JP2001161377A - 核酸検出のための万能プローブおよび方法 - Google Patents
核酸検出のための万能プローブおよび方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】核酸標的配列を検出するための材料と方法の提
供。 【解決手段】シグナルプライマーが、蛍光消光機序によ
る核酸標的配列の検出に利用されている。シグナルプラ
イマーは、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌ
クレオチドを含み、部分的に一本鎖であり、又、部分的
に二本鎖である。標的が存在すると、シグナルプライマ
ーの第二のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオ
チドから置換され、リポータープローブにおいてコンフ
ォメーションの変化が起こり、それによってリポーター
プローブに結合されたドナー/消光剤色素対間距離に変
化が生じる。色素間距離の変化により蛍光消光の増加ま
たは減少が起こり、これは標的配列の存在の指標として
検出される。
供。 【解決手段】シグナルプライマーが、蛍光消光機序によ
る核酸標的配列の検出に利用されている。シグナルプラ
イマーは、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌ
クレオチドを含み、部分的に一本鎖であり、又、部分的
に二本鎖である。標的が存在すると、シグナルプライマ
ーの第二のオリゴヌクレオチドは第一のオリゴヌクレオ
チドから置換され、リポータープローブにおいてコンフ
ォメーションの変化が起こり、それによってリポーター
プローブに結合されたドナー/消光剤色素対間距離に変
化が生じる。色素間距離の変化により蛍光消光の増加ま
たは減少が起こり、これは標的配列の存在の指標として
検出される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸標的配列を検
出するための材料と方法に関する。
出するための材料と方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】標識オリゴヌクレオチドプローブの配列
特異性ハイブリッド形成は、選択されたヌクレオチド配
列の検出および同定の一手段として長い間利用されてき
た。蛍光標識によるこの様なプローブの標識方法は、プ
ローブのハイブリッド形成の検出を助ける比較的鋭敏な
非放射性手段を提供してきた。最近開発された検出方法
は、プローブのハイブリッド形成の検出に蛍光強度を直
接検出するのではなく、蛍光エネルギー移動(fluoresce
nce energy transfer; FET)の方法を利用している。蛍
光エネルギー移動は、ドナー蛍光体と消光剤色素(蛍光
体でも、蛍光体でなくてもよい。)の間で発生し、一方
(消光剤)の吸収スペクトルがもう一方(ドナー)の発光ス
ペクトルとオーバーラップし、この2つの色素が近接し
たときに発生する。これらの特性を有する色素は、ドナ
ー/消光剤色素対またはエネルギー移動色素対と呼ばれ
る。ドナー蛍光体の励起状態エネルギーは、共鳴双極子
により引き起こされる双極子相互作用により、近くの消
光剤に移動される。その結果、ドナー蛍光体の消光が起
こる。場合によっては、消光剤も蛍光体の場合、その蛍
光強度が増強されることもある。エネルギー移動効率
は、ドナーと消光剤の距離に高度に依存しており、これ
らの関係を予測する式がForster(1948. Ann. Phys.2,
55-75)により開発されている。エネルギー移動効率が50
％であるドナーと消光剤色素の距離はForster距離(Ro)
と呼ばれる。蛍光消光の機序として他に、例えば、電荷
移動消光および衝突消光等がある。
特異性ハイブリッド形成は、選択されたヌクレオチド配
列の検出および同定の一手段として長い間利用されてき
た。蛍光標識によるこの様なプローブの標識方法は、プ
ローブのハイブリッド形成の検出を助ける比較的鋭敏な
非放射性手段を提供してきた。最近開発された検出方法
は、プローブのハイブリッド形成の検出に蛍光強度を直
接検出するのではなく、蛍光エネルギー移動(fluoresce
nce energy transfer; FET)の方法を利用している。蛍
光エネルギー移動は、ドナー蛍光体と消光剤色素(蛍光
体でも、蛍光体でなくてもよい。)の間で発生し、一方
(消光剤)の吸収スペクトルがもう一方(ドナー)の発光ス
ペクトルとオーバーラップし、この2つの色素が近接し
たときに発生する。これらの特性を有する色素は、ドナ
ー/消光剤色素対またはエネルギー移動色素対と呼ばれ
る。ドナー蛍光体の励起状態エネルギーは、共鳴双極子
により引き起こされる双極子相互作用により、近くの消
光剤に移動される。その結果、ドナー蛍光体の消光が起
こる。場合によっては、消光剤も蛍光体の場合、その蛍
光強度が増強されることもある。エネルギー移動効率
は、ドナーと消光剤の距離に高度に依存しており、これ
らの関係を予測する式がForster(1948. Ann. Phys.2,
55-75)により開発されている。エネルギー移動効率が50
％であるドナーと消光剤色素の距離はForster距離(Ro)
と呼ばれる。蛍光消光の機序として他に、例えば、電荷
移動消光および衝突消光等がある。
【０００３】近接する2つの色素の相互作用により消光
を引き起こすことに基づくエネルギー移動とその他の機
序は、均一方式で実施できるため、ヌクレオチド配列を
検出または同定する魅力的な手段である。均一分析方式
は、1つの蛍光体標識の蛍光の検出に基づく従来のプロ
ーブハイブリッド形成分析法よりも簡単である。なぜな
らば、一般に、不均一分析はハイブリッド形成していな
い遊離標識からハイブリッド形成した標識を分離する更
なるステップを必要とするからである。典型的には、FE
Tおよび関連方法は、2つの相補的オリゴヌクレオチドが
ハイブリッド形成により結合された時に、一方または両
方の色素標識の蛍光特性の変化を監視することに基づく
ものである。この方式において、蛍光特性の変化は、エ
ネルギー移動量の変化として、あるいは蛍光消光量の変
化として測定され、典型的には、一方の色素の蛍光強度
の増加として示される。この方法においては、ハイブリ
ッド形成しないオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成
したオリゴヌクレオチドを分離せずに、目的のヌクレオ
チド配列を検出することが可能である。一方はドナー蛍
光体で、もう一方は消光剤で標識された2つの別々の相
補的オリゴヌクレオチドの間でハイブリッド形成を生じ
ることができる。一本鎖オリゴヌクレオチドと比べ、二
本鎖型ではドナー蛍光の減少(消光の増加）および/また
はエネルギー移動の増加が起こる。FETハイブリッド形
成分析法に関する幾つかの方式が、Nonisotopic DNA Pr
obe Techniques(1992. Academic Press, Inc., pags. 3
11-352)に概説されている。あるいは、オリゴヌクレオ
チドがハイブリッド形成していない場合と、相補的配列
とハイブリッド形成した場合とで、一方または両方の蛍
光特性に検出可能な差が生じるように、ドナーと消光剤
を1つのオリゴヌクレオチドに結合させることができ
る。この方式においては、典型的には、オリゴヌクレオ
チドがハイブリッド形成するとドナー蛍光は増加し、エ
ネルギー移動/消光は減少する。例えば、両端に標識さ
れた自己相補的オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形
成すると、これによって2つの蛍光体(即ち、5'末端と
3’末端)が近接し、エネルギー移動と消光が起こる。自
己相補的オリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチ
ドの中の相補的配列がハイブリッド形成すると、ヘアピ
ン構造は破壊され、2つの色素間距離が拡大するため消
光は減少する。ヘアピン構造の欠点は、安定性が非常に
高く、非消光ハイブリッド形成型への変換がしばしば遅
く、僅かにそちらに偏るだけで、一般的に性能は低い。
TyagiおよびKramer(1996.Nature Biotech.14, 303-308)
は、ステムを形成するヘアピン構造の自己相補的アーム
の間のループ中に検出配列を含む上記の様に標識された
ヘアピン構造を報告している。塩基対合したステムは、
検出配列が標的とハイブリッド形成し、消光の減少を引
き起こすためには融解しなくてはならない。「二重ヘア
ピン」プローブとそれを利用する方法が、B. Bagwell,
et al. (1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425;米国
特許No.5,607,834)に報告されている。これらの構造は
ヘアピン構造内に標的結合配列を含んでおり、従って、
標的とヘアピン構造の自己相補的配列との間に競合的ハ
イブリッド形成が関与している。Bagwellは、ミスマッ
チによりヘアピン構造を不安定化させることにより、不
利なハイブリッド形成速度論の問題を解決している。
を引き起こすことに基づくエネルギー移動とその他の機
序は、均一方式で実施できるため、ヌクレオチド配列を
検出または同定する魅力的な手段である。均一分析方式
は、1つの蛍光体標識の蛍光の検出に基づく従来のプロ
ーブハイブリッド形成分析法よりも簡単である。なぜな
らば、一般に、不均一分析はハイブリッド形成していな
い遊離標識からハイブリッド形成した標識を分離する更
なるステップを必要とするからである。典型的には、FE
Tおよび関連方法は、2つの相補的オリゴヌクレオチドが
ハイブリッド形成により結合された時に、一方または両
方の色素標識の蛍光特性の変化を監視することに基づく
ものである。この方式において、蛍光特性の変化は、エ
ネルギー移動量の変化として、あるいは蛍光消光量の変
化として測定され、典型的には、一方の色素の蛍光強度
の増加として示される。この方法においては、ハイブリ
ッド形成しないオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成
したオリゴヌクレオチドを分離せずに、目的のヌクレオ
チド配列を検出することが可能である。一方はドナー蛍
光体で、もう一方は消光剤で標識された2つの別々の相
補的オリゴヌクレオチドの間でハイブリッド形成を生じ
ることができる。一本鎖オリゴヌクレオチドと比べ、二
本鎖型ではドナー蛍光の減少(消光の増加）および/また
はエネルギー移動の増加が起こる。FETハイブリッド形
成分析法に関する幾つかの方式が、Nonisotopic DNA Pr
obe Techniques(1992. Academic Press, Inc., pags. 3
11-352)に概説されている。あるいは、オリゴヌクレオ
チドがハイブリッド形成していない場合と、相補的配列
とハイブリッド形成した場合とで、一方または両方の蛍
光特性に検出可能な差が生じるように、ドナーと消光剤
を1つのオリゴヌクレオチドに結合させることができ
る。この方式においては、典型的には、オリゴヌクレオ
チドがハイブリッド形成するとドナー蛍光は増加し、エ
ネルギー移動/消光は減少する。例えば、両端に標識さ
れた自己相補的オリゴヌクレオチドがヘアピン構造を形
成すると、これによって2つの蛍光体(即ち、5'末端と
3’末端)が近接し、エネルギー移動と消光が起こる。自
己相補的オリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチ
ドの中の相補的配列がハイブリッド形成すると、ヘアピ
ン構造は破壊され、2つの色素間距離が拡大するため消
光は減少する。ヘアピン構造の欠点は、安定性が非常に
高く、非消光ハイブリッド形成型への変換がしばしば遅
く、僅かにそちらに偏るだけで、一般的に性能は低い。
TyagiおよびKramer(1996.Nature Biotech.14, 303-308)
は、ステムを形成するヘアピン構造の自己相補的アーム
の間のループ中に検出配列を含む上記の様に標識された
ヘアピン構造を報告している。塩基対合したステムは、
検出配列が標的とハイブリッド形成し、消光の減少を引
き起こすためには融解しなくてはならない。「二重ヘア
ピン」プローブとそれを利用する方法が、B. Bagwell,
et al. (1994. Nucl. Acids Res. 22, 2424-2425;米国
特許No.5,607,834)に報告されている。これらの構造は
ヘアピン構造内に標的結合配列を含んでおり、従って、
標的とヘアピン構造の自己相補的配列との間に競合的ハ
イブリッド形成が関与している。Bagwellは、ミスマッ
チによりヘアピン構造を不安定化させることにより、不
利なハイブリッド形成速度論の問題を解決している。
【０００４】核酸増幅を検出するためにエネルギー移動
またはその他の蛍光消光の機序を利用する均一方法も報
告されている。L. G. Lee, et al. (1993. Nuc. Acids
Res.21, 3761-3766)は、PCR中に標的増幅に特異的に二
重標識検出プローブが切断されるリアルタイム検出方法
を開示している。検出プローブが増幅プライマーの下流
でハイブリッド形成されると、Taqポリメラーゼの5'-
3’エキソヌクレアーゼ活性が検出プローブを消化し、
エネルギー移動対を形成する2つの蛍光色素を分離す
る。
またはその他の蛍光消光の機序を利用する均一方法も報
告されている。L. G. Lee, et al. (1993. Nuc. Acids
Res.21, 3761-3766)は、PCR中に標的増幅に特異的に二
重標識検出プローブが切断されるリアルタイム検出方法
を開示している。検出プローブが増幅プライマーの下流
でハイブリッド形成されると、Taqポリメラーゼの5'-
3’エキソヌクレアーゼ活性が検出プローブを消化し、
エネルギー移動対を形成する2つの蛍光色素を分離す
る。
【０００５】増幅プライマーのハイブリッド形成部位下
流の標的配列とハイブリッド形成するシグナルプライマ
ー(しばしば検出プローブとも呼ばれる。) が、核酸増
幅の均一検出法に関して報告されている(米国特許No.5,
5547,861、引用する事により本明細書の一部を成す事と
する)。シグナルプライマーは、増幅プライマーの伸長
と同様の方法で、ポリメラーゼにより伸長される。増幅
プライマーの伸長により、標的の増幅に従属して、シグ
ナルプライマーの伸長生成物が置換され、標的増幅の指
標として検出可能な二本鎖二次増幅生成物が生成され
る。一本鎖シグナルプライマーと共に利用するための均
一検出方法の例が、米国特許No.5,550,025（親油性色素
と制限部位を含む)と米国特許No.5,593,867(蛍光偏光検
出法)に記載されている。より最近では、FET法を用いる
核酸と標的の検出用にシグナルプライマーが改変されて
いる。米国特許No.5,691,145に、一本鎖シグナルプライ
マーの標的結合配列の5'末端にドナー/消光剤色素対を
付着させたGカルテット構造が開示されている。標的増
幅時に相補的鎖が合成されると、Gカルテット構造が展
開され、ドナーと消光剤色素間の距離が広がり、ドナー
蛍光に検出可能な増加が生じる。ドナー/消光剤色素対
で標識された一部が一本鎖、一部が二本鎖のシグナルプ
ライマーも最近報告されている。例えば、EP 0 878 554
には、一本鎖制限エンドヌクレアーゼ認識部位を挟む
ドナー/消光剤色素対を有するシグナルプライマーが開
示されている。標的が存在すると、制限部位は二本鎖と
なり、制限エンドヌクレアーゼにより切断可能となる。
切断により色素対は分離され、ドナー消光が減少する。
EP 0 881 302に、分子間塩基対合構造を付けたシグナル
プライマーが報告されている。分子間塩基対合構造に結
合されたドナー/消光剤色素対のドナー色素は、その構
造が折り畳まれている時は消光しているが、標的が存在
すると、分子間塩基対合構造と相補的配列が合成され
る。これによって、分子間塩基対合構造は展開され、ド
ナーと消光剤色素は分離され、ドナー消光の減少を引き
起こす。Nazarenko, et al.(米国特許No.5,866,336)に
より、類似の方法が報告されており、この場合、増幅プ
ライマーがドナー/消光剤色素対を有するヘアピン構造
により形成されている。
流の標的配列とハイブリッド形成するシグナルプライマ
ー(しばしば検出プローブとも呼ばれる。) が、核酸増
幅の均一検出法に関して報告されている(米国特許No.5,
5547,861、引用する事により本明細書の一部を成す事と
する)。シグナルプライマーは、増幅プライマーの伸長
と同様の方法で、ポリメラーゼにより伸長される。増幅
プライマーの伸長により、標的の増幅に従属して、シグ
ナルプライマーの伸長生成物が置換され、標的増幅の指
標として検出可能な二本鎖二次増幅生成物が生成され
る。一本鎖シグナルプライマーと共に利用するための均
一検出方法の例が、米国特許No.5,550,025（親油性色素
と制限部位を含む)と米国特許No.5,593,867(蛍光偏光検
出法)に記載されている。より最近では、FET法を用いる
核酸と標的の検出用にシグナルプライマーが改変されて
いる。米国特許No.5,691,145に、一本鎖シグナルプライ
マーの標的結合配列の5'末端にドナー/消光剤色素対を
付着させたGカルテット構造が開示されている。標的増
幅時に相補的鎖が合成されると、Gカルテット構造が展
開され、ドナーと消光剤色素間の距離が広がり、ドナー
蛍光に検出可能な増加が生じる。ドナー/消光剤色素対
で標識された一部が一本鎖、一部が二本鎖のシグナルプ
ライマーも最近報告されている。例えば、EP 0 878 554
には、一本鎖制限エンドヌクレアーゼ認識部位を挟む
ドナー/消光剤色素対を有するシグナルプライマーが開
示されている。標的が存在すると、制限部位は二本鎖と
なり、制限エンドヌクレアーゼにより切断可能となる。
切断により色素対は分離され、ドナー消光が減少する。
EP 0 881 302に、分子間塩基対合構造を付けたシグナル
プライマーが報告されている。分子間塩基対合構造に結
合されたドナー/消光剤色素対のドナー色素は、その構
造が折り畳まれている時は消光しているが、標的が存在
すると、分子間塩基対合構造と相補的配列が合成され
る。これによって、分子間塩基対合構造は展開され、ド
ナーと消光剤色素は分離され、ドナー消光の減少を引き
起こす。Nazarenko, et al.(米国特許No.5,866,336)に
より、類似の方法が報告されており、この場合、増幅プ
ライマーがドナー/消光剤色素対を有するヘアピン構造
により形成されている。
【０００６】エネルギー移動およびその他の蛍光消光検
出方法は、特異的プローブのハイブリッド形成による標
的配列の検出にも応用されている。日本特許No.9301543
9 Bに、エネルギー移動対を形成する2つの標識を付けた
一本鎖ポリヌクレオチドプローブと一本鎖標的をハイブ
リッド形成させる事により、ポリヌクレオチドを測定す
る方法が開示されている。二本鎖ハイブリッドは、制限
酵素により標識間で切断され、標識の一方の蛍光が測定
される。この方法の欠点は、プローブ中の制限部位が、
検出される標的配列の中にも存在しなくてはならない点
である。S. S. Gosh, et al.(1994. Nucl. Acids Res.
22, 3155-3159)が、蛍光共鳴エネルギー移動を用いて分
析される、制限酵素により触媒される蛍光体標識オリゴ
ヌクレオチドの切断を報告している。これらの分析にお
いて、相補的オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成さ
れると、二本鎖制限部位を生じ、2つの鎖にそれぞれ蛍
光体標識が1つずつ付いている。
出方法は、特異的プローブのハイブリッド形成による標
的配列の検出にも応用されている。日本特許No.9301543
9 Bに、エネルギー移動対を形成する2つの標識を付けた
一本鎖ポリヌクレオチドプローブと一本鎖標的をハイブ
リッド形成させる事により、ポリヌクレオチドを測定す
る方法が開示されている。二本鎖ハイブリッドは、制限
酵素により標識間で切断され、標識の一方の蛍光が測定
される。この方法の欠点は、プローブ中の制限部位が、
検出される標的配列の中にも存在しなくてはならない点
である。S. S. Gosh, et al.(1994. Nucl. Acids Res.
22, 3155-3159)が、蛍光共鳴エネルギー移動を用いて分
析される、制限酵素により触媒される蛍光体標識オリゴ
ヌクレオチドの切断を報告している。これらの分析にお
いて、相補的オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成さ
れると、二本鎖制限部位を生じ、2つの鎖にそれぞれ蛍
光体標識が1つずつ付いている。
【０００７】（発明の概要）本発明は、核酸標的配列を
検出するためにシグナルプライマーを利用している。シ
グナルプライマーは、2つのオリゴヌクレオチドから成
り、一部一本鎖、一部二本鎖である。第一のオリゴヌク
レオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドと呼ばれ
る。アダプターオリゴヌクレオチドは、アダプターオリ
ゴヌクレオチドの3’末端が標的配列とハイブリッド形
成する一本鎖尾部領域を形成する様に、相補的な第二の
オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成している。標的
配列とハイブリッド形成する一本鎖3’尾部の部分は、
標的結合配列と呼ばれる。標的結合配列と3’一本鎖尾
部の5'方向のアダプターオリゴヌクレオチドの領域は、
シグナルプライマーが標的とハイブリッド形成するため
の選択された反応条件下で第二のオリゴヌクレオチドと
ハイブリッド形成し、分子間塩基対合した、一部二本鎖
のシグナルプライマー分子を形成する。第二のオリゴヌ
クレオチドがハイブリッド形成するアダプターオリゴヌ
クレオチドの配列(5'アダプター配列)は、標的とハイブ
リッド形成しない配列から成る。5'アダプター配列は、
異なる標的結合配列を持つ多様なアダプターオリゴヌク
レオチドにおいて同一となるように選択できる(すなわ
ち「万能」(universal)5'アダプター配列)。これによっ
て、下記の様に、種々の標的の検出が簡易化される。
検出するためにシグナルプライマーを利用している。シ
グナルプライマーは、2つのオリゴヌクレオチドから成
り、一部一本鎖、一部二本鎖である。第一のオリゴヌク
レオチドは、アダプターオリゴヌクレオチドと呼ばれ
る。アダプターオリゴヌクレオチドは、アダプターオリ
ゴヌクレオチドの3’末端が標的配列とハイブリッド形
成する一本鎖尾部領域を形成する様に、相補的な第二の
オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成している。標的
配列とハイブリッド形成する一本鎖3’尾部の部分は、
標的結合配列と呼ばれる。標的結合配列と3’一本鎖尾
部の5'方向のアダプターオリゴヌクレオチドの領域は、
シグナルプライマーが標的とハイブリッド形成するため
の選択された反応条件下で第二のオリゴヌクレオチドと
ハイブリッド形成し、分子間塩基対合した、一部二本鎖
のシグナルプライマー分子を形成する。第二のオリゴヌ
クレオチドがハイブリッド形成するアダプターオリゴヌ
クレオチドの配列(5'アダプター配列)は、標的とハイブ
リッド形成しない配列から成る。5'アダプター配列は、
異なる標的結合配列を持つ多様なアダプターオリゴヌク
レオチドにおいて同一となるように選択できる(すなわ
ち「万能」(universal)5'アダプター配列)。これによっ
て、下記の様に、種々の標的の検出が簡易化される。
【０００８】従って、本発明のシグナルプライマーの利
点は、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成す
るための共通の5'アダプター配列をアダプターオリゴヌ
クレオチドの中に異なる標的結合配列を種々の標的結合
配列に結合することができるため、種々の標的配列の検
出に単一の標識リポータープローブ(下記)が利用できる
点である。これによって、リポータープローブの合成が
簡易化され、それにかかる費用が削減される。アダプタ
ーオリゴヌクレオチドは、異なる標的を認識する標的結
合配列を持たなくてはならないが、本発明において利用
するためにラベリングする必要がないため、リポーター
プローブよりも合成が簡単で、費用がかからない。
点は、第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成す
るための共通の5'アダプター配列をアダプターオリゴヌ
クレオチドの中に異なる標的結合配列を種々の標的結合
配列に結合することができるため、種々の標的配列の検
出に単一の標識リポータープローブ(下記)が利用できる
点である。これによって、リポータープローブの合成が
簡易化され、それにかかる費用が削減される。アダプタ
ーオリゴヌクレオチドは、異なる標的を認識する標的結
合配列を持たなくてはならないが、本発明において利用
するためにラベリングする必要がないため、リポーター
プローブよりも合成が簡単で、費用がかからない。
【０００９】本明細書に使用されている幾つかの用語を
以下の様に定義する。増幅プライマーは、プライマー伸
長による標的配列の増幅のためのプライマーである。SD
Aの場合、増幅プライマーの3’末端(標的結合配列)は、
標的配列の3’末端でハイブリッド形成する。増幅プラ
イマーは、その5'末端付近に制限エンドヌクレアーゼの
認識部位を含む。米国特許No.5,455,166;米国特許No.5,
270,184およびEP 0 674 315に記載されているように、
認識部位は、認識部位が半修飾(「ニッキング」)された
時、DNA二重らせんの鎖の1本を切断する制限エンドヌク
レアーゼのためのものである。半修飾された認識部位
は、1本の鎖に少なくとも1個の誘導されたヌクレオチド
が含まれており、その誘導されたヌクレオチドが、制限
エンドヌクレアーゼに認識部位の両方の鎖の切断ではな
く、2本の鎖の内1本のニッキングを引き起こす、制限エ
ンドヌクレアーゼの二本鎖認識部位である。増幅プライ
マーは、3’-OH基も含み、これは、増幅プライマーの標
的結合配列が標的配列とハイブリッド形成すると、DNA
ポリメラーゼにより伸長可能である。大多数のSDA反応
に関して、増幅プライマーは標的配列の指数的増幅に関
与している。
以下の様に定義する。増幅プライマーは、プライマー伸
長による標的配列の増幅のためのプライマーである。SD
Aの場合、増幅プライマーの3’末端(標的結合配列)は、
標的配列の3’末端でハイブリッド形成する。増幅プラ
イマーは、その5'末端付近に制限エンドヌクレアーゼの
認識部位を含む。米国特許No.5,455,166;米国特許No.5,
270,184およびEP 0 674 315に記載されているように、
認識部位は、認識部位が半修飾(「ニッキング」)された
時、DNA二重らせんの鎖の1本を切断する制限エンドヌク
レアーゼのためのものである。半修飾された認識部位
は、1本の鎖に少なくとも1個の誘導されたヌクレオチド
が含まれており、その誘導されたヌクレオチドが、制限
エンドヌクレアーゼに認識部位の両方の鎖の切断ではな
く、2本の鎖の内1本のニッキングを引き起こす、制限エ
ンドヌクレアーゼの二本鎖認識部位である。増幅プライ
マーは、3’-OH基も含み、これは、増幅プライマーの標
的結合配列が標的配列とハイブリッド形成すると、DNA
ポリメラーゼにより伸長可能である。大多数のSDA反応
に関して、増幅プライマーは標的配列の指数的増幅に関
与している。
【００１０】増幅反応を誘導するために、特別な配列ま
たは構造は必要ないので、PCRの増幅プライマーは標的
結合配列のみから成る。これと対照的に、3SRとNASBAの
増幅プライマーは、5'末端付近にRNAポリメラーゼプロ
モーターを含む。プロモーターは、標的配列に付けら
れ、標的の複数のRNAコピーの転写を命令することによ
り、増幅反応を引き起こす働きをする。
たは構造は必要ないので、PCRの増幅プライマーは標的
結合配列のみから成る。これと対照的に、3SRとNASBAの
増幅プライマーは、5'末端付近にRNAポリメラーゼプロ
モーターを含む。プロモーターは、標的配列に付けら
れ、標的の複数のRNAコピーの転写を命令することによ
り、増幅反応を引き起こす働きをする。
【００１１】伸長生成物は、プライマーまたはプライマ
ーの一部およびプライマー結合部位下流の標的配列と相
補的な新しく合成された鎖を含む核酸である。伸長生成
物は、標的配列とプライマーのハイブリッド形成と、標
的配列を鋳型として用いるポリメラーゼによるプライマ
ーの伸長の結果生じる。
ーの一部およびプライマー結合部位下流の標的配列と相
補的な新しく合成された鎖を含む核酸である。伸長生成
物は、標的配列とプライマーのハイブリッド形成と、標
的配列を鋳型として用いるポリメラーゼによるプライマ
ーの伸長の結果生じる。
【００１２】標的または標的配列という言葉は、増幅ま
たは検出される核酸配列を意味する。これらには、増幅
される元の核酸配列、その相補的第二の鎖および複製ま
たは増幅により生成される元の配列のコピーの両鎖が含
まれる。標的配列は、ハイブリッド形成されるプライマ
ーの伸長の鋳型とも呼ばれる。
たは検出される核酸配列を意味する。これらには、増幅
される元の核酸配列、その相補的第二の鎖および複製ま
たは増幅により生成される元の配列のコピーの両鎖が含
まれる。標的配列は、ハイブリッド形成されるプライマ
ーの伸長の鋳型とも呼ばれる。
【００１３】本発明のシグナルプライマーは、2つのオ
リゴヌクレオチドを含む。シグナルプライマーにおい
て、第一のオリゴヌクレオチド(アダプターオリゴヌク
レオチド)の標的配列とハイブリッド形成する一本鎖3’
「尾部」を形成する様に、オリゴヌクレオチドがハイブ
リッド形成している。第二のオリゴヌクレオチドは、標
的結合配列に隣接する5'方向にある第一のオリゴヌクレ
オチドにおいて5'アダプター配列と塩基対合(すなわち
ハイブリッド形成)している。本明細書に使用されてい
る様に、「標的結合配列に隣接する5'方向」という言葉
は、標的結合配列の全てまたは一部が3’尾部に一本鎖
のままで残っており、標的とハイブリッド形成するため
に利用可能であることを意味する。すなわち、シグナル
プライマーにおいて、標的結合配列の一部が隣接する二
本鎖部分の分子間塩基対合に関与していても、標的結合
配列全体が一本鎖3’尾部を形成していてもよい。シグ
ナルプライマーの二本鎖部分の残りは、標的と相補的で
はない。シグナルプライマーの分子間塩基対合部分のミ
スマッチによって、標的配列が存在する時の蛍光の変化
量が減じる可能性があるが、分析の鋭敏度が問題でなけ
れば、許容可能な程度である。一本鎖尾部の標的結合配
列におけるミスマッチも許容可能であり、単一のヌクレ
オチド多型性の検出に利用できるが、やはり特定の環境
において分析の鋭敏度および/または特異性を減じる。
しかし、ハイブリッド形成に関与する配列を完全にマッ
チさせれば、反応速度論に大きな悪影響を及ぼさずに、
分析の特異性が改善される。
リゴヌクレオチドを含む。シグナルプライマーにおい
て、第一のオリゴヌクレオチド(アダプターオリゴヌク
レオチド)の標的配列とハイブリッド形成する一本鎖3’
「尾部」を形成する様に、オリゴヌクレオチドがハイブ
リッド形成している。第二のオリゴヌクレオチドは、標
的結合配列に隣接する5'方向にある第一のオリゴヌクレ
オチドにおいて5'アダプター配列と塩基対合(すなわち
ハイブリッド形成)している。本明細書に使用されてい
る様に、「標的結合配列に隣接する5'方向」という言葉
は、標的結合配列の全てまたは一部が3’尾部に一本鎖
のままで残っており、標的とハイブリッド形成するため
に利用可能であることを意味する。すなわち、シグナル
プライマーにおいて、標的結合配列の一部が隣接する二
本鎖部分の分子間塩基対合に関与していても、標的結合
配列全体が一本鎖3’尾部を形成していてもよい。シグ
ナルプライマーの二本鎖部分の残りは、標的と相補的で
はない。シグナルプライマーの分子間塩基対合部分のミ
スマッチによって、標的配列が存在する時の蛍光の変化
量が減じる可能性があるが、分析の鋭敏度が問題でなけ
れば、許容可能な程度である。一本鎖尾部の標的結合配
列におけるミスマッチも許容可能であり、単一のヌクレ
オチド多型性の検出に利用できるが、やはり特定の環境
において分析の鋭敏度および/または特異性を減じる。
しかし、ハイブリッド形成に関与する配列を完全にマッ
チさせれば、反応速度論に大きな悪影響を及ぼさずに、
分析の特異性が改善される。
【００１４】第一の実施例において、本発明のシグナル
プライマーの第二のオリゴヌクレオチドはリポータープ
ローブである。リポータープローブは、少なくとも1つ
のドナー/消光剤色素対、すなわち蛍光ドナー色素とそ
のドナー蛍光体に対する消光剤を含む。リポータープロ
ーブの配列は、アダプターオリゴヌクレオチドの5'アダ
プター配列とハイブリッド形成していない時には、リポ
ータープローブが自然に、ドナーと消光剤色素を近接さ
せ、ドナー蛍光の消光を引き起こす様なコンフォメーシ
ョンを取るように選択される。リポータープローブは規
則正しい二次構造(例えば、Gカルテット、ヘアピンまた
は三重らせん)、ランダムコイルまたはドナーおよび消
光剤色素を蛍光消光を引き起こす位十分近接させるその
他の全てのコンフォメーションに折り畳まれる。しか
し、リポータープローブがアダプターオリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成すると、リポータープローブは直
鎖状にされるかまたは展開され、ドナー/消光剤色素対
は消光が消滅または減じるように空間的に分離される。
標的が存在すると、リポータープローブはアダプターオ
リゴヌクレオチドから分離され、消光されるコンフォメ
ーションを取る。アダプターオリゴヌクレオチドとハイ
ブリッド形成したリポータープローブとアダプターオリ
ゴヌクレオチドとハイブリッド形成していないリポータ
ープローブの蛍光消光の程度の差を、シグナルプライマ
ーがその標的結合配列を介して結合する標的の存在の有
無の指標として利用できる。要約すると、リポータープ
ローブがアダプターオリゴヌクレオチドとハイブリッド
形成するとリポータープローブの色素は十分に分離され
るので、ドナーは検出可能な蛍光を生じ、アダプターオ
リゴヌクレオチド中の相補的配列からリポータープロー
ブが分離されると、置換されたリポータープローブが折
り畳まれ、ドナーと消光剤が近接するため、蛍光消光が
増加する。
プライマーの第二のオリゴヌクレオチドはリポータープ
ローブである。リポータープローブは、少なくとも1つ
のドナー/消光剤色素対、すなわち蛍光ドナー色素とそ
のドナー蛍光体に対する消光剤を含む。リポータープロ
ーブの配列は、アダプターオリゴヌクレオチドの5'アダ
プター配列とハイブリッド形成していない時には、リポ
ータープローブが自然に、ドナーと消光剤色素を近接さ
せ、ドナー蛍光の消光を引き起こす様なコンフォメーシ
ョンを取るように選択される。リポータープローブは規
則正しい二次構造(例えば、Gカルテット、ヘアピンまた
は三重らせん)、ランダムコイルまたはドナーおよび消
光剤色素を蛍光消光を引き起こす位十分近接させるその
他の全てのコンフォメーションに折り畳まれる。しか
し、リポータープローブがアダプターオリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成すると、リポータープローブは直
鎖状にされるかまたは展開され、ドナー/消光剤色素対
は消光が消滅または減じるように空間的に分離される。
標的が存在すると、リポータープローブはアダプターオ
リゴヌクレオチドから分離され、消光されるコンフォメ
ーションを取る。アダプターオリゴヌクレオチドとハイ
ブリッド形成したリポータープローブとアダプターオリ
ゴヌクレオチドとハイブリッド形成していないリポータ
ープローブの蛍光消光の程度の差を、シグナルプライマ
ーがその標的結合配列を介して結合する標的の存在の有
無の指標として利用できる。要約すると、リポータープ
ローブがアダプターオリゴヌクレオチドとハイブリッド
形成するとリポータープローブの色素は十分に分離され
るので、ドナーは検出可能な蛍光を生じ、アダプターオ
リゴヌクレオチド中の相補的配列からリポータープロー
ブが分離されると、置換されたリポータープローブが折
り畳まれ、ドナーと消光剤が近接するため、蛍光消光が
増加する。
【００１５】あるいは、本発明のリポータープローブ
は、アダプターオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成
していなくてもよい。第二の実施例において、本発明の
シグナルプライマーは、未標識の第二のオリゴヌクレオ
チドとハイブリッド形成したアダプターオリゴヌクレオ
チドから成る。ハイブリッド形成していないリポーター
プローブも折り畳まれ、消光したコンフォメーションで
存在している。未標識の第二のオリゴヌクレオチドとリ
ポータープローブは十分に相補的なので、選択された反
応条件でハイブリッド形成する。未標識の第二のオリゴ
ヌクレオチドの分離によるシグナルプライマーの二重鎖
が標的依存的に崩壊されると、この時点で一本鎖となっ
た未標識の第二のオリゴヌクレオチドはリポータープロ
ーブ中の相補的配列とハイブリッド形成することができ
る。置換された未標識の第二のオリゴヌクレオチドとハ
イブリッド形成する前には、リポータープローブは規則
正しい二次構造、ランダムコイルまたはその他のコンフ
ォメーションに折り畳まれているため、ドナーおよび消
光剤色素は近接しており、ドナーの消光は増加する。未
標識の第二のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に
より、リポータープローブは直鎖状にされるかまたは展
開され、2つの色素間距離は開き、蛍光消光は減少す
る。消光の減少により、標的配列の存在の指標として検
出されるドナーまたは消光剤の蛍光パラメータに検出可
能な変化が生じる。色素対の両方が、置換される未標識
の第二のヌクレオチドとのハイブリッド形成に関与する
リポータープローブ中の配列に結合されていても、ある
いは色素対の一方が、未標識の第二のオリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成しないリポータープローブの一部
に、例えば、未標識の第二のオリゴヌクレオチドと相補
的でないリポータープローブの一本鎖尾部または内部の
配列に結合されていてもよい。
は、アダプターオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成
していなくてもよい。第二の実施例において、本発明の
シグナルプライマーは、未標識の第二のオリゴヌクレオ
チドとハイブリッド形成したアダプターオリゴヌクレオ
チドから成る。ハイブリッド形成していないリポーター
プローブも折り畳まれ、消光したコンフォメーションで
存在している。未標識の第二のオリゴヌクレオチドとリ
ポータープローブは十分に相補的なので、選択された反
応条件でハイブリッド形成する。未標識の第二のオリゴ
ヌクレオチドの分離によるシグナルプライマーの二重鎖
が標的依存的に崩壊されると、この時点で一本鎖となっ
た未標識の第二のオリゴヌクレオチドはリポータープロ
ーブ中の相補的配列とハイブリッド形成することができ
る。置換された未標識の第二のオリゴヌクレオチドとハ
イブリッド形成する前には、リポータープローブは規則
正しい二次構造、ランダムコイルまたはその他のコンフ
ォメーションに折り畳まれているため、ドナーおよび消
光剤色素は近接しており、ドナーの消光は増加する。未
標識の第二のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成に
より、リポータープローブは直鎖状にされるかまたは展
開され、2つの色素間距離は開き、蛍光消光は減少す
る。消光の減少により、標的配列の存在の指標として検
出されるドナーまたは消光剤の蛍光パラメータに検出可
能な変化が生じる。色素対の両方が、置換される未標識
の第二のヌクレオチドとのハイブリッド形成に関与する
リポータープローブ中の配列に結合されていても、ある
いは色素対の一方が、未標識の第二のオリゴヌクレオチ
ドとハイブリッド形成しないリポータープローブの一部
に、例えば、未標識の第二のオリゴヌクレオチドと相補
的でないリポータープローブの一本鎖尾部または内部の
配列に結合されていてもよい。
【００１６】ドナー蛍光体およびその対応する消光剤
は、アダプターオリゴヌクレオチドまたは未標識プロー
ブとのハイブリッド形成を阻害しない(下記に説明され
ている)、リポータープローブがアダプターオリゴヌク
レオチドまたは未標識プローブとハイブリッド形成した
時に検出可能なドナー蛍光を生じる、また折り畳まれた
状態とハイブリッド形成した状態でリポータープローブ
に変化が生じた時、蛍光パラメータに変化を生じる全て
の相対位置でリポータープローブに結合することができ
る。リポータープローブがシグナルプライマーのアダプ
ターオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成している本
発明の実施例においては、塩基対合オリゴヌクレオチド
の分離による二重鎖の標的依存性の崩壊により、リポー
タープローブは規則正しい二次構造、ランダムコイルま
たはその他のコンフォメーションに折り畳まれ、これに
よってドナー色素と消光剤色素は近接し、ドナーの消光
が増加する。消光の増加によりドナーまたは消光剤のい
ずれかの蛍光パラメータに検出可能な変化が生じ、これ
は標的配列の存在の指標として検出される。色素対の両
方を、シグナルプライマーの二本鎖部分の分子間水素結
合の形成に関与する配列に結合させることができる。あ
るいは、色素対の片方を、アダプターとハイブリッド形
成しないリポータープローブの一部に、例えば、標的と
もアダプターオリゴヌクレオチドとも相補的でないリポ
ータープローブの一本鎖3’尾部において結合すること
もできる。
は、アダプターオリゴヌクレオチドまたは未標識プロー
ブとのハイブリッド形成を阻害しない(下記に説明され
ている)、リポータープローブがアダプターオリゴヌク
レオチドまたは未標識プローブとハイブリッド形成した
時に検出可能なドナー蛍光を生じる、また折り畳まれた
状態とハイブリッド形成した状態でリポータープローブ
に変化が生じた時、蛍光パラメータに変化を生じる全て
の相対位置でリポータープローブに結合することができ
る。リポータープローブがシグナルプライマーのアダプ
ターオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成している本
発明の実施例においては、塩基対合オリゴヌクレオチド
の分離による二重鎖の標的依存性の崩壊により、リポー
タープローブは規則正しい二次構造、ランダムコイルま
たはその他のコンフォメーションに折り畳まれ、これに
よってドナー色素と消光剤色素は近接し、ドナーの消光
が増加する。消光の増加によりドナーまたは消光剤のい
ずれかの蛍光パラメータに検出可能な変化が生じ、これ
は標的配列の存在の指標として検出される。色素対の両
方を、シグナルプライマーの二本鎖部分の分子間水素結
合の形成に関与する配列に結合させることができる。あ
るいは、色素対の片方を、アダプターとハイブリッド形
成しないリポータープローブの一部に、例えば、標的と
もアダプターオリゴヌクレオチドとも相補的でないリポ
ータープローブの一本鎖3’尾部において結合すること
もできる。
【００１７】一般に、アダプターと未標識オリゴヌクレ
オチドまたはリポータープローブの間、あるいは未標識
の第二のオリゴヌクレオチドとリポータープローブの間
の分子間塩基対合に関与する配列の全長は重要ではな
い。適切な長さは、選択された反応条件において、一部
二本鎖の分子を維持するための安定した塩基対合に必要
なヌクレオチドの数によって決定される。好都合には、
塩基対合に関与する配列は、典型的には、8から75ヌク
レオチド長である。最大長は、オリゴヌクレオチドの合
成および回収の容易さあるいは効率等の実際的問題によ
ってのみ限定される。
オチドまたはリポータープローブの間、あるいは未標識
の第二のオリゴヌクレオチドとリポータープローブの間
の分子間塩基対合に関与する配列の全長は重要ではな
い。適切な長さは、選択された反応条件において、一部
二本鎖の分子を維持するための安定した塩基対合に必要
なヌクレオチドの数によって決定される。好都合には、
塩基対合に関与する配列は、典型的には、8から75ヌク
レオチド長である。最大長は、オリゴヌクレオチドの合
成および回収の容易さあるいは効率等の実際的問題によ
ってのみ限定される。
【００１８】シグナルプライマーの二本鎖領域の配列
は、少なくともその一部が標的と相補的でない様に、ま
たそれを崩壊する反応の温度で比較的安定である様に選
択される。しかし、標的とのハイブリッド形成が許容で
きない程遅い位安定であっても、あるいは相補的鎖合成
のために、ポリメラーゼがアダプターオリゴヌクレオチ
ドから第二のオリゴヌクレオチドを置換できない程安定
であってもならない。好ましくは、第一のオリゴヌクレ
オチドと第二のオリゴヌクレオチドの間の配列に関与す
るシグナルプライマーの二本鎖部分のTmは、置換反応が
起こる温度以上であるが、それより低くてもよい。この
セグメントのTmが反応温度より低い場合には、標的の存
在と無関係に検出用核酸分子の半分以上が完全に一本鎖
となる。これにより分析の鋭敏度は低下するが、比較的
大量の標的が存在する場合には許容可能である。典型的
には、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレ
オチドのハイブリッド形成に関与するシグナルプライマ
ーの二本鎖部分のTmは、第二のオリゴヌクレオチドを置
換する反応温度と等しいか、それよりも約30℃まで高
い。最も好ましくは、Tmは第二のオリゴヌクレオチドを
置換する反応よりも約10〜20℃高い。
は、少なくともその一部が標的と相補的でない様に、ま
たそれを崩壊する反応の温度で比較的安定である様に選
択される。しかし、標的とのハイブリッド形成が許容で
きない程遅い位安定であっても、あるいは相補的鎖合成
のために、ポリメラーゼがアダプターオリゴヌクレオチ
ドから第二のオリゴヌクレオチドを置換できない程安定
であってもならない。好ましくは、第一のオリゴヌクレ
オチドと第二のオリゴヌクレオチドの間の配列に関与す
るシグナルプライマーの二本鎖部分のTmは、置換反応が
起こる温度以上であるが、それより低くてもよい。この
セグメントのTmが反応温度より低い場合には、標的の存
在と無関係に検出用核酸分子の半分以上が完全に一本鎖
となる。これにより分析の鋭敏度は低下するが、比較的
大量の標的が存在する場合には許容可能である。典型的
には、第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレ
オチドのハイブリッド形成に関与するシグナルプライマ
ーの二本鎖部分のTmは、第二のオリゴヌクレオチドを置
換する反応温度と等しいか、それよりも約30℃まで高
い。最も好ましくは、Tmは第二のオリゴヌクレオチドを
置換する反応よりも約10〜20℃高い。
【００１９】第二のオリゴヌクレオチド(リポータープ
ローブまたは未標識の第二のオリゴヌクレオチド)は、
アダプターオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する
ときに、アダプターオリゴヌクレオチドの一部が3’
「尾部」として一本鎖の状態で残る様に選択される。シ
グナルプライマーの一本鎖尾部部分は、検出される標的
配列と相補的で、シグナルプライマーと標的配列とハイ
ブリッド形成させる役目を果たす。尾部の配列は、好ま
しくは、選択された反応条件で標的と安定した二重らせ
んを形成し、本発明の技術において公知の所望の検出特
異度を提供するように選択される。標的とのハイブリッ
ド形成を有利にするには、第一のオリゴヌクレオチドの
一本鎖標的結合尾部領域の配列も好ましくは、標的結合
配列/標的二重らせんのTmが反応温度と等しいか、それ
以上となる様に選択される。標的結合領域の配列は、検
出される配列によって決定されるが、検出用核酸の標的
結合配列のTmは、例えば、その長さを調節することによ
り調節することが可能である。
ローブまたは未標識の第二のオリゴヌクレオチド)は、
アダプターオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する
ときに、アダプターオリゴヌクレオチドの一部が3’
「尾部」として一本鎖の状態で残る様に選択される。シ
グナルプライマーの一本鎖尾部部分は、検出される標的
配列と相補的で、シグナルプライマーと標的配列とハイ
ブリッド形成させる役目を果たす。尾部の配列は、好ま
しくは、選択された反応条件で標的と安定した二重らせ
んを形成し、本発明の技術において公知の所望の検出特
異度を提供するように選択される。標的とのハイブリッ
ド形成を有利にするには、第一のオリゴヌクレオチドの
一本鎖標的結合尾部領域の配列も好ましくは、標的結合
配列/標的二重らせんのTmが反応温度と等しいか、それ
以上となる様に選択される。標的結合領域の配列は、検
出される配列によって決定されるが、検出用核酸の標的
結合配列のTmは、例えば、その長さを調節することによ
り調節することが可能である。
【００２０】米国特許5,547,861号に記載されているよ
うに、本発明のシグナルプライマーは、蛍光パラメータ
の変化を伴う二次増幅生成物を産生する増幅反応におい
て、シグナルプライマーとして利用できる。アダプター
オリゴヌクレオチドの3’末端から成るシグナルプライ
マーの一本鎖尾部は、プライマー伸長が可能である。本
発明の第一の実施例の核酸増幅反応におけるシグナルプ
ライマーの利用が、図1により詳細に示されており、以
下の様に要約できる。この第一の実施例において、第二
のオリゴヌクレオチドは、リポータープローブがアダプ
ターオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成している時
は、ドナー/消光剤色素対が空間的に分離されており、
ドナー蛍光が検出可能であるように結合されているドナ
ー/消光剤色素対を含むリポータープローブである。ア
ダプターオリゴヌクレオチドの一本鎖尾部を介して、シ
グナルプライマーは増幅プライマー下流の標的配列の一
本の鎖とハイブリッド形成する。増幅プライマーとシグ
ナルプライマーのアダプターオリゴヌクレオチドは共
に、標的配列を鋳型として用いてDNAポリメラーゼによ
り伸長される。シグナルプライマーの第一の伸長生成物
は、まだリポータープローブとハイブリッド形成したま
まで、上流の増幅プライマーの伸長により鋳型から置換
される。シグナルプライマーは、標的から第一のシグナ
ルプライマー伸長生成物が置換された後も、まだ一部二
本鎖のままである。伸長され、置換されたシグナルプラ
イマーは次に第二の増幅プライマーのハイブリッド形成
と伸長のための鋳型となり、最初にシグナルプライマー
伸長生成物の一本鎖部分を二本鎖とする。アダプターオ
リゴヌクレオチドと相補的な新しい鎖の重合により、ポ
リメラーゼの鎖置換活性に従属して、アダプターオリゴ
ヌクレオチドからリポータープローブが置換される。リ
ポータープローブは、規則正しい二次構造、ランダムコ
イルまたはドナーおよび消光剤色素を近接させるその他
のコンフォメーションに自然に折り畳まれる配列を含む
ため、アダプターオリゴヌクレオチドから分離されると
この様な折り畳みが発生する。これによって、蛍光消光
が増加し、蛍光消光度の変化に伴う適切な蛍光パラメー
タの変化が、標的配列の増幅の指標として検出できる。
うに、本発明のシグナルプライマーは、蛍光パラメータ
の変化を伴う二次増幅生成物を産生する増幅反応におい
て、シグナルプライマーとして利用できる。アダプター
オリゴヌクレオチドの3’末端から成るシグナルプライ
マーの一本鎖尾部は、プライマー伸長が可能である。本
発明の第一の実施例の核酸増幅反応におけるシグナルプ
ライマーの利用が、図1により詳細に示されており、以
下の様に要約できる。この第一の実施例において、第二
のオリゴヌクレオチドは、リポータープローブがアダプ
ターオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成している時
は、ドナー/消光剤色素対が空間的に分離されており、
ドナー蛍光が検出可能であるように結合されているドナ
ー/消光剤色素対を含むリポータープローブである。ア
ダプターオリゴヌクレオチドの一本鎖尾部を介して、シ
グナルプライマーは増幅プライマー下流の標的配列の一
本の鎖とハイブリッド形成する。増幅プライマーとシグ
ナルプライマーのアダプターオリゴヌクレオチドは共
に、標的配列を鋳型として用いてDNAポリメラーゼによ
り伸長される。シグナルプライマーの第一の伸長生成物
は、まだリポータープローブとハイブリッド形成したま
まで、上流の増幅プライマーの伸長により鋳型から置換
される。シグナルプライマーは、標的から第一のシグナ
ルプライマー伸長生成物が置換された後も、まだ一部二
本鎖のままである。伸長され、置換されたシグナルプラ
イマーは次に第二の増幅プライマーのハイブリッド形成
と伸長のための鋳型となり、最初にシグナルプライマー
伸長生成物の一本鎖部分を二本鎖とする。アダプターオ
リゴヌクレオチドと相補的な新しい鎖の重合により、ポ
リメラーゼの鎖置換活性に従属して、アダプターオリゴ
ヌクレオチドからリポータープローブが置換される。リ
ポータープローブは、規則正しい二次構造、ランダムコ
イルまたはドナーおよび消光剤色素を近接させるその他
のコンフォメーションに自然に折り畳まれる配列を含む
ため、アダプターオリゴヌクレオチドから分離されると
この様な折り畳みが発生する。これによって、蛍光消光
が増加し、蛍光消光度の変化に伴う適切な蛍光パラメー
タの変化が、標的配列の増幅の指標として検出できる。
【００２１】二本鎖標的配列の第二の相補的鎖とハイブ
リッド形成する第二のシグナルプライマーをこの反応に
任意で含めることが可能である。第二のシグナルプライ
マーは、第二の増幅プライマー下流の標的配列の第二の
鎖とハイブリッド形成し、伸長され、第二の増幅プライ
マーの伸長により置換される。第二のシグナルプライマ
ー伸長生成物の一本鎖部分は、第一の増幅プライマーの
ハイブリッド形成と伸長により二本鎖にされ、リポータ
ープローブが置換される。
リッド形成する第二のシグナルプライマーをこの反応に
任意で含めることが可能である。第二のシグナルプライ
マーは、第二の増幅プライマー下流の標的配列の第二の
鎖とハイブリッド形成し、伸長され、第二の増幅プライ
マーの伸長により置換される。第二のシグナルプライマ
ー伸長生成物の一本鎖部分は、第一の増幅プライマーの
ハイブリッド形成と伸長により二本鎖にされ、リポータ
ープローブが置換される。
【００２２】上記に説明され、図1に示される反応図
は、第二のオリゴヌクレオチドが標識されていない場合
も同様である。しかし、未標識の第二のオリゴヌクレオ
チドのアダプターオリゴヌクレオチドからの標的依存性
の分離は直接検出することはできない。図2に示すよう
に、未標識の第二のオリゴヌクレオチドのアダプターオ
リゴヌクレオチドからの分離は、折り畳まれ、消光した
コンフォメーションで存在しているリポータープローブ
とのハイブリッド形成により検出される。未標識プロー
ブと相補的リポータープローブとのハイブリッド形成に
より、リポータープローブは展開または直線化され、ド
ナーおよび消光色素間距離は拡大し、蛍光消光は減少す
る。第二のオリゴヌクレオチドとリポータープローブの
ハイブリッド形成は、標的の存在を示す指標であり、蛍
光消光度の変化を伴う蛍光パラメータの変化として検出
される。
は、第二のオリゴヌクレオチドが標識されていない場合
も同様である。しかし、未標識の第二のオリゴヌクレオ
チドのアダプターオリゴヌクレオチドからの標的依存性
の分離は直接検出することはできない。図2に示すよう
に、未標識の第二のオリゴヌクレオチドのアダプターオ
リゴヌクレオチドからの分離は、折り畳まれ、消光した
コンフォメーションで存在しているリポータープローブ
とのハイブリッド形成により検出される。未標識プロー
ブと相補的リポータープローブとのハイブリッド形成に
より、リポータープローブは展開または直線化され、ド
ナーおよび消光色素間距離は拡大し、蛍光消光は減少す
る。第二のオリゴヌクレオチドとリポータープローブの
ハイブリッド形成は、標的の存在を示す指標であり、蛍
光消光度の変化を伴う蛍光パラメータの変化として検出
される。
【００２３】どちらの実施例においても、所望により標
的の1本の鎖あたり複数のシグナルプライマーを利用で
き、それぞれが同じ鎖の他の配列の下流の標的配列とハ
イブリッド形成し、全てのシグナルプライマーは、増幅
プライマーの下流でハイブリッド形成される。この方法
において、各シグナルプライマーは、上流の検出用核酸
の伸長により置換され、最も5'末端のシグナルプライマ
ーは増幅プライマーにより置換される。複数のシグナル
プライマーを利用する事により、標的あたりのシグナル
プライマーの発生が増加または増幅し、分析の鋭敏度が
増加する利点がある。
的の1本の鎖あたり複数のシグナルプライマーを利用で
き、それぞれが同じ鎖の他の配列の下流の標的配列とハ
イブリッド形成し、全てのシグナルプライマーは、増幅
プライマーの下流でハイブリッド形成される。この方法
において、各シグナルプライマーは、上流の検出用核酸
の伸長により置換され、最も5'末端のシグナルプライマ
ーは増幅プライマーにより置換される。複数のシグナル
プライマーを利用する事により、標的あたりのシグナル
プライマーの発生が増加または増幅し、分析の鋭敏度が
増加する利点がある。
【００２４】本発明の複数のシグナルプライマーは、複
数の異なる標的配列の同時検出にも利用できる。この場
合、アダプターオリゴヌクレオチドの5'アダプター配列
は、好ましくは、検出されるそれぞれの標的に関して異
なる。各標的特異性アダプターオリゴヌクレオチドの5'
アダプター配列特異性リポータープローブを識別可能な
ドナー/消光剤色素対で標識する事により、各標的の存
在を、各標的に対するリポータープローブにおける蛍光
消光度の変化を検出することにより決定する事ができ
る。
数の異なる標的配列の同時検出にも利用できる。この場
合、アダプターオリゴヌクレオチドの5'アダプター配列
は、好ましくは、検出されるそれぞれの標的に関して異
なる。各標的特異性アダプターオリゴヌクレオチドの5'
アダプター配列特異性リポータープローブを識別可能な
ドナー/消光剤色素対で標識する事により、各標的の存
在を、各標的に対するリポータープローブにおける蛍光
消光度の変化を検出することにより決定する事ができ
る。
【００２５】図1および2に示す様に、シグナルプライマ
ーの一本鎖部分は、増幅プライマーのハイブリッド形成
および伸長により二本鎖型に変換される。また、ポリメ
ラーゼによる鎖置換により、ポリメラーゼがその相補的
鎖を合成するのに伴い、アダプターオリゴヌクレオチド
からリポータープローブまたは未標識の第二のオリゴヌ
クレオチドが置換される。ポリメラーゼの鎖置換活性が
アダプターオリゴヌクレオチドからリポータープローブ
を分離するにつれ、リポータープローブは折り畳まれ、
ドナーおよび消光剤色素間距離は小さくなり、これによ
ってドナー蛍光の消光は増加する。即ち、この様に生成
された一本鎖の置換されたリポータープローブは、自己
ハイブリッド形成することも、あるいは分子内相互作用
により色素間距離を縮小させることも可能である。一本
鎖の置換されたオリゴヌクレオチド未標識の第二のオリ
ゴヌクレオチドである場合、溶液または固相に付着され
た折り畳まれ消光した状態のリポータープローブとハイ
ブリッド形成できる様になる。置換された未標識の第二
のオリゴヌクレオチドとリポータープローブのハイブリ
ッド形成により、リポータープローブの少なくとも一部
は展開され、それによってドナーおよび消光剤間距離は
開き、ドナー蛍光の消光は減少する。いずれの実施例に
おいても、ドナーまたは消光剤色素のいずれかの蛍光の
変化を、標的配列の増幅の指標として、監視または検出
することができる。リポータープローブの置換の場合、
ドナー蛍光度の減少または消光剤蛍光度の増加が、標的
増幅が発生している、あるいは発生した事を示す指標と
して検出および/または監視できる。未標識の第二のオ
リゴヌクレオチドの置換に関しては、ドナー蛍光度の増
加または消光剤蛍光度の減少が、標的増幅が発生してい
る、あるいは発生したことを示す指標として検出および
/または監視できる。ドナー蛍光体とその消光剤の近接
により影響を受けるその他の蛍光パラメータ(例えば、
蛍光寿命またはドナーおよび/またはアクセプターの蛍
光強度比の変化)も、いずれの実施例においても監視す
ることが可能である。
ーの一本鎖部分は、増幅プライマーのハイブリッド形成
および伸長により二本鎖型に変換される。また、ポリメ
ラーゼによる鎖置換により、ポリメラーゼがその相補的
鎖を合成するのに伴い、アダプターオリゴヌクレオチド
からリポータープローブまたは未標識の第二のオリゴヌ
クレオチドが置換される。ポリメラーゼの鎖置換活性が
アダプターオリゴヌクレオチドからリポータープローブ
を分離するにつれ、リポータープローブは折り畳まれ、
ドナーおよび消光剤色素間距離は小さくなり、これによ
ってドナー蛍光の消光は増加する。即ち、この様に生成
された一本鎖の置換されたリポータープローブは、自己
ハイブリッド形成することも、あるいは分子内相互作用
により色素間距離を縮小させることも可能である。一本
鎖の置換されたオリゴヌクレオチド未標識の第二のオリ
ゴヌクレオチドである場合、溶液または固相に付着され
た折り畳まれ消光した状態のリポータープローブとハイ
ブリッド形成できる様になる。置換された未標識の第二
のオリゴヌクレオチドとリポータープローブのハイブリ
ッド形成により、リポータープローブの少なくとも一部
は展開され、それによってドナーおよび消光剤間距離は
開き、ドナー蛍光の消光は減少する。いずれの実施例に
おいても、ドナーまたは消光剤色素のいずれかの蛍光の
変化を、標的配列の増幅の指標として、監視または検出
することができる。リポータープローブの置換の場合、
ドナー蛍光度の減少または消光剤蛍光度の増加が、標的
増幅が発生している、あるいは発生した事を示す指標と
して検出および/または監視できる。未標識の第二のオ
リゴヌクレオチドの置換に関しては、ドナー蛍光度の増
加または消光剤蛍光度の減少が、標的増幅が発生してい
る、あるいは発生したことを示す指標として検出および
/または監視できる。ドナー蛍光体とその消光剤の近接
により影響を受けるその他の蛍光パラメータ(例えば、
蛍光寿命またはドナーおよび/またはアクセプターの蛍
光強度比の変化)も、いずれの実施例においても監視す
ることが可能である。
【００２６】SDAの他に、本発明のシグナルプライマー
を、その他のプライマー伸長増幅方法(例えば、PCR、3S
R、TMAまたはNASBA)においてシグナルプライマーとして
利用するために改変できることは明らかである。例え
ば、本方法を、PCR増幅プライマーと5'→3’エキソヌク
レアーゼ活性を欠失した鎖置換DNAポリメラーゼ(例え
ば、Promega 社のSequencing Grade Taq またはNew Eng
land BioLabs社のEso-VentまたはExoDeepVent)をPCRに
おいて利用することにより、PCRにおいて利用するため
に改変することができる。これらのシグナルプライマー
は、伸長され、標的から置換され、本質的にSDAで説明
した様に、リポータープローブまたは未標識の第二のオ
リゴヌクレオチドの置換により二本鎖にされる。SDA系
の場合と同様に、リポータープローブまたは未標識の第
二のオリゴヌクレオチドが置換されることにより、ドナ
ー/アクセプター色素対の近接度と蛍光消光度に変化が
引き起こされる。蛍光度の様な蛍光パラメータに伴う変
化は、標的増幅の指標の役割を果たす。
を、その他のプライマー伸長増幅方法(例えば、PCR、3S
R、TMAまたはNASBA)においてシグナルプライマーとして
利用するために改変できることは明らかである。例え
ば、本方法を、PCR増幅プライマーと5'→3’エキソヌク
レアーゼ活性を欠失した鎖置換DNAポリメラーゼ(例え
ば、Promega 社のSequencing Grade Taq またはNew Eng
land BioLabs社のEso-VentまたはExoDeepVent)をPCRに
おいて利用することにより、PCRにおいて利用するため
に改変することができる。これらのシグナルプライマー
は、伸長され、標的から置換され、本質的にSDAで説明
した様に、リポータープローブまたは未標識の第二のオ
リゴヌクレオチドの置換により二本鎖にされる。SDA系
の場合と同様に、リポータープローブまたは未標識の第
二のオリゴヌクレオチドが置換されることにより、ドナ
ー/アクセプター色素対の近接度と蛍光消光度に変化が
引き起こされる。蛍光度の様な蛍光パラメータに伴う変
化は、標的増幅の指標の役割を果たす。
【００２７】本発明の方法を3SR、TMAまたはNASBA用に
改変するために、鎖置換活性を有する5'→3’エキソヌ
クレアーゼ活性欠失逆転写酵素を利用し、シグナルプラ
イマーとRNAポリメラーゼプロモーターを含む増幅プラ
イマー下流のRNA標的をハイブリッド形成させる。前記
と同様の反応方法において、ハイブリッド形成したリポ
ータープローブまたは未標識の第二のオリゴヌクレオチ
ドを含むハイブリッド形成したシグナルプライマーは、
1)伸長され、2)上流の増幅プライマーの伸長により置換
される。置換された伸長生成物は次に、第二の増幅プラ
イマーのハイブリッド形成と伸長により完全に二本鎖と
される。これによって、リポータープローブまたは未標
識の第二のオリゴヌクレオチドはシグナルプライマーの
アダプターオリゴヌクレオチドから置換され、リポータ
ープローブのドナーおよび消光剤色素間距離が変わり、
ドナー蛍光体の蛍光消光度に変化が生じる。3SRまたはN
ASBAのシグナルプライマーは、RNAポリメラーゼプロモ
ーター配列を含まず、従って、増幅プライマーとしての
機能を果たすことができず、非特異的バックグラウンド
シグナルは減少する。これは、SDAにおけるシグナルプ
ライマーと類似しており、ニッキング可能なRERSを含ま
ないため、非特異的標的の指数的バックグラウンド増幅
に大きく寄与することはない。
改変するために、鎖置換活性を有する5'→3’エキソヌ
クレアーゼ活性欠失逆転写酵素を利用し、シグナルプラ
イマーとRNAポリメラーゼプロモーターを含む増幅プラ
イマー下流のRNA標的をハイブリッド形成させる。前記
と同様の反応方法において、ハイブリッド形成したリポ
ータープローブまたは未標識の第二のオリゴヌクレオチ
ドを含むハイブリッド形成したシグナルプライマーは、
1)伸長され、2)上流の増幅プライマーの伸長により置換
される。置換された伸長生成物は次に、第二の増幅プラ
イマーのハイブリッド形成と伸長により完全に二本鎖と
される。これによって、リポータープローブまたは未標
識の第二のオリゴヌクレオチドはシグナルプライマーの
アダプターオリゴヌクレオチドから置換され、リポータ
ープローブのドナーおよび消光剤色素間距離が変わり、
ドナー蛍光体の蛍光消光度に変化が生じる。3SRまたはN
ASBAのシグナルプライマーは、RNAポリメラーゼプロモ
ーター配列を含まず、従って、増幅プライマーとしての
機能を果たすことができず、非特異的バックグラウンド
シグナルは減少する。これは、SDAにおけるシグナルプ
ライマーと類似しており、ニッキング可能なRERSを含ま
ないため、非特異的標的の指数的バックグラウンド増幅
に大きく寄与することはない。
【００２８】バックグラウンドの減少には、上流の増幅
プライマーの伸長に基づく置換によりシグナルプライマ
ー伸長生成物を標的配列から分離し、本発明のシグナル
プライマーを上記の様に利用することが好ましい。しか
し、種々の核酸増幅反応における利用が公知の増幅プラ
イマーも、本発明のシグナルプライマーに関して説明さ
れているように、5'分子間塩基対合配列の付加により改
変できることは明らかである。この実施例において、5'
二本鎖部分と共に増幅プライマー伸長生成物は、標的鎖
の変性(例えば、PSAにおける様に加熱）または酵素的消
化(例えば、3SRにおける様にリボヌクレアーゼ)によ
り、上流の非増幅プライマー(例えば、SDAにおける様に
バンパープライマー)の伸長に基づく置換によって標的
配列から分離できる。5'二本鎖部分とドナー/アクセプ
ター色素対を含む増幅プライマーにより、反応に更なる
シグナルプライマーは不要となるが、本実施例において
バックはグラウンドが高くなる可能性があるため、分析
の鋭敏度が低くなる可能性がある。
プライマーの伸長に基づく置換によりシグナルプライマ
ー伸長生成物を標的配列から分離し、本発明のシグナル
プライマーを上記の様に利用することが好ましい。しか
し、種々の核酸増幅反応における利用が公知の増幅プラ
イマーも、本発明のシグナルプライマーに関して説明さ
れているように、5'分子間塩基対合配列の付加により改
変できることは明らかである。この実施例において、5'
二本鎖部分と共に増幅プライマー伸長生成物は、標的鎖
の変性(例えば、PSAにおける様に加熱）または酵素的消
化(例えば、3SRにおける様にリボヌクレアーゼ)によ
り、上流の非増幅プライマー(例えば、SDAにおける様に
バンパープライマー)の伸長に基づく置換によって標的
配列から分離できる。5'二本鎖部分とドナー/アクセプ
ター色素対を含む増幅プライマーにより、反応に更なる
シグナルプライマーは不要となるが、本実施例において
バックはグラウンドが高くなる可能性があるため、分析
の鋭敏度が低くなる可能性がある。
【００２９】PCRの場合、増幅プライマーは、リポータ
ープローブまたは未標識の第二のオリゴヌクレオチドに
相補的な配列を標的結合配列の5'に付加することによ
り、アダプターオリゴヌクレオチドとなる様に修飾され
る。次に、リポータープローブまたは未標識の第二のオ
リゴヌクレオチドを付加した5'配列とハイブリッド形成
させる。このプライマーは、上記PCRシグナルプライマ
ーと構造的に同じである。しかし、機能的には、伸長さ
れ、置換される下流のプライマーが存在せず、増幅プラ
イマーそのものが蛍光に変化を引き起こす点が異なる。
3SE、NASBAおよびTMAの場合、第二のオリゴヌクレオチ
ドに相補的な配列を、増幅プライマーのプロモーターの
5'に配置し、第二のオリゴヌクレオチドを、第二のオリ
ゴヌクレオチドが置換され、アダプターオリゴヌクレオ
チドが増幅サイクルの二本鎖DNA部分において全体的に
二本鎖となるように、それとハイブリッド形成させる。
プロモーター配列を含まない(例えば、NASBAの場合の様
に)第二の増幅プライマーは、標的結合配列5'のハイブ
リッド形成した第二のオリゴヌクレオチドに相補的な配
列を更に、あるいは代わりに含むことが可能である。
ープローブまたは未標識の第二のオリゴヌクレオチドに
相補的な配列を標的結合配列の5'に付加することによ
り、アダプターオリゴヌクレオチドとなる様に修飾され
る。次に、リポータープローブまたは未標識の第二のオ
リゴヌクレオチドを付加した5'配列とハイブリッド形成
させる。このプライマーは、上記PCRシグナルプライマ
ーと構造的に同じである。しかし、機能的には、伸長さ
れ、置換される下流のプライマーが存在せず、増幅プラ
イマーそのものが蛍光に変化を引き起こす点が異なる。
3SE、NASBAおよびTMAの場合、第二のオリゴヌクレオチ
ドに相補的な配列を、増幅プライマーのプロモーターの
5'に配置し、第二のオリゴヌクレオチドを、第二のオリ
ゴヌクレオチドが置換され、アダプターオリゴヌクレオ
チドが増幅サイクルの二本鎖DNA部分において全体的に
二本鎖となるように、それとハイブリッド形成させる。
プロモーター配列を含まない(例えば、NASBAの場合の様
に)第二の増幅プライマーは、標的結合配列5'のハイブ
リッド形成した第二のオリゴヌクレオチドに相補的な配
列を更に、あるいは代わりに含むことが可能である。
【００３０】別の実施例において、本発明のシグナルプ
ライマーは標的オリゴヌクレオチドを検出するために増
幅に依らない分析方法において利用できる。第一の増幅
に依らない実施例において、アダプターオリゴヌクレオ
チドの3’一本鎖標的結合配列は、シグナルプライマー
の塩基対合二重鎖部分が5'オーバーハングを形成するよ
うに、標的オリゴヌクレオチドの3’末端とハイブリッ
ド形成する。標的配列は、プライマー伸長反応において
プライマーとして機能し、鋳型として5'オーバーハング
(即ち、第二のオリゴヌクレオチドと塩基対合するアダ
プターオリゴヌクレオチドの配列)を用いて標的配列を
伸長する鎖置換ポリメラーゼを用いて、アダプターオリ
ゴヌクレオチドと相補的な鎖を合成する。検出用核酸の
標的結合配列が標的配列の一部とのみハイブリッド形成
する場合には、標的配列も5'オーバーハングを形成し、
シグナルプライマーのアダプターオリゴヌクレオチドも
鋳型として標的の5'オーバーハングを用いて同様に伸長
される。シグナルプライマーの標的結合配列が、標的配
列の全長と相補的な場合、標的だけが伸長される。いず
れの場合でも、上記の様にシグナルプライマーの第二の
オリゴヌクレオチドはこの様にしてアダプターオリゴヌ
クレオチドから置換され、蛍光パラメータに変化を生じ
る。蛍光パラメータの変化を伴う第二のオリゴヌクレオ
チドの置換を伴う伸長は、標的が存在する場合に限り発
生し得る。
ライマーは標的オリゴヌクレオチドを検出するために増
幅に依らない分析方法において利用できる。第一の増幅
に依らない実施例において、アダプターオリゴヌクレオ
チドの3’一本鎖標的結合配列は、シグナルプライマー
の塩基対合二重鎖部分が5'オーバーハングを形成するよ
うに、標的オリゴヌクレオチドの3’末端とハイブリッ
ド形成する。標的配列は、プライマー伸長反応において
プライマーとして機能し、鋳型として5'オーバーハング
(即ち、第二のオリゴヌクレオチドと塩基対合するアダ
プターオリゴヌクレオチドの配列)を用いて標的配列を
伸長する鎖置換ポリメラーゼを用いて、アダプターオリ
ゴヌクレオチドと相補的な鎖を合成する。検出用核酸の
標的結合配列が標的配列の一部とのみハイブリッド形成
する場合には、標的配列も5'オーバーハングを形成し、
シグナルプライマーのアダプターオリゴヌクレオチドも
鋳型として標的の5'オーバーハングを用いて同様に伸長
される。シグナルプライマーの標的結合配列が、標的配
列の全長と相補的な場合、標的だけが伸長される。いず
れの場合でも、上記の様にシグナルプライマーの第二の
オリゴヌクレオチドはこの様にしてアダプターオリゴヌ
クレオチドから置換され、蛍光パラメータに変化を生じ
る。蛍光パラメータの変化を伴う第二のオリゴヌクレオ
チドの置換を伴う伸長は、標的が存在する場合に限り発
生し得る。
【００３１】本発明の特徴は、最初に検出用核酸の塩基
対合配列とハイブリッド形成する必要がない点である。
多くの従来の分析方法では、最初に競合的ハイブリッド
形成が起こるため、標的に対するプローブまたはプライ
マーの親和性が低下し、分析鋭敏度が低下している。こ
れに反して、本発明のシグナルプライマーは最初競合的
に結合していないので、その後の競合的ハイブリッド形
成反応の全てにおいて分子間ハイブリッド形成により有
利となっている。一本鎖3’尾部の長さは、シグナルプ
ライマーの二重鎖部分の熱力学特性に影響を及ぼさずに
調節でき、従って、シグナルプライマーの二重鎖部分を
デザインし直すさずに、最適にすることができる。これ
によって、従来の技術と比べ、プライマーのデザインは
大幅に簡易化される。
対合配列とハイブリッド形成する必要がない点である。
多くの従来の分析方法では、最初に競合的ハイブリッド
形成が起こるため、標的に対するプローブまたはプライ
マーの親和性が低下し、分析鋭敏度が低下している。こ
れに反して、本発明のシグナルプライマーは最初競合的
に結合していないので、その後の競合的ハイブリッド形
成反応の全てにおいて分子間ハイブリッド形成により有
利となっている。一本鎖3’尾部の長さは、シグナルプ
ライマーの二重鎖部分の熱力学特性に影響を及ぼさずに
調節でき、従って、シグナルプライマーの二重鎖部分を
デザインし直すさずに、最適にすることができる。これ
によって、従来の技術と比べ、プライマーのデザインは
大幅に簡易化される。
【００３２】リポータープローブまたは未標識の第二の
オリゴヌクレオチドの置換による蛍光の変化は、選択さ
れた反応終点で検出できる。しかし、完全または一部置
換された第二のオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形
成とプライマー伸長と同時に産生されるので、蛍光の変
化を反応の発生と同時に、すなわち“リアルタイム”で
監視することも可能である。この均一リアルタイム分析
方法は、存在する初期標的量に関する半定量的または定
量的情報を提供する。例えば、第二のオリゴヌクレオチ
ドの置換反応(標的増幅の一部として、あるいは非増幅
検出方法のどちらでも)時に蛍光度が変化する速度は、
初期標的量の指標である。その結果、初期標的配列コピ
ー数が多く存在する程、蛍光は選択された閾値により迅
速に到達する(即ち、短時間で確実性が得られる)。更
に、第二のオリゴヌクレオチドの置換反応過程の蛍光パ
ラメータの変化速度は、初期標的量を少なく含む試料よ
りも、初期標的量を多く含む試料においてより迅速であ
る。本発明の技術において公知のこれらおよびその他の
測定値を、存在する標的量または標的増幅の指標とする
ことが可能である。初期標的量は、典型的には、既知量
の標的に関する実験結果の比較により決定される。
オリゴヌクレオチドの置換による蛍光の変化は、選択さ
れた反応終点で検出できる。しかし、完全または一部置
換された第二のオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形
成とプライマー伸長と同時に産生されるので、蛍光の変
化を反応の発生と同時に、すなわち“リアルタイム”で
監視することも可能である。この均一リアルタイム分析
方法は、存在する初期標的量に関する半定量的または定
量的情報を提供する。例えば、第二のオリゴヌクレオチ
ドの置換反応(標的増幅の一部として、あるいは非増幅
検出方法のどちらでも)時に蛍光度が変化する速度は、
初期標的量の指標である。その結果、初期標的配列コピ
ー数が多く存在する程、蛍光は選択された閾値により迅
速に到達する(即ち、短時間で確実性が得られる)。更
に、第二のオリゴヌクレオチドの置換反応過程の蛍光パ
ラメータの変化速度は、初期標的量を少なく含む試料よ
りも、初期標的量を多く含む試料においてより迅速であ
る。本発明の技術において公知のこれらおよびその他の
測定値を、存在する標的量または標的増幅の指標とする
ことが可能である。初期標的量は、典型的には、既知量
の標的に関する実験結果の比較により決定される。
【００３３】本発明の技術において公知の多くのドナー
/消光剤色素対が、本発明において有用である。これら
には、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FIT
C)/テトラメチルローダミンイソシアネート(TRITC)、FI
TC/Texas RedTM(MolecularProbes社)、FITC/N-ヒドロキ
シスクシンイミジル 1-ピレンブチレート(PYB)、FITC/
エオシンイソシアナート(EITC)、N-ヒドロキシスクシン
イミジル 1-ピレンスルホネート(PYS)/FITC、FITC/ロー
ダミンX、FITC/テトラメチルローダミン(TAMRA)等が挙
げられる。特定のドナー/消光剤対の選択は重要ではな
い。エネルギー移動消光機序にとって、ドナー蛍光体の
発光波長が、消光剤の励起波長とオーバーラップするこ
とだけが必要である。すなわち、エネルギー移動、電荷
移動、または蛍光消光を十分可能にするために2つの色
素間に十分なスペクトルのオーバーラップが無くては成
らない。p-(ジメチルアミノフェニラゾ)安息香酸(CABCY
L)は、隣接する蛍光体、例えば、フルオレセインまたは
5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン(EDANS)から蛍光
を有効に消光する非蛍光消光剤色素である。特定のドナ
ー/消光剤色素対が、上記および以下の具体例に例示さ
れているが、その他の色素対も本発明において有用であ
ることは、本技術に精通する者にとって明らかである。
本発明の検出用核酸において蛍光消光を生じる色素対は
全て、消光機序に関わりなく、本発明の方法における使
用に適している。末端および内部標識法も本技術におい
て公知であり、検出用核酸においてそれぞれの部位でド
ナーおよび消光剤色素を結合するためにルーチンに利用
できる。
/消光剤色素対が、本発明において有用である。これら
には、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FIT
C)/テトラメチルローダミンイソシアネート(TRITC)、FI
TC/Texas RedTM(MolecularProbes社)、FITC/N-ヒドロキ
シスクシンイミジル 1-ピレンブチレート(PYB)、FITC/
エオシンイソシアナート(EITC)、N-ヒドロキシスクシン
イミジル 1-ピレンスルホネート(PYS)/FITC、FITC/ロー
ダミンX、FITC/テトラメチルローダミン(TAMRA)等が挙
げられる。特定のドナー/消光剤対の選択は重要ではな
い。エネルギー移動消光機序にとって、ドナー蛍光体の
発光波長が、消光剤の励起波長とオーバーラップするこ
とだけが必要である。すなわち、エネルギー移動、電荷
移動、または蛍光消光を十分可能にするために2つの色
素間に十分なスペクトルのオーバーラップが無くては成
らない。p-(ジメチルアミノフェニラゾ)安息香酸(CABCY
L)は、隣接する蛍光体、例えば、フルオレセインまたは
5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン(EDANS)から蛍光
を有効に消光する非蛍光消光剤色素である。特定のドナ
ー/消光剤色素対が、上記および以下の具体例に例示さ
れているが、その他の色素対も本発明において有用であ
ることは、本技術に精通する者にとって明らかである。
本発明の検出用核酸において蛍光消光を生じる色素対は
全て、消光機序に関わりなく、本発明の方法における使
用に適している。末端および内部標識法も本技術におい
て公知であり、検出用核酸においてそれぞれの部位でド
ナーおよび消光剤色素を結合するためにルーチンに利用
できる。
【００３４】（具体例1）合成標的配列の検出のため
に、本発明のシグナルプライマーを含む鎖置換増幅反応
を、本質的に米国特許No.5,547,861に記載されている方
法により実施した。1番目の反応は、合成標的配列の増
幅に適切なコピー数106個の標的配列SDA増幅プライマー
および標的に特異的な標的結合配列とリポータープロー
ブに相補的な5'配列を持つアダプターオリゴヌクレオチ
ドとフルオレセインとダブシルで標識されたリポーター
プローブから成る本発明のシグナルプライマー(UDP1)を
含んだ。リポータープローブの配列は、その相補的配列
とハイブリッド形成していない時は、自然にヘアピン構
造に折り畳まれ、リポータープローブが相補的配列とハ
イブリッド形成した時と比べ、2つの色素を近接させ、
蛍光消光を増加させる様に選択された。シグナルプライ
マーの配列は以下の通りであった(5'から3’末端方向に
表示)。アダプターオリゴヌクレオチドの標的結合配列
はイタリック体で表示され、アダプターオリゴヌクレオ
チドとリポータープローブ中の相補的配列には下線が付
けられている。リポータープローブの5'および3’配列
はハイブリッド形成しヘアピン構造を形成する。
に、本発明のシグナルプライマーを含む鎖置換増幅反応
を、本質的に米国特許No.5,547,861に記載されている方
法により実施した。1番目の反応は、合成標的配列の増
幅に適切なコピー数106個の標的配列SDA増幅プライマー
および標的に特異的な標的結合配列とリポータープロー
ブに相補的な5'配列を持つアダプターオリゴヌクレオチ
ドとフルオレセインとダブシルで標識されたリポーター
プローブから成る本発明のシグナルプライマー(UDP1)を
含んだ。リポータープローブの配列は、その相補的配列
とハイブリッド形成していない時は、自然にヘアピン構
造に折り畳まれ、リポータープローブが相補的配列とハ
イブリッド形成した時と比べ、2つの色素を近接させ、
蛍光消光を増加させる様に選択された。シグナルプライ
マーの配列は以下の通りであった(5'から3’末端方向に
表示)。アダプターオリゴヌクレオチドの標的結合配列
はイタリック体で表示され、アダプターオリゴヌクレオ
チドとリポータープローブ中の相補的配列には下線が付
けられている。リポータープローブの5'および3’配列
はハイブリッド形成しヘアピン構造を形成する。
【００３５】
【化１】
【００３６】2番目の反応は、標的を含まず、1番目の反
応と同様のシグナルプライマーを含んだ。3番目の反応
は対照反応で、コピー数106個の標的配列とリポーター
プローブのみ(すなわちアダプターオリゴヌクレオチド
を含まない)を含んだ。図3に示すように、標的を含まな
いと、反応を通して、蛍光は高い状態を維持し(比較す
ると消光していない)、シグナルプライマーにおいてア
ダプターオリゴヌクレオチドからリポータープローブが
置換されなかったことを示した。しかし、標的が存在す
ると、ドナー蛍光は最初高かったが(比較すると消光し
ていない)、リポータープローブが置換され、比較的よ
り消光したコンフォメーションを取るため、増幅反応の
経過と共に減少した。シグナルプライマーが存在しない
と、増幅反応を通してドナー蛍光は消光したままであっ
た。これらの結果から、本発明のシグナルプライマー
は、蛍光消光度の変化を監視することにより、核酸標的
配列を検出するために利用できることが証明された。
応と同様のシグナルプライマーを含んだ。3番目の反応
は対照反応で、コピー数106個の標的配列とリポーター
プローブのみ(すなわちアダプターオリゴヌクレオチド
を含まない)を含んだ。図3に示すように、標的を含まな
いと、反応を通して、蛍光は高い状態を維持し(比較す
ると消光していない)、シグナルプライマーにおいてア
ダプターオリゴヌクレオチドからリポータープローブが
置換されなかったことを示した。しかし、標的が存在す
ると、ドナー蛍光は最初高かったが(比較すると消光し
ていない)、リポータープローブが置換され、比較的よ
り消光したコンフォメーションを取るため、増幅反応の
経過と共に減少した。シグナルプライマーが存在しない
と、増幅反応を通してドナー蛍光は消光したままであっ
た。これらの結果から、本発明のシグナルプライマー
は、蛍光消光度の変化を監視することにより、核酸標的
配列を検出するために利用できることが証明された。
【００３７】（具体例2）リポータープローブが相補的
配列とハイブリッド形成している時よりも、相補的配列
とハイブリッド形成していない時にはドナー色素と消光
剤色素をより近接させるGカルテット構造を自然に形成
するリポータープローブ配列(UDP5)を用いて、具体例1
を繰り返した。
配列とハイブリッド形成している時よりも、相補的配列
とハイブリッド形成していない時にはドナー色素と消光
剤色素をより近接させるGカルテット構造を自然に形成
するリポータープローブ配列(UDP5)を用いて、具体例1
を繰り返した。
【００３８】
【化２】
【００３９】この場合も、シグナルプライマーのアダプ
ターオリゴヌクレオチドからリポータープローブが置換
されるにつれ、標的増幅によりドナー蛍光は減少した。
リポータープローブ単独では標的を認識できず、標的が
存在しないとドナー蛍光に変化は観察されなかった。こ
れらの結果を図4に示す。
ターオリゴヌクレオチドからリポータープローブが置換
されるにつれ、標的増幅によりドナー蛍光は減少した。
リポータープローブ単独では標的を認識できず、標的が
存在しないとドナー蛍光に変化は観察されなかった。こ
れらの結果を図4に示す。
【００４０】
【配列表】 <110> Nadeau, James G. Linn, C. Preston Pitner, J. Bruce Dean, Cheryl H. Walker, G. Terrance <120> Universal Probes and Methods for Detection of Nucleic Acids <130> P000873 <140> JP P2000-291720 <141> 2000-09-26 <150> US 09/406,074 <151> 1999-09-27 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: hypothetical synthetic sequence for purposes of examples <400> 1 tcgggtggct ccttctgata atgactcact gagctggaac gtcgt 45 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: hypothetical synthetic sequence for purposes of examples <400> 2 cagcattatc agaaggagcc acccgataat gctg 34 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: hypothetical synthetic sequence for purposes of examples <400> 3 cccaaaaccc aaaacccaaa acccactcac tgagctggaa cgtcgt 46 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: hypothetical synthetic sequence for purposes of examples <400> 4 gggttttggg ttttgggttt tggg 24
【図１】シグナルプライマーの第二のオリゴヌクレオチ
ドがリポータープローブである、鎖置換増幅(SDA)反応
における核酸標的配列の検出を示す。
ドがリポータープローブである、鎖置換増幅(SDA)反応
における核酸標的配列の検出を示す。
【図２】シグナルプライマーの第二のオリゴヌクレオチ
ドが未標識プローブである、鎖置換増幅(SDA)反応にお
ける核酸標的配列の検出を示す。
ドが未標識プローブである、鎖置換増幅(SDA)反応にお
ける核酸標的配列の検出を示す。
【図３】相補的配列とハイブリッド形成していない時、
ヘアピン構造を自然に形成する配列から成るリポーター
プローブを利用した、具体例1の結果を示す。
ヘアピン構造を自然に形成する配列から成るリポーター
プローブを利用した、具体例1の結果を示す。
【図４】相補的配列とハイブリッド形成していない時、
Gカルテット構造を自然に形成する配列から成るリポー
タープローブを利用した、具体例2の結果を示す。
Gカルテット構造を自然に形成する配列から成るリポー
タープローブを利用した、具体例2の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 シー・プレストン・リン アメリカ合衆国ノースカロライナ州27707, ダーラム，トロッター・リッジ・ロード 4110 (72)発明者 ジェイ・ブルース・ピトナー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27707, ダーラム，クインスムーア・ロード 2903 (72)発明者 シェリル・エイチ・ディーン アメリカ合衆国ノースカロライナ州27614, ローリー，トレイルズ・エンド・コート 205 (72)発明者 ジー・テランス・ウォーカー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27514, チャペル・ヒル，マウント・ボーラス・ロ ード 209
Claims (10)
- 【請求項１】 a)相補的配列とハイブリッド形成してい
ない時は、リポータープローブに結合された蛍光ドナー
/消光剤色素対を空間的に十分近接させ、ドナー蛍光を
消光させる様なコンフォメーション構造を取るリポータ
ープローブと、 b)シグナルプライマーが分子間塩基対合部分と一本鎖標
的結合配列とを含むようにリポータープローブとハイブ
リッド形成されたアダプターオリゴヌクレオチドとを含
んでなるシグナルプライマー。 - 【請求項２】 検出用核酸の分子間塩基対合部分が、標
的結合配列の一部を含んでなる請求項１記載のシグナル
プライマー。 - 【請求項３】 a) シグナルプライマーと標的配列とを
ハイブリッド形成させるステップと、ここで、シグナル
プライマーは、相補的配列とハイブリッド形成していな
い時には二次構造を形成するリポータープローブと、二
次構造の形成が実質的に阻害される様にリポータープロ
ーブとハイブリッド形成させたアダプターオリゴヌクレ
オチドとを含み b)標的に依存する方法で、アダプターオリゴヌクレオチ
ドからリポータープローブを分離するステップと、 c)標的配列の存在の指標として二次構造の形成を検出す
るステップとを含む核酸標的配列の検出方法。 - 【請求項４】 二次構造の形成が、蛍光の変化により検
出される請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 リポータープローブがドナー/消光剤色
素対により標識され、二次構造の形成がドナー蛍光の減
少により検出される請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 シグナルプライマーのアダプターオリゴ
ヌクレオチドが、第二の標的配列を検出するための第二
のシグナルプライマーの第二のアダプターオリゴヌクレ
オチドのアダプター配列と実質的に同一であるリポータ
ープローブとハイブリッド形成するためのアダプター配
列を含んでなる請求項３の方法。 - 【請求項７】 a) シグナルプライマーを標的配列とハ
イブリッド形成させるステップと、ここで、シグナルプ
ライマーは第二のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形
成されたアダプターオリゴヌクレオチドを含み、第二の
オリゴヌクレオチドは、相補的配列とハイブリッド形成
していない時には二次構造を形成するリポータープロー
ブと相補的であり、 b)標的に依存する方法で、アダプターオリゴヌクレオチ
ドからリポータープローブを分離するステップと、 c)標的配列の存在の指標として二次構造の形成を検出す
るステップとを含む核酸標的配列の検出方法。 - 【請求項８】 第二のオリゴヌクレオチドとリポーター
プローブのハイブリッド形成が、蛍光の変化により検出
される請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 リポータープローブがドナー/消光剤色
素対により標識され、第二のオリゴヌクレオチドとのハ
イブリッド形成がドナー蛍光の増加により検出される請
求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 シグナルプライマーのアダプターオリ
ゴヌクレオチドが、第二の標的配列を検出するための第
二のシグナルプライマーの第二のアダプターオリゴヌク
レオチドのアダプター配列と実質的に同一である第二の
オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するためのアダ
プター配列を含んでなる請求項７の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/406,074 US6379888B1 (en) | 1999-09-27 | 1999-09-27 | Universal probes and methods for detection of nucleic acids |
| US09/406074 | 1999-09-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001161377A true JP2001161377A (ja) | 2001-06-19 |
| JP3779144B2 JP3779144B2 (ja) | 2006-05-24 |
Family
ID=23606443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000291720A Expired - Fee Related JP3779144B2 (ja) | 1999-09-27 | 2000-09-26 | 核酸検出のための万能プローブおよび方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6379888B1 (ja) |
| EP (1) | EP1087020B1 (ja) |
| JP (1) | JP3779144B2 (ja) |
| AT (1) | ATE343644T1 (ja) |
| AU (1) | AU774319B2 (ja) |
| BR (1) | BR0004377A (ja) |
| CA (1) | CA2320575A1 (ja) |
| DE (1) | DE60031489T2 (ja) |
| ES (1) | ES2273640T3 (ja) |
| MX (1) | MXPA00009212A (ja) |
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| JP2014513963A (ja) * | 2011-05-04 | 2014-06-19 | バイオセプト インコーポレイティッド | 核酸配列変種を検出するための方法 |
| CN110536968A (zh) * | 2016-12-23 | 2019-12-03 | 阿尔伯特-路德维希-弗莱堡大学 | 两部分式中介探针 |
| WO2023248310A1 (ja) * | 2022-06-20 | 2023-12-28 | 株式会社日立ハイテク | プライマー、ｄｎａ検出方法およびｄｎａ検出キット |
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| US20080318889A1 (en) * | 1999-04-08 | 2008-12-25 | Antisoma Research Limited | Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides and method of using same to bind to nucleolin |
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