JP2000511535A - ２型ケモカイン結合蛋白質およびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、急性または慢性の調節不全性炎症反応に関連した疾患症候群に対して、ポックスウイルスによってコードされ、ショープ線維腫ウイルスT1ファミリー蛋白質とのアミノ酸配列相同性を有する新規なケモカイン結合蛋白質（2型CBP）を使用するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 2 型ケモカイン結合蛋白質およびそれらの使用方法 発明の背景 １．発明の分野 本発明は一般に免疫学の分野に関し、特に、種々のポックスウイルスによって コードされるケモカイン結合蛋白質およびそれらの使用方法に関する。 ２．関連技術の記載 高等な脊椎動物の細胞内で生きるウイルスは、宿主免疫系を特別に回避するよ うに進化したに違いないと考えられることが徐々に明らかになってきている（Go oding，L.，Cell，91：5〜7，1992；Marrack，P.およびKappler，J.，Cell，76 ：323〜332，1994；Smith，G.，Trends in Micro.，82：80〜88，1994）。事実 、ウイルスの生存の可否は、外部からの侵入物に対する無数の宿主応答を回避し たり、抑制したり、打ち消したり、混乱させたりすることができる戦略を持つか どうかに応じて決まる。免疫系のエフェクター部分によって加えられる選択圧は 明らかに進化圧の強力な要素でありうると考えられ、今日存在するあらゆる真核 生物ウイルスは、コードされた蛋白質として、またはそれらの独特な生物学的生 存戦略によって証明されるように、免疫系との戦いの痕跡または残存物を含んで いる。 比較的大きいDNAウイルス（すなわち、アデノウイルス、イリドウイルスおよ びポックスウイルス）は、免疫認識および／または感染宿主による排出からウイ ルスを保護するように機能する蛋白質を特別にコードしている。現在、このよう な「破壊性（subversive）」のウイルス蛋白質は、免疫系の機能的操作に関する 情報を提供しており、今後も、この増加しつつあるファミリーの新たなメンバー の発見が数多く行われる可能性が高い。 1980年代には、宿主免疫のさまざまな働きのために重要なサイトカインまたは その他の分泌性調節因子などの細胞外シグナル伝達分子を模倣することによって 機能する、ウイルスによってコードされ、感染細胞から分泌される蛋白質を記述 するために「ビロカイン（virokine）」という用語が提唱された（Kotwal，G., およびMoss，B.，Nature，335：176〜178，1988）。その後、1990年代には、ウ イル スによってコードされるいくつかの蛋白質が重要な細胞受容体を模倣していて、 宿主サイトカインが通常の受容体に作用しないように働くことによって非常に早 い段階で免疫回路網を遮断するとの観察結果を説明するために、「ビロセプター （viroceptor）」という用語が提案された（Uptonら、Virology，184：370，199 1；SchreiberおよびMcFadden，Virology，204：692〜705，1994）。 ポックスウイルスの一つである粘液腫ウイルスに関する最近の研究により、こ のウイルスがさまざまな戦略によって免疫系を破壊することが示されている(McF addenおよびGraham，Seminars in Virology，5：421〜429，1994）。粘液腫ウイ ルスは、粘液腫病と呼ばれる飼育ウサギの悪性全身疾患の原因となる感染性因子 である。粘液腫は19世紀に最初に記載されており、実験動物に関して最初に発見 されたウイルス性病原体であって、疫病撲滅という明確な目的で環境中に計画的 に導入された最初のウイルス性因子でもある。オーストラリアおよび欧州の野生 ウサギ集団に対する放出は40年以上前に行われているため、ウサギおよびウイル スの両方の野外系統は相互に進化圧および選択圧にさらされており、接種が行わ れた地域では定常状態にある常在伝染病となっている（Fenner，F.およびRatcli ffe，F.N.，「粘液腫病（Myxomatosis）」，Cambridge University Press，Lond on，1965）。 粘液腫は、複製部位が細胞質にあり、長い2本鎖DNAゲノム（160キロベース） を持つといった、他のポックスウイルスに付随する生物学的特徴の多くを共有し ている。一連の所見から、粘液腫が他のポックスウイルスと同じく、さまざまな 宿主組織におけるウイルスの伝播および増殖を可能とする機能を持つ複数の遺伝 子産物をコードしていることが示されている。これらのウイルス蛋白質の中には 、宿主の免疫応答および後天的細胞性免疫の発生を特異的に打ち消す、または破 壊するものがあるが、ポックスウイルスは一般にこのような免疫調節性蛋白質の 豊富な供給源である（Turner，P.C.およびMoyer，R.W.，Cur．Top．Microbiol． Imm.，163：125〜152，1990；Buller，R.M.L.およびPalumbo，G.J.，Micro．Dev .,55：80〜122，1991；Smith，G.L.，J.，Gen．Virol.，94：1725〜1740，1993 ；MacFadden，G.,編、「DNAウイルスによってコードされるビロセプター、ビロ カインおよび関連した免疫調節因子（Viroceptors，virokines and related in immune modulators encoded by DNA viruses）」，R.G．Landes Co.，Austin Texas，19 95）。 このような免疫調節性遺伝子産物の例には、細胞の上皮増殖因子受容体を介し たパラクリン様の様式で隣接細胞を刺激する粘液腫増殖因子（MGF）（Uptonら、 J．Virol.，61：1271〜1275，1987；Opgenorthら、Virol.，186：185〜191，199 2；Opgenorthら、Virol.，192：701〜708，1992；Opgenorthら、J．Virol.，66 ：4720〜4731，1992）、初期炎症反応の発生を防止する、セリンプロテアーゼ阻 害活性を有する分泌性糖蛋白であるSerp1（Uptonら、Virol.，179:628〜631，19 90；Lomasら、JBC，268：516〜521，1993；Macenら、Virol.，195：348〜363，1 993）、ウサギTNFと結合してそれを阻害する、細胞の腫瘍壊死因子（TNF）受容 体ファミリーの分泌性ウイルス相同体であるT2（Smithら、BBRC，176：335〜342 ，1991；Schreiber，M.およびMcFadden，G.，前記、1994；Uptonら、前記、1991 ）、ウサギインターフェロン-γと結合してそれを阻害する、細胞のインターフ ェロン-γ受容体の分泌性ウイルス相同体であるT7（Uptonら、Science，258：13 69，1992；UptonおよびMcFadden，Methods in Molecular Genetics，4：383，19 94；Mossmanら、「DNAウイルスによってコードされるビロセプター、ビロカイン および関連した免疫調節因子（Viroceptors，virokines and related immune mo dulators encoded by DNA viruses）」，p.41〜54、McFadden編、R.G．Landes C o.，1995）、および未知の機序によって炎症反応を妨げる表面受容体様蛋白質で あるMI1L（Opgenorthら、前記；Grahamら、Virol，191：112〜124，1992）が含 まれる。 免疫調節性蛋白質には、「ケモカイン」と呼ばれる走化性サイトカインも含ま れる。ケモカインは、白血球、特に好中球、好塩基球、単球およびT細胞に対す る化学誘引物質である低分子量免疫リガンドである。ケモカインには2つの主要 なクラスがあり、これらはいずれも蛋白質の4次構造においてジスルフィド結合 を形成する4つの保存されたシステイン残基を含む。αクラスはC-X-C（Xは任意 のアミノ酸）で示され、これにIl-8、CTAP−III、gro／MGSAおよびENA-78が含ま れ、一方、βクラスはC-Cで示され、これにはMCP-1、MIP-1αおよびβ、ならび にRANTES（regulated on activation，normal T expressed and secreted prote in）が含まれる。クラスの命名は、モチーフ中の最初の2つのシステインの間に 介在性残基の 領域があるか否かによる。一般に、ほとんどのC-X-C型ケモカインは好中球に対 する化学誘引物質であるが単球に対しては作用せず、一方、C-C型ケモカインは 単球には誘引作用があるが好中球には作用しないと考えられる。最近、リンフォ タクチンと呼ばれる新たな蛋白質が発見されたことにより（Kelnerら、Science ，266：1395〜1399，1994）、第３グループのケモカインである「C」グループが 命名された。このケモカインファミリーは、リンパ球および単球が炎症部位に浸 潤するために極めて重要であると考えられている。 未発見の免疫調節性ウイルス遺伝子はほかにも数多いと考えられる。上記のお よび関連した遺伝子産物により、宿主の抗ウイルス防御機構の個々の部分を詳細 に分析するための有用なツールが提供されるだけでなく、細胞免疫のさまざまな 働きの新規な要素、ならびに炎症および免疫系の調節不全を抑制するための新た なクラスの薬剤を同定するための新たなプローブも提供される。発明の概要 本発明は、白血球の走化性に関与しており「ケモカイン」と総称される1つの クラスのサイトカインに関する、可溶性ウイルス特異的阻害因子の新たなファミ リーを記載する。これらの蛋白質は2型ケモカイン結合白質（2型CBP）と呼ばれ 、ショープ線維腫ウイルスおよび粘液腫ウイルス（SFV-T1）によってコードされ るT1蛋白質に関連したポックスウイルス蛋白質のファミリーである。2型CBPおよ び関連した機能的相同体は、発病過程に伴って白血球の過度の流入がみられる種 々の炎症性疾患の治療に有用である。図面の簡単な説明 図1は、走化性サイトカイン（ケモカイン）と結合する、2型CBPファミリーに 属するポックスウイルス蛋白質の既知のメンバーの配列アラインメントを示して いる。RPV 35KDaの配列は不完全である。 図2は、2型CBPを発現する粘液腫T1遺伝子のヌクレオチド配列を示している。 枠で囲んだヌクレオチドトリプレットは、隣接するT2遺伝子（TNF受容体相同体 ）に関する停止コドンであり、矢印は推定されるシグナルペプチドの切断部位を 示し、下線を施したアミノ酸はT1蛋白質に関する２つのN推定グリコシル化部位 である（配列番号：１および配列番号：2）。 図3は、2型CBPファミリーのメンバーの1つであるウサギポックスウイルス（RP V）の35KDa蛋白質が、C-Cファミリーのケモカイン（MIP-1β、上のパネル）およ びC-X-Cファミリー（Il-8、中央のパネル)のメンバーと結合することを示してい る。上部2つのパネルでは、放射性標識されたリガンドを、対照感染BGMK細胞（ 疑似感染）、または粘液腫（MYX）、粘液腫のT7欠失変異体（MYX-T7^-）、ウサギ ポックスウイルス（RPV）およびRPVの35KDa欠失変異体（RPV-35K^-）に感染した 細胞から分泌されたウイルス蛋白質と架橋させている。リガンドとウイルス蛋白 質との架橋複合体を矢印で示す。粘液腫1型CBP蛋白質（T7）もケモカイン類と結 合するが、一番下のパネルに示されている通り、2型CBP蛋白質（T1）は実質的に 同じサイズ（約35KDa）である。このため、粘液腫のT1（2型）およびT7（1型） 蛋白質は両方ともケモカインと結合するが、この活性を持つのはRPV（2型）の35 KDa蛋白質のみである。 図４は、ワクシニア（リスター株）からは得られるがWR株からは得られない35 KDa分泌蛋白質が、RPVの35KDa分泌蛋白質と同様にケモカインMIP-1βと結合する ことを示している。矢印は、MIP-1Bと、リスター株のワクシニアに感染したBGMK 細胞から分泌される35KDa蛋白質との複合体は形成されるが、WR株では認められ ないことを示している。発明の詳細な説明 本発明の所見により、損傷、感染および種々の疾患状態に対する炎症および免 疫応答の時期における循環血中から組織部位へのリンパ球および単球の輸送に関 連した広範な免疫病理学的状態を治療する可能性のある、抗免疫性蛋白質の重要 な新たな供給源が提供される。 クローニングおよび配列決定がなされた2型CBP遺伝子は、最近の総説に記載さ れているように（Kelvin，D.J.ら、J．Leukocyte Biol.，54：604〜612，1993； Murphy，P.M.，Ann．Rev．Imm.，12：593〜633，1994；Horuk，R.，Imm．Today. ，15：169〜174，1994、およびHoruk，R.，Trends in Pharm．Sci.，15：159〜1 65，1994）、そのすべてが7回膜を貫通するドメインを有する（「セルペンチン 」と呼ばれる）既知のケモカイン受容体の分泌性相同体ではない。ポックスウイ ルスにおける少なくとも1つの遺伝子候補を含め（Massung，R.F.ら、Virology，19 7 ：511〜528，1994）、一部のDNAウイルスはこのようなセルペンチン受容体の相 同体をコードするが（Ahuja，S.K.ら、Imm．Today，15：281〜287，1994）、本 発明の2型CBPはこの特定の受容体ファミリーのメンバーではない。 例となる本発明の2型ケモカイン結合蛋白質（2型CBP）は、ショープ線維腫ウ イルスに感染した細胞から分泌される蛋白質の一つであり、T1オープンリーディ ングフレームにコードされる（Uptonら、Virology，160：20〜30，1987およびGe nBank寄託番号第P25946号）。この蛋白質は、ワクシニア（コペンハーゲン株お よびリスター株）およびウサギポックスウイルスの分泌性35KDa蛋白質と有意な 配列類似性を有する。さらに、ウサギIFN-γとは特異的に結合するもののマウス およびヒトIFN-γとは結合せず、しかしケモカインとは結合して1型ケモカイン 結合蛋白と命名されている（以前はケモカイン結合蛋白質-1（CBP-1）と呼ばれ ていた）粘液腫M-T7蛋白質とは、この2型CBP蛋白質は明らかに異なる（Mossman ら、J．Biol．Chem.，270：3031〜3038，1995）。 「ケモカイン結合蛋白質」という用語は、1つまたはそれ以上のケモカインと 結合してそれを阻害する蛋白質を意味する。「ケモカイン」とは、白血球の走化 性をもたらす1つのクラスのサイトカインである。αクラスのケモカインはC-X-C （Xは任意のアミノ酸）で示され、これにはインターロイキン-8（Il-8）、結合 組織活性化蛋白質III（CTAP-III）、メラノサイト増殖刺激活性（MGSA）gro／MG SA）IFN-γ誘導性蛋白質（IP-10）、好中球活性化ペプチド2（NAP2）、β-トロ ンボグロブリン、および上皮由来好中球誘引物質78（ENA-78）が含まれ、C-Cで 示されるβクラスには、T細胞活性化遺伝子3（TCA-3）単球走化性蛋白質（MCP-1 、2および3)、マクロファージ炎症性蛋白質（MIP-1αおよびβ）、ならびにRANT ES（regulated on activation，normal T expressed and secreted protein）が 含まれる。 当技術分野で一般的に用いられている方法によって、その他のケモカインを検 出することもできる。例えば、化学誘引物質のインビトロ研究のために好ましい 微小走化性アッセイ系であるボイデンチェンバー（Boyden chamber）を用いて 分子を検査することもできる。プレキシグラス製ブロック中に、各ウェルが上下 2つの槽からなり、それらが例えばニトロセルロースおよびポリカーボネートな どの いくつかの種類の多孔性フィルターの任意の1つによって区分されているような 一連のウェルを形成する。対象の細胞、例えば末梢血単核細胞（PBMC）を、各ウ ェルの上の槽に加え、例えば化学誘引物質などの被験物質を下の漕に加える。上 の漕の中にある細胞が下の漕の中の物質に誘引されるならば、細胞は溶液中に存 在する理論上の濃度勾配に沿って移動してフィルターの孔の中をゆっくりと進み 、そのフィルターの下側に付着すると考えられる。 そこで現在は、ケモカインファミリーのメンバーであると推測されるポリペプ チドを本発明のCBPを用いてスクリーニングすることができる。したがって、1つ の態様において、本発明は、遊離した、または基質に結合した本発明のCBPと1つ またはそれ以上のケモカインを含むと推測される組成物との接触、およびCBPと 組成物との結合の検出を含む、新規なケモカインをスクリーニングし同定するた めの方法を提供する。 必要に応じて、CBPとケモカインとの結合を検出するための手段として種々の 標識を用いることができる。ケモカインまたはCBPは、例えば放射性同位体、蛍 光化合物、生物発光性化合物、化学発光性化合物、金属キレート剤、または酵素 を用いて、直接的または間接的に検出可能に標識することができる。当業者はそ の他の適切な標識を知っているか、または慣習的な実験によってこの種のものを 確認しうると考えられる。 1つの態様において、本発明は、患者における免疫病理学的疾患を治療するた めの方法であって、還元性SDS-PAGEによって決定されるようなグリコシル化の程 度に応じて約30〜40kDの分子量を有し、SFV T1またはRPV 35KD相同体とのアミノ 酸配列相同性を有し、感染細胞から分泌される性質を持つことを特徴とする、治 療的有効量の抗炎症性蛋白質を該患者に投与することを含む方法を提供する。「 抗炎症性」という用語は、炎症反応を軽減または抑制することを意味する。 グリコシル化または分泌された形態の本発明の2型CBPの見かけの分子量は、還 元性条件下でのSDS-PAGEによって決定された通り、約35〜40kDである。さらに、 この蛋白質はSFV T1およびRPV 35KDa分泌性蛋白質との相同性を有する。「相同 性」という用語は、2型CBPとその他のファミリーメンバーとの間のアミノ酸レベ ルでの一致の程度を意味する。好ましくは、2型CBPはSFV T1蛋白質と50〜95％の ア ミノ酸配列相同性を有する。この相同性に関する必要条件は厳密なものではない が、2型CBPはヒトケモカインに干渉するという生物学的機能は保持している必要 がある。言い換えれば、2型CBPがケモカインと結合してそれを阻害するだけの相 同性があれば十分である。 本発明は、機能的ポリペプチドである2型CBP、およびその機能的断片を含む。 本明細書で用いられる「機能的ポリペプチド」という用語は、規定された機能ア ッセイを介して同定される生物学的な機能または活性を有しており、かつ特定の 生物学的、形態的および表現型の反応に関連するポリペプチドを意味する。2型C BPポリペプチドの機能的断片には、2型CBPの活性（例えばケモカインとの結合） を保持している限りにおいて2型CBPの断片が含まれる。2型CBPの生物活性を含む 低分子ペプチドは本発明に含まれる。このようなペプチドは、本明細書の実施例 において記載されている方法を含む、当業者に公知の方法によってケモカインと の結合性をアッセイすることができる。生物学的機能は、抗体分子が結合しうる ポリペプチド断片ないしはエピトープから、細胞内における特徴的な表現型変化 の誘導またはプログラミングに関与しうる大きなポリペプチドまでさまざまであ りうる。「機能的ポリヌクレオチド」とは、本明細書に記載の機能的ポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチドを指す。 2型CBPの一次アミノ酸配列にわずかな変更を加えることにより、本明細書に記 載される2型CBPポリペプチドと比べて実質的に等価な活性を有する蛋白質が得ら れる可能性もある。このような変更は、部位特異的変異誘発法によるような計画 的なものでも自然発生的なものでもよい。2型CBPの活性が保持されている限り、 これらの変更によって生じるポリペプチドはすべて本明細書に含まれる。さらに 、1つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失によって、その活性を大きく変化させる ことなく結果として得られる分子の構造を変化させることも可能である。これは 、広範な用途を有すると考えられるより低分子量の活性分子の開発につながる可 能性がある。例えば、2型CBP活性に必要でないと思われるアミノ末端またはカル ボキシ末端のアミノ酸を除去することが可能である。 また、本発明の2型CBPポリペプチドには、ポリペプチド配列の保存的変異体も 含まれる。本明細書で用いられる「保存的変異」という用語は、別の生物学的に 類似した残基によるアミノ酸残基の置換を指す。 保存的変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなど の1つの疎水性残基を別のものと置換すること、またはアルギニンとリジンとの 置換、グルタミン酸とアスパラギン酸との置換、もしくはグルタミンとアスパラ ギンとの置換などのように1つの極性残基を別のものと置換することが含まれる 。「保存的変異」という用語には、置換されたポリペプチドに対して産生された 抗体も置換されていないポリペプチドと免疫応答するという条件を満たせば、置 換されていない親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸を用いることも含まれ る。 本発明の方法において用いられる2型CBPのウイルス供給源の例には、その2型C BPが、グリコシル化の程度に応じて約30〜40kDの分子量を有し、SFV T1蛋白質相 同体との相同性を有し、かつこのファミリーの蛋白質の生物学的機能を有するこ とを特徴とする抗炎症性蛋白質の生物学的機能を有する限りにおいて、粘液腫ウ イルス、ワクシニア（リスターまたはコペンハーゲン株）、ショープ線維腫ウイ ルス、ウサギポックスおよびその他の哺乳動物ポックスウイルスが含まれる。 本発明の方法によって治療される免疫病理学的疾患は、ケモカインの産生およ びその結果として生じる罹患組織における反応性白血球の蓄積に関連したもので もよい。本方法は、治療的有効量の2型CBPを患者に投与することを含む。「免疫 病理学的疾患」という用語は、免疫応答または一般的な免疫が関与する任意の疾 患を意味する。本明細書で用いられる「治療的に有効である」とは、免疫病理学 的疾患の原因を改善するために十分な2型CBPの量を意味する。「改善」とは、治 療を受ける患者における疾患の障害作用を軽減することを意味する。本発明の対 象は好ましくはヒトであるが、例えばヒト骨髄を移植されたSCIDマウス（ヒト化 SCID）などの免疫病理学的疾患を有する任意の動物を本発明の方法によって治療 できることが想起しうる。本発明の方法によって治療しうる免疫病理学的疾患の 例には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、毒素性ショック症候群、同種移植片拒 絶、アテローム動脈硬化性粥腫の増殖、紫外線および放射線反応、ならびに免疫 応答および急性期反応の時期におけるT細胞、B細胞、マクロファージおよびその 他の炎症性白血球の活性化を伴う疾患、ならびに進行癌に伴う腫瘍壊死因子媒介 性悪液質などの疾患が含まれる。 本発明は、敗血症の症状を呈しているか、または敗血症を発症する危険性のあ る患者に対して治療的有効量の2型CBPを投与することを含む、内毒素血症もしく は敗血性ショック（敗血症）または敗血症の1つもしくはそれ以上の症状を含む 免疫病理学的疾患を治療または改善するための方法を提供する。「改善」という 用語は、治療しようとする疾患の症状を減少させるかまたは軽減することを意味 する。 免疫病理学的疾患の症状を呈している患者を、2型CBPによる投与に加えて抗生 物質または抗ウイルス薬を用いて治療してもよい。典型的な抗生物質には、ゲン タマイシンなどのアミノグリコシド、またはペニシリンもしくはセファロスポリ ンなどのβラクタムが含まれる。したがって、本発明の治療法には、治療的有効 量の2型CBPを、殺菌量の抗生物質または十分量の抗ウイルス性化合物の投与と実 質的に同時に投与することが含まれる。 本明細書で用いられる「殺菌量」という用語は、治療を受ける患者において殺 菌性血中濃度を達成するために十分な量を意味する。抗生物質の殺菌量がヒトへ の投与に関して安全であると一般に認識されていることは当技術分野では周知で あり、当技術分野で知られているように、その量は個々の抗生物質および治療し ようとする細菌感染症の種類によって異なる。好ましくは、2型CBPの投与は、抗 生物質の投与から約48時間以内、好ましくは約2〜8時間以内、最も好ましくは実 質的に同時に行われる。 本発明の方法における2型CBPの投与を、再潅流後障害の改善のために用いても よい。動脈血栓症を治療する際には、組織プラスミノーゲン活性化因子（t-pA） などの血栓溶解薬による再潅流の導入がしばしば組織障害の原因となることがあ る。このような組織障害は少なくとも部分的には、多核白血球（PMN）を非制限 的に含む白血球を介すると考えられている。したがって、2型CBPの投与は、白血 球またはPMNと内皮との相互作用を遮断し、それによって再潅流後障害を軽減ま たは防止すると考えられる。また、2型CBPの投与は、動脈損傷後に新たに発生し たまたは再発性のアテローム動脈硬化性粥腫の増殖を子防するのにも有用である 。再狭窄および粥腫の新たな増殖は、動脈壁の内層に対する局所的な炎症反応に よって悪化すると考えられている。 本発明の方法はまた、アレルギー性または自己免疫疾患に起因する炎症の治療 にも有用である。アレルギー性疾患の例には、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピ ー性皮膚炎および食物アレルギーが含まれる。免疫系が宿主自身の組織を攻撃す る自己免疫疾患の例には、1型インスリン依存型糖尿病、炎症性腸疾患、皮膚炎 、髄膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、脳炎、ぶどう膜炎 、白血球粘着異常症、リウマチ性およびその他の形態の免疫性関節炎、リウマチ 熱、ライター症候群、乾癬性関節炎、進行性全身性硬化症、原発性胆汁性肝硬変 、天疱瘡、類天疱瘡、壊死性血管炎、重症筋無力症、多発性硬化症、エリテマト ーデス、多発性筋炎、サルコイドーシス、肉芽腫症、血管炎、悪性貧血、CNS炎 症疾患、抗原抗体複合体媒介性疾患、自己免疫性溶血性貧血、橋本甲状腺炎、グ レーブス病、習慣性自然流産、レイノー症候群、糸球体腎炎、皮膚筋炎、慢性活 動性肝炎、小児脂肪便症、AIDSの自己免疫性合併症、萎縮性胃炎、強直性脊椎炎 およびアジソン病が非制限的に含まれる。 本方法は、乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症候群、急性呼吸窮迫症候群（ ARDS）、虚血性心疾患、アテローム性動脈硬化症、透析後症候群、白血病、後天 性自己免疫不全症候群、敗血性ショックおよび他の種類の急性炎症、ならびに脂 質性組織球症などの、非悪性または免疫に関連した細胞増殖性疾患の治療にも有 用である。本質的には、ケモカインの産生に起因する炎症誘発性過程および細胞 浸潤（例えば、IL-8、MIP-1αまたはβ発現の誘導）がその病因に関連している あらゆる疾患が、治療に対して感受性を持つと考えられる。 本発明の方法は、微生物感染症の治療にも有用である。細菌、リケッチア、種 々の寄生生物およびウイルスなどの多くの微生物は、血管内皮および白血球と結 合し、例えば結果としてインターロイキン類の産生をもたらすような炎症反応を 誘導する。このため、このような感染症に起因する炎症を予防するために、患者 本発明の方法で用いられる2型CBPを投与してもよい。 本発明の2型CBPの投与に関する用量の範囲は、免疫応答の症状が一定の程度の 抑制を示すような所望の効果が生じる十分な高用量である。用量は、望ましくな い交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほどには高 くない必要がある。一般に、用量は、年齢、状態、性別および患者における疾患 の程度に伴って変化すると考えられ、当業者にはその決定が可能である。何らか の相対する適応症（counterindication）がある場合には、個々の医師が用量を 調整することが可能である。用量は1回の投薬当たり約10pgから100μｇまでの範 囲であってよく、1日または数日にわたって1日に1回またはそれ以上の用量を投 与しうる。 2型CBPは、非経口的、皮下、肺内、動脈内、直腸内、筋肉内および鼻腔内投与 を含む任意の手段によって投与される。非経口的注入には、筋肉内、静脈内、動 脈内または腹腔内投与が含まれる。また、2型CBPを、例えば徐放性皮下インプラ ントの形態で経皮的に、またはカプセル剤、散剤もしくは顆粒剤の形態で経口的 に投与することもできる。また、2型CBPを吸入によって投与することもできる。 例えば、肺の炎症性疾患の治療のために治療的に用いる際には、好ましい投与経 路は肺エアロゾルによるものと考えられる。 非経口的投与のための薬学的に許容される担体調製物には、滅菌または水性も しくは非水性の溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例には、プ ロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およ びオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルがある。水性担体には、生理 食塩水および緩衝性媒体を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液または懸 濁液が含まれる。非経口用溶媒には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロ ース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳化リンゲル液または固定油が 含まれる。治療的有効成分はしばしば、薬学的に許容され有効成分と適合性のあ る賦形剤と混合される。適した賦形剤には、水、生理食塩水、デキストロース、 グリセリンおよびエタノール、またはそれらの混合物が含まれる。静脈用溶媒に は、液体および栄養分の補液、リンゲルデキストロース液をベースとするものな どの電解質補液などが含まれる。例えば抗菌薬、酸化防止剤、キレート剤、およ び不活性ガスなどの防腐剤およびその他の添加物が存在してもよい。 本発明はまた、本発明の2型CBPを含む医薬品または薬学的組成物を調製するた めの方法であって、該医薬品が望ましくない免疫応答／炎症反応の治療のために 用いられ、該免疫応答が本発明の2型CBPと結合するケモカインの産生をもたらす ような方法に関する。 本発明は、グリコシル化の程度に応じて約30〜40kDの分子量を有し、粘液腫T1 インターフェロン-γ受容体相同体とのアミノ酸相同性を有し、かつ粘液腫T1イ ンターフェロン-γ受容体相同体の生物学的機能を有することを特徴とする免疫 治療的有効量の抗炎症性蛋白質の少なくとも1回分の用量を薬理学的担体中に含 む薬学的組成物を提供する。 本発明は、本発明の方法において用いるための本発明の2型CBPを含む薬学的製 剤および組成物を提供する。その形態は投与経路に応じて異なると考えられる。 例えば、注射用の組成物は、それぞれが1単位分の用量を含むアンプルの形態、 または複数回分の用量を含む容器の形態で提供することができる。 2型CBPは、中和された薬学的に許容される塩の形態としての治療的組成物とし て処方することもできる。これらには、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸 、または酢酸、シュウ酸、酒石酸などの有機酸を用いて形成される酸添加塩が含 まれる。また、塩には、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウ ムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリエチル アミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から形成されるものも含まれる 。 制御された送達は、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリ ドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロ ース、硫酸プロタミン、またはラクチド／グリコリド共重合体などの適切な巨大 分子を選択することによって達成されると思われる。2型CBPの放出速度は、巨大 分子の濃度を変化させることによって制御されると考えられる。 作用持続時間を制御するためのもう1つの方法には、ポリエステル、ポリアミ ノ酸、ヒドロゲル、ポリラクチド／グリコリド共重合体、またはエチレンビニル アセテート共重合体などの重合性物質の粒子中に2型CBPを組み込むことが含まれ る。または、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイク ロカプセルもしくはポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルを用いること によるコアセルベーション法もしくは界面重合などによって、またはコロイド性 薬物送達システム中にて、調製されたマイクロカプセル中に2型CBPを封入するこ とも可能である。コロイド分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微粒子 、 ビーズ、ならびに水中油型乳濁液、ミセル、混成ミセルおよびリポソームなどの 脂質に基づく系が含まれる。 以下の実施例は例示を目的としており、本発明を制限するものではない。それ らは使用されると思われるものの典型であるが、当業者に公知のその他の手順を 代替的に用いてもよい。 実施例1 材料および方法 損傷誘発性アテローム性動脈硬化症のラットモデル スプレーグ-ドーリー（Sprague-Dawley）ラットの右または左の腸骨大腿動脈 にバルーン血管形成術を介した損傷を加えた。ペントバルビタールによる全身麻 酔下（Somnotrol，MTC Pharmaceuticals，Cambridge，Ontarioを体重100g当たり 6.5mgで筋肉内注射）での動脈切開による切開部を介して1.5mmのUSCI血管形成用 バルーンを動脈内に逆行性に進めた。血管形成用バルーンカテーテルの遠位管腔 内へのCBPまたは対照溶液の動脈内注射によって、後にバルーンを介した損傷を 加える予定部位から上流に、CBP 500pg（ラット6匹）または生理食塩水（ラット 6匹）を投与した。続いてバルーンを1.0分間にわたり気圧8バールにして膨張さ せた。血管形成術の後にバルーンから空気を抜いて抜去し、n-ブチルシアノアク リレートモノマー（Nexaband，Veterinary Products Laboratories，Phoenix，A rizona）の局所塗布によって動脈切開部位を閉鎖した。各ラットにラット用普通 食を与えて飼育し、術後４週間にわたり追跡調査を行った。追跡調査時には、体 重1kg当たり2.0mlのユータニル（euthanyl）によってラットを屠殺し、動脈を組 織検査のために回収した。損傷誘発性アテローム性動脈硬化症のウサギモデル コレステロール食を与えたニュージーランドホワイト種ウサギ8匹の腹部大動 脈遠位部にバルーン血管形成術による処置を行う。バルーン損傷を加える2週間 前から、すべてのウサギ（ニュージーランドホワイト種）に4日／週にわたって2 ％コレステロールを含む10％ピーナッツ油食を与える。麻酔を施した後（40mg／ kgのケタレアン（ketalean）、8mg／kgのキシラゼン（xylazene）および0.5mg／ kgのアセプロマジンの筋肉内注射）に、大体動脈切開部を介して径3〜3.5mmの血 管形 成用バルーンカテーテル（バルーンと動脈径との比は1.1以上）を導入する。腹 部大動脈遠位部においてバルーンを気圧8バールにして膨張させ、胸部大動脈遠 位部の方に逆行性に進める。確実に内皮裸出が行われるように、各ウサギにおい て蛍光透視下にてバルーンの進行および引き戻しを3回行う。バルーン血管形成 術を介した外傷を加える前後、および4週間の追跡調査時に血管造影図を記録す る。カテーテルによる血栓症の発生を抑えるために、大腿部への到達が得られた 直後にヘパリン（400単位）を投与する。 4匹のウサギの腹部大動脈遠位部には、バルーンを介した損傷を加えた直後に 、1試料当たり500pgの精製された2型CBPを注入する。4匹のウサギにはこれと平 行して腹部大動脈遠位部に生理食塩水の局所注入を行う。各注入物は、0.9％の 滅菌生理食塩水で希釈して総容積を10mlにした上で、バルーンを介した損傷を加 えた直後にウォリンスキー（Wolinsky）カテーテルを介して投与する。注入はす べて、腸骨分岐部よりも近位側の腹部大動脈中に挿入された3.25mmのウォリンス キーバルーンを介して行う（最終気圧を６±1バールにして2分間膨張させる）。 ウォリンスキーバルーンは、潅流バルーンが規則的に分岐部から0.5〜2.5cmだけ 上に位置するように蛍光透視下にて腸骨分岐部のすぐ上に配置し、これを一次注 入部位と命名する。上流の二次部位は、腸骨分岐部の近位側2.5cmよりも上の領 域内に規定される。すべての実験において、注入物は、滅菌0.9％生理食塩水で 希釈して総容積を10mlにした上で、バルーンを介した損傷を加えた直後にウォリ ンスキーカテーテルを介して投与する。注入はすべて、腸骨分岐部よりも近位側 の腹部大動脈中に挿入された3.25mmのウォリンスキーカテーテルを介して行う（ 最終気圧を6±1バールにして2分間膨張させる）。組織分析および形態計測分析 形態分析は、潅流バルーンの最初の配置によって規定される一次注入部位であ る、腹部大動脈遠位部（ウサギ）または腸骨大腿動脈上方（ラット）におけるウ ォリンスキーカテーテルの一次部位で実施する。ウサギでは、下流に位置する腸 骨分岐部付近の非注入部位（分岐部の0.5cm上方から0.5cm下方の範囲）および上 流に位置する非注入部位（腹部大動脈の上側、腸骨分岐部の2.5〜3.5cm上方）か ら内部対照切片を採取する。腸骨分岐部から1.5〜2.5cm上方の領域は、バルーン の位置により一定でない用量の注入が行われた可能性のある境界領域であると考 えられ、このため本分析には含めない。ラットでは、T-1処理ラットおよび生理 食塩水注入ラットの両方に関して、一次バルーン部位を組織評価のために用いた 。すでに記載されている通りに、ホルマリン固定標本にヘマトキシリンおよびエ オジン染色を行った。簡潔に示すと、それぞれの標本を10％（v／v）リン酸ナト リウム緩衝ホルマリン中にて固定し、処理し、含浸させ、パラフィン中に包埋し 、ミクロトームによって5μｍ切片を作成した。続いて、各標本からの切片（1部 位当たり最低2切片）をヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、光学顕微鏡で 観察した。 実施例2 サイトカインと新規ウイルス蛋白質との結合 簡潔に示すと、種々のヒトサイトカインを¹²⁵Iによって放射性標識し、対照ま たはポックスウイルスに感染したBGMK細胞から回収した分泌性蛋白質に対して曝 露し、架橋させた後、続いて新規サイトカイン／蛋白質複合体の有無に関してSD S-PAGEによって分析した。 架橋アッセイにより、検討したヒトケモカイン、すなわちIL-8およびMIP-1β のそれぞれに結合した新規なウイルス特異的蛋白質が何であるかが判明した（図 2）。図2（上の2つのパネル）は、ヨウ素化したリガンドおよび組織培養上清を 用いるゲル移動度シフトアッセイを示している。組織培養上清（Sups）は以下の 通りに調製した：BGMK（仔ミドリザルの腎細胞）を、非処理（疑似感染）または 感染多重度（MOI）3の条件で粘液腫（MYX）、粘液腫のT7欠失変異体（myx-T7-) 、ウサギポックス（RPV）もしくはRPVの35kDa欠失体に感染させた。感染から4時 間後に単層をPBSで3回洗って無血清培地を補添し、続いてこれらの上清を感染後 18時間目に回収することによって、分泌された蛋白質を調製した（L）。ウイル スの非存在下において疑似上清（mock supernatant）を同じ方法で調製した。上 清はアミコン（Amicon）濃縮器を用いて約15倍に濃縮した。ヨードビーズ（iodo beads）（Pierce社）を製造者の手順書に従って用いて、ヒトケモカインIL-8お よびMIP-1βを¹²⁵Iで標識した。 ゲル移動度シフトアッセイは以下の通りに実施した：ヨウ素化したリガンド5 μ ｌをSUP10μｌと混合し、室温で2時間放置した。続いて、化学的架橋剤である1- エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDC）（pH7.5の100m Mリン酸カリウム中に200mMを含むもの）を添加して15分間おき、続いてさらに2 μｌを添加して15分間おいた。続いてTris-HCl2μｌ（1.0M，pH7.5）を添加する ことによって反応を停止させた。結果として得られた混合物をSDS-PAGEおよびオ ートラジオグラフィーを用いて分析した。矢印は移動した複合体を示す。一番下 のパネルは、myx-T7-感染物におけるT7蛋白質の喪失およびRPV-35k^-感染物にお ける35KDa蛋白質の喪失を示す、クーマシーブルー染色を施したゲルを示してい る。 実施例3 ラット大腿動脈における血管形成バルーンを介した損傷において示された、 抗再狭窄蛋白質としての2型CBP（T1）の有効性の分析 炎症には、動脈壁におけるアテローム動脈硬化性粥腫の発生促進が伴っている 。バルーン血管形成術または閉塞した動脈を開通させるために設計された他の類 似した血管形成用装置を使用した後の、粥腫の再発または再狭窄の頻度は高い。 アテローム動脈硬化性粥腫の増殖促進は、動脈損傷、ウイルス感染、血管炎、ホ モシスチン尿症、糖尿病、高血圧、高脂血症、喫煙および免疫複合体形成性疾患 につながる条件下でも報告されている。比較的大きなDNAウイルスは、宿主の免 疫および炎症防御機序による阻害を低下させて宿主内でのウイルスの増殖を可能 にする、抗炎症性蛋白質などの機序を進化させている。血管形成術後の粥腫の増 殖を予防するための有望な治療薬として2型CBP（T-1）を検討した。2型CBPは、 インターフェロンγ受容体相同体およびケモカイン阻害因子の両方として作用す ると考えられている。損傷誘発性アテローム性動脈硬化症の動物モデルにおいて 2型CBPを検討したところ、その結果、注入4週後に粥腫形成の有意な低下が示さ れた。ワクシニアウイルスから単離された2型CBPである35KDaは、単回の静脈内 注射後にバルーン血管形成損傷後の内膜増殖（アテローム動脈硬化性粥腫の増殖 ）を有意に低下させた（表1）。これは、免疫に基づく疾患の治療または予防の ための抗炎症薬として2型CBPを使用しうることを示している。 スプレーグ-ドーリー（Sprague-Dawley）ラット10匹に対して、全身麻酔下に て右腸骨大腿動脈にバルーン損傷を加えた。大腿動脈切開部を介して1.5mmの血 管形 成用バルーンを動脈内に導入し、バルーンの遠位端を腸骨分岐部まで進めた。バ ルーンを膨張させる直前に、生理食塩水（ラット５匹）または徐々に高くなる濃 度の精製ワクシニア35K蛋白質、50pg（ラット5匹）のいずれか1mlを動脈内に注 入した。続いてバルーンを気圧6〜8バールにして2分間膨張させ、空気を抜いて 抜去した。カテーテル抜去後に大腿動脈の穿剌部位をネクサバンド（nexaband） で閉鎖した。ラットを回復させ、4週間にわたってモニターした。4週時点でラッ トを屠殺し、組織評価のために動脈を回収した。形態計測分析によって内膜領域 を測定した。生理食塩水を注入した対照と比べて、35KDa蛋白質の注入後には、 内膜増殖（粥腫領域）の有意の低下が検出された（p＜0.0089）（表1）。 実施例4 CBP-II はヒト単球の細胞受容体に対するケモカインの結合を阻害する ワクシニア（リスター株）（表1およびM-1T（表3）由来のそれぞれの35KDa蛋 白質による、ヒトMIP-1αと初代ヒト単球およびTHP-1細胞の表面受容体との結合 の阻害が、以下の手順に従って示された。（注：表1および2における実験3にはT HP-1細胞を用い、それ以外のすべての結果は初代単球を用いて得た）。 放射性標識した¹²⁵I MIP-1α（25μCi／ml）を入手し、それぞれの管に50,000 cp・が含まれるように、適当な容積の放射性標識した（hot）MIP-1αを添加した 。対照として、バックグラウンド結合を示すために、非標識（cold）MIP-1α（4 00ng）を放射性標識（hot）MIP-1αと平行して添加した。35KDa M-T1（CBP-2） およびM-T7（CBP-1）の阻害特性を測定するために、さまざまな用量の阻害因子 を放射性標識したリガンドとともに添加し、試料を37℃で30分間インキュベート した（5％C0₂）。ヒト血液から単離してパーコール勾配上で分離した初代単球を 1％BSAを含むRPMI1640によって１×10⁷細胞／mlの濃度になるように希釈し、こ れらの細胞の200μｌをそれぞれの反応物に添加した。THP-1細胞（単球性細胞系 列）についても同様の濃度を用いた。サンプルチューブに室温で1時間遠心処理 を施し、13, 000rpmで5分間処理して細胞を遠心沈殿させた。上清を除去して、細胞を10％シ ョ糖水溶液800μｌで洗浄した。細胞に再度13,000rpmで10分間の遠心処理を行い 、上清を除去した。続いてガンマ線測定器を用いてペレットの放射活性を測定し た。２つ目の対照セットとして、阻害因子の存在下におけるH³-fMLPの細胞受容 体に対する結合特性も検討した（表4）。それぞれのチューブに均一に１μｌの 容積を分配したことを除いて、上記の手順を繰り返し、その結果、チューブ1本 当たり約180,000cpmの計数値を得た。35KDaおよびM-T1が両方とも、ケモカイン とMIP-1αの細胞受容体との結合を量的に遮断したことは注目に値する。 注：実験3にはTHP-1細胞を用い、実験1および2には初代単球を用いた。 本発明は現時点で好ましい態様を参照しながら説明してきたが、本発明の精神 を逸脱することなくさまざまな変更を成しうることが理解される必要がある。し たがって、本発明は以下の請求の範囲によってのみ制限される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/00 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/566 33/566 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者におけるケモカインに関連した免疫病理学的疾患を治療するための方法 であって、配列番号：2に示されたアミノ酸配列を有する治療的有効量のケモカ イン結合蛋白質を該患者に投与することを含む、方法。 ２．ケモカインがクラスαまたはクラスβのケモカインである、請求項1記載の 方法。 ３．ケモカインが、CTAP-III、gro／MGSA、ENA-78、MCP-1、インターロイキン-8 、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、PF-4、IP-10およびNAP-2からなる群より選択され る、請求項2記載の方法。 ４．免疫病理学的疾患が、微生物感染、悪性腫瘍および転移、喘息、冠動脈再狭 窄、自己免疫疾患、肝硬変、内毒素血症、アテローム性動脈硬化症、ならびに再 潅流障害からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 ５．患者への抗生物質または抗ウイルス薬の投与をさらに含む、請求項1記載の 方法。 ６．抗炎症性蛋白質の投与が投与1回当たり約10pgから100μｇの用量で行われる 、請求項1記載の方法。 ７．抗炎症性蛋白質の投与が、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、直腸内、および 経皮的投与からなる群より選択される、請求項1記載の方法。 ８．薬学的に許容される担体中に、配列番号：2に記載のアミノ酸配列を有する 免疫治療的有効量の抗炎症性蛋白質の少なくとも1投与量を含む、薬学的組成物 。 ９．抗炎症性蛋白質が2型ケモカイン結合蛋白質である、請求項8記載の組成物。 10．ケモカインがクラスαまたはクラスβのケモカインである、請求項9記載の 組成物。 11．ケモカインが、CTAP-III、gro／MGSA、ENA-78、MCP-1、インターロイキン-8 、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、PF-4、IP-10、およびNAP-2からなる群より選択さ れる、請求項10記載の組成物。 12．ケモカインを同定するための方法であって、約30〜40kDの分子量およびSFV- T1ファミリーの蛋白質とのアミノ酸相同性を有するケモカイン結合蛋白質とケモ カインであると推測される組成物とを接触させる段階、および該ケモカイン組成 物とケモカイン結合蛋白質との結合を検出する段階を含む、方法。