JP2001054392A - 変異α−アミラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 特定のアミノ酸配列又は該アミノ酸配列
に対して７０％以上の相同性を有するα−アミラーゼに
おいて、該アミノ酸配列の１６７番目のＧｌｎ、１６９
番目のＴｙｒ、１７８番目のＡｌａ等のアミノ酸残基の
１残基以上を置換又は欠失させてなる変異α−アミラー
ゼ、当該変異α−アミラーゼをコードする遺伝子、ベク
ター、形質転換細胞、形質転換細胞を培養することを特
徴とする変異α−アミラーゼの製造方法、当該変異α−
アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。 【効果】 この変異α−アミラーゼは、高いキレート剤
耐性の優れた特性及びアルカリ領域における高い比活性
を有し、更に熱に対する優れた安定性を有することか
ら、自動食器洗浄機用洗浄剤、衣料用洗浄剤等として有
用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、優れた耐熱性を有
し、特に洗剤用酵素として有用な変異液化型アルカリα
−アミラーゼ及びその遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、α−アミラーゼ [EC.3.2.1.1]を
洗剤用として利用する場合には、澱粉を高ランダムに分
解でき、アルカリ性で安定で且つキレート成分、酸化漂
白成分に対しても安定である液化型アルカリα−アミラ
ーゼが好ましいとされている。しかしながら、液化型ア
ミラーゼは一般に、酵素の構造維持にカルシウムイオン
が重要であり、キレート剤の存在下ではその安定性が低
下し、また作用至適pHに関しても中性ないし弱酸性領域
であるものが殆どであった。

【０００３】斯かる状況の下、本発明者らは、土壌中か
ら分離した好アルカリ性Bacillus sp KSM-K38（FERM BP
-6946）株及び同KSM-K36（FERM BP-6945）株の生産する
酵素が、従来の液化型α−アミラーゼでは失活が認めら
れる高い濃度のキレート剤によって全く活性の低下を示
さず、更に界面活性剤や酸化剤に対する耐性を有してい
ること、また、従来の液化型α−アミラーゼに比べて、
アルカリ側で高い活性を有し洗剤用として有用であるこ
とを見出している(特願平１０−３６２４８７号)。

【０００４】しかし、当該酵素は５０℃以上の温度では
失活を示すことから、衣料や食器の洗浄が１０〜６０℃
付近で行うのが一般的あることを考えるとその耐熱性が
やや不十分であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、アルカリ側
で高い活性を有し、キレート成分、酸化漂白成分に対し
ても安定である液化型アルカリα−アミラーゼであっ
て、且つ優れた耐熱性を有するα−アミラーゼを提供す
ることを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、液化型ア
ルカリα−アミラーゼについて種々の変異酵素を取得、
検討した結果、ＫＳＭ−Ｋ３８由来アミラーゼのアミノ
酸配列（配列番号１）の特定のアミノ酸残基に変異を与
えることにより、キレート剤耐性や酸化剤耐性の特性及
びアルカリ領域に於ける高い比活性を失うことなく耐熱
性が向上すること、またこれらの変異を組み合わせるこ
とによって更なる耐熱化が可能であることを見出した。

【０００７】即ち、本発明は、配列番号１に示されるア
ミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して７０％以上の相
同性を有するα−アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列
の１１番目のＴｙｒ、１６番目のＧｌｕ、４９番目のＡ
ｓｎ、８４番目のＧｌｕ、１４４番目のＳｅｒ、１６７
番目のＧｌｎ、１６９番目のＴｙｒ、１７８番目のＡｌ
ａ、１８８番目のＧｌｕ、１９０番目のＡｓｎ、２０５
番目のＨｉｓ及び２０９番目のＧｌｎのうちのいずれか
に相当するアミノ酸残基の１残基以上を置換又は欠失さ
せてなる変異α−アミラーゼを提供するものである。ま
た本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列又は該
アミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するα−
アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列のアミノ末端から
１１〜１００アミノ酸残基に相当する配列を他の液化型
α−アミラーゼの該アミノ酸配列に相当するアミノ酸配
列に置換させてなる変異α−アミラーゼを提供するもの
である。

【０００８】また本発明は、これらの変異α−アミラー
ゼをコードする遺伝子、該遺伝子を有するベクター、該
ベクターで形質転換された細胞、該形質転換細胞を培養
することを特徴とするこれらの変異α−アミラーゼの製
造方法を提供するものである。更に本発明は、これらの
変異α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供する
ものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の変異α−アミラーゼは、
配列番号１に示したアミノ酸配列又は該配列と７０％以
上の相同性を有するアミノ酸配列を有する液化型アルカ
リα−アミラーゼをコードする遺伝子を変異させて得ら
れるものであるが、アミノ酸の欠失・置換により耐熱性
を向上させた例は従来の液化型α−アミラーゼについて
も行われていた。例えば、B. amyloliquefaciens由来の
酵素において１７７番目のＡｒｇから１７８番目のＧｌ
ｙ残基を欠失させたもの（J. Biol. Chem., 264, 1893
3, 1989)、B. licheniformisの酵素において、１３３番
目のＨｉｓをＴｙｒに置換したもの(J. Biol. Chem., 2
65, 15481, 1990)が報告されている。しかし、本発明で
用いられる液化型アルカリα−アミラーゼは、従来の液
化型α−アミラーゼとのアミノ酸相同性は低く、また上
記の１７７番目のＡｒｇから１７８番目のＧｌｙ残基に
相当する部位は既に欠失しており、また、１３３番目の
Ｈｉｓ相当のアミノ酸は既にＴｙｒであり、従来酵素の
例が必ずしも適用できるものではない。即ち、本発明に
おける耐熱性を向上させるためのアミノ酸配列の変異は
これまでの例とは全く異なるものである。

【００１０】当該液化型アルカリα−アミラーゼの例と
しては、本発明者らが土壌中から分離したBacillus sp.
KSM-K38（FERM BP-6946）株由来であり、配列番号１の
アミノ酸配列を有する酵素（特願平１０−３６２４８７
号）、或いは同KSM-K36(FERMBP-6945) 株由来であって
配列番号１のアミノ酸配列と約９５％の相同性を有する
酵素（配列番号４）（特願平１０−３６２４８７号）等
が挙げられる。尚、アミノ酸配列の相同性はLipman-Pea
rson法（Science, 227, 1435, 1985）によって計算され
る。

【００１１】本発明の変異α−アミラーゼの取得は、先
ず液化型α−アミラーゼを生産する微生物より、当該液
化型α−アミラーゼをコードする遺伝子をクローニング
するが、その方法は、一般的な遺伝子組換え技術を用い
れば良く、例えば、特開平８−３３６３９２号記載の方
法を用いることができる。遺伝子の例としては、配列番
号３及び配列番号５に示されるものが挙げられる。

【００１２】次に得られた遺伝子に対して変異を与える
が、その方法としても一般的に行われている部位特異的
変異の方法であればいずれも採用でき、例えば宝酒造社
のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Exp
ress Kmキット等を用いて行うことができる。また、リ
コンビナントＰＣＲ (polymerase chain reaction)法
(PCR protocols, Academic press, New York, 1990)を
用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子
の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能で
ある。

【００１３】本発明における耐熱化変異は、配列番号１
に示されるアミノ酸配列の１１番目のＴｙｒに相当する
アミノ酸残基をＰｈｅ、１６番目のＧｌｕに相当するア
ミノ酸残基をＰｒｏ、４９番目のＡｓｎに相当するアミ
ノ酸残基をＳｅｒ、８４番目のＧｌｕに相当するアミノ
酸残基をＧｌｎ、１４４番目のＳｅｒに相当するアミノ
酸残基をＰｒｏ、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ
酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ
酸残基をＬｙｓ、１７８番目のＡｌａに相当するアミノ
酸残基をＧｌｎ、１８８番目のＧｌｕに相当するアミノ
酸残基をＡｓｐ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ
酸残基をＰｈｅ、２０５番目のＨｉｓに相当するアミノ
酸残基をＡｒｇ又は２０９番目のＧｌｎに相当するアミ
ノ酸残基をＶａｌに置換する変異が望ましい。

【００１４】また、本発明の配列番号１のアミノ酸配列
のアミノ末端（Ａｓｐ）から１１〜１００アミノ酸残基
に相当するアミノ酸配列、好ましくは、１番目のＡｓｐ
から１９番目のＧｌｙに相当する配列を、他の液化型α
−アミラーゼの該アミノ酸配列に相当するアミノ酸配列
に置換することによっても耐熱化を達成することができ
る。

【００１５】置き換える他の液化型α−アミラーゼの例
としては、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列を
有する酵素が挙げられ、その配列の前記１番目のＡｓｐ
から１９番目のＧｌｙに相当する部位は１番目のＨｉｓ
から２１番目のＧｌｙである。当該酵素は、Bacillus s
p. KSM-AP1378 (FERM BP-3048)株由来の液化型α−アミ
ラーゼであり、その遺伝子配列は特開平８−３３６３９
２号において開示されている。

【００１６】本発明の変異α−アミラーゼにおいては、
更に上記の各種アミノ酸残基の置換又は欠失及びアミノ
酸配列の置換から選ばれる２種以上の置換又は欠失を組
み合わせた変異も有効であり、組み合わせることによ
り、より耐熱性が向上した変異酵素を得ることができ
る。即ち、変異の組み合わせ方は、各種アミノ酸残基の
置換又は欠失の２種以上を組み合わせたもの、アミノ酸
配列の置換を２種以上組み合わせたもの及びアミノ酸残
基の置換又は欠失とアミノ酸配列の置換を２種以上組み
合わせたものが挙げられるが、好ましくは４９番目のＡ
ｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ、１６７番目のＧ
ｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目のＴ
ｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９０番目のＡ
ｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０５番目のＨ
ｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ若しくは２０９番
目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する
変異、又は１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでに
相当する配列を配列番号２に示されるアミノ酸配列の１
番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列
に置換する変異のうちいずれか２種以上の変異を適宜組
み合わせるとよい。

【００１７】更に、最適な組み合わせの例としては、４
９番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅｒ、１６
７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６
９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９
０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０
５番目のＨｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒｇ及び２
０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置
換する変異の組み合わせ、或いは１番目のＡｓｐから１
９番目のＧｌｙまでに相当する配列を配列番号２に示さ
れるアミノ酸配列の１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌ
ｙまでのアミノ酸配列に置換する変異と、１６７番目の
Ｇｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌｕ、１６９番目の
Ｔｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙｓ、１９０番目の
Ａｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈｅ、２０９番目の
Ｇｌｎに相当するアミノ酸残基をＶａｌに置換する変異
の組み合わせ等が挙げられる。

【００１８】また、上記の変異に、耐熱性以外の特性を
改良する変異、例えば、酸化剤耐性をより強化する１０
７番目のＭｅｔに相当するアミノ酸残基をＬｅｕに置換
する変異、更に衣料用洗剤における洗浄力を増強させる
１８８番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＩｌｅに
置換する変異等を組み合わせることも可能である。

【００１９】かくして得られる本発明の変異α−アミラ
ーゼは、高いキレート剤耐性の優れた特性及びアルカリ
領域に於ける高い比活性を失うことなく、熱に対する安
定性が向上することから、自動食器洗浄機用洗浄剤、衣
料用洗浄剤、繊維糊抜き剤として有用である。洗浄剤組
成物中の本発明変異α−アミラーゼの含有量は、０．０
０１〜１０重量％、特に０．０１〜５重量％が好まし
い。

【００２０】当該洗浄剤には、上記変異α−アミラーゼ
以外に、更に枝切り酵素（例えばプルラナーゼ、イソア
ミラーゼ、ネオプルラナーゼなど）、α−グルコシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リ
パーゼ、ペクチナーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチン
酸リアーゼ、パーオキシダーゼ、ラッカーゼ及びカタラ
ーゼから選ばれる１種または２種以上の酵素を含有させ
ることができる。

【００２１】また、洗浄剤には洗浄成分としてアニオン
界面活性剤、両性界面活性剤、ノニオン界面活性剤、カ
チオン界面活性剤等の界面活性剤を１〜９０重量％含有
させることができる。また、キレート剤、アルカリ剤、
無機塩、再汚染防止剤、塩素捕捉剤、還元剤、漂白剤、
蛍光染料可溶化剤、香料、ケーキング防止剤、酵素の活
性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色素、青味付け剤、漂白
活性化剤、酵素安定化剤、調節剤等を含有させることが
できる。

【００２２】本発明の洗浄剤組成物は、上記変異α−ア
ミラーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に
従い、製造することができる。洗浄剤の形態は、用途に
応じて選択することができ、例えば、液体、粉末、顆粒
等にすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、
衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、
配水管洗浄剤、義歯洗浄剤等として使用できるが、特に
衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤と
して好適に使用することができる。

【００２３】また、本発明の変異α−アミラーゼは、澱
粉液化・糖化用組成物として用いることができ、更にグ
ルコアミラーゼ、マルターゼ、プルラナーゼ、イソアミ
ラーゼ、ネオプルラナーゼ、などから選ばれる１種また
は２種以上の酵素を配合し、変異α−アミラーゼととも
に澱粉に作用させることもできる。

【００２４】更に、本発明の変異α−アミラーゼは、繊
維の糊抜き剤組成物として用いることができ、プルラナ
ーゼ、イソアミラーゼ或いはネオプルラナーゼ等の酵素
を共に含有させることもできる。

【００２５】

【実施例】アミラーゼ活性及びタンパク質量の測定 各酵素のアミラーゼ活性及びタンパク質量は以下に示す
方法で行った。アミラーゼ活性測定は、３，５−ジニト
ロサリチル酸法（ＤＮＳ法）で測定した。５０ｍＭグリ
シン緩衝液（ｐＨ１０）中に可溶性澱粉を含む反応液
中、５０℃で１５分間の反応を行った後、生成した還元
糖をＤＮＳ法で定量することによって測定した。酵素の
力価は１分間に１μｍｏｌのグルコースに相当する還元
糖を生成する酵素量を１単位とした。蛋白量の測定は、
牛血清アルブミンを標準として、Bio-Rad社のProtein A
ssayキットを用いて定量した。

【００２６】参考例１ アルカリ液化型アミラーゼのス
クリーニング 土壌約０．５ｇを滅菌水に懸濁し、８０℃で１５分間加
熱処理した。この熱処理液の上清を適当に滅菌水で希釈
して、分離用寒天培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、
これを３０℃で２日間培養し、集落を形成させた。集落
の周囲に澱粉溶解に基づく透明帯を形成するものを選出
し、これをアミラーゼ生産菌として分離した。更に、分
離菌を培地Ｂに接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培
養した。培養後、遠心分離した上清液について、キレー
ト剤（ＥＤＴＡ）耐性能を測定し、更に最適作用pHを測
定して、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ生産菌をス
クリーニングした。

【００２７】上述の方法により、Bacillus sp.KSM-K38
（FERM BP-6946）株及びBacillus sp. KSM-K36（FERM B
P-6945）株を取得することができた。

【００２８】 ＫＳＭ−Ｋ３８株及びＫＳＭ−Ｋ３６株の菌学的性質を
表１に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】参考例２ ＫＳＭ−Ｋ３８株及びＫＳＭ−
Ｋ３６株の培養 参考例１の液体培地Ｂに、ＫＳＭ−Ｋ３８株あるいはＫ
ＳＭ−Ｋ３６株を接種し、３０℃で２日間好気的に振盪
培養した。遠心分離上清についてアミラーゼ活性（ｐＨ
８．５）を測定した結果、培養液１Ｌ当たり、それぞれ
５５７Ｕ及び１１７７Ｕの活性を有していた。

【００３１】参考例３ アルカリ液化型アミラーゼの精
製 参考例２で得られたＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清液に８
０％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて撹
拌後、生成した沈殿を回収し、２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含
む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、
同緩衝液に対して一晩透析した。得られた透析内液を同
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラ
ムに添着し、同緩衝液を用いて０−１Ｍの食塩の濃度勾
配によりタンパクを溶出した。活性画分を同緩衝液にて
透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得た
活性画分を上記緩衝液にて透析することによってポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）及びソデ
ィウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動で単一のバンド
を与える精製酵素を得ることができた。尚、ＫＳＭ−Ｋ
３６株の培養上清液からも同様の方法で精製酵素を得る
ことができた。

【００３２】参考例４ 酵素特性 両精製酵素の特性は以下の通りである。 （１）作用 いずれも、澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれ
らの部分分解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、
アミロースからはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ
２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース
（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサ
オース（Ｇ６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成
する。ただしプルランには作用しない。 （２）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液） いずれも、４０℃、３０分間処理条件下で、ｐＨ６．５
〜１１．０の範囲で７０％以上の残存活性を示す。 （３）作用温度範囲及び最適作用温度 いずれも、２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温
度は５０〜６０℃である。 （４）温度安定性 ５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）中
にて温度を変化させ、各温度で３０分間処理することに
より失活の条件を調べると、いずれも４０℃で８０％以
上の残存活性を示し、４５℃でも約６０％の残存活性を
示した。 （５）分子量 いずれも、ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により測定した分子量は５５，０００±
５，０００である。 （６）等電点 いずれも、等電点電気泳動法により測定した等電点は
４．２付近である。

【００３３】（７）界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル
硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン
酸ナトリウム、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウ
ム、アルキルスルホン酸ナトリウム、ＳＤＳ、石鹸及び
ソフタノール等の各種界面活性剤０．１％溶液中で、ｐ
Ｈ１０、３０℃で３０分間処理しても、いずれも殆ど活
性阻害を受けない（活性残存率９０％以上）。 （８）金属塩の影響 各種金属塩と共存させて、ｐＨ１０、３０℃で３０分間
処理してその影響を調べた。Ｋ３８は、１ｍＭのＭｎ²⁺
により阻害され（阻害率約７５％）、１ｍＭのＳｒ ²⁺及
びＣｄ²⁺により若干阻害される（阻害率約３０％）。Ｋ
３６は、１ｍＭのＭｎ²⁺により阻害され（阻害率約９５
％）、１mMのＨｇ²⁺、Ｂｅ²⁺及びＣｄ²⁺により若干阻害
される（阻害率３０〜４０％）。

【００３４】実施例１ 液化型α−アミラーゼ遺伝子の
クローニング ＫＳＭ−Ｋ３８株の菌体からSaitoとMiuraの方法（Bioc
him. Biophys. Acta, 72, 619, 1961）の方法によって
抽出した染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＫ３８Ｕ
Ｓ（配列番号１９）及びＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を
用いて、ＰＣＲ反応によって配列番号１に示されるアミ
ノ酸配列を有する液化型アルカリα−アミラーゼ（以下
Ｋ３８ＡＭＹと記載）をコードする遺伝子断片（約１．
５ｋｂ）を増幅した。これを制限酵素ＳａｌＩによって
切断後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平６−２１７
７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入することによ
って、ｐＨＳＰ６４に含まれるBacillus sp. KSM-64 (F
ERM P-10482)株のアルカリセルラーゼ遺伝子に由来する
強力プロモーターの下流に、Ｋ３８ＡＭＹの構造遺伝子
が結合した組換えプラスミドｐＨＳＰ−Ｋ３８を構築し
た（図１）。また、同様にBacillus sp. KSM-AP1378 (F
ERM BP-3048)株（特開平９−３３６３９２）から抽出し
た染色体ＤＮＡを鋳型とし、プライマーＬＡＵＳ（配列
番号２１）とＬＡＤＨ（配列番号２２）を用いたＰＣＲ
反応によって増幅した配列番号２に示されるアミノ酸配
列を有する液化型α−アミラーゼ（以下，ＬＡＭＹと記
載）をコードする遺伝子断片（約１．５ｋｂ）を、上記
と同様に発現ベクターｐＨＳＰ６４のＳａｌＩ−Ｓｍａ
Ｉ部位に挿入することによって、組換えプラスミドｐＨ
ＳＰ−ＬＡＭＹを構築した（図１）。

【００３５】実施例２ 変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子の調製
−１ 部位特異的変異には宝酒造社のSite-Directed Mutagene
sis System Mutan-Super Express Kmキットを用いた。
まず、実施例１で得られた組換えプラスミドｐＨＳＰ−
Ｋ３８を鋳型とし、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２
３）及びＫ３８ＤＨ（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反
応を行うことによって、ＫＳＭ−６４株由来の強力プロ
モーターの上流から液化型アルカリα−アミラーゼ遺伝
子の下流までの約２．１ｋｂの断片を増幅させ、これを
上記キットに付属のプラスミドベクターｐＫＦ１９ｋの
ＳｍａＩ部位に挿入し、変異導入用組換えプラスミドｐ
ＫＦ１９−Ｋ３８を構築した（図２）。

【００３６】次に、配列番号６〜１５に示した各種の部
位特異的変異導入用オリゴヌクレオチドプライマーをＴ
４ＤＮＡキナーゼによって５’リン酸化した後、これと
上記のｐＫＦ１９−Ｋ３８を用いて、キットの方法に従
って変異導入反応を行い、反応産物によって大腸菌ＭＶ
１１８４株（コンピテントセルＭＶ１１８４、宝酒造社
製）の形質転換を行った。この結果得られた形質転換体
から組換えプラスミドを抽出し、塩基配列の解析を行っ
て変異の確認を行った。

【００３７】また、変異導入した遺伝子は、上記と同様
にして、発現プロモーター領域と変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝
子部分を再度ｐＫＦ１９ｋのＳｍａＩ部位に挿入するこ
とにより、異なる変異を導入する際の鋳型プラスミドと
なり、上記と同様の方法によって更に別の変異を導入し
た。

【００３８】得られた各変異組換えプラスミドを鋳型と
し、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＫ３８Ｄ
Ｈ（配列番号２０）を用いてＰＣＲ反応を行うことによ
って、各変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子断片を増幅させ、これ
をＳａｌＩによって切断した後、発現ベクターｐＨＳＰ
６４（特開平６−２１７７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ
部位に挿入して、変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用プラスミドを
構築した（図１）。

【００３９】実施例３ 変異Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子の調製
−２（ＬＡＭＹ遺伝子とのキメラ） Ｋ３８ＡＭＹ遺伝子のＮ末領域をＬＡＭＹ遺伝子の相当
する領域と置換する変異にはリコンビナントＰＣＲ法を
用いた（図３）。まず、実施例１で得られた組換えプラ
スミドｐＨＳＰ−Ｋ３８を鋳型とし、プライマーＫ３８
ＤＨ（配列番号２０）及びＬＡ−Ｋ３８（配列番号１
７）を用いてＰＣＲ反応を行うことによって、配列番号
１に示されるＫ３８ＡＭＹのアミノ酸配列のＧｌｎ２０
からＣ末下流までの配列をコードする断片を増幅した。
一方、組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＬＡＭＹを鋳型と
し、プライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＬＡ−Ｋ
３８Ｒ（配列番号１８）を用いたＰＣＲ反応によって、
強力プロモーターの上流から、配列番号２のＬＡＭＹの
アミノ酸配列の２１番目のＧｌｙまでをコードする遺伝
子断片を増幅させた。次に、得られた両ＤＮＡ断片とプ
ライマーＣＬＵＢＧ（配列番号２３）とＫ３８ＤＨ（配
列番号２０）を用いた２回目のＰＣＲ反応を行うことに
よって、末端にプライマーＬＡ−Ｋ３８（配列番号１
７）及びＬＡ−Ｋ３８Ｒ（配列番号１８）に由来する相
補的な配列を持つ両断片が結合し、強力プロモーターの
下流にＬＡＭＹの１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙ
までをコードする領域に続いてＫ３８ＡＭＹのＧｌｎ２
０以降Ｃ末までをコードする領域が結合した置換変異酵
素（ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹと略する）をコードする遺伝子
断片（約２．１ｋｂ）が増幅された。これをＳａｌＩに
よって切断した後、発現ベクターｐＨＳＰ６４（特開平
６−２１７７８１）のＳａｌＩ−ＳｍａＩ部位に挿入し
て、変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用プラスミドを構築した（図
１）。

【００４０】実施例４ 変異液化型アルカリα−アミラ
ーゼの生産 実施例２及び３で得られた各種変異Ｋ３８ＡＭＹ生産用
プラスミドをプロトプラスト法 (Mol. Gen. Genet., 16
8, 111, 1979)により枯草菌ＩＳＷ１２１４株（leuA me
tB5 hsdM1）に導入し、得られた組換え枯草菌を液体培
地（コーンスティープリカー、８％；肉エキス、１％；
リン酸１カリウム、０．０２％；マルトース、５％；塩
化カルシウム、５ｍＭ；テトラサイクリン、１５μｇ／
ｍＬ）で３０℃で３日間培養した。得られた培養上清液
をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）にて透析し、
同緩衝液にて平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ
カラムに吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出さ
せた。この溶出液を１０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１
０．０）にて透析することにより、各変異Ｋ３８ＡＭＹ
の精製酵素を得た。

【００４１】実施例５ 耐熱性の検定−１ 実施例１、２、４に記載の方法により、配列番号１にお
ける１１番目のＴｙｒをＰｈｅに置換した酵素（Ｙ１１
Ｆと略する）、４９番目のＡｓｎをＳｅｒに置換した酵
素（Ｎ４９Ｓと略する）、８４番目のＧｌｕをＧｌｎに
置換した酵素（Ｅ８４Ｑと略する）、１４４番目のＳｅ
ｒをＰｒｏに置換した酵素（Ｓ１４４Ｐと略する）、１
６７番目のＧｌｎをＧｌｕに置換した酵素（Ｑ１６７Ｅ
と略する）、１６９番目のＴｙｒをＬｙｓに置換した酵
素（Ｙ１６９Ｋと略する）、１７８番目のＡｌａをＧｌ
ｎに置換した酵素（Ａ１７８Ｑと略する）、１８８番目
のＧｌｕをＡｓｐに置換した酵素（Ｅ１８８Ｄと略す
る）、１９０番目のＡｓｎをＰｈｅに置換した酵素（Ｎ
１９０Ｆと略する）、及び２０９番目のＧｌｎをＶａｌ
に置換した酵素（Ｑ２０９Ｖと略する）の精製標品を取
得し、次に示す手法で耐熱性を検定した。対照として野
生型Ｋ３８ＡＭＹを用いた。

【００４２】あらかじめ５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ
１０．０）を５０℃にてプレインキュベートした中に、
約１．２Ｕ／ｍＬとなるよう酵素を添加後、３０分後に
サンプリングし、上記実施例に示す方法で残存するアミ
ラーゼ活性を測定した。それぞれのスタート時の活性を
１００％として相対活性を求め、アミラーゼ残存活性と
した。結果を表２に示したが、野生型Ｋ３８ＡＭＹでは
３０分後の残存活性が、１５％まで減少したことに対
し、いずれの変異酵素も野生型に比べて高い残存活性を
示した。

【００４３】

【表２】

【００４４】実施例６ 耐熱性の検定−２ 実施例５に示した変異のうち、Ｑ１６７Ｅ、Ｙ１６９
Ｋ、Ｎ１９０Ｆ及びＱ２０９Ｖを次の様に組み合わせた
変異酵素を実施例１、２、４に記載の方法により作製し
た。 Ｑ１６７Ｅ／Ｙ１６９Ｋ（配列番号１６のプライマー使
用、ＱＥＹＫと略する） Ｎ１９０Ｆ／Ｑ２０９Ｖ（ＮＦＱＶと略する） Ｑ１６７Ｅ／Ｙ１６９Ｋ／Ｎ１９０Ｆ／Ｑ２０９Ｖ（Ｑ
ＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する）

【００４５】これらについて実施例５と同様の手法によ
り耐熱性を検定した。ただし、熱処理の温度は５５℃と
し、対照として、Ｑ１６７Ｅ、Ｙ１６９Ｋ、Ｎ１９０Ｆ
及びＱ２０９Ｖを用いた。この結果、表３に示した様
に、いずれの変異も、組み合わせによる耐熱性の向上が
認められ、４種類の変異を組み合わせたＱＥＹＫ／ＮＦ
ＱＶは５５℃においても３０分後に８５％の残存活性を
示した。

【００４６】

【表３】

【００４７】実施例７ 耐熱性の検定−３ 実施例６に示した変異ＮＦＱＶに、実施例５で示した変
異とＳ１４４Ｐを組み合わせた変異酵素、更にこれに１
６番目のＧｌｕをＰｒｏに置換する変異（Ｅ１６Ｐと略
する）と組み合せた変異酵素を実施例１、２、４に記載
の方法により作製した。 Ｓ１４４Ｐ／ＮＦＱＶ（ＳＰ／ＮＦＱＶと略する） Ｅ１６Ｐ／Ｓ１４４Ｐ／ＮＦＱＶ（ＥＰＳＰ／ＮＦＱＶ
と略する） これらについて実施例５と同様の手法（５０℃）により
耐熱性を検定した。この結果、表４に示した様に、ＳＰ
／ＮＦＱＶに対してＥ１６Ｐを組み合わせることで耐熱
性の向上が認められた。

【００４８】

【表４】

【００４９】実施例８ 耐熱性の検定−４ 実施例４に示した変異のうちＱＥＹＫ／ＮＦＱＶに、配
列番号１における１０７番目のＭｅｔをＬｅｕに置換し
た変異（Ｍ１０７Ｌと略する）、２０５番目のＨｉｓを
Ａｒｇに置換した変異（Ｈ２０５Ｒと略する）及び実施
例３で示した変異のうちＮ４９Ｓを組み合わせた次のよ
うな変異酵素を実施例１、２、４に記載の方法により作
製した。 Ｍ１０７Ｌ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶ（ＭＬ／ＱＥＹＫ／Ｎ
ＦＱＶと略する） Ｎ４９Ｓ／Ｍ１０７Ｌ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶ（ＮＳＭＬ
／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する） Ｎ４９Ｓ／Ｍ１０７Ｌ／Ｈ２０５Ｒ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱ
Ｖ（ＮＳＭＬＨＲ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶと略する） これらについて実施例５と同様の手法により耐熱性を検
定した。ただし、熱処理の温度は６０℃とした。この結
果、ＭＬ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶにＮ４９Ｓ、更にはＨ２
０５Ｒを組み合わせることによって耐熱性は相加的に向
上し、ＮＳＭＬＨＲ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶは６０℃にお
いても３０分後に７５％の残存活性を示した（表５）。

【００５０】

【表５】

【００５１】実施例９ 耐熱性の検定−５ 実施例１、３、４に示した方法によって、Ｋ３８ＡＭＹ
のＡｓｐ１から１９番目のＧｌｙまでの配列がＬＡＭＹ
の１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでの配列と置
換した変異酵素ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹを取得した。この酵
素の耐熱性を実施例５の方法によって検定した結果、表
６に示した様に、置換による耐熱性の向上が認められ
た。

【００５２】

【表６】

【００５３】実施例１０ 耐熱性の検定−６ 実施例６に示した変異酵素ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶの遺伝子
について、実施例１及び３と同様の方法により、１番目
のＡｓｐから１９番目のＧｌｙまでの配列がＬＡＭＹの
１番目のＨｉｓから２１番目のＧｌｙまでの配列と置換
する変異を導入した。この遺伝子を用いて実施例４の方
法により得られた変異酵素ＬＡ−Ｋ３８ＡＭＹ／ＱＥＹ
Ｋ／ＮＦＱＶについて実施例８と同様の手法により耐熱
性を検定した（熱処理は６０℃）。この結果、組み合わ
せによって耐熱性は相加的に向上し、ＬＡ−Ｋ３８ＡＭ
Ｙ／ＱＥＹＫ／ＮＦＱＶは６０℃に於いても３０分後に
６３％の残存活性を示した（表７）。

【００５４】

【表７】

【００５５】実施例１１ 自動食器洗浄機用洗浄剤組成
物 表８に示す配合で自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を製造
し、本洗浄剤に各変異酵素を配合して洗浄試験を行っ
た。この結果、同一活性値の酵素を添加した場合、変異
酵素は野生型酵素と比較して優れた洗浄効果を示した。

【００５６】

【表８】

【００５７】

【発明の効果】本発明の変異α−アミラーゼは、高いキ
レート剤耐性の優れた特性及びアルカリ領域における高
い比活性を有し、更に熱に対する優れた安定性を有す
る。従って、自動食器洗浄機用洗浄剤、衣料用洗浄剤、
澱粉液化、糖化用組成物、繊維糊抜き剤として有用であ
る。

【００５８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110>KAO CORPORATION <120>New mutant alpha-amylase <130>P02591206 <150>JP P1999-163569 <151>1999-06-10 <160>23 <210>1 <211>480 <212>PRT <213>Bacillus sp. KSM-K38 <400>1 Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu 20 25 30 Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr 100 105 110 Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp 115 120 125 Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser 130 135 140 Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe 145 150 155 160 Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg 165 170 175 Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val 195 200 205 Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp 210 215 220 Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr 225 230 235 240 Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu 245 250 255 Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe 260 265 270 Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly 355 360 365 Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu 370 375 380 Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg 405 410 415 Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser 420 425 430 Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp 435 440 445 Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp 450 455 460 Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln 465 470 475 480

【００５９】 <210>2 <211>485 <212>PRT <213>Bacillus sp. KSM-AP1378 <400>2 His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His 5 10 15 Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr 50 55 60 Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly 85 90 95 Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp 100 105 110 Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn 115 120 125 Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp 130 135 140 Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr 145 150 155 160 His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys 165 170 175 Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp 180 185 190 Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met 195 200 205 Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr 210 215 220 Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His 225 230 235 240 Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr 245 250 255 Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu 260 265 270 Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val 275 280 285 Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly 290 295 300 Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys 305 310 315 320 His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro 325 330 335 Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala 340 345 350 Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr 355 360 365 Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser 370 375 380 Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr 385 390 395 400 Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu 405 410 415 Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly 435 440 445 Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile 450 455 460 Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser 465 470 475 480 Val Trp Val Lys Gln 485

【００６０】 <210>3 <211>1753 <212>DNA <213>Bacillus sp. KSM-K38 <220> <221>sig#peptide <222>(162)..(224) <220> <221>mat#peptide <222>(225)..(1664) <220> <221>CDS <222>(162)..(1664) <400>3 gtatgcgaaa cgatgcgcaa aactgcgcaa ctactagcac tcttcaggga ctaaaccacc 60 ttttttccaa aaatgacatc atataaacaa atttgtctac caatcactat ttaaagctgt 120 ttatgatata tgtaagcgtt atcattaaaa ggaggtattt g atg aga aga tgg gta 176 gta gca atg ttg gca gtg tta ttt tta ttt cct tcg gta gta gtt gca 224 gat gga ttg aac ggt acg atg atg cag tat tat gag tgg cat ttg gaa 272 Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu 1 5 10 15 aac gac ggg cag cat tgg aat cgg ttg cac gat gat gcc gca gct ttg 320 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu 20 25 30 agt gat gct ggt att aca gct att tgg att ccg cca gcc tac aaa ggt 368 Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 aat agt cag gcg gat gtt ggg tac ggt gca tac gat ctt tat gat tta 416 Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 gga gag ttc aat caa aag ggt act gtt cga acg aaa tac gga act aag 464 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 gca cag ctt gaa cga gct att ggg tcc ctt aaa tct aat gat atc aat 512 Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn 85 90 95 gta tac gga gat gtc gtg atg aat cat aaa atg gga gct gat ttt acg 560 Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr 100 105 110 gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat cca acg aat cgt tgg cag gat 608 Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp 115 120 125 att tca ggt gcc tac acg att gat gcg tgg acg ggt ttc gac ttt tca 656 Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser 130 135 140 ggg cgt aac aac gcc tat tca gat ttt aag tgg aga tgg ttc cat ttt 704 Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe 145 150 155 160 aat ggt gtt gac tgg gat cag cgc tat caa gaa aat cat att ttc cgc 752 Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg 165 170 175 ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga gtg gat gaa gag aac ggt aat 800 Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn 180 185 190 tat gat tac ctg tta gga tcg aat atc gac ttt agt cat cca gaa gta 848 Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val 195 200 205 caa gat gag ttg aag gat tgg ggt agc tgg ttt acc gat gag tta gat 896 Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp 210 215 220 ttg gat ggt tat cgt tta gat gct att aaa cat att cca ttc tgg tat 944 Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr 225 230 235 240 aca tct gat tgg gtt cgg cat cag cgc aac gaa gca gat caa gat tta 992 Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu 245 250 255 ttt gtc gta ggg gaa tat tgg aag gat gac gta ggt gct ctc gaa ttt 1040 Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe 260 265 270 tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg tct cta ttc gat gtt cca ctt 1088 Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 aat tat aat ttt tac cgg gct tca caa caa ggt gga agc tat gat atg 1136 Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met 290 295 300 cgt aat att tta cga gga tct tta gta gaa gcg cat ccg atg cat gca 1184 Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala 305 310 315 320 gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act cag cca ggg gag tca tta gag 1232 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu 325 330 335 tca tgg gtt gct gat tgg ttt aag cca ctt gct tat gcg aca att ttg 1280 Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu 340 345 350 acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta ttt tac ggt gat tac tat ggg 1328 Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly 355 360 365 att cct aac gat aac att tca gct aaa aaa gat atg att gat gag ctg 1376 Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu 370 375 380 ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat ggc acg cag cat gac tat ttt 1424 Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 gat cat tgg gat gtt gta gga tgg act agg gaa gga tct tcc tcc aga 1472 Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg 405 410 415 cct aat tca ggc ctt gcg act att atg tcg aat gga cct ggt ggt tcc 1520 Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser 420 425 430 aag tgg atg tat gta gga cgt cag aat gca gga caa aca tgg aca gat 1568 Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp 435 440 445 tta act ggt aat aac gga gcg tcc gtt aca att aat ggc gat gga tgg 1616 Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp 450 455 460 ggc gaa ttc ttt acg aat gga gga tct gta tcc gtg tac gtg aac caa 1664 Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln 465 470 475 480 taacaaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaactcaag gctttcttta tgtcgcttag 1724 cttaacgctt ctacgacttt gaagcttta 1753

【００６１】 <210>4 <211>480 <212>PRT <213>Bacillus sp. KSM-K36 <400>4 Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu 5 10 15 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Glu Ala Leu 20 25 30 Ser Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn 85 90 95 Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Leu Gly Ala Asp Phe Thr 100 105 110 Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Ser Asn Arg Trp Gln Asp 115 120 125 Ile Ser Gly Val Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Pro 130 135 140 Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe 145 150 155 160 Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Leu Phe Arg 165 170 175 Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn 180 185 190 Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val 195 200 205 Gln Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp 210 215 220 Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr 225 230 235 240 Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Ser Glu Ala Asp Gln Asp Leu 245 250 255 Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe 260 265 270 Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Lys Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met 290 295 300 Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Ile His Ala 305 310 315 320 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu 325 330 335 Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu 340 345 350 Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly 355 360 365 Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu 370 375 380 Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 Asp His Trp Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Thr Ser Ser Arg 405 410 415 Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser 420 425 430 Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Gln His Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp 435 440 445 Leu Thr Gly Asn His Ala Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp 450 455 460 Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln 465 470 475 480

【００６２】 <210>5 <211>1625 <212>DNA <213>Bacillus sp.KSM-K36 <220> <221>sig#peptide <222>(40)..(102) <220> <221>mat#peptide <222>(103)..(1542) <220> <221>CDS <222>(40)..(1542) <400>5 atgatatatg taagcgttat cattaaaagg aggtatttg atg aaa aga tgg gta 54 gta gca atg ctg gca gtg tta ttt tta ttt cct tcg gta gta gtt gca 102 gat ggc ttg aat gga acg atg atg cag tat tat gag tgg cat cta gag 150 Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu 1 5 10 15 aat gat ggg caa cac tgg aat cgg ttg cat gat gat gcc gaa gct tta 198 Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Glu Ala Leu 20 25 30 agt aat gcg ggt att aca gct att tgg ata ccc cca gcc tac aaa gga 246 Ser Asn Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly 35 40 45 aat agt cag gct gat gtt ggg tat ggt gca tac gac ctt tat gat tta 294 Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu 50 55 60 ggg gag ttt aat caa aaa ggt acc gtt cga acg aaa tac ggg aca aag 342 Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys 65 70 75 80 gct cag ctt gag cga gct ata ggg tcc cta aag tcg aat gat atc aat 390 Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn 85 90 95 gtt tat ggg gat gtc gta atg aat cat aaa tta gga gct gat ttc acg 438 Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Leu Gly Ala Asp Phe Thr 100 105 110 gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat cct tcg aac cgt tgg cag gat 486 Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Ser Asn Arg Trp Gln Asp 115 120 125 att tca ggt gtc tac acg att gat gca tgg acg gga ttt gac ttt cca 534 Ile Ser Gly Val Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Pro 130 135 140 ggg cgc aac aat gcc tat tcc gat ttt aaa tgg aga tgg ttc cat ttt 582 Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe 145 150 155 160 aat ggc gtt gac tgg gat caa cgc tat caa gaa aac cat ctt ttt cgc 630 Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Leu Phe Arg 165 170 175 ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga gtg gat gaa gag aat ggt aat 678 Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn 180 185 190 tat gac tat tta tta gga tcg aac att gac ttt agc cac cca gag gtt 726 Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val 195 200 205 caa gag gaa tta aag gat tgg ggg agc tgg ttt acg gat gag cta gat 774 Gln Glu Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp 210 215 220 tta gat ggg tat cga ttg gat gct att aag cat att cca ttc tgg tat 822 Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr 225 230 235 240 acg tca gat tgg gtt agg cat cag cga agt gaa gca gac caa gat tta 870 Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Ser Glu Ala Asp Gln Asp Leu 245 250 255 ttt gtc gta ggg gag tat tgg aag gat gac gta ggt gct ctc gaa ttt 918 Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe 260 265 270 tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg tct cta ttc gat gtt ccg ctc 966 Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu 275 280 285 aat tat aat ttt tac cgg gct tca aag caa ggc gga agc tat gat atg 1014 Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Lys Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met 290 295 300 cgt aat att tta cga gga tct tta gta gaa gca cat ccg att cat gca 1062 Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Ile His Ala 305 310 315 320 gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act cag cca gga gag tca tta gaa 1110 Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu 325 330 335 tca tgg gtc gct gat tgg ttt aag cca ctt gct tat gcg aca atc ttg 1158 Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu 340 345 350 acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta ttt tac ggt gac tac tat ggg 1206 Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly 355 360 365 att cct aac gat aac att tca gct aag aag gat atg att gat gag ttg 1254 Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu 370 375 380 ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat ggc aca caa cat gac tat ttt 1302 Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe 385 390 395 400 gat cat tgg gat atc gtt gga tgg aca aga gaa ggt aca tcc tca cgt 1350 Asp His Trp Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Thr Ser Ser Arg 405 410 415 cct aat tcg ggt ctt gct act att atg tcc aat ggt cct gga gga tca 1398 Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser 420 425 430 aaa tgg atg tac gta gga cag caa cat gca gga caa acg tgg aca gat 1446 Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Gln His Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp 435 440 445 tta act ggc aat cac gcg gcg tcg gtt acg att aat ggt gat ggc tgg 1494 Leu Thr Gly Asn His Ala Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp 450 455 460 ggc gaa ttc ttt aca aat gga gga tct gta tcc gtg tat gtg aac caa 1542 Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln 465 470 475 480 taataaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaactcaag gctttcttta tgtcgtttag 1602 ctcaacgctt ctacgaagct tta 1625

【００６３】 <210>6 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>6 atgatgcagt attttgagtg gcatttggaa 30

【００６４】 <210>7 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>7 tatgagtggc atttgccaaa cgacgggcag cat 33

【００６５】 <210>8 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>8 ccagcctaca aaggtagtag tcaggcggat gtt 33

【００６６】 <210>9 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>9 gcacagcttc aacgagctat t 21

【００６７】 <210>10 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>10 tttcgacttt ccagggcgta a 21

【００６８】 <210>11 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>11 catattttcc gctttcaaaa tacgaactgg aac 33

【００６９】 <210>12 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>12 aactggcgag tggatgatga gaacggtaat tat 33

【００７０】 <210>13 <211>25 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>13 tggatgaaga gttcggtaat tatga 25

【００７１】 <210>14 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>14 aatatcgact ttagtcgtcc agaagtacaa gat 33

【００７２】 <210>15 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>15 agtcatccag aggtcgtaga tgagttgaag gat 33

【００７３】 <210>16 <211>33 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>16 gttgactggg atgagcgcaa acaagaaaat cat

【００７４】 <210>17 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>17 atttgccaaa tgacgggcag cattggaatc ggtt 34

【００７５】 <210>18 <211>34 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>18 aaccgattcc aatgctgccc gtcatttggc aaat 34

【００７６】 <210>19 <211>40 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>19 gggtcgacca gcacaagccg atggattgaa cggtacgatg 40

【００７７】 <210>20 <211>29 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>20 taaagctttt gttattggtt cacgtacac 29

【００７８】 <210>21 <211>30 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>21 gagtcgacca gcacaagccc atcataatgg 30

【００７９】 <210>22 <211>21 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>22 taaagcttca atttatattg g 21

【００８０】 <210>23 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <400>23 ccagatctac ttaccatttt agagtca 27

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＫＳＭ−Ｋ３８株及びＫＳＭ−ＡＰ１３７８
株由来のα−アミラーゼ生産用組換えプラスミドの構築
方法を示す図である。

【図２】 ＫＳＭ−Ｋ３８株由来のα−アミラーゼ遺伝
子の変異導入方法を示す模式図である。

【図３】 ＫＳＭ−Ｋ３８株由来のα−アミラーゼ遺伝
子のＮ末配列をＫＳＭ−ＡＰ１３７８株由来のα−アミ
ラーゼ遺伝子のＮ末領域と置換する方法を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/28 9/28 5/00 Ａ (72)発明者 林 康弘 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 萩原 浩 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 尾崎 克也 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示されるアミノ酸配列又は
   該アミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するα
   −アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列の１１番目のＴ
   ｙｒ、１６番目のＧｌｕ、４９番目のＡｓｎ、８４番目
   のＧｌｕ、１４４番目のＳｅｒ、１６７番目のＧｌｎ、
   １６９番目のＴｙｒ、１７８番目のＡｌａ、１８８番目
   のＧｌｕ、１９０番目のＡｓｎ、２０５番目のＨｉｓ及
   び２０９番目のＧｌｎのうちのいずれかに相当するアミ
   ノ酸残基の１残基以上を置換又は欠失させてなる変異α
   −アミラーゼ。
2. 【請求項２】 配列番号１に示されるアミノ酸配列又は
   該アミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するα
   −アミラーゼにおいて、該アミノ酸配列のアミノ末端か
   ら１１〜１００アミノ酸残基に相当する配列を他の液化
   型α−アミラーゼの該アミノ酸配列に相当するアミノ酸
   配列に置換させてなる変異α−アミラーゼ。
3. 【請求項３】 配列番号１のアミノ酸配列の１番目のＡ
   ｓｐから１９番目のＧｌｙまでに相当する配列を他の液
   化型α−アミラーゼの該アミノ酸配列に相当するアミノ
   酸配列に置換させたものである請求項２記載の変異α−
   アミラーゼ。
4. 【請求項４】 他の液化型α−アミラーゼが配列番号２
   に示されるアミノ酸配列を有するものである請求項２又
   は３記載の変異α−アミラーゼ。
5. 【請求項５】 配列番号１に示されるアミノ酸配列又は
   該アミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するα
   −アミラーゼに対して、請求項１記載のアミノ酸残基の
   置換又は欠失及び請求項２〜４のいずれかに記載のアミ
   ノ酸配列の置換から選ばれる２種以上の置換又は欠失を
   組み合わせて変異させた変異α−アミラーゼ。
6. 【請求項６】 アミノ酸残基の置換が配列番号１のアミ
   ノ酸配列の１１番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基を
   Ｐｈｅ、１６番目のＧｌｕに相当するアミノ酸残基をＰ
   ｒｏ、４９番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＳｅ
   ｒ、１６７番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＧｌ
   ｕ、１６９番目のＴｙｒに相当するアミノ酸残基をＬｙ
   ｓ、１９０番目のＡｓｎに相当するアミノ酸残基をＰｈ
   ｅ、２０５番目のＨｉｓに相当するアミノ酸残基をＡｒ
   ｇ又は２０９番目のＧｌｎに相当するアミノ酸残基をＶ
   ａｌに置換させてなるものであり、アミノ酸配列の置換
   が配列番号１の１番目のＡｓｐから１９番目のＧｌｙま
   でのアミノ酸配列を配列番号２の１番目のＨｉｓから２
   １番目のＧｌｙまでのアミノ酸配列に置換させてなるも
   のである請求項５記載の変異α−アミラーゼ。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項記載の変異
   α−アミラーゼをコードする遺伝子又は当該遺伝子を含
   有するベクター。
8. 【請求項８】 請求項７に記載のベクターで形質転換さ
   れた細胞。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の形質転換細胞を培養す
   ることを特徴とする変異α−アミラーゼの製造方法。 【請求１０】 請求項１〜６のいずれか１項記載の変異
   α−アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。