JP2000511427A

JP2000511427A - Nematode-inducible plant gene promoter

Info

Publication number: JP2000511427A
Application number: JP10500116A
Authority: JP
Inventors: アンドレアスオウル，スティーブン; クリスティアンシモンズ，ペーター; デルリー，フレデリックマリアンヌバン; ヨハネスマリアゴディン，オスカー; クラプ，ジョーク
Original assignee: モーヘンインターナショナルエヌ．ブイ．
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2000-09-05
Also published as: HUP9903512A3; WO1997046692A1; RU2198219C2; HUP9903512A2; AU707563B2; BR9612635A; CA2257149A1; EP0904387A1; AU6222296A

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物中に再導入された場合に、結合したDNA配列の根瘤およびシスト線虫誘導性転写を促進し得る、Arabidopsis thalianaから入手可能なDNAフラグメント、ならびにそのDNAフラグメントの使用を提供する。 (57) [Summary] The present invention provides DNA fragments available from Arabidopsis thaliana, as well as the use of the DNA fragments, which, when reintroduced into a plant, can promote nodules and cyst nematode-induced transcription of the bound DNA sequence. .

Description

【発明の詳細な説明】線虫誘導性植物遺伝子プロモーター本発明は、植物細胞中のDNA配列を発現するために使用され得る調節DNA配列に関する。本発明はさらに、植物細胞中で発現されるDNAに作動可能に連結されたこの調節DNA配列を含むキメラDNA、ならびにこのようなキメラDNAをそれらの細胞中に含む植物を含む。本発明はさらに、植物寄生性線虫またはそれらの影響に抵抗性であるかまたは少なくともより感受性でない植物を作製するための方法、ならびに細胞、植物、およびそれらの部分に関する。技術水準国際特許出願WO92/17054には、Arabidopsis thalianaからの線虫応答性調節DN A配列の同定およびそれに続く単離のための方法が開示される。 WO 92/21757では、いくつかの調節DNA配列が、Lycopersicon esculentumから単離されている。これは、根瘤線虫であるMeloidogyne incognitaに応答性である。これらの調節配列の一部（Lycopersicon esculcntum−Meloidogyne incogni taについてはLEMMI）は線虫により刺激されるが、他の調節配列は線虫により抑制されるようである。いずれの誘導性調節配列が、広範な範囲の線虫により刺激されるか否かは知られていない。根瘤線虫Meloidogyne incognitaにより誘導性である別の調節配列は、WO93/06 710に開示される。この調節配列TobRb7の不都合は、TobRb7が多くのシスト線虫、中でもHeterodera種およびGlobodera種により活性化されないことである。このことは、TobRB7配列を、例えば、ジャガイモにおいてシスト線虫抵抗性を目的とするキメラ構築物における使用に不適切なものとする。本発明の目的の１つは、シスト線虫および根瘤線虫の両方により誘導され得、そして線虫の摂食構造の内側で、好ましくは、しかし必ずというわけではないが、実質的な摂食部位特異的な方法で、それらの制御下で異種DNA配列を発現するために使用され得る、調節DNA配列を提供することである。発明の要旨本発明は、植物中に再導入された場合に、結合したDNA配列の根瘤およびシスト線虫誘導性転写を促進し得る、Arabidopsis thalianaから入手可能なDNAフラグメントを提供する。本発明により好ましいのは、配列番号４のヌクレオチド１〜2361により示される配列である。また認識されるのは、植物中に再導入された場合に、結合したDNA配列の根瘤およびシスト線虫誘導性転写を促進し得る、本発明によるDNAフラグメントの部分または改変体である。本発明のなおさらに好ましい局面は、実質的に線虫摂食部位特異的である調節DNAフラグメントを含む。本発明のさらなる実施態様は、転写の方向において、本発明による調節DNAフラグメント、およびその転写制御下で発現されるDNA配列であって、そして天然ではそのDNAフラグメントの転写制御下にないDNA配列を含む、キメラDNA配列を含む。本発明によるキメラDNA配列の中でも好ましいのは、発現されるDNA配列が、植物細胞破壊物質（例えば、バルナーゼ）の生成を生じるキメラDNA配列である。異なる実施態様において、細胞破壊物質は、細胞の生存能力に必須なRNAに相補的なRNAを含む。なお別の実施態様において、発現されるDNA配列が、誘導する線虫に対して毒性の物質の生成を生じる。本発明は、本発明によるDNAフラグメントまたはキメラDNA配列を含むレプリコン、このようなレプリコンを含む微生物、ならびにそれらのゲノムの中に本発明によるキメラDNA配列を取り込んでいる植物細胞においてさらなる使用を見出す。さらに有用な実施態様は、本発明による細胞から本質的に構成される植物の根系、ならびに本発明による細胞から本質的に構成される完全に成長した植物、好まし，くは双子葉植物、より好ましくはジャガイモ植物である。また認識されるのは、本発明による根系に接ぎ木された植物、ならびに種子、花、塊茎、根、葉、果実、花粉、および木部から選択される植物部分、およびこのような植物を含む作物である。本発明はまた、植物中の結合したDNA配列の転写を促進し得るサブフラグメントを同定するための、本発明によるDNAフラグメントの使用を包含する。また認識されるのは、植物を形質転換するための、本発明によるキメラDNA配列の使用である。本発明はさらに、ハイブリッド調節DNA配列を作製するための、本発明による調節DNAのフラグメント、部分、または改変体の使用を提供する。以下の図は本発明をさらに例示する。図の簡単な説明図１．バイナリーベクターpMOG23の模式的なプラスミドマップ。図２．バイナリーベクターpMOG800の模式的なプラスミドマップ。図３．バイナリーベクターpMOG553の模式的なプラスミドマップ。図４．バイナリーベクターpMOG819の模式的なプラスミドマップ。図５．バイナリーベクターpMOG849の模式的なプラスミドマップ。図６．いくつかのpMOG849形質転換Arabidopsis thaliana系統のNFSの外側の発現パターン。図７．線虫抵抗性植物の操作のための２成分系におけるNFS破壊遺伝子および中和遺伝子の模式図。図８．バイナリーベクターpMOG893の模式的なプラスミドマップ。本発明を実施するいくつかの方法ならびに種々の句の意味を以下でより詳細に説明する。発明の詳細な説明本発明は、Arabidopsis thalianaから入手可能な調節DNA配列を提供する。これは根瘤およびシスト線虫により誘導可能であり、そして植物根の特殊な線虫摂食構造の内部で、任意の結合したDNAの発現の高い優先性を示す。このような線虫摂食構造は、侵入する線虫によって食物の供給源として使用され、それにより線虫は植物組織における変化を誘導し、それにより巨細胞（根瘤線虫）またはシンチウム（シスト線虫）のいずれかを形成する。調節DNA配列を単離する方法は開示され、そして先行の出願（WO92/17054）において請求され、これは本明細書中に参考として援用される。主に、本発明による調節DNA配列が、異種DNAをこの調節DNA配列の制御下に配置し、そして植物を公知の方法を用いて得られるキメラDNA配列で形質転換することにより、選択した任意の植物において任意の異種DNAを発現するために使用され得る。異種DNAは、種々の根瘤線虫（例えば、Meloidogyne incognita）、およびシスト線虫（例えば、Heterodera schachtiiおよびGlobodera pallida（より包括的な一覧が表２に示されるが、これらに限定されない））による根の感染に際して発現される。都合良く、植物寄生性線虫に対して低減した感受性を有する植物を作成するために、異種DNAは、植物寄生性線虫に対して毒性または阻害性である物質をコードする遺伝子から構成され得る。そこには、多数のこのような毒性物質の例（例えば、Bacillus thuringiensis（例えば、EP 0 352 052）のエンドトキシン、レクチンなど）が存在する。植物寄生性線虫に対して低減した感受性を有する植物を作成するためのより好ましいアプローチは、本発明による調節DNA配列の制御下で植物毒性物質を発現することによる、植物根の特殊化した摂食構造の破壊にある。このアプローチの一般原理は、国際特許出願WO92/21757、WO93/10251、およびWO94/10320に開示され、そして請求されており、これらは参考として本明細書に参考として援用される。一貫性のために、植物毒性物質は、本明細書中以下で線虫摂食部位（NFS）破壊物質として言及される。本発明による調節DNA配列は、線虫摂食構造に実質的に特異的であるが、これは、それらの制御下でNFS破壊物質が非標的（すなわち、非NFS）組織における発現に起因して植物生存能および/または収量に対する有害な効果を有することであり得る。さらに、本発明による調節DNA配列は、形質転換手順における組織培養段階の間活性であり、この段階中、中和物質の使用を必要とする。従って、（潜在的な）有害な効果を低減または除去するために、中和遺伝子構築物と併用して、本発明によるキメラNFS-破壊構築物を使用することが非常に好ましい。線虫耐性植物の操作をするためのこのようないわゆる２成分アプローチの詳細は、WO 93/10251に説明される。このアプローチに従って、NFS-破壊化合物（コード配列 -Ａ）は、NFSにおいて少なくとも活性であるプロモーターの制御下に配置され、そして好ましくはNFSの外部では活性ではないか、またはほとんど活性ではなく、一方NFSの外部の所望でない植物毒性効果は、NFSを除いて破壊物質が産生されるこれらの組織において少なくとも発現される中和化合物（コード配列-Ｂ）により中和される。２成分アプローチに従って、適切なプロモーターＡは、NSFの代謝および／または機能および／または生存能に対して十分に有害なレベルで、下流コード配列のNFSの内部での発現を駆動するプロモーターとして規定される。一方このプロモーターは、好ましくはNFSの外部の組織において不活性であるが、必須ではない；コード配列-Ａによりコードされる破壊物質の活性がコード配列-Ｂからの生成物により十分に中和され得ないようなレベルで、少なくともNFSの外部では決して活性ではない。本発明による調節DNA配列（特に＃1164の４、2.1および1.5kBpのフラグメント）の特性は、本明細書中の実施例の方法により示される２成分アプローチにおいて、それらを非常に有用にする。明らかに、ヌクレオチド配列における欠失、付加、および改変ならびに／またはそれらの組合せのような多数の変異（これらは、それらの意図される使用に対して重大な程度にはこれらの配列の特性を変化させない）が、本発明による調節DNA配列において可能である。従って、このような変異は、本発明から逸脱しない。さらに、当業者に周知のように、植物遺伝子の調節領域は、遺伝子発現の点から興味深い特性を有する異なるサブ領域から成る。本明細書中で意味するサブ領域の例は、エンハンサーだけでなく、転写のサイレンサーでもある。これらのエレメントは、全体的（構成的）方法でまたは組織特異的様式で機能し得る。実施例で示されるように、いくつかの欠失が本発明による調節DNA配列において作成され得、そしてサブフラグメントは、結合したDNAの発現パターンについて試験され得る。そのように得られた種々のサブフラグメントまたはその組合せでさえ、線虫耐性を操作する方法、または植物において異種DNAの発現を含む他の適用において、有用であり得る。機能性サブ領域を同定するための本発明によるDNA 配列の使用、および植物における遺伝子発現を促進または抑制するためのそれらの後続の使用もまた、本発明により含まれる。本発明の文脈において、用語、NFS破壊物質および中和物質は、遺伝子産物（タンパタ質またはRNAもしくはアンチセンスRNA）が、NFSまたはその中の細胞小器官の代謝および／または機能および／または生存能に対して有害であるDNA によりコードされる一連の選択された化合物、および破壊物質が発現される細胞と同じ細胞において同時に発現される場合、破壊物質の活性を抑制し得ることが公知である中和物質を含む。破壊物質と中和物質との好ましい組合せは、例えば、Bacillus amyloliquefaciens由来のバルナーゼ／バルスター（Hartley，1988 ，J.Mol．Blol．202，913-915）、制限エンドヌクレアーゼ／対応するメチラーゼ（例えば、E．coli由来のEcoRI（Greenら、1981，J．Biol．Chem．256，2143- 2153）およびEcoRIメチラーゼ、またはII型制限修飾系についての総説（Wilson ，1991，Nucl．Acid Res．19，2539-2566）に記載される同様の組合せ、バクテリオシンと対応する免疫タンパタ質（例えば、コリシンE3／E．coli由来の免疫タンパク質（Lauら、1985，Nucl．Acid Res．12，8733-8745））、またはプロモーター-Ｂの制御下でアンチセンスRNAの同時生成により中和され得る任意の破壊物質コード遺伝子（例えば、Dipthcria Toxin Chain A（Czako＆An，1991，Plan t Physiol．95，687-692）、RNAsc T1のようなRNAse、リボヌクレアーゼ、またはプロテアーゼをコードするDNA配列）と植物毒性タンパク質をコードするmRNA に対するリボザイムである。本発明の別の局面に従って、破壊物質および中和物質の組合せは、それぞれ、細胞生存能に必須なタンパク質またはポリペプチド産物をコードする内因性遺伝子に対して阻害性である遺伝子、および中和遺伝子として内因性タンパク質またはポリペプチド産物の機能を置換し得るタンパク質またはポリペプチド産物をコードする遺伝子を含む。このような破壊遺伝子は、（ａ）内因性RNA転写物に対するリボザイムをコードする遺伝子、（ｂ）転写される場合、細胞生存能のために必須である内因性遺伝子のRNA転写物に対して相補的または少なくとも部分的に相補的なRNA転写物を生成する遺伝子（遺伝子発現のアンチセンス阻害として公知の方法（EP-A 240 208で開示される））、または（ｃ）転写される場合、細胞生存能のために必須である内因性遺伝子の転写物と同一または少なくとも非常に類似したRNA転写物を生成する遺伝子（同時抑制として言及される遺伝子発現のまだ未知の阻害方法（Napoli Cら、1990，The Plant Cell 2，279-289）によって開示される）から成る群から選択され得る。本発明の使用の好ましい実施態様に従って、細胞生存能のために必須な内因性遺伝子の発現を阻害するアンチセンス遺伝子が作成される。この遺伝子は、このアンチセンス遺伝子に対して上流で融合した、本発明による調節DNA配列の長所により、線虫摂食構造において発現される。不可欠の内因性遺伝子に阻害性のアンチセンス遺伝子によりもたらされる破壊効果は、中和化合物-Ｂの発現により中和される。この発現は、定義されるプロモーター-Ｂの制御下にあり、この化合物Ｂは内因性の不可欠の遺伝子によりコードされるタンパク質またはポリペプチドと同一または類似であり、そして宿主植物において内因性遺伝子産物の機能を置換することが可能であるタンパク質またはポリペプチド産物である。中和遺伝子によりコードされるRNA転写物のヌクレオチド配列は、起こり得る同時抑制効果を回避するために内因性の重要な遺伝子RNA転写物と異なることが好ましい。それ故、中和遺伝子が内因性の重要な遺伝子と本質的に同じ機能を有するが、異なるRNA転写中間体を介するタンパク質またはポリペプチドをコードする中和遺伝子が好ましい。この説明に適合する中和遺伝子は、異なる植物種または酵母、動物、真核生物もしくは原核生物のような種々の非植物種でさえから入手可能な遺伝子のデータベースをスクリーニングすることにより適切に得られ得る。好ましくは、破壊アンチセンス導入遺伝子および中和センス導入遺伝子によりコードされる転写物のヌクレオチド配列の同一性は、90％より低く、好ましくは80％より低く、なおより好ましくは、この中和センス導入遺伝子は破壊された遺伝子産物に対してアミノ酸配列において同一でないタンパタ質またはポリペプチド遺伝子産物をコードし、ここで中和導入遺伝子によりコードされる転写物のヌクレオチド配列同一性は75％より低い。アンチセンス破壊遺伝子のための標的遺伝子は、細胞生存能のために必須である酵素（ハウスキーピング酵素とも呼ばれる）をコードする遺伝子から選択され、そして、小さいサイズの遺伝子ファミリーがまた、本発明の目的に適切であるが、好ましくは単一コピーの遺伝子としてコードされる核であるべきである。さらに、この遺伝子のアンチセンス発現の効果は、このような酵素により正常に合成される酵素生成物の他の細胞または細胞小器官からの拡散または移行により無効とされてはならない。好ましくは、膜移行酵素をコードしている遺伝子は、これらが細胞小器官膜を横切る化学的勾配の確立に関与するように、選択される。アンチセンス発現によるこのようなタンパク質の阻害は、定義により、これらのタンパク質が存在する膜を横切る基質の拡散により取り消され得ない。移行した化合物は有機分子に限らず、例えば、Ｐ、Ｈ、OH、または電子のような無機性質であり得る。好ましくは、膜移行酵素は、寄生の間その数が増加する細胞小器官（それにより、NFSを構成する細胞においてこのような細胞小器官が有する基本的な役割を示す）において存在するべきである。このような細胞小器官の具体的な例は、ミトコンドリア、小胞体、および原形質連絡である（Husseyら、1992 Protoplasma167 ;55-65，MagnussonおよびGolinowski 1991 Can．J．Botany 69;44-52）。標的酵素の一覧表を、例示の目的で表１に示すが、本発明はこの表に示される酵素に限定されない。より詳細な一覧は、植物の生化学のシリーズ（StumpfおよびCo nn編，1988-1991，1-16巻，Academic Press）または植物生理学の百科事典（新シリーズ，1976，Springer-Verlag，Berlin）のようなシリーズから集められ得る。いくつかの場合（これらの酵素コードする遺伝子が単離され、それ故遺伝子コピーの数が知られていない）においてのみだが、満たされなければならない判定基準が本発明に記載される。適切なプロモーターＢが、実質的に全ての細胞において発現を駆動するプロモーターとして定義される。ここで、線虫摂食構造内部で発現を駆動しないかまたは効果的に駆動しない条件でコード配列-Ａは発現される。（「実質的に全ての細胞」は、このような植物の商業的活用のために必要とされる正常な植物増殖およびまたは発育を得るために、生存可能である少なくともこれらの細胞を意味する）。破壊効果が、宿主植物の正確に全ての細胞内で中和されず、それにもかかわらず、生存可能であり、かつ商業的活用のために適切である植物の実例は、おしべの細胞内で本発明による破壊遺伝子を発現する植物（これは雄性不稔植物を産生し得る）であり、これはいくつかの作物において商業的に魅力のある特性とさえ見なされる。プロモーター-Ｂ型の適切な例は、植物もしくは植物ウイルスから得られ得、または化学的に合成され得る。調節配列はまた、CaMVの35Sプロモーター（Kayら、1987，Science 236、1299-1302）に見出されるようなエンハンサー配列、およびアルファルファモザイクウイルスRNA4のリーダー配列（Bred erodeら、1980，Nucl，Acids Res．8，2213-2223）のようなmRNA安定化配列、または同様の様式で機能する任意の他の配列を含み得る。あるいは、全てのまたは実際上全ての植物組織における発現を提供するために、プロモーター-Ｂ/コード-配列-Ｂは、プロモーター-Ｂ/コード-配列-Ｂと部分的に重複または全体的に相補的である発現パターンを有する第２のプロモーター -Ｂ'/コード-配列-Ｂで補充され得る。ただし、プロモーター-Ｂもプロモーター -Ｂ'も共にNFS内で発現を駆動しない。本明細書中に規定される必要とされる発現パターンを提供するために結合される種々のプロモーター（の部分）を含むハイブリッドプロモーターもまた、本発明の範囲内にある。好ましくは、プロモーターＢは、カリフラワーモザイクウイルス35Ｓプロモーターまたはその誘導体である。これは一般に、植物組織において強力な構成性プロモーターであると考えられている（Odellら1985 Nature 313，810-812）。プロモーターＢの別の好ましい例は、Agrobacterium rhizogenesのプラスミドpRiA 4;ORFl5の5'隣接領域（Slightomら1986，J．Biol．Chem．261，108-121）由来の強力な根プロモーターrolDである（LeachおよびAoyagi;1991 Plant Sci．79;69- 76）。プロモーターＢとしての使用のためのノパリンシンターゼプロモーター（ Bevan，1984，Nucl．Acids Res．12，8711-8721）またはゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター（EP-A 426 641）のような他の構成性プロモーターの適合性は、GUS（Jefferson，1987，Plant Mol．Biol．Reporter 5，387-405）のようなマーカー遺伝子への融合、これらの構築物の植物への移入、そしてPPNでの感染後のこのような導入ジェニック植物の組織化学的分析を介して試験され得る。ターミネーター配列およびポリアデニル化シグナルのような他の調節配列は、植物において機能するような任意の配列機能を含む。配列機能の選択は、平均的な当業者の技術レベルの範囲内にある。このような配列の例は、Agrobacteriumt umefaciensのノパリンシンターゼ（nos）遺伝子の3'隣接領域である（Bevan，19 84，Nucl．Acids Rcs．12，8711-8721）。２成分アプローチのさらなる詳細は、WO93/10251（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。植物種の選択は、農業において起こると推測されるPPN感染による損傷の量および形質転換に対する植物種の感受性により主に決定される。PPNにより農作業の間損傷される植物属、および本明細書の方法により、PPNに対して有意に感受性を低く作成され得る植物属は、表２に記載される属を含むがこれらに限定されない。本明細書の文脈で規定される線虫種には、宿主細胞を特に適応した摂食構造へ改変する全ての植物寄生性線虫（転位性外寄生生物（例えば、Xiphinema spp.）からより進化した定住性内部寄生生物（例えば、Heteroderidae，Meloidogynae またはRotylenchulinae）の範囲である）が含まれる。寄生性線虫の一覧表は表２に提供されるが、本発明はこの表に記載された種に限定されない。より詳細な一覧はZuckermanら（編，Plant Parasitic Nematodes，第I巻1971，New York，1 39-162頁）に示されている。本発明の文脈において、植物根の表面で発達している成熟雌の数において統計学的に有意な低減がコントロール植物と比較して観察され得る場合、植物は、植物寄生性線虫(PPN)に対して減少した感受性を示すといわれる。成熟雌数による感受性／耐性の分類は、シスト線虫および根瘤線虫の両方にとって標準的な実施である（例えば、LaMondia，1991，Plant Disease 75，453-454;Omwegaら、1990 ，Phytopathol．80，745-748）。本発明による線虫摂食構造は、初期摂食細胞を含むはずである。初期摂食細胞は、侵入する線虫の誘導に際して線虫摂食構造になる運命にある、細胞または非常に限定された数の細胞を意味するはずである。本発明によるNFS破壊効果は、NFSのみに対する有害な効果に限定されず；また破壊効果は、さらに、直接の相互作用による線虫発生に対して有害効果を有することが意図される。本発明に記載されるように、組換えDNA含有DNA配列の植物宿主への導入のために、幾つかの技術が利用可能である。このような技術には、カルシウム／ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション、およびマイクロインジェクション、または（コートされた）粒子ボンバードメントを使用するプロトプラストの形質転換を含むが、これらに限定されない（Potrykus，1990，Bio/Technol．8， 535-542）。これらのいわゆる直接DNA形質転換方法に加えて、ウイルスベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）および細菌性ベクター（例えば、Agro bacterium属由来））のようなベクターを含む形質転換系が広く利用可能である（Potrykus，1990，Bio/Technol．8，535-542）。選択および／またはスクリーニングの後、プロトプラスト、形質転換された細胞または植物部分は、当該分野で公知の方法（Horschら、1985，Science 225，1229-1231）を使用して、植物全体に再生され得る。形質転換および／または再生技術の選択は、本発明にとって重要ではない。本発明の好ましい実施態様によって、使用はいわゆるバイナリーベクター系（ EP-A 120 516で開示される）から構成され、ここで、毒性遺伝子を有するヘルパープラスミドおよび移入されるべき遺伝子構築物を含む適合性プラスミド（バイナリーベクター）を含むAgrobacterium株が使用される。このベクターは、E.col iおよびAgrobacteriumの両方で複製され得る；本発明で使用されるものは、バイナリーベクターBin19から誘導される（Bevan 1984，Nucl．Acids Res．12,8711- 8721）。本実施例中で使用されるバイナリーベクターは、T-DNAの左-と右-ボーダー配列との間、カナマイシン耐性をコードする同一のNPTII-遺伝子（Bevan，1 984，Nucl．Acids Res．12，8711-8721）、および必要とされる遺伝子構築物中にクローニングするための複数クローニング部位を含む。最近の科学的進歩は、原則的に、単子葉植物が形質転換を受け入れやすく、そして稔性トランスジェニック植物が形質転換された細胞から再生され得ることを示す。これらの作物のための再現性のある組織培養系の開発は、遺伝物質の植物細胞への導入のための強力な方法とともに、促進された形質転換を有する。現在、単子葉植物の形質転換のための好ましい方法は、移植片または懸濁細胞のマイクロプロジェクタイルボンバードメント、および直接的なDNAの取り込みまたはエレクトロポレーションである（Shimamotoら、1989，Nature 228，274-276）。トランスジェニックトウモロコシ植物は、Streptomyces hygroscopicus bar遺伝子（これは、フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（除草剤フォスフィノスリシンを不活化する酵素）をコードする）をマイクロプロジェクタイルボンバードメントによりトウモロコシ懸濁培養物の胚形成細胞中に導入することによって得られている（Gordon-Kamm，1990，Plant Cell，2，603-618）。コムギおよびオオムギのような他の単子葉作物のデンプンプロトプラストへの遺伝物質の導入が報告されている（Lee，1989，Plant Mol．Biol．13，21-30）。コムギ植物は、胚形成懸濁培養物の樹立ための、成長した緻密で結節性の胚形成カルス組織のみを選択することにより、胚形成懸濁培養物から再生されている（Vasil ，1990 Bio/Technol．8，429-434）。イネの形質転換のためのAgrobacterium使用方法もまた、最近開示されている（WO 95/16031）。これらの作物のための形質転換系との組合せは、本発明の単子葉植物への適用を可能にする。これらの方法はまた、双子葉植物の形質転換および再生に適用され得る。以下の実施例は、例示の目的のためにのみ与えられ、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。実験の部 DNA手順全てのDNA手順を、Maniatis（Molecular Clonlng，A laboratory Manual第２版，Cold SprlngHarbor Laboratory，1990）に記載される標準的な方法に従って行った。 Arabidopsisの形質転換形質転換を、Valvekensら（1988，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 85，5536-5540 ）により記載されるように、適切なバイナリーベクターを含むAgrobacterium株M OG101とのArabidopsis thaliana（生態型C24）根セグメントの同時培養を用いて行った。これは以下の通りである： Arabidopsis種子を、発芽の前に４℃で７日間春化処理した。種子を70％EtOH 中で２分間表面滅菌し、５％NaOCl/0.5％NaDodSO₄に15分間移し、滅菌蒸留水で５回リンスし、そして発芽させるために、発芽培地（GM）（表３）を含む150×2 5mmペトリ皿に配置した。ペトリ皿を、気体透過性医療用テープ（Urgopore，Che nove France）でシールした。植物を22℃で16時明所／８時間暗所周期で増殖させた。組織培養手順のために、同じ増殖部屋条件を使用した。全ての植物培地を 0.5g/リットルの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（pH 5.7:１Ｍ KOHで調整した）で緩衝化し、0.8％Difco Bacto agarで固形化し、そして121℃で15分間オートクレーブした。ホルモンおよび抗生物質を、それぞれジメチルスルホキシドおよび水に溶解し、そしてオートクレーブして、そして65℃まで冷却させた後の培地に添加した。インタクトな根を、固形化した0.5/0.05培地（表３）上で３日間インキュベートした。次いで根を約0.5cmの小断片（本明細書中で「根移植片」と呼ぶ）にきり出し、そして10mlの液体0.5/0.05培地に移し；0.5〜1.0mlのAgrobacterium一晩培養物を添加した。根移植片および細菌を緩徐に約２分間振盪することにより混合した。次いで、ほとんどの液体培地を除去するために、根移植片を滅菌フィルターペーパー上にブロッティングし、そして0.5/0.05寒天上で48時間同時培養した。次いで、１リットル当たり1000mgのバンコマイシン（Sigma）を含む液体0.5/0.05 培地中で移植片をリンスした。小片をブロッティングし、次いで1リットル当たり750mgのバンコマイシンおよび50mgのKmを補充した0.15/5寒天（表３）上でインキュベートした。キメラneo遺伝子を含むアグロバクテリア（agrobacteria）で感染して３週間後、緑色のKm耐性（Km^R）カルスが、黄色がかった根移植片のバックグランドの中で形成された。この時点で、１リットル当たり500mgのバンコマイシンおよび50mgのKmのみを含む新鮮な0.15/5寒天に根移植片を移した。３週間後、最も緑色のカルスはシュートを形成した。根もしくは種子またはその両方を形成するために、GMを含む150×25mmペトリ皿に移したシュートを移した。これらのペトリ皿において、多くの再生体が根を付けずに種子を形成した。根を付けた植物はまた、種子を作らせるために土壌に移され得る。以下の改変を、初期の根物質を得るために行った。６つの滅菌したArabidopsis thaliana C24種子を、低光量条件下の増殖部屋においてロータリー振盪器（100 rpm）上の50mlのG M（250ml三角フラスコ）中で９日間発芽させた。トランジェニック植物を、選択培地（50mg/lカナマイシン）上で増殖させたシュートから再生し、根を付けさせ、発芽培地または土壌に移した。L、リットル；IAA、インドール-3-酢酸；Kin、キネチン；2ipAde、N⁶-(2-イソペンテニル)アデニン；CIM、カルス誘導培地；SIM、シュート誘導培地；MS、Muras higeおよびSkoog培地；B5、Gamborg B5培地ジャガイモの形質転換 Solanum tuberosum var．Kardalの形質転換について、Hoekemaら、1989 Bio/T echnology 7,273-278に記載されるようなプロトコルを、いくつか改変して使用した。皮を剥いて表面を殺菌したジャガイモ塊茎を、２mmの厚さのスライスに切った。これらを使用して、スライスの周縁部に沿って直径１cmのディスクを切り出した。ディスタをWM（MurashigeおよびSkoog培地、１mg/lチアミンHCl、0.5mg/lピリドキシンHcl、0.5mg/lニコチン酸、100mg/lミオイノシトール、30g/lスクロース、 0.5g/l MES(pH5.8)を含む）中に回収した。Agrobacterium tumefaciensEHA105株（Hoodら、1993 Transgenic Research 2，208-218）での接種を、LBおよび適切な抗生物質中で0.5〜0.7のOD₆₀₀まで新たに増殖させたAgrobacterium培養物10ml の再懸濁したペレットを含む新たなWM 100mlでWMを置換することによって行った。細菌懸濁物中で20分間塊茎ディスクをインキュベートした後、それらを、20外植片／ペトリ皿の密度で、固化CM（８g/l寒天、3.5mg/lゼアチンリポシド、0.03 mg/lインドール酢酸を補充したWM）に移した。２日後、ディスクをPM（200mg/l セフォタキシム、100mg/lバンコマイシンを補充したCM）に移し、Agrobacteria に対して選択した。３日後、ディスクを、10外植片／ペトリ皿の密度でSIMプレート（250mg/lカルベニシリン、100mg/lカナマイシンを補充したCM）に移し、形質転換されたシュートの再生を選択した。２週間後、組織ディスクを新たなSIM に移し、そしてさらに３週間後、それらをSEM（10倍低い濃度のホルモンを有するSIM）に移した。同時培養の約８〜９週間後、シュートはカルス組織から切り出すのに十分な大きさであり、そしてシュートをインビトロでの発根維持および栄養増殖のために10mlのRM（0.5×MS塩、0.5×ビタミン、10g/lスタロース、100 mg/lセフォタキシム、50mg/lバンコマイシン、および50mg/1カナマイシンを含む WM）を含有するガラス管（Sigma，Cat.nr．C5916）に移した。線虫の操作、植物の根の増殖および感染 Arabidopsisの種子を表面殺菌し、そしてペトリ皿（φ：９cm）中の20g/lグルコースおよび20mg/lカナマイシンを含むB5培地に蒔いた。４℃にて３日後、プレートを、22℃にて16時間明所／８時間暗所のサイクルで、増殖チャンバー中で２週間インキュベートした。次いで、カナマイシン耐性植物を、土壌を充填した半透明のプラスチック管（30×15×120mm、Kelder plastibox b.v.，The Netherla nds）に移した。根が管の下面で生育するように、管を垂直軸に対して60度の角度で斜めに置いた。これは、感染過程を肉眼でモニターすることを可能にし、そしてGUS分析のために土壌から根系を取り出すのを容易にした。さらに２週間後に、１根系あたり500匹のHeterodera schachtiiの二齢幼虫（３ml H₂O中）または１根系あたり300匹のMeloidogyne incognitaの二齢幼虫を含む懸濁物を、土壌に注入することによって、感染を行った。同様に、カナマイシン含有RM培地上に根付いたジャガイモシュートを、土壌を充填した半透明のプラスチック管（30×15×120mm、Kelder plastibox b.v.，Th e Netherland）に移し、そして22℃にて16時間明所／８時間暗所のサイクルで、さらに２週間傾けて生育させた。１根系あたり500のGlobodera pallidaの二齢幼虫（３ml H₂O中）を含む懸濁物を土壌に注入することによって、感染を行った。 GUSアッセイ感染過程の間の種々の時機に、付着した土壌のほとんどを除去するために根系を完全に洗浄し、そしてこれらをX-Gluc溶液（１mg/ml X-Gluc、50mM NaPO₄(pH7 )、１mM K₄Fe(CN)₆、１mM K₃Fe(CN)₆、10mM EDTA、0.1％ Triton X100)中で、37 ℃にて一晩インキュベートすることによって、GUS活性を測定した。70％エタノールとの数時間のインキュベーションによって組織から葉緑素を除去した後、顕微鏡下でGUS染色をモニターした。実施例１バイナリーベクターpMOG800の構築バイナリーベクターpMOG800は、pMOG23の誘導体である（図１、Centraal Bure au voor schimmelcultures，Oosterstraat 1，Baarn，The Netherlandsに1990年１月29日、番号CBS 102.90で寄託）。pMOG23には、EcoRIとSmaIとの問のポリリンカーに、さらなるKpnI制限部位が導入された。このプラスミドは、T-DNAの左ボーダーと右ボーダーとの間に、トランスジェニック植物細胞の選択のためのカナマイシン耐性遺伝子を含む（図２）。E.coli DH5αのサンプル（pMOG800を有する）を、Centraal Bureau voor Schimmelcultures，Oosterstraat 1，Baarn， The Netherlandsに1993年８月12日、番号CBS 414.93で寄託した。実施例２プロモーターを含まないGUS構築物pMOG553の構築このベクターの構築は、Goddijnら、1993 Plant J 4，863-873に記載される。この参考文献には、誤りがある；この構築物は、β-グルクロニダーゼ遺伝子の後ろに、指示されたnosターミネーターのかわりにCaMV 35S RNAターミネーターを含む。このバイナリーベクターのT-DNAボーダーの間の配列は、EMBLデータベースから、アタセス番号X84105で入手可能である。pMOG553は、植物形質転換のためのHygRマーカーを有する（図３）。実施例３ Arabidopsis thalianaにおける捕捉されたNFS優先プロモーターフラグメントの同定および単離バイナリーベクターpMOG553を、三親接合によってAgrobacterium tumefaciens MOG101株に動員した。得られた株を、Arabidopsis根形質転換のために使用した。この方法で、1100を越えるトランスジェニックArabidopsis植物系統を得た。トランスジェニック植物を、成熟するまで生育させ、自家受精させ、そして得られた種子（S1）を収穫し、そして春化処理した。続いて、S1種子を、0.6％の寒天、10mg/lハイグロマイシンで凝固させた栄養液（Goddijnら、1993 Plant J 4 ，863-873）上で発芽させ、そして４℃にて４日間の吸収期間保存した。５日目に、プレートを室温に移し、そして発芽のために光を弱めた（1000lux、16時間明所／８時間暗所）。14日齢の芽生えを、5000lux（20℃）でさらに生育させるために、傾斜した半透明のプラスチック管（30×15×120mm）中の鉢植え用土に移した。この方法で植物が生育するにつれ、ほとんどの根系が、土壌と管との間の中間層において、管の下面で生育するようになる。２週間後、実験の部に記載のように線虫で根を感染させた。接種後いくつかの時点（２〜14日の範囲）で、実験の部に記載のように、根系をGUS活性について分析した。pMOG553#1164株を、それぞれHeterodera schachtiiおよびMeloidogyne incognitaによって誘導されたシンシチウムおよび巨細胞内で幾分強いGUS発現を示す系統として同定した。この系統の非感染コントロール植物（ならびに感染植物）において、若い側根の基部少数の細胞および植物のいくつかの緑の部分で、非常に弱いGUS発現を検出した。 1164系統において、この表現型は、１：３の比で分離することを見出し、これは、GUS構築物が、１ゲノムあたり１遺伝子座で存在することを示した。１つのT -DNAコピーのみの存在を、サザン分析によって確認した。GUSオープンリーディングフレームに隣接した、捕捉されたプロモーター配列の1.5kbフラグメントを、逆PCRによって単離した。この系統のゲノムDNAを、制限酵素Mscl（GUSコード領域を一回切断する）で切断し、そして再連結した。続いての酵素SnaBIでの環状DNAの消化によって、公知のGUS配列を両端に、そしてその間に隣接する植物配列を有する、直線状フラグメントを得た。このフラグメントを、GUSinv5（5'CTT TCC CAC CAA CGC TGA TC3’配列番号1）およびGUS7（5'GTA ATG CTC TAC ACC A CG CCG 3’配列番号２）のプライマーセットを用いて増幅させ、多コピー型のベタター中にクローン化し、そして配列決定した（以下を参照のこと）。この増幅したフラグメントをGUSの前へクローン化し戻すために、植物配列を、プライマーGUSinv5および1164XBM（5'TCT AGA GGA TCC TGG CCA TAC AAA TCA ACG TTT AC 3’配列番号３）を用いて、ArabidopsisゲノムDNAから再増幅した。プルーフリーディング活性を有するpfu DNAポリメラーセを使用して、誤りの割合を減少させた。プライマー1164XBMは、プロモーターの5'末端にBamHI部位を導入する。このことは、GUSオープンリーディングフレームと植物プロモーターとの間の配列が変化していない構築物pMOG819において、GUSの前へ1480bpのBamHIプロモーターフラグメントをクローン化し戻すを可能にした。実施例４プロモータ−を含まないGUS構築物pMOG819の構築 pMOG553のGUSイントロンコード領域（Vancanncytら1990，Mol．Gen．Genet．2 20；245-250）を、pMOG800のポリリンカー中のBamHI-EcoRIフラグメントとしてクローン化することにより、このベクターを構築した。バイナリーベクターpMOG 819（図４）を、植物の形質転換後のさらなる発現分析のためのクローン化プロモーターフラグメントを導入するために供する。実施例５ Arabidopsisへの再導入後のプロモーターフラグメントの分析 tag533#1164からのPCR産物を、バイナリーベクターpMOG819上のGUS遺伝子の前へクローン化し戻し、pMOG849を作製した（図５）。pMOG849を有するE.coli DH5 αのサンプルは、Centraal Bureau voor schimmelcultures，Oosterstraat 1，B aarn，The Netherlandsに1995年５月４日、番号CBS 308.95で寄託されている。クローン化プロモーターフラグメントの組織特異的活性を測定するために、得られたクローンpMOG849を、Agrobacterium tumefaciensに動員（mobilise）し、そして対応する株を使用して、野生型Arabidopsis thaliana植物を形質転換した。１構築物あたり、24〜30の形質転換体を生成した。一次形質転換体からの種子を収穫し、そして実験の部に記載のように、Heterodera schachtiiでの感染アッセイのために生育させた。線虫感染後のGUS分析は、pMOG849で形質転換した系統の 79％が、シンシチウムでレポーター遺伝子を発現したことを示した。いくつかの弱い発現もまた、側根が分枝する領域、根および葉の維管束組織、ロゼット（ro zette）の中心、ならびにいくつかの花組織において見出された。シンシチウム外でのGUS発現は、系統によって顕著な変動を示した（図６を参照のこと）。おそらく、この変動は、導入された調節配列のゲノム位置効果の結果である。それにもかかわらず、ほとんどの系統において、発現パターンは、元々タグ化された系統553#1164に非常に類似することが見出された。種々のpMOG849系統におけるプロモーターフラグメントの活性が、一般的にシンシチウム内側のGUS活性よりずっと弱かったとしても、摂食部位に完全に特異的なシンシチウムポジティブ系統はなかった。 GUS発現はまた、Heterodera schachtiiによって誘導されたシンシチウムにおいてGUSを発現する同じ系統に、Meloidogyne incognltaでの感染によって誘導される巨細胞において見出された。これは、#1164フラグメントをほぼ摂食部位特異的プロモーターとして使用して、Meloidogyne incognitaおよびHeterodera sc hachtiiに対して減少した感受性を有する植物を操作し得ることを示す。組織培養段階の間、#1164調節配列はまた、プロモーターとして活性であり、従って、#1164プロモーターフラグメントを、Arabidopsisに、そのコントロール下の植物細胞破壊性遺伝子（例えば、バルナーゼ（barnase））とともに移入する場合、中和遺伝子を使用する必要性を促すことが観察された（実施例８および９を参照のこと）。 553#1164ベースのPCRフラグメントをプローブとして使用して、対応するゲノムクローンを単離した。次いで、2.1kbのゲノムフラグメント（配列番号４）を、上記と同様のアプローチにおいて使用した（pMOG889は、GUSイントロンに融合したゲノム533#1164を含む）。また、線虫誘導性GUS発現は、それぞれ、H．Scha chtiiおよびM．incognitaでのArabidopsis根の線虫感染後にシンシチウムおよび巨細胞において観察され得た。実施例６プロモータータグpMOG553#1164の配列決定 #1164のゲノムクローンの配列を、Pharmaciaの自動シーケンサーALFを用いて、CsCl精製DNAのプライマーウォーキングストラテジーによって決定した。蛍光d ATPを、AutoRead配列決定キットと組み合わせて使用した。手順は、Vossら、（1 992）Mol Cell Biol 3，153-155に記載される。配列を、配列番号４に示す。実施例７プロモーターサブフラグメント（単数および複数）のクローン化プロモーター#1164の５つのサブフラグメントを、表４に示されるようなプライマーを用いてPCRによって作製した。プライマーの番号付けは、配列表に使用されたものと同一である。全ての増幅について、プルーフリーディングDNAポリメラーゼpfuを使用して、そしてpMOG849を標的DNAとして供した。全ての5'末端プライマーは、XhoI部位を含む。従って、1164プロモーターのPCR作製欠失フラグメントの全ては、このXhoI部位およびBamHI部位を用いてpMOG819に再導入され得、これはpMOG553のマルチクローニング部位に配置され、そしてタグ化1164株中でGUSコード領域とタグ化植物配列との間に保持された。番号は、pMOG819にクローン化されたサブフラグメントから生じる構築物をいう；プライマー6044-1〜 6044-6は、それぞれ、配列番号６〜11に対応する。植物へのこれらの遺伝子カセットの再導入後、発現のパターン、タイミングなどを、実施例３の1.5kbの#1164フラグメントについて記載された様に決定し得る。有用なパターンおよび／またはタイミングを有することが見出されたフラグメントを、続いて他の異種DNA配列（センス／コードおよびアンチセンスの両方）の発現を駆動するために使用し、そして／またはハイブリッドプロモーター構築物を作製するために使用し得る。さらに、さらなる分析は、いくつかの調節エレメント（例えば、サイレンサー、エンハンサーなど）における洞察を生じ、そして発現パターンおよび／またはタイミングに故意に影響を与える可能性を生じる。本発明によるプロモーターフラグメントをどのように使用して線虫に対する減少した感受性を与え得るかを図示するために、これをここで、#1164の2.1kbのゲノムフラグメント（バルナーゼの前にクローン化した）について、NFS破壊遺伝子の１例として図示する。実施例８バルナーゼの前での#1164のクローン化 116系統からの5'タグ化配列を含む2.1kbのゲノムDNAフラグメントを、バルナーゼ（Bcillus amyloliquefaciens由来RNase遺伝子）の前にクローン化し、定住植物線虫に耐性である植物を操作した。ゲノムフラグメントを、Arabidopsis生態型C24のゲノムライブラリーの400000クローンを#1164 iPCR産物でスクリーニングすることによって得た（実施例３を参照のこと）。ハイブリダイズするクローンの１つから、４kbのEcoRIフラグメントを単離し、そして多コピー型プラスミドpKS（Stratagene）にサブクローン化した。配列分析により、このクローンが、1164株におけるT-DNA挿入の5'配列側の2.1kbの配列および1.9kbの3'配列を含むことが明らかになった。 GUSコード領域の前の正確な配列の前後関係を回復させるために、プロモーター-GUS融合物に及ぶ、pMOG849からの546bpのSnaBIフラグメントを、ゲノムクローンのSnaBI部位に挿入した。2325bpのHindIIIフラグメントを、得られたクローンから単離した。このクローンは、ゲノムEcoRIサブクローンからの完全な5'タグ化配列を含んでいた。このフラグメントを、構築物pFL8（以下に記載）中のバルナーゼ遺伝子の前にクローン化し、クローンpFL15を得た。バルナーゼコード領域を含むフラグメントを、プライマー5'CGGACTCTGGATCCGG AAAGTG 3'（配列番号12）および5'CTGCTCGAGCCTAGGCACAGGTTATCAACACGTTTG 3'（配列番号13）を用いて、pMT416 DNA（Hartley，sub）でPCR増幅させた。これらのプライマーは、隣接するBamHIおよびXhoI制限部位を導入し、このフラグメントのクローン化を容易にする。フラグメントを、Taqプロモーターの制御下でバルスター遺伝子（細菌中でバルナーゼの毒性を克服するために必要）を含むベクター中のマルチクローニング部位にクローン化した。続くクローニング工程におけるバルナーゼ発現の毒性を排除するために、ST-LS1イントロンを、バルナーゼのStyI部位に挿入した。NcoI部位を、プライマー5'CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG 3' （配列番号14）および5'CTTACTCGAGCCATGGTAAGTTTCTGC 3'（配列番号15）を用いて組み換えPCRによって、バルナーゼ翻訳開始コドンに作製し、pOG16.1を得た。以下のオリゴヌタレオチド5'GATCTAGACTCGAGAAGCTTGGATCCCCGGGTAGGTCAGTCCCC 3 '（配列番号16）および5'CATGGGGGACTGACCTACCCGGGGATCCAAGCTTCTCGAGTCTA 3'（配列番号17）をアニールし、そして得られたアダプターをpOG16.1のBgIII部位と NcoI部位との間に連結することによって本来のpMOG553#1164系統中の対応する配列に似せるようにバルナーゼの5'非翻訳配列をさらに改変し、クローンpFL8を得た。アダプターは、バルナーゼコード領域の5'側にHindIIIの部位を導入した。これを用いて、1164プロモーターを挿入しpFL15を得た。さらに、この手順により、Taqプロモーターおよびバルスター遺伝子を含むフラグメントを、このアダプターと交換した。実施例９ rolD-B^★の構築構築物pFL11は、バイナリーベクター中にキメラバルスター遺伝子を含む。この構築物を、以下の方法でクローン化した。バルスターコード領域は、構築物pM T316中のHindIII/BamHIフラグメントに存在する（Hartley(1988)J Mol Biol 202 ，913-915）。HindIII部位を、この部位に自己アニーリングアダプター5'AGCTCG GATCCG 3'（配列番号18）を連結することによって、BamHI部位に変更した。続いて、得られたBamHIフラグメントを、発現カセットpMOG180（WO93/10251に記載）中の二重に増強したCaMV 35Sプロモーターとnosターミネーターとの間にクローン化し、pOG30を得た。アダプター5'GGCTGCTCGAGC 3'（配列番号19）を用いて、 nosターミネーターの3'末端のHindIII部位をXhoI部位に変更し、そしてアダプター5'AATTGACGAAGCTTCGTC 3'（配列番号20）を用いて、プロモーターの5'末端のE coRI部位をHindIII部位に変更した。次いで、35Sプロモーターを、Agrobacteriu m rhizogenes Ro1D遺伝子からのプロモーターによって置換した。このプロモーターを、HindIII/BamHIフラグメントとして、構築物pDO2（F．Leach（LeachおよびAoyagi(1991)Plant Sci 79，69-76）から得た）から切り出した。得られたクローンpOG38から、プロモーターおよびターミネーターを含むバルスター遺伝子を、HindIIIおよびXhoIでの消化によって切り出し、そしてpMOG800のポリリンカーのそれぞれの位置に挿入し、pFL11を得た。最後に、キメラ#1164プロモーター-バルナーゼ遺伝子を、EcoRIフラグメントとしてpFL15外に切り出し、そしてバルスターとNptIIマーカー遺伝子との間のpF L11の唯一のEcoRI部位にタンデム配向で挿入し、pMOG893を得た。実施例10 ジャガイモ植物のpMOG893での形質転換および Globodera pallidaに対する増加した耐性についての試験バイナリーベクターpMOG893を、Agrobacterium tumefaciensに動員し、そして得られた株を、実験の部に記載のように、ジャガイモ品種Kardalからの塊茎ディスクの形質転換に使用した。合計98のトランスジェニック系統を得た。少なくとも１つの節を含むセグメントにシュートを切断し、そしてインビトロでそれらを発根させることによって、これらの系統を栄養増殖させた。１系統あたり15の植物を、実験の部に記載のように、Globodera pallldaに対する増加した耐性について試験した。バルナーゼ／バルスター構築物を含むpMOG893で形質転換したジャガイモ植物は、（発達した）線虫食餌構造の内側のバルナーゼの線虫誘導性発現に帰因して、Globodera pallidaに対する減少した感受性を示すことが予想される。上記の実施例は、本発明を例示するために提供されるにすぎず、そしてその限定を示すつもりはない。本発明の範囲内で、当業者は、容易に多数の改変を行う。 The present invention relates to regulatory DNA sequences that can be used to express DNA sequences in plant cells. The present invention further includes chimeric DNAs comprising this regulatory DNA sequence operably linked to DNA expressed in plant cells, as well as plants comprising such chimeric DNAs in those cells. The present invention further relates to methods for producing plants that are resistant or at least less susceptible to plant parasitic nematodes or their effects, as well as cells, plants, and parts thereof. State of the art International patent application WO 92/17054 discloses a method for the identification and subsequent isolation of a nematode responsive regulatory DNA sequence from Arabidopsis thaliana. In WO 92/21757, several regulatory DNA sequences have been isolated from Lycopersicon esculentum. It is responsive to the root-knot nematode Meloidogyne incognita. Some of these regulatory sequences (LEMMI for Lycopersicon esculcntum-Meloidogyne incognita) are stimulated by nematodes, while others appear to be suppressed by nematodes. It is not known whether any inducible regulatory sequences are stimulated by a wide range of nematodes. Another regulatory sequence that is inducible by the root-knot nematode Meloidogyne incognita is disclosed in WO 93/06710. The disadvantage of this regulatory sequence TobRb7 is that TobRb7 is not activated by many cyst nematodes, notably Heterodera and Globodera species. This makes the TobRB7 sequence unsuitable for use in chimeric constructs aimed at cyst nematode resistance in, for example, potatoes. One of the objects of the present invention is that it can be induced by both cyst nematodes and root-knot nematodes, and, preferably, but not necessarily, within the nematode's feeding structure, a substantial feeding. It is to provide regulatory DNA sequences that can be used to express heterologous DNA sequences under their control in a site-specific manner. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides DNA fragments obtainable from Arabidopsis thaliana that, when reintroduced into plants, can promote nodules and cyst nematode-induced transcription of bound DNA sequences. Preferred by the present invention is the sequence represented by nucleotides 1-2361 of SEQ ID NO: 4. Also recognized are portions or variants of the DNA fragments according to the present invention that, when reintroduced into plants, can promote nodules and cyst nematode-induced transcription of the bound DNA sequence. A still further preferred aspect of the present invention comprises a regulatory DNA fragment that is substantially nematode feeding site specific. A further embodiment of the present invention relates to a regulatory DNA fragment according to the invention, and a DNA sequence which is expressed under its transcriptional control in the direction of transcription, and which is not naturally under the transcriptional control of the DNA fragment. Including chimeric DNA sequences. Preferred among the chimeric DNA sequences according to the invention are those in which the expressed DNA sequence results in the production of a plant cell-disrupting substance (eg barnase). In different embodiments, the cytocidal substance comprises RNA that is complementary to RNA that is essential for cell viability. In yet another embodiment, the expressed DNA sequence results in the production of a substance that is toxic to the inducing nematode. The invention finds further use in DNA fragments or replicons comprising a chimeric DNA sequence according to the invention, microorganisms containing such replicons, and plant cells which have incorporated the chimeric DNA sequence according to the invention into their genome. Further useful embodiments are the root system of plants consisting essentially of cells according to the invention, as well as fully grown plants, preferably dicots, consisting essentially of cells according to the invention, Preferably, it is a potato plant. It will also be appreciated that plants grafted to the root system according to the invention and plant parts selected from seeds, flowers, tubers, roots, leaves, fruits, pollen, and xylem, and crops comprising such plants It is. The present invention also encompasses the use of a DNA fragment according to the present invention for identifying subfragments capable of promoting transcription of a bound DNA sequence in a plant. Also recognized is the use of the chimeric DNA sequence according to the present invention to transform plants. The present invention further provides the use of a fragment, part or variant of a regulatory DNA according to the present invention to generate a hybrid regulatory DNA sequence. The following figures further illustrate the invention. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. Schematic plasmid map of the binary vector pMOG23. FIG. Schematic plasmid map of the binary vector pMOG800. FIG. Schematic plasmid map of the binary vector pMOG553. FIG. Schematic plasmid map of the binary vector pMOG819. FIG. Schematic plasmid map of the binary vector pMOG849. FIG. NFS outer expression patterns of some pMOG849 transformed Arabidopsis thaliana strains. FIG. Schematic representation of NFS disruption and neutralization genes in a two-component system for manipulation of nematode resistant plants. FIG. Schematic plasmid map of the binary vector pMOG893. Several methods of practicing the invention, as well as the meaning of various phrases, are described in more detail below. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides regulatory DNA sequences available from Arabidopsis thaliana. It is inducible by root nodules and cyst nematodes, and shows a high preference for expression of any bound DNA within the special nematode-feeding structure of plant roots. Such nematode-feeding structures are used as a source of food by invading nematodes, whereby the nematodes induce changes in plant tissue, thereby causing giant cells (root-knot nematodes) or scintillation (cyst lines). Insects). Methods for isolating regulatory DNA sequences are disclosed and claimed in a prior application (WO92 / 17054), which is incorporated herein by reference. Primarily, the regulatory DNA sequence according to the present invention has been selected by placing the heterologous DNA under the control of this regulatory DNA sequence and transforming the plant with the chimeric DNA sequence obtained using known methods. It can be used to express any heterologous DNA in plants. Heterologous DNA can be rooted by various root knot nematodes (eg, Meloidogyne incognita) and cyst nematodes (eg, Heterodera schachtii and Globodera pallida (a more comprehensive list is shown in, but not limited to, Table 2)). Is expressed upon infection. Conveniently, to create a plant with reduced susceptibility to plant parasitic nematodes, the heterologous DNA can be composed of genes encoding substances that are toxic or inhibitory to plant parasitic nematodes . There are numerous examples of such toxic substances (eg, endotoxins, lectins of Bacillus thuringiensis (eg, EP 0 352 052), and the like). A more preferred approach to create plants with reduced susceptibility to phytoparasitic nematodes is to provide specialized access to plant roots by expressing phytotoxic agents under the control of regulatory DNA sequences according to the present invention. In the destruction of the eclipse structure. The general principles of this approach are disclosed and claimed in International Patent Applications WO92 / 21757, WO93 / 10251, and WO94 / 10320, which are hereby incorporated by reference. For consistency, phytotoxic agents are referred to hereafter as nematode feeding site (NFS) disruptors. The regulatory DNA sequences according to the present invention are substantially specific for nematode feeding structures, because under their control NFS disruptors are expressed in non-target (ie, non-NFS) tissues. It may have deleterious effects on plant viability and / or yield. In addition, the regulatory DNA sequences according to the invention are active during the tissue culture stage in the transformation procedure, during which it requires the use of neutralizing substances. Therefore, it is highly preferred to use a chimeric NFS-disrupted construct according to the present invention in combination with a neutralizing gene construct to reduce or eliminate (potential) deleterious effects. Details of such a so-called two-component approach for manipulating nematode resistant plants are described in WO 93/10251. According to this approach, the NFS-disrupting compound (coding sequence-A) is placed under the control of a promoter that is at least active in NFS, and is preferably inactive or less active outside of NFS, while NFS Undesired phytotoxic effects outside of are neutralized by neutralizing compounds (coding sequence-B) that are expressed at least in those tissues where disruptors are produced except for NFS. According to a two-component approach, a suitable promoter A is defined as a promoter that drives expression of the downstream coding sequence within NFS at a level that is detrimental to NSF metabolism and / or function and / or viability. You. On the other hand, this promoter is preferably inactive in tissues outside of NFS, but is not essential; the activity of the disruptor encoded by coding sequence-A is sufficiently neutralized by the product from coding sequence-B. At a level that would not be possible, at least never active outside of NFS. The properties of the regulatory DNA sequences according to the present invention (especially the 4, 2.1 and 1.5 kBp fragments of # 1164) make them very useful in the two-component approach shown by the methods of the Examples herein. Obviously, numerous mutations, such as deletions, additions, and alterations in nucleotide sequences and / or combinations thereof, which alter the properties of these sequences to a significant extent for their intended use Is not possible) in regulatory DNA sequences according to the invention. Accordingly, such mutations do not depart from the present invention. Furthermore, as is well known to those skilled in the art, the regulatory regions of plant genes consist of different sub-regions that have interesting properties in terms of gene expression. Examples of subregions as referred to herein are not only enhancers, but also silencers of transcription. These elements may function in a holistic (constitutive) manner or in a tissue-specific manner. As shown in the examples, some deletions can be made in the regulatory DNA sequence according to the invention, and subfragments can be tested for the expression pattern of the bound DNA. The various subfragments so obtained, or even combinations thereof, may be useful in methods of manipulating nematode resistance, or in other applications involving expression of heterologous DNA in plants. Use of the DNA sequences according to the invention for identifying functional subregions and their subsequent use for promoting or suppressing gene expression in plants is also encompassed by the present invention. In the context of the present invention, the terms NFS disruptor and neutralizer refer to the gene product (protein or RNA or antisense RNA) whose metabolism and / or function and / or viability of NFS or the organelle therein. It is known that a series of selected compounds encoded by DNAs that are harmful to, and that, when co-expressed in the same cell as, the disrupting agent, can suppress the activity of the disrupting agent. Contains Japanese substances. Preferred combinations of disruptors and neutralizers include, for example, barnase / barstar from Bacillus amyloliquefaciens (Hartley, 1988, J. Mol. Blol. 202 , 913-915), restriction endonucleases / corresponding methylases (eg, EcoRI from E. coli (Green et al., 1981, J. Biol. Chem. 256 , 2143-2153) and a review of EcoRI methylases or type II restriction modification systems (Wilson, 1991, Nucl. Acid Res. 19 , 2539-2566), bacteriocins and corresponding immunoproteins (eg immune proteins from colicin E3 / E. Coli (Lau et al., 1985, Nucl. Acid Res. 12 , 8733-8745)), or any disruptor-encoding gene that can be neutralized by co-production of antisense RNA under the control of promoter-B (eg, Dipthcria Toxin Chain A (Czako & An, 1991, Plant Physiol. 95, 687-692), a RNA sequence such as RNAsc T1, a DNA sequence encoding a ribonuclease, or a protease) and an mRNA encoding a phytotoxic protein. According to another aspect of the invention, the combination of disruptor and neutralizer is a gene that is inhibitory to an endogenous gene encoding a protein or polypeptide product essential for cell viability, and a neutralizing gene, respectively. As a gene encoding a protein or polypeptide product that can replace the function of an endogenous protein or polypeptide product. Such disrupted genes are complementary to (a) the gene encoding the ribozyme for the endogenous RNA transcript, and (b) the RNA transcript of the endogenous gene that, when transcribed, is essential for cell viability. Genes that produce RNA transcripts that are specifically or at least partially complementary (a method known as antisense inhibition of gene expression (disclosed in EP-A 240 208)), or (c) cells that are transcribed Genes that produce RNA transcripts that are identical or at least very similar to those of the endogenous gene that are essential for viability (a yet unknown method of inhibiting gene expression referred to as co-repression (Napoli C et al., 1990) , The Plant Cell Two , 279-289)). According to a preferred embodiment of the use according to the invention, antisense genes are created which inhibit the expression of endogenous genes essential for cell viability. This gene is expressed in nematode feeding structures by virtue of the regulatory DNA sequence according to the invention, fused upstream to this antisense gene. The disruptive effect provided by the antisense gene inhibiting essential endogenous genes is neutralized by the expression of neutralizing compound-B. This expression is under the control of a defined Promoter-B, which is identical or similar to the protein or polypeptide encoded by the endogenous essential gene, and that the endogenous gene product is expressed in the host plant. A protein or polypeptide product capable of replacing function. Preferably, the nucleotide sequence of the RNA transcript encoded by the neutralizing gene is different from the endogenous key gene RNA transcript to avoid possible co-suppression effects. Therefore, neutralizing genes that have essentially the same function as the endogenous key gene, but encode a protein or polypeptide through a different RNA transcription intermediate are preferred. Neutralizing genes that fit this description can be suitably obtained by screening a database of genes available from different plant species or even various non-plant species such as yeast, animals, eukaryotes or prokaryotes. obtain. Preferably, the nucleotide sequence identity of the transcripts encoded by the disrupted antisense transgene and the neutralizing sense transgene is less than 90%, preferably less than 80%, and even more preferably, the neutralizing sense transgene. The gene encodes a protein or polypeptide gene product that is not identical in amino acid sequence to the disrupted gene product, wherein the transcript encoded by the neutralizing transgene has less than 75% nucleotide sequence identity. The target gene for the antisense disrupting gene is selected from genes encoding enzymes essential for cell viability (also called housekeeping enzymes), and small size gene families are also objects of the present invention. But should preferably be the nucleus encoded as a single copy of the gene. Furthermore, the effect of antisense expression of this gene must not be abolished by the diffusion or translocation of enzyme products normally synthesized by such enzymes from other cells or organelles. Preferably, the genes encoding membrane transfer enzymes are selected such that they are involved in establishing a chemical gradient across the organelle membrane. Inhibition of such proteins by antisense expression, by definition, cannot be reversed by diffusion of the substrate across the membrane where these proteins are located. The transferred compound is not limited to an organic molecule, and may be of an inorganic nature such as, for example, P, H, OH, or electrons. Preferably, the membrane-translocating enzyme should be present in organelles whose number increases during infestation, thereby indicating a fundamental role such organelles play in the cells making up NFS. . Specific examples of such organelles are mitochondria, endoplasmic reticulum, and protoplasmic communication (Hussey et al., 1992 Protoplasma 167 ; 55-65, Magnusson and Golinowski 1991 Can. J. Botany 69 ; 44-52). A list of target enzymes is shown in Table 1 for illustrative purposes, but the invention is not limited to the enzymes shown in this table. A more detailed list can be found in the series on plant biochemistry (Stumpf and Conn, eds., 1988-1991, Volumes 1-16, Academic Press) or in the encyclopedia of plant physiology (New Series, 1976, Springer-Verlag, Berlin). Can be gathered from such series. Only in some cases (where the genes encoding these enzymes have been isolated, and thus the number of gene copies is not known), the criteria that must be met are described in the present invention. A suitable promoter B is defined as a promoter that drives expression in virtually all cells. Here, the coding sequence-A is expressed under conditions that do not or do not drive expression within the nematode feeding structure. ("Substantially all cells" means at least those cells that are viable to obtain the normal plant growth and / or development required for commercial utilization of such plants) . Examples of plants in which the destructive effects are not neutralized in exactly all cells of the host plant, but nevertheless are viable and suitable for commercial use, are described in the stamen cells. Plants that express the disrupted gene according to the invention, which can produce male sterile plants, which are even regarded as commercially attractive properties in some crops. Suitable examples of promoter-B type may be obtained from plants or plant viruses, or may be chemically synthesized. The regulatory sequences also include the CaMV 35S promoter (Kay et al., 1987, Science). 236 , 1299-1302) and the leader sequence of alfalfa mosaic virus RNA4 (Bred erode et al., 1980, Nucl, Acids Res. 8 , 2213-2223), or any other sequence that functions in a similar manner. Alternatively, the promoter-B / coding-sequence-B partially overlaps or is completely complementary to the promoter-B / coding-sequence-B to provide expression in all or virtually all plant tissues. Can be supplemented with a second promoter-B '/ coding-sequence-B having an expression pattern that is: However, neither promoter-B nor promoter-B 'drives expression in NFS. Hybrid promoters that include (parts of) various promoters that are joined to provide the required expression pattern as defined herein are also within the scope of the invention. Preferably, promoter B is the cauliflower mosaic virus 35S promoter or derivative thereof. It is generally considered to be a strong constitutive promoter in plant tissues (Odell et al. 1985 Nature 313 810-812). Another preferred example of promoter B is the strong root promoter rolD from the 5 'flanking region of the plasmid pRiA4; ORF15 of Agrobacterium rhizogenes (Slightom et al. 1986, J. Biol. Chem. 261, 108-121) (Leach And Aoyagi; 1991 Plant Sci. 79; 69-76). Nopaline synthase promoter for use as promoter B (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12 , 8711-8721) or the compatibility of other constitutive promoters such as the Scrophularis mosaic virus promoter (EP-A 426 641) is described in GUS (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Five , 387-405), transfer of these constructs to plants, and histochemical analysis of such transgenic plants after infection with PPN. Other regulatory sequences, such as terminator sequences and polyadenylation signals, include any sequence function that functions in plants. The choice of sequence function is well within the level of ordinary skill in the art. An example of such a sequence is the 3 ′ flanking region of the nopaline synthase (nos) gene of Agrobacterium umefaciens (Bevan, 1984, Nucl. Acids Rcs. 12 , 8711-8721). Further details of the two-component approach can be found in WO 93/10251, which is incorporated herein by reference. The choice of plant species is largely determined by the amount of damage due to PPN infections that is expected to occur in agriculture and the susceptibility of the plant species to transformation. Plant genera that are damaged during farming by PPN and that can be made significantly less sensitive to PPN by the methods herein include, but are not limited to, those listed in Table 2. Nematode species as defined in the context of this specification include those that evolve from all plant parasitic nematodes (transposable ectoparasites (eg, Xiphinema spp.) That alter host cells to a particularly adapted feeding structure. (Eg, Heteroderidae, Meloidogynae or Rotylenchulinae). A list of parasitic nematodes is provided in Table 2, but the invention is not limited to the species listed in this table. A more detailed list is given in Zuckerman et al. (Eds., Plant Parasitic Nematodes, Vol. I, 1971, New York, pp. 139-162). In the context of the present invention, a plant is a plant parasitic nematode (PPN) if a statistically significant reduction in the number of mature females developing on the surface of the plant root can be observed compared to a control plant. It is said to show reduced sensitivity to Classification of susceptibility / resistance by adult female numbers is a standard practice for both cyst nematodes and root-knot nematodes (eg, LaMondia, 1991, Plant Disease 75 Omwega et al., 1990, Phytopathol. 80 , 745-748). A nematode feeding structure according to the present invention should include early feeding cells. Primary feeding cells shall mean cells or a very limited number of cells that are destined to become nematode feeding structures upon induction of invading nematodes. The NFS destructive effects according to the present invention are not limited to detrimental effects on NFS alone; and destructive effects are further intended to have detrimental effects on nematode development by direct interaction. As described in the present invention, several techniques are available for introducing a recombinant DNA-containing DNA sequence into a plant host. Such techniques include, but are not limited to, transformation of protoplasts using the calcium / polyethylene glycol method, electroporation and microinjection, or (coated) particle bombardment (Potrykus, 1990, Bio / Technol. 8 , 535-542). In addition to these so-called direct DNA transformation methods, transformation systems containing vectors such as viral vectors (eg, cauliflower mosaic virus (CaMV) and bacterial vectors (eg, from the genus Agro bacterium)) are widely available. (Potrykus, 1990, Bio / Technol. 8 , 535-542). After selection and / or screening, protoplasts, transformed cells or plant parts can be obtained by methods known in the art (Horsch et al., 1985, Science). 225 , 1229-1231) can be regenerated throughout the plant. The choice of transformation and / or regeneration technique is not critical to the invention. According to a preferred embodiment of the invention, the use consists of a so-called binary vector system (disclosed in EP-A 120 516), wherein a compatible plasmid containing a helper plasmid with the toxic gene and the genetic construct to be transferred Agrobacterium strains containing (binary vectors) are used. This vector can be replicated in both E. coli and Agrobacterium; those used in the present invention are derived from the binary vector Bin19 (Bevan 1984, Nucl. Acids Res. 12 , 8711-8721). The binary vector used in this example is the same NPTII-gene (Bevan, 1998, Nucl. Acids Res.) Encoding kanamycin resistance between the left and right border sequences of T-DNA. 12 , 8711-8721), and multiple cloning sites for cloning into the required gene construct. Recent scientific advances have shown that, in principle, monocotyledonous plants are amenable to transformation and that fertile transgenic plants can be regenerated from the transformed cells. The development of a reproducible tissue culture system for these crops has enhanced transformation as well as powerful methods for the introduction of genetic material into plant cells. Currently, the preferred methods for the transformation of monocotyledonous plants are microprojectile bombardment of explants or suspension cells, and direct DNA uptake or electroporation (Shimamoto et al., 1989, Nature 228, 274-276). The transgenic corn plant uses a microprojectile bombardment to encode the Streptomyces hygroscopicus bar gene (which encodes a phosphinothricin acetyltransferase (an enzyme that inactivates the herbicide phosphinothricin)) into a corn suspension culture. It has been obtained by introduction into embryogenic cells (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, Two , 603-618). The introduction of genetic material into starch protoplasts of other monocot crops such as wheat and barley has been reported (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13 , 21-30). Wheat plants have been regenerated from embryogenic suspension cultures by selecting only grown, compact, nodular embryogenic callus tissue for the establishment of embryogenic suspension cultures (Vasil, 1990 Bio / Technol. 8 429-434). Methods of using Agrobacterium for rice transformation have also been recently disclosed (WO 95/16031). The combination with the transformation system for these crops allows the application of the invention to monocotyledonous plants. These methods can also be applied to the transformation and regeneration of dicotyledonous plants. The following examples are given for illustrative purposes only, and are not intended to limit the scope of the invention. Experimental Section DNA Procedures All DNA procedures were performed according to standard methods described in Maniatis (Molecular Clonlng, A laboratory Manual 2nd edition, Cold Sprlng Harbor Laboratory, 1990). Transformation of Arabidopsis Transformation was performed according to Valvekens et al. (1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 , 5536-5540) using co-culture of Arabidopsis thaliana (ecotype C24) root segments with Agrobacterium strain MOG101 containing the appropriate binary vector. This is as follows: Arabidopsis seeds were vernalized at 4 ° C. for 7 days before germination. Seeds are surface sterilized in 70% EtOH for 2 minutes, 5% NaOCl / 0.5% NaDodSO _Four For 15 minutes, rinsed 5 times with sterile distilled water, and placed in a 150 × 25 mm Petri dish containing germination medium (GM) (Table 3) for germination. Petri dishes were sealed with gas permeable medical tape (Urgopore, Chenove France). Plants were grown at 22 ° C. on a 16:00 light / 8 hour dark cycle. The same growth room conditions were used for the tissue culture procedure. All plant media was buffered with 0.5 g / l of 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (pH 5.7 adjusted with 1 M KOH), solidified with 0.8% Difco Bacto agar, and autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes. did. Hormones and antibiotics were dissolved in dimethyl sulfoxide and water, respectively, and autoclaved and added to the medium after cooling to 65 ° C. Intact roots were incubated on solidified 0.5 / 0.05 medium (Table 3) for 3 days. The roots are then cut into small pieces of about 0.5 cm (referred to herein as "root explants") and transferred to 10 ml of liquid 0.5 / 0.05 medium; 0.5-1.0 ml of Agrobacterium overnight culture is added. did. The root explant and the bacteria were mixed by gentle shaking for about 2 minutes. Root explants were then blotted on sterile filter paper and co-cultured on 0.5 / 0.05 agar for 48 hours to remove most liquid media. The explants were then rinsed in liquid 0.5 / 0.05 medium containing 1000 mg per liter vancomycin (Sigma). Small pieces were blotted and then incubated on 0.15 / 5 agar (Table 3) supplemented with 750 mg vancomycin and 50 mg Km per liter. Three weeks after infection with agrobacteria containing the chimeric neo gene, green Km-resistant (Km ^R ) Callus was formed in the background of the yellowish root explant. At this point, root explants were transferred to fresh 0.15 / 5 agar containing only 500 mg vancomycin and 50 mg Km per liter. After three weeks, the greenest calli had formed shoots. Shoots were transferred to 150 × 25 mm Petri dishes containing GM to form roots or seeds or both. In these petri dishes, many regenerants formed seeds without rooting. Rooted plants can also be transferred to soil to produce seeds. The following modifications were made to obtain the initial root material. Six sterilized Arabidopsis thaliana C24 seeds were germinated in a growth room under low light conditions in 50 ml GM (250 ml Erlenmeyer flask) on a rotary shaker (100 rpm) for 9 days. Transgenic plants were regenerated from shoots grown on selective medium (50 mg / l kanamycin), rooted and transferred to germination medium or soil. L, liter; IAA, indole-3-acetic acid; Kin, kinetin; 2ipAde, N ⁶ -(2-isopentenyl) adenine; CIM, callus induction medium; SIM, shoot induction medium; MS, Murashige and Skoog medium; B5, Gamborg B5 medium Transformation of potato Solanum tuberosum var. For the transformation of Kardal, a protocol as described in Hoekema et al., 1989 Bio / Technology 7,273-278 was used with some modifications. The peeled and surface-sterilized potato tubers were cut into 2 mm thick slices. These were used to cut out 1 cm diameter disks along the periphery of the slice. Disaster was treated with WM (Murashige and Skoog medium, 1 mg / l thiamine HCl, 0.5 mg / l pyridoxine Hcl, 0.5 mg / l nicotinic acid, 100 mg / l myo-inositol, 30 g / l sucrose, 0.5 g / l MES (pH 5.8) ). Inoculation with Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 (Hood et al., 1993 Transgenic Research 2, 208-218) was performed with an OD of 0.5-0.7 in LB and appropriate antibiotics. ₆₀₀ This was done by replacing WM with 100 ml of fresh WM containing a resuspended pellet of 10 ml of freshly grown Agrobacterium culture. After incubating the tuber discs in the bacterial suspension for 20 minutes, they were grown at a density of 20 explants / petri dish with solidified CM (8 g / l agar, 3.5 mg / l zeatin liposide, 0.03 mg / l indoleacetic acid). (Replenished WM). Two days later, the disks were transferred to PM (CM supplemented with 200 mg / l cefotaxime, 100 mg / l vancomycin) and selected against Agrobacteria. Three days later, the discs were transferred to SIM plates (CM supplemented with 250 mg / l carbenicillin, 100 mg / l kanamycin) at a density of 10 explants / petri dish and selected for regeneration of transformed shoots. Two weeks later, the tissue disks were transferred to a new SIM, and after another three weeks, they were transferred to SEM (SIM with a 10-fold lower concentration of hormone). After about 8-9 weeks of co-culture, shoots are large enough to cut from callus tissue and shoots are maintained in 10 ml RM (0.5 x MS salt, 0.5 x MS salt, 0.5% for in vitro rooting maintenance and vegetative growth). X Transferred to a glass tube (Sigma, Cat. Nr. C5916) containing WM containing 10 g / l stalose, 100 mg / l cefotaxime, 50 mg / l vancomycin, and 50 mg / 1 kanamycin. Nematode manipulation, plant root growth and infection Arabidopsis seeds were surface-sterilized and plated on B5 medium containing 20 g / l glucose and 20 mg / l kanamycin in Petri dishes (φ: 9 cm). After 3 days at 4 ° C, the plates were incubated for 2 weeks in a growth chamber at 22 ° C with a 16 hour light / 8 hour dark cycle. The kanamycin resistant plants were then transferred to translucent plastic tubes (30 x 15 x 120 mm, Kelder plastibox bv, The Netherlands) filled with soil. The tube was placed at an angle of 60 degrees to the vertical axis so that the roots grew on the underside of the tube. This allowed the infection process to be monitored visually and made it easier to remove the root system from the soil for GUS analysis. After another two weeks, 500 second instar larvae of Heterodera schachtii per root system (3 ml H _Two Infection was performed by injecting into the soil a suspension containing the second instar larvae of 300 Meloidogyne incognita per root system or in a root system. Similarly, potato shoots rooted on RM medium containing kanamycin were transferred to translucent plastic tubes (30 × 15 × 120 mm, Kelder plastibox bv, The Netherland) filled with soil and lit at 22 ° C. for 16 hours. The plants were allowed to grow for an additional 2 weeks with a cycle of 8 hours in the dark. 500 second instar larvae of Globodera pallida per root system (3 ml H _Two Infection was performed by injecting a suspension containing (in O) into the soil. GUS Assay At various times during the infection process, the root system is thoroughly washed to remove most of the attached soil, and these are washed with an X-Gluc solution (1 mg / ml X-Gluc, 50 mM NaPO4). _Four (pH7), 1 mM K _Four Fe (CN) ₆ , 1 mM K _Three Fe (CN) ₆ GUS activity was measured by incubating overnight at 37 ° C., 10 mM EDTA, 0.1% Triton X100). After removing chlorophyll from the tissue by incubation with 70% ethanol for several hours, GUS staining was monitored under a microscope. Example 1 Construction of Binary Vector pMOG800 Binary vector pMOG800 is a derivative of pMOG23 (FIG. 1, deposited with Centraal Bure au voor schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, The Netherlands, January 29, 1990, number CBS 102.90). In pMOG23, an additional KpnI restriction site was introduced into the polylinker between EcoRI and SmaI. This plasmid contains a kanamycin resistance gene between the left and right borders of T-DNA for selection of transgenic plant cells (FIG. 2). A sample of E. coli DH5α (with pMOG800) was deposited with the Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, The Netherlands on Aug. 12, 1993 under the number CBS 414.93. Example 2 Construction of a promoter-free GUS construct pMOG553 The construction of this vector is described in Goddijn et al., 1993 Plant J 4,863-873. There is an error in this reference; this construct contains the CaMV 35S RNA terminator instead of the indicated nos terminator after the β-glucuronidase gene. The sequence between the T-DNA borders of this binary vector is available from the EMBL database under accession number X84105. pMOG553 has a HygR marker for plant transformation (FIG. 3). Example 3 Identification and Isolation of Captured NFS Preferred Promoter Fragment in Arabidopsis thaliana The binary vector pMOG553 was recruited into the Agrobacterium tumefaciens MOG101 strain by triparental conjugation. The resulting strain was used for Arabidopsis root transformation. In this way, over 1100 transgenic Arabidopsis plant lines were obtained. Transgenic plants were grown to maturity, self-fertilized, and the resulting seeds (S1) were harvested and vernalized. Subsequently, S1 seeds are germinated on nutrient solution (Goddijn et al., 1993 Plant J 4, 863-873) coagulated with 0.6% agar, 10 mg / l hygromycin, and absorbed at 4 ° C. for 4 days. Saved for a period. On day 5, the plates were transferred to room temperature and light was reduced for germination (1000 lux, 16 hours light / 8 hours dark). The 14 day old sprouts were transferred to potting soil in inclined translucent plastic tubes (30 × 15 × 120 mm) for further growth at 5000 lux (20 ° C.). As the plants grow in this way, most root systems grow on the lower surface of the tube, in the middle layer between the soil and the tube. Two weeks later, the roots were infected with nematodes as described in the experimental section. At several time points after inoculation (range 2-14 days), the root system was analyzed for GUS activity as described in the experimental part. Strain pMOG553 # 1164 was identified as a line showing somewhat strong GUS expression in syncytia and giant cells induced by Heterodera schachtii and Meloidogyne incognita, respectively. In uninfected control plants of this line (as well as infected plants), very weak GUS expression was detected in a few cells at the base of the young lateral roots and in some green parts of the plant. In line 1164, this phenotype was found to segregate at a ratio of 1: 3, indicating that the GUS construct is present at one locus per genome. The presence of only one T-DNA copy was confirmed by Southern analysis. A 1.5 kb fragment of the captured promoter sequence flanked by GUS open reading frames was isolated by inverse PCR. The genomic DNA of this line was cut with the restriction enzyme Mscl (cutting the GUS coding region once) and religated. Subsequent digestion of the circular DNA with the enzyme SnaBI yielded a linear fragment with the plant sequence flanked by known GUS sequences and flanking between them. This fragment was amplified using the primer set of GUSinv5 (5'CTT TCC CAC CAA CGC TGA TC3 'SEQ ID NO: 1) and GUS7 (5'GTA ATG CTC TAC ACC ACG CCG 3' SEQ ID NO: 2) to obtain multiple copies. It was cloned into type Better and sequenced (see below). To clone the amplified fragment back into the GUS, the plant sequence was transformed with the Arabidopsis genome using the primers GUSinv5 and 1164XBM (5 'TCT AGA GGA TCC TGG CCA TAC AAA TCA ACG TTT AC 3' SEQ ID NO: 3). Re-amplified from DNA. Pfu DNA polymerase with proofreading activity was used to reduce the rate of error. Primer 1164XBM introduces a BamHI site at the 5 'end of the promoter. This allowed the 1480 bp BamHI promoter fragment to be cloned back before GUS in the construct pMOG819, in which the sequence between the GUS open reading frame and the plant promoter was unchanged. Example 4 Construction of Promoter-Free GUS Construct pMOG819 The GUS intron coding region of pMOG553 (Vancanncyt et al. 1990, Mol. Gen. Genet. 220; 245-250) was used as a BamHI-EcoRI fragment in the polylinker of pMOG800. This vector was constructed by cloning. The binary vector pMOG819 (FIG. 4) serves to introduce a cloned promoter fragment for further expression analysis after plant transformation. Example 5 Analysis of Promoter Fragment after Reintroduction into Arabidopsis The PCR product from tag 533 # 1164 was cloned back into the binary vector pMOG819 before the GUS gene to create pMOG849 (FIG. 5). A sample of E. coli DH5α with pMOG849 has been deposited with the Centraal Bureau voor schimmelcultures, Oosterstraat 1, Baarn, The Netherlands, May 4, 1995, under the number CBS 308.95. To determine the tissue-specific activity of the cloned promoter fragment, the resulting clone pMOG849 was mobilized to Agrobacterium tumefaciens and the corresponding strain was used to transform wild-type Arabidopsis thaliana plants. 24-30 transformants were generated per construct. Seeds from primary transformants were harvested and grown for infection assays on Heterodera schachtii as described in the experimental section. GUS analysis after nematode infection showed that 79% of the lines transformed with pMOG849 expressed the reporter gene with syncytium. Some weak expression was also found in the regions where the lateral roots branch, root and leaf vascular tissue, the center of the rosette, and some flower tissues. GUS expression outside syncytia showed significant variability between strains (see FIG. 6). Presumably, this variation is the result of genomic location effects of the introduced regulatory sequences. Nevertheless, in most strains, the expression pattern was found to be very similar to the originally tagged strain 553 # 1164. Even though the activity of the promoter fragment in the various pMOG849 lines was generally much weaker than the GUS activity inside the syncytium, no syncytium-positive line was completely specific to the feeding site. GUS expression was also found in giant cells induced by infection with Meloidogyne incognlta in the same line expressing GUS in syncytium induced by Heterodera schachtii. This indicates that the # 1164 fragment can be used as an almost feeding site specific promoter to engineer plants with reduced susceptibility to Meloidogyne incognita and Heterodera sc hachtii. During the tissue culture stage, the # 1164 regulatory sequence is also active as a promoter, thus transferring the # 1164 promoter fragment into Arabidopsis along with a plant cell-disruptive gene under its control (eg, barnase). In some cases, it was observed that this prompted the need to use a neutralizing gene (see Examples 8 and 9). The corresponding genomic clone was isolated using the 553 # 1164 based PCR fragment as a probe. A 2.1 kb genomic fragment (SEQ ID NO: 4) was then used in a similar approach as described above (pMOG889 contains genome 533 # 1164 fused to the GUS intron). In addition, nematode-induced GUS expression was determined by Scha chtii and M.S. It could be observed in syncytia and giant cells after nematode infection of Arabidopsis roots with incognita. Example 6 Sequencing of the Promoter Tag pMOG553 # 1164 The sequence of the genomic clone # 1164 was determined by a primer walking strategy on CsCl purified DNA using the Pharmacia automated sequencer ALF. Fluorescent dATP was used in combination with the AutoRead sequencing kit. The procedure is described in Voss et al., (1992) Mol Cell Biol 3, 153-155. The sequence is shown in SEQ ID NO: 4. Example 7 Cloning of Promoter Subfragment (s) Five subfragments of promoter # 1164 were generated by PCR using primers as shown in Table 4. The numbering of the primers is identical to that used in the sequence listing. For all amplifications, proofreading DNA polymerase pfu was used and pMOG849 served as target DNA. All 5 'end primers contain an XhoI site. Thus, all of the PCR-created deletion fragments of the 1164 promoter can be reintroduced into pMOG819 using the XhoI and BamHI sites, which are located at the multiple cloning site of pMOG553 and have GUS coding in the tagged 1164 strain. Retained between the region and the tagged plant sequence. The numbers refer to the construct resulting from the subfragment cloned into pMOG819; primers 6044-1 to 6044-6 correspond to SEQ ID NOs: 6 to 11, respectively. After reintroduction of these gene cassettes into plants, the pattern, timing, etc. of expression can be determined as described for the 1.5 kb # 1164 fragment of Example 3. Fragments found to have useful patterns and / or timing are subsequently used to drive the expression of other heterologous DNA sequences (both sense / coding and antisense) and / or hybrid promoters. Can be used to make constructs. In addition, further analysis yields insights into some regulatory elements (eg, silencers, enhancers, etc.) and the potential for intentionally affecting expression patterns and / or timing. To illustrate how the promoter fragment according to the invention can be used to confer reduced susceptibility to nematodes, this was now used as a 2.1 kb genomic fragment of # 1164 (cloned before barnase). Is shown as an example of the NFS disruption gene. Example 8 Cloning of # 1164 in front of barnase A 2.1 kb genomic DNA fragment containing the 5 'tagged sequence from line 116 was cloned before barnase (RNase gene from Bcillus amyloliquefaciens) and Plants that were resistant to spores were engineered. Genomic fragments were obtained by screening 400000 clones of a genomic library of Arabidopsis ecotype C24 with the # 1164 iPCR product (see Example 3). A 4 kb EcoRI fragment was isolated from one of the hybridizing clones and subcloned into the multicopy plasmid pKS (Stratagene). Sequence analysis revealed that this clone contained a 2.1 kb sequence and a 1.9 kb 3 'sequence 5' to the T-DNA insert in strain 1164. To restore the correct sequence context before the GUS coding region, a 546 bp SnaBI fragment from pMOG849 spanning the promoter-GUS fusion was inserted into the SnaBI site of the genomic clone. A 2325 bp HindIII fragment was isolated from the resulting clone. This clone contained the complete 5 'tagged sequence from the genomic EcoRI subclone. This fragment was cloned before the barnase gene in construct pFL8 (described below), resulting in clone pFL15. The fragment containing the barnase coding region was PCR amplified with pMT416 DNA (Hartley, sub) using primers 5'CGGACTCTGGATCCGG AAAGTG 3 '(SEQ ID NO: 12) and 5'CTGCTCGAGCCTAGGCACAGGTTATCAACACGTTTG 3' (SEQ ID NO: 13). These primers introduce adjacent BamHI and XhoI restriction sites and facilitate cloning of this fragment. The fragment was cloned into a multiple cloning site in a vector containing the Barstar gene (required to overcome the toxicity of Barnase in bacteria) under the control of the Taq promoter. To eliminate the toxicity of barnase expression in the subsequent cloning step, an ST-LS1 intron was inserted at the StyI site of barnase. An NcoI site was created at the barnase translation initiation codon by recombinant PCR using primers 5'CGGACTCTGGATCCGGAAAGTG 3 '(SEQ ID NO: 14) and 5'CTTACTCGAGCCATGGTAAGTTTCTGC 3' (SEQ ID NO: 15) to give pOG16.1. The following oligonucleotides 5 'GATCTAGACTCGAGAAGCTTGGATCCCCGGGTAGGTCAGTCCCC 3' (SEQ ID NO: 16) and 5 'CATGGGGGACTGACCTACCCGGGGATCCAAGCTTCTCGAGTCTA 3' (SEQ ID NO: 17) were annealed and the resulting adapter was ligated between the BgIII and NcoI sites of pOG16.1. By doing so, the 5 ′ untranslated sequence of barnase was further modified so as to resemble the corresponding sequence in the original pMOG553 # 1164 strain to obtain clone pFL8. The adapter introduced a HindIII site 5 ′ to the barnase coding region. Using this, 1164 promoter was inserted to obtain pFL15. In addition, this procedure replaced the fragment containing the Taq promoter and the bulster gene with this adapter. Example 9 rolD-B ^★ Construction pFL11 contains the chimeric bulster gene in a binary vector. This construct was cloned in the following manner. The balstar coding region is present on the HindIII / BamHI fragment in construct pMT316 (Hartley (1988) J Mol Biol 202, 913-915). The HindIII site was changed to a BamHI site by ligating a self-annealing adapter 5′AGCTCG GATCCG 3 ′ (SEQ ID NO: 18) to this site. Subsequently, the obtained BamHI fragment was cloned between the doubly enhanced CaMV 35S promoter and the nos terminator in the expression cassette pMOG180 (described in WO93 / 10251) to obtain pOG30. The HindIII site at the 3 ′ end of the nos terminator was changed to an XhoI site using the adapter 5′GGCTGCTCGAGC 3 ′ (SEQ ID NO: 19), and the 5 ′ promoter was changed using the adapter 5′AATTGACGAAGCTTCGTC 3 ′ (SEQ ID NO: 20). The 'EcoRI site at the end was changed to a HindIII site. The 35S promoter was then replaced by a promoter from the Agrobacterium rhizogenes Ro1D gene. This promoter was excised as a HindIII / BamHI fragment from the construct pDO2 (obtained from F. Leach (Leach and Aoyagi (1991) Plant Sci 79, 69-76)). From the resulting clone pOG38, the bulster gene containing the promoter and terminator was excised by digestion with HindIII and XhoI, and inserted into each position of the polylinker of pMOG800 to obtain pFL11. Finally, the chimeric # 1164 promoter-barnase gene was excised out of pFL15 as an EcoRI fragment and inserted in tandem orientation into the unique EcoRI site of pFL11 between the bulster and the NptII marker gene, yielding pMOG893. Example 10 Transformation of potato plants with pMOG893 and testing for increased resistance to Globodera pallida Binary vector pMOG893 was mobilized into Agrobacterium tumefaciens and the resulting strain was used for potato cultivars as described in the experimental section. Tuber discs from Kardal were used for transformation. A total of 98 transgenic lines were obtained. These lines were vegetatively grown by cutting shoots into segments containing at least one node and rooting them in vitro. Fifteen plants per line were tested for increased resistance to Globodera palllda as described in the experimental section. Potato plants transformed with pMOG893 containing a barnase / barstar construct are expected to show reduced susceptibility to Globodera pallida due to nematode-induced expression of barnase inside the (developed) nematode dietary structure Is done. The above examples are provided only to illustrate the present invention and are not intended to be limiting. One skilled in the art will readily make numerous modifications within the scope of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者バンデルリー，フレデリックマリアンヌオランダ国エヌエル―2623 ジージェイデルフト，ビンケンラーン 131 (72)発明者ゴディン，オスカーヨハネスマリアオランダ国エヌエル―2312 エルエヌライデン，オウデヘレングラッチ５ (72)発明者クラプ，ジョークオランダ国エヌエル―1055 エヌエイアムステルダム，アドミラールデリューターウェフ 352 ３────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF) , CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S Z, UG), AM, AT, AU, BB, BG, BR, B Y, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES , FI, GB, GE, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LT, LU, L V, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ , PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, U Z, VN (72) Inventor Van der Lee, Frederick Maria Nenne Nuel-2623 GJ Delft, Binkenran 131 (72) Godin, Oscar Johannes Maria Nuel 2312 LN Leiden, Oude Herrengatch 5 (72) Inventor Clap, joke Nuel 1055 N.A. Admiral de Lu, Amsterdam -Terwef 352 3

Claims

[Claims] 1. A DNA fragment available from Arabidopsis thaliana that is Promotes root-knot and cyst nematode-induced transcription of bound DNA sequences when reintroduced The nucleotide sequence represented by nucleotides 646-2141 of SEQ ID NO: 4 A DNA fragment comprising 2. Comprises the nucleotide sequence represented by nucleotides 1-2141 of SEQ ID NO: 4 A DNA fragment according to claim 1. 3. When reintroduced into plants, nodules and cyst nematodes of bound DNA sequences The DNA fragment according to any one of claims 1 or 2, which can promote conductive transcription. Part or subfragment or combination of subfragments. 4. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, which is substantially specific to a nematode feeding site. DNA fragment. 5. The DNA fragment according to any one of claims 1 to 4, in the direction of transcription. And a DNA sequence expressed under the control of its transcription, and A chimeric DNA sequence comprising a DNA sequence that is not under the transcriptional control of the fragment. 6. 6. The method according to claim 5, wherein the expressed DNA sequence results in the production of a plant cell disrupting substance. The described chimeric DNA sequence. 7. 7. The chimeric DNA sequence according to claim 6, wherein said cell disrupting substance is barnase. 8. The cell-disrupting substance includes RNA complementary to RNA essential for cell viability A chimeric DNA sequence according to claim 6. 9. The expressed DNA sequence causes the production of a substance toxic to the inducing nematode. 6. The chimeric DNA sequence of claim 5, which results. 10. A replicon comprising the chimeric DNA sequence according to any one of claims 5 to 9. . 11. The DNA fragment according to any one of claims 1 to 4, in the direction of transcription. For insertion of DNA sequences expressed under the control of the DNA fragment. A replicon comprising at least one restriction endonuclease recognition site. 12. A microorganism comprising the replicon according to claim 10. . 13. The chimeric DNA sequence according to any one of claims 5 to 9 in the genome thereof. Incorporated, plant cells. 14． A plant root system consisting essentially of the cells of claim 13. 15. A plant consisting essentially of the cells of claim 13. 16. The plant according to claim 15, which is a dicotyledon. 17． 17. The plant according to claim 16, which is a potato plant. 18. A plant grafted to the root system according to claim 14. 19. Claims obtained from the plant of any one of claims 15 to 18, and claims A seed, flower, tuber, root, leaf, fruit, pollen, and tree comprising the plant cell of claim 13. A part of a plant, selected from parts. 20. It consists essentially of the plant according to any one of claims 15 to 18, produce. 21. Identify subfragments capable of promoting transcription of bound DNA sequences in plants Use of the DNA fragment according to any one of claims 1 to 4 for the preparation of a DNA fragment. 22. The chimera according to any one of claims 6 to 9, for transforming a plant. Use of DNA sequences. 23. 4. The method according to claim 3 for producing a hybrid regulatory DNA sequence. Is the use of subfragments or a combination of subfragments.