源からのαサテライトDNA、Mus musculusからのマイナーサテライトDNA 、Mus caroliからの69および79bp反復、サテライトIII、βサテライト、γサテライト、メジャーサテライト、ならびに縦列反復のこれらのクラスのそれぞれのすべてのサブモノマー反復が挙げられる。本発明は有用でありそして任意のタイプの反復DNAを包含するが、反復DNAの好ましい実施態様は、サブモノマー配列を含むものを包含する。最も好ましくは、縦列反復配列が本発明に包含される。本発明は、特に、約170bpを越えるユニット反復長に関する。最も非常に好ましい実施態様では、反復DNAは、ヒトαサテライトDNAである。反復DNAインサートについての最小サイズ範囲は、少なくとも約20kbである。しかし、本発明は、20から140kbを越えるまで、例えば、40、60、80、100、120 、および200kbを越える、任意の範囲を包含する。任意のプラスミドベクターは、プラスミドが特異的反復DNAインサートを安定に増幅するように十分に低いコピー数で維持され得る限り、本発明の実施に潜在的に利用可能である。例としては、細菌人工染色体（BAC）ならびに他のＦ因子ベースのプラスミドおよびP1ベクターが挙げられるが、これらの限定されない。好ましい実施態様では、プラスミドは、Ｆ因子ベースのプラスミドである。非常に好ましい実施態様では、プラスミドは、pBAC108Lのような、細菌人工染色体である。もちろん、プラスミドが細菌／原核生物起源に由来する必要がないことが理解される。全ての細菌プラスミドは潜在的に本発明に包含されるが、真核生物供給源に由来するプラスミドもまた包含され得る。さらに、ウイルスプラスミドも有用である。このようなプラスミドは、当業者に公知である。例えば、ATCC Recom bjnant DNA Materials，ATCC Bacteria and Phages，and Cloning Vectors，Pou wels編を参照のこと。このすべてが、関連の技法についての参考として本明細書に援用される。当業者が、所定のプラスミドが所望の長さの所定の反復DNA配列を安定に増幅し得るかどうかをテストすることを可能にする日常的アッセイが存在する。これは、本明細書中において方法および実施例の項に記載される。あるプラスミドは、本来、プラスミドに内因性のエレメントによって低コピー数で維持されるが、当業者は、プラスミドのコピー数を潜在的に減少させるための方法を知っている。これらには、複製起点を変異すること、プラスミド複製を担うタンパク質をコードする遺伝子を変異すること、ならびに最少培地中でのあるいはより高いまたは低い培養温度でのプラスミド含有細胞の増殖が挙げられるが、これらに限定されない。ここでは本発明を一般的に記載したので、例示によって提供される以下の実施例への参照によって、本発明がより容易に理解され、そして明記されなければ、本発明を限定するようには意図されない。実施例実施例１第17染色体αサテライトベクターの構築 BACベクターを使用してE．coliにおけるαサテライトDNAをクローニングおよび繁殖するために、種々のサイズの一連の縦列αサテライト整列を構築した。ヒト第17染色体からのより高次数のαサテライト反復の構造は以前に記載されている（WayeおよびWillard，Mol．Cell．Biol．6(9):3156-65(1986)）。ヒト第 17染色体の優勢なより高次数の反復は、2.7kb長であり、そしてEcoRI部位に隣接する16アルフォイドモノマーからなる。ヒト第17染色体またはヒトＹ染色体に由来する、より高次数の反復のαサテライトDNAの別々の構造ユニットを、制限酵素EcoRIでヒトゲノムDNAを切断することによって、プラスミドクローニングベクターpACYCl84（New England Biolabs）にクローニングした。クローニングしたより高次数の反復のヌクレオチド配列を、DNA配列分析によって確認した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、相補的制限部位（BamHIおよびBglI I）がより高次数の整合（register）の反対末端で生成されるように、一本鎖2.7 kbのより高次数の反復モノマーを増幅した。より高次数の反復の正確な長さを維持した。このフラグメントを増幅するために使用したプライマー対は、以下のものであった：改変されたより高次数の反復を、BamHIで、増幅したフラグメントを切断し、挿入DNAをゲル精製し、そしてBamHIおよびHpaIで切断してゲル精製したベクターDN Aに連結することによって、BACベクターpBAC108L（Bruce Birren，California I nstitute of Technology，Pasadena，CAからの贈与）にクローニングした。得られるプラスミドを、pBAC-17α1と命名した。 αサテライトDNAの合成ダイマーを構築するために、pBAC-17α1のアリコートを、(1)BamHI＋SfiI、または(2)BglII＋SfiIのいずれかで別々に切断した。ゲル電気泳動の後、BglII/SfiI切断物からの2.7kbαサテライトバンドを切り出し、そして切り出したpBAC-17α1 BamHI/SfiIフラグメントに連結した。BglIIおよび BamHIが適合性突出を生成し、そしてSfiIが特定の配向でのみ再連結し得る非対称突出を生成するので、2.7kbフラグメントは、先端−末尾様式で整列した縦列ダイマーを生成するようにベクターDNAに連結する。連結産物を、エレクトロポレーションによって細菌株DH10Bに形質転換した。クローンを制限分析によって分析し、そして第17染色体αサテライトの縦列整列した改変したダイマーを含むクローンを、pBAC-17α2と命名した（図１）。この方策を繰り返して、４、８、 16、32、48、または64より高次数のαサテライト反復からなる伸長したαサテライト整列を生成した。類似の方策を利用して、Ｙ染色体のような他のヒト染色体からのより高次数の反復の合成整列を構築した。 αサテライトDNAの174kbを含むBACベクターの構築は、これまでにE．coliにクローニングおよび繁殖されるこのクラスのDNAの最大量を示す。これまでの実験は、コスミドを使用して、E．coliにおいて約40kbをうまくクローニングした（W illardら，Prog．Clin．Biol．Res．318:9-18(1989)）。他のものは、約171bpアルフォイドモノマーから40kbまでのサイズの範囲の整列をクローニングするために、中程度のコピー数のプラスミドを使用した（WayeおよびWillard，NucleicAc ids Res．15(18):7549-69(1987)）。当該技術分野での報告された研究では、組換えの高頻度が、最大のアルフォイド整列を含むプラスミドで観察された。逆に、pBAC-17α64の繁殖中、本発明者らは、プラスミド精製の標準的方法を利用して組換え産物の証拠をほとんど観察しなかった。αサテライトDNAの不安定性がこれらのクローニングベクターの状況において示されているので、本発明者らは、ゲル電気泳動を利用して、明らかに再整列された整列の存在について、pBAC-1 7α64の本発明者らの調製物を分析した。このアッセイによって、再整列されたプラスミドの顕著なレベルの存在は検出できなかった。実施例２安定性アッセイ実施例１からの合成αサテライト整列における組換えおよび／または欠失の高レベルの証拠は観察されないが、組換えは比較的高レベルで生じるが多数の種々の欠失産物は任意の１つの産物が検出可能になることを防ぐ可能性があった。したがって、非常に感度のあるアッセイを利用してこれらの構築物の組換えの割合を決定した。さらに、より大きな整列はより小さなものよりも安定でないと予測され得るので、いくつかの異なるサイズの構築物を試験した。これらの構築物の安定性を以下のように検査した。安定性アッセイを、上記のように、pBAC108Lにクローニングされている３つの異なるαサテライト整列サイズを使用して行った。pBAC-17α32、pBAC-17α48、およびpBAC-17α64と呼ばれるこれらの構築物は、それぞれ、αサテライトDNAの 87kb、130kb、および174bpを含む。E．coli株DH10B（GIBCO BRL）への形質転換（エレクトロポレーション）後、単一のクローンを取り出しそして分析した。形質転換プロセス自体がDNA再配置を導き得る可能性があるので、制限切断および電気泳動によって判断される場合、優勢な全長構築物を含むクローンのみが、グリセロールストックとして役立った。安定性アッセイを開始するために、各構築物のグリセロールストックからの細胞を、12.5μｇ/mlクロラムフェニコールを含むLBプレート上に画線した。得られるコロニーのうちの８個を取り出し、そして12.5μｇ/mlクロラムフェニコールを含む５mlのLB中で飽和になるまで個々に培養した（約20世代）。次いで、各クローンからのプラスミドDNAを精製し、BamHIで切断し、そしてパルスフィールドゲル電気泳動によって分離した。任意の全長プラスミドを含むクローンは、単一細胞段階で全長プラスミドを有するといわれた。任意の検出可能な全長プラスミドを含まないクローンは、再画線前の組換え事象の結果（すなわち、グリセロールストックの産生中に生じた再配置）であるといわれ、そして除外した。いくつかの全長プラスミドを含むクローンのうち、10培養物がランダムに取り出され、12.5μｇ/mlのクロラムフェニコールを含む新しいLB中に１対百万に希釈され、飽和になるまで培養された（約30世代）。単一細胞からこの最終飽和した培養物まで、約50世代の培養が起こった。これらの50世代中に再整列したプラスミドの割合を決定するために、各飽和した培養物を、12.5μｇ/mlクロラムフェニコールを含むLBプレート上に画線した。次いで、個々のコロニーを、12.5μｇ/mlクロラムフェニコールを含む1.5ml L B中で飽和になるまで培養した。培養後、DNAを精製し、そして制限切断（BamHI) およびPFGEによって分析した。検出可能な全長プラスミドを含む任意のクローンを、50世代実験中に再整列しないとしてスコア付けした。逆に、任意の検出可能な全長プラスミドを含まない任意のクローンを、50世代実験中に再整列するようにスコア付けした。各構築物について世代当たりの平均再配置頻度を算出するために、再配置したクローンの画分を、50世代後に決定した。１−[この値]は、再配置されないクローンの画分に等しい（50世代後）。１世代後に再配置するクローンの画分は、１ −[50世代後の再配置されなかったクローンの画分の50乗根]である。これは以下の等式にまとめられる：Ｘ＝１−（１−Ｙ）^1/50 ここで、Ｘは世代当たりの再配置するクローンの画分であり、そしてＹは50世代の増殖後の再配置されたクローンの画分である。この方策を使用して、構築物を含む３つのαサテライトの組換え頻度を決定した。50世代の増殖後、pBAC-17α32クローンの０％（n＝9）は短縮形態に組換えた。組換え体を、それぞれ8.5％（n＝59）および25％（n＝84）のレベルでpBAC- 17α48およびpBAC-17α64について検出した。これは、１世代当たり、pBAC-17α 48については0.18％およびpBAC-17α64については0.57％の組換え頻度に対応する。したがって、この組換え頻度は、はるかに少ないアルフォイドDNA（例えば、40kb）を含む他のクローニングベクターについて報告されたよりも顕著に低く、そしてより少ない世代（例えば、30世代）について培養される。この結果は、少なくとも174kbのサイズまでのαサテライト整列が、本発明の方法でBACベクターを使用してE．coli中で安定に繁殖し得ることを示す。174kb および130kb整列は、それぞれ、世代当たり、0.57％および0.18％の頻度で組換える。したがって、例としてpBAC-17α64を使用して、単一細胞からの増殖の50 世代後に、約1,000リットルの飽和した細菌培養物は、単一細胞から産生され得そして少なくとも75％の細胞が平均して全長pBAC-17α64を含む。再配置のこの程度は、遺伝子治療での使用のためのヒト人工染色体を含むαサテライトの大規模産生のために予測された受容可能な範囲内にはいる。 pBAC108LでのαサテライトDNA再配置の頻度を決定する他に、非常に反復性の αサテライト整列のサイズとこのベクター中でのその安定性との間の相互関係を確立した。上で決定した組換え頻度に基づいて、BACベクターにおける同種αサテライトDNAの最小の上限サイズの見積もり（50世代後の50％の全長クローンは受容可能であると見なす）は、保存的に200と215kbとの間である（図２）。これを、コンピュータプログラムCricket Graphを使用してエクストラポレーションによって決定した。他の株は、データを適合しそして上記のものよりも大きな見積もりを生じることが見いだされるので、これは、アルフォイド能力の最小の見積もりである。この相互関係から、200〜215kb整列、および細菌株DB10Bでの繁殖を使用する場合、50％以上のプラスミドは50世代後に全長であることが見積もられる。この上限サイズの数字は、特定化した組換え防御細菌株とともにBACベクターを利用することによって広げられ得るようである。さらに、この見積もりは、最大同種整列に基づく。ある天然のαサテライト整列を含む異なる整列の安定性は、この見積もりを越えるべきである。本明細書に記載された実験は、E．coliにおいて50kbより大きいαサテライト整列の最初の安定なクローニングおよび繁殖を示す。以前に、αサテライトDNA は、コスミドを使用してE．coliでクローニングされている（Haafら，Cell 70(4 ):681-96(1992)）。これらの整列の比較的小さいサイズ（40kbと等しいまたはそれより小さい）の他に、これらの整列の完全性および安定性を分析しなかった。 αサテライトDNAはまた、YACを使用してクローニングされている（Neilら，Nucl eic Acids Res．18(6):1421-8(1990)）。これらの研究では、αサテライト整列の不安定性に注目し、そしてアガロースゲル精製のようなさらなる操作を、優勢な全長整列を含む調製物を得るために必要とした。さらに、αサテライトDNAを繁殖するためにYACを使用することに特定の不利点がある。おそらく、これらのうちの最も重要なものは、YACのトポロジーに関連する。一般に、YACは、直鎖状 DNA分子であり、したがって、単純アルカリ溶解精製方法論は、夾雑する酵母染色体からαサテライト構築物を精製するために使用され得ない。その代わりに、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）、スケールアップに従わない分離方法が、使用されなければならない。最後に、YACの直線トポロジーは、精製中に特に剪断を受けやすくする。ここでは、本発明者らは、BACを含むαサテライトは採取され、そして実質的に剪断されずにE．coli染色体DNAから精製され得ることを実証した。これまでの研究は、αサテライトDNAが機能的ヒトセントロメアの重要な成分であることを示唆する。天然に存在するαサテライト整列は、230kb〜数メガ塩基長までのサイズの範囲にある（OakeyおよびTyler，Genomics 7(3):325-30(199 0)；WevrickおよびWillard，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86(23):9394-8(1989) ）。しかし、近年の研究は、140kbほどの小さいαサテライトDNAが、ヒト細胞においてセントロメア機能を与えるために十分であることを示唆する（Brownら，H uman Molecular Genetics 3(8):1227-1237(1994)）。本明細書で記載するαサテライト整列構築物は、機能的ヒトセントロメアのαサテライト要求性を満たすために十分大きいαサテライト整列の大規模で安定な産生を可能にする最初のものである。これらの構築物は、合成ヒト染色体の骨格として役立ち得る。実施例３Ｙ染色体αサテライトベクターの構築構築を、ヒト男性Ｙ染色体細胞株GM07033からのDNAを使用したこと；任意のヒト正常男性細胞株からのDNAが等価であることを除いて、実施例１のように行った。ヒトＹ染色体状の優勢なより高次数のアルフォイド反復は5.7kb長であり、そして隣接するEcoRI部位によって限界が示される。Ｙ染色体アルフォイド整列からの5.7kbのより高次数の反復を、標準的E．coliクローニングベクターpACYC1 84（New England Biolabs）にクローニングした。次いで、より高次数の反復の末端を、PCRを使用して改変して、一方の末端にBamHI部位および他方の末端にBg lII部位を生成し、現存するEcoRI部位を置換した。改変されたより高次数の反復を、上記のようにpBAC108Lクローニングベクターにクローニングした。実施例４ハイブリッドαサテライトベクターの構築ヒト第17染色体とヒトＹ染色休の両方からのアルフォイドDNAを使用した以外は、構築は実施例１のようであった。２つの型の整列を構築した。１つの整列は、単純な交替した反復であり、ここでは、第17染色体アルフォイドDNAの１つのより高次数の反復ユニットは、Ｙ染色体アルフォイドDNAからの１つのより高次数の反復ユニットで変更した。構築された第２のタイプの整列は、アルフォイド DN Aの染色体Y反復の１つのユニットで、アルフォイドDNAの第17染色体のより高次数の反復のダイマーユニットを交替した。各場合において、上記の実施例でのように、各染色体に由来するより高次数の反復の適切な同調を、合成ハイブリッドの連結で保持した。上記のことは特定の好ましい実施態様を述べるが、本発明がそのように限定されないことが理解される。種々の改変が、開示された実施態様に行われ得ることおよびこのような改変が本発明の範囲内であると意図されることは、当業者が考えつくことである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バンボッケレン，ギルビー. アメリカ合衆国カリフォルニア 94022, ロスアルトス，マーシデスアベニューナンバー28 1070 (72)発明者ウィラード，ハンティントンエフ. アメリカ合衆国オハイオ 44122，シェイカーハイツ，シェイカーブールバード 22565

Claims

【特許請求の範囲】１．増幅されたプラスミドベクターであって、反復DNA整列（array）からなる配列を含み、該整列が、反復DNAユニットを含み、ここで、該整列が約20キロ塩基長より大きい、ベクター。２．前記DNAがセントロメアDNAである、請求項１に記載のベクター。３．前記セントロメアDNAがαサテライトDNAである、請求項２に記載のベクター。４．前記αサテライトDNAの前記整列が100kb長より長い、請求項３に記載のベクター。５．前記αサテライトDNAの前記整列が140kb長より長い、請求項４に記載のベクター。６．前記αサテライトDNAがヒトαサテライトDNAである、請求項２に記載のベクター。７．請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクターで安定に形質転換された、宿主細胞。８．前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。９．前記原核生物細胞がE．coliである、請求項８に記載の宿主細胞。１０．前記プラスミドベクターがＦ因子ベースである、請求項１に記載のプラスミドベクター。１１．前記プラスミドベクターがBACベクターである、請求項１０に記載のプラスミドベクター。１２．請求項１〜６、１０、および１１のいずれか一項に記載のプラスミドベクターを増幅する方法であって、 (a)該ベクターを宿主細胞に導入する工程；および (b)該ベクターを該宿主細胞中で複製させる工程、を包含する、方法。