JP2001183368A - 固相担体表面へのｄｎａ断片の固定方法及びｄｎａチップ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 固相担体表面に、予め別に調製したＤＮＡ断
片を迅速な反応によって結合させることが可能で、か
つ、反応生成物が安定に結合を維持することが可能な固
定方法を開発し、ブロッキング工程が不要なＤＮＡチッ
プを得ること。 【解決手段】 表面にホウ素含有化合物もしくはホウ素
化合物と反応して環状の結合を形成する二価の部分構造
が導入された固相担体と、一方の末端部に該ホウ素化合
物と反応して環状の結合を形成する二価の部分構造もし
くはホウ素化合物が導入されたＤＮＡ断片とを液相にて
接触させることにより、ホウ素含有化合物と二価の部分
構造との間での反応によって結合を形成させることを特
徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法、この
方法により得られたＤＮＡチップ、そしてそのＤＮＡチ
ップを用いるＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補
性を有する核酸断片を検出する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、変
異、多型等の同時解析に非常に有用である、多数のＤＮ
Ａ断片やオリゴヌクレオチドを固相表面に整列させた高
密度アレイ（ＤＮＡチップ）の作製に必要な、ＤＮＡ断
片の固相担体表面への固定方法に関する。本発明はま
た、そのＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法により
製造されたＤＮＡチップ、そしてＤＮＡチップ上のＤＮ
Ａ断片に対して相補性を有する核酸断片の検出方法にも
関する。

【０００２】

【従来の技術】多彩な生物の全遺伝子機能を効率的に解
析するための技術開発が進んでおり、その解析手段とし
て、ＤＮＡチップが利用されている。ＤＮＡチップは通
常、スライドガラス等の固相担体に多数のＤＮＡ断片を
整列固定させたマイクロアレイの形態にあり、ＤＮＡチ
ップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を持つＤＮＡ
断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮＡチッ
プ上に固定し、検出する方法に利用される。形成された
ハイブリッドの検出手段としては、ＤＮＡ断片試料に予
め結合させた蛍光標識あるいは放射性標識を利用する方
法、そしてハイブリッドに取り込まれる蛍光発生基もし
くは導電性基を持つインターカレータを利用する方法な
どが知られている。

【０００３】ＤＮＡチップを用いるＤＮＡチップ技術
は、ＤＮＡ以外の生体分子にも適用可能であり、創薬研
究、疾病の診断や予防法の開発、エネルギーや環境問題
対策等の研究開発に新しい手段を提供するものとして期
待されている。

【０００４】ＤＮＡの解析手段としてのＤＮＡチップの
利用が具体化してきたのは、ＤＮＡの塩基配列をオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって決定
する方法（ＳＢＨ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂ
ｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が考案されたことに始まる（Ｄ
ｒｍａｎａｃ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
４，ｐａｇｅ １１４（１９８９））。ＳＢＨは、ゲル
電気泳動を用いる塩基配列決定法の限界を克服できる方
法ではあったが、実用化には至らなかった。

【０００５】その後、ＤＮＡチップ作製技術が開発さ
れ、遺伝子の発現、変異、多型等を短時間で効率よく調
べる、いわゆるＨＴＳ（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕ
ｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）が可能となった（Ｆｏｄｏ
ｒ，Ｓ．Ｐ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，ｐａｇｅ
７６７（１９９１）およびＳｃｈｅｎａ，Ｍ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２７０，ｐａｇｅ ４６７（１９９
５））。

【０００６】しかし、ＤＮＡチップ利用技術を実用化す
るためには、多数のＤＮＡ断片やオリゴヌクレオチドを
固相担体表面に整列固定させるためのＤＮＡチップの作
製技術が必要とされる。

【０００７】ＤＮＡチップの作製方法としては、固相担
体表面で直接ＤＮＡ断片を合成する方法（「オン・チッ
プ法」という。）と、予め別に調製したＤＮＡ断片を固
相担体表面に固定する方法とが知られている。オン・チ
ップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の
使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー
技術および固相合成技術とを組み合わせて、微小なマト
リックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（「マ
スキング技術」という。）が代表的である。

【０００８】予め調製したＤＮＡ断片を固相担体表面に
固定する方法としては、ＤＮＡ断片の種類や固相担体の
種類に応じて下記の方法がある。 （１）固定するＤＮＡ断片がｃＤＮＡ（ｍＲＮＡを鋳型
にして合成した相補的ＤＮＡ）やＰＣＲ産物（ｃＤＮＡ
をＰＣＲ法によって増幅させたＤＮＡ断片）の場合に
は、これらをＤＮＡチップ作製装置に備えられたスポッ
タ装置を用いて、ポリ陽イオン（ポリリシン、ポリエチ
レンイミン等）で表面処理した固相担体表面に点着し
て、ＤＮＡの荷電を利用して固相担体に静電結合させる
方法が一般的に利用される。また、固相担体表面の処理
方法として、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を
有するシランカップリング剤を用いる方法も利用されて
いる（Ｇｅｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，５４５６−５４６５
（１９９４））。この場合には、アミノ基、アルデヒド
基等は、共有結合により固相担体表面に導入されるた
め、ポリ陽イオンによる場合と比較して安定に固相担体
表面に存在する。

【０００９】ＤＮＡの荷電を利用する方法の変法とし
て、アミノ基で修飾したＰＣＲ産物をＳＳＣ（標準食塩
クエン酸緩衝液）に懸濁させ、これをシリル化したスラ
イドガラス表面に点着し、インキュベートした後、水素
化ホウ素ナトリウムによる処理および加熱処理を順に行
う方法が報告されている（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９３，１０６１４−１０６１９（１９９６））。しか
し、この固定方法では必ずしも充分な安定度が得られ難
いという問題がある。ＤＮＡチップ技術では、検出限界
が重要となる。そのため、固相担体表面に充分な量で安
定にＤＮＡ断片を固定する技術の開発は、固定ＤＮＡ断
片と標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーション
の検出限界の向上に大きく寄与する。

【００１０】（２）固定するＤＮＡ断片が合成オリゴヌ
クレオチドの場合には、反応活性基を導入したオリゴヌ
クレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面に該オ
リゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（「蛋白質
・核酸・酵素」、４３巻、（１９９８）、２００４−２
０１１、Ｌａｍｔｕｒｅ，Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，２１２１−２１２
５，１９９４、およびＧｕｏ．Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２２，５４５６−５
４６５，１９９４）。例えば、アミノ基を導入したスラ
イドガラスに、ＰＤＣ（ｐ−フェニレンジイソチオシア
ネート）存在下、アミノ基導入オリゴヌクレオチドを反
応させる方法、および該スライドガラスに、アルデヒド
基導入オリゴヌクレオチドを反応させる方法が知られて
いる。これらの二つの方法は、前記（１）のＤＮＡの荷
電を利用する方法と比べて、オリゴヌクレオチドが固相
担体表面に安定に固定される。しかし、ＰＤＣを存在さ
せる方法は、ＰＤＣとアミノ基導入オリゴヌクレオチド
との反応が遅く、またアルデヒド基導入オリゴヌクレオ
チドを用いる方法は、反応生成物であるシッフ塩基の安
定性が低い（通常、加水分解が起こり易い）という問題
点を有し、さらに、固相表面にアミノ基のようにＤＮＡ
との相互作用の強い官能基が全面に存在すると、被検体
である核酸断片がＤＮＡチップ全面に非特異的に付着し
やすいため、検出を妨害するという問題がある。このた
め、これを防止するために、未反応の官能基を塞ぐ、ブ
ロッキングという工程が必要であった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、固相担体表
面に、予め別に調製したＤＮＡ断片を迅速な反応によっ
て結合させることが可能で、かつ、反応生成物が安定に
結合を維持することが可能な固定方法、ブロッキング工
程を特に必要としないＤＮＡチップ、および核酸断片の
検出方法を提供することを、その課題とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記の課題は下記の本発
明によって解決された。 （１）表面にホウ素含有化合物もしくはホウ素化合物と
反応して環状の結合を形成する二価の部分構造が導入さ
れた固相担体と、一方の末端部に該ホウ素化合物と反応
して環状の結合を形成する二価の部分構造もしくはホウ
素化合物が導入されたＤＮＡ断片とを、液相にて接触さ
せることにより、ホウ素含有化合物と二価の部分構造と
の間での反応によって結合を形成させることを特徴とす
るＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。本発明にお
いて、ホウ素含有化合物がボロン酸であることが好まし
く、またホウ素化合物と環状の結合を形成する二価の部
分構造が、ジオール、ジアミンまたはアミノアルコール
であることが好ましい。

【００１３】（２）上記の方法によって得られたＤＮＡ
チップ。

【００１４】（３）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光
物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試料を含む
水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイブリダ
イゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する工程、
そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断片試料の
蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。 （４）上記のＤＮＡチップの表面に、蛍光発生基もしく
は導電性基を有するインターカレータと核酸断片試料と
を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定され
ているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハイ
ブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定する
工程、そしてＤＮＡチップのＤＮＡ断片と核酸断片試料
とから形成されたハイブリッド構造内に取り込まれたイ
ンターカレータの蛍光発生基から発生する蛍光もしくは
導電性基を介して流れる電流を検出する工程からなる、
ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を有する核
酸断片の検出方法。

【００１５】本発明は、ＤＮＡ断片を固相担体上に固定
する方法において、特定の官能基を有するＤＮＡ断片を
特定の官能基を有する固相担体上に点着した箇所での
み、該ＤＮＡ断片と固相担体との間に極めて効率よく環
状構造が形成され、固定化される発見に基づいている。
この本発明の特定の官能基の組合せは、ホウ素化合物と
該ホウ素化合物と反応して環状構造を形成可能な二価の
部分構造を有する化合物の組合せである。本発明によ
り、極めて効率よく強固な環状構造形成を伴う共有形成
可能となり、被検体核酸断片検出の感度が向上すること
が分かった。

【００１６】本発明はさらに以下のようにして具体化さ
れる。固相担体表面へのＤＮＡ断片固定は環状構造の形
成を伴う共有結合の形成をもって行われる。この共有結
合の形成は固相担体表面とＤＮＡ断片にそれぞれ特定の
官能基を含有せしめることにより達成される。すなわ
ち、固相担体表面およびＤＮＡ断片のいずれか一方を、
ホウ素化合物とし、他方を該ホウ素化合物と環状構造を
形成しうる二価の基を結合したものを用いる。

【００１７】一般にホウ素化合物（例えば、ホウ酸エス
テル）はアルコール性水酸基と容易にエステル交換し、
新たな共有結合を形成することは広く知られている。し
かし、この新たに形成された共有結合も水や他の非共有
電子対を有する化合物の存在下では安定ではない。本発
明はホウ素化合物と反応し、ホウ素原子を含む環状構造
を形成する二価の基を作用させることによって、極めて
安定な共有結合の形成が可能になる発見に基づいてい
る。このような形式によって固相担体表面にＤＮＡ断片
を安定に固定することが可能なことは知られておらず、
また、非検体核酸断片の検出感度が向上することもこれ
まで知られていなかった。

【００１８】さらに、本発明においては固相担体表面と
ＤＮＡ断片とに特異的に安定な結合を形成する組合せを
選択したため、被検体核酸断片の固相担体上への非特異
的に結合あるいは吸着（本システムにとって極めて大き
な問題となる検出感度の低下を引き起こす原因）を大き
く抑制できることも見出された。すなわち、ＤＮＡ断片
が点着されていない部分（非点着部）においては、固相
担体表面は被検体核酸断片に対しての親和性が小さく、
ハイブリダイゼーションが起こらなかった被検体核酸断
片は洗浄操作によって容易に除去される。結果として、
特別な工程を施すことなく、検出のバックグラウンドを
低下させることができ、煩雑なブロッキング工程を不要
化することが可能となった。

【００１９】

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡ断片の固相担体表
面への固定方法の好ましい態様は、以下の通りである。 （１）ホウ素含有化合物または、該ホウ素含有化合物と
環状の結合を形成する二価の部分構造を有する基を固相
担体表面に固定する。 （２）ＤＮＡ断片として、（１）で用いなかった方の基
（ホウ素含有化合物または、該ホウ素含有化合物と環状
の結合を形成する二価の部分構造を有する基）を末端に
を有し、その塩基配列が既知であるものを用いる。 （３）（１）で作成した固相担体表面に、（２）で作成
したＤＮＡ断片を含有した水性液体を点着する。

【００２０】本発明は固相担体表面とＤＮＡ断片末端の
いずれか一方がホウ素含有化合物を有し、他方が該ホウ
素化合物と環状の結合を形成する二価の部分構造を有し
ていることを特徴とし、いずれも好ましく用いることが
できるが、ＤＮＡチップとしての感度およびコストの点
からはＤＮＡ断片末端にホウ素含有基を有している方が
有利である。

【００２１】本発明の固定方法において用いられるホウ
素含有化合物について述べる。本発明において用いられ
るホウ素含有化合物としてはホウ酸エステル類、ボロン
酸類、ボロン酸エステル類が好ましく用いられる。これ
らのホウ素含有化合物の中では担体やＤＮＡ断片と安定
な結合形成が可能な点でボロン酸、ボロン酸エステルが
より好ましい。ホウ酸エステルについては市販品を容易
に入手可能であり、また、これらの市販品からエステル
の交換反応によって任意のエステルを合成することがで
きる。ボロン酸およびボロン酸エステルの合成法につい
ては、例えば、伊藤卓、内本喜一朗、中村晃、干鯛眞信
著「＜化学総説１７＞前周期遷移金属の有機化学」山崎
博史編、学会出版センター刊（１９９３年）、辻二郎著
「遷移金属が拓く有機合成その多彩な反応形式と最新の
成果」（株）化学同人刊（１９９７年）、Ｌ．Ｂｒａｎ
ｄｓｍａ、Ｓ．Ｆ．Ｖａｓｉｌｅｖｓｋｙ、Ｈ．Ｄ．Ｖ
ｅｒｋｒｕｉｊｓｓｅ共著「アプリケーション・オブ・
トランジション・メタル・キャタリスツ・イン・オーガ
ニック・シンセシス（Application of Transition Meta
l Catalysts in Organic Synthesis）」Ｓｐｒｉｎｇｅ
ｒ刊（１９９８年）、Ｐａｕｌ Ａ．Ｇｒｉｅｃｏ編
「オーガニック・シンセシス・イン・ウォーター（Orga
nic Synthesis in Water）」ＢＬＡＣＫＩＥ・ＡＣＡＤ
ＥＭＩＣ＆ ＰＲＯＦＥＳＳＩＯＮＡＬ刊（１９９８
年）に記載の方法やこれらに記載の引用文献等を参考に
することができる。

【００２２】ホウ酸エステルの例としてはトリメトキシ
ボラン、トリエトキシボラン、トリオクチルボランなど
が挙げられる。ボロン酸、ボロン酸エステルの例として
はアルキルボロン酸およびそのエステル、アルケニルボ
ロン酸およびそのエステル、アリールボロン酸およびそ
のエステルが好ましく、固相担体やＤＮＡ断片との結合
が容易なボロン酸（エステル）試薬の例を挙げると、３
−アミノフェニルボロン酸、２−ホルミルフェニルボロ
ン酸、２−カルボキシフェニルボロン酸、４−（２−カ
ルボキシエチル）フェニルボロン酸、４−カルボキシフ
ェニルボロン酸、２−（カルボキシビニル）フェニルボ
ロン酸、３−（カルボキシビニル）フェニルボロン酸、
４−（カルボキシビニル）フェニルボロン酸、３−ホル
ミルフェニルボロン酸、３−ホルミルフラン−２−ボロ
ン酸、４−ホルミルフェニルボロン酸、３−ホルミルチ
オフェン−２−ボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロ
ン酸、４−ビニルフェニルボロン酸およびこれらのボロ
ン酸エステルが挙げられる。

【００２３】以上のホウ素含有化合物と環状の結合を形
成する２価の部分構造を有する化合物として、１，２−
あるいは１，３−ジオール、１，２−あるいは１，３−
アミノアルコール、１，２−あるいは１，３−ジアミ
ン、２−ヒドロキシカルボン酸、２−アミノカルボン
酸、３−ヒドロキシカルボン酸、３−アミノカルボン酸
が好ましい。以下に具体例として、好ましい部分構造を
基として示す。

【００２４】

【化１】

【００２５】ホウ酸エステル類、ボロン酸類、ボロン酸
エステル類およびホウ素含有化合物と環状の結合を形成
する２価の部分構造を有する化合物が固相担体表面に固
定された固相担体は、次のようにして作製することがで
きる。

【００２６】ガラス製の担体や担体表面をアルコール性
水酸基を有するポリマーで被覆したもののように、表面
に水酸基を有する担体の場合には、シランカップリング
剤を上記のホウ素化合物に連結し、さらに、それらを担
体表面に接触、反応させて作製することができる。例え
ば、カルボキシル基を有するボロン酸エステルとして、
４−（２−カルボキシエチル）フェニルボロン酸（Lanc
aster Synthesis社製）から１，３−プロパンジオール
と脱水反応を行い、６員環の環状エステルへと導き、ト
リエチルアミンと３−アミノプロピルトリメトシキシラ
ンの存在下でカルボジイミドなどの縮合剤を作用させ、
４−（２−（３−トリメトキシシリルプロピルカルバモ
イル）エチル）フェニルボロン酸−１，３−プロパンジ
オールエステルとした後、この溶液を担体上に接触、反
応させることによりボロン酸エステルが表面に固定され
た固相担体を得ることができる。

【００２７】表面にアミノ基を有する固相担体（例え
ば、ガラス製担体表面を３−アミノプロピルトリメトシ
キシランを作用させて作製したものや、アミノ基を有す
るポリマーによりガラス表面を被覆したもの）を用いる
場合には、ホウ酸エステル類、ボロン酸類、ボロン酸エ
ステル類としてカルボキシル基を有するものを用い、縮
合剤（カルボジイミド化合物など）を用いてアミド結合
を形成する方法が挙げられる。例えば、４−（２−カル
ボキシエチル）フェニルボロン酸（Lancaster Synthesi
s社製）およびカルボジイミドで代表される縮合剤を同
時に作用させることによりボロン酸が表面に固定された
固相担体を得ることができる。この他、ホウ酸エステル
類、ボロン酸類、ボロン酸エステル類としてアリールオ
キシカルボニルアミノ基を有するものを用い、担体表面
に接触させた後に、塩基の存在下または非存在下におい
て加熱し、尿素結合を形成する方法が好ましい。

【００２８】上記の方法以外にはアミノ基と反応する基
として、ホルミル基、スルホ基、イソシアナト基、イソ
チオシアナト基、酸無水物を有するものを用いる方法が
挙げられ、結合の際には、加熱や適当な塩基、縮合剤を
用いて固定する方法を用いることができる。

【００２９】担体表面にホウ素含有化合物と環状の結合
を形成する二価の部分構造を有する化合物が固定された
固相担体は、例えばガラス製の担体の場合にはポリビニ
ルアルコールやＮ−（トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル）アクリルアミドを構成単位として有するポリマーな
どのポリマーを水性溶液として表面に付与し、薄膜を形
成する方法、あるいはガラス表面をテトラメトキシシラ
ンなどにより処理して表面がシリルエーテル化された担
体とし、多価アルコールであるポリビニルアルコールや
グリセリン、Ｎ−（トリス（ヒドロキシメチル）メチ
ル）アクリルアミドを構成単位として有するポリマーな
どを塗布またはこれらの溶液に担体を浸漬することによ
って得ることができる。

【００３０】ホウ酸エステル類、ボロン酸類、ボロン酸
エステル類およびこれらホウ素含有化合物と環状の結合
を形成する２価の部分構造を末端に有するＤＮＡ断片は
次のようにして作製することができる。ホウ酸エステル
類、ボロン酸類、ボロン酸エステル類およびこれらホウ
素含有化合物と環状の結合を形成する２価の部分構造を
末端に有するＤＮＡ断片を得る方法は大別して次の二つ
の方法が挙げられる。

【００３１】一つは該官能基を有するプライマーを用い
てＰＣＲ法にて、該官能基を有するＤＮＡ断片を増幅す
る方法であり、他の一つはアミノ基などの反応性基を有
するプライマーを用いてＰＣＲ法にてＤＮＡ断片を増幅
したのち、共有結合によって目的とする官能基を有する
化合物を連結する方法である。通常は後者の方法が容易
であり、本発明においても好ましい。連結方法として
は、カルボキシル基を有する化合物とアミノ基を末端に
有するＤＮＡ断片を適当な縮合剤を用いてアミド結合に
より連結することができる。

【００３２】末端部にホウ酸エステル基、ボロン酸基、
ボロン酸エステル基を有するＤＮＡ断片は先に述べたよ
うに、二通りの方法で得ることができる。一つの方法は
末端にアミノ基が導入されたＤＮＡ断片を用いる方法で
あり、他の一つは、末端にアミノ基が導入されたＤＮＡ
断片の作成法については、公知であり、商業的に容易に
入手可能である。従って、ホウ素含有基を固相担体に固
定する方法と同様の方法が採用できる。すなわち、カル
ボキシル基、ホルミル基、ハロスルホニル基、イソシア
ナト基、イソチオシアナト基を有するカップリング成分
や酸無水物、ケテンを部分構造として有するカップリン
グ成分を、加熱や適当な塩基、縮合剤を用いてＤＮＡ断
片のアミノ基と結合させることができる。この中ではカ
ルボキシル基、イソシアナト基、イソチオシアナト基を
有するものが好ましく、カルボキシル基を有するものは
適当な縮合剤（カルボジイミド化合物など）を用いてア
ミド結合を形成する方法が好ましい。

【００３３】もう一つの方法はＤＮＡ断片を作製するＰ
ＣＲ反応時に使用するプライマーにホウ素含有基を結合
させておくやり方である。この方法も上記と同様に末端
にアミノ基を有するプライマーを同様の処理を行うこと
によってホウ素含有基を導入することが可能である。

【００３４】末端にホウ素含有化合物と環状の結合を形
成する二価の部分構造を有するＤＮＡ断片の作製法は基
本的にはホウ素含有基と同様である。１，２−あるいは
１，３−ジオール、１，２−あるいは１，３−アミノア
ルコール、１，２−あるいは１，３−ジアミン、２−ヒ
ドロキシカルボン酸、２−アミノカルボン酸、３−ヒド
ロキシカルボン酸、３−アミノカルボン酸を部分構造と
して有する化合物を末端にアミノ基を有するＤＮＡ断片
に結合する。また、末端にチオール基を有するＤＮＡ断
片も好ましく使用することができる。

【００３５】末端にアミノ基を有するＤＮＡ断片の場合
に、アミド結合によって環状の結合を形成する２価の部
分構造を導入可能な好ましい化合物の例として、Ｎ−
（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）グリシン、トリメチロール酢酸、
２，２−ジメチロールプロピオン酸、グルコン酸、グリ
セリン酸、セリン、ホモセリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ
エチル）アスパラギン酸、２−ケトグルタコン酸、パン
トテン酸、スレオニン酸、トリシン（Ｎ［トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル］グリシン）などが挙げられ、縮
合剤を用いる方法により結合することができる。

【００３６】末端にアミノ基を有するＤＮＡ断片の場合
に、末端アミノ基をアルキル化することによって環状の
結合を形成する２価の部分構造を導入可能な好ましい化
合物の例としては、エチレンオキシド、２−クロロエタ
ノール、２−ブロモエタノール、３−クロロプロパノー
ル、３−ブロモブロモプロパノール、３−ブロモ−１，
２−プロパンジオール、グリシドール、３−ブロモ−
２，２−ジメチルプロパノール、エポキシコハク酸が挙
げられ、この中ではグリシドール、エポキシコハク酸が
好ましい。

【００３７】末端にチオール基を有するＤＮＡ断片の場
合に、末端チオール基をアルキル化することによって環
状の結合を形成する二価の部分構造を導入可能な好まし
い化合物の例としては、３−クロロ−１，２−プロパン
ジオール、３−ブロモ−１，２−プロパンジオール、グ
リシドール、エポキシコハク酸が挙げられる。末端の官
能基をアルキル化する反応においては、通常、末端に官
能基を有するＤＮＡ断片とアルキル化試薬を混合し、加
熱を行うことにより反応することができる。塩基は通常
存在した方が反応は速やかに進行する。この塩基として
は後述の塩基を使用することができる。

【００３８】本発明においては、各工程において、酸や
塩基を適宜用いることができる。酸としては無機あるい
は有機の酸であり、塩酸、硫酸、リン酸、ｐ−トルエン
スルホン酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、トリフルオロメ
タンスルホン酸などから選択して用いられる。本発明に
おいても塩基を好ましく用いることができる。本発明で
用いることができる塩基は無機または有機の塩基でもよ
く、これらを組み合わせて用いることも好ましい。無機
塩基の例としては炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
セシウム、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、水酸化セシウム、水酸化カルシウム、水酸化
マグネシウムなどが挙げられる。有機塩基の例として
は、トリメチルアミン、トリエチルアミン、水酸化テト
ラメチルアンモニウム、ジメチルベンジルアミン、ジエ
チルアニリン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジ
ン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、
１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセ
ン、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カ
リウム−ｔ−ブトキシド、ｎ−ブチルリチウム、リチウ
ムジイソプロピルアミド、フッ化テトラブチルアンモニ
ウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどが挙げられ
る。酸と塩基を組み合わせることも好ましく用いられ
る。

【００３９】本発明の各工程で使用する反応において
は、溶媒として水の他に種々の有機溶媒を用いることが
できる。有機溶媒としてはトルエン、キシレン、ｎ−ヘ
キサンのような疎水的な溶媒を用いることもできるが、
水と混和する極性の高い溶媒が好ましい。その例として
は、酢酸エチル、酢酸メチル、メタノール、エタノー
ル、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブ
タノール、スルホラン、１，２−ジメトキシエタン、ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチル
アセタミド、アセトニトリル、プロピオニトリル、ジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、エチレングリコー
ル、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオー
ル、グリセリン、２−メトキシエタノール、ジエチレン
グリコール、ジエチレングリコールジメチルエーテル、
酢酸、ピリジン、ギ酸、プロピオン酸、酪酸などが挙げ
られる。

【００４０】本発明の固相担体とＤＮＡ断片の結合形成
反応においては、反応時、室温付近あるいは冷却して反
応することができるが、加熱することも好ましい。冷却
する場合は、その温度は５乃至１０℃の範囲にあること
が好ましく、加熱する場合には、その温度は４乃至１５
０℃の範囲にあることが好ましく、５０乃至１３０℃の
範囲にあることがより好ましく、５０乃至１００℃の範
囲であることが特に好ましい。また、反応の際には反応
溶媒の揮発、揮散を防ぐ目的、あるいは調湿やガス状の
試薬を供給するためにで周囲を隔壁で覆って行うことも
好ましい。圧力をかける必要がある反応についてはオー
トクレーブなどの耐圧力容器中で反応を行うこともでき
る。

【００４１】固相担体としては、疎水性、あるいは親水
性の低い担体であることが好ましい。また、その表面が
凹凸を有する平面性の低いものであっても好ましく用い
ることができる。固相担体の材質としては、ガラス、セ
メント、陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミ
ックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロー
ス、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレ
ン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー、シリコ
ン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔
質シリコン、多孔質活性炭、織物、編み物、不織布、濾
紙、短繊維、メンブレンフィルター等の多孔質物質、金
などの導電性材料などを拳げることができる。多孔質物
質の細孔の大きさは、２乃至１０００ｎｍの範囲にある
ことが好ましく、２乃至５００ｎｍの範囲にあることが
特に好ましい。固相担体の材質は、ガラスもしくはシリ
コンであることが特に好ましい。これは、表面処理の容
易さや電気化学的方法による解析の容易さによるもので
ある。固相担体の厚さは、１００乃至２０００μｍの範
囲にあることが好ましい。

【００４２】表面処理がされた固相担体表面上には、さ
らに、電荷を有する親水性高分子等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって表面処理がされた固相担体の凹凸を軽減するこ
とができる。固相担体の種類によっては、その担体中に
親水性高分子等を含有させることも可能であり、このよ
うな処理を施した固相担体も好ましく用いることができ
る。

【００４３】クロスリンカーは、単結合、アルキレン基
あるいはＮ−アルキルアミノアルキレン基であることが
好ましく、単結合、ヘキシレン基あるいはＮ−メチルア
ミノへキシレン基であることが特に好ましい。

【００４４】ＤＮＡ断片は、目的によって二通りに分け
ることができる。遺伝子の発現を調べるためには、ｃＤ
ＮＡ、ｃＤＮＡの一部、ＥＳＴ等のポリヌクレオチドを
使用することが好ましい。これらのポリヌクレオチド
は、その機能が未知であってもよいが、一般的にはデー
タベースに登録された配列を基にしてｃＤＮＡのライブ
ラリー、ゲノムのライブラリーあるいは全ゲノムをテン
プレートとしてＰＣＲ法によって増幅して調製する（以
下、「ＰＣＲ産物」という。）。ＰＣＲ法によって増幅
しないものも好ましく使用することができる。また、遺
伝子の変異や多型を調べるには、標準となる既知の配列
をもとにして、変異や多型に対応する種々のオリゴヌク
レオチドを合成し、これを使用することが好ましい。さ
らに、塩基配列分析の場合には、４ⁿ（ｎは、塩基の長
さ）種のオリゴヌクレオチドを合成したものを使用する
ことが好ましい。ＤＮＡ断片の塩基配列は、一般的な塩
基配列決定法によって予めその配列が決定されているこ
とが好ましい。ＤＮＡ断片は、２乃至５０量体であるこ
とが好ましく、１０乃至２５量体であることが特に好ま
しい。

【００４５】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片を水性媒
体に溶解あるいは分散した水性液を、９６穴もしくは３
８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した水性液
をスポッター装置等を用いて固相担体表面上に滴下して
行うことが好ましい。

【００４６】点着後のＤＮＡ断片の乾燥を防ぐために、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液中に、高
沸点の物質を添加してもよい。高沸点の物質としては、
ＤＮＡ断片が溶解あるいは分散してなる水性液に溶解し
得るものであって、試料核酸断片とのハイブリダイゼー
ションを妨げることがなく、かつ粘性の大きくない物質
であることが好ましい。このような物質としては、グリ
セリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドお
よび低分子の親水性ポリマーを挙げることができる。親
水性ポリマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリエチ
レングリコール、ポリアクリル酸ナトリウム等を挙げる
ことができる。ポリマーの分子量は１0₃乃至１０⁶の範
囲にあることが好ましい。高沸点の物質としては、グリ
セリンあるいはエチレングリコールを用いることがさら
に好ましく、グリセリンを用いることが特に好ましい。
高沸点の物質の濃度は、ＤＮＡ断片の水性液中、０．１
乃至２容量％の範囲にあることが好ましく、０．５乃至
１容量％の範囲にあることが特に好ましい。また、同じ
目的のために、ＤＮＡ断片を点着した後の固相担体を、
９０％以上の湿度および２５乃至５０℃の温度範囲の環
境に置くことも好ましい。

【００４７】ＤＮＡ断片を点着後、紫外線、水素化ホウ
素ナトリウムあるいはシッフ試薬による後処理を施して
もよい。これらの後処理は、複数の種類を組み合わせて
行ってもよく、加熱処理と紫外線処理を組み合わせて行
うことが特に好ましい。点着後は、インキュベーション
を行うことも好ましい。インキュベート後、未点着のＤ
ＮＡ断片を洗浄して除去することが好ましい。

【００４８】ＤＮＡ断片の固定量は、固相担体表面に対
して、１０₂乃至１０₅種類／ｃｍ₂の範囲にあることが
好ましい。ＤＮＡ断片の量は、１乃至１０₁₅モルの範囲
にあり、重量としては数ｎｇ以下であることが好まし
い。点着によって、ＤＮＡ断片の水性液は、固相担体表
面にドットの形状で固定される。ドットの形状は、ほと
んど円形である。形状に変動がないことは、遺伝子発現
の定量的解析や一塩基変異を解析するために重要であ
る。ドット間の距離は、０乃至１．５ｍｍの範囲にある
ことが好ましく、１００乃至３００μｍの範囲にあるこ
とが特に好ましい。１つのドットの大きさは、直径が５
０乃至３００μｍの範囲にあることが好ましい。点着す
る量は、１００ｐＬ乃至１μＬの範囲にあることが好ま
しく、１乃至１００ｎＬの範囲にあることが特に好まし
い。

【００４９】上記の工程によって作製されたＤＮＡチッ
プの寿命は、ｃＤＮＡが固定されてなるｃＤＮＡチップ
で数週間、オリゴＤＮＡが固定されてなるオリゴＤＮＡ
チップではさらに長期間である。これらのＤＮＡチップ
は、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異
解析、多型解析等に利用される。検出原理は、後述する
標識した試料核酸断片とのハイブリダイゼーションであ
る。

【００５０】標織方法としては、大別してＲＩ法と非Ｒ
Ｉ法（蛍光法、ビオチン法、電気化学的方法、化学発光
法等）とが知られているが、本発明のＤＮＡチップは、
蛍光法を用いる際に特に有利である。蛍光物質として
は、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用
いることができるが、たとえば、シアニン色素（例え
ば、ＣｙＤｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ロー
ダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ²−アセチルアミ
ノフルオレン（ＡＡＦ）あるいはＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨ
ウ素誘導体）を使用することができる。

【００５１】なお、上記の標識を利用する以外にも、導
電性基を持ち、形成されたハイブリッド構造体に取り込
まれる性質を持つインターカレータを用いる電気化学的
な検出方法を利用する方法も知られており、本発明のＤ
ＮＡチップは電気化学的な検出方法に利用することもで
きる。

【００５２】試料として用いる核酸断片としては、その
配列や機能が未知であるＤＮＡ断片試料あるいはＲＮＡ
断片試料を用いることが好ましい。試料核酸断片は、遺
伝子発現を調べる目的では、真核生物の細胞や組織サン
プルから単離することが好ましい。試料がゲノムなら
ば、赤血球を除く任意の組織サンプルから単離すること
が好ましい。赤血球を除く任意の組織は、末梢血液リン
パ球、皮膚、毛髪、精液等であることが好ましい。試料
がｍＲＮＡならば、ｍＲＮＡが発現される組織サンプル
から抽出することが好ましい。ｍＲＮＡは、逆転写反応
により標識ｄＮＴＰ（「ｄＮＴＰ」は、塩基がアデニン
（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）もしくはチミ
ン（Ｔ）であるデオキシリボヌクレオチドを意味す
る。）を取り込ませて標識ｃＤＮＡとすることが好まし
い。ｄＮＴＰとしては、化学的な安定性のため、ｄＣＴ
Ｐを用いることが好ましい。１回のハイブリダイゼーシ
ョンに必要なｍＲＮＡ量は、液量や標識方法によって異
なるが、数μｇ以下であることが好ましい。尚、ＤＮＡ
チップ上のＤＮＡ断片がオリゴＤＮＡである場合には、
試料核酸断片は低分子化しておくことが望ましい。原核
生物の細胞では、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難なた
め、全ＲＮＡを標識することが好ましい。試料核酸断片
は、遺伝子の変異や多型を調べる目的では、標識プライ
マーもしくは標識ｄＮＴＰを含む反応系で標的領域のＰ
ＣＲを行って得ることが好ましい。

【００５３】ハイブリダイゼーションは、９６穴もしく
は３８４穴プラスチックプレートに分注しておいた、標
識した試料核酸断片が溶解あるいは分散してなる水性液
を、上記で作製したＤＮＡチップ上に点着することによ
つて実施することが好ましい。点着の量は、１乃至１０
０ｎＬの範囲にあることが好ましい。ハイブリダイゼー
ションは、室温乃至７０℃の温度範囲で、そして６乃至
２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダ
イゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液
を用いて洗浄を行い、未反応の試料核酸断片を除去する
ことが好ましい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液と
しては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができ
るが、クエン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。

【００５４】ＤＮＡチップを用いるハイブリダイゼーシ
ョンの特徴は、標識した試料核酸断片の使用量が非常に
少ないことである。そのため、固相担体に固定するＤＮ
Ａ断片の鎖長や標識した試料核酸断片の種類により、ハ
イブリダイゼーションの最適条件を設定する必要があ
る。遺伝子発現の解析には、低発現の遺伝子も十分に検
出できるように、長時間のハイブリダイゼーションを行
うことが好ましい。一塩基変異の検出には、短時間のハ
イブリダイゼーションを行うことが好ましい。また、互
いに異なる蛍光物質によって標識した試料核酸断片を二
種類用意し、これらを同時にハイブリダイゼーションに
用いることにより、同一のＤＮＡチップ上で発現量の比
較や定量ができる特徴もある。

【００５５】

【実施例】［実施例１］ＤＮＡ断片固定スライドの作成
およびＤＮＡ断片の固定量の測定（１）ホウ素化合物と
環状の結合を形成する２価の部分構造が導入されたスラ
イド（Ｃ）の作成 ２質量％の１，２−ビス（トリエトキシシリル）エタン
（アルドリッチ社製）のエタノール溶液に、スライドガ
ラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を１０分間浸した後取り出
し、エタノールで洗浄後、１１０℃で１０分間乾燥し
て、シラン化合物被覆スライド（Ａ）を作成した。次い
で、このシラン化合物被覆スライド（Ａ）を、ポリビニ
ルアルコール（重合度約２０００、ケン化度８０％）
（東京化成工業（株）製）の４質量％（５０ｍＬ）溶液
に１時間浸した後取り出し、アセトニトリルで洗浄し、
１時間減圧下乾燥し、固相担体表面に多価水酸基の導入
されたスライド（Ｃ）を作成した。

【００５６】（２）ＤＮＡ断片の点着と蛍光強度の測定 ３'末端および５'未端がそれぞれアミノ基、蛍光標織試
薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５ｄＣＴＰ、アマシャ
ム・ファルマシア・バイオテック社製）で修飾されたＤ
ＮＡ断片（３'CTAGTCTGTGAAGTGTCTGATC５'）を４−（２
−カルボキシエチル）フェニルボロン酸（Lancaster Sy
nthesis社製）および１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（東京化成工業
（株）製）で処理し、３'末端にボロン酸が導入された
ＤＮＡ断片を作成した。このＤＮＡ断片を０．１Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ９．８）に分散してなる水性液（１×１０
^-6Ｍ、１μＬ）とし、上記（１）で得たスライド（Ｃ）
にこれを点着した。直ちに、それぞれの点着後のスライ
ドを６０℃、湿度９０％にて１時間放置した後、このス
ライドを０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム）と２×ＳＳＣ（２×ＳＳＣ：ＳＳＣの原液を２倍に
希釈した溶液、ＳＳＣ：標準食塩クエン酸緩衝液）との
混合溶液で２回、０．２×ＳＳＣ水溶液で１回順次洗浄
した。次いで、上記の洗浄後のスライドを０．１Ｍグリ
シン水溶液（ｐＨ１０）中に１時間３０分浸漬した後、
蒸留水で洗浄し、室温で乾燥させ、ＤＮＡ断片が固定さ
れたスライド（Ｄ１）を得た。このスライド（Ｄ１）表
面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定したとこ
ろ、それぞれ１６７０であった。本発明の固定化方法に
より、ＤＮＡ断片が効率よくスライドガラスに固定され
たことが分かる。

【００５７】［実施例２］試料ＤＮＡ断片の検出 （１）ＤＮＡチップの作成 ５'末端が蛍光標識試薬で修飾されていないＤＮＡ断片
を用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡ断片が固
定されたスライド（Ｄ２）を得た。 （２）試料ＤＮＡ断片の検出 ５'末端にＣｙ５が結合した２２ｍｅｒの試料オリゴヌ
クレオチド（GATCAGACACTTCACAGACTAG５'）をハイブリ
ダイゼーション用溶液（4×ＳＳＣおよび１０重量％の
ＳＤＳの混合溶液）（２０μＬ）に分散させたものを、
上記（１）で得たスライド（Ｄ２）に付与し、表面を顕
微鏡用カバーガラスで保護した後、モイスチャンバー内
にて６０℃で２０時間インキュベートした。次いで、こ
のものを０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶
液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。スライ
ドガラス表面の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定
したところ、６９０であった。本発明の固定化方法によ
って作成されたＤＮＡチップを用いることによって、Ｄ
ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
る試料ＤＮＡ断片を検出できることが分かる。

【００５８】

【発明の効果】本発明によって、固相担体表面にＤＮＡ
断片を安定かつ迅速に固定することができる。すなわ
ち、ＤＮＡ断片にホウ素化合物もしくはホウ素化合物と
反応して環状の結合を形成する二価の部分構造が導入
し、ホウ素化合物と反応して環状の結合を形成する二価
の部分構造もしくはホウ素化合物を固相担体表面に導入
することにより、固相担体表面に強固にＤＮＡ断片を固
定することができる。ＤＮＡ断片の安定な固定は、遺伝
子解析等に有効に利用することができる高い検出限界を
有するＤＮＡチップの作製に有効である。その一つの例
として、本発明によって作製されたＤＮＡチップを用い
て、試料核酸断片とのハイブリダイゼーションを行うこ
とにより、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片に
相補性を有する試料核酸断片を感度よく検出することが
できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 31/22 １２１ Ｇ０１Ｎ 33/566 ＺＮＡ 33/566 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 篠木 浩 埼玉県朝霞市泉水３−11−46 富士写真フ イルム株式会社内 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BD12 BD20 CB03 DA08 FA11 FB05 FC07 4B024 AA20 BA80 HA14 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 FA15 4B063 QA01 QA13 QA17 QA18 QQ42 QQ52 QR32 QR55 QS03 QS34 QX01 QX07

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面にホウ素含有化合物もしくはホウ素
   化合物と反応して環状の結合を形成する二価の部分構造
   が導入された固相担体と、一方の末端部に該ホウ素化合
   物と反応して環状の結合を形成する二価の部分構造もし
   くはホウ素化合物が導入されたＤＮＡ断片とを、液相に
   て接触させることにより、ホウ素含有化合物と二価の部
   分構造との間での反応によって結合を形成させることを
   特徴とするＤＮＡ断片の固相担体表面への固定方法。
2. 【請求項２】 ホウ素含有化合物がボロン酸であること
   を特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片の固相担体表
   面への固定方法。
3. 【請求項３】 ホウ素化合物と環状の結合を形成する二
   価の部分構造が、ジオール、ジアミンまたはアミノアル
   コールであることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ
   断片の固相担体表面への固定方法。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３のうちのいずれかの項に
   記載の方法によって得られたＤＮＡチップ。
5. 【請求項５】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光物質もしくは放射性物質で標識した核酸断片試
   料を含む水性液を付与する工程、ＤＮＡチップに固定さ
   れているＤＮＡ断片と相補性を有する核酸断片試料をハ
   イブリダイゼーションによってＤＮＡチップ上に固定す
   る工程、そしてＤＮＡチップ上に固定された標識核酸断
   片試料の蛍光標識もしくは放射性標識を検出する工程か
   らなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対して相補性を
   有する核酸断片の検出方法。
6. 【請求項６】 請求項４に記載のＤＮＡチップの表面
   に、蛍光発生基もしくは導電性基を有するインターカレ
   ータと核酸断片試料とを含む水性液を付与する工程、Ｄ
   ＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片と相補性を有す
   る核酸断片試料をハイブリダイゼーションによってＤＮ
   Ａチップ上に固定する工程、そしてＤＮＡチップのＤＮ
   Ａ断片と核酸断片試料とから形成されたハイブリッド構
   造内に取り込まれたインターカレータの蛍光発生基から
   発生する蛍光もしくは導電性基を介して流れる電流を検
   出する工程からなる、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片に対
   して相補性を有する核酸断片の検出方法。