JP2001238668A

JP2001238668A - ポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸を生産する微生物およびこれを用いたポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸の生産方法

Info

Publication number: JP2001238668A
Application number: JP2000056231A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Honma; 務本間; Takeshi Imamura; 剛士今村; Tetsuya Yano; 哲哉矢野; Takashi Kenmoku; 敬見目
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2000-03-01
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2001-09-04

Abstract

(57)【要約】【課題】デバイス材料や医用材料等として有用なポリ
−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸の高生産
能を有する微生物及び該微生物を用いたポリ−３−ヒド
ロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸の製造方法を提供す
る。【解決手段】シュードモナス・フルオレッセンスＮ
１２７株（Pseudomonasfluorescens N127、FERM P-1774
5）を、下記式（２）で表される４−フェノキシ−ｎ−
酪酸を含む培地で培養し、該Ｎ１２７株の培養により生
産されたポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−
酪酸を抽出する。【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物産生ポリヒドロ
キシアルカノエート（ＰＨＡ）のうち、ポリ−３−ヒド
ロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸（ＰＨＰｘＢ）の微
生物生産において、従来の微生物と比較してより多量の
ＰＨＰｘＢを菌体内に蓄積する新規微生物に関する。ま
た、この微生物を用いたＰＨＰｘＢの生産方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】これまで、多くの微生物がポリ−３−ヒ
ドロキシ酪酸（ＰＨＢ）あるいはその他のＰＨＡを生産
し、菌体内に蓄積することが報告されてきた（「生分解
性プラスチックハンドブック」、生分解性プラスチック
研究会編、（株）エヌ・ティー・エス発行、Ｐ１７８−
１９７、１９９５）。これらのポリマーは、従来のプラ
スチックと同様に、溶融加工等により各種製品の生産に
利用することができる。さらに、生分解性であるがゆえ
に、自然界で微生物により完全分解されるという利点を
有しており、従来の多くの合成高分子化合物のように自
然環境に残留して汚染を引き起こすことがない。また、
生体適合性にも優れており、医療用軟質部材等としての
応用も期待されている。

【０００３】このような微生物産生ＰＨＡは、その生産
に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、
様々な組成や構造のものとなり得ることが知られてお
り、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点か
ら、このような組成や構造の制御に関する研究がなされ
てきた。

【０００４】例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス
Ｈ１６株（Alcaligenes eutropusH16、ATCC No.1769
9）及びその変異株は、その培養時の炭素源を変化させ
ることによって、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−
ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）との共重合体を様々な組成
比で生産することが報告されている（特表平６−１５６
０４号公報、特表平７−１４３５２号公報、特表平８−
１９２２７号公報等）。

【０００５】また、特許公報第２６４２９３７号では、
シュードモナス・オレオボランスATCC29347株（Pseudom
onas oleovorans ATCC29347）に、炭素源として非環状
脂肪族炭化水素を与えることにより、炭素数が６から１
２までの３−ヒドロキシアルカノエートのモノマーユニ
ットを有するＰＨＡが生産されることが開示されてい
る。

【０００６】特開平５−７４４９２号公報では、メチロ
バクテリウム属（Methylobacteriumsp.）、パラコッカ
ス属（Paracoccus sp.）、アルカリゲネス属（Alcalige
nessp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）の微
生物を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させる
ことにより、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる
方法が開示されている。

【０００７】特開平５−９３０４９号公報、及び、特開
平７−２６５０６５号公報では、アエロモナス・キャビ
エ（Aeromonas caviae）を、オレイン酸やオリーブ油を
炭素源として培養することにより、３ＨＢと３−ヒドロ
キシヘキサン酸（３ＨＨｘ）の２成分共重合体が生産さ
れることが開示されている。

【０００８】特開平９−１９１８９３号公報では、コマ
モナス・アシドボランス・IFO13852株（Comamonas acid
ovorans IFO13852）が、グルコン酸及び１，４−ブタン
ジオールを炭素源として用いた培養により、３ＨＢと４
−ヒドロキシ酪酸とをモノマーユニットとして持つポリ
エステルを生産することが開示されている。

【０００９】さらに、ある種の微生物では、様々な置換
基、例えば、不飽和炭化水素から得られる基、エステル
基、アリル基、シアノ基、ハロゲン化炭化水素から得ら
れる基、エポキシド等が導入されたＰＨＡを生産するこ
とが報告されており、このような手法によって微生物産
生ＰＨＡの物性改良を目指す試みもなされ始めている。
例えば、Makromol. Chem., 191,1957-1965, 1990、Macr
omolecules, 24, 5256-5260, 1991、Chirality, 3, 492
-494, 1991等では、シュードモナス・オレオボランスが
３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（３ＨＰＶ）から
得られる３ＨＰＶモノマーユニットを含むＰＨＡを生産
することが報告されており、３ＨＰＶモノマーユニット
が含まれることに起因すると思われる、ポリマー物性の
変化が認められている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前述のような、置換基
を側鎖に導入したタイプのＰＨＡは、導入した置換基を
所望とする特性等に応じて選択することで、導入した置
換基の特性等に起因する、極めて有用な機能や特性を具
備した「機能性ポリマー」としての展開も期待でき、そ
のような機能性と生分解性とを兼ね備えた優れたポリマ
ーと、その製造方法、並びに、そのような微生物を用い
た所望のポリマーの効率的生産方法の開発は極めて有用
かつ重要であると考えられた。

【００１１】一般に、特殊な官能基を導入したモノマー
ユニットを含むＰＨＡを微生物により生産させようとし
た場合、３ＨＢなどの一般的なモノマーユニットのみか
らなるＰＨＡを微生物に生産させる場合と比較して、菌
体内のＰＨＡ蓄積量は大幅に低下する傾向がある。よっ
て、このような特殊な置換基を側鎖に導入したＰＨＡ
を、より多く菌体内に蓄積させることは、当該ポリマー
を開発する上で重要な技術課題であった。

【００１２】ＰＨＡの菌体内蓄積量を増大させる方法と
しては、所望の官能基を含む脂肪酸と、ｎ−ノナン酸な
どの補助的基質とを含む培地で微生物を培養する方法な
どが例示できる。しかしながら、上記の方法では、生産
されたＰＨＡに、所望の官能基を含むモノマーユニット
の他に、補助的基質に由来するモノマーユニットが多量
に混在することが避けられず、従って、所望の官能基を
含むモノマーユニットのみから構成されるホモポリマー
を取得したい場合などには用いることが出来ない。

【００１３】本発明の目的は、ポリ−３−ヒドロキシ−
４−フェノキシ−ｎ−酪酸の生産能力の高い微生物及び
該微生物を用いたポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキ
シ−ｎ−酪酸の生産方法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ポリ−３
−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸（ＰＨＰｘ
Ｂ）を機能性ポリマーとして開発することを目指して、
高純度のＰＨＰｘＢをより多く菌体内に蓄積する新規微
生物の探索、及び、このような微生物を用いたＰＨＰｘ
Ｂの高収率生産方法について鋭意研究を重ねてきた。そ
の結果、下記式（２）：

【００１５】

【化３】

【００１６】で表される４−フェノキシ−ｎ−酪酸（Ｐ
ｘＢＡ）を原料として、下記式（１）：

【００１７】

【化４】

【００１８】（ｎは１０以上の整数である。）で表わさ
れる繰返し単位を有するＰＨＰｘＢを、例えば、シュー
ドモナス・プチダＰ９１株（Pseudomonas putida P9
1、FERM P-17409、特願平11-371867号）と比較して、よ
り多量に蓄積する能力を有する新規微生物であるシュー
ドモナス・フルオレッセンスＮ１２７株（Pseudomona
s fluorescens N127、FERM P-17745）を見出し、さら
に、この微生物を用いたＰＨＰｘＢの高収率生産方法を
開発した。

【００１９】すなわち、本発明のＰＨＰｘＢの生産方法
は、上記式（１）で表わされる繰返し単位を有するＰＨ
ＰｘＢを生産する方法であって、上記のＮ１２７株を、
上記式（２）で表されるＰｘＢＡを含む培地で培養する
工程と、該Ｎ１２７株の培養により生産されたＰＨＰｘ
Ｂを抽出する工程とを有することを特徴とする。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下に本発明についての詳細を示
す。

【００２１】まず、本発明者らはＰｘＢＡを基質として
用いて、ＰＨＰｘＢを生産する能力を有する微生物の探
索を行った。その結果、より多くのＰＨＰｘＢを生産し
菌体内に蓄積する微生物を土壌より分離することに成功
し、これをＮ１２７株とした。

【００２２】本発明によるＮ１２７株の菌学的性質を列
挙すれば以下の通りである。

【００２３】＜Ｎ１２７株の菌学的性質＞（ａ）形態的性質細胞の形：桿菌細胞の大きさ：０．５μｍ×１．５〜２．０μｍ細胞の多形性の有無：− 運動性：＋鞭毛の着生状態：極毛、２〜３本胞子の有無：− グラム染色性：− （ｂ）培養的性質コロニー形状：円形、全縁なめらか、低凸状、表層なめ
らか、クリーム色肉汁液体培地：混濁リトマスミルク：− （ｃ）生理学的性質硝酸塩の還元：− 脱窒反応：− ＭＲテスト：− ＶＰテスト：− インドールの生成：− 硫化水素の生成：− 色素の生成Ｋｉｎｇ'ｓＢ寒天培地：＋デンプンの加水分解：− ウレアーゼ：− オキシダーゼ：＋カタラーゼ：＋アルギニンジヒドロラーゼ：＋生育温度２５℃：＋３０℃：＋３７℃：＋４２℃：− 酸素に対する態度：好気的Ｏ−Ｆテスト：酸化型ブドウ糖酸性化：− エスクリン加水分解：− ゼラチン加水分解：＋白糖からのレバン産生：− オルニチンの脱炭素反応：− リジンの脱炭素反応：− β−ガラクトシダーゼ：− レシチナーゼ：＋リパーゼ：− 糖類からの酸産生／ガスの産生Ｌ−アラビノース：−／− Ｄ−ソルビトール：−／− イノシトール：−／− Ｄ−キシロース：−／− Ｄ−ガラクトース：−／− シュークロース：−／− グリセリン：−／− Ｄ−フラクトース：−／− マルトース：−／− ラクトース：−／− Ｄ−マンノース：−／− トレハノース：−／− Ｄ−マンニトール：−／− 炭素源の資化性ブドウ糖：＋Ｌ−アラビノース：＋Ｄ−マンノース：＋Ｄ−マンニトール：＋Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：＋マルトース：− グルコン酸カリウム：＋ｎ−カプリン酸：＋アジピン酸：＋ｄｌ−リンゴ酸：＋クエン酸ナトリウム：＋酢酸フェニル：− 以上の菌学的性質から、バージェーズ・マニュアル・オ
ブ・システマティック・バクテリオロジー・第１巻（Be
rgey's Manual of Systematic Bacteriology,Volume
1）（1984年）、及び、バージェーズ・マニュアル・オブ
・ディタミネーティブ・バクテリオロジー（Bergey's M
anual of Determinative Bacteriology）第９版（1994
年）に基づいて検索したところ、Ｎ１２７株はシュード
モナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescen
s）に属すると判明した。従って、この菌株をシュード
モナス・フルオレッセンス・Ｎ１２７株と命名した。

【００２４】なお、本菌株は寄託番号「FERM P-17745」
として、通商産業省、工業技術院、生命工学工業技術研
究所、特許微生物寄託センターに寄託されている。

【００２５】本発明のＰＨＰｘＢの生産方法に用いる微
生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＰｘ
Ｂの生産に必要とされる菌数や活性状態の確保のための
培養などには、微生物の生育や生存に悪影響を及ぼすも
のでない限り、一般的な天然培地（肉汁培地など）や栄
養源を添加した合成培地等、いかなる種類の培地をも用
いることができる。温度、通気、撹拌などの培養条件は
用いる微生物に応じて適宜選択する。

【００２６】一方、微生物を用いてＰＨＰｘＢを生産・
蓄積させる場合は、ＰｘＢＡを少なくとも含んだ無機培
地などが用いられる。

【００２７】上記の培養方法に用いる無機培地として
は、リン源（例えば、リン酸塩等）、窒素源（例えば、
アンモニウム塩、硝酸塩等）等、微生物が増殖し得る成
分を含んでいるものであればいかなるものでも良く、例
えば無機塩培地としては、ＭＳＢ培地やＭ９培地等を挙
げることができる。

【００２８】なお、本発明における実施例で用いるＭ９
培地の組成は以下の通りである。

【００２９】Ｎａ₂ＨＰＯ₄：６．２ｇＫＨ₂ＰＯ₄：３．０ｇＮａＣｌ：０．５ｇＮＨ₄Ｃｌ：１．０ｇ（培地１リットル中、ｐＨ７．０）培養条件としては、例えば１５〜４０℃、好ましくは２
０〜３５℃で、好気条件下での振盪培養や撹拌培養が挙
げられる。

【００３０】培養工程は、バッチ式、流動バッチ式、半
連続培養、連続培養、リアクター形式など、通常の微生
物の培養に用いるいかなる方法をも用いることができ、
これらの工程を複数段接続した多段方式を採用してもよ
い。

【００３１】例えば、例えば、０．１重量％〜１．０重
量％程度の酵母エキスやグルコースなどの増殖用基質
と、０．０１重量％〜０．５重量％程度のＰｘＢＡとを
含んだ無機培地などで対数増殖後期から定常期の時点ま
で培養し、菌体を遠心分離等で回収したのち、ＰｘＢＡ
を０．０１重量％〜０．５重量％程度含んだ、窒素源が
存在しない無機培地で更に培養して、菌体を回収しＰＨ
ＰｘＢを抽出する方法がある。また、０．１〜１重量％
程度の酵母エキスやグルコースなどの増殖用基質と、
０．０１重量％〜０．５重量％程度のＰｘＢＡとを与え
て培養し、対数増殖後期から定常期の時点で菌体を回収
しＰＨＰｘＢを抽出する方法もある。

【００３２】本発明の方法における菌体からのＰＨＰｘ
Ｂの回収は、通常行われているクロロホルム等の有機溶
媒による抽出が最も簡便ではあるが、有機溶媒が使用し
にくい環境中においては、ＳＤＳ等の界面活性剤による
処理、リゾチーム等の酵素による処理、ＥＤＴＡ、次亜
塩素酸ナトリウム、アンモニア等の薬剤による処理によ
ってＰＨＰｘＢ以外の菌体成分を除去して、ＰＨＰｘＢ
を回収する方法を用いることもできる。

【００３３】なお、微生物の培養、微生物によるＰＨＰ
ｘＢの生産と菌体内への蓄積、並びに、菌体からのＰＨ
ＰｘＢの回収は、上記の方法に限定されるものではな
い。

【００３４】

【実施例】以下に実施例を示すが、本発明は以下の実施
例によって何ら制約されるものではない。

【００３５】実施例１酵母エキス０．５重量％、ＰｘＢＡ０．１重量％を含
むＭ９培地２００ｍｌにＮ１２７株を植菌し、３０℃、
１２５ストローク／分で振盪培養した。２４時間後、菌
体を遠心分離によって回収し、冷メタノールで一度洗浄
して凍結乾燥した。

【００３６】この凍結乾燥ペレットを２０ｍｌのクロロ
ホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽
出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィル
ターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮
し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿の
みを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨ
Ａは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスク
ロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津Ｑ
Ｐ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、ＰＨＡを構成するモ
ノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行った。

【００３７】その結果、表１に示す通り、当該ＰＨＡは
ほぼ３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸（３Ｈ
ＰｘＢ）のみをモノマーユニットとして含むＰＨＰｘＢ
であり、その生産性は乾燥菌体重量あたり１．８重量％
であった。Ｐ９１株を用いて同様の方法でＰＨＰｘＢを
生産させた場合、その生産性は乾燥菌体重量あたり０．
５重量％であった。

【００３８】

【表１】

【００３９】実施例２Ｄ−グルコース０．５重量％、ＰｘＢＡ０．１重量％
を含むＭ９培地２００ｍｌにＮ１２７株を植菌し、３０
℃、１２５ストローク／分で振盪培養した。４８時間
後、菌体を遠心分離によって回収し、Ｄ−グルコース
０．５重量％、ＰｘＢＡ０．１重量％とを含む、窒素
源（ＮＨ₄Ｃｌ）を含まないＭ９培地２００ｍｌに再懸
濁して、更に３０℃、１２５ストローク／分で振盪培養
した。４８時間後、菌体を遠心分離によって回収し、冷
メタノールで一度洗浄して凍結乾燥した。

【００４０】この凍結乾燥ペレットを２０ｍｌのクロロ
ホルムに懸濁し、６０℃で２０時間攪拌してＰＨＡを抽
出した。抽出液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィル
ターでろ過したのち、ロータリーエバポレーターで濃縮
し、濃縮液を冷メタノール中で再沈殿させ、更に沈殿の
みを回収して真空乾燥してＰＨＡを得た。得られたＰＨ
Ａは、常法に従ってメタノリシスを行ったのち、ガスク
ロマトグラフィー−質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ，島津Ｑ
Ｐ−５０５０、ＥＩ法）で分析し、当該ＰＨＡを構成す
るモノマーユニットのメチルエステル化物の同定を行っ
た。

【００４１】その結果、表２に示す通り、当該ＰＨＡは
ほぼ３ＨＰｘＢのみをモノマーユニットとして含むＰＨ
ＰｘＢであり、その生産性は乾燥菌体重量あたり７．１
％であった。

【００４２】

【表２】

【００４３】

【発明の効果】本発明により、高純度のポリ−３−ヒド
ロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸をより多く菌体内に
蓄積することができる新規微生物、および、この微生物
を用いたポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−
酪酸の高収率生産方法が提供される。これにより、機能
性ポリマーとして有用なポリ−３−ヒドロキシ−４−フ
ェノキシ−ｎ−酪酸が効率的に生産でき、各分野への応
用が期待できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:39）Ｃ１２Ｒ 1:39） (72)発明者矢野哲哉東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者見目敬東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内Ｆターム(参考） 4B064 AD83 CA02 CB12 CB24 CC03 CD07 CE08 CE17 DA01 DA20 4B065 AA43X AC14 BA23 BB08 BD11 BD16 CA12 CA44 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式（１）で表される繰返し単位を有
するポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸
を、下記式（２）で表される４−フェノキシ−ｎ−酪酸
を利用して生産する能力を有することを特徴とするシュ
ードモナス・フルオレッセンスＮ１２７株（Pseudomo
nas fluorescens N127、FERM P-17745）。【化１】
【請求項２】下記式（１）で表れる繰返し単位を有す
るポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸を
生産する方法であって、シュードモナス・フルオレッセンスＮ１２７株（Pseu
domonas fluorescensN127、FERM P-17745）を、下記式
（２）で表される４−フェノキシ−ｎ−酪酸を含む培地
で培養する工程と、該Ｎ１２７株の培養により生産され
たポリ−３−ヒドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸を
抽出する工程とを有することを特徴とするポリ−３−ヒ
ドロキシ−４−フェノキシ−ｎ−酪酸の生産方法。【化２】