JP2001149070A - 肝細胞の接着および増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、肝細胞の接着および増殖方法を提
供することを目的とする。 【解決手段】 哺乳動物由来の線維芽細胞の培養上清を
培養器にコーティングすることにより、肝細胞の接着性
および増殖性を付与、向上させる肝細胞の接着および増
殖方法を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、肝細胞の接着およ
び増殖方法に関する。詳しくは、肝機能解析に重要な肝
細胞培養法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】培養
肝細胞は種々の肝機能を解明するためなどに用いられる
が、長期間の培養は困難で、従来より、培養肝細胞を得
る培養方法の検討が行なわれてきた。

【０００３】肝細胞を比較的長く培養する方法として
は、コラーゲン膜上、ニトロセルロースフィルター上な
どでの培養方法があるが、長期に培養できるという結果
は得られていない。

【０００４】また、線維芽細胞をフィーダー細胞とし
て、初代肝細胞と混合して共存培養する方法も行なわれ
ているが、肝細胞と肝細胞以外の細胞とを共存培養する
と、肝細胞の増殖よりも肝細胞以外の細胞の増殖が盛ん
に行なわれ、肝細胞自身の機能解析が充分に行なわれな
かった。

【０００５】細胞培養法の１つに、ガンマ線などの放射
線やマイトマイシンＣなどの薬剤を用い、生存しながら
分裂・増殖能を欠失させた、いわゆる不稔化した３Ｔ３
マウス肺線維芽細胞などをフィーダーレイヤーとしする
フィーダーレイヤー法が知られており、特開昭６２−２
８５７８１には、このようなフィーダーレイヤー法を用
いて肝細胞を培養する方法が報告されている。

【０００６】しかし、たとえば３Ｔ３マウス肺線維芽細
胞をフィーダーレイヤーとする従来のフィーダーレイヤ
ー法では、肝細胞播種直前に前記３Ｔ３マウス肺線維芽
細胞を調製する必要があり煩雑で、フィーダーレイヤー
が有効である期間も限定される。マウス以外の肝細胞
（たとえば、ヒト肝細胞）の増殖においては、これらに
３Ｔ３マウス肺線維芽細胞という異種の細胞が混入する
恐れがある。また３Ｔ３マウス肺線維芽細胞の分裂・増
殖能を欠失させる際に用いられるマイトマイシンＣなど
の薬剤を用いた場合、該薬剤の残留も懸念される。

【０００７】一方、３Ｔ３マウス肺線維芽細胞の代わり
に、得ようとする肝細胞と同種の線維芽細胞（たとえ
ば、ヒト肝細胞を増殖する際には、ヒト線維芽細胞を用
いる）をフィーダーレイヤーとして利用する際には、異
種の細胞が混入することはないものの、やはり線維芽細
胞の分裂・増殖能を欠失させる必要があるため、マイト
マイシンＣなどの薬剤の残留が懸念される。また、ヒト
線維芽細胞などを用いると、３Ｔ３マウス肺線維芽細胞
を用いるより、肝細胞の増殖が遅い。

【０００８】前記のごとく、肝細胞培養においてフィー
ダーレイヤーを用いる方法は、薬物残留や異種の細胞の
混入の可能性は否定できない。

【０００９】本発明は、従来のフィーダーレイヤー法で
必要であった線維芽細胞などフィーダーレイヤーとなる
細胞の調製や該細胞の不稔化の工程を省くことができ、
かつ異種細胞の混入がない肝細胞を得ることができ、し
かも該方法における場合に比べ、肝細胞の接着性および
増殖性を向上させることができる肝細胞の接着および増
殖方法を提供することを目的とする。さらに、本発明
は、哺乳動物由来線維芽細胞（とりわけ３Ｔ３マウス肺
線維芽細胞）を培養した培養上清を回収し、該細胞を除
去または死滅させた後、肝細胞を播種する培養器にコー
ティングすることで、細胞培養が良好に行える肝細胞の
接着および増殖方法を提供することを目的とする。

【００１０】具体的には、哺乳動物細胞由来の線維芽細
胞、とくに３Ｔ３マウス肺線維芽細胞などを培養した培
養上清を回収し、培養上清に混入した線維芽細胞を、そ
のまま凍結することで死滅、および／またはメンブレン
フィルターなどで除去する。その後、培養上清を培養器
にコーティングすることで培養上清中に該細胞が分泌し
た、細胞の接着および増殖に必要な成分を培養器に付着
させ、肝細胞の接着および増殖方法を提供することを目
的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、肝細胞の
培養条件について鋭意検討した結果、哺乳動物由来の線
維芽細胞を培養した培養上清を回収し、培養上清に混入
した線維芽細胞を死滅または／および除去した後、各種
培養器にコーティングすることによって実質的に該細胞
が分泌した細胞外マトリックスなどの成分を培養器に付
着させることにより従来のフィーダーレイヤー法で必要
であった線維芽細胞などフィーダーレイヤーとなる細胞
の調製や該細胞の不稔化の工程を省くことができた。ま
た、従来のフィーダーレイヤーは、約２日程度しかその
性質を保持できなかったが、該方法で接着性および増殖
性を有した培養器は、細胞の接着性および増殖性を有し
たまま少なくとも半年から１年程度の長期間貯蔵が可能
である。

【００１２】すなわち、本発明は、哺乳動物由来の線維
芽細胞の培養上清を培養器にコーティングすることを特
徴とする肝細胞の接着および増殖方法（請求項１）、培
養上清を培養器にコーティングする方法が凍結乾燥また
は乾燥処理であることを特徴とする請求項１記載の肝細
胞の接着および増殖方法（請求項２）、哺乳動物由来の
線維芽細胞が３Ｔ３マウス肺線維芽細胞であることを特
徴とする請求項１記載の肝細胞の接着および増殖方法
（請求項３）および培養上清が、混入した線維芽細胞を
死滅および／または除去した培養上清である請求項１記
載の肝細胞の接着および増殖方法（請求項４）に関す
る。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は哺乳動物由来の線維芽細
胞を培養した培養上清を培養器にコーティングすること
を特徴とする肝細胞の接着および増殖方法に関するもの
である。さらに詳しくは、肝機能解析に重要な肝細胞培
養法に関するものである。

【００１４】本発明の接着および増殖方法により接着お
よび増殖する肝細胞とは、肝小葉を構成する細胞であ
る。

【００１５】なお、本発明の接着および増殖方法は、上
皮系細胞などの従来のフィーダーレイヤー法により培養
され得る細胞にも適用することができる。「上皮系細
胞」の語は小腸、口腔、鼻腔などの表面細胞である粘膜
上皮細胞や角膜上皮細胞などの上皮細胞および皮膚上皮
に存在し分裂後脱核し角質化する細胞である表皮細胞を
含むものである。

【００１６】本発明の肝細胞の接着および増殖方法にお
いては、哺乳動物由来の線維芽細胞を培養した培養上清
中の細胞を死滅および／または除去したのち細胞の接着
および増殖に必要な細胞外マトリックスなどの成分のみ
を存在させることが重要になる。

【００１７】線維芽細胞としては、たとえば、マウス、
ヒト、ラット、ハムスター、ウサギなどの哺乳動物由来
の線維芽細胞、好ましくは従来のフィーダーレイヤー法
で汎用されている３Ｔ３マウス肺線維芽細胞が用いられ
る。該細胞の播種、培養条件はとくに限定されるもので
はなく、一般の方法が用いられる。たとえば、培養器内
で単独に増殖した線維芽細胞を、エチレンジアミン四酢
酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）を濃度０．２０６ｍｇ／ｍｌ
に調製したリン酸緩衝液に０．２５ｗ／ｖ％となるよう
にトリプシンを溶解したトリプシン溶液などで剥離し、
ウシ胎児血清５〜１０％含有の培地に懸濁して培養器に
播種し、その後、炭酸ガス培養装置内に静置する。その
際用いられる培養器としては、コラーゲンなどの細胞外
マトリックスをコーティングした細胞培養器などの特殊
な細胞培養器は必要でなく、３Ｔ３線維芽細胞などが接
着し増殖し得る培養器であれば、材質や形状は、とくに
限定されるものではない。市販の接着細胞培養容器（フ
ラスコ、シャーレ、ローラーボトル、ウェルプレート、
トレイ）または通常の合成高分子からなる膜、フィル
ム、プレート、さらには生体高分子からなる膜、フィル
ム、およびマイクロビーズなどの担体も培養器として選
択することができる。

【００１８】該接着性および増殖性付与の観点から、好
ましくは１．０×１０²〜１．０×１０⁵細胞個／ｃ
ｍ²、より好ましくは１．０×１０³〜１．０×１０⁵細
胞個／ｃｍ²の線維芽細胞を播種し、前記条件にしたが
って培養する。

【００１９】このようにして培養した線維芽細胞の培養
上清をピペットなどを用いて回収する。このようにして
回収された培養上清は線維芽細胞を含むことが多いの
で、この混入した線維芽細胞を死滅および／または除去
する。具体的には凍結や電子線、Ｘ線などの電磁波照射
などの細胞死滅方法、メンブレンフィルターや遠心分離
機を用いた細胞の除去方法、またはそれらの併用などが
あげあれる。これらの方法であれば、該細胞を実質的に
完全に死滅および／または除去させることができ、また
細胞の接着に必要な成分は変性されず肝細胞の接着性お
よび増殖性は維持される。さらにより好ましくは凍結の
使用があげられる。本方法では、操作が容易で、一度に
大量の培養上清中の細胞を死滅させることができ、しか
も装置が他の方法で使用するものより安価である。な
お、本凍結操作は、凍結およびそれにつづく解凍、ま
た、凍結・解凍の繰り返し操作を含むものである。

【００２０】メンブレンフィルターを用いた線維芽細胞
の除去方法の具体的な条件を示す。フィルターの材質と
しては細胞の接着および増殖に有効な成分が吸着しにく
いものを用いるのが好ましく、具体的にはＰＶＤＦ（ポ
リビニリデンジフロライド）や親水性ポリスルホンなど
があげられる。フィルターの孔のサイズは細胞が通過し
なければよく、１０μｍ以下が細胞の混入が完全に否定
できるという理由で好ましい。

【００２１】凍結により線維芽細胞を死滅させる場合、
凍結手段としては凍結乾燥器、冷凍庫、超低温冷凍庫、
液化炭酸ガス、液化窒素ガスなどが使用される。凍結温
度は、凍結が可能な温度であればいずれの温度でもよ
く、通常は０℃以下である。また、細胞の凍結速度は細
胞の死滅に影響するため、好ましくはプログラムフリー
ザーなどを用い、徐冷による凍結を行うのがよい。

【００２２】前記方法により培養上清中の線維芽細胞を
死滅および／または除去した後、培養上清を各種培養器
にコーティングする。コーティング方法としては乾燥、
凍結乾燥があげられる。また、３０〜３７℃に保たれた
乾燥器や炭酸ガス培養装置中に１時間以上静置したり、
４℃の冷蔵庫中に１晩以上静置しても良い。さらには、
コラーゲン、キトサン、ゼラチン、ヒアルロン酸、コン
ドロイチン、コンドロイチン酸硫酸など細胞外マトリッ
クスと混合した後、ゲル化させ、その後凍結乾燥させて
も良い。

【００２３】本発明において培養上清中の線維芽細胞は
死滅および／または除去されるので本発明の方法によっ
て得られる培養器を用いて増殖される肝細胞には実質的
には３Ｔ３マウス肺線維芽細胞などの混入は全くない。
従来、フィーダーレイヤー法において、フィーダーレイ
ヤーに用いられる線維芽細胞は死滅していないのでヒト
以外の細胞をフィーダーレイヤーに用いる場合には、少
なからず異種細胞の混入があったことから、本発明の方
法により肝細胞の接着性および増殖性が付与された培養
器で増殖された肝細胞は異種細胞の混入のない優れた肝
細胞である。

【００２４】以下に実施例をあげて本発明をより詳細に
説明するが、本発明は該実施例にのみ限定されるもので
はない。

【００２５】

【実施例】実施例１ 培養フラスコ（培養面積８０ｃｍ²）に株化されたマウ
ス肺線維芽細胞（３Ｔ３細胞）を３×１０⁵細胞個／ｃ
ｍ²で播種。炭酸ガス培養装置（３７℃、５％炭酸ガス
濃度に設定）内で３日間培養。培地は５％ウシ胎児血清
含有ダルベッコ改変イーグル基本培地（ＤＭＥＭ＋５％
ＦＢＳ）を使用した。培養後培養上清をピペットで回収
し−３０℃のディープフリーザーで凍結した。凍結後室
温にて解凍し−３０℃で再凍結することで細胞を死滅さ
せた。

【００２６】この上清を室温で解凍させ２ｍｌを培養フ
ラスコ（培養面積２５ｃｍ²）に加え、３０℃に保って
おいた乾燥器中に４８時間静置した。乾燥器にて静置後
細胞播種までは４℃で保管した。

【００２７】このフラスコに正常ヒト肝細胞を１．０×
１０³細胞個／ｃｍ²になるように播種した。コントロー
ルとしてマイトマイシンＣにて不稔化し１．０×１０⁴
細胞個／ｃｍ²となるように培養フラスコ（培養面積２
５ｃｍ²）に播種したもの（３Ｔ３フィーダーレイヤ
ー）をおいた。コントロールに比し肝細胞は上清コート
フラスコに良好に接着しその後増殖した。

【００２８】

【発明の効果】線維芽細胞の培養上清を培養器にコーテ
ィングすることで、（１）肝細胞の培養面への接着のフ
ィーダーレイヤーとして使用される生きた３Ｔ３マウス
肺線維芽細胞などが、肝細胞へ混入する危険を回避させ
得る。また、（２）３Ｔ３マウス肺線維芽細胞などをフ
ィーダーレイヤーとする際に、分裂・増殖能を欠失する
ために投与するマイトマイシンＣなどの薬剤残留の危険
を回避させ得る。

【００２９】線維芽細胞の培養上清を培養器にコーティ
ングすることで、特殊な細胞培養用容器を使用しなくと
も、３Ｔ３マウス肺線維芽細胞などが接着し増殖し得る
培養器であれば使用することができ、コストを低減する
ことができる。

【００３０】３Ｔ３マウス肺線維芽細胞などの培養上清
を培養器にコーティングすることで、肝細胞接着性を維
持したまま、該培養器を保存することができるので、従
来までの肝細胞播種直前のフィーダーレイヤー調製作業
を省略することができる。また、同等な肝細胞接着性を
もった培養器を、一度に大量に作製することができるの
で、コストを低減することができる。

【００３１】さらに、フィーダーレイヤーとして使用す
る線維芽細胞の日常的な継代（細胞が培養器内で過密に
なりすぎないように他の容器に植え継ぐこと）の必要性
がなくなる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 河南 哲 愛知県春日井市高森台五丁目１番地10 株 式会社メニコン総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B065 AA91X BB23 BC41 BC45 BD10

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物由来の線維芽細胞の培養上清を
   培養器にコーティングすることを特徴とする肝細胞の接
   着および増殖方法。
2. 【請求項２】 培養上清を培養器にコーティングする方
   法が凍結乾燥または乾燥処理であることを特徴とする請
   求項１記載の肝細胞の接着および増殖方法。
3. 【請求項３】 哺乳動物由来の線維芽細胞が３Ｔ３マウ
   ス肺線維芽細胞であることを特徴とする請求項１記載の
   肝細胞の接着および増殖方法。
4. 【請求項４】 培養上清が、混入した線維芽細胞を死滅
   および／または除去した培養上清である請求項１記載の
   肝細胞の接着および増殖方法。