JP2001131087A

JP2001131087A - オイルアジュバントワクチン

Info

Publication number: JP2001131087A
Application number: JP31612199A
Authority: JP
Inventors: Koichi Saito; 晃一齋藤; Yoko Kishimoto; 洋子岸本; Tokuji Miyahara; 徳治宮原; Kozo Takase; 公三高瀬
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; NOF Corp
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; NOF Corp
Priority date: 1999-11-05
Filing date: 1999-11-05
Publication date: 2001-05-15
Also published as: DK1097721T3; EP1097721A2; EP1097721B1; TW581682B; DE60002650D1; CN100384473C; ES2199734T3; AU6971300A; KR100726818B1; KR20010051463A; CN1307903A; DE60002650T2; EP1097721A3; US20050158330A1; AU780054B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】外水相が分子量４００〜２０,０００の
ポリエチレングリコール誘導体を０．５〜２０重量％含
有し、且つ内水相が生物学的に許容される有効量の抗原
を含有することを特徴とするＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュ
バントワクチンの提供。【効果】外水相に特定の分子量を有するポリエチレン
グリコール誘導体を含有させることによって、高いアジ
ュバント効果を発揮すると共に、局所反応等の副作用が
軽減され、且つ粘度が低減された作業性、製剤安定性に
優れたＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを調製
し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オイルアジュバン
トワクチンに関する。詳しくは、アジュバント効果に優
れ、製剤としての安定性の高いＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジ
ュバントワクチンに関する。

【０００２】

【従来の技術】オイルアジュバントワクチンは、古くか
ら効率よく免疫を強化するワクチンとして広く知られて
いる。特にフロイントのアジュバントは、不活化した抗
原を用いる場合に非常に有効な免疫増強効果を発揮する
ことから、実験動物に広く用いられている代表的なアジ
ュバントである。しかしながらこのアジュバントは、重
度の膿腫や肉芽腫を引き起こす等、強い副作用のため実
験室外での使用はほとんど行われていない。

【０００３】そこで、このような副作用を軽減し、オイ
ルアジュバントを一般に利用しようとする試みが数多く
なされており、その製剤型もフロイントアジュバントと
同様のＷ／Ｏ型や、安全性に優れたＯ／Ｗ型、複合型で
あるＷ／Ｏ／Ｗ型等、多岐にわたっている。

【０００４】たとえば、特公平６−８１７３１号公報に
は、界面活性剤として無水マンニトール・オレイン酸エ
ステルを、油分として流動パラフィンを用いたＷ／Ｏ型
の油性アジュバントが報告されており、ＷＯ９１／００
１０７号（特表平４−５０６５２１号）公報には、油分
として植物油などの代謝可能な油と鉱物油などの代謝不
可能な油を混合して用いた低粘度のＷ／Ｏ型油性アジュ
バントが示されている。

【０００５】また特公平８−３２６３８号公報には、サ
ブミクロン油滴乳剤を含んでなるアジュバント製剤とし
てＯ／Ｗ型のアジュバントが、さらに特許第２７４６２
７２号公報には、ＰＯＰ−ＰＯＥブロックポリマーから
なる乳化剤および免疫増強剤としてのグリコペプチドを
含むＯ／Ｗ型のワクチンアジュバントが示されている。

【０００６】しかし、このようなアジュバントの中でＷ
／Ｏ型オイルアジュバントは高い免疫増強効果が認めら
れる反面、製剤の連続相が油であることから、生体内で
の拡散、代謝に長期間を要すると共に、接種部位周辺に
無菌化膿巣や肉芽腫の形成を引き起こすことも稀ではな
く、また接種時に強い疼痛を伴う可能性があるため、生
体に直接接種する製剤としてはその使用が制限されてき
た。一方、Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントは接種部位に対
する局所反応は軽微であり、安全性の面では優れている
が、抗原が連続相に含有されているために生体内で速や
かに拡散し、十分な有効性が得られにくく、特定の免疫
賦活物質が必要である場合が多い。

【０００７】そのため最近ではさらに新しいタイプのオ
イルアジュバントとしてＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバン
トに関する検討も行われている。たとえば特許第２８５
１４２２号公報には、注射後、動物の体温により、Ｗ／
Ｏ型に変換するＷ／Ｏ／Ｗ型多相乳剤が示されている。
しかし、この技術はオイルアジュバントが体内で結果的
にＷ／Ｏ型の形態で存在することから、局所反応等の従
来のＷ／Ｏ型オイルアジュバントが有していた問題をす
べて解決するには至っていない。

【０００８】Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントは、複合
エマルションの形態をとっているためＷ／Ｏ型やＯ／Ｗ
型のオイルアジュバントと比較して製剤としての安定性
を維持することが非常に難しい。そのためＷ／Ｏ／Ｗ型
オイルアジュバントワクチンは、優れたアジュバント活
性を発揮するＷ／Ｏ型と、安全性に優れたＯ／Ｗ型のそ
れぞれの特長を併せ持つことが期待されながら、両者の
特性をバランスよく発揮できるオイルアジュバントの開
発には依然多くの問題が残されている。

【０００９】本発明者らは、特開平９−２６８１３０号
公報に、安全性、製剤安定性に優れたＷ／Ｏ型オイルア
ジュバントワクチンと、さらにそれを水相に分散させる
ことにより得られるＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワ
クチンを示している。

【００１０】しかし、従来の技術により調製されたＷ／
Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンは、処方による物
性の差が大きく、抗原成分の影響によって粘度が著しく
高くなる場合があったり、Ｗ／Ｏ型オイルアジュバント
と比較すると、安定して免疫を誘導することが難しいな
どの問題があった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、製剤として
の保存安定性や接種部位における局所反応等が改善さ
れ、かつ高い免疫効果を発揮する、Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイル
アジュバントワクチンを提供することを目的とするもの
である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するため鋭意検討した結果、Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイ
ルアジュバントワクチンにおいて、外水相に特定の分子
量を有するポリエチレングリコール誘導体を特定量配合
することにより、当該Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバント
ワクチンが、製剤として高い安定性を有し、局所反応等
の安全面で優れると共に、高いアジュバント効果を有す
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】すなわち本発明は以下の通りである。（１）Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンであっ
て、外水相が分子量４００〜２０，０００の下記一般式
（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール誘導体を０．
５〜２０重量％含有し、且つ内水相が生物学的に許容さ
れる有効量の抗原を含有することを特徴とするオイルア
ジュバントワクチン。

【００１４】

【化２】

【００１５】（式中、Ｒ¹およびＲ²は、同一または異な
っていても良く、水素原子または炭素数１〜４のアルキ
ル基を表し、ｎは重合度を表す。）（２）一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール
誘導体の分子量が１，０００〜１０，０００である、上
記（１）に記載のオイルアジュバントワクチン。（３）一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール
誘導体の外水相中の含有量が１〜１０重量％である、上
記（１）に記載のオイルアジュバントワクチン。（４）常温で液状を呈する油性成分（Ａ）、乳化剤
（Ｂ）および生物学的に許容される有効量の抗原を含有
する水性成分（Ｃ）を含んで調製されるＷ／Ｏエマルシ
ョンを、乳化剤（Ｄ）および水性成分（Ｅ）を含む液に
分散・乳化させることにより調製されるＷ／Ｏ／Ｗ型オ
イルアジュバントワクチンであって、当該液が、分子量
が４００〜２０，０００の一般式（Ｉ）で表されるポリ
エチレングリコール誘導体を０．５〜２０重量％含有す
る、上記（１）に記載のオイルアジュバントワクチン。（５）常温で液状を呈する油性成分（Ａ）、乳化剤
（Ｂ）および生物学的に許容される有効量の抗原を含有
する水性成分（Ｃ）を含んで調製されるＷ／Ｏエマルシ
ョンを、乳化剤（Ｄ）および水性成分（Ｅ）を含む液に
分散・乳化させることにより調製されるＷ／Ｏ／Ｗ型オ
イルアジュバントワクチンに、分子量が４００〜２０，
０００の一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコー
ル誘導体を、外水相中の含有量が０．５〜２０重量％と
なるように添加する、上記（１）に記載のオイルアジュ
バントワクチン。（６）常温で液状を呈する油性成分（Ａ）が、油相に対
して２０重量％以上の脂肪酸エステルおよび／またはス
クアレンを含有する上記（４）または（５）に記載のオ
イルアジュバントワクチン。（７）乳化剤（Ｂ）が、ＨＬＢ１０未満の乳化剤であ
る、上記（４）または（５）に記載のオイルアジュバン
トワクチン。（８）乳化剤（Ｂ）が、多価アルコールと脂肪酸との部
分エステル、ポリオキシエチレン鎖を有する非イオン系
界面活性剤から選ばれる１種以上を含有する上記（７）
に記載のオイルアジュバントワクチン。（９）乳化剤（Ｄ）が、ＨＬＢが１０以上の乳化剤であ
る、上記（４）または（５）に記載のオイルアジュバン
トワクチン。（１０）乳化剤（Ｄ）が、ポリオキシエチレン鎖を有す
る非イオン系界面活性剤を含有する上記（９）に記載の
オイルアジュバントワクチン。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明のオイルアジュバントワク
チンは常温で液状を呈する油性成分（Ａ）、乳化剤
（Ｂ）および生物学的に許容される有効量の抗原を含有
する水性成分（Ｃ）を含んで調製される（第１工程）Ｗ
／Ｏエマルションを、乳化剤（Ｄ）および水性成分
（Ｅ）を含む液に分散・乳化させること（第２工程）に
より調製され、最終的に得られるＷ／Ｏ／Ｗ型オイルア
ジュバントワクチンの外水相に特定の分子量を有するポ
リエチレングリコール誘導体を特定量含有することを特
徴とする。常温で液状を呈する油性成分（Ａ）は、第１
工程で調製されるＷ／Ｏエマルションにおいては連続相
を構成し、第２工程を経て得られるＷ／Ｏ／Ｗ型オイル
アジュバントワクチンにおいては分散相である油相を構
成する。本発明において単に油相という時は、当該Ｗ／
Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンにおける油相を意
味する。この明細書において「常温」とは、１５〜２５
℃の範囲内の温度を意味する。常温で液状を呈する油性
成分（Ａ）としては、従来、一般的に食品や医薬品、化
粧品などに用いられているエステル系油性基剤、あるい
は非エステル系油性基剤のうち、常温で液状を示すもの
から種々選択、使用することができる。

【００１７】常温で液状を示す非エステル系油性基剤と
しては、たとえば軽質流動パラフィンやスクアレン、ス
クアラン、ポリブテンなどの炭化水素、カプリル酸やカ
プリン酸などの中鎖飽和脂肪酸、あるいはオレイン酸、
リノール酸、リノレン酸などの長鎖不飽和脂肪酸などの
脂肪酸類や、中鎖あるいは長鎖の脂肪族アルコール類な
どが挙げられる。また、常温で液状を示すエステル系油
性基剤としてはカプリル酸やカプリン酸などの中鎖の飽
和脂肪酸やオレイン酸やリノール酸などの長鎖の不飽和
脂肪酸とアルコールから誘導される種々の脂肪酸エステ
ルの他、天然由来の脂肪酸エステルであるピーナッツ
油、オリーブ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ホホバ油
などの液状の植物油、あるいは動物由来の液状油である
オレンジラフィー油などが挙げられる。

【００１８】油性成分（Ａ）として、これらのうちから
所望により１種あるいは２種以上を混合して用いる。こ
れらの油性成分の中でも、脂肪酸エステル類、植物油、
あるいはスクアレンといった油は、酸化安定性が比較的
高いことに加え、生体に対する親和性が高いという長所
を有しているので、本発明のオイルアジュバントワクチ
ンに用いる油性成分としてはこれらの油から、１種ある
いは、２種以上を選択するのが好ましい。特に、脂肪酸
エステルとしては生体脂質の構成成分でもある炭素数１
６から２２のシス−Δ９−不飽和脂肪酸と、炭素数１か
ら３のアルコールとのエステル化物からなる油性基剤を
選択するのが好ましい。

【００１９】さらに脂肪酸エステルおよび／またはスク
アレンを、油相中少なくとも２０重量％以上含有するよ
うに用いることによって、最終的に得られるオイルアジ
ュバントワクチンの局所反応等の副作用をより一層軽減
し、安全性を向上させることが可能となる。脂肪酸エス
テルとスクアレンを併用する場合にはその合計量が油相
中少なくとも２０重量％以上となるように含有させれば
よい。

【００２０】本発明において、オイルアジュバントワク
チンを構成する乳化剤（Ｂ）および乳化剤（Ｄ）は、一
般に医薬品や食品などに使用されている界面活性剤の中
から、生体に対して安定性の高いものを１種あるいは２
種以上を選択して用いることができる。

【００２１】乳化剤（Ｂ）は第１工程、すなわち抗原を
含有する水性成分（Ｃ）と油性成分（Ａ）とによって構
成されるＷ／Ｏエマルションの調製において使用され
る。乳化剤（Ｂ）として用いる界面活性剤としては、最
終的に得られるＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチ
ンの安定性を考慮すると親油性のもの、即ちＨＬＢ（Hy
drophilic-Lipophile Balance:親水親油バランス）が比
較的小さいものが好ましく、特にＨＬＢが１０未満のも
のが好ましい。当該乳化剤(Ｂ)は所望により１種あるい
は２種以上を組み合わせて用いることもでき、その場
合、全体のＨＬＢが１０未満となるように当該乳化剤
（Ｂ）を選択するのが好ましい。

【００２２】より具体的には、ソルビタン脂肪酸エステ
ル（ソルビタンモノオレート、ソルビタンジオレート、
ソルビタンセスキオレートなど）やグリセロール脂肪酸
エステル（グリセロールモノオレートなど）、ポリグリ
セロール脂肪酸エステル（ジグリセロールモノオレー
ト、ジグリセロールジオレートなど）などの多価アルコ
ールと脂肪酸の部分エステルやポリソルベートをはじめ
とするポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル
（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート
など）、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシ
エチレンポリオキシプロピレングリコールなど分子内に
ポリオキシエチレン鎖を有する非イオン系界面活性剤な
どが用いられる。また、天然のレシチンを含むグリセロ
リン脂質を使用することもできる。この中でも特に、ソ
ルビタンやグリセロール、ポリグリセロールのように分
子内に３個〜１０個の水酸基を有する多価アルコールと
炭素数１２〜２０の脂肪酸との部分エステルと、ポリオ
キシエチレン硬化ひまし油に代表されるポリオキシエチ
レン鎖を付加したヒドロキシ脂肪酸トリグリセライドを
全体のＨＬＢが１０未満となるよう組み合わせて用いる
ことで、製剤としての安定性がより優れたＷ／Ｏ／Ｗ型
オイルアジュバントワクチンが調製できる。

【００２３】なお本明細書中では、「ＨＬＢ」は、W.C.
Griffinによって提唱された式（W.C.Griffin,J.Soc.Cos
metic.Chemists,１,311(1949)参照）に従って求めてい
る。

【００２４】また、本発明のオイルアジュバントワクチ
ン調製の際、抗原液を含有するＷ／Ｏエマルションを構
成する成分として、アミノ酸またはその塩および分子内
に少なくとも５個の水酸基を有する非還元性の糖または
糖アルコールを含有する水溶液と、３個以上の水酸基を
有する多価アルコールと脂肪酸との部分エステルで常温
で液状を呈する非イオン系界面活性剤とを予め混合して
なる乳化剤組成物を上記乳化剤（Ｂ）と共に使用するこ
とにより、オイルアジュバントの有効性、製剤安定性を
さらに高めることが可能である。ここで水溶液として用
いるアミノ酸またはその塩と糖または糖アルコールは食
品や日本薬局方医薬品、日本薬局方外医薬品として一般
に使用されているものの中から選択して使用できる。た
とえば、アミノ酸またはその塩としては、グリシン、ア
ラニン、アルギニン塩酸塩、ヒスチジン、フェニルアラ
ニンや、アスパラギン酸ナトリウム、アスパラギン酸カ
リウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウ
ムおよびそれらの水和物などが挙げられ、糖、または糖
アルコールとしてはトレハロース、キシリトール、ソル
ビトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトール
などが好ましく選択される。

【００２５】上記乳化剤組成物は、上記のアミノ酸また
はその塩と上記の糖または糖アルコールを含有する水溶
液を調製した後、当該水溶液を上記の非イオン系界面活
性剤との重量比が１０：１〜１：１となるような範囲で
混合、攪拌することにより調製される。当該乳化剤組成
物は、抗原液を含有するＷ／Ｏエマルション中、１〜２
０重量％程度、好ましくは２〜１０重量％程度となるよ
うに使用される。

【００２６】乳化剤（Ｄ）は第２工程、すなわち上述の
Ｗ／Ｏエマルションを乳化剤（Ｄ）と水性成分（Ｅ）を
含む液に分散・乳化する工程で使用する。乳化剤（Ｄ）
として用いる界面活性剤としては、最終的に得られるＷ
／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの安定性を考慮
すると親水性のもの、即ち比較的ＨＬＢの大きいものが
好ましく、特にＨＬＢが１０以上のものが好ましい。当
該乳化剤（Ｄ）は所望により１種あるいは２種以上を組
み合わせて用いることができ、その場合、全体のＨＬＢ
が１０以上となるように当該乳化剤（Ｄ）を選択するの
が好ましい。

【００２７】より具体的には、ポリソルベート、ポリオ
キシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオ
キシプロピレングリコールなど分子内にポリオキシエチ
レン鎖を有する非イオン系界面活性剤でＨＬＢが１０以
上のものが用いられる。また、これらの界面活性剤とソ
ルビタン脂肪酸エステルやグリセロール脂肪酸エステ
ル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセロール脂肪酸エ
ステルなどの多価アルコールと脂肪酸の部分エステル、
天然のレシチンを含むグリセロリン脂質などを組み合わ
せて使用することも可能である。その中でも特にポリオ
キシエチレンポリオキシプロピレングリコールを単独あ
るいは他の界面活性剤と組み合わせて使用することで、
製剤安定性の優れたＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワ
クチンを調製することが可能になる。

【００２８】乳化剤（Ｂ）または乳化剤（Ｄ）として使
用するグリセロリン脂質としては、たとえば卵黄や大豆
などより抽出、精製されたリン脂質やそれらの水素添加
物のような天然由来のリン脂質、およびアシル基部分や
塩基部分の組成をコントロールした種々の合成リン脂
質、リゾリン脂質などが挙げられる。

【００２９】本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバント
ワクチンにおいて、水性成分（Ｃ）は、第１工程で調製
されるＷ／Ｏエマルションにおいては分散相である水相
を構成し、最終的に得られるＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュ
バントワクチンにおいては分散相である油相中に分散し
て存在する内水相を構成する。当該水性成分（Ｃ）には
各種抗原が含有されている。

【００３０】水性成分（Ｃ）に含有させる抗原として
は、数多くの種類や形態が挙げられる。より具体的には
一般的に用いられている不活化菌体や不活化ウイルス粒
子、不活化マイコプラズマなどのほか、サブユニットワ
クチンで用いられるアタッチメントプロテインやエンベ
ロープ抗原といった病原体の感染防御因子などが挙げら
れる。不活化菌体の菌としては、例えば、豚アクチノバ
シラス(Actinobacilluspleuropneumoniae)、大腸菌(Esc
herichia coli)などのグラム陰性細菌、豚丹毒菌(Erysi
pelothrix rhusiopahtiae)などのグラム陽性細菌などが
挙げられる。不活化ウイルス粒子のウイルスとしては、
例えば日本脳炎ウイルス(Japanese encephalitis viru
s)などが挙げられる。不活化マイコプラズマのマイコプ
ラズマとしては、豚や鶏などのマイコプラズマが挙げら
れる。さらに病原体の感染防御因子として、ニューカッ
スル病ウイルス(New castle disease virus)のＦ蛋白な
どが挙げられる。また、複数の抗原をもちいたコンバイ
ンワクチンとして用いることも可能である。さらに、本
発明のオイルアジュバントワクチンにおいては、抗原に
加えて抗生物質などのような抗原以外の薬効成分を配合
することも当然可能である。抗生物質の例として硫酸カ
ナマイシン、塩酸オキシテトラサイクリンなどが挙げら
れる。抗原の水性成分（Ｃ）中の量は、目的や使用する
抗原などの種類によって生物学的に許容される有効量が
適宜決められる。

【００３１】本発明において、上記抗原は内水相中に含
有されるものであるが、本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイルア
ジュバントワクチンを調製する過程でその抗原の一部が
外水相に漏出した場合も、本発明の効果を損なうもので
はない。

【００３２】本発明において、水性成分（Ｅ）はＷ／Ｏ
／Ｗ型オイルアジュバントワクチンにおいて外水相を構
成する成分である。より具体的には、当該水性成分
（Ｅ）は、最終的に得られるアジュバントワクチンの安
定性と生体安全性を考慮して適宜選択され、例えば生理
食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などが用いられる。

【００３３】本発明において、オイルアジュバントワク
チンの外水相に含有させるポリエチレングリコール誘導
体は、下記一般式（Ｉ）で表される。

【００３４】

【化３】

【００３５】（式中、Ｒ¹およびＲ²は、同一または異な
っていても良く、水素原子または炭素数１〜４のアルキ
ル基を表し、ｎは重合度を表す。）

【００３６】上記一般式（Ｉ）において、Ｒ¹およびＲ²
の炭素数１〜４のアルキル基は、直鎖状または分岐鎖状
のいずれでもよく、その具体例としては、メチル基、エ
チル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、
イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基
が挙げられる。好適なＲ¹、Ｒ²としては、水素原子、メ
チル基、エチル基であり、水素原子が特に好適である。
Ｒ¹とＲ²の好適な組み合わせとしては、水素原子と水素
原子、水素原子とメチル基、水素原子とエチル基、メチ
ル基とメチル基などが挙げられるが、水素原子と水素原
子の組み合わせが特に好適である。ｎは重合度で、分子
量が４００〜２０，０００の範囲内となるような値であ
る。

【００３７】上記一般式（Ｉ）のポリエチレングリコー
ル誘導体の分子量は４００〜２０，０００であり、好ま
しくは１，０００〜１０，０００、特に好ましくは３，
０００〜９，０００である。さらに当該ポリエチレング
リコール誘導体の外水相に対する含有量は、０．５〜２
０重量％、好ましくは１〜１０重量％、更に好ましくは
１〜５重量％である。

【００３８】ポリエチレングリコール誘導体の分子量が
４００未満の場合あるいは含有量が０．５重量％未満の
場合、十分な粘度低減効果が得られないのに加え、アジ
ュバントとしての効果が弱くなる恐れがある。また、ポ
リエチレングリコール誘導体の分子量が２０,０００を
越えると、外水相自体の粘度が上昇する為にオイルアジ
ュバントワクチン全体の粘度が上昇し、よって十分な粘
度低減効果が得られない。さらに含有量が２０重量％を
越える場合は、内水相と外水相の浸透圧に大きな差が生
じてしまうために安定なＷ／Ｏ／Ｗ型のエマルション状
態を維持することが困難になり、結果として安定なオイ
ルアジュバントワクチンを調製することができなくなる
可能性がある。

【００３９】本発明においては、上記ポリエチレングリ
コール誘導体の分子量が高くなるほど、外水相の粘度が
上昇し、結果として最終的に得られるオイルアジュバン
トワクチンの粘度が上昇するため、含有させるポリエチ
レングリコール誘導体の分子量に従って、その含有量を
上記範囲内で調整することが望ましい。

【００４０】本発明においては、上記ポリエチレングリ
コール誘導体のうち、分子量が４００〜２０，０００の
範囲内において、特定の分子量を有する１種のみを使用
してもよく、あるいは分子量の異なる２種以上を組み合
わせて使用してもよい。

【００４１】最終的に得られるオイルアジュバントワク
チンの製剤としての安定性とアジュバント効果を考慮す
ると、外水相に含有させるポリエチレングリコール誘導
体として特に好ましいのは、分子量１０００〜１０，０
００であり、外水相に対する濃度は１〜１０重量％、更
に好ましくは１〜５重量％である。

【００４２】本発明により調製されるオイルアジュバン
トワクチンは、アジュバント効果に優れることに加え、
外水相中に含有するポリエチレングリコール誘導体によ
り粘度が低減されるという特徴をも有している。一般的
にＷ／Ｏ／Ｗ型のエマルションは、内水相に含まれる物
質の影響や内水相と外水相の成分の違いにより、粘度が
大きく上昇したり、Ｗ／Ｏ粒子同土が凝集するなどの現
象がしばしば観察される。特にオイルアジュバントワク
チンに使用する抗原液には、菌体成分や培地成分などの
多様な成分が高濃度に含まれる場合があるため、Ｗ／Ｏ
／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの場合には、全く同
じ処方でも、用いる抗原液の成分の影響によって、Ｗ／
Ｏ／Ｗ型エマルションの粘度や安定性が大きく変化して
しまうことがある。このことは、ワクチンの製造管理上
最も避けるべき事象であり、特に複数の抗原種を混合し
たワクチンを調製する場合には大きな問題となる。しか
し、本発明においては、ポリエチレングリコール誘導体
を外水相に含有させることにより、処方や内水相の成分
に関係なく粘度が低減されるため、そのような問題を大
きく改善することが可能である。また、オイルアジュバ
ントワクチンとしての粘度が高いと、生体に投与する際
の作業性が悪くなるだけでなく、生体内で拡散性が低下
し、注射部位の局所反応や残留性に悪影響を及ぼす可能
性もあるが、ポリエチレングリコール誘導体を外水相に
配合することで、これらを改善することも可能になる。

【００４３】また、Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントの
特性に影響を及ぼす大きな要因の一つとして、外水相中
に分散しているＷ／Ｏエマルションの粒径を挙げること
ができる。一般に、外水相中に分散するＷ／Ｏエマルシ
ョンの粒径が大きくなれば、Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュ
バントでありながら、Ｗ／Ｏ型オイルアジュバントを接
種した場合と同じような挙動が認められ、アジュバント
効果は高くなるが、同時に局所反応のような副作用も強
くなる。さらに粒子同士の合一が起こりやすく、製剤と
しての安定性は低くなる。一方、Ｗ／Ｏエマルションが
比較的小さな粒子である場合は、製剤としての安定性は
高くなり、副作用は少ないが、アジュバント効果もまた
弱くなる。本発明により調製されるＷ／Ｏ／Ｗ型オイル
アジュバントワクチンはＷ／Ｏエマルション粒子が比較
的小さくても、高いアジュバント効果を示すといった特
徴を有しており、製剤としての安定性に優れ、副作用が
少ないことに加え、有効性の面でも優れたオイルアジュ
バントワクチンを調製することが可能である。製剤とし
ての安定性と、副作用の軽減の観点から、Ｗ／Ｏ／Ｗ型
オイルアジュバントワクチンを構成するＷ／Ｏエマルシ
ョン粒子は、実質上すべてが５０μｍ以下で、かつ平均
粒径が２０μｍ以下であることが好ましい。

【００４４】本発明のオイルアジュバントワクチンの製
造方法は特に限定されず、既知の方法に準じて行なうこ
とができる。本発明のオイルアジュバントワクチンを調
製する際、第１の工程で調製するＷ／Ｏエマルション中
の各成分の配合量は、Ｗ／Ｏエマルションに対して、油
性成分（Ａ）が３０〜９０重量％、好ましくは４０〜８
０重量％、乳化剤（Ｂ）が１〜２０重量％、好ましくは
２〜１５重量％、そして抗原を含む水性成分（Ｃ）が５
〜７５重量％、好ましくは１５〜６０重量％の範囲内で
調製するのが望ましい。第２の工程で使用される乳化剤
（Ｄ）の濃度は、乳化剤（Ｄ）、水性成分（Ｅ）および
ポリエチレングリコール誘導体の合計中、０．１〜２０
重量％、好ましくは０．５〜１０重量％とするのが望ま
しい。

【００４５】第２工程におけるＷ／Ｏエマルション（第
１工程で調製される）と、乳化剤（Ｄ）と水性成分
（Ｅ）とを含む液との混合比は、目的あるいは選択する
抗原種に応じて適宜選択される。好ましくはＷ／Ｏエマ
ルション：乳化剤（Ｄ）と水性成分（Ｅ）を含む液が、
重量比で２：１〜１：１０、さらに好ましくは２：１〜
１：５である。

【００４６】本発明において、外水相へのポリエチレン
グリコール誘導体の添加は、予め上述した分子量が４０
０〜２０，０００の上記一般式（Ｉ）で表されるポリエ
チレングリコール誘導体の一部あるいは全量を、上記の
乳化剤（Ｄ）と水性成分（Ｅ）を含む液に添加すること
によって、あるいはいったんＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュ
バントを調製した後、別個に水や生理食塩水または緩衝
液などに溶解させた当該ポリエチレングリコール誘導体
を添加することによって行なうことができる。当該ポリ
エチレングリコール誘導体の添加量は上述のとおりであ
る。

【００４７】また、複数の抗原種を混合したオイルアジ
ュバントワクチンを調製する場合には、後述の如く、ま
ず各抗原種毎にそれぞれの抗原を内水相に含むＷ／Ｏエ
マルションを調製し、それらを混合した後、ポリエチレ
ングリコール誘導体、乳化剤（Ｄ）および水性成分
（Ｅ）を含む液に分散させてもよいし、各抗原でＷ／Ｏ
／Ｗ型オイルアジュバントを調製したのち、混合しても
良い。

【００４８】本発明のオイルアジュバントワクチンに
は、医薬品として当然のことながら、緩衝化剤や防腐
剤、浸透圧調整成分などアジュバント活性には直接関与
しない種々の添加剤を含有させることができる。

【００４９】本発明のオイルアジュバントワクチンの調
製に際しては、内水相に抗原を含有したＷ／Ｏエマルシ
ョンを調製する段階（第１工程）、およびＷ／Ｏエマル
ションを乳化剤（Ｄ）および水性成分（Ｅ）を含む液に
分散・乳化させる段階（第２工程）のいずれにおいて
も、ホモミキサーやホモジナイザー、ＣＬＥＡＲＭＩＸ
（エム・テクニック（株）製）などの一般的な乳化装置
のほか、多孔質膜を利用した膜乳化装置や、高圧ジェッ
ト流乳化装置など、一般に乳化が可能な手段であれば、
どのような装置でも使用することができる。さらに必要
に応じて、メンブランフィルター等を通過させることに
より、本発明のオイルアジュバントワクチンを構成する
Ｗ／Ｏエマルション粒子の粒径を一定粒径以下に揃える
ことも可能である。なお、ワクチンの調製に際して、使
用する各成分については、その特性に応じて、あらかじ
め加熱滅菌か濾過滅菌などの滅菌処理を行なうこともで
きる。

【００５０】また、本発明により調製されたオイルアジ
ュバントワクチンを生体に対して適用する際には、皮
下、筋肉、腹腔などへの注射の他、鼻腔や腸管などの粘
膜を通した投与方法など、種々の投与経路を目的に応じ
て選択することができる。また、生体への投与量ならび
に投与回数は所望の免疫効果が得られるべく設定される
べきであり、通常当分野で行なわれている方法に準じて
行なうことができる。

【００５１】

【実施例】つぎに、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが本発明はこれらの実施例のみに限定される
ものではない。本実施例ではポリエチレングリコール誘
導体として、ポリエチレングリコール（以下ＰＥＧ又は
マクロゴールと称することもある）を用いた。

【００５２】［オイルアジュバントワクチンの調製］以
下の各実施例で使用したオイルアジュバントワクチン
は、いずれもＣＬＥＡＲＭＩＸＣＬＭ−０．８Ｓ［エ
ム・テクニック（株）製］を用いて以下に示す方法で調
製した。乳化は室温下で行い、必要に応じて冷却水など
を用いた。なお、処方中の各成分は、各々に適した滅菌
方法により滅菌処理して使用した。また、攪拌、乳化な
どの各操作は、すべて無菌環境下にて行った。なお実施
例中の「部」は「重量部」を表している。「オイルアジ
ュバントワクチンの調製」において、「外水相」とはＷ
／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンを調製する為に
Ｗ／Ｏエマルションと混合する液を意味する。

【００５３】《実施例１：ワクチン１の調製》表１のＷ
／Ｏ−１の組成に基づき、ビーカー中に抗原液以外の各
成分をはかりとった。なお、ポリオキシエチレン硬化ひ
まし油は５０℃に加温、溶解して使用し、グルタミン酸
ナトリウム、ソルビトール水溶液はソルビタンセスキオ
レートと１／１重量比で混合、攪拌した後添加した。処
方中の残りのソルビタンセスキオレートはそのまま添加
した。これに抗原液を攪拌しながら徐々に加え、常温に
て、ＣＬＥＡＲＭＩＸＣＬＭ−０．８Ｓ［エム・テク
ニック（株）製］を用いて、１２，０００ｒｐｍで５分
間攪拌混合し、Ｗ／Ｏ型エマルション（Ｗ／Ｏ−１）を
調製した。

【００５４】次に、表３の外水相１の組成に従い、各成
分をリン酸緩衝生理食塩水(PBS, Phosphate Buffered S
aline,pH7.4)に溶解した（外水相１）。ビーカー中に、
上記Ｗ／Ｏ−１を１部と外水相１を１部はかりとり、Ｃ
ＬＥＡＲＭＩＸＣＬＭ−０．８Ｓを用いて９，０００
ｒｐｍで５分間混合して、オイルアジュバントワクチン
１を調製した。なお、以下の実施例、比較例のワクチン
調製において、Ｗ／Ｏエマルションと外水相との混合
は、特に方法を規定したものを除いて、すべて実施例１
と同じ攪拌条件で行った。

【００５５】《実施例２：ワクチン２の調製》実施例１
で調製したＷ／Ｏ型エマルション（Ｗ／Ｏ−１）を１部
と、表３の外水相２の組成に従って調製した外水相２を
１部はかりとり、オイルアジュバントワクチン２を調製
した。

【００５６】《実施例３：ワクチン３の調製》表１のＷ
／Ｏ−２の組成に基づき、ビーカー中に抗原液以外の各
成分をはかりとった。なお、ポリオキシエチレン硬化ひ
まし油は５０℃に加温、溶解して使用し、日本薬局方マ
クロゴール６０００はあらかじめ抗原液に均一に溶解し
た。実施例１と同様の条件でＷ／Ｏ型エマルションを調
製した（Ｗ／Ｏ−２）。次に、Ｗ／Ｏ−２を３部と、表
３の外水相３の組成に従って調製した外水相３を２部は
かりとり、オイルアジュバントワクチン３を調製した。

【００５７】《実施例４：ワクチン４の調製》表３の外
水相４の組成に従って各成分をはかりとった。約６０℃
に加温し、十分に混合、分散したものを室温まで冷却
し、外水相４として使用した。次に、実施例３で調製し
たＷ／Ｏ型エマルション（Ｗ／Ｏ−２）を１部と、外水
相４を３部はかりとり、オイルアジュバントワクチン４
を調製した。

【００５８】《実施例５：ワクチン５の調製》表１のＷ
／Ｏ−３の組成に基づき、ビーカー中に抗原液以外の各
成分をはかりとった。実施例１と同様に、抗原液を攪拌
しながら徐々に加え、実施例１と同様にＷ／Ｏ型エマル
ション（Ｗ／Ｏ−３）を調製した。次に、このＷ／Ｏ型
エマルション（Ｗ／Ｏ−３）を２部と外水相２を３部ビ
ーカー中にはかりとり、オイルアジュバントワクチン５
を調製した。

【００５９】《実施例６：ワクチン６の調製》実施例５
で調製したＷ／Ｏ型エマルション（Ｗ／Ｏ−３）を２部
と、表４の外水相５の組成に従って調製した外水相５を
２部はかりとり、ＣＬＥＡＲＭＩＸＣＬＭ−０．８Ｓを
用いて、９，０００ｒｐｍ、５分間混合、乳化した後、
１０重量％となるようＰＢＳに溶解した日本薬局方マク
ロゴール６０００溶液１部を添加して軽く混合し、オイ
ルアジュバントワクチン６を調製した。

【００６０】《実施例７：ワクチン７の調製》表２のＷ
／Ｏ−４の組成に基づき、ビーカー中に抗原液以外の各
成分をはかりとり、ＣＬＥＡＲＭＩＸＣＬＭ−０．８
Ｓを用いて、実施例１と同様にＷ／Ｏ型エマルションを
調製した（Ｗ／Ｏ−４）。次に、Ｗ／Ｏ−４を１部と、
表３の外水相４の組成に従って調製した外水相４を１部
はかりとり、オイルアジュバントワクチン７を調製し
た。

【００６１】《実施例８：ワクチン８の調製》表２のＷ
／Ｏ−５の組成に基づき、ビーカー中に抗原液以外の各
成分をはかりとった。なお、ポリオキシエチレン硬化ひ
まし油は６０℃に加温、溶解して使用した。抗原液を攪
拌しながら徐々に加え、実施例１と同様にＷ／Ｏ型エマ
ルションを調製した（Ｗ／Ｏ−５）。次に、このＷ／Ｏ
型エマルション（Ｗ／Ｏ−５）を１部と外水相２を１部
はかりとり、オイルアジュバントワクチン８を調製し
た。

【００６２】《実施例９：ワクチン９の調製》表２のＷ
／Ｏ−６の組成に基づき、ビーカー中に抗原液以外の各
成分をはかりとった。なお、卵黄レシチンは油相に均一
に溶解し、ポリオキシエチレン硬化ひまし油は６０℃に
加温して、溶解した後使用した。抗原液を攪拌しながら
徐々に加え、実施例１と同様にＷ／Ｏ型エマルションを
調製した（Ｗ／Ｏ−６）。次に、このＷ／Ｏ型エマルシ
ョン（Ｗ／Ｏ−６）を３部と外水相３を２部はかりと
り、オイルアジュバントワクチン９を調製した。

【００６３】《比較例１：ワクチン１０の調製》実施例
１で調製したＷ／Ｏ−１の１部と、表４に示した外水相
５の１部をはかりとり、オイルアジュバントワクチン１
０を調製した。

【００６４】《比較例２：ワクチン１１の調製》実施例
１で調製したＷ／Ｏ−１の１部と、表４に示した外水相
６の１部をはかりとり、オイルアジュバントワクチン１
１を調製した。

【００６５】《比較例３：ワクチン１２の調製》実施例
３で調製したＷ／Ｏ−２の３部と、表４に示した外水相
７の２部をはかりとり、オイルアジュバントワクチン１
２を調製した。

【００６６】《比較例４：ワクチン１３の調製》実施例
５で調製したＷ／Ｏ−３の２部と、表４に示した外水相
５の３部をはかりとり、オイルアジュバントワクチン１
３を調製した。

【００６７】《比較例５：ワクチン１４の調製》実施例
７で調製したＷ／Ｏ−４の１部と、表４に示した外水相
８の１部をはかりとり、オイルアジュバントワクチン１
４を調製した。

【００６８】《比較例６：ワクチン１５の調製》実施例
８で調製したＷ／Ｏ−５の１部と、表４に示した外水相
６の１部をはかりとり、オイルアジュバントワクチン１
５を調製した。

【００６９】《比較例７：ワクチン１６の調製》実施例
９で調製したＷ／Ｏ−６の３部と、表４に示した外水相
７の２部をはかりとり、オイルアジュバントワクチン１
６を調製した。

【００７０】なお、実施例、比較例の各ワクチンに使用
したＷ／Ｏエマルションの組成を表１、２に、外水相の
組成を表３、４に、そして各ワクチンにおけるＷ／Ｏエ
マルションと外水相の配合割合を表５にそれぞれまとめ
て記載した。

【００７１】

【表１】

【００７２】

【表２】

【００７３】

【表３】

【００７４】

【表４】

【００７５】

【表５】

【００７６】［免疫試験］次に実際に種々の抗原を含有
するオイルアジュバントワクチンについて、免疫試験を
行った。各試験例中で用いているワクチンの記号は、そ
のワクチンが、前記実施例および比較例の各々の記号に
対応した処方に基づいて調製されたものであることを示
している。

【００７７】《試験例１：豚丹毒（Ｅｒ）不活化ワクチ
ン》Erysipelothrix rhusiopahtiae ＳＥ−９株(AMERIC
AN TYPE CULTURE COLLECTION)を５％牛血清加ブレイン
ハートインフュージョンブロス（ＢＨＩＢ）にて培養
し、ホルマリンで不活化したものを抗原とし、ワクチン
１、３、５、７、１０、１２、１４を調製した。調製に
際しては、各ワクチン中の抗原量が５．０×１０⁸ＣＦ
Ｕ／ｍｌとなるようリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を
用いて適宜抗原濃度を調整した。また、各ワクチンにつ
いて抗原液の代わりにＰＢＳを用いたプラセボを調製
し、それぞれのワクチンを対応するプラセボを用いて希
釈し、５倍希釈系列を作成した。また、対照としてフロ
イントのインコンプリートアジュバント（ＩＦＡ）、Ｉ
ＦＡの内水相にＰＥＧ１０００を５％添加（対内水相）
したアジュバント（ＩＦＡ−ＰＥＧ）および水酸化アル
ミニウムゲルをアジュバントとして用いたワクチンにつ
いても調製した。

【００７８】各ワクチン（あるいは希釈ワクチン）を１
群５匹の５週齢クリーンマウスの内股部皮下に０．２５
ｍｌ／匹で接種した。免疫３週間後に、ＥｒＦｕｊｉ
ｓａｗａ株（社団法人動物用生物学的製剤協会）を２．
２×１０⁶ＣＦＵ／０．１ｍｌ／匹の量で各マウスに内
股部皮下注射し、注射後１０日間生死を観察し、５０％
生存ワクチン希釈倍数（ＰＤ₅₀）を算出した。また免疫
２週間後に、ワクチン原液および５倍希釈ワクチンを接
種したマウス（各処方につき計１０匹）について注射局
所の触診を行って硬結の程度を調べた。硬結の程度は５
段階でスコア化し（０；無し、１；軽度〜４；重度）、
各処方についてその平均値を算出した。

【００７９】さらに、今回調製したＷ／Ｏ／Ｗ型オイル
アジュバントワクチンの平均粒径をレーザー回折式粒度
分布測定装置ＳＡＬＤ−２１００（島津製作所（株）
製）により測定した。

【００８０】有効性の結果（ＰＤ₅₀）について表６にま
とめた。

【００８１】

【表６】

【００８２】結果は希釈ワクチン（またはワクチン原
液）を接種したマウスの耐過匹数およびＰＤ₅₀値で示し
た。ここでＰＤ₅₀値は、５０％生存ワクチン希釈倍数と
して表してあるため、大きなＰＤ₅₀値を与えるワクチン
ほど有効性が高い。免疫群のワクチン１、３、５、７接
種群はいずれも、１３００以上のＰＤ₅₀を示し、ＩＦＡ
と遜色ない優れた有効性を示した。一方、比較免疫群の
ワクチン１０、１２、１４およびアルミゲルアジュバン
トではＰＤ₅₀が各々５３２．１、３８５．７、２７９．
５、７７．１であり、本発明により調製されたワクチン
のＰＤ₅₀値が有意に高い値であることがわかる。これら
の結果より、本発明により調製されたワクチンの有効性
が非常に優れていることが示された。

【００８３】次に、注射局所の触診結果（硬結の程度の
確認）およびＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチン
の平均粒径を表７に示す。

【００８４】

【表７】

【００８５】免疫群では注射局所の反応はほとんど観察
されず、いずれも高い安全性を示しており、平均粒径は
６．８〜８．１と２０μｍ以下であった。一方、比較免
疫群のＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの平均
粒径もほぼ同等であり、ＩＦＡおよびＩＦＡ−ＰＥＧを
除く比較免疫群の注射局所の反応も小さかった。しか
し、ＩＦＡおよびＩＦＡ−ＰＥＧ注射群のマウスにおい
ては重度の硬結が見られ、非常に高い反応スコアとな
り、ＩＦＡ、ＩＦＡ−ＰＥＧを接種したマウスのうち、
約４分の３以上のマウスが歩行障害をきたしていた。

【００８６】以上の成績は、本発明のオイルアジュバン
トワクチンが優れた有効性を発揮することに加え、注射
局所の反応はアルミゲルワクチンと同様に極めて軽微で
あり、非常に高い安全性を示すことを証明するものであ
る。

【００８７】《試験例２：豚マイコプラズマ感染症不活
化ワクチン》豚血清添加ＢＨＬ培地にて培養したMycopl
asma hyopneumoniae９２−２８株（野外症例より分離さ
れた株；財団法人化学及血清療法研究所）ホルマリン不
活化菌体を用いて、ワクチン２、４、６、１１、１３を
調製した。調製に際しては各ワクチン中の抗原量が８．
０×１０⁸ＣＣＵ／ｍｌとなるようリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）を用いて適宜抗原濃度を調整した。さらに
水酸化アルミニウムゲル（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ社製、ＡＬ
ＨＹＤＲＯＧＥＬ８５、アルミニウム換算９ｍｇ／ｍ
ｌ）をアジュバントとして使用したワクチン（ワクチン
ＡＬ）と、水酸化アルミニウムゲルに日本薬局方マクロ
ゴール４０００を最終濃度４％となるように添加したワ
クチン（ワクチンＡＬ−ＰＥＧ）を同濃度の抗原を含有
するように調製した。

【００８８】各ワクチンを２ｍｌ／頭の量で１群８頭の
ＳＰＦ(Specific Pathogen Free）豚（初回免疫時４週
齢）の頸部筋肉内に２週間隔で２回接種した。２回目免
疫１週間後にMycoplasma hyopneumoniae９２−２８株
（野外症例より分離された株；財団法人化学及血清療法
研究所）感染豚由来肺乳剤（３×１０⁶ＣＣＵ／６ｍｌ
／頭）を気管内に投与し、投与４週間後に解剖し、肺病
変を観察した。それぞれの肺病変をスコア化し、非免疫
対照豚の病変に対する各ワクチンの病変減少率（％）を
算出した。結果を表８に示す。

【００８９】

【表８】

【００９０】ワクチン２、４、６を接種した免疫群はい
ずれも病変減少率が６０％を上回り、優れた有効性を示
した。ＰＥＧを二次乳化後に添加したワクチン６につい
ても他の免疫群とほとんど同様の効果が認められた。一
方、比較免疫群であるワクチン１１、１３は、病変減少
率がそれぞれ３９．８％、２６．０％にとどまり、さら
にアルミゲルワクチンはＰＥＧ添加の有無に関わらず、
ワクチンによる病変の軽減が全く認められなかった。

【００９１】以上の成績は、マイコプラズマを抗原とし
た場合においても、本発明のオイルアジュバントワクチ
ンが優れた効果を有することを証明するものであり、さ
らに外水相へのＰＥＧの添加が二次乳化前後のいずれで
あっても有効であることを示すものである。

【００９２】［エマルションの粘度測定］次に、調製し
たＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンについて、
粘度測定を行った。測定には前述の試験例１で調製した
豚丹毒(Erysipelothrix rhusiopahtiae)ワクチン（ワク
チン１、３、５、７、１０、１２、１４）に加え、同一
抗原液処方で比較できるように当該豚丹毒を同様に抗原
として用いて、ワクチン２、４、６、８、９、１１、１
３、１５、１６の各処方に従って調製した各種ワクチン
についても測定を行った。また粘度の測定は、ワクチン
調製１週間後に、Ｅ型回転粘度計［東機産業（株）製、
ＲＥ１０５Ｈ型］を用いて、２５℃で実施した。結果を
表９に示す。

【００９３】

【表９】

【００９４】粘度測定の結果、表９示したように、実施
例のワクチンは２５℃における粘度がすべて５０ｍＰａ
・ｓ以下であり、非常に低粘度で容易に注射可能であっ
たのに対し、比較例のワクチンは１５０ｍＰａ・ｓ以上
の粘度を示し、注射の際にかなり強い力と時間を要し
た。

【００９５】以上の結果は、本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイ
ルアジュバントワクチンが、外水相にポリエチレングリ
コール誘導体を含有させることによって、その粘度が大
きく低減することを示したものであり、ワクチンの投与
に関して大幅な省力化が可能であることを示すものであ
る。

【００９６】［エマルションの内包率測定］次に、調製
したＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンについ
て、内包率の測定を行った。測定には、前述の試験例２
で使用した豚マイコプラズマワクチン（ワクチン２、
４、６、１１、１３）に加え、同一抗原液処方で比較で
きるように当該マイコプラズマを同様に抗原として用
い、ワクチン１、３、５、７、８、９、１０、１２、１
４、１５、１６の各処方に従って調製した各種ワクチン
についても測定を行った。調製したワクチンは、ＰＢＳ
で希釈後、遠心分離によりエマルション部分と外水相を
分離、採取し、外水相中のタンパク量を測定した。ま
た、Ｗ／Ｏエマルション調製の際に添加した抗原液（内
水相を構成する）中のタンパク量から外水相中のタンパ
ク量を差し引いて内水相中に保持されているタンパク量
を求め、以下の式に従って内包率を算出した。

【００９７】

【数１】

【００９８】ワクチンは調製後４℃に保管し、内包率の
測定は、ワクチン調製の翌日と３ヶ月後に実施した。内
包率の測定結果を表１０に示す。

【００９９】

【表１０】

【０１００】実施例、比較例共に、調製翌日および調製
３ヶ月後において７０％以上の高い内包率を示し、優れ
た安定性を有していた。特に実施例の各ワクチンは、表
９に示したような非常に低い粘度でありながら、優れた
タンパクの内包率を示した。

【０１０１】以上の結果は、本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイ
ルアジュバントワクチンが、粘度が大きく低減されてい
るにも関わらず、高い安定性を有することを証明するも
のである。

【０１０２】前述の表６〜表１０の結果から明らかなよ
うに、本発明のオイルアジュバントワクチンは、Ｗ／Ｏ
型オイルアジュバントの特徴である優れた有効性と、Ｏ
／Ｗ型オイルアジュバントの特徴である優れた安全性を
共にバランスよく発揮するワクチンであることがわか
る。さらにＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチンの
外水相に特定のポリエチレングリコール誘導体を含有さ
せるという本発明の技術により、内水相に含有する成分
の影響を受けず、しかも安定性を損なうことなく、粘度
が低減された作業性に優れた有用なオイルアジュバント
ワクチンが調製できることがわかる。

【０１０３】

【発明の効果】本発明のＷ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバン
トワクチンは、高いアジュバント効果を発揮すると共
に、局所反応等の副作用が軽減され、且つ製剤安定性に
優れている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者宮原徳治熊本県菊池郡合志町幾久富1866−1445 (72)発明者高瀬公三熊本県菊池郡大津町杉水3410−30 Ｆターム(参考） 4C076 AA18 BB11 CC06 DD01 DD08 DD09 DD23 DD26 DD34 DD38 DD45 DD51 EE23 EE51 FF16 FF36 FF67 4C085 AA03 AA38 EE06 FF12 FF17 FF21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｗ／Ｏ／Ｗ型オイルアジュバントワクチ
ンであって、外水相が分子量４００〜２０，０００の下
記一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール誘導
体を０．５〜２０重量％含有し、且つ内水相が生物学的
に許容される有効量の抗原を含有することを特徴とする
オイルアジュバントワクチン。【化１】（式中、Ｒ¹およびＲ²は、同一または異なっていても良
く、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表し、
ｎは重合度を表す。）
【請求項２】一般式（Ｉ）で表されるポリエチレング
リコール誘導体の分子量が１，０００〜１０，０００で
ある、請求項１に記載のオイルアジュバントワクチン。
【請求項３】一般式（Ｉ）で表されるポリエチレング
リコール誘導体の外水相中の含有量が１〜１０重量％で
ある、請求項１に記載のオイルアジュバントワクチン。
【請求項４】常温で液状を呈する油性成分（Ａ）、乳
化剤（Ｂ）および生物学的に許容される有効量の抗原を
含有する水性成分（Ｃ）を含んで調製されるＷ／Ｏエマ
ルションを、乳化剤（Ｄ）および水性成分（Ｅ）を含む
液に分散・乳化させることにより調製されるＷ／Ｏ／Ｗ
型オイルアジュバントワクチンであって、当該液が、分
子量が４００〜２０，０００の一般式（Ｉ）で表される
ポリエチレングリコール誘導体を０．５〜２０重量％含
有する、請求項１に記載のオイルアジュバントワクチ
ン。
【請求項５】常温で液状を呈する油性成分（Ａ）、乳
化剤（Ｂ）および生物学的に許容される有効量の抗原を
含有する水性成分（Ｃ）を含んで調製されるＷ／Ｏエマ
ルションを、乳化剤（Ｄ）および水性成分（Ｅ）を含む
液に分散・乳化させることにより調製されるＷ／Ｏ／Ｗ
型オイルアジュバントワクチンに、分子量が４００〜２
０，０００の一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリ
コール誘導体を、外水相中の含有量が０．５〜２０重量
％となるように添加する、請求項１に記載のオイルアジ
ュバントワクチン。
【請求項６】常温で液状を呈する油性成分（Ａ）が、
油相に対して２０重量％以上の脂肪酸エステルおよび／
またはスクアレンを含有する請求項４または５に記載の
オイルアジュバントワクチン。
【請求項７】乳化剤（Ｂ）が、ＨＬＢ１０未満の乳化
剤である、請求項４または５に記載のオイルアジュバン
トワクチン。
【請求項８】乳化剤（Ｂ）が、多価アルコールと脂肪
酸との部分エステル、ポリオキシエチレン鎖を有する非
イオン系界面活性剤から選ばれる１種以上を含有する請
求項７に記載のオイルアジュバントワクチン。
【請求項９】乳化剤（Ｄ）が、ＨＬＢが１０以上の乳
化剤である、請求項４または５に記載のオイルアジュバ
ントワクチン。
【請求項１０】乳化剤（Ｄ）が、ポリオキシエチレン
鎖を有する非イオン系界面活性剤を含有する請求項９に
記載のオイルアジュバントワクチン。