JP2001258551A - ウイルス濃縮用粒子、該粒子を使用するウイルス濃縮用試薬、ウイルス濃縮方法およびウイルス検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便な手段により、同時に多数の検体を簡便
に処理することができ、核酸増幅検査に悪影響を及ぼさ
ないウイルス濃縮用粒子、並びにこの粒子を使用するウ
イルス濃縮方法およびウイルス検出方法を提供する。 【解決手段】 磁性体を含有してなるウイルス濃縮用粒
子、並びにこの粒子を使用するウイルス濃縮用試薬、ウ
イルス濃縮方法およびウイルス検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のウイルス
を濃縮するためにウイルス濃縮粒子、該濃縮用粒子を含
むウイルス濃縮用キット、ウイルス濃縮方法およびウイ
ルス検査方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルスはヒトや動植物のさまざまな病
気の原因の一つであり、その検査・診断のためには原因
ウイルスの確認が非常に重要である。従来のウイルス検
査・診断法としては、ウイルス抗原あるいは抗ウイルス
抗体の免疫学的測定が一般的である。しかしながら、ウ
イルス感染から数週間から数ヶ月は、ウイルス量あるい
は抗ウイルス抗体量が少ないため、これらの免疫学的測
定法では検出できない場合がある。この検出不可能な期
間はウインドウ・ピリオド（空白期間）と呼ばれてお
り、このような患者が献血を行った場合、その献血液は
十分な感染性を持つことが多く、不特定多数の輸血患者
・血液製剤利用患者に危険をおよぼす可能性がある。し
たがって、ウインドウ・ピリオドをできる限り短縮する
ため、免疫学的測定限界下のウイルスを高感度に検出で
きる技術の開発が急務とされている。

【０００３】近年、ポリメラーゼチェインリアクション
法（以下ＰＣＲ法）に代表される、核酸増幅技術によ
り、極微量のウイルスでも検出できる可能性が開けてき
た。しかしながら、ＰＣＲ法などによっても極微量のウ
イルス検出は特殊な施設と高度な技術が必要とされ、一
般的な施設で簡便に実施することはきわめて困難であ
る。そこで、これらの問題解決のため、検体中のウイル
スを濃縮する手法が用いられている。

【０００４】従来のウイルス濃縮法の代表例としては超
遠心法が挙げられるが、高価な機器と長時間を要し、か
つ同時に多数の検体を処理することは困難であり簡便な
方法とは言い難い。また、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原
（ＨＢｓ抗原）がヘパリンと結合する性質から、ヘパリ
ンセファロース担体によるクロマトグラフィー法も報告
されているが、これも同時に多数の検体を処理すること
は困難である。その他、硫酸アンモニウムやポリエチレ
ングリコール、ポリアニオンと２価イオンの組み合わせ
等によりウイルスを沈殿させる方法があるが、混合する
試薬にＰＣＲ阻害がある等の問題からウイルスの沈殿分
離後の試料精製が必要であるという難点があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
のウイルス濃縮法の問題点を解決し、簡便な手段によ
り、同時に多数の検体を簡便に処理することができ、自
動化への対応も容易で、核酸増幅検査に悪影響を及ぼさ
ないウイルス濃縮用粒子並びにこの粒子を使用するウイ
ルス濃縮用試薬、ウイルス濃縮方法およびウイルス検出
方法を提供することにある。

【０００６】

【発明を解決するための手段】本発明者らは研究の結
果、上記課題を解決する手段として、次のウイルス濃縮
用粒子および濃縮方法を開発するに到った。即ち、本発
明は、第一に、磁性体を含有してなるウイルス濃縮用粒
子を提供する。該ウイルス濃縮用粒子は好ましくは粒子
表面にアニオン性基（塩の状態を含む）を有している。
本発明は、第二に、上記のウイルス濃縮粒子と多価金属
化合物とからなるウイルス濃縮用試薬を提供する。ま
た、本発明は、第三に、ウイルスを含有する可能性のあ
る試料に上記のウイルス濃縮用粒子を添加し、ウイルス
を前記粒子に結合させる段階、次にこうしてウイルスが
結合した前記粒子を試料から分離、収集する段階を含
む、ウイルス濃縮方法を提供するものである。好ましい
態様では、ウイルス濃縮粒子とともに多価金属化合物を
試料に添加する。さらに、本発明は、第四に、ウイルス
を含有する可能性のある試料に上記のウイルス濃縮用粒
子を添加し、ウイルスを前記粒子に結合させる段階、次
にこうしてウイルスが結合した前記粒子を試料から分
離、収集することによりウイルスを濃縮する段階、こう
して濃縮されたウイルスを核酸増幅検査に供する段階を
含む、ウイルス検出方法を提供する。好ましい態様で
は、ウイルス濃縮粒子とともに多価金属化合物を試料に
添加する。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 〈ウイルス濃縮用粒子〉本発明において、ウイルス濃縮
用粒子とは、血液や体液等の検体中のウイルスを吸着し
た後、分離・濃縮する粒子であり、当該粒子により分離
・濃縮されたウイルスは核酸抽出・検査・診断、特に核
酸増幅を伴う検査・診断に用いられる。本発明のウイル
ス濃縮用粒子は磁性体を含有するものであって、さらに
粒子表面にアニオン性基（塩の状態を含む）を有するこ
とが好ましい。

【０００８】本発明のウイルス濃縮用粒子は基材粒子に
磁性体を含有してなる。この磁性体は該粒子の内部のみ
に含有され、表面に露出していないことが好ましい。本
発明においては、ウイルス濃縮用粒子に磁性体を含有さ
せることにより、該粒子の磁気を作用させて収集するこ
とが可能となり、遠心分離等による操作が不要で検査時
間を短縮させることが可能となるほか、検査・診断の自
動化への対応も容易となる。このような磁性体は、例え
ば四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆ
ｅ₂Ｏ₃）等の各種フェライト、鉄、マンガン、コバル
ト、クロムなどの金属またはこれら金属の合金などを用
いることができる。

【０００９】磁性体の含有量は、ウイルス濃縮用粒子全
体に対し10重量％以上、特に20〜100重量％であること
が好ましい。この量が少なすぎると、該ウイルス濃縮用
粒子に、良好な磁気分離性が得られず、その結果、後述
するウイルスの分離・濃縮方法において、血液または体
液等の検体からウイルス濃縮用粒子を分離するために相
当に長い時間を要するので、高い時間的効率が得られな
いことがあり、好ましくない。

【００１０】本発明におけるアニオン性基としては、カ
ルボキシル基、スルホン基（スルホン基は硫酸基の一部
として存在していてもよい）などを挙げることができ
る。これらのアニオン性基は塩を形成した状態で存在し
てもよい。本発明において、アニオン性基は、水や緩衝
液、血液、体液中に溶出するとＰＣＲ法などの核酸増幅
法を阻害することがあるため、基材粒子に化学的に結合
されている必要がある。その存在量は通常、ウイルス濃
縮用粒子１ｇ当り平均で１×１０^-12モル以上であり、
代表的には１×１０^-12〜１×１０^-2モルであり、好ま
しくは１×１０^-11〜１×１０^-3モルであり、より好ま
しくは１×１０^-11〜１×１０^-4モルである。アニオン
性基の存在量が少なすぎると、ウイルス濃縮能力が不十
分であることがある。限定するものではないが、通常、
ウイルス濃縮用粒子１ｇ当り１×１０^-2モルより多くの
アニオン性基を導入することは困難なことが多い。

【００１１】本発明のウイルス濃縮用粒子の基材粒子と
しては、例えば、表面にスルホン基を有する粒子（「表
面スルホン化粒子」という）、表面にカルボキシル基を
有する粒子（「表面カルボン酸粒子」という）、合成高
分子粒子にスルホン基含有単量体および／またはカルボ
キシル基含有単量体をシード重合あるいはグラフト重合
した粒子、スルホン基含有単量体と架橋性単量体からな
るハイドロゲル粒子、ポリアニオン化合物固定化粒子、
硫酸化多糖類ゲル粒子などを挙げることができるが、こ
れらに限定されるものではなく、少なくとも表面の一部
にアニオン性基を持つ粒子であれば使用できる。

【００１２】表面スルホン化粒子としては、例えば、少
なくともその表面にスルホン化可能な官能基、例えば主
鎖または側鎖に不飽和二重結合、芳香族基、第一級また
は第二級アミノ基、第一級ハロゲン化アルキル基、脂肪
族アルデヒド、脂肪族ケトン、脂肪族カルボン酸、脂肪
族カルボン酸無水物、水酸基等をもつ高分子化合物の
（共）重合体からなり、その表面の少なくとも一部がス
ルホン化されてスルホン基を有した粒子を用いることが
できる。表面スルホン化可能な粒子を構成する高分子化
合物の例として、スチレン、α−メチルスチレン、ビニ
ルナフタレン、ジビニルベンゼン、ブタジエン、イソプ
レン、ビニルアルコール等のスルホン化可能な単量体の
（共）重合体、およびこれら単量体と他の重合性単量体
との（共）重合体等の付加重合系高分子化合物；ポリカ
ーボネート、ポリエステル、ポリエステルエーテル、ポ
リアリールエーテル、ポリアルキレンオキシド、ポリス
ルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリイミ
ド、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリウ
レタン、芳香族化合物のアセトアルデヒド縮合物、ポリ
エーテル等の縮合重合系高分子化合物等が挙げられる。

【００１３】これらの高分子化合物からなる粒子のスル
ホン化は、（１）スルホン化されていない重合体粒子
を、濃硫酸、発煙硫酸、無水硫酸、無水硫酸−ジオキサ
ン錯体、無水硫酸−ピリジン錯体、クロルスルホン酸等
で粒子を処理方法、（２）スルホン酸単量体と他の単量
体を共重合する方法により達成できる。

【００１４】表面カルボン酸粒子としては、カルボン酸
含有単量体の（共）重合体粒子を挙げることができる。
ここで、カルボン酸含有単量体（以下「カルボン酸単量
体」という。）とは、付加重合性の不飽和結合およびカ
ルボキシル基を分子中に有する重合性単量体である。具
体例としては、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン
酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸などを挙げるこ
とができる。これらの（共）重合体粒子は、通常の乳化
重合、あるいは懸濁重合の手法により合成することが可
能である。

【００１５】合成高分子粒子にスルホン基含有単量体
（以下、「スルホン酸単量体」という）および／または
カルボン酸単量体をシード重合あるいはグラフト重合し
た粒子としては、合成高分子からなるシード粒子にスル
ホン酸単量体および／またはカルボン酸単量体、さらに
必要に応じてそれら以外の他の共重合可能な単量体とと
もにシード（共）重合あるいはグラフト（共）重合した
粒子を挙げることができる。このような粒子は、界面活
性剤を含む水あるいは水／極性溶媒に分散したシード粒
子に、モノマーおよびラジカル発生剤を加え、５０〜１
００℃で反応することにより合成できる。ここで、シー
ド粒子の合成高分子を形成する成分としては、スチレ
ン、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、ビニルナフ
タレンなどの重合性二重結合含有芳香族化合物；アクリ
ロニトリル、メタクリロニトリル、シアン化ビニリデン
等の重合性二重結合含有シアン化合物；ジビニルベンゼ
ン、エチレングリコールジメタクリレート等の重合性架
橋性化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルメチ
ルエチルケトン、ビニルメチルエーテル、酢酸ビニル、
ギ酸ビニル、酢酸アリル、酢酸メタアリル、アクリルア
ミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルア
ミド、Ｎ―イソプロピルアクリルアミド、アクリル酸グ
リリジル、メタクリル酸グリシジル、アクロレイン、メ
タクロレイン、アリルアルコール、２―ヒドロキシエチ
ルアクリレート、２―ヒドロキシエチルメタクリレー
ト、２―メトキシエチルアクリレート、ｎ−ブチルアク
リレート、ｓｅｃ−ブチルアクリレート、イソブチルア
クリレート、ｔ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタ
クリレート、ｓｅｃ−ブチルメタクリレート、イソブチ
ルメタクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、メチル
アクリレート、エチルアクリレート、ｎ−プロピルアク
リレート、イソプロピルアクリレート、メチルメタクリ
レート、エチルメタクリレート、ｎ−プロピルメタクリ
レート、イソプロピルメタクリレート等の重合性二重結
合含有化合物；エチレンオキシド、プロピレンオキシ
ド、２−メチルテトラヒドロキシフラン、スチレンオキ
シド、ブチレンオキシド、グリシジルエーテル等の重合
性環状化合物等の（共）重合体等を挙げることができ
る。

【００１６】スルホン酸単量体としては、イソプレンス
ルホン酸、エチレンスルホン酸、ビニルスルホン酸、ス
チレンスルホン酸、α−メチルスチレンスルホン酸、2-
アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸、スルホ
エチルアクリレート、スルホン化ジシクロペンタジエン
等を挙げることができる。

【００１７】他の共重合可能な単量体としては、1,3-ブ
タジエン、イソプレン等の脂肪族ジエン系化合物；スチ
レン、α−メチルスチレン、ビニルトルエンなどの重合
性二重結合含有芳香族化合物；メチルアクリレート、エ
チルアクリレート、2-エチルヘキシルアクリレート、メ
チルメタクリレート、エチルメタクリレート、２―ヒド
ロキシエチルアクリレート、２―ヒドロキシエチルメタ
クリレート等の（メタ）アクリル酸アルキルエステル；
アクリロニトリル、メタクリロニトリル等の重合性シア
ン化合物；塩化ビニル、塩化ビニリデン、ビニルメチル
エチルケトン、ビニルメチルエーテル、酢酸ビニル、ギ
酸ビニル、酢酸アリル、酢酸メタアリル、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミ
ド、Ｎ―イソプロピルアクリルアミド、アクリル酸グリ
リジル、メタクリル酸グリシジル、アクロレイン、メタ
クロレイン、アリルアルコール等の重合性二重結合含有
化合物、エチレンオキシド、プロピレンオキシド、２−
メチルテトラヒドロキシフラン、スチレンオキシド、ブ
チレンオキシド、グリシジルエーテル等の重合性環状化
合物等を挙げることができる。

【００１８】スルホン酸単量体と水溶性架橋性単量体と
からなるハイドロゲル粒子としては、例えば上記スルホ
ン酸単量体と、N,N'-メチレンビスアクリルアミド等の
水溶性架橋性単量体の重合体からなるハイドロゲル粒子
を用いることができる。このような粒子は、スルホン酸
単量体、水溶性架橋性単量体、ラジカル反応開始剤の水
溶液と、界面活性剤を非極性溶媒に添加しながら激しく
混合し、油中水型の逆ミセルを形成させた後、５０〜１
００℃で反応することにより得られる。

【００１９】ポリアニオン化合物固定化粒子としては、
分子内に複数のスルホン基および／またはカルボキシル
基を有するポリアニオンを、エポキシ基、アミノ基、ア
ルデヒド基、カルボキシル基、水酸基、酸クロライド基
などの官能基を持つ粒子に直接もしくはカップリング剤
やスペーサーを介して材料表面に担持させた粒子を挙げ
ることができる。ここで、ポリアニオンとしては、例え
ば、スルホン酸単量体および／またはカルボン酸単量
体、さらに必要に応じてそれら以外の他の単量体を
（共）重合した高分子化合物；硫酸化多糖類；リンタン
グステン酸；ポリリン酸等を挙げることができる。

【００２０】固体酸粒子としては、例えばガラス、シリ
カなどの粒状体の表面をスルホン基やカルボキシル基を
有する重合体で被覆したものをあげることができる。こ
の場合、カルボキシル基は、γ−アミノプロピルトリエ
トキシシランでアミノ基を粒状体表面に導入し、このア
ミノ基を無水コハク酸と、またはカルボジイミドの存在
下にコハク酸と反応させることにより導入できる。ま
た、スルホン基は、粒状体をアミノシラン化処理後、グ
ルタルアルデヒド処理でアルデヒド基を導入し、これに
２−アミノエタンスルホン酸を反応させることにより導
入することができる。

【００２１】スルホン酸単量体、カルボン酸単量体、ス
ルホン酸単量体と他の単量体を（共）重合した高分子化
合物、およびカルボン酸単量体と他の単量体を（共）重
合した高分子化合物の具体例は、前述したとおりであ
る。

【００２２】硫酸化多糖類としては、ヘパリン、デキス
トラン硫酸、セルロース硫酸、ガードラン硫酸、コンド
ロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、キチ
ン硫酸、キトサン硫酸、デルマタン硫酸、アミロペクチ
ン硫酸、ケタラン硫酸、キシラン硫酸、カロニン硫酸、
ペクチン硫酸、イヌリン硫酸、アルギン酸硫酸、グリコ
ーゲン硫酸、ポリラクトース硫酸、カラゲニン硫酸、デ
ンプン硫酸、ポリグルコース硫酸、ラミナリン硫酸、ガ
ラクタン硫酸、レバン硫酸、メペサルフェート、フコイ
ダンなどを挙げることができる。

【００２３】硫酸化多糖類ゲル粒子としては、セルロー
ス、アガロース、デキストラン、キチン、キトサンなど
の架橋あるいは未架橋粒子を硫酸化して得られる、スル
ホン化された多糖類からなるゲル粒子を挙げることがで
きる。

【００２４】本発明のウイルス濃縮用粒子は次のように
して製造することができる。 １）基材粒子が合成高分子（例えば、表面スルホン酸粒
子、表面カルボン酸粒子、合成高分子粒子にスルホン酸
含有単量体および／またはカルボン酸単量体をシード重
合あるいはグラフト重合した粒子、合成高分子化合物を
用いたポリアニオン化合物固定化粒子等）の場合 （ａ）単量体に磁性体を分散して重合を行う。重合方法
としては、通常の乳化重合、懸濁重合、分散重合などの
方法が挙げられる。 （ｂ）上記（ａ）の方法で重合体粒子を合成後、該粒子
表面に、磁性体層を形成する。 （ｃ）上記の（ａ）または（ｂ）で得られた粒子表面
に、さらに重合体または天然高分子の層を形成する。 ２）基材粒子が天然高分子（例えば天然高分子化合物を
用いたポリアニオン化合物固定化粒子、硫酸化多糖類ゲ
ル粒子等）の場合 （ａ）天然高分子を水溶液とし、磁性体を分散した後、
天然高分子を架橋して水不溶性粒子とする。 （ｂ）上記（ａ）で得られた粒子表面に、さらに重合体
または天然高分子の層を形成する。

【００２５】以上のようにして得られるウイルス濃縮用
粒子の磁気特性は、1,200,000Ａ／ｍ（アンペア毎メー
トル）の磁場において感磁させたとき、保磁力について
は4000〜160,000Ａ／ｍ、特に800〜8,000Ａ／ｍである
ことが好ましく、残留磁束密度については1×10^-4wb・m
／kg以下、特に2.0×10^-6〜20×10^-6wb・m／kgであるこ
とが好ましい。保磁力が小さすぎるか、または残留磁束
密度が小さすぎると、天然磁石(磁束密度が、例えば0.1
〜0.4Ｔ)によって感磁させても、ウイルス濃縮用粒子間
に十分に大きい磁力が作用しないため、当該天然磁石に
よって該粒子を高い効率で分離・回収することが困難と
なることがあり、実用上好ましくない。一方、保磁力が
大きすぎるか、または残留磁束密度が大きすぎると、粒
子間に作用する磁力が過大となるため、該粒子を分離・
回収した後、再分散することが困難となることがある。

【００２６】本発明のウイルス濃縮粒子を用いて血漿や
血清等の検体中のウイルスを濃縮するには、通常、カラ
ムクロマト法ではなくバッチ法にて使用される。したが
って、粒子の粒径は通常0.08μm〜300μm、好ましくは
0.1μm〜100μmである。粒径がこの範囲内であれば粒径
が均一でなくても本発明の目的のために使用することが
可能である。また、本発明のウイルス濃縮用粒子の粒子
形状は球状である必要はなく、異形粒子であってもかま
わない。なお球状でない粒子の粒径としては、それぞれ
の粒子の最長径と最短径との平均値をとるものとする。
粒径が小さすぎると、良好な磁気分離性が得られないこ
とがあり、好ましくない。また、粒径が大きすぎると、
ウイルスを捕獲する効率が低下し、ウイルス濃縮が十分
に行えないことがあるため好ましくない。

【００２７】本発明のウイルス濃縮用粒子の基材粒子
は、多孔性であっても、非多孔性であってもかまわな
い。但し、多孔性である場合にはウイルス粒子が粒子内
部まで侵入したとき、粒子からのウイルス分離が困難と
なる場合があるので、ウイルスと同程度以上の孔径、例
えば孔径10nm以上の孔が粒子表面から粒子内部にまで連
続して存在する多孔質体は好ましくない。また、本発明
のウイルス濃縮用粒子としては、市販の磁性粒子、例え
ばMagacell（CORTEX BIOCHEM社）、Dynabeads（Dynal
社）、SeraMag（Seradyne社）などをそのまま、あるい
は必要に応じてスルホン化して用いることができる。

【００２８】〈ウイルス濃縮方法〉次に、本発明のウイ
ルス濃縮用粒子によるウイルス濃縮方法について具体的
に説明する。本発明のウイルス濃縮用粒子は各種ウイル
スに対して濃縮能を有しており、例えばヘパドナウイル
ス（Ｂ型肝炎ウイルス等）、アデノウイルス、フラビウ
イルス（日本脳炎ウイルス等）、ヘルペスウイルス、
（単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、サ
イトメガロウイルス、EBウイルス等）、ポックスウイル
ス、パルボウイルス（アデノ関連ウイルス等）、オルソ
ミクソウイルス（インフルエンザウイルス等）、ラブド
ウイルス（狂犬病ウイルス等）、レトロウイルス（後天
性免疫不全症候群ウイルス等）、Ｃ型肝炎ウイルス等の
ウイルスの濃縮が可能である。

【００２９】本発明のウイルス濃縮用粒子によるウイル
ス濃縮の対象となる検体としては、血漿、血清、細胞破
砕液、尿、唾液等の各種体液、細胞培養液等を挙げるこ
とができる。このような検体はそのまま試料として使用
されてもよいし、何らかの目的で希釈などされた状態で
試料として使用されてもよい。

【００３０】本発明のウイルス濃縮用粒子の試料への添
加量は、試料に含まれているウイルス濃度にもよるが、
試料の通常0.05〜50重量％、好ましくは0.1〜10重量％
である。添加量が少なすぎると、ウイルス濃縮用粒子に
結合できるウイルスの数が限られるため濃縮効率が悪化
する。また、添加量が多すぎると、結合したウイルスを
後段階で脱離させるのに多量の脱離液が必要となり濃縮
効率が低下する。

【００３１】本発明において、ウイルス濃縮用粒子とと
もに多価金属化合物を試料に添加することにより、ウイ
ルスのウイルス濃縮用粒子への結合割合をより高くする
ことができる。ここで多価金属としては、例えば、Be,
Mg, Sr, Ba, Ti, Zr, Cr, Mo, W, Mn,Fe, Ru, Os, Co,
Rh, Ni, Pd, Pt, Cu, Ag, Au, Zn, Cd, Hg, Al, Ga, S
i, Ge,Sn, Pb, P, As, Sb, Biなどを挙げることがで
き、多価金属化合物とはこれら多価金属の塩化物、水酸
化物、炭酸化合物、硫酸化合物、硝酸化合物、酢酸化合
物、塩素酸化合物などのうち、水中で解離して２価以上
のカチオンを生成する化合物である。これらの多価金属
化合物としては、塩化マンガンや硫酸銅などが好まし
い。多価金属化合物の使用量は、通常、ウイルス濃縮用
粒子と試料とを混合する際の反応液中濃度が0.1〜100mm
ol/lとなる量である。

【００３２】試料中のウイルスを吸着したウイルス濃縮
用粒子は、磁気分離、遠心分離あるいは自然沈降により
試料より分離される。本発明のウイルス濃縮用粒子は通
常、0.01〜100μmの粒径範囲を持つので、磁気分離の
他、遠心機でも十分遠心分離が可能である。磁気分離ま
たは遠心分離されたウイルス濃縮用粒子は必要に応じ
て、低濃度の緩衝液で洗浄した後、ウイルスの粒子から
の分離、核酸の抽出工程に移る。核酸抽出は、ウイルス
が粒子に結合したままでも行うことができる。即ち、例
えば、分離されたウイルス濃縮用粒子に少量の緩衝液を
加え、加熱することで直接、ウイルスの核酸を抽出する
ことも可能であるし、市販されている核酸抽出試薬を直
接添加してウイルスの核酸を抽出することも可能であ
る。

【００３３】ウイルスを粒子から分離する方法として
は、塩溶液を作用させてウイルス濃縮用粒子とウイルス
とを解離させる方法がある。塩溶液としては高濃度の臭
化カリウム、臭化ナトリウム、1.5M塩化ナトリウム、1m
Mリンタングステン酸等を用いることができる。そこ
で、本発明はその一側面として、前述したウイルス検出
方法を提供するものである。

【００３４】〈ウイルス検出方法〉このウイルス検出方
法は、上記のようにしてウイルスが結合した本発明によ
る粒子を試料から分離、収集することによりウイルスを
濃縮する段階ののち、こうして濃縮されたウイルスを核
酸増幅検査に供する段階を有している。

【００３５】ウイルスの核酸増幅検査（ＮＡＴ; nuclei
c acid amplification test）の方法は特に限定され
ず、例えば、ロシュ社のＰＣＲ(Polymerization chain
reaction)法、ジェン・プローブ社のＴＭＡ(Transcript
ion Mediated amplification-hybridization protectio
n assay)法、アボット社のＬＣＲ(Ligase chain reacti
on)法等を利用することができる。このウイルス濃縮方
法を利用したウイルス検出法では、核酸増幅検査に供さ
れる検体中のウイルスが既に濃縮されているので、元の
検体または試料に含まれているウイルスが極く微量であ
っても効率的にウイルスの検出を行うことができる。

【００３６】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、粒子の粒径の測定および粒子表面に存在するアニオ
ン性基の存在量は次のようにして測定した値である。 ・粒径の測定：粒子粒径は光学顕微鏡、走査型電子顕微
鏡または透過型電子顕微鏡により写真撮影を行い２００
個の粒子の粒径を測定し、その平均値を求めた。 ・アニオン性基の存在量：粒子約10gにイオン交換水90
g、陽イオン・陰イオン交換樹脂混合物（アンバーライ
トＭＢ３ オルガノ社製）30gを加え、1時間穏やかに攪
拌した。イオン交換樹脂をナイロンメッシュ（４８メッ
シュ；孔眼寸法295μm）を用いて濾去し、粒子量を定量
後0.01mol/lの水酸化ナトリウム溶液を用いて電導度滴
定を行い、アニオン性基の量を求めた。

【００３７】〔実施例１〕 磁性表面スルホン化スチレ
ン／ジビニルベンゼン粒子の調製 磁性スチレン／ジビニルベンゼン粒子（DYNO社製）１０
ｇに５０℃の濃硫酸（９８重量％）１００ｇを加え、１
分間攪拌した後、純水、続いてリン酸緩衝生理食塩水
（以下「PBS」という）にて粒子を洗浄し、磁性スルホ
ン化スチレン／ジビニルベンゼン粒子を得た。粒径およ
びアニオン性基の存在量を表１に示す。

【００３８】〔実施例２〕 磁性カルボン酸粒子の調製 油性磁性流体「フェリコロイドＨＣ５０」〔タイホー工
業（株）製〕にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた
後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面
を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：０．０１
μｍ）を得た。超常磁性体４０部に、シクロヘキシルメ
タクリレート９５部、メタクリル酸５部およびベンゾイ
ルペルオキシド（重合開始剤）３部を添加し、この系を
混合攪拌することにより超常磁性体を均一に分散させて
モノマー組成物を調製した。一方、ポリビニルアルコー
ル１０部、ラウリル酸ナトリウム０．０５部およびポリ
エチレオキシドノニルフェニルエーテル０．１部を水１
０００部に溶解して水性媒体を調製した。得られた水性
媒体（水相）中に上記のモノマー組成物を添加し、この
系を、ホモミキサーで予備攪拌した後、超音波分散機で
分散処理することにより、平均粒子径が２μｍの油滴
（油相）が水性媒体に分散されてなる懸濁液（油滴分散
体)を調製した。

【００３９】次いで、得られた懸濁液を、容量２リット
ルの攪拌機付三つ口フラスコ内に仕込み、この系を７５
℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しながら５時間
にわたって、油滴中のモノマーを重合（懸濁重合）させ
ることにより、本発明の磁性ポリマー粒子が水性媒体中
に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）を
調製した。得られた粒子を５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶
液に分散し、８０℃、１２時間処理して、表面カルボン
酸粒子を得た。粒径およびアニオン性基の存在量を表１
に示す。

【００４０】〔実施例３〕 スルホン酸単量体シード重
合粒子の調製 スチレン／ジビニルベンゼン粒子（DYNO社製）８ｇを、
ドデシル硫酸ナトリウム０．０３ｇ部を含む水１００ｇ
に分散した。スチレン１ｇおよびスチレンスルホン酸ナ
トリウム１ｇを加え80℃に加温した後、過硫酸カリウム
０．０１ｇを加え１０時間反応を行った。反応終了後、
純水、続いてＰＢＳにて粒子を洗浄し、磁性スチレンス
ルホン酸／スチレンシード重合粒子を得た。粒径および
アニオン性基の存在量を表１に示す。

【００４１】〔実施例４〕磁性ポリスチレンスルホン酸
固定化粒子の調製 耐圧反応容器にスチレン３５ｇ、ｎ−ブチルリチウム
０．４４ｇおよびシクロヘキサン２００ｇを仕込み、６
０〜９０℃を保ちながら４時間重合した後、反応容器内
に二酸化炭素を吹き込むことにより反応を終了した。次
いで減圧下で溶剤および未反応単量体を留去したのち、
エーテル１００ｇを加えて希釈し、ポリマー溶液を得
た。このポリマー溶液に濃硫酸４１ｇを少しずつ添加
し、５０℃で５時間撹拌を続けた後、減圧下で溶剤を留
去し、得られた生成物を水酸化ナトリウムにより中和
後、透析によって精製し、末端カルボン酸変性ポリスチ
レンスルホン酸ナトリウム（分子量２６０００）を得
た。

【００４２】次に、実施例２の粒子１０ｇを水５０ｇに
分散し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＷＳＣ）０．１ｇを加え、4℃で
１時間反応後、冷水で洗浄し、次いで０．５ｇのヘキサ
メチレンジアミンを加え、室温で２時間反応後、純水で
洗浄しヘキサメチレンジアミン固定化粒子を得た。これ
に、ＷＳＣ ０．１ｇ、末端カルボン酸変性ポリスチレ
ンスルホン酸０．５ｇを加え、室温で２時間反応した
後、純水、続いてPBSにて粒子を洗浄しポリスチレンス
ルホン酸ナトリウム固定化粒子を得た。粒径およびアニ
オン性基の存在量を表１に示す。

【００４３】〔実施例５〕 水溶性多糖類を有する粒子
の調製 ヘパリンを0.04mol/mlHCl水溶液に溶解し、100℃、1.5
時間反応させ、部分脱N-硫酸化ヘパリンを調製し、エタ
ノールに再沈して精製した。この脱N-硫酸化ヘパリンの
アミノ残基とカルボキシル基を有する磁性粒子とを水溶
性カルボジイミド試薬EDC・HCl（1-エチル-3(3-ジメチ
ルアミノプロピル)カルボジイミド・ハイドロクロライ
ド）を用いて、10mmol／mlMES緩衝溶液(pH6.0)中、0
℃、2時間反応させヘパリン含有磁性粒子を得た。

【００４４】〔実施例６〕 水溶性多糖類を有する粒子
の調製 デキストラン硫酸を0.1mol/l過ヨウ素酸ナトリウム溶液
中で30分間攪拌して酸化し、0.01mol/l炭酸ナトリウム
緩衝液(pH9.5)に対して透析して精製した。このデキス
トラン硫酸と、エチレンジアミンとカルボキシル基含有
磁性粒子とをEDC・HClを用いて反応して得たアミノ基含
有磁性粒子とを混合し、4℃、12時間反応させ、シッフ
塩基形成によりカップリングした。さらに、水素化ホウ
素ナトリウムを加えてシッフ塩基を還元し、デキストラ
ン硫酸含有磁性粒子を得た。

【００４５】〔実施例７〕等電点がpH9である酸性ゼラ
チン4gを40℃の温水に100mlになるように溶解し、10％
の水酸化ナトリウム溶液を用いてpH9に調整した。デキ
ストラン硫酸4gを100mlになるように水に溶解し、40℃
に加温した。このようにして得られたゼラチン溶液25ml
とデキストラン硫酸溶液25mlを混合し、この混合液をあ
らかじめ40℃に加温した30容量％のエチルアルコール溶
液150mlをそそぎ入れ、良く攪拌した。これに10％ヘキ
サメタリン酸ナトリウム溶液0.8ml、10％アルキルスル
ホマレイン酸溶液1mlおよび平均粒径150Åのフェリコロ
イドＷ−３５（タイホー工業(株)製）300μｌを加えよ
く攪拌した。

【００４６】次いで、40℃に保ちながら10容量％の酢酸
溶液を滴下して、pH7.2に調整し、粒子を生成させた。
得られた粒子分散液を氷冷したのち、グルタールアルデ
ヒド0.7ｇを加え、良く攪拌後氷上に一晩放置した。こ
の粒子分散液を2000rpmで10分間遠心分離し、0.005％ア
ルキルスルホンマレイン酸で3回遠心洗浄し、4容量％ホ
ルマリン溶液に分散し5℃で1週間放置した。その後、蒸
留水で3回洗浄し、生理食塩水に懸濁した。

【００４７】〔試験例１〕ウイルス濃縮−核酸定量 上記実施例１〜４で得られた粒子を用いて、ウイルス濃
縮を行った。ＨＣＶの存在が確認されているヒト血漿１
ｍＬに粒子懸濁液（10重量％）100μＬおよび１Ｍ Ｍｎ
Ｃｌ₂溶液 75μＬを加え、室温で１０分間回転撹拌を
行った。反応終了後、磁性チューブスタンドにて分離
し、上清を捨て、粒子を得た。上記作業にて得た粒子に
飽和臭化カリウム水溶液を50μL添加し、５分間撹拌
後、磁性チューブスタンドにて分離し、上清を得た（分
離濃縮分画）。最終容量は約50μＬであった。

【００４８】分離濃縮画分より２μLを取り、通常の方
法で核酸を抽出した。分離濃縮に使用した血漿を予め、
各ウイルスの核酸陰性であることを確認しているヒト血
漿を用いて、希釈系列を作成し、これを校正用サンプル
とした。これらのサンプルより通常の方法を用いて核酸
を抽出した。この抽出核酸について、ＨＣＶ遺伝子の
５’ＵＴＲ領域を対象として一般的に実施されているＲ
Ｔ−ＰＣＲ法によるＨＣＶ−ＲＮＡ量を定量した。

【００４９】〔比較例〕試験例１の検定と並行して、試
験例１で使用したものと同じＨＣＶの存在が確認されて
いるヒト血漿１ｍＬにヘパリン溶液（１６０／USPunits
/mgを０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液５ｍＬで溶解した
もの）１０μＬを加え、さらに１Ｍ ＭｎＣｌ₂７５μ
Ｌ加えて室温で２０分間反応させた。反応終了後１５０
００ｒｐｍで１０分間低速微量遠心機にて分離し、上清
を捨て沈殿を得た、この沈殿に飽和臭化カリウム５０μ
Ｌを加え沈殿を可溶化した（分離濃縮分画）。最終容量
は約50μＬであった。その後、上記試験例と同様の評価
を行った。回収量、濃縮率および分離濃縮に必要な時間
を表１に示す。比較例の方法ではヘパリンによるＰＣＲ
阻害のため核酸の検出ができなかった。一方、各実施例
では、ウイルス回収率はほぼ１００％であり、濃縮率は
２５倍と高かった。

【００５０】

【表１】

【００５１】

【発明の効果】本発明のウイルス濃縮用粒子を用いるこ
とにより、磁気を作用させる簡便な手段により、同時に
多数の検体を簡便に濃縮処理することのでき、しかも得
られた濃縮ウイルスを含む試料は核酸増幅の処理に悪影
響を及ぼさない。この粒子を利用するウイルス濃縮方法
は、極く微量のウイルスを含む検体からウイルスを効率
良く短時間で濃縮することができ、またウイルス検出方
法はより高精度でウイルスを検出することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/553 (Ｃ１２Ｎ 7/02 //(Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 西田 昌三 東京都中央区築地二丁目11番24号 ジェイ エスアール株式会社内 (72)発明者 日方 幹雄 東京都中央区築地二丁目11番24号 ジェイ エスアール株式会社内 (72)発明者 笠井 澄 東京都中央区築地二丁目11番24号 ジェイ エスアール株式会社内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 磁性体を含有してなるウイルス濃縮用粒
   子。
2. 【請求項２】 粒子表面にアニオン性基を含む請求項１
   に記載のウイルス濃縮粒子。
3. 【請求項３】 請求項１または請求項２に記載の粒子と
   多価金属化合物とからなるウイルス濃縮用試薬。
4. 【請求項４】 ウイルスを含有する可能性のある試料に
   請求項１または請求項２に記載のウイルス濃縮用粒子を
   添加し、ウイルスを前記粒子に結合させる段階、次にこ
   うしてウイルスが結合した前記粒子を試料から分離、収
   集する段階を含む、ウイルス濃縮方法。
5. 【請求項５】 前記の試料にウイルス濃縮用粒子ととも
   に多価金属化合物を添加する請求項４に記載のウイルス
   濃縮方法。
6. 【請求項６】 ウイルスを含有する可能性のある試料に
   請求項１または請求項２に記載のウイルス濃縮用粒子を
   添加し、ウイルスを前記粒子に結合させる段階、次にこ
   うしてウイルスが結合した前記粒子を試料から分離、収
   集することによりウイルスを濃縮する段階、こうして濃
   縮されたウイルスを核酸増幅検査に供する段階を含む、
   ウイルス検出方法。
7. 【請求項７】 前記の試料にウイルス濃縮用粒子ととも
   に多価金属化合物を試料に添加する請求項６に記載のウ
   イルス検出方法。