JP2001269196A

JP2001269196A - 被検体核酸の定量方法、および被検体核酸の分子数の計数方法

Info

Publication number: JP2001269196A
Application number: JP2000085048A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Hirano; 憲一平野; Tadashi Fukami; 正深見
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 2000-03-24
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2001-10-02

Abstract

(57)【要約】【課題】試料中の微量な遺伝子やｍＲＮＡなどの被検
体核酸を正確に定量する。【解決手段】被検体核酸に由来する標的ＤＮＡを含む
ＰＣＲ溶液をキャピラリープレートのチャンネル内に分
注し、キャピラリープレートをそのままＰＣＲの温度サ
イクルで処理し、チャンネル内の標的ＤＮＡをＰＣＲに
より増幅し、増幅された標的ＤＮＡが蛍光を発するチャ
ンネルを画像解析により特定、計数することによって、
最初に試料中に存在した被検体核酸の分子数を計数・定
量する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、極微量で試料中に
存在する遺伝子またはｍＲＮＡなどの核酸を定量する方
法に関する。さらに詳しくは、本発明はＰＣＲに基づ
き、極微量で試料中に存在する遺伝子またはｍＲＮＡな
どの核酸または該核酸に由来する標的ＤＮＡを増幅させ
て、もともと試料に存在した核酸の分子数を計数する方
法、並びに該計数結果から核酸の濃度を定量する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】インビトロ核酸増幅技術は、少量の核酸
の検出、および分析のための強力な手段を提供してき
た。このような技術は、感染症および遺伝的疾患の診
断、生化学的分析のための遺伝子の単離、並びに法医学
における特定の核酸の検出のおいて格段の進歩をもたら
した。現在、最も汎用性のある技術は、耐熱性ポリメラ
ーゼ（Ｔａｑｐｏ１ｙｍｅｒａｓｅ）を用いたポリメ
ラーゼ連鎖反応（Ｐｏ１ｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲ
ｅａｃｔｉｏｎ（以下ＰＣＲまたはＰＣＲ法という））
であり、ＤＮＡ（断片）を理論的には１０億倍以上に増
幅し得る。しかしながら、ＰＣＲにおける増幅効率およ
び正確さは、処理温度、前記核酸の塩基配列、反応溶液
成分の濃度や種類等の様々な要因によって左右され、測
定対象である核酸分子の数（濃度）をＰＣＲ最終産物の
濃度測定またはＰＣＲ過程におけるリアルタイム測定に
よって正確に決定することは、困難であった。

【０００３】このような状況下、微量な遺伝子を正確に
定量する試みとして、最近「デジタルＰＣＲ」という技
術が提案された。ＢｅｒｔＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６
巻，９２３６−９２４１頁を参照。この方法に従うと、
定量すべき遺伝子試料をＰＣＲ溶液で限界希釈し、タイ
タープレートの穴（ウエル）に分注する。タイタープレ
ート上で試料溶液のＰＣＲを行わせ、前記遺伝子に由来
するＤＮＡを増幅した後、蛍光プローブ等を用いて、各
穴の蛍光信号を計測し、増幅されたＤＮＡが蛍光を発す
る穴の数を計数する。前記限界希釈によって、各穴には
１分子のＤＮＡが存在すると仮定してもよいので、蛍光
を発する穴の数が試料中のＤＮＡ分子の数、すなわち試
料中のｍＲＮＡ量に対応し、遺伝子を定量できることに
なる。この方法は、残念ながら以下に言及する幾つもの
潜在的な問題を抱えている。

【０００４】タイタープレート上でＰＣＲを行わせ、Ｄ
ＮＡ増幅が検出できるまでにはＰＣＲのサイクルを６０
回程度行う必要がある。しかしながら、ＰＣＲのサイク
ル回数が４０を超えると、目的のＰＣＲ増幅物以外のＰ
ＣＲ産物が生成し、該増幅物を汚染する（以下、非特異
的ＤＮＡ増幅という）ことが当業者に認識されている。
これには、２つの原因が考えられる。その１つは、偶然
にＰＣＲ溶液中に混入した微量のＤＮＡがＰＣＲによっ
て増幅されることで、一般に「キャリーオーバー」と呼
ばれる。この現象はＰＣＲ溶液中の標的ＤＮＡの濃度が
低くなれば、より顕著になる。他の１つは、プライマー
同士が二本鎖を形成し、これが鋳型となり、ＰＣＲによ
って増幅されることで、非特異的増幅産物をもたらす。
これを避けるために、サイクル数は、一般的に４０回以
上としないことが当業者に了解されている。いずれにし
ろ、前記デジタルＰＣＲ法は、６０回以上のサイクル数
を必要とするので、目的のＰＣＲ増幅物と所望でない混
在ＰＣＲ増幅物との区別がつきにくくなり、正確なＤＮ
Ａの定量は、当然難しくなる。このような非特異的ＤＮ
Ａ増幅を回避するには、幾つかの対処策が既に知られて
いるが、いずれも煩雑な操作または高価な試薬が要求さ
れる。例えば、１）ＤＮＡ合成の基質として用いる塩基
の一つｄＴＴＰの替わりにｄＵＴＰを加えてＤＮＡ合成
を行い、次のＰＣＲにおいてＤＮＡに取り込まれたｄＵ
ＴＰの部分を切断する酵素を加える方法、２）異なるプ
ライマー対を２種類用いて２段階のＰＣＲを行う方法、
３）増幅するＤＮＡ中の適当な塩基配列を特異的に切断
する制限酵素をＰＣＲ高温処理前の溶液に加えてキャリ
ーオーバーＤＮＡを除去する方法等が公知である。

【０００５】さらに、デジタルＰＣＲ法では、限界希釈
を得るために種々の倍率に希釈して、例えばタイタープ
レートの穴の総数の半分にＤＮＡ分子が含まれるように
条件設定しなくてはならない。

【０００６】また、デジタルＰＣＲ法では、タイタープ
レートの穴の総数の半分にＤＮＡ分子が含まれるように
限界希釈した場合、ポアソン分布から、１つの穴にＤＮ
Ａ分子が２分子入る確率が１２％、３分子入る確率が３
％、と無視できない。このため、計数した穴の数とＤＮ
Ａ分子の数が一致せず、評価にぶれがでて、定量の信頼
性が薄れる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】以上のようなデジタル
ＰＣＲ法の問題点に鑑み、試料中の微量な遺伝子やｍＲ
ＮＡなどの核酸の分子数を正確に決定（すなわち、計数
する）し、核酸の濃度を含めて定量するためにデジタル
ＰＣＲ法にかわる方法が望まれる。従って、本発明は、
デジタルＰＣＲ法の問題点を解決し、簡便かつ正確に試
料中の被検体核酸を定量する方法、または被検体核酸の
分子数の計数方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明に従え
ば、被検体核酸の定量方法であって、試料からの被検体
核酸に由来する標的ＤＮＡ、および蛍光試薬を含むＰＣ
Ｒ溶液を調製する第１の工程と、所定の数のチャンネル
を備えたキャピラリープレートに前記ＰＣＲ溶液を載せ
る第２の工程と、前記キャピラリープレートの両面を弾
力性のある透明な板で密閉し、前記ＰＣＲ溶液を前記各
チャンネルに封入する第３の工程と、前記両面が密閉さ
れたキャピラリープレートを予め設定した温度サイクル
に曝し、前記被検体核酸に由来する標的ＤＮＡのＰＣＲ
を行わせる第４の工程と、前記両面が密閉されたキャピ
ラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する蛍光性
チャンネルの数を計数し、ここで該蛍光性チャンネルは
前記ＰＣＲによって増幅された被検体核酸に由来する標
的ＤＮＡを含むチャンネルである第５の工程と、を含む
ことを特徴とする被検体核酸の定量方法が提供される。

【０００９】また、本発明は、前記第５の工程に続い
て、前記計数された蛍光性チャンネルの数に基づいて被
検体核酸の濃度を求める工程を含むことを特徴とする上
記被検体核酸の定量方法を提供する。

【００１０】また、本発明は、キャピラリープレートを
タンパク質の吸着阻害剤で前処理する工程をさらに含む
ことを特徴とする上記被検体核酸の定量方法を提供す
る。

【００１１】好ましくは、上記被検体核酸の定量方法に
おいて、蛍光試薬がマイナーグローブ結合型の蛍光色
素、または蛍光エネルギー移動を利用した蛍光プローブ
オリゴヌクレオチドからなる。

【００１２】また、好ましくは、上記被検体核酸の定量
方法において、キャピラリープレートの両面を密閉する
弾力性のある透明な板がシリコンゴム製である。

【００１３】さらに、本発明の別の側面によれば、被検
体核酸の分子数の計数方法であって、試料からの被検体
核酸に由来する標的ＤＮＡ、および蛍光試薬を含むＰＣ
Ｒ溶液を調製する第１の工程と、所定の数のチャンネル
を備えたキャピラリープレートに前記ＰＣＲ溶液を載せ
る第２の工程と、前記キャピラリープレートの両面を弾
力性のある透明な板で密閉し、前記ＰＣＲ溶液を前記各
チャンネルに封入する第３の工程と、前記両面が密閉さ
れたキャピラリープレートを予め設定した温度サイクル
に曝し、前記被検体核酸に由来する標的ＤＮＡのＰＣＲ
を行わせる第４の工程と、前記両面が密閉されたキャピ
ラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する蛍光性
チャンネルの数を計数し、ここで該蛍光性チャンネルは
前記ＰＣＲによって増幅された被検体核酸に由来する標
的ＤＮＡを含むチャンネルである第５の工程と、を含む
ことを特徴とする被検体核酸の分子数の計数方法が提供
される。

【００１４】以下、本発明を好適な実施の形態に従っ
て、詳細に説明する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明の主要な側面は、被検体核
酸の分子数または濃度の定量方法であって、試料からの
被検体核酸に由来する標的ＤＮＡ、および蛍光試薬を含
むＰＣＲ溶液を調製する第１の工程と、所定の数のチャ
ンネルを備えたキャピラリープレートに前記ＰＣＲ溶液
を載せる第２の工程と、前記キャピラリープレートの両
面を弾力性のある透明な板で密閉し、前記ＰＣＲ溶液を
前記各チャンネルに封入する第３の工程と、前記両面が
密閉されたキャピラリープレートを予め設定した温度サ
イクルに曝し、前記被検体核酸に由来する標的ＤＮＡの
ＰＣＲを行わせる第４の工程と、前記両面が密閉された
キャピラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発する
蛍光性チャンネルの数を計数し、ここで前記蛍光性チャ
ンネルは前記ＰＣＲによって増幅された被検体核酸に由
来する標的ＤＮＡを含むチャンネルである第５の工程
と、を含むことを特徴とする被検体核酸の定量方法であ
る。

【００１６】従って、本発明の被検体核酸の定量方法の
骨子は、被検体核酸に由来する標的ＤＮＡを含むＰＣＲ
溶液をキャピラリープレートのチャンネル内に封入し、
前記標的ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、増幅された標的
ＤＮＡが発する蛍光を検出、解析することにより、最初
に試料中に存在した被検体核酸の分子数を計数すること
にある。そこで、以下、「本発明の定量方法」とは、本
発明に従う、被検体核酸の濃度の定量方法および被検体
核酸の分子数の計数方法を含み、それら両方またはいず
れかの意味で用いる。

【００１７】本明細書中で用いる「被検体核酸」とは、
ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）を包含し、１本
鎖または２本鎖のいずれであってもよいが、本発明の定
量方法を適用するためには、被検体核酸自身、或いはそ
れに由来する標的ＤＮＡ（後述）の塩基配列が少なくと
もＰＣＲ可能な程度に知られている必要がある。また、
被検体核酸は必ずしも純粋な形態である必要はなく、複
雑な混合物のごく一部のフラクション（例えば、β−グ
ロブリン遺伝子の一部）であってもよい。さらに、被検
体核酸は、天然または人工的に合成されたもの等いかな
る起源のものであってもよいが、本発明の応用分野を鑑
みて、血液、細胞、組織、微生物またはウイルスから抽
出されたＤＮＡまたはＲＮＡであることが好ましい。本
明細書中で用いる「試料」とは、このような被検体核酸
が含まれる試料を指し、これも特に限定はない。しか
し、前記と同様の理由から、生体試料（特に、臨床検体
および細胞診検体）が好適に本発明の定量方法におい
て、用いられる。臨床検体としては、尿、糞便、喀痰、
血液等が挙げられる。細胞診検体としては、液状の胸
水、腹水等の体腔液および針窄刺吸引等の生検手法で得
られる腫瘍細胞等が挙げられる。通常、これらの検体か
ら被検体核酸（ＤＮＡ）を得るには、検体を前処理し
て、核酸を抽出する。前処理方法は、検体の種類によ
り、異なっており、各検体について、確立された処理方
法を適用すればよい。核酸の抽出方法としては、フェノ
ール・クロロホルム法およびグアニジンチオシアン酸法
等が公知である。一方、被検体核酸がＲＮＡである場
合、ＲＮＡ自身は、ＰＣＲの基質とはなりえない。しか
し、逆転写酵素によって、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成す
ることによりＰＣＲをＲＮＡの解析に応用することが可
能である。従って、前記逆転写酵素反応をＰＣＲと組み
合わせることにより、被検体核酸がＲＮＡであっても本
発明の定量方法が適用できる。特に、検体がＲＮＡウイ
ルス（ＨＩＶ、ＨＣＶ、ハンターウイルス等）を含むと
きがこのような場合にあたる。ＲＮＡウイルスは、染色
体としてＤＮＡではなく、ＲＮＡを有しているからであ
る。また、被検体核酸として、ＤＮＡが解析の対象とな
り得るときでも、該ＤＮＡの代わりにｍＲＮＡを被検体
核酸とすると、ｍＲＮＡはＤＮＡに比べて細胞あたりの
コピー数が多い場合があり、感度の点でｍＲＮＡを解析
するほうがＤＮＡを解析するより有利となる。従って、
本明細書中で用いる「被検体核酸に由来する標的ＤＮ
Ａ」とは、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡであり、被
検体核酸がＤＮＡの場合、該ＤＮＡを指し、被検体核酸
をＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とするとそれから得られるＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）を指す。

【００１８】前記逆転写酵素反応は、常法にしたがい容
易に実施できる。例えば、試料に対して、市販の標準的
なｃＤＮＡ合成キット（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍ
ａｃｉａ社製ＴｉｍｅＳａｖｅｒｃＤＮＡＳｙｎ
ｔｈｅｓｉｓＫｉｔ）を作用させ、ｍＲＮＡからｃＤ
ＮＡを合成する。また、逆転写酵素反応での逆転写酵素
の至適ｐＨ（８．３付近）は、ＰＣＲの緩衝液のｐＨ
（例えば、８．４〜８．８）と近く、さらに両反応で要
求されるＭｇ²⁺も共通である。そこで、逆転写酵素反応
後、緩衝液を置き換えずそのままＰＣＲで使用する緩衝
液で希釈することで、ＰＣＲに適した緩衝液条件を得る
ことができる。従って、逆転写によって合成されたｃＤ
ＮＡを直接ＰＣＲにより増幅に供することが可能であ
る。尚、この場合、通常のＰＣＲにおいて、２本鎖ＤＮ
Ａを変性させて、１本鎖ＤＮＡとしてからＰＣＲを実施
するのと同様に、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ２本鎖を変性させ
て、１本鎖ｃＤＮＡとする。この時、同時に使用した逆
転写酵素も失活する。

【００１９】本発明の定量方法に含まれる第１の工程
は、被検体核酸に由来する標的ＤＮＡ（１本鎖）、およ
び蛍光試薬を含むＰＣＲ溶液を調製することからなる。
具体的には、前記標的ＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液（プライマ
ー、ｄＮＴＰ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ等からな
る）、および蛍光試薬を混合して、ＰＣＲ溶液を調製す
る。ここで用いるプライマーは、標的ＤＮＡの５'側と
３'側での２種類のプライマーを常法に従って合成した
ものである。プライマーの設計に関しては、ＧＥＮＥＴ
ＹＸ（ソフトウェア開発）等の市販のソフトウェアを利
用することができる。

【００２０】蛍光試薬は、増幅された標的ＤＮＡを検出
する目的で使用するものであり、増幅されたＤＮＡ量に
比例して、その蛍光強度が増加する性質を有する必要が
ある。本発明では、好ましくは、マイナーグルーブ結合
型のＤＮＡ特異的蛍光色素を蛍光試薬として使用する。
この型の蛍光色素は、ＤＮＡ鎖のマイナーグルーブに結
合するので、増幅ＤＮＡにその量に比例して取り込まれ
る。ＤＮＡが存在しないとき、蛍光色素自身は弱い蛍光
しか発しない。このようなマイナーグルーブ結合型の蛍
光色素の代表的なものとして、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５
８およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２が挙げられる。

【００２１】また、蛍光エネルギー移動を利用した蛍光
プローブも蛍光試薬として本発明の定量方法に使用可能
である。このようなプローブは、供与体色素および受容
体色素として働く２種類の蛍光色素の対を、または１種
類の蛍光色素とその蛍光を消光する色素の対を結合させ
たオリゴヌクレオチドであり、ＰＣＲ進行に伴って生じ
る、プローブのハイブリダイゼーションや分解により蛍
光エネルギー移動が解消される結果、供与体色素の蛍光
強度が増加するため、蛍光測定からＤＮＡ増幅を推定す
ることができる。

【００２２】本発明の定量方法に含まれる第２の工程
は、所定の数のチャンネルを備えたキャピラリープレー
トに前記ＰＣＲ溶液を載せることからなる。ここで使用
されるキャピラリープレートは、ガラス製またはシリコ
ン製の材料から構成されるものが好ましい。図１ａおよ
び図１ｂに、本発明で使用されるキャピラリープレート
１の一例を示す。典型的なものは、外径数〜数十ｍｍで
あり、直径数〜２００μｍ程度かつ深さ（厚さ）０．５
〜数ｍｍの円筒状のカラム（チャンネル２ともいう）を
所定の数（数千〜数百万で任意に選択できる）を備え
る。キャピラリープレート１にＰＣＲ溶液を載せるに
は、ＰＣＲ溶液を、キャピラリープレート１の片側（底
面）に接触させる。すると毛細管現象によりＰＣＲ溶液
が、各チャンネル２に注入される。この注入段階の様子
は、図３（ａ）（後述）に模式的に示される。別法とし
て、キャピラリプレートの上面からピペット操作により
ＰＣＲ溶液をチャンネル内に注入してもよい。

【００２３】本発明の定量方法に含まれる第３の工程
は、前記キャピラリープレートの両面を弾力性のある透
明な板で密閉し、前記ＰＣＲ溶液を前記各チャンネル内
に封入することからなる。ここでは、図２ａに示すよう
に、前記第２の工程でキャピラリープレート１の各チャ
ンネル２にＰＣＲ溶液が注入されたままの状態で、キャ
ピラリープレート１の両面を弾力性のある透明な板（例
えば、シリコンゴム板３）で密閉する。キャピラリープ
レート１が密閉されると、ＰＣＲ溶液が各チャンネル２
内に封入され、チャンネル間でＰＣＲ溶液の移動は起こ
らない。この後、シリコンゴム板３の外側をカバーガラ
ス４で覆う。

【００２４】本発明の定量方法に含まれる第４の工程
は、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを予め
設定した温度サイクルに曝し、前記標的ＤＮＡのＰＣＲ
を行わせることからなる。この工程は、通常のＰＣＲと
同様にして実施される。図２ａさらに図２ｂを参照。ま
ず、前記第３の工程で、両面が密閉され、さらにカバー
ガラス４で覆われたキャピラリープレート１をＰＣＲ用
に設計されたチェンバー５内に収納する。チェンバー５
の外枠は熱伝導性の高い材料、例えば、無酸素銅または
アルミ合金板で作られており、チェンバー５自体がヒー
トブロックとして、直接加熱／冷却される。キャピラリ
ープレート１をチェンバー５内に載置した後、固定ネジ
６を締めてキャピラリープレート１を固定する（図２
ｂ）。チェンバー５をそのままの状態で、市販のサーマ
ルサイクラーのアルミブロック７上に載置する。サーマ
ルサイクラーでの各サイクルの温度、反応時間およびサ
イクル数を設定し、ＰＣＲを実施する。本発明で採用さ
れる温度サイクルは、通常のＰＣＲの温度サイクルと特
に、異ならない。本発明の定量方法も増幅反応自体は、
通常のＰＣＲとなんら異ならないので、デジタルＰＣＲ
法の項で説明した、交雑ＤＮＡからくる「キャリーオー
バー」を出来るだけ少なくし、非特異的ＤＮＡ増幅（バ
ックグランド）を抑えることが好ましい。このための、
様々な措置、工夫については、当業者に認識されている
とおりである。このようにして、標的ＤＮＡを鋳型とし
てＰＣＲが行われ、該ＤＮＡが増幅されることとなる。

【００２５】しかし、前記のＰＣＲ反応溶液をそのまま
キャピラリープレートのチャンネルに封入して、ＰＣＲ
を試みると、ＰＣＲが進行しないことがある。これは、
チャンネルの内壁にＤＮＡポリメラーゼが吸着されて、
ＰＣＲに悪影響を及ぼすためである。このようなタンパ
ク質の吸着現象は、他の反応容器を使用しても起こり得
るが、キャピラリープレートの場合、反応容器の全表面
積が非常に大きくなるため、特に顕著である。そこで本
発明の好適な１つの実施の形態では、たんぱく質吸着阻
害作用を有する物質（タンパク質吸着阻害剤という）で
キャピラリープレートをＰＣＲに先立って処理し、前記
吸着現象を防止する。タンパク質吸着阻害剤による前処
理工程は、前記第２の工程の前に実施される。別法で
は、タンパク質吸着阻害剤を前記ＰＣＲ溶液に混入して
ＰＣＲを行ってもよい。この場合、タンパク質吸着阻害
剤は、ＤＮＡポリメラーゼ濃度に対して、過剰であるこ
とが好ましい。タンパク質吸着阻害剤の一例として、ウ
シ血清アルブミンが例示される。その適当な濃度は、約
０．０１〜約０．１％である。

【００２６】本発明の定量方法に含まれる第５の工程
は、両面が密閉されたキャピラリープレートを蛍光測定
に供し、蛍光を発する蛍光性チャンネルの数を計数する
ことからなる。ここで、前記蛍光性チャンネルは前記Ｐ
ＣＲによって増幅された被検体核酸に由来する標的ＤＮ
Ａを含むチャンネルである。具体的には、前記第４の工
程の後、チェンバー５からキャピラリープレート１を取
り出し、カバーガラス４を取り付けたまま、蛍光顕微鏡
下、キャピラリープレートの表面を観察する。本発明に
使用される蛍光顕微鏡は、励起光源、励起光波長選択フ
イルター（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８の場合は、紫外線
透過フイルター）、蛍光波長選択フイルター等を備えた
市販の製品でよい。さらに、キャピラリープレートの表
面の蛍光像を高感度カメラ（II-ＣＣＤカメラ）で撮像
し、得られた画像を画像処理システムで解析する。この
ようにして、蛍光試薬からの蛍光信号をキャピラリープ
レートの各チャンネル毎に計測することが可能である。
画像処理に際して、適当な閾値を設定し、それ以下のバ
ックグランド蛍光信号をフィルターで除去する。すると
蛍光信号の変化した（すなわち、蛍光を発する蛍光性チ
ャンネル）チャンネルのみが特定される。このような蛍
光性チャンネルの数を計数するには、画像処理された蛍
光画像上で輝度の高いチャンネル数を目視により計数す
る。或いは、画像処理システム内で蛍光信号に基づき、
マイクロコンピューターに処理させ、自動的に計数する
ようにしてもよい。いずれにしろ、これら一連の蛍光信
号のプロセシングは、公知技術の組み合わせによって、
実行され得る。

【００２７】前記蛍光性チャンネルは、ＰＣＲによって
増幅された標的ＤＮＡを含む。これは、該チャンネル内
に前記第３の工程で封入されたＰＣＲ溶液が、被検体核
酸に由来する標的ＤＮＡ分子を含むからである。その標
的ＤＮＡ分子が前記第４の工程で増幅され、増幅された
ＤＮＡが蛍光試薬により蛍光を発するのでチャンネルの
蛍光信号がＰＣＲ前と比べると変化する。一方、チャン
ネル内のＰＣＲ溶液が標的ＤＮＡ分子を含まないとき、
ＰＣＲによって増幅ＤＮＡは生じない。チャンネルの蛍
光信号は、ＰＣＲ前と変化はなく、これは、後述の実施
例における実験からも確かめられた。従って、蛍光性チ
ャンネルを特定し、キャピラリープレート上でその総数
を計数することによって、標的ＤＮＡ分子がＰＣＲ以前
に存在したチャンネル数を決定できる。

【００２８】キャピラリプレートを構成するチャンネル
の総数に対して、ＰＣＲ前の標的ＤＮＡ分子の数が充分
に少ない条件下において、標的ＤＮＡを含むチャンネル
では、ほとんどのチャンネル内の標的ＤＮＡ分子の数は
１分子であると、ポアソン分布から仮定することができ
る。従って、このような標的ＤＮＡの濃度が充分に低い
場合、蛍光性チャンネルの数が標的ＤＮＡの分子の数に
相当することになる。

【００２９】この仮定も、後述の実施例における実験に
おいて、実測値がポアソン分布からの期待値にほぼ一致
することから支持される。以上のように、本発明の定量
方法に従えば、蛍光性チャンネルの総数を計数すること
によって、ＰＣＲ溶液中の標的ＤＮＡの分子数を計数
し、さらには試料中の被検体核酸の分子数を決定するこ
とが可能になる。所望ならば、このようにして決定され
た分子数とチャンネルの容積に基づいて標的ＤＮＡ（従
って、被検体核酸）の濃度を求めることもできる。

【００３０】以上詳述してきた本発明の定量方法を上記
第１ないし第４の工程に相当する段階毎に、模式的に説
明したものが第３図である。本発明の定量方法に従う、
一連の手順は、上記の説明とこの図を参照して、当業者
に容易に理解されうる。

【００３１】以下、実施例を挙げて本発明をより具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例によって制限さ
れるものではない。

【００３２】

【実施例】（実施例１）下記の組成を有するＰＣＲ溶液
を調製した。本例で使用した標的ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡに
対応）、５’プライマー、および３’プライマーは、そ
れぞれ次の塩基配列を有する。これらＤＮＡは、受託Ｄ
ＮＡ合成業者（ベックス株式会社）より入手した。標的ＤＮＡ： 5'-ATGGAAACCTGTTTGTTGGATATAAATACGTCGT
AGATGGGCACAGTGTG-3'(配列表の配列番号１に記載) ５’プライマー: 5'-CACACTGTGCCCATCTACGA-3'(配列表
の配列番号２に記載) ３’プライマー： 5'-ATGGAAACCTGTTTGTTGGA-3'(配列表
の配列番号３に記載) ＰＣＲ溶液標的ＤＮＡ１００ａＭ５’プライマー１μＭ３’プライマー１μＭＭｇ₂Ｃｌ６ｍＭＢＳＡ０．１％各ｄＮＴＰ０．５ｍＭＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８１μＭＴａｑ抗体０．０５６μＭＴａｑＤＮＡポリメラーゼ０．０２ｕｎｉｔ／μｌＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液１０倍溶液２５μｌ蒸留水残部全液量２５０μｌ直径０．０５ｍｍ、深さ１ｍｍのチャンネル（約１０万
個、容積約２ｎｌ）を備える外径２５ｍｍのキャピラリ
ープレートを用いて、上記ＰＣＲ溶液を毛細管現象によ
り各チャンネルに分注した。キャピラリープレートの両
面を透明なシリコンゴム板で密封し、さらに外側をカバ
ーガラスで覆った［図２（ａ）］。このキャピラリープ
レートをチェンバー内に収納し、チェンバーをサーマル
サイクラー（パーキンエルマー社、DNA Thermal Cycler
488）のアルミブロック上に載置した［図２（ｂ）］。

【００３３】サーマルサイクラーでの各サイクルの温
度、反応時間およびサイクル数を次のように設定し、Ｐ
ＣＲを実施した。すなわち、９５℃３分間の前処理を１
回行い、次に９５℃で２分、次に４５℃で２分間反応さ
せることとし、これを４０サイクル繰り返した。さら
に、６８℃で５分間、保持し、室温まで放置しＰＣＲを
終了した。

【００３４】ＰＣＲ終了後、チェンバーからキャピラリ
ープレートを取り出し、シリコンゴム板およびカバーガ
ラスを取り付けたまま、倒立蛍光顕微鏡下（オリンパス
製ＩＸ70、対物レンズ：１０倍）、その表面を観察し
た。表面の蛍光像を高感度カメラ、ＩＩ−ＣＣＤカメラ
（浜松ホトニクス製 ARGUS500）で撮像し、得られた蛍
光画像を画像処理システムで記録した。この画像を図４
（ａ）に示す。

【００３５】また、標的ＤＮＡを含ませず、それ以外は
上記のＰＣＲ溶液と全く同一の組成で、新たなＰＣＲ溶
液を調製し、対照試験を行った。得られた画像を図４
（ｂ）に示す。

【００３６】図４（ａ）の蛍光画像と図４（ｂ）の蛍光
画像とを比較すると、前者の画像は、明らかに輝度の高
い（蛍光性）チャンネルを数十含み、これらのチャンネ
ルが輝度の低いチャンネルの間に散在する様子を示して
いる。一方、後者の画像は、すべてのチャンネルにわた
って、暗く、輝度の高いチャンネルは、１つも存在しな
いことを示している。蛍光性チャンネルは、その中で標
的ＤＮＡ分子が増幅されたために輝度が増したものであ
り、該チャンネルにＰＣＲ以前に標的ＤＮＡ分子が存在
していたことが分かる。上記ＰＣＲ条件で採用された４
０サイクルというサイクル数でも、ＤＮＡ増幅が充分に
起こり、検出可能であった。また、前記対照試験の結果
から、このＰＣＲ条件では、非特異的ＤＮＡ増幅が全く
起こらないことが明らかとなった。

【００３７】（実施例２）実施例１で使用したＰＣＲ溶
液において、標的ＤＮＡの濃度（１００ａＭ）を種々変
化させて、それ以外の組成は同一のＰＣＲ溶液を調製し
た。これらのＰＣＲ溶液を実施例１と同様に、ＰＣＲに
供し、それぞれの濃度について、蛍光画像を求め、蛍光
性チャンネルを計数した。キャピラリープレートの総チ
ャンネル数に対する得られた蛍光性チャンネル数の割合
を求め、各標的ＤＮＡの濃度に対してプロットしたのが
図５である。図５中、曲線は、このようにして得られ
た実測値の割合（蛍光チャンネル数：総チャンネル数）
をプロットしたものであり、曲線は、ポアソン分布か
らの期待値のプロットである。まず、曲線は標的ＤＮ
Ａの濃度に比例して、蛍光性チャンネルの数が増加する
ことを示している。また、両曲線の近似は、本例で使用
したＰＣＲ溶液がポアソン分布に従うことを示唆してい
る。すなわち、標的ＤＮＡの濃度が低い領域では（例え
ば、前記期待値が０．１以下）、蛍光性チャンネルのほ
とんどで、標的ＤＮＡが１分子のみ存在することにな
る。その１分子がＰＣＲによって増幅され、それが含ま
れるチャンネルが蛍光を発する。これらの事実と、実施
例１の結果と合わせて、蛍光性チャンネルの数からＰＣ
Ｒ溶液中の標的ＤＮＡの分子数が正確に推定できること
が分かる。なお、図５に示したデータの基になる一部の
蛍光画像は、図６に直接示される。図中、標的ＤＮＡの
濃度が１００、１０、１ａＭのときの蛍光画像がそれぞ
れ（ａ）（ｂ）（ｃ）であり、左側と右側は、別個の溶
液を希釈した系に属するものである。左右の蛍光画像か
らの計数結果がほぼ一致することから、本発明の定量方
法での計数は、再現性があることが分かる。

【００３８】

【発明の効果】本発明の定量方法は、通常のＰＣＲ条件
として、許容されるサイクル数でも増幅されたＤＮＡが
充分に蛍光検出できるので、デジタルＰＣＲ法と比較し
て、非特異的ＤＮＡ増幅による計数精度の低下が改善さ
れ、信頼性のある定量結果が得られる。

【００３９】また、本発明の定量方法は、同様の理由か
ら、非特異的ＤＮＡ増幅を抑制するための特別な手法ま
たは試薬を必要とせず、簡便な定量方法である。

【００４０】さらに、本発明の定量方法では、キャピラ
リープレートの使用によって、デジタルＰＣＲ法で採用
するタイタープレートのウエルに対応するチャンネルの
数が飛躍的に増大する。典型的には、タイタープレート
の数百に対して、数万以上に上り、解析できるＤＮＡ濃
度範囲（すなわち、定量可能な被検体核酸の分子数）が
１００倍以上に向上する。しかも、この範囲は、使用す
るキャピラリーのサイズを小さくするか、またはキャピ
ラリープレートの総面積を拡大する、或いはそれらの両
方でさらに広げ得る。これは被検体核酸を含む試料を、
様々な濃度に希釈して定量を繰り返すことなく、単一の
測定で定量が可能であることを意味する。

【００４１】本発明の定量方法は、デジタルＰＣＲ法よ
り、計数精度および操作の簡便性が優れており、試料
（特に、生体試料）中の極微量の遺伝子その他核酸を検
出し、その分子数を計数して、定量するのに非常に有用
である。例えば、本発明の定量方法を用いて、特定の遺
伝子の発現分子数を計数することにより、細胞が正常か
或いは異常か識別可能となる。

【００４２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hamamatsu Photonics K.K. <120> Method for quantifying nucleic acid analyte and method for counting the molecular number of nucleic acid analyte <130> P99HP-257 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR template <400> 1 atggaaacct gtttgttgga tataaatacg tcgtagatgg gcacagtgtg 50 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 cacactgtgc ccatctacga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 atggaaacct gtttgttgga 20 gga

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）は、本発明に係るキャピラリープレート
の部分切除斜視図である。（ｂ）は、本発明に係るキャ
ピラリープレートの模式的断面図である。

【図２】（ａ）は、本発明に係るキャピラリープレート
がＰＣＲ用のチェンバーに収容された様子を模式的に示
す断面図である。（ｂ）は、（ａ）に示したチェンバー
がサーマルサイクラー上に載置され、ＰＣＲが実施され
る様子を模式的に示す断面図である。

【図３】図３は、本発明の定量方法を、段階毎に説明す
るための模式図である。図中、（ａ）は、ＰＣＲ溶液が
本発明に係るキャピラリープレートのチャンネルに分注
されつつある段階を示し、（ｂ）は、ＰＣＲ溶液をチャ
ンネルに封入する段階を示し、（ｃ）は、ＰＣＲによっ
て、いくつかのチャンネルで標的ＤＮＡの増幅が起こっ
ている段階を示し、（ｄ）は、キャピラリープレートの
チャンネルからの蛍光を観察する段階を示す。

【図４】図４は、実施例１で得られた、キャピラリープ
レートの蛍光画像（写真）である。図中、（ａ）は、標
的ＤＮＡを含むＰＣＲ溶液のＰＣＲから得られた蛍光画
像であり、（ｂ）は、標的ＤＮＡを含まないＰＣＲ溶液
のＰＣＲから得られた蛍光画像である。

【図５】図５は、実施例２の試験結果を示し、標的ＤＮ
Ａの濃度に対して、蛍光性チャンネル数の総チャンネル
数に対する割合をプロットしたグラフである。図中、
は実測値のプロットであり、はポアソン分布からの期
待値のプロットである。

【図６】図６は、実施例２で得られた、キャピラリープ
レートの蛍光画像（写真）である。図中、（ａ）は、濃
度１００ａＭの標的ＤＮＡを含むＰＣＲ溶液のＰＣＲか
ら得られた蛍光画像であり、（ｂ）は、濃度１０ａＭの
標的ＤＮＡを含むＰＣＲ溶液のＰＣＲから得られた蛍光
画像であり、（ｃ）は、濃度１ａＭの標的ＤＮＡを含む
ＰＣＲ溶液のＰＣＲから得られた蛍光画像である。

【符号の説明】

１・・・キャピラリープレート、２・・・チャンネル、３・・・
シリコンゴム板、４・・・カバーグラス、５・・・チェンバ
ー、６・・・固定ネジ、７・・・サーマルサイクラーのアルミ
ブロック、８・・・標的ＤＮＡ分子、９・・・増幅されたＤＮ
Ａ分子、１０・・・蛍光性チャンネル

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G045 AA40 BB60 DA12 DA13 DA14 FA11 FA16 FA19 FB12 GC15 JA01 JA07 4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ53 QR32 QR62 QR66 QS25 QS32 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被検体核酸の定量方法であって、試料か
らの被検体核酸に由来する標的ＤＮＡ、および蛍光試薬
を含むＰＣＲ溶液を調製する第１の工程と、所定の数の
チャンネルを備えたキャピラリープレートに前記ＰＣＲ
溶液を載せる第２の工程と、前記キャピラリープレート
の両面を弾力性のある透明な板で密閉し、前記ＰＣＲ溶
液を前記各チャンネルに封入する第３の工程と、前記両
面が密閉されたキャピラリープレートを予め設定した温
度サイクルに曝し、前記被検体核酸に由来する標的ＤＮ
ＡのＰＣＲを行わせる第４の工程と、前記両面が密閉さ
れたキャピラリープレートを蛍光測定に供し、蛍光を発
する蛍光性チャンネルの数を計数し、ここで前記蛍光性
チャンネルは前記ＰＣＲによって増幅された被検体核酸
に由来する標的ＤＮＡを含むチャンネルである第５の工
程と、を含むことを特徴とする被検体核酸の定量方法。
【請求項２】前記第５の工程に続いて、前記計数され
た蛍光性チャンネルの数に基づいて被検体核酸の濃度を
求める工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の
被検体核酸の定量方法。
【請求項３】前記キャピラリープレートをタンパク質
の吸着阻害剤で前処理する工程をさらに含むことを特徴
とする、請求項１に記載の被検体核酸の定量方法。
【請求項４】前記蛍光試薬がマイナーグローブ結合型
の蛍光色素からなることを特徴とする、請求項１に記載
の被検体核酸の定量方法。
【請求項５】前記蛍光試薬が蛍光エネルギー移動を利
用した蛍光プローブオリゴヌクレオチドからなることを
特徴とする、請求項１に記載の被検体核酸の定量方法。
【請求項６】前記弾力性のある透明な板がシリコンゴ
ム製であることを特徴とする、請求項１に記載の被検体
核酸の定量方法。
【請求項７】被検体核酸の分子数の計数方法であっ
て、試料からの被検体核酸に由来する標的ＤＮＡ、およ
び蛍光試薬を含むＰＣＲ溶液を調製する第１の工程と、
所定の数のチャンネルを備えたキャピラリープレートに
前記ＰＣＲ溶液を載せる第２の工程と、前記キャピラリ
ープレートの両面を弾力性のある透明な板で密閉し、前
記ＰＣＲ溶液を前記各チャンネルに封入する第３の工程
と、前記両面が密閉されたキャピラリープレートを予め
設定した温度サイクルに曝し、前記被検体核酸に由来す
る標的ＤＮＡのＰＣＲを行わせる第４の工程と、前記両
面が密閉されたキャピラリープレートを蛍光測定に供
し、蛍光を発する蛍光性チャンネルの数を計数し、ここ
で該蛍光性チャンネルは前記ＰＣＲによって増幅された
被検体核酸に由来する標的ＤＮＡを含むチャンネルであ
る第５の工程と、を含むことを特徴とする被検体核酸の
分子数の計数方法。