JP2000517168A

JP2000517168A - バイオセンサー

Info

Publication number: JP2000517168A
Application number: JP10508330A
Authority: JP
Inventors: シュナイダー，レネ; ヴァンコヴ，トニー; ジュリー，カレン
Original assignee: シーアールシーフォーウェイストマネージメントアンドポリューションコントロールリミテッド
Priority date: 1996-07-29
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2000-12-26
Also published as: ATE304595T1; DE69734204T2; EP0922106A1; KR20000029543A; CA2262015A1; DE69734204D1; WO1998004716A1; AUPO128096A0; KR100469588B1; EP0922106B1; EP0922106A4; US6329160B1

Abstract

(57)【要約】（ａ）検出可能な活性を有するリポーター分子をコードする配列を含む第１の核酸分子、及び、（ｂ）リポーター分子のための基質を生成する酵素をコードする配列を含む第２の核酸分子を含んでなり、前記第１の配列が第１の誘導プロモーターの制御下にあり、第２の配列が第２の誘導プロモーターの制御下にある、バイオセンサーで用いるための遺伝子構築物。その遺伝子構築物を含む細胞と、細胞が環境シグナルに露出されたとき細胞におけるリポーター分子の活性を測定する手段とを具備してなるバイオセンサー。

Description

【発明の詳細な説明】バイオセンサー技術分野本発明は、環境シグナル検出のためのバイオセンサーの使用に関し、このバイオセンサーは、これらシグナルに対する細胞の遺伝子反応の測定に基づく。従来の技術 “遺伝子反応に基づく”バイオセンサー測定のための標準的な研究方法は、リポーター遺伝子を関連プロモーターに結合させ、研究対象物で対応するシグナル（リポーター遺伝子によってコード化された酵素の活性からなる）を測定することである。このような測定を行うための細菌ルシフェラーゼオペロンの使用を扱った最初の文献は、1984年に発行されている（Baldwin等，1984）。それ以来、プロモーターの活性を精査するこのリポーターの使用を詳説する多数の文献が発表されている。今日では、おそらく、この問題についての数千の文献がある。これらの文献のほとんどは、全luxカセットのluxAB融合の使用に重きをおいている。こうした構築物で汚染物質の濃度を測定するという、さらに限定された目的は、米国テネシー大学のゲイリー・セイラーのグループ（Gary Sayler's group）によって初めて提唱され、提示された（King等，1990）。Burlage & Kuo（1994 ）は、近年、環境モニターの応用に関連して、こうしたバイオセンサーの応用を見直している。実質的には、言及された全ての構築物が、活性測定のための全luxオペロンまたはそのルシフェラーゼ部分（luxAB、この場合はアルデヒド基質の外部添加により活性が測定される）のいずれかを利用している。全luxオペロンを使用することの主な欠点は、ルシフェラーゼの基質（luxCDEによってコード化された脂肪酸リダクターゼ）の発生を招く酵素の生成が、ルシフェラーゼの合成と同時に起こることである。したがって、細胞によって生成される基質の量は、おそらくルシフエラーゼの飽和には不十分である。本発明者らは、この欠点に対処するための試みとして、バイオセンサーとして好適な構築物に修飾を行い、これによって、ルシフェラーゼが合成され次第、最大の発光を奏するようにした。発明の開示第一の態様として、本発明は、下記：（ａ）検出可能な活性を有するリポーター遺伝子をコード化する配列を含む第一核酸分子；及び、（ｂ）リポーター分子のための基質を生成する酵素をコード化する配列を含む第二核酸分子を含み、第一配列が第一誘導プロモーターの制御下にあり、第二配列が第二誘導プロモーターの制御下にあるバイオセンサーに使用される遺伝子構築物である。好ましい実施態様では、第一核酸分子が、細菌ルシフェラーゼlux ABまたはその機能的等価物をコード化し、第二核酸分子が、lux CDE酵素脂肪酸リダクターゼまたはその機能的等価物をコード化する。これらの遺伝子は、生物発光微生物のあらゆるluxオペロンから入手可能であり、そのほとんどが、ビブリオ（Vibri o）、Xenorhabdus、Photorhabdus及び発光菌（Photobacterium）属に属する（Me ighen，1994）。この系における検出可能作用は、光の発生である。あらゆる誘導プロモーターが本発明に好適であることは重要である。好適なプロモータの数例を補足２に列挙した。しかしながら、このリストは完全なものではなく、可能な複数のプロモーターを示すためのものである。第一プロモーターの選択は、しばしば、バイオセンサーが適合して反応する環境シグナルに依存する。特に、バイオセンサーが、キシレンの検出のために使用される場合、第一プロモーターとしてはPuプロモーターが特に好適である。本発明の更に好ましい実施態様は、図１４に示したキシレンの検出に適合させた遺伝子構築物である。本発明の遺伝子構築物の顕著な利点は、細胞中で、リポーター分子の発現とは別々に、酵素の発現が誘導可能なことである。このため、細胞には、酵素によって生成される基質が供給される。基質は、生成後即座にリポーター分子によって利用可能であり、このため、検出されたシグナルに迅速に対応する。リポーター分子は、環境シグナルに対応して発生する場合、最大限に反応して検出作用を与えることができる。第一プロモーターは、試験する環境シグナルに露出させることにより誘導されることが好ましい。誘導は、シグナルによって直接的に、または、構築物を含有する細胞内で、一以上の別々の経路を活性化することによって間接的に達成可能である。遺伝子構築物は、そのプロモーターを介してリポーター分子の活性化に必要な補助成分をコード化する核酸分子を更に含有可能である。例には、調節遺伝子または“第二メッセージ”分子を発現して第一プロモーターを活性化する核酸分子が含まれる。調節遺伝子による間接的活性化経路に依存する、既存のプロモーターのエフェクター特異性は、調節タンパク質のシグナル結合部位の突然変異によって変更される（Ramons等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，83，8467-8471，1986）。新たなプロモーターは、デロレンツォら（deLorenzo，V.;Herrero．M.;Jakubzik，U. & Timmis，K．N．J．Bact.，172，6568-6572，1990）またはソハスキーら（Soha skey，C．D.;Im，H.& Schauer，A．T.，J．Bact.，1674，367-376，1992）によって記載されたもの等のトランスポゾンを主成分とする、プロモーターを含まないプロモーター精査ベクターを使用して識別可能である。第二の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の遺伝子構築物を含有する細胞を含む環境シグナルの測定のためのバイオセンサー及び、細胞を環境シグナルに露出させた際の細胞内のリポーター分子の活性を測定する方法である。細胞は、細菌、酵母、真菌及び他の植物細胞及び動物を含むあらゆる細胞であってよい。該細胞は、細菌細胞であることが好ましい。環境シグナルは、汚染物質、毒素、温度、線照射、生化学的及び化学的なものであってよい。細菌ルシフェラーゼ系を使用する場合、センサーの基本的な遺伝子ユニットは、脂肪酸リダクターゼの生成をコード化する第二核酸分子（ユニット２）、ルシフェラーゼ遺伝子と第一プロモーターを含むリポーター因子をコード化する第一核酸分子（ユニット１）並びに、幾つかの例では、調節遺伝子などのセンサー因子の活性化のための補助成分を供給する三番目のユニット（ユニット３）である。市販のセンサーでは、全ての因子が宿主生物の染色体中に理想的に挿入されている。あるいはまた、全てのユニットをプラスミド上においても、または染色体挿入因子とプラスミド上の構築物を組み合わせて使用してもよい。例えば、三つのユニットを使用する場合、ユニット２及びユニット３を染色体に挿入する一方で、ユニット１をプラスミド上に配してもよい。細菌ルシフェラーゼ系を使用する機能的バイオセンサーユニットは、試験しようとするサンプルを、本発明の第一の態様による遺伝子構築物を含むバイオセンサー細胞と（例えばキュベット中で）露出させる装置及び細胞の発光を測定することのできる器具からなる。原則として、あらゆる光測定装置が使用可能であるか、最も好適なのは、光電子増倍管、荷電結合デバイス、光度計、測光器、光ファイバーケーブルまたは液体シンチレーションカウンターである。これらのシステムは、携帯用かまたは研究室用の、一回の分析に適合させたものかまたは多数回の分析のための高性能装置であってよい。本発明に好適な市販の９０以上のシステムについての概説がスタンレーによって発表されており（Stanley in J．Bi oluminesc．Chemiluminescence，7，77-108，1992）、その後定期的に最新版が発表されている。分析物は、表面に吸着した場合、液状媒体に溶解された場合、または気相中に存在する場合にバイオセンサーによって測定可能である。測定の条件は、遺伝子構築物を含むバイオセンサー細胞の機能が確実に発揮されるのに十分な湿度が得られることである。サンプルは、分析前に、適当な組成の緩衝剤で希釈し、この溶液としてインキュベートすることが理想的である。あるいはまた、分析前に、対象の分析物を、溶媒等の手段または例えば膜などの選択的に透過可能な障壁を使用して、サンプルから分離してもよい。分析物はまた、分析前に、例えば、気体サンプルを液体または適当な固形吸収体を通過させることにより濃縮しても良い。バイオセンサーは、生物中で遺伝子反応を誘発する有機または無機の化学的シグナルまたは環境シグナルの検出に使用可能である。微生物系を主として対象としているが、ほ乳類、植物または真菌性のプロモーターもまた使用可能である。さらに、バイオセンサーは、生理学的測定に好適なプロモーターの後ろにルシフェラーゼ遺伝子を挿入することにより、飢餓、毒性（ビルレンス）または胞子形成などの生理学的反応もまた検出可能である。バイオセンサーは、粒子に結合した、水性サンプルに溶解した、または気相中に分散した毒物の検出に使用可能である。しかしながら、この測定は、通常は液相中で行う必要がある。第三の態様では、本発明は、本発明の第二の態様によるバイオセンサーを、シグナルに露出させ、バイオセンサー中の細胞のリポーター分子の発現を、シグナルを誘発させることを含む環境シグナルの検出方法であって、露出前または露出中に細胞が誘発されて酵素を生成し、細胞内で基質が形成されてリポーター分子が予め形成された基質と反応して検出可能な反応を起こす方法、及び該反応を検出することである。本発明がより明確に理解されるよう、好ましい形態を下記の図面を参照して説明する。図面の簡単な説明図１は、luxオペロンの図である。図２は、設計したクローンｐＬｕｘＡＢの図である。図３は、設計したクローンｐＬｕｘＣＤＥの図である。図４は、設計したクローンｐＴｌｕｘの図である。図５は、トルエンの分解をコード化する遺伝子を制御する二つのオペロン、Ｔｏｌオペロンの図である。図６は、ｐＸｌａｃＲ／Ｓの図である。図７は、設計した構築物ｐＸｙｌＲの特性の図である。図８は、設計した構築物ｐＴＵ／Ｍの図である。図９は、ｐＴＬＵ中の成分の相対位置を示す図である。図１０は、設計した形質転換体ｐｌｕ−ｘの模式図である。図１１は、設計した形質転換体ｐＬＥＵの模式図である。図１２は、新たなセンサー構築物（Leu-lacR）であって、キシレンを添加したもの（黒四角）及びキシレンを添加していないもの（白四角）の生物発光の経時変化並びに、黒丸と白丸がそれぞれキシレンの存在下とキシレンのない状態での反応を表すコントロール構築物（Lux-lacR）での対応データを示す図である。図１３は、新たなセンサー構築物（Leu-lacR）で得られる検定曲線を示す。生物はグリセリンストックから接種され、３０℃で最小限の刺激のもとで一晩おいた。図１４は、プラスミドｐＬＥＵのマップを示す。発明の詳細な説明本発明に使用した全ての成分は、既に一般に入手可能である（この研究のために特に生成させた異種構築物を除く）。材料及び方法培養条件 Escherichia coliの組換え株を、通常通り、好気条件下でLuria groth（ＬＢ）（トリプトン１０g/L、ＮａＣｌ１０g/L及び酵母抽出物５g/L）中３７℃にて培養した。媒体にKobe寒天15g/Lを添加して固化させた。フィルター滅菌した抗生物質を必要に応じて添加した。100mg/mlのアンピシリンを使用して下記のベクター：ｐSP72、pUC18、ｐTrc99A及びpPL-L：を主成分とする構築物を維持し、10 mg/mlのテトラサイクリンをpPK404を主成分とする構築物に用いた。使用した相違する炭素源は、グルコース（１％w/v）及びラクトース（１％w/v）であった。一般的な組換えDNA操作制限酵素及び他のＤＮＡ変性酵素を、提供者に特定された条件下で使用した。ＤＮＡの処理及びクローン化のために、Sambrook等，（1989）により発表された標準的な操作を用いた。プラスミドＤＮＡのE.coliからの単離は、プラスミド坦持クローンの迅速なスクリーニングのために、Morelle（1989）によって発表された方法によって行われた。表１：本研究の間に構築したクローンの説明表２：本研究の間に構築したクローンの説明表２、続き表３：組換えE.coli株生物発光アッセイ−培地の調製特に述べないが、E.coliクローンは、新鮮な寒天プレートから、適当な抗生物質を含む40mlのLB媒質を含むフラスコに植付け、37℃で2-3時間、好気的に（振とうさせながら）成長させた。培地は、約0.8-1.2のOD600で播種し、2回洗浄し、100mMのリン酸バッファーpH7.5、１/10希釈LB broth、及び0.1％グルコース(w /v)を含むバッファー中に再懸濁させた。いくつかの場合には、本文中に特定したが、IPTG及びｍ−キシレン(1mM)などのインデューサ及び／またはエフェクターを添加した。培地の光学密度は、1.6に調節し、以下のようにアッセイした。細胞懸濁液の10mlを、100mlの密にシールしたボトル（Scottボトル）に入れ、実験の間、それを室温でマグネチックスターラに載せた。サンプリングは、20分または30分間隔で行なった。培地の100mlのアリコートを取り出し、600nmで培地の光学密度を測定して、バイオマス含有量を測定した。光発生（秒あたりの蛍光カウント、LCPSでの生物発光）は、ミクロタイタープレートを用いて、Microbet aシンチレーションカウンターで測定した。 20％グルコースの20μlを、ミクロタイタープレートの各ウェルに添加した（グルコースは、電子ドナーとして作用する）。各サンプルにおいて、0.5％テトラデシルアルデヒド有無での蛍光活性を記録した。LCPSをOD600で除することにより、特異的活性を決定した。アルデヒドインジケータプレートパラロサニリン及びビサルファイトの混合物は、しばしばシッフ試薬と呼ばれ、アルデヒドの検出に広く用いられている（Lillie 1997）。これらの化合物は、固体媒質に導入され、アルデヒドを生成する酵素を発現するクローンの同定に使用される。インジケータプレートは、8mlのパラロサニリン（95％エタノール中2.5mg/ml）及び100mgのナトリウムビサルファイトを、予め冷却した寒天に添加することによって調製した。プレートは、室温で貯蔵し、アルデヒドを含むヒュームから遠ざける。それらはバックグラウンド色の増大を促進する。結果ルシフェラーゼ化合物の発色ａ）バックグラウンド X．luminescensのluxAB遺伝子産物は、他の細菌（わずか30℃まで、Szittner and Meighen，1990）より温度的に（45℃まで）安定である。この生物のlux構造遺伝子の順序は、luxCDABEであり、luxCDとluxE遺伝子に隣接するルシフェラーゼ遺伝子を持つ（図１）。ｂ）lux AB遺伝子のクローニング lux系を検出する商業的に入手可能なプロモータが無い状況で、研究は、この系を開発するために行なわれた。プロモータの無いlux AB遺伝子カセットを、lu xAB遺伝子のリボソーム結合部位(RBS)のすぐ上流側、翻訳ターミネーター（rrnb T1T2）の隣、かつ最小２つの独特な酵素部位（BamHI及びXholまたはSalIまたはP stI）に位置し、他のベクターへのクローニングを促進する、独特のクローニング部位（EcoRV、ClaI及びEcoRI）を含むようにデザインした。プロモータ配列は、EcoRV、ClaI及びEcoRI部位に、正しい方向で挿入し、lux AB遺伝子を発現する能力を有する。 EcoRV部位の上流のrrnbT1T2ターミネーターの目的は、他のプロモーターからl ux遺伝子への連続的な翻訳を阻害することであるが、これらは、ホストベクター系の不安定化の阻害においてlux遺伝子補助から縁に遠位にある。 pSP72の異なるプロモーターにおけるrrnbT1T2ターミネーターのクローニングを促進するために、PCRプライマーの２つのセットが消化された。最初に、後ろのターミネーターがベクターpKK232-8(Brosius，1984)から増幅され、pSP72のBa mHI/Xbal部位にクローンされてpT2となる。BglII及びBamHIは、適合性の接着末端を生成するが、再リゲートされた末端は、いずれかの酵素によって再び切断される。従って、pSP72における元のBamHI及びBglII制限部位及びrrnbT1T2 PCR産物は各々pT2に存在しない。順方向翻訳ターミネーターは同様に増幅されpT2のBg lII/EcoRV部位にクローンされる。ポジティブクローン（設計されたpTER）が単離され、特徴付けされてさらなる研究に残された。 X.luminescensからのluxAB遺伝子は、増幅され、EcoRI/SmaI部位pUC18にクローンされ、ベクターのlacZプロモーター及びluxAB遺伝子の間の翻訳的融合となる。この構築物を有するコロニーの生物発光は、外来のアルデヒドを添加すると、暗中裸眼で容易に可視化された。ランダムに取られた１０のコロニーから単離された構築物の特徴付けは、互いに同一で純粋であることが見いだされた。一つのクローン、設計されたpluxAbが保持された（図２参照）。ｃ）アルデヒドシンターゼ遺伝子のクローニング luxCDE遺伝子は、17塩基離間したtrp(-35)位置とlac UV5(-10)領域とを含むプロモーターの翻訳制御下におかれた（Amann等，1988）。luxCDによって生成されたPCRフラグメントは、Eco Ri/Kpn Iで制限され、及びluxE PCR産物に制限されたKpn I/Bam HIに離ゲートしている。独特な制限酵素部位が導入され、各プライマーの５’末端に位置する。プライマーのヌクレオチド配列及び増幅条件は、補足(appendix)に記載する。得られたリゲーション混合物は、luxCD順方向及びlux E逆方向プライマーでの、さらなる２５ラウンドの増幅を施された。luxCDE（約3 .7Kb）を含む最終生成物は、発現ベクターpTrc 99AのEcoRi/BamHI部位にクローンされ、NM522にトランスフェクションされた。陽性のアルデヒド生成クローンは、形質転換体のアルデヒドインジケータープレートへのパッチングによって単離した。取り出したクローンの引き続くPCR及びRE分析は、構築物の真性であることを確証した。設計されたpluxCDEクローン（図３参照）は、さらなる研究のために残した。プラスミドpTrc 99Aは、IPTGによって誘導され得る強いtrcプロモーターを含む。さらに、ベクターは、lacZリボソーム結合部位及びプロモーターを制御する lacIQリプレッサを含む。しかし、trcプロモーターは、非常に強いプロモーターであり、非誘導状態においても低レベルで翻訳を開始することがわかった（Aman n等，1988）。ｄ）対照用構築物−ルシフェラーゼオペロン全luxオペロンを単一単位としてコードする構築物が、対照用として提供された。全luxオペロン（CDABE遺伝子）は、X.luminescensから、Boehringerの延長TM 長テンプレートPCRキットを用いて、luxCD順方向及びluxE逆方向で増幅された。 EcoRi及びBamHI制限に続いて、PCRフラグメントが、pTrc 99AのEcoRI/BamHI部位にクローンされ、trcプロモーターとluxオペロンとの翻訳的融合が得られた。得られた組み換えクローンの目視検査では、外部アルデヒドの有無における生物発光はみられなかった。しかし、外部アルデヒド無しでのシンチレーションカウンターを用いて発光が検出された。これらの形質転換体のRE及びPCR分析を介した特徴付けにより、全luxオペロンがクローンされたことが確認された。形質転換体の代表例である、設計されたpluxCDABEは、さらなる研究のために残した。 luxオペロンの内部プロモーター活性化翻訳の可能性をルール・アウトするために、PCRフラグメントをpTERのEcoRi/SmaI部位にクローンした。得られた組み換えクローン（設計したpTlux）の裸眼による検査及びシンチレーションカウンターでは、外部のアルデヒドの有無における生物発光がみられなかった。luxCDA BE遺伝子を含むpTluxは、２つの翻訳末端に隣接していた（図４に概略を示す）。 BTEXセンサーの構築ａ）バックグラウンド Pseudomonas putidaのTolプラスミドは、トルエン、ｍ−キシレン及びｐ−キシレンの完全な消化に必要な酵素をコードする（Wand & Dunn，1974;Worsey & W illiams，1975）。トルエンの分解をコードする遺伝子は、２つのオペロンを含む（図５参照）。”上方”経路は、トルエン及びキシレンの芳香族カルボン酸への酸化を担う（Franklin等，1983）。異化酵素に加えてTolプラスミドは、（トルエンなどの）上方経路エフェクターと共同して経路オペロンプロモーターからの発現をトリガーするXylR調節タンパク質をコードする（Pu，Abril等，1989）。ｂ）調節遺伝子のクローニング XylR遺伝子は、原型Tolプラスミドから（PCRを介して）増幅され、広いホスト範囲のベクターpRK404のPstI/BamHI部位に個々にクローンされた（Ditta等，19 85）。得られた構築物は、図６に示すように、誘導lacZプロモーターの翻訳制御下にある。 XylR遺伝子は内部PstI部位を含むので、NsiI制限部位が、順方向PCRプライマーを介してXylR遺伝子産物の５’末端に導入された。このプライマーは、NsiIの認識部位を含む。NsiIでの切断は、PstIを持つ適合性接着末端、すなわち促進リゲーションを生成する。得られた構築物、設計されたpxylac-Rは、XylR遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。全XylR遺伝子（そのプロモーターＰｒを含む）もクローンされた。この構築物の生成を理論付けは、異種遺伝子を含む株が、原型遺伝子を有する株より迅速に BTX化合物に反応することを示すことである。全XylR遺伝子（2.1kb）は、Tolプラスミドから（PCRを介して）増幅され、pRK404のPstI/BamHI部位にクローンされた。lacZプロモーターからの翻訳阻害をルールアウトするために、XylR遺伝子が反対方向にクローニングされた。これは、順方向及び逆方向PCRプライマーの制限部位を交換することによって助長された。すなわち、順方向プライマーは５ ’末端にBamHI認識部位を含み、同様に、逆方向プライマーはNsiI部位を含む。得られた構築物pXylRの特徴を示す模式図を図７に記載した。ｃ）異化プロモーターのlux検出系への融合この目的の次のステップは、TolプラスミドのpTERへの上方経路のプロモーターをクローンすることである。プロモーターはTolプラスミドから増幅され、pTE RのEcoRV/EcoRI部位へリゲートし、E.coli HB101に形質転換した。PCR及び制限エンドヌクレアーゼ分析についで、２つのクローンが単離され、将来の研究のために保持された。Puプロモーターを含む構築物は、設計されたpTUである（図８参照）。 X.luminescensからのluxAB遺伝子が、E.coliにおいて機能的に翻訳されたことを確定し、遺伝子は次いでpTUにクローンされた。luxAB PCRフラグメントはEcoR Iで制限され、次いで平滑化され、個々にpTUのEco RV/Eco RI部位にリゲートされ、pTLUを生成した。得られた組み換えクローンの目視検査では、外部アルデヒドの存在下での生物発光は見られなかった。しかし、発光は、シンチレーションカウンターを用いて検出された。細胞の全ループは、寒天プレートでスクラップされ、100mlのLuria brith及び1％テトラデシルアルデヒドを含むエッペンドルフ管内に再懸濁された。培地は、ポリスチレン製ミクロタイタープレートに移され、シンチレーションカウンターを用いて光生成をスキャンされた。VE及びPCR 分析を通したこれらの形質転換体の特徴付けは、構築物が原型であることを証明した。構築物の成分の代表的位置を例示する模式図を図９に示した。ｄ）Puプロモーター構築物の翻訳 pTLUの潜在的な有用性を確認するために、これらのクローンのルシフェラーゼ活性を、周知のエフェクターであるｍ−キシレンに対して試験された。このクローンを含むE.coli株及びその特異的レギュレータ（pxylacR）も試験された（表４参照）。pTLUを含むE.coli NM522において、比較的に低いレベルの発光が検出された。これらの結果は、Puがそのレギュレータの不存在下で翻訳を開始できることを示した以前の発見（Hugouvieux-Cotte-pattatet等，1990）に一致する。予想したように、PuプロモータのXyIR-依存性発現は、存在する糖及び／またはIPTGのタイプによって40から470倍増大した。光出力の5から10倍の増加は、グルコースとともに成長させたものを除くすべての生物に対して、エフェクター分子（ｍ−キシレン）の不存在下で観察された。最大のキシレン−誘導ルシフェラーゼ活性は、グルコース存在下（7.5×10₅LCPS）で成長させた細胞について記録した。グルコースは、lacZプロモーターからの翻訳を抑制することが知られている(XyIRはlacZプロモーターから翻訳される）ので、これらの結果の解釈において、いくつかの注意が必要である。表４：TOL xyIRレギュレーター及び”上方”プロモーターluxAB構築物を含む組み換えE.coli（NM522）株の蛍光活性組み換え株の終夜培地は、アンピシリン及びテトラサイクリンを各々100及び1 0mg/mlの濃度で含むLB broth中に100倍希釈した。炭素源、グルコース及びラクトースは、1％の濃度で提供した。調節遺伝子XyIRの発現を誘導するために、IPT Gを１mMの濃度で添加した。蛍光活性（１秒あたりの蛍光カウント）は、エフェクターｍ−キシレン（1mM）の存在下、10％テトラデシルアルデヒド2mlの添加後５時間に測定した。培地は、30℃で成長させた。・ａ、検出せずｅ）BTEXセンサー制御構築物 luxオペロン（制御構築物）は、Puプロモータの制御下においた。すでに述べたように、全luxオペロン（CDABE遺伝子）は、Boerhingerの拡張TM長テンプレートPCTキットを用いてX.liminescensから増幅した。５’末端でEcoRIによって制限し、３’末端で平滑化したPCRフラグメントは、pTUのEcoRI/SmaI部位にリゲートした。NM522への形質転換に続いて、陽性生物発光クローンを、外部アルデヒドの不存在下でシンチレーションカウンターを用いて同定した。制限エンドヌクレアーゼ及びPCR分析は、それらの原型性(authenticity)の決定に用いられた。バックグラウンド蛍光活性の測定が行われた。pLu-xは、方法及び材料の部分に記載したプロトコールに従って、Luria broth中で培養した。外部ｍ−キシレンの有無において発光は検出されなかった。ｆ）完全なBTEXセンサーの構築 Pu-luxABカセットは、BamHI/PstIでの制限に続いて寒天ゲル電気泳動を介して pTLUから単離され、pluxCDEの同様に制限された部位にクローニングされた。これらの形質転換体の、RE及びPCR分析を通した特徴付けは、Pu-luxABカセットがl uxCDE遺伝子に融合したことを確認した。形質転換体の代表例、設計されたpLEU は、さらなる研究のために保持した。pLEUにおけるPu-luxABカセットの相対的位置は、図１１に概略を示した。バックグラウンド蛍光活性を決定するために、pL EUはLuria broth中で培養し、材料及び方法の部分で述べたプロトコールに従ってアッセイした。繰り返しアッセイでは、ｍ−キシレンの存在下でも発光は見られなかった。これらの結果は、調節タンパク質Xyl Rの不存在下でのPuの誘導を欠くことを明らかに示している。試験株Leu-lacRは、pLEU及びpxylac-Rの両方のNM522への形質転換及びアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の分泌によって生成された。同様に、Leu-R、L ux-lacR及びLux-Rは、各構築物（表１及び２参照）のNM522への形質転換によって生成した。これらの株のアッセイ結果は、図１２及び図１３に示した。本発明の新規なセンサーの機能性は、図１２及び１３に示されている。新たなセンサーの応答は、生得的なlux遺伝子カセットに基づく参照構築物で得られるものより明らかに優れている。新たなセンサーにおいて、光シグナルの誘導は迅速であり、極めて感度がよい。図１３は、そのようなセンサーで、キシレンの場合にサブppmレベルまで低い範囲までの線形校正曲線が得られることを明らかに示している。従ってセンサー応答は、この新規なセンサーで達成されるように、lu x遺伝子をスプリット(split)することによって優位に向上する。当業者は、広く記載した発明の精神及び範囲から離れることなく、特定の実施態様に記載した本発明に多くの変更及び／または修正を加えることができるであろう。従って、ここに示す実施態様は、あらゆる意味において例示的であり何ら限定するものではない。補足１： Psuedomonas putidaにおけるTOLプラスミドからのXyIR遺伝子のPCR。コンピューター分析（PCRプライマー及び増幅）に従って、以下のプライマーが用いられた： XyIR遺伝子 XyIR ORF：順方向プライマー(RF)：30mer逆方向プライマー(RR)：28mer PCR条件：プライマーは、46℃で30秒間、2.5分の延長時間、30サイクルにわたってアニールした。得られた生成物サイズ：約1963bps XyIR全遺伝子：順方向プライマー（XyIRN.for）：29mer 逆方向プライマー（XyIRn.rev）：29mer PCR条件：プライマーは、45℃で30秒間、2.5分の延長時問、30サイクルにわたってアニールした。得られた生成物サイズ：約2111bps ターミネーターベクターpkk232-8からEscherichia coli 5sリボソームRNAターミネーター（rrnb T1T2）をPCRする。コンピューター分析（PCRプライマー及び増幅）にしたがって、以下のプライマーを設計した：順方向ターミネーター順方向プライマー（Frnb.F）：36mer 逆方向プライマー（rrnb.R）：27mer 生成物サイズ：約390bps 逆方向ターミネーター順方向プライマー（Rrnb.F）：26mer 逆方向プライマー（Rrnb.R）：29mer 生成物サイズ：約380bps 両方の生成物のPCR条件：プライマーは63℃で10秒間、30秒の延長時間、20サイクルについてアニールした。 Xenorhabdus luminescens Lux CDABE遺伝子 X.luminescens.からluxオペロン(CDABE)遺伝子（リボソーム結合部位を含む）をPCRする。以下の遺伝子を単一ユニットとして増幅した：・lux CD ・lux AB ・lux E ・全オペロンlux CDABE コンピューター分析（PCRプライマー及び増幅）にしたがって、以下のプライマーを用いた： Lux CD：順方向プライマー（luxCD.F）：26mer 逆方向プライマー（luxCD.R）：32mer PCR条件：プライマーは、52℃で30秒間、2.5分の延長時間、25サイクルにわたってアニールした。得られた生成物サイズ：約2483bps Lux AB：順方向プライマー（lux.F）：32mer逆方向プライマー（lux.R）：18mer PCR条件:プライマーは、50℃で30秒間、2.0分の延長時間、25サイクルにわたってアニールした。得られた生成物サイズ：約2114bps Lux E：順方向プライマー（luxE.F）：32mer 逆方向プライマー（luxE.R）：30mer PCR条件：プライマーは、45℃で30秒間、2.0分の延長時間、25サイクルにわたってアニールした。得られた生成物サイズ:約1205bps Luxオペロン：順方向プライマー（luxCD.F）：25mer 逆方向プライマー（luxE.R）：30mer PCR条件：Boerhinger延長TM長テンプレートPCRキットを用いた。実際に、最初の10サイクルは次の通り：94℃で10秒間変性させ，・52℃で30秒間アニールし、・68℃で5分間延長させた。次の15サイクルは次の通り：94℃で10秒間変性させ，・52℃で30秒間アニールし、・68℃で5分間延長させ、各延長ステップで20秒間成長増加させた。得られた生成物サイズ：約5831bps 上方トルエン異化経路プロモーター領域 Pseudomonas putidaのTOLプラスミドから上方トルエン異化経路プロモーター（リボソーム結合部位を含む）をPCRする。コンピューター分析（PCRプライマー及び増幅）にしたがって、異化のプライマーを用いた：順方向プライマー（UF）：19mer 逆方向プライマー（UR）：28merPCR条件：プライマーは、58℃で10秒間、30秒の延長時間、25サイクルにわたってアニールした。得られた生成物サイズ：約246bps 補足２：センサー成分として用いられるプロモーターの例

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年５月１９日（１９９８．５．１９）【補正内容】請求の範囲 1.（ａ）検出可能な活性を有し、細菌性ルシフェラーゼＬｕｘＡＢまたはその機能的等価物であるリポーター分子をコードする配列を含む第１の核酸分子、及び、（ｂ）リポーター分子のための基質を生成し、Lux CDE酵素脂肪酸リダクターゼまたはその機能的等価物である酵素をコードする配列を含む第２の核酸分子を含んでなり、第１の配列が、第１の誘導プロモーターの制御下にあり、第２の配列が第２の誘導プロモーターの制御下にある、バイオセンサーで用いるための遺伝子構築物。２．Luxをコードする核酸分子が、ビブリオ、Xenorhabdus、Photorhabd us及び発光菌属に属する生物発光微生物のluxオペロンから得られる、請求項１記載の構築物。３．Puプロモーターが第１のプロモーターであるキシレンの検出に用いるための、請求項１または２記載の構築物。４．実質的に図１４に記載された、請求項３記載の構築物。５．第１のプロモーターが環境シグナルに誘導され、当該誘導が、シグナルによって直接的に、あるいは、該構築物を含む細胞における１つまたはそれ以上の別々の経路の活性化によって間接的に行われる、請求項１から４のいずれかに記載の構築物。６．リポーター分子のプロモーターを介した活性化に必要な補助的成分をさらに含有する、請求項１から５のいずれかに記載の構築物。７．請求項１から６のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む細胞と、細胞が環境シグナルに露出されたとき細胞におけるリポーター分子の活性を測定する手段とを具備するバイオセンサー。８．細胞が、細菌、イースト菌、真菌、及び他の植物細胞及び動物からなる群から選択される、請求項７記載のバイオセンサー。９．細胞が細菌細胞である、請求項８記載のバイオセンサー。１０．細菌細胞が、Escherichia coli.である、請求項９記載のバイオセンサー。１１．環境シグナルが、汚染物質、毒素、温度、照射、生物学的及び化学的なものからなる群から選択される、請求項８から１０のいずれかに記載のバイオセンサー。１２．細胞におけるリポーター分子の活性を測定する手段が、細胞の光出力を測定できる装置である、請求項７から１１のいずれかに記載のバイオセンサー。１３．細胞の光出力を測定できる装置が、光電子倍増管、電荷結合デバイス、蛍光強度計、光度計、光ファイバケーブル、及び液体シンチレーションカウンターからなる群から選択される、請求項１２記載のバイオセンサー。１４．（ａ）請求項７から１３のいずれかに記載のバイオセンサーを、バイオセンサー中の細胞のリポーター分子の発現を誘導するようにシグナルに露出し、その露出の前または最中に、細胞を、基質が細胞内に形成されるように酵素を精製するために誘導し、（ｂ）リポーター分子を、予め形成された基質と反応させて検出可能な反応を生じさせ、そして、（ｃ）当該反応を検出することを具備してなる、環境シグナルの検出方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ヴァンコヴ，トニーオーストラリア国ニューサウスウェールズ 2199 ユウグナミュラロード２エー (72)発明者ジュリー，カレンイギリス国ＮＲ４７ＵＡノーウィッチコロニーレインコロニーリサーチパーク（番地なし）デパートメントオブジェネティクスアンドマイクロバイオロジーインスティテュートオブフードリサーチ

Claims

【特許請求の範囲】 1.（ａ）検出可能な活性を有するリポーター分子をコードする配列を含む第１の核酸分子、及び、（ｂ）リポーター分子のための基質を生成する酵素をコードする配列を含む第２の核酸分子を含んでなり、前記第１の配列が第１の誘導プロモーターの制御下にあり、第２の配列が第２の誘導プロモーターの制御下にある、バイオセンサーで用いるための遺伝子構築物。２．第１の核酸分子が、細菌性ルシフェラーゼLux ABまたはその機能的等価物をコードし、第２の核酸分子が、Lux CDE酵素脂肪酸リダクターゼまたはその機能的等価物をコードする、請求項１記載の構築物。３．Luxをコードする核酸分子が、ビブリオ、Xenorhabdus、Photorhabd us及び発光菌属に属する生物発光微生物のluxオペロンから得られる、請求項２記載の構築物。４．Puプロモーターが第１のプロモーターである、キシレンの検出に用いるための、請求項１から３のいずれかに記載の構築物。５．実質的に図１４に記載された、請求項４記載の構築物。６．第１のプロモーターが環境シグナルに誘導され、当該誘導が、シグナルによって直接的に、あるいは、該構築物を含む細胞における１つまたはそれ以上の別々の経路の活性化によって間接的に行われる、請求項１から５のいずれかに記載の構築物。７．リポーター分子のプロモーターを介した活性化に必要な補助的成分をさらに含有する、請求項１から６のいずれかに記載の構築物。８．請求項１から７のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む細胞と、細胞が環境シグナルに露出されたとき細胞におけるリポーター分子の活性を測定する手段とを具備してなるバイオセンサー。９．細胞が、細菌、イースト菌、真菌、及び他の植物細胞及び動物からなる群から選択される、請求項８記載のバイオセンサー。１０．細胞が細菌細胞である、請求項９記載のバイオセンサー。１１．細菌細胞が、Escherichia coli.である、請求項１０記載のバイオセンサー。１２．環境シグナルが、汚染物質、毒素、温度、線照射、生物学的及び化学的なものからなる群から選択される、請求項８から１１のいずれかに記載のバイオセンサー。１３．細胞におけるリポーター分子の活性を測定する手段が、細胞の光出力を測定できる装置である、請求項８から１２のいずれかに記載のバイオセンサー。１４．細胞の光出力を測定できる装置が、光電子倍増管、電荷結合デバイス、蛍光強度計、光度計、光ファイバケーブル、及び液体シンチレーションカウンターからなる群から選択される、請求項１３記載のバイオセンサー。１５．（ａ）請求項８から１４のいずれかに記載のバイオセンサーを、バイオセンサー中の細胞のリポーター分子の発現を誘導するようにシグナルに露出し、その露出の前または最中に、細胞を、基質が細胞内に形成されるように酵素を精製するために誘導し、（ｂ）リポーター分子を、予め形成された基質と反応させて検出可能な反応を生じさせ、そして、（ｃ）当該反応を検出することを具備してなる、環境シグナルの検出方法。