JP2000509146A

JP2000509146A - 遅延クエンチングによりホルムアルデヒド固定を制御する方法および組成物

Info

Publication number: JP2000509146A
Application number: JP9537286A
Authority: JP
Inventors: ジェームス，ウィリアム，エム．; ホーグ，ステファン，ダブル．
Original assignee: オンコール，インコーポレーテッド; ユニバーシティーオブメリーランドアットボルティモア
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-14
Publication date: 2000-07-18
Also published as: WO1997039330A1; AU2668697A; EP0900367A1; US20010031482A1; US6319683B1

Abstract

(57)【要約】細胞および組織標本のホルムアルデヒド固定をクエンチングするための方法および組成物。該組成物はホルムアルデヒド反応性剤を含む。ホルムアルデヒド反応性剤はホルムアルデヒドと反応して、細胞または組織標本の固定をクエンチングする。該方法は、ホルムアルデヒド固定液をこの組成物と接触させることを含む。

Description

【発明の詳細な説明】遅延クエンチングによりホルムアルデヒド固定を制御する方法および組成物関連出願本願は、1996年４月12日に出願した米国特許出願シリアルNo.08/631,440号の同時部分継続出願である。発明の分野本発明は一般に、ホルムアルデヒドの溶液を使用する、生物学の研究または医学実験のための細胞および組織標本の固定に関する。本発明は特に、そのような標本の固定時間を化学的に制御するための方法および組成物に関する。発明の背景固定は、広範囲の分析試験で使用するための細胞標本および組織標本を調製する最初の重要な段階である。いくつかの具体的試験としては、免疫組織化学(ＩＨＣ)、フロー免疫サイトメトリー、核酸プローブを用いたin situでのハイブリッド形成(ＩＳＨ)、in situでのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＰＣＲが包含される。これらの試験は典型的には、特定のＤＮＡもしくはＲＮＡシーケンス、ペプチド、タンパク質または他の種類の生体分子、薬物および一般的分析物の検出に使用される。固定は、標本において微細な細胞の構造および構成を安定化して、それらが次の加工処理に耐え、回顧分析(retrospective analysis)のために保存されるようにする。固定した細胞標本および組織標本はまた、生化学またはヌクレオチドシーケンス分析のための生合成分子を抽出するのに使用され得る。固定なしでは、多種類の細胞標本および組織標本において生合成分子または環境分子を感度よく検出し、位置測定し、かつ定量することは、不可能でないとしても困難であろう。良い固定液は、細胞および組織の成分を固めて、分解、腐敗および自己消化を防がなければならない。固定液による組織の修飾の物理化学的プロセスは漸次的かつ複合的であり、組織への拡散浸透および種々の潜在的な化学反応を含む。今までに、理想的な固定剤は見出されていない。すなわち、細胞形態を完全に保存し、なお、次の検出のためにそこでの分析種の反応性を変えないように標本組成を修飾することのない固定液は見出されていない。この状態のゆえに、特定の固定液の選択は一般に、多様な考慮を伴う。したがって、多くの固定液が現在使用されている。アルコールまたは他の有機溶媒を高含量で有する固定液は、特に穏やかな有機酸で酸性化すると、沈殿および凝固によって組織標本を固める。そのような固定液はいくつか利点を有する。まず、固定液が組織中の構成分子を共有結合的に修飾しないので、組織中のほとんどの抗原の抗体に対する反応性は非常に高いままである。第２に、同じ理由のために、組織中の核酸が良い状態で容易に抽出され得る。第３に、緩衝溶液中で組織を再水和することによって、固定液が組織から完全に洗い流され得る。しかしながら、そのような固定液は、１つの重大な欠点を有する。この欠点というのは、アルコールまたは他の溶媒で固定した組織の顕微鏡的形態が、共有結合する固定液を用いて固定した組織の形態ほど詳細ではないことである。アルコールまたは他の溶媒に基づく固定液に対して、共有結合する固定液、例えばホルムアルデヒドは、優れた細胞保存を提供する。ホルムアルデヒド（ＣＨ₂ Ｏ）は、組織保存剤としてＦ.Blumによって1893年に最初に報告された(10Ｚ．W iss.Mikrosc.314)。その固定液は、安価で、使用が簡単で、首尾一貫した結果が得られるので、現在組織病理学において最も広く使用されている。ほとんどの合衆国および外国での研究および臨床実験室で見出されるホルムアルデヒドの処方は、中性の緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）である。それはまた、「緩衝化された中性のホルマリン」とも呼ばれ得る。Ｒ．Lillie、Histopathologic Tech.300(1948年 )参照。他のホルムアルデヒド処方は次のものを含む。10％ホルマリン；アルコール性ホルマリン；酢酸カルシウムホルマリン；ボーインの流体（Bouin'Fluid ）(ピクリン酸または酢酸を含む、ｐＨ1.6)；カジャル(Cajal)のホルマリン−臭化アンモニウム；ホルマリン／アルコール／酢酸；パラホルムアルデヒド(重合したホルムアルデヒド)；およびホルモル−塩類(Ｇ．Clark、Staining Procedur es 13-16(1981年))。 10％メタノール安定剤を含む市販の飽和水性ホルムアルデヒドストックをホルマリンと呼ぶ。そのホルムアルデヒド濃度は、いくつかのやり方で表示できる。特に、100％飽和、37％(重量／重量)、40％（重量／体積）または13.3Ｍ溶液として表示され得る。固定液のためのこのストックの通常使用する希釈は、体積比で１：10（初期：最終）である。そのような希釈によって、3.7％(重量／重量) 、4.0％（重量／体積）または1.3Ｍホルムアルデヒドとしても表示され得る10％飽和溶液を生じる。例えば、米軍病理学処方研究所[Ｕ.Ｓ.Armed Forced Instit ute of Pathology Formulation(AFIP)］の標準ＮＢＦ溶液は、ｐＨ6.8〜7.2のリン酸緩衝液中でのホルマリンの１：10（体積：体積）希釈である（Laboratory M ethods in Histotechnology）(Edona Prophetら編集、1992年))。水性ホルムアルデヒドの化学は、特にＪ．Walkerの論文、ホルムアルデヒド、８章（1944年）にすっかり概説されている。ホルムアルデヒドは、水（＞99.9％、Ｃ.Ｈ．Foxら、33J．Histochem．Cytochem.845-853(1985年)による）とすみやかに結合し、水和物、メチレングリコールを形成する気体である：ＣＨ₂Ｏ＋Ｈ₂Ｏ → ＣＨ₂（ＯＨ）₂ メチレングリコールは、大量プロセスによって重合し、パラホルムアルデヒド（ポリオキシメチレングリコール）を形成することができ：ｎＣＨ₂（ＯＨ）₂ → （ＣＨ₂Ｏ）_n・Ｈ₂Ｏ＋（n-1）Ｈ₂Ｏこれは、ホルムアルデヒド固定液の処方においてホルマリンの代わりに時々使用される。中性からアルカリ性の緩衝溶液中で、パラホルムアルデヒドはメチレングリコールに解重合し、これは脱水して活性カルボニルホルムアルデヒドと平衡になる(Walker,上出、74-75頁)。このように、組織へのその効果は希釈したホルマリンと同じである。メチレングリコールは、組織標本温度とは逆比例する速度で、拡散によって組織に速やかに浸透する。組織浸透は、ウサギの肝臓で、８時間で0.5ｃｍと測定された(Ｗ．Ｔ．Dempster、107 Am.Ｊ.Anal.59-72(1960年))。組織内でのメチレングリコールの脱水は、反応性のカルボニルホルムアルデヒドの有効レベルを維持する。カルボニルホルムアルデヒドの固定反応は浸透の速度よりずっとゆっくりであり、温度依存性である。かくして、¹⁴Ｃホルムアルデヒドをラットの腎臓のやや薄い（16μｍ）組織セクションに施与すると、結合反応が24時間かけて進んで、平衡に達する(Ｃ.Ｈ.Foxら、33J.Histochem.Cytochem.845-853(198 5年))。非常に反応性のある親電子性の種であるホルムアルデヒドは、組織中のタンパク質および核酸と結合することによって、組織を固定する(Feldman、13 Prog.Nu cleic Acid Res.Mol.Biol.1-49(1973年))。組織のホルムアルデヒドによる修飾は、２つの速度論的に異なる段階で進む。最初の反応は、１級アミン類（リジン）およびチオール類（システイン）および、核酸のピリミジンではなくプリン塩基を修飾し、シッフ塩基ではないモノおよびジメチロール誘導体を形成する。反応が、ヌクレオチド、核酸ポリマー、アミノ酸またはタンパク質を含むかどうかにかかわらず、この段階は、24〜48時間内に平衡に達する。ホルムアルデヒドが組織から除去されると、これらの不安定な付加物は速やかに逆戻りし得る。次の反応は、組織に共有的に結合するメチロール誘導体が関与する。これらの第２の反応は、洗浄しても逆戻りしないメチレン架橋を形成する。タンパク質においては、第２の架橋反応は、最初に修飾した部位に隣接する１級アミド(グルタミン、アルパラギン)、グアニジン基（アルギニン）およびチロシン環炭素等のより反応性の低い官能基でメチレン架橋を経て生じる(Ｈ．Flraenkel-Conrat ＆Ｈ．Ｓ．Olcott、70 Ｊ.Am.Chem.Soc'y 2673(1948年))。この反応は非常に漸次的で、固定に少なくとも30日間かかり、比較的安定な共有架橋結合を生じる。核酸では、第２の反応はまた、連鎖架橋を生じる。連鎖架橋のほかに、この反応は、核酸とタンパク質との間の架橋結合を生じることができる。これら第２の反応のすべてが、固定された組織においてマクロ分子内および分子間で架橋結合の格子を生じる。すべての共有結合適修飾の網目の効果は、帯電したタンパク質側鎖の通常の非共有結合パターンを妨げることによって、組織中の生体ポリマーを部分的に変性させ、かつその立体配座を固くて曲がらない立体配置に固定することである。すなわち、マクロ分子の二次構造は変えられない（ Masonら、39Ｊ.Histochem.Cytochem.225(1991年)）が、その立体配座は固くて曲がらない立体配置に固定される。これら第２の架橋反応は、固定された組織に行われる分析試験に悪影響を及ぼす。例えば、固定された組織中のマクロ分子種（タンパク質、核酸）またはよリ小さい分子（タンパク質付加物、薬剤、代謝産物、シグナル導入種、脂質等）の選択的染色はしばしば、組織中の分析物に特異的にかつ高親和性で結合する抗体を用いて行われる。核酸のシーケンス特異的検出においては、検出可能な相補的なオリゴまたはポリヌクレオチドシーケンス（プローブ）が、ハイブリッド形成のために使用され得る。サイトメトリーアッセイにおいては（例えば顕微鏡またはフローサイトメトリーによって）インタクトな細胞構造で(in situ)ハイブリッド形成を行なうことができる。しかしながら、固定された組織の内部の架橋結合は、これらの試験で使用される大きなプローブ分子、特に抗体およびオリゴまたはポリヌクレオチドが浸透するのを妨げる。これらのプローブ分子の接近の減少は、アッセイ感度の損失へと転じる。ハイブリッド形成はまた、(例えばゲルまたはブロットで)組成物アッセイのために、組織または細胞から調製した可溶の抽出物で行なうことができる。固定液による修飾によって、抽出効率または分析物の反応性のいずれかを妥協することになる。例えば、固定は、核酸の抽出効率または次の核酸増幅の効率に影響を及ぼし得る。同様に、抗体またはプローブの付着を引き起こす非共有結合力の１つは、水素結合を生じる反対の電荷間のクーロンの引力であり、すなわち試験で反対に荷電した基および分析物分子の対形成である。しかし、組織における側鎖の修飾および架橋は、分析物が抗体または核酸プローブとこれらの非共有結合を形成する能力を妨害し得る。かくして、施与されたリガンドとの特異的な非共有結合的相互作用に関与するスルフヒドリル基および荷電アミノ側鎖のホルムアルデヒドによる修飾は、アッセイ感度に有害である。大きな標的分析物、例えば多くの潜在するエピトープを含むタンパク質は、多くの異なる抗体を用いて検出できる。異なるエピトープは、変性に対する感受性の範囲を示して、ホルムアルデヒド固定に対して異なる極性および感度を有する。広範なホルムアルデヒド固定の後、別のものではなく１つの抗体で検出可能な標的分析物の多くの例がある。１つの極端な状態では、凍結切片組織にしか使用できない多くの抗体がある。これらのいくつかは、抗体結合の前に酸アルコール中での組織の短時間の後固定を許容することしかできない。多くの他の抗体を用いると、のばされたホルムアルデヒド固定中に、抗原反応性の連続的損失が見出される。広く発現された癌マーカータンパク質であるｐ53 は、例えば、ホルムアルデヒド中に６〜24時間固定されると、モノクローナル抗体PAb1801に対するその反応性のすべてを徐々に失う(Ｒ.Silvestriniら、87J.Na t.Cancer Inst.1020(1995年))。同様に、診断上重要な上皮細胞マーカータンパク質のケラチンは、組織が24時間までホルムアルデヒド中に固定されると、モノクローナル抗ケラチン抗体と結合できなくなる(Ｈ.Battifora＆Ｍ.Kopinski、34 J.Histochem.Cytochem.1095-1100(1986年))。１日固定された組織に有効であり、より長い期間ＮＢＦ中に貯蔵された組織にはあまり有効でない他の抗体がある。腫瘍診断において普通に使用されるこれらの抗体のいくつかは、リンパ球抗原、ビメンチン(vimentin)、デスミン(desmin) 、神経フィラメント、サイトケラチン、Ｓ100タンパク質、前立腺特異的抗原、チログロブリンおよび癌胚抗原を含む(Ａ．Ｓ.Leong＆Ｐ.Ｎ.Gilham、4 Patholo gy 266-268(1989年))。そのような抗体の他の例は、生物医学的文献に見出すことができる。このように、組織の固定時間を制御して、組織の形態の保存と抗原性の損失との間の妥協を達成することが重要である。一般的規則として、アルデヒド固定の持続は、標本が広範囲の異なる抗体を用いて試験されるように、最小に保たれるべきである。免疫アッセイの結果の質および再現性がまた、組織の固定時間に依存する。現今、固定は、固定液についてアルコールを物理的に交換することによって終わらせる。LengおよびGilhamは、外科組織病理学標本を６時間以下の間固定することを推奨した。彼らによれば、外科病理学標本は通常、４〜24時間固定された後サンプリングされる。しかし、実際には、外科切除の大部分はしばしば、将来の再サンプリングのためにホルムアルデヒド中に保持され、これは３日以上後に起こり得る。解剖標本は通常、都合によって、３〜14日間固定される。しかし、ある状況下では、綿密に標本を監視して、好ましい固定時間を達成することは実験室職員には好都合ではない。これらの職員は、他の職務で手一杯で、かくして固定液を除去すべきときに不在であり得る。さらに、１つの集団内部で加工処理されない生検または死後の標本は、固定液中で病理学実験室へと送られ得る。この輸送時間はしばしば、標本の全固定時間に加える。また、金曜日に到着する標本は週末後まで加工処理され得ず、それによって全固定時間をより長くのばす。さらに、実験室技術者は、所定の固定時間後に各試料を別々に加工処理するよりむしろ、多くの試料をバッチ式処理のために蓄積する。かくして、それぞれの個々の試料の全固定時間の正確な記録は、質の制御標準化について後で参考にするために入手できない。ＩＨＣを、知られていない時間固定された保管所のパラフィン切片に施与するときは、可変の染色が普通である。そのような変化は、固定敏感な推定の癌マーカータンパク質、例えば最も広く発現された癌マーカータンパク質であるp53の発現における回顧研究実験を混乱させる「隠された可変」であり得る(Ｐ．Hall ＆Ｄ．Lane、172Ｊ.Pathol.1-4(1994年))。免疫および遺伝の試験の組織病理学的施与に関連する重要な点は、その再現性と質である。最近、カレッジオブアメリカンパソロジスツおよび他のグループは、食品医薬品局（ＦＤＡ）に、米国で販売されたほぼ2,500の抗体をクラスII医療具に分類することを請願した(Ｒ.Stone、268 Science 494(1995年)) 。ＦＤＡは、あるＩＨＣ試薬をクラスIIまたはクラスIII医療具として分類するその意図を告知した。このことは、製品に、試験の正確さと精度(accuracy and precision)を文書で証明することを要求するであろう（Ｇ.Graziano、10 Col.Am .Pathologists 1 er seq.(1996年))。このように、ＦＤＡおよびこの分野の病理学者は、免疫組織化学的方法のよりよい質の制御およびより大きい標準化の必要性を認識している。標的エピトープの固定から誘導される損失は、いくつかの技術を用いることにより補償され得、これは、文献では、抗原「回復(retrieval)」、「回復(restorati on)」、「非架橋」または「非マスキング」と呼ばれてきた。これらの技術は、個々に加工処理される薄い組織切片で行われる。しかしながら、これらの技術は、固定および改善における制御されない変化によって、標準化の損失を必然的に改善する。可変の固定時間は、可変のかつ知られていない量の非架橋／非マスキングを必要として、もし実際に免疫反応性が不可逆的に失われないなら、免疫反応性の同じレベルに達する。ホルムアルデヒド固定によって隠された多くの抗原は、プロテアーゼ溶液を組織切片に施与することによって再びさらされ得る(Ｓ.Hungら、35 Lab.Invest.38 3(1976年)；Ｈ.Battifora ＆Ｍ．Kopinski、34 J.Histochem．Cytochem.1095-1 100(1986年))。しかしながら、ホルムアルデヒドにさらに長いことさらされると、一定のレベルの免疫反応性を回収するように、より活発なタンパク質分解を要した。タンパク質分解は、最小にされなければならない。というのは、大量のプロテアーゼ消化は、組織の形態を退化させるからである。実際に、ホルムアルデヒドにさらす長さは、種々の試料で変化し、タンパク質分解時間を標準化することの非実用性を示唆する。種々の抗原が種々のプロテアーゼ処理を必要とする。したがって、標準化と取り組むために、これは簡単な方法ではない。マイクロ波の抗原回復が、Ｍ．Ｅ．Key、Ｓ．Ｒ．ShiおよびＫ．Ｌ．Kalraにより米国特許第5,244,787号明細書（1993年９月14日）に、およびＳ．Ｒ．Shiら、39Ｊ.Histochem.Cytochem.741-748(1991年)に開示された。この方法は、顕微鏡スライド上の組織切片を、種々の決められたｐＨおよびイオン組成から選択される水性溶液中で沸騰させることを含む。Bankfalviら、174Ｊ.Pathol.223-228( 1994年)は、同程度に有効で、より好都合の方法は、水和した切片をオートクレーブで処理することであることを見出した。種々の新規な方法学体系の現今の発展は、Ｓ.Ｒ.Shi、Ｒ．Ｊ.Cote＆Ｃ.Taylor(45Ｊ.Histochem.Cytochem327(1997 年))による概説に要約されており、ここでは、この分野でよりよい最適化および標準化についての必要性が力説されている。 Cattorettiら、171Ｊ.Pathol.83-98(1993年)は、タンパク質分解を種々の溶液中でのマイクロ波に対して比べた。彼らは、いくつかの抗原は、その処理の両方ではなくいずれかから選択的に利益を得ることを見出した。著者らは、抗原非マスキング法の通常のメカニズムはタンパク質の変性に関係することを推論した。しかし、種々のモノクローナル抗体を用いた免疫染色によるその後の検出可能性へのホルムアルデヒドの有害な効果に、特定のタンパク質エピトープのアミノ酸組成を関係付ける明らかな見本はなかった。この分野での他の人の発見（Ｓ．Ｒ．Shiら、39Ｊ.Histochem.Cytochem.741-748(1991年);Ａ．Ｓ.Leong＆Ｐ．Ｎ．G ilham、4 Pathology 266-268(1989年)）と一致して、これらの著者は、すべてではなくいくつかのエピトープは、タンパク質分解または加熱のいずれかによる過度固定(over-fixation)の後、完全に回収され得ることを見出した。そのための抗原の回復が有効でない、いくつかの固定感受性抗原が存在するので、かつ過度固定されたときだけ抗原回復から利益を得ることができる他の固定感受性抗原が存在するので、これらの差異は、固定時間を標準化することによって抗原マスキングの範囲を標準化する、完成した方法および組成物のこの分野での必要性を生じさせる。ＤＮＡ含量は、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織中の単細胞中で、またはそこから回収した細胞中で測定されて、イメージ分析またはフローサイトメトリーによって細胞増殖についてアッセイされ得る。ホルマリン過度固定は、プロピディウムアイオダイドおよび他の蛍光のＤＮＡ結合染料の結合を減らすことによって、ＤＮＡ含量の測定を妨げる。これはおそらく、それが、架橋されたＤＮＡ‐ヒストン複合体を作るためである。細胞懸濁物または組織切片を用いる、熱的な抗原回復がこの問題に適切である(Ｗ．Ｒ．Overton ＆Ｊ．Ｐ．McCoy、16 Cytometry 351-356(1994年);Ｗ.Ｒ.Overton＆Ｊ.Ｐ.McCoy,26 Cytometry166-17 1(1996年))。ＤＮＡまたはＲＮＡは、遺伝分析のためのホルマリン固定された、パラフィン包埋組織試料から抽出できる。これらは、定量され、次いでＰＣＲを用いて増幅されて、例えば発現または突然変異分析のために、遺伝子シーケンスの存在を測定され得る。ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織試料は、もし組織がＮＢＦ中に約12-24時間固定されたなら、ＰＣＲシーケンス分析にのみ敏感に反応する(Ｊ．Ｊ．O'Learyら、26 Histochem.Ｊ.337-346(1994年);Ｃ．Ｅ．Greerら、95Am.Ｊ.Clin.Pathol.117-124(1991年);Ｆ.Karlsenら、71 Lab.Invest.604-61 1(1994年))。ＰＣＲ in situ／in situＰＣＲ法が、保管所の中にある、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織の遺伝分析に使用されて、例えば単細胞中のウィルスおよび腫瘍遺伝子突然変異が検出される。24-48時間の制限された固定は、最良のin situでの増幅結果を与える(Ｊ.Ｊ.O7Learyら、26 Biochem. Ｊ.337-346(1994年))。このように、固定の過度にのばされた期間は、これらのタイプの試験ならびに上記した他の試験の結果に悪影響を及ぼし得る。組織のホルムアルデヒド結合における量的な変化は、ＩＨＣ処置において回顧的に評価することが難しい。Battiforaは、ＮＢＦ中での固定の範囲に比例して免疫反応性の徐々の損失に供される、部分的に固定感受性の抗原が内部対照として役立つことを提案した。Battiforaは、96 Am.Ｊ.Clin.Pathiol.669-671(1991 年)にて、いたるところにある内皮のマーカーであるビメンチンを用いて彼が提案した「普遍的な代用エピトープ(universal surrogate epitope)」について切片を染色することによって、固定した組織中で抗体結合の平均減少を較正することを提案した。しかしながら、この方法は、全体の質の制御のための標準化された固定の必要性と直接には取り組まない。上記を考慮して、従来、固定液から細胞または組織標本を物理的に除去する必要なしに、または標本の固定時間を綿密に監視する必要なしに、またはその両方なしに、第２の架橋反応が生じるのを防ぐ方法および組成物の必要性がある。また、固定液中の細胞または組織標本の経済的なバッチ処理ができ、同時に、綿密な監視の必要なしにそれらの標本の固定時間を標準化する方法および組成物のこの分野での必要性がある。さらに、高い経済的コストなしに組織の固定時間に関して質の制御のレベルを上げることによって、分析的試験方法例えばＩＨＣおよびＩＳＨをより感度よくし、首尾一貫したものにする方法および組成物のこの分野での必要性がある。したがって、本発明の目的は、固定液から組織を物理的に除去する必要なしに、または組織標本の固定時間を綿密に監視する必要なしに、またはその両方なしに、第２の架橋反応が生じるのを防ぐ方法および組成物を提供することである。本発明の目的はさらに、固定液中の細胞または組織標本の経済的なバッチ処理ができ、同時に、綿密な監視の必要なしにそれらの標本の固定時間を標準化する方法および組成物を提供することである。本発明の目的はさらに、組織標本の固定において重要な変化しやすいもの、例えばホルムアルデヒドを用いた固定の時間を標準化する方法および組成物を提供することである。本発明のこれらのおよび他の目的は、以下の要約、詳細な説明および添付の図面を参考にして容易に理解されよう。発明の要約本発明は、上記の目的のすべてを達成し、細胞および組織標本の過度の固定に関連する問題を解決する。それらの問題は、望まないメチレン架橋結合の形成および抗原活性の損失を含む。本発明は、ホルムアルデヒド反応性剤を有する固定液をクエンチング(quenching)させることによって、生物試料のホルムアルデヒド固定を制御するための方法および組成物を提供することによって、これらの問題を解決する。その組成物の観点での１つにおいて、本発明は、ホルムアルデヒド反応性剤および発泡剤を含む組成物に関する。組成物の観点での別のものにおいて、本発明は、コアおよびコアを取り巻くコーティング層を含む組成物に関する。コアはホルムアルデヒド反応性剤を含む。１の実施態様において、ホルムアルデヒド反応性剤は尿素である。別の実施態様において、ホルムアルデヒド反応性剤はアンモニウム塩である。本発明はさらに、成分のキットに関する。キットの観点での１つにおいて、本発明は、少なくとも１の上記した組成物および生物組織固定のための体積較正された容器を含むキットに関する。キットの観点での別のものにおいて、本発明は、少なくとも１の上記した組成物および、少なくとも１の、固定液のｐＨを中和するための補助的組成物を含む成分のキットに関する。補助的組成物は、コアおよびコアを取り巻くコーティング層を含む。コアは固定液のｐＨを中和するために添加剤を含む。方法の観点での１つにおいて、本発明は、ホルムアルデヒドを含む固定液をクエンチングさせるための方法に関する。この方法は、固定液を少なくとも１の上記した組成物と接触させることを含む。方法の観点での別のものにおいて、本発明は、生物試料を固定するための方法に関する。この方法は、試料をホルムアルデヒドを含む固定液と接触させることを含む。この方法はさらに、固定液を少なくとも１の上記した組成物と接触させることを含む。方法の観点でのなお別のものにおいて、本発明は、生物試料を固定液試薬にさらすことを調節する方法に関する。この方法は、生物試料を固定液試薬に所定の時間さらすことを含む。この方法はさらに、固定液試薬および生物試料を、生物試料の固定を実質的に止めるのに十分な量の固定液クエンチング試薬と接触させることを含む。更なる観点において、本発明は、上記した方法によって作られた生物試料に関する。図面の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは、中性の緩衝ホルムアルデヒド（ＮＢＦ）で18時間固定され、次いでエタノール中に29日間置かれた組織試料を示す。図１Ｃは、ＮＢＦ中に30日間保持された組織試料を示す。図１Ｄは、ＮＢＦ中で18時間固定され、次いで等モル量の尿素を用いてクエンチングされ、さらに29日間保存された組織試料を示す。図２Ａは、標準としてＮＢＦの希釈を用いた、アセチルアセトンとの反応によるホルムアルデヒドについてのアッセイの較正を示す。図２Ｂは、ＮＢＦ中で尿素と21時間反応させた４回の反応におけるオリジナルのホルムアルデヒド濃度の百分率を示す。図３Ａは、ＮＢＦ中で12時間固定された組織試料を示す。図３Ｂは、ＮＢＦ中で48時間固定された組織試料を示す。図３Ｃは、ＮＢＦ中で48時間固定された別の組織試料を示す。図４Ａは、ＮＢＦ中で１週間固定された組織試料を示す。図４Ｂは、ＮＢＦ中で１週間固定された別の組織試料を示す。図５は、酢酸アンモニウムとの反応における時間外の、オリジナルのホルムアルデヒド濃度の百分率を示す。発明の詳細な説明本発明は一般に、ホルムアルデヒド反応性剤を用いて固定液をクエンチングさせることによって、生物試料のホルムアルデヒド固定を制御するための方法および組成物に関する。しかしながら、本発明を詳細に議論する前に、以下の用語をまず定義する。「錠剤」という語は、凝集性の塊を意昧する。錠剤は、常にではなく典型的には、凝集性の固体に圧縮された粉末を含む。「カプセル」という語は、固体または液体物質が外部の抑制力によって閉じ込められるシステムを述べるために使用される。カプセルは、常にではなく典型的には、通常ゼラチンでできたカプセル殻中に置かれた粉末または液体を含む。「コーティング層」という語は、デリバリーシステムの外部表面に施与された層を述べるために使用される。この層は、常にではなく典型的には、コーティング層内に閉じ込められた活性成分の拡散速度を変え、または活性成分に悪影響を与える種々の環境因子から活性成分を保護するように設計される。本発明はいくつかの面を有する。最初の面では、本発明はホルムアルデヒドを含む固定液をクエンチングさせるための組成物に関する。クエンチング組成物は、ホルムアルデヒド反応性剤および発泡剤を含む。この組成物は、コーティングされていない錠剤の形状であり得る。コーティングされていない錠剤は、ホルムアルデヒド反応性剤が固定液と接触するとすぐに拡散するようにし、そうすると、ホルムアルデヒド反応性剤がホルムアルデヒドと反応し、かつホルムアルデヒドの固定液挙動をクエンチングさせ始める。本発明のコーティングされていない錠剤は、生物試料を物理的に除去しまたは浴溶液を変えることなしに、固定液をクエンチングさせる方法を考慮する。ホルムアルデヒド反応性剤は、以下の基準に合う任意の化学薬品であり得る： (1)室温以下の温度で約１時間以内に水に溶解して、少なくとも約0.25Ｍの濃度になる；(2)ほぼ中性のｐＨで室温以下の温度で水性溶液中でホルムアルデヒドと反応して、安定で、かつ組織構成成分に対しては比較的非反応性である化合物（群）を形成する；(3)溶液のｐＨを大きく下げたり上げたりしない；(4)侵食性、毒性、刺激性、または発癌性がせいぜいわずかである；かつ(5)錠剤、ペレットまたはカプセルに組み込まれ得ること。１の実施態様において、ホルムアルデヒド反応性剤は尿素（カルバミド；カルボニルジアミド；またはＨ₂ＮＣＯＮＨ₂）である。それは、上記した必須の特性のすべてを有する。尿素は水に非常に溶解性であり、室温以下の温度で中性ｐＨ（7.2〜7.6）でホルムアルデヒドと非常に反応性である。重要なことに、尿素とホルムアルデヒドとの反応は、固定液のｐＨを変えない。尿素ならびにホルムアルデヒドとの反応により形成された化合物は組織構成成分、例えばタンパク質および核酸と反応性ではない。尿素は非侵食性で、非毒性で、非発癌性で、非刺激性でかつ臭いがない。最終的にそれは、錠剤として圧縮調剤および表面コーティングされやすい。上記したように、尿素は中性のｐＨで室温にて水性溶液中で、ホルムアルデヒドと速やかに縮合する(Ｊ．Ｆ.Walker、Formaldehyde 110,208-209(1944年))。等モル比の反応体が使用されると、反応生成物はモノメチル尿素である：Ｈ₂ＮＣＯＮＨ₂ ＋ＣＨ₂Ｏ → Ｈ₂ＮＣＯＮＨＣＨ₂ＯＨ１：２のモル比では、形成される反応生成物はジメチロール尿素である：Ｈ₂ＮＣＯＮＨ₂ ＋２ＣＨ₂Ｏ → ＨＯＣＨ₂−ＮＨＣＯＮＨ−ＣＨ₂ＯＨ１：２のモル比では、ホルムアルデヒドの平衡残留濃度は比較的高い。したがって、尿素対ホルムアルデヒドのモル比約１：１〜約２：１が好ましい。好ましくは、無水の超高純度等級の尿素が、本発明の組成物中のホルムアルデヒド反応性剤として使用される。組成物はブリスタタイプのパッケージ中に保存され得る。あるいは、デシケータを含むディスペンサー中に保存され得る。１の実施態様において、ホルムアルデヒド反応性物質はアンモニウム塩である。アンモニウム（ＮＨ₄ ⁺）塩は、水に非常に溶解性であり、便利に濃縮され、アンモニア（ＮＨ₃）分子の安定な供給源である。アンモニアは、室温以下の温度で中性ｐＨ（約7.2〜7.6）でホルムアルデヒドと非常に反応性である。ホルムアルデヒドと典型的なアンモニウム塩との反応の速い速度が、実施例17、図５に示される。アンモニウム塩は典型的には、組織構成成分例えばタンパク質および核酸と有意には反応しない。アンモニウム塩のほとんどが通常、非侵食性で、非毒性で、非発癌性であり、非常に穏やかな臭いを有する。いくつかのアンモニウム塩は、他のものより錠剤として圧縮調剤されやすく、錠剤への均質な表面コーティングの施与をされやすい。アンモニウム塩の例としては、制限されることはないが、重炭酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、安息香酸アンモニウム、アルギン酸アンモニウム、重酒石酸アンモニウム、二塩基性クエン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、グルコン酸アンモニウム、吉草酸アンモニウム、アンモニウムチオシアネート、一塩基リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、スルファミン酸アンモニウム、プルプル酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、馬尿酸アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、臭化アンモニウム、フッ化アンモニウム、炭酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等を含む。アンモニアとホルムアルデヒドとの主な反応生成物は、ヘキサメチレンテトラミン（1,3,5,7-テトラアザトリシクロ[3.3.1.1^3,7]デカン：同義語：ＨＭＴＡ，メテンアミン、ヘキサミン）[100-97-0]（Ｃ₆Ｈ₁₂Ｎ₄；Ｆ．Ｗ．140.2；メルクインデックス第11版、1989年、モノグラフ＃5879）である。ＨＭＴＡは安定で、非常に水溶性で、わずかに塩基性の３級アミン含有化合物で、ダイヤモンド様の構造を有する。６ＣＨ₂Ｏ（水性）＋４ＮＨ₃ → Ｃ₆Ｈ₁₂Ｎ₄ ＋６Ｈ₂ＯＨＭＴＡの形成および特性は、Ｊ．Ｆ．Walkerの論文（Fnrmaldehyde、レインホールド、ニューヨーク、第３版、1964年、第19章、511〜551頁）に記載されている。反応は速く(図５)、等モルのアンモニウムおよびホルムアルデヒドを反応させたとき、少なくとも90％のホルムアルデヒドを消費する。固定中の組織の収縮は、組織における微細構造の正確な測定についての問題を引き起こし得る。そのために、固定中に組織の収縮を避けるについては、固定液の浸透力の軽減が有益である。１モルのＨＭＴＡ当たり６モル当量の炭素および４モル当量の窒素の組込みは、加えたアンモニウム塩および賦形剤の浸透力を実質的に相殺する、全浸透力の低下を与える。反応のｐＨは可変であり、これは反応される入手可能なアンモニウムイオンの一部分を変える。ほぼ定量的な反応を成し遂げるために、反応は、約6.7〜約7.0 の範囲のｐＨに緩衝されなければならない。アンモニウムではなくアンモニアが反応種であると、水素イオン（Ｈ⁺）が水に分け与えられ、それでｐＨは反応中に減少する傾向がある。６ＣＨ₂Ｏ（水性）＋４ＮＨ₃ → Ｃ₆Ｈ₁₂Ｎ₄ ＋６Ｈ₂Ｏ＋４Ｈ⁺ この反応は通常、反応したホルムアルデヒド１モル当たり２／３モルの水素イオンを与えることができる。ＮＢＦはホスフェート緩衝液を、通常約0.075Mで含み、これは反応されるべきホルムアルデヒドの濃度（1.3Ｍ）より遥かに低い。この反応は固定液のｐＨを下げる傾向にあるので、緩衝液を供給して、反応のｐＨを中和することができる。好ましい面においては、緩衝剤は、ホルムアルデヒド反応性剤において内在する構成成分である。このように、錠剤の内容および製作の困難性が最小にされる。かくして、アンモニウム塩のアニオンが緩衝剤として機能し得る。７つの異なるアンモニウム塩を直接比較すると、ｐＨは、特に中性より下で、残余のホルムアルデヒド濃度に強く関連することを示す。重炭酸塩または炭酸塩をアンモニウムのクエンチング反応に加えると、ｐＨは上がり、反応は終了へとさらに進む(実施例18)。錠剤を作り、任意的にそれにコーティングするのに使用される製作工程においては、ある困難性が錠剤の大きさに比例し得る。しかし、最大可能な大きさの錠剤が、固定液のより大きい体積をクエンチングさせるのに使用されるのが好ましい。反応性のアンモニウム塩の内在緩衝剤としての重炭酸アンモニウムの使用は、経済的でかつ効率的である。というのは、それは、１つのアンモニウム塩および１つの補助的な緩衝剤を使用するときに比べて、物質の使用を減らすからである。かくして、本発明の好ましい組成物は、第１の緩衝剤として重炭酸アンモニウムを含む。しかし、組成物が他の公知の緩衝剤を含むことができることは理解されるべきである。本発明にしたがい組み込まれることができる他のホルムアルデヒド反応性剤の例は、アミノ酸、例えばグリシンおよびその誘導体、例えばグリシンエチルエステルハイドロクロライド、アラニン、アスパラギン等；タンパク質例えばコラーゲン、ゼラチン、カゼイン等；尿素過酸化水素(カルバメートパーオキシド)；チオ尿素；カルバミン酸エステル(ウレタン)；シアナミド、ジシアナミドおよびメラミン；重亜硫酸ナトリウム；硫化水素；アルカリ溶液中の糖類例えばフラクトースおよびグルコース；マロン酸エステル；フェニルヒドラジン；アニリン；固体ヒドラジンジヒドロクロライド、ヘミサルフェート、サルフェート、(酸性化剤)およびヒドロキシルアミン（酸性化剤）である。使用されるホルムアルデヒド反応性剤の量は、クエンチングされることが要求されるホルムアルデヒドの量および組成物それ自体の所望の大きさに依存して変わり得る。全体で、ホルムアルデヒド反応性剤対ホルムアルデヒドのモル比は、約0.8：１〜約２：１にすべきであり、好ましくは約0.8：1.0〜1.5：1.0の範囲にすべきである。好ましくは、使用されるホルムアルデヒド反応性剤の量は、固定液中で約0.25Ｍ以下の残余ホルムアルデヒド濃度にするような量である。残余ホルムアルデヒド濃縮物は、処理された組織において固定液のレベルを保持することおよび腐敗または疾病を引き起こす微生物を抑制することの両方の目的に役立つ。組成物中の発泡剤は、ホルムアルデヒド反応性剤が、固定液中で水と接触すると、クエンチングし分散することを促進する。当分野で公知の任意の発泡剤が本発明の組成物において使用できる。典型的な発泡剤は、穏やかな有機酸およびカーボネート化合物の組合せを含む。典型的な穏やかな有機酸としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸およびコハク酸を含む。典型的なカーボネート化合物としては、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、ナトリウムセスキカーボネート、ナトリウムグリシンカーボネート、Ｌ−リジンカーボネート、アルギニンカーボネートおよび無定形炭酸カルシウムを含む。これらの物質は、当分野で公知の技術を用いて、混合されかつ製造されることができる。例えばPharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Vol.1 、Ｈ．Ａ．Liverman、Ｌ．Lachman、およびＪ．Ｂ．Schwartzによる（マルセルデッカー、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ.）を見よ。本発明の好ましい態様において、アンモニウムイオンは、ホルムアルデヒド固定液との反応においてプロトンを放出することによって、内在性の穏やかな有機酸として機能する。このように、本発明の方法および組成物における好ましい発泡性カーボネート化合物は、アンモニウム塩の固有の重炭酸アニオンである。４ＮＨ₄ＨＣＯ₃ → ４ＮＨ₄ ⁺ ＋４ＨＣＯ₃−（水性）６ＣＨ₂Ｏ＋４ＮＨ₄ ⁺ → Ｃ₆Ｈ₁₂Ｎ₄ ＋６Ｈ₂Ｏ＋４Ｈ⁺ ４Ｈ⁺ ＋４ＨＣＯ₃ ^- → ４Ｈ₂ＣＯ₃ → ４ＣＯ₂（気体）＋４Ｈ₂Ｏアンモニウム塩の固有の重炭酸アニオンの使用は、反応性のアンモニウム塩、補助的な穏やかな酸、および補助的な重炭酸塩と比べて、物質のより経済的で有効な使用を提供し、これは組成物のコスト、大きさおよび製造の困難性を減少させる。ホルムアルデヒドとの反応によって放出される二酸化炭素ガスは、固定液の閉じられた容器に圧力を生じさせ得る。気体の圧力は、閉じられた容器の漏れ、こぼれまたは破壊すら引き起こすことができる。この潜在する危険を軽減するために、２つの方法を使用する。方法の１つは、気体が透過できるが水は不透過性である口を有する容器に固定液をまとめることである。容器に口を付ける方法は当業者に良く知られている。あるいは、反応において放出される気体の体積を、重炭酸アンモニウムの全部でなく一部を第２のアンモニウム塩で置きかえることにより、良好なレベルに減らすことができる。第２のアンモニウム塩はアルカリ固有のｐＨに対してほぼ中性で、中性ｐＨのあたりに適切な緩衝容量を有していなければならない。例としては、二塩基性リン酸アンモニウムおよびリン酸ジアンモニウムを含む。好ましい組成物においては、アンモニウム塩の混合物は、重炭酸アンモニウム（ＮＨ₄ ＨＣＯ₃、Ｆ.Ｗ.８４．０）およびリン酸水素アンモニウム（二塩基性;（ＮＨ₄ ）₂ＨＰＯ₄；Ｆ.Ｗ.132.1）である。種々のアンモニウム塩は、特有の物理的テクスチャー、コンシステンシーおよび吸湿性を有する。これらの特性は、ホルムアルデヒド反応性剤、緩衝剤または発泡剤としての有用性にかかわらず、錠剤を調剤し、成形する目的のために、種々のアンモニウム塩の潜在的有用性に影響を与え得る。例えば、酢酸アンモニウムが本発明に従い使用できるが、それは非常に吸湿性であり、通常の湿度条件下では大気の水分の重量分を吸収しそうである。かくして、酢酸アンモニウムの処方の水分含量は錠剤の製作中に制御するのが困難であり得、乾燥錠剤が比較的不安定であり得る。さらなる例として、ホウ酸アンモニウムが本発明に従い使用できるが、それは、比較的滑らかな粗く顆粒状のコンシステンシーのゆえに、凝集性の錠剤に圧縮するのが比較的困難である。さらにホウ酸アンモニウムは、要求されるより固定液中の溶解性が低い。本発明の組成物において好ましい２つのアンモニウム塩、重炭酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウムは、吸湿性でないが水溶性であり、賦形剤と共に適当に調剤されると、凝集性の安定な錠剤へ圧縮されやすい。ホルムアルデヒド反応性剤の好ましい組成物は、出発重炭酸塩イオン対出発ホスフェート（二塩基性）アニオンのモル比約80:20〜約60:40の範囲で含むアンモニウム塩の混合物を組み込む。これは、それぞれ４ＮＨ₄ＣＨＯ₃:（ＮＨ₄）₂ＨＰＯ₄のモル比約４：１〜約1.4:１の範囲に同等である。これらの剤のこれらの比の使用は、アンモニウムイオンのモル対ホルムアルデヒドのモルの比約１：１以上を用いて反応が進められるとすれば、反応後のｐＨをｐＨ約6.7〜約7.3の許容範囲にする(実施例18)。本発明に従いホルムアルデヒドクエンチングのためのアンモニウム塩を含む組成物の使用は、好ましくは固定液のｐＨを実質的に変えてはならない。あるいは、組成物は、固定液のｐＨを上げるかまたは下げるように変えられ得る。より低いｐＨでホルムアルデヒドのほとんどを反応させる目的のために、ホルムアルデヒド反応性剤対ホルムアルデヒドのモル比は増加されなければならない。反応ｐＨは、任意の補助的な緩衝剤および／またはアンモニウム塩の任意の内在的アニオンを用いることによって変えられ得る。好ましくは、アンモニウム塩の種類から選ばれたホルムアルデヒド反応性剤の異なる混合物を使用することによって、反応ｐＨはもっとも経済的に変えられ得る。好ましくは、本発明の組成物に使用されるすべての化学薬品は、調剤前に無水でなければならず、ＡＣＳ等級かそれ以上でなければならない。組成物は、ブリスタタイプのパッケージ中に保存され得る。あるいは、デシケータを含むディスペンサー中に保存され得る。１の実施態様において、クエンチング組成物は、コアおよび、コアを取り巻く１またはそれ以上のコーティング層を含む。コアは、上記したホルムアルデヒド反応性剤の１またはそれ以上を含む。好ましくは、組成物は、コーティングされた錠剤またはカプセルの形状である。コーティングされた錠剤またはカプセルを作るために、当分野で公知の任意の方法が使用できる。コアのための典型的な錠剤処方は、充填剤／結合剤、滑沢剤および１またはそれ以上の活性成分を含む。活性成分は好ましくは、約50〜約75重量％の範囲の量で存在する。充填剤は好ましくは、約20〜約48重量％の範囲の量で存在する。滑沢剤は、好ましくは、約２〜５重量％の範囲の量で存在する。適当な充填剤の例としては、微晶質のセルロース、ブドウ糖、ラクトースおよびマンニトールを含む。適当な滑沢剤の例としては、ナトリウムラウリルサルフェート、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ8000)、ステアリン酸マグネシウムおよびナトリウムステアリルフマレートを含む。錠剤および／またはカプセルは、一般に容認された製造の実施に従って製造され得る。例えば、活性成分および充填剤をまず適当なブレンダーで、完全な混合を確実にするのに十分な時間ブレンドする。次に、滑沢剤を混合物に加え、適当な時間、例えば５分間ブレンドする。標準の打錠機および打錠用具を用いて圧縮することにより、錠剤が形成され得る。コーティング層は、大気の水分との接触により早熟な分解からコアを保護するため、または遅らせた放出プロファイルを提供するためまたはその両方のために役立ち得る。かくして、コーティング層の目的に依存して、層は、厚さならびに組成を変えることができる。もし遅らせた放出プロファイルが望ましいなら、コーティング層は、固定液と接触したら、コア内容物の即座の湿潤を防がなければならない。しかしながら、水がコアに達すると、コーティング層は速やかにばらばらになり、固定液中に溶解するか、または固定液から容易に除去することができる空のコーティング殼を残さなければならない。かくしてコーティング層は、所望の時間でコア中のホルムアルデヒド反応性剤を放出して、ホルムアルデヒド固定液と反応し、組織標本の固定を止めるような物質および厚さを持たなければならない。好ましくは、コーティング層は、室温で測定したときに約１分〜約36時間水に不浸透性である。室温測定は、より高い温度でのより速い効果およびより低い温度でのよりゆっくりとした効果に言い換える。コーティング層がホルムアルデヒド固定液を放出しなければならない特定の時間は、固定される標本に依存する。というのは、種々の標本が、種々の速度で固定液による拡散浸透を受け、組織中の種々の分析物が種々の時間の固定で架橋を受けるからである。本発明での使用に適当な典型的なコーティング層物質としては、天然ポリマー、合成ポリマーまたは変性した天然のポリマーを含む。これらのポリマーの例としては、ジメチルアミノエチルメタクリレート、メチルアクリレート酸エステルコポリマー、エチルアクリレート‐メチルメタクリレートコポリマー、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドングリコール、セルロースアセテートフタレートおよびポリエチレングリコールを含む。他の例としては、シェラック、シリコーンエラストマー、ワックスおよび脂肪を含む。当分野で良く知られているように、これらの物質はしばしば、可塑剤例えば多価アルコール、酢酸エステル、フタル酸エステルおよびグリセリドと共に使用される。これらのコーティング物質は、当分野で公知の方法を用いて施与され得る。例えば、ファーマシューティカルドーセッジフォームズ(Pharmaceutical Dosage Forms):Tablets,Vol. ３、Ｈ．Ａ．Lieberman、Ｌ．Lachman、およびＪ．Ｂ．Schwartzによる（マルセルデッカー、ニューヨークＮ．Ｙ．）を見よ。好ましいコーティング層物質は、ポリメタクリレートポリマー、エチルセルロースおよびポリ（オルトエステル）ポリマーである。ポリメタクリレートポリマーは好ましくは、アンモニアメタクリレートコポリマーと組合せて使用される。１の実施態様において、錠剤は、サブコーティングとして設計され得る第１の層に囲まれたコアを含む。サブコーティングは、どのような次のコーティング層の施与中にもどんな湿気感受性の物質をも保護するために使用され得る。サブコーティング物質が処方されて、次のものを含み得る：コーティング剤例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ポビドン(povidone)、シェラックマルトース／デキストリン等；可塑剤例えばポリデキストロース、レシチン、ポリエチレングリコール、グリセリン、トリエチルシトレート、トリアセチン等；および任意的に、アジュバント例えば、アルギネート、ビスマス、カラギーナン、アカシア(アラビアゴム)、トラガカントゴム、レシチン等を含みうる懸濁剤を含むことができる。サブコートの処方における使用に適した市販の入手可能な製品は、ＯＰＡＤＲＹ（商標）であり、カラーコン(C olorcon)、ペンシルバニアから市販に入手可能で、これはヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリデキストロース、アルギン酸ナトリウム、レシチンおよびトリアセチンからできている。ホルムアルデヒド反応性剤が尿素であるとき、および組成物がポリメタクリレートポリマーでコーティングされているとき、組成物がさらに穏やかな有機酸を含むのが好ましい。典型的には、ポリメタクリレートポリマーは、持続放出のために使用される。すなわち、それらは、延ばされた時間にわたって、ゆっくりと薬剤を放出するように設計される。しかし、弱酸の組成物への組込みは、一旦水がコーティング層を通過し、コアを湿らせると、放出速度を促進する。このことは、ナリサワらによって、lI Pharm.Res.111-116(1994年)に開示された。この目的のために適当な酸としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、酢酸、グルタール酸、およびコハク酸を含む。好ましくは、穏やかな有機酸はコハク酸である。上記に挙げた酸は、二溶液補助(disolution aid)として機能する剤の例である。アルカリ性ｐＨに対して中性で、尿素とホルムアルデヒドの反応生成物は固定液に溶解できる。しかし、数日後、白い沈殿の薄い層が生じ、接触する表面を覆う。非常に低いｐＨ値では、不溶性のポリ縮合生成物または樹脂が沈殿する。樹脂形成の問題を避けるために、クエンチング組成物のコアは、酸性の固定液のｐＨを中和する化合物を任意的に含むことができる。中和する化合物は、塩基または緩衝剤であり得る。例えば、クエンチング組成物のコアは二塩基性リン酸ナトリウムを含んで、ボウイン溶液(Bouin'solution)を中和することができる。好ましい態様において、コーティングされた錠剤をホルムアルデヒド固定液中に置くと、計画された遅延があり、その後、固定液は錠剤のコアへ入リコアと反応し始めなければならない。加圧されたＣＯ₂気体の少しの体積が最初に生じ、なお無傷の錠剤コーティングの内部に閉じ込められる。十分な量のこの気体の放出は次に、コーティングが開裂し、単一のものから成る錠剤から分離することの観察によって証明されるように、錠剤の残留コーティングの突然の破壊を引き起こす。かくして、本発明に従い、コーティングはパンと開き、１回の破裂でコア内容物の速やかな暴露を引き起こして、ホルムアルデヒドのクエンチングが始まるときの時間をはっきりと規定する。組成物はまた、水溶性ポリマー例えばポリメタクリレートタイプのポリマーまたはセルロースアセテートフタレートを用いてコーティングされ得る。これらのコーティングされた錠剤をホルムアルデヒド固定液中に置くと、ポリマーは水和し、かつ溶解し始める。結局、ある期間の後、コーティングの構造の完全無欠さが、コアが固定液に速やかに暴露される点まで減らされるのに十分なポリマーが溶解する。コアの速やかな暴露は、コアの発泡性の性質によって促進される。このように、本発明の好ましい組成物はアンモニウムの重炭酸塩を含み、これはホルムアルデヒド反応性剤のコーティングからの一気の放出を引き起こし、内在する緩衝剤としてふるまい、ホルムアルデヒドとの反応において主な活性種であり、かつ発泡剤としてふるまう。クエンチング組成物の可能な大きさには限りがあるので、そのコア中に中和化合物および賦形剤のみを含む第２の別のコーティングされた組成物が、クエンチング組成物と共同で使用され得る。もちろん、第２の組成物の使用は、クエンチング組成物の使用に対して補助的である。第２の／補助的組成物のコーティング層は、クエンチング組成物のコーティング層と同じ材料から作られ得る。また、別の物質からできていることもできる。好ましくは、第２の／補助的組成物のコーティング層は、クエンチング組成物のコーティング層より短い遅延放出プロファイルを有する。これによって、第２の／補助的組成物中の中和化合物が、クエンチング組成物がホルムアルデヒド反応性剤を放出する前に固定液のｐＨを中和することができる。もちろん、固定液のｐＨおよび温度に依存して、クエンチング組成物ならびに第２の／補助的組成物のコーティング層物質は、所望の遅延放出プロファイルを達成するように、変わり得る。上記したように、尿素とホルムアルデヒドとのクエンチング反応は、温度依存性ならびにｐＨ依存性である。例えば、尿素とホルムアルデヒドとのクエンチング反応は、４℃では24℃より10倍遅い。図２Ｂを見よ。そのような温度では、クエンチングの全時間は約24時間である。このように、試料を低温でホルムアルデヒドで固定すると、遅延放出プロファイルを有するクエンチング組成物の使用は必要ない。すなわち、尿素を届けるために、コーティングされた錠剤またはカプセルを使用する必要がない。発泡剤を含む尿素組成物は固定液に直接届けられ、同時に試料が固定液中に置かれる。その点で、固定とクエンチングの両方が起こっている。アンモニウム塩とホルムアルデヒドとのクエンチング反応は、温度依存性ならびにｐＨ依存性である。例えば、酢酸アンモニウムとホルムアルデヒドとのクエンチング反応は、４℃では24℃より３倍遅い。図５を見よ。ホルムアルデヒド反応性剤とホルムアルデヒドとのクエンチング反応は温度依存性なので、本発明のクエンチング組成物は種々の厚さを有するコーティング層を有し得ることが企図される。コーティング層の厚さは固定液の温度に依存する。さらに、本発明のクエンチング組成物はコーティング層なしで使用され得るが、クエンチング組成物は、大気の湿気による減成および劣化からホルムアルデヒド反応性剤を保護するためだけに、そこに薄いコーティング層を有するのが好ましい。１面において、本発明は、成分のキットに関する。キットは、少なくとも１の上記したホルムアルデヒドクエンチング組成物および、体積較正された容器（この中に組織試料が固定され得る）を含む。容器は、パーケージされたクエンチング組成物でクエンチングされ得るホルムアルデヒド固定液の特定量を計量するように設計される。任意的に、容器は特定量の固定液であらかじめ満たされる。キットは、使用者が、規定されたホルムアルデヒド反応性剤対ホルムアルデヒドのモル比を使用するのに好都合にし、この比は好ましくは、約0.8:１〜約２：１である。キットに供給されるクエンチング組成物中のホルムアルデヒド反応性剤の量は、規定された体積の水中で少なくとも1.3Ｍ溶液を作るのに十分でなければならない。種々の組織標本が、固定を達成するために種々の量のホルムアルデヒドならびにクエンチングまでの種々の時間を必要とするので、キットは、種々の大きさの容器および、ホルムアルデヒド反応性剤の種々の投薬量を有するクエンチング組成物を有することが企図される。１つの大体積の固定液をクエンチングするために、１以上のクエンチング組成物がまた使用され得る。好ましくは、１つの大体積の固定液をクエンチングするために、２またはそれ以上のクエンチング組成物が使用される。さらに、キット中のクエンチング組成物は、固定されるべき標本に依存して、種々の遅延放出プロファイルを有することができる。発泡性化合物を組み込む本発明の処方は、穴のない容器の内部に気体圧力を生じさせる。したがって、本発明の好ましいキットデザインは、締りばめのふた(c lose-fitting lid)を有する容器を有する。ふたは、小さい半透過性のメンブランフィルター(membrane filter)が取り付けられている口に合わせられ得る。フィルターは、疎水性の微孔性膜タイプであることができ、これは、過度の圧力になった気体を排出させるが、通常の大気圧では水および気体を保持する。例えば、それは、次の物質から成ることができる：ポリテトラフルオロエチレン(ＰＴＦＥ；ゴア‐テックス(商標))、ポリプロピレン、アクリルコポリマー、またはポリビニルジフルオライド(ＰＶＤＦ)。キットの観点で、別のものにおいては、本発明は、上記したホルムアルデヒドクエンチング組成物の少なくとも１つ、および上記した第２の／補助的組成物の少なくとも１つを含む、成分のキットに関する。特に、第２の／補助的組成物は、補助的なコアおよび補助的コアを取り囲む補助的コーティング層を含む。コアは、固定液のｐＨを中和するための添加剤を含む。コアは任意的に、固定液をクエンチングさせるためのホルムアルデヒド反応性剤をまた含む。その多の実施態様は、上記した本発明のキットと同じであり得る。方法の観点での１つにおいて、本発明は、ホルムアルデヒドを含む固定液をクエンチングさせる方法に関する。この方法は、固定液を少なくとも１の上記したクエンチング組成物と接触させることを含む。本発明の方法において、種々のホルムアルデヒド固定液が使用できる。典型的なホルムアルデヒド固定液としては、ＮＢＦ、パラホルムアルデヒド、および上記した他のものを含む。方法の好ましい実施態様においては、クエンチング組成物が、大量の固定液中に、生物標本と同時に置かれる。遅延の後、クエンチング組成物が溶解し、ホルムアルデヒド反応性剤を分散させる。この剤は次に、ホルムアルデヒドのほとんどと共有的に反応し、これを不活性化する。別の方法の観点では、本発明は、生物試料を固定するための方法に関する。この方法は、試料をホルムアルデヒド含有固定液と接触して、組織を固定することを含む。この方法はさらに、固定液を、上記したホルムアルデヒドクエンチング組成物の少なくとも１と接触させて、直ちに、または設定した時間後にホルムアルデヒドをクエンチングさせる。生物試料は、単細胞、組織、生物体、ウィルス、および細胞外組成物であり得る。好ましくは、試料体積は、固定液の約20％体積未満である。本発明を用いて調製した生物試料、またはそれから調製した抽出物に直接、実施するとき、よりよい感度および質の制御をもって、種々の分析試験を行なうことができる。これらの試験は、免疫アッセイ(例えばＩＨＣ、フローイムノサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、イムノブロッティング(immunoblotting) )、増幅なしの核酸の定量および配列のためのアッセイ（例えばin situでのハイブリッド形成、定量）または増幅法を用いたもの(例えばＰＣＲ、in situ/in si tuでのＰＣＲ、溶液ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、ストランド置換増幅)、クロマトグラフ法(例えば気相または液相分析物移動)、電気泳動法(キャピラリー、粘着性ゲル)、測光法（例えばＵＶ、可視または赤外分光測光法、蛍光測定法）および分子組成の分析のための他の方法（例えば質量分光法、ＮＭＲ）のカテゴリーを含む。別の方法の観点においては、本発明は、生物試料の固定液試薬に対する暴露を調節する方法に関する。この方法は、生物試料を固定液試薬に所定の時間暴露することを含む。この方法はさらに、生物試料の固定を実質的に止めるのに十分な量の固定液クエンチング試薬で、固定液試薬と生物試料とを接触させることを含む。好ましくは、生物試料が固定液試薬にさらされる時間の長さは、生物試料が、劣化および腐敗から十分に安定化されるが、固定液試薬へののばされた暴露の特性を有することはないような長さである。なおさらに好ましくは、生物試料が固定液試薬にさらされる時間の長さは、生物試料が、劣化および腐敗から十分に安定化されるが、実質的な妨害なしに生物学的に試験され得るような長さである。固定時間を厳密な質の制御に供したことにより、固定され安定化された生物試料は、他の同様に固定された試料と一緒に次の加工処理のためにバッチ式に処理されて、さらなる経済的な規模を達成できる。本発明はさらに、上記した方法に従って処理された生物試料に関する。実施例以下の実施例は、本発明をさらに説明するためのものであり、本発明の範囲を不当に限定するものとして解釈されるべきではない。実施例１コア１の直接圧縮処方滑沢剤、崩壊剤、コハク酸および尿素を含むコアを作った。特定の成分およびその重量パーセントを以下の表１に示す。表１１．尿素 76重量％２．Avicel¹ 10重量％３．コハク酸 10重量％４．AcDiSol² 3.5重量％５．ステアリン酸 0.5重量％ ¹ Avicelは、微晶質セルロースの商標、Ｎ．Ｆ． ² AcDiSolは、クロスカルメロース(Croscarmellose)の商標、Ｎ．Ｆ．完全な混合を確実にするのに十分な時間、成分１〜３をまず、適当なブレンダー中でブレンドした。次に成分５を混合物に加え、５分間ブレンドした。標準打錠機および打錠用具を用いて圧縮により錠剤を成形した。実施例２コア２の直接圧縮処方滑沢剤、崩壊剤および尿素を含むコアを作った。特定の成分およびその重量パーセントを以下の表２に挙げた。表２１．尿素 86重量％２．Avicel¹ 10重量％３．Ac-Di-Sol² 3.5重量％４．ステアリン酸 0.5重量％ ¹ Avicelは、微晶質セルロースの商標、Ｎ．Ｆ． ² Ac-Di-Solは、クロスカルメロースの商標、Ｎ．Ｆ．完全な混合を確実にするのに十分な時間、成分１〜３をまず、適当なブレンダー中でブレンドした。次に成分４を加え、５分間ブレンドした。標準打錠機および打錠用具を用いて錠剤を圧縮した。実施例３ポリメタクリレートポリマーでのコーティング実施例１に記載した錠剤をコーティングするためにポリメタクリレートポリマーを使用した。このポリマーは、コハク酸のような弱酸と相互作用して、遅延放出プロファイルを与える。錠剤へコーティングした処方物は、ポリメタクリレートポリマー、タルク、ＴＥＣおよび水を含む。特定の成分およびその重量パーセントを以下の表３に示す。表３１．Eudragit RS 30D¹ 40重量％２．タルク 6重量％３．TEC² 1重量％４．水 53重量％¹ Eudragit RS 30Dは、アンモニアメタクリレートコポリマーを含有するポリメタクリレートポリマーの商標 ² TECは、クエン酸トリエチルの省略成分１〜４を混合して水性懸濁液を調製し、次いで、標準パンコーティングまたは流動床技術を用いて、錠剤に噴霧した。実施例４弱酸およびポリメタクリレートポリマーでのコーティング実施例２に記載した錠剤をまず、以下の表４に処方したような結合剤溶液中に溶解した弱有機酸の層でスプレーコーティングした。次に、上記の表３に記載したようなポリメタクリレートポリマー処方物からなる第２の層を有機酸層の上に噴霧した。このポリマーは弱酸と相互作用して遅延放出プロファイルを与える。表４１．コハク酸 33重量％２．スクロース 33重量％４．水 33重量％成分１および２を水に溶かし、次に、標準パンコーティングまたは流動床技術を用いて、実施例２に記載した錠剤に噴霧した。実施例５ポリ（オルトエステル）ポリマーでのコーティングこの実施例では、クエンチング剤のための制御放出マトリックスとして、ポリ（オルトエステル）ポリマーを使用した。薬剤はポリマーマトリックスの侵食を介して放出される。この侵食は、水によるポリマーの加水分解により引き起こされる。以下の表５に示した成分１および２を一緒に混合し、次いで硬質ゼラチンカプセルに充填した。表５１．尿素 50重量％２．ポリ（オルトエステル）¹ 50重量％¹ 分子量約5000 実施例６発泡剤処方発泡錠剤の処方物を以下の表６に示す。基本錠剤処方物は、重炭酸ナトリウム、クエン酸および尿素から成る。表６１．クエン酸、無水（顆粒状） 40重量％２．重炭酸ナトリウム（顆粒状） 40重量％３．尿素 19重量％４．水 1重量％成分１〜３を十分にブレンドし、混合しながら迅速に水を加えた。作業可能な湿った塊が形成されるまで混合を続けた。この塊を10メッシュのふるいにかけた。この物質を、コンベクションオーブン中で70℃にて２時間トレー乾燥し、次いで冷却し、オーブンから取り出した。次にそれを16メッシュのふるいにかけた。この物質を次に、十分量の滑沢剤と混合し、標準打錠機および打錠用具を用いて錠剤に圧縮した。得られた錠剤を次に、実施例３に記載したコーティング溶液および手順を用いて、スプレーコーティングした。実施例７活性成分の効力ラットの回腸を、切除後すぐに、中性の緩衝化ホルムアルデヒド（NBF）中に置いた。図１Ａおよび１Ｂでは、この組織を18時間固定し、次いでエタノール中に29日間置いた。図１Ｃでは、組織をNBF中に30日間保持した。図１Ｄでは、組織を18時間固定した。次に、等モル量の尿素をNBFに加えた。この混合物中に組織をさらに29日間入れたままにしておいた。すべての組織をパラフィンに包埋し、５μｍの厚さの切片とした。その後、組織抗原ビメンチンのための免疫組織化学染色を、標準モノクローナル抗体V9（図１Ａ、１Ｃおよび１Ｄ）またはイソタイプ適合コントロールモノクローナル抗体（図１Ｂ）を用いて、標本に対して行った。これに続いて、第二試薬、西洋ワサビペルオキシダーゼポリマーと結合したウサギ抗マウス抗体を用いて、検出を行った。ペルオキシダーゼ基質としてジアミノベンジジンおよび過酸化水素を用いて発色させた（DAKO Envision System）。ビメンチンのための免疫組織化学染色は、ホルムアルデヒドに30日間浸漬した標本については染色感度がきわめて弱いことを示した。ホルムアルデヒドおよび尿素中に保持した標本は、免疫反応性を失わず、ほんの短時間固定したものに似ていた。これらの実験の結果は、免疫組織化学においてホルムアルデヒドを尿素でクエンチングすることの効力を明確に示している。尿素対ホルムアルデヒドの最適モル比は必ずしも１：1ではない。しかしながら、この実験は、そのような比が記載されたように使用されるときに真の効力を証明する。実施例８尿素とホルムアルデヒドとの化学反応尿素（顆粒状）を標準NBFと反応させて、化学反応の速度および平衡の程度を決定した。図２Aおよび２Bにそれぞれ示した、ホルムアルデヒドキャリブレーターおよび反応残留物は、T．Nashの分光測光法(55 Biochem．J．416-421(1953)) を用いて測定した。この方法は、アセチルアセトンで形成された化合物の吸光度を405nmで測定することを含む。残留ホルムアルデヒドについてのアッセイは、図２Aに示したように、NBFの連続希釈物を測定することによって、直線性を確認した。ＮＢＦ中の尿素およびホルムアルデヒドを、３つの異なるモル比および２つの温度で反応させた。図２Bにおいて、このデータは、示された時間で、反応物中に測定された残留ホルムアルデヒド濃度を示す。データを出発濃度で除して、10 0％をかけて、残っているオリジナル濃度のパーセントを表した。図２Bの24℃での反応のデータは、反応の動的速度が、尿素：ホルムアルデヒドモル比１：１および1.5：１では比較的速いことを示す。平衡では、オリジナル濃度の90％以上がクエンチングされた。これは、ホルムアルデヒドの残留濃度約0.12M（0.33％、重量／体積）および尿素の残留濃度、１：１で約0.13Mまたは 1.5：１で0.2Mに等しい。平衡の濃度は、少なくとも39日間安定であった。これらのデータもまた、クエンチングの速度が４℃では24℃でよりも約10倍遅いことを示す。実施例９コア３の直接圧縮処方滑沢剤、崩壊剤、コハク酸、重炭酸アンモニウムおよびリン酸水素アンモニウムからコアを製造した。特定の成分およびその重量パーセントを以下の表７に示す。表７１．重炭酸アンモニウム 44重量％２．リン酸水素アンモニウム 32重量％３．Avicel¹ 10重量％４．コハク酸 10重量％５．AcDiSol² 3.5重量％６．ステアリン酸 0.5重量％ ¹ Avicelは、微晶質セルロースの商標、Ｎ．Ｆ． ² AcDiSolは、クロスカルメロース(Croscarmellose)の商標、Ｎ．Ｆ．完全な混合を確実にするのに十分な時間、成分１〜４をまず、適当なブレンダー中でブレンドした。次に成分５および６を混合物に加え、５分間ブレンドした。標準打錠機および打錠用具を用いて圧縮により錠剤を成形した。実施例10 コア４の直接圧縮処方滑沢剤、崩壊剤、重炭酸アンモニウムおよびリン酸水素アンモニウムからコアを製造した。特定の成分およびその重量パーセントを以下の表８に示す。表８１．重炭酸アンモニウム 32重量％２．リン酸水素アンモニウム 18重量％３．マンニトール 45重量％４．粉末PEG 8000 5重量％完全な混合を確実にするのに十分な時間、成分１〜３をまず、適当なブレンダ -中でブレンドした。次に成分４を混合物に加え、５分間ブレンドした。標準打錠機および打錠用具を用いて圧縮により錠剤を成形した。実施例11 コア５の湿式造粒圧縮処方滑沢剤、充填剤／結合剤および活性成分からコアを製造した。処方物を圧縮の前に湿式造粒し、特定の成分およびその重量パーセントを以下の表９に示す。表９１．重炭酸アンモニウム 35重量％２．リン酸水素アンモニウム 25重量％３．微晶質セルロース 39重量％４．ステアリン酸マグネシウム 1重量％完全な混合を確実にするのに十分な時間、成分１〜３をまず、適当なブレンダ -中でブレンドした。次に適当な顆粒化液体を加えて、良好な顆粒を形成し、次いで乾燥した。次に、顆粒に成分４を加え、５分間ブレンドした。標準打錠機および打錠用具を用いて圧縮により錠剤を成形した。実施例12 弱酸およびポリメタクリレートポリマーでのコーティング実施例10に記載した錠剤をまず、以下の表10に処方したような結合剤溶液中に溶解した弱有機酸の層でスプレーコーティングした。次に、上記の表３に記載したようなポリメタクリレートポリマー処方物からなる第２の層を有機酸層の上に噴霧した。このポリマーは、弱酸と相互作用して、遅延放出プロファイルを与える。表10 １．コハク酸 33重量％２．スクロース 33重量％３．水 33重量％成分１および２を水に溶解し、次いで標準パンコーティングまたは流動床技術を用いて、実施例10に記載した錠剤に噴霧した。実施例13 ポリ（オルトエステル）ポリマーでのコーティングこの実施例では、クエンチング剤のための制御された放出マトリックスとしてポリ（オルトエステル）ポリマーを使用した。薬剤はポリマーマトリックスの侵食により放出される。この侵食は、水によるポリマーの加水分解により引き起こされる。以下の表11に示した成分１〜３を一緒に混合し、次いで硬質ゼラチンカプセルに充填した。表11 １．重炭酸アンモニウム 29重量％２．リン酸水素アンモニウム 21重量％３．ポリ（オルトエステル）¹ 50重量％ ¹ 分子量約5000 実施例14 ヒドロキシプロピルメチルセルロースポリマー系でのサブコーティングこの実施例では、ヒドロキシプロピルメチルセルロースポリマーのサブコートを、主コートを施与する前に上記の実施例のいずれかに施与した。サブコーティングは主コートの前に施与される保護コーティングである。サブコートは、主コートの施与中に湿気に敏感な物質を保護し、よって湿気に敏感な物質のコーティングを可能にする。サブコーティング物質は、標準パンまたは流動床コーティング技術を用いて施与することができる。特定の成分およびその重量パーセントを以下の表12に示す。表12 １．Opadry溶液¹ 3〜7.5重量％２．水 97〜92.5重量％¹ 5% Opadry（Colorcon(ペンシルバニア)から市販）を含む。 0padry粉末を水に溶かし（５％）、70〜80℃の温度で噴霧器を用いて錠剤にゆっくりと施与した。標準パンまたは流動床コーティング技術を用いて、典型的には、３〜10固体重量％のOpadryのコーティングレベルを錠剤に施与した。実施例15 エチルセルロースシュードラテックスポリマー系でのコーティングエチルセルロースシュードラテックス(pseudo-latex)ポリマーを用いて、実施例14に記載したようにあらかじめサブコートしておいた錠剤をコーティングした。錠剤にコーティングした処方物は、水中のエチルセルロースシュードラテックスおよび可塑剤を含む。特性の成分およびその懸濁物固体を、パーセントで、以下の表13に示す。表13 １．エチルセルロースシュードラテックス 11重量％２．クエン酸トリエチル 4重量％３．水 85重量％成分１〜３を混合して水性懸濁液を形成し、次いで、標準パンまたは流動床コーティング技術を用いて錠剤に噴霧した。実施例16 活性成分の効力この実施例で使用されるクエンチング錠剤は、0.5gの重炭酸アンモニウム、0. 19gの二塩基性リン酸アンモニウムおよび0.34gのアビセル(Avicell)およびステアリン酸マグネシウムからできていて、コーティングは、0.03gのOpadry（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）からなる。１つのクエンチング錠剤を、１：１のアンモニウム：ホルムアルデヒドのモル比を形成する9.0mLのNBFに添加した。癌腫および子宮組織試料の新鮮な外科標本を集め、帯片に分割し、これを直ちにNBF中に置いた。図３Aでは、組織を12時間固定した。図３Bおよび３Cでは、組織を48時間固定した。図４Aおよび４Bでは、組織を１週間固定した。図３Bおよび４Bでは、組織を１日固定したとき、クエンチング錠剤を加え、組織をそれぞれさらに36時間または6.5日間この混合物中に入れておいた。次に、すべての組織を脱水し、パラフィンに包埋して５μｍの厚さの切片とした。異なるモノクローナル抗体を使用して免疫組織化学染色を行って、２つの核抗原を検出した。かかる抗原は、エストゲンレセプター（DAKO社、カーピンテリア、カリフォルニア州から入手可能な、モノクローナル抗体ＥＲ−１Ｄ５）および腫瘍サプレッサータンパク質ｐ53（DAK0社、カーピンテリア、カリフォルニアから入手可能な、モノクローナル抗体ＤＯ−７）である。この後、第２の試薬、ビオチンと結合したウサギ抗マウス抗体（Sigma）セントルイス、ミズーリ州から入手可能）を添加した。次に、アビジンとビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体（ABC試薬；Vector Laboratories）を用いて検出試薬を加えた。ペルオキシダーゼ基質としてジアミノベンジジンおよび過酸化水素を用いて、発色させた。ホルムアルデヒドおよびアンモニウム塩中に保持した標本は、免疫反応性をあまり失わず、短時間しか固定しなかったものと似ている。図３Aでは、12時間のみの固定後のエストロゲンレセプターについての免疫組織化学染色は、最小固定での染色の基準強度を示した。図３Bでは、ホルムアルデヒドクエンチング錠剤コアを24時間後に加え、標本を合計48時間固定液中に保持したとき、染色強度および染色されたすべての細胞の画分が類似していた。図３Cにおいては、ホルムアルデヒドクエンチング錠剤を加えることなしに48時間ホルムアルデヒド中に浸漬した標本について、染色があまり強くなく、かつ細胞カウント数が著しく低かった。図４Aでは、ｐ53についての免疫組織化学染色は、ホルムアルデヒドクエンチング錠剤コアを24時間後に加え、標本を１週間固定液中に保持したとき、染色が強いことを示した。図４Bでは、ホルムアルデヒドクエンチング錠剤を加えることなしに１週間ホルムアルデヒド中に浸漬した標本について、染色はあまり強くなく、かつ細胞カウント数が著しく低かった。この実験の結果ははっきりと、免疫組織化学においてアンモニウム塩でホルムアルデヒドをクエンチングすることの効力を示す。実施例17 緩衝化アンモニウム塩およびホルムアルデヒドの化学反応酢酸アンモニウム（ＮＨ₄Ｃ2.3Ｈ₂Ｏ）を標準NBFと反応させて、この化学反応の速度および平衡の程度を決定した。図２Aおよび５にそれぞれ示した、ホルムアルデヒドキャリブレーターおよび反応残留物は、T．Nashの分光測光法(55 Bio chem．J．416-421(1953))を用いて測定した。この方法は、405nmで、アセチルアセトンで形成された化合物の吸光度を測定することを含む。残留ホルムアルデヒドについてのアッセイは、図２Aに示したように、NBFの連続希釈物（≦0.0004X ）を測定することによって、直線性を確認した。酢酸アンモニウムおよびＮＢＦ中のホルムアルデヒド（補助的な炭酸ナトリウムでさらに緩衝化されている）を、２つの温度およびアンモニウム：ホルムアルデヒドのモル比1.5：１で反応させた。図５において、データは、示された時間で、反応物中に測定された残留ホルムアルデヒド濃度を示す。データを出発濃度で除して、100％をかけて、残存するオリジナル濃度のパーセントを表した。図５のデータは、反応の動的速度が、22℃で、約１分の非常に速い半減期を有し、 30分以内で平衡に達することを示す。４℃（氷上）で得られたデータは、約３分の半減期を示し、これもなお非常に速い。両平衡において、オリジナルのホルムアルデヒド濃度の少なくとも90％がクエンチングされた。10％の残留濃度は、約 0.12M（0.33％、重量／体積）に等しい。反応生成物の高度に希釈された試料中のホルムアルデヒドの90％以上の反応を正確に測定するこのアッセイ法の能力は、独立して確認されなかった。実際の残留ホルムアルデヒド濃度は、出発濃度の 10％以下だろう。実施例18 ８種のアンモニウム塩およびホルムアルデヒドの化学反応８種の異なるアンモニウム塩を、アンモニウム対ホルムアルデヒドのモル比１：１で、中性の緩衝化ホルマリンと１時間反応させ、次いで残留ホルムアルデヒド濃度を、T．Nashの分光測光法(55 Biochem．J．416-421(1953))を用いて測定した。＞12時間後、較正したｐＨメータを用いて平衡でのpHを測定した。データを出発濃度で除して、100％をかけて、残っているオリジナル濃度のパーセントを表した。表14 ＊アニオンのモル比 ** 四ホウ酸アンモニウムは反応後に不溶性の沈殿を残した。表14のデータは、ｐＨ1.5〜約ｐＨ5.0の範囲にわたり、ホルムアルデヒドのクエンチングの反応の程度とｐＨとの間に、逆の関係が存在することを示す。これは予想されたとおりである。というのは、ホルムアルデヒドと実際に反応するのはアンモニア種（NH₃）であり、ほとんどのアンモニウムイオン（NH₄ ⁺）は酸性溶液中に存在するからである。酢酸塩反応のｐＨを中和するための、補助的な重炭酸ナトリウム緩衝剤の添加は、ホルムアルデヒド濃度を低下させた。ホルムアルデヒドの消費は、約ｐＨ6.0〜ｐＨ7.0の間で漸近線に接近すると思われる。しかし、上記したように、実際の残留ホルムアルデヒド濃度は、出発濃度の10％以下だろう。この表のデータはさらに、化合物の種類として考えられる多くのアンモニウム塩が、本発明においては、適当な緩衝剤も存在するという条件で、ホルムアルデヒド反応性剤として働くのに十分であることを示す。重炭酸アンモニウムは、ホルムアルデヒドのクエンチングについて特に高い能力を有する。というのは、重炭酸塩は、反応のpHを有効に中和するからである。ホウ酸アンモニウムは、比較的アルカリ性の緩衝剤であるが、固定液中に不溶性の残渣を残した。ここに記載した好ましい実施態様に対する他の変更および修飾が、本発明の真の精神および範囲によって達成されることが意図される。この真の精神および範囲は、先の明細書に照らして解釈されるべき添付の請求の範囲によって規定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ジェームス，ウィリアム，エム. アメリカ合衆国 20878 メリーランド州, ダーネスタウン，スカーレットオークドライブ 13133 (72)発明者ホーグ，ステファン，ダブル. アメリカ合衆国 21228 メリーランド州, ケイトンズビル，ビターナットコート２

Claims

【特許請求の範囲】１．ホルムアルデヒド固定液およびホルムアルデヒド固定液のクエンチングに有効な量の少なくとも１種のアンモニウム塩を含んでなる組成物。２．アンモニウム塩が、重炭酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、安息香酸アンモニウム、アルギン酸アンモニウム、重酒石酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム（二塩基性）、塩化アンモニウム、グルコン酸アンモニウム、吉草酸アンモニウム、チオシアン酸アンモニウム、リン酸アンモニウム（一塩基性）、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、スルファミン酸アンモニウム、プルプル酸アンモニウム、酒石酸アンモニウム、馬尿酸アンモニウム、ヨウ化アンモニウム、臭化アンモニウム、フッ化アンモニウム、炭酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムおよび酢酸アンモニウムからなる群より選択される、請求項１記載の組成物。３．前記組成物が発泡剤を含む、請求項１記載の組成物。４．発泡剤がアンモニウム塩の固有のアニオンである、請求項３記載の組成物。５．前記組成物が緩衝剤を含む、請求項１記載の組成物。６．緩衝剤がアンモニウム塩の固有のアニオンである、請求項５記載の組成物。７．アンモニウム塩が重炭酸アンモニウムである、請求項４記載の組成物。８．緩衝剤が重炭酸アンモニウムである、請求項５記載の組成物。９．ホルムアルデヒド反応性剤および発泡剤を含んでなるクエンチング組成物。 10．ホルムアルデヒド反応性剤が、尿素、アンモニウム塩、アミノ酸、尿素過酸化水素、チオ尿素、カルバミン酸エステル、シアナミド、ジシアナミド、メラミン、重亜硫酸ナトリウム、硫化水素、アルカリ溶液中の糖類、マロン酸エステル、フェニルヒドラジン、アニリン、固体ヒドラジンおよびヒドロキシルアミンからなる群より選択される、請求項９記載のクエンチング組成物。 11．ホルムアルデヒド反応性剤が尿素である、請求項９記載のクエンチング組成物。 12．ホルムアルデヒド反応性剤がアンモニウム塩である、請求項９記載のクエンチング組成物。 13．ホルムアルデヒド反応性剤および発泡剤が１種以上のアンモニウム塩である、請求項９記載のクエンチング組成物。 14．ホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物であって、ホルムアルデヒド反応性剤を含むコアおよび該コアを取り囲むコーティング層を含んでなる組成物。 15．ホルムアルデヒド反応性剤が尿素である、請求項14記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 16．ホルムアルデヒド反応性剤がアンモニウム塩である、請求項14記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 17．前記コアが発泡剤を含む、請求項14記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 18．発泡剤が重炭酸ナトリウムおよび重炭酸アンモニウムからなる群より選択される、請求項17記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 19．前記コアが溶解助剤を含む、請求項14記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 20．溶解助剤が、二酸化炭素ガス、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、酢酸、グルタル酸およびコハク酸からなる群より選択される、請求項19記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 21．前記コアがｐＨ中和剤を含む、請求項１４記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 22．ｐＨ中和剤が緩衝剤または塩基である、請求項２１記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 23．ｐＨ中和剤がアンモニウム塩である、請求項２１記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 24．ホルムアルデヒド反応性剤が重炭酸アンモニウムおよび二塩基性リン酸アンモニウムを含む、請求項14記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 25．重炭酸アンモニウムおよび二塩基性リン酸アンモニウムからのアニオンのモル比が約50：50〜約90：10の範囲である、請求項24記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 26．ポリメチルアクリレート、エチルセルロースおよびポリ（オルト）エステルからなる群より選択される物質から前記コーティングが形成される、請求項14 記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 27．前記コーティングが少なくとも第１の層および第２の層を含み、第１層は、第２層の施与に先立ちコア中の感湿性物質を保護するためのサブコーティングである、請求項14記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 28．サブコーティングがヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む、請求項27 記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための組成物。 29．ホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングする方法であって、該固定液を、尿素および発泡剤を含む組成物と接触させることを含んでなる方法。 30．ホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングする方法であって、該固定液を、アンモニウム塩を含む組成物と接触させることを含んでなる方法。 31．アンモニウム塩が発泡剤として作用する、請求項30記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングする方法。 32．アンモニウム塩が、重炭酸アンモニウム、二塩基性リン酸アンモニウムおよびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項30記載のホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングする方法。 33．ホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングする方法であって、該固定液をコア含有組成物と接触させることを含み、該コアがコーティングを有し、かつ該コアがホルムアルデヒド反応性剤を含む方法。 34．ホルムアルデヒド反応性剤が、尿素、アンモニウム塩、アミノ酸、尿素過酸化水素、チオ尿素、カルバミン酸エステル、シアナミド、ジシアナミド、メラミン、重亜硫酸ナトリウム、硫化水素、アルカリ溶液中の糖類、マロン酸エステル、フェニルヒドラジン、アニリン、固体ヒドラジンおよびヒドロキシルアミンからなる群より選択される、請求項33記載の方法。 35．接触後に、前記固定液が約0.25M以下のホルムアルデヒド残留濃度を有する、請求項33記載の方法。 36．生物学的試料を固定するための方法であって、試料をホルムアルデヒド含有固定液と接触させること；および該固定液を、尿素であるところのホルムアルデヒド反応性剤を含む組成物と接触させること；を含んでなる方法。 37．前記試料が単細胞、組織、生物体、ウィルスおよび細胞外組成物からなる群より選択される、請求項36記載の方法。 38．前記組成物がさらに発泡剤を含む、請求項36記載の方法。 39．生物学的試料を固定するための方法であって、試料をホルムアルデヒド含有固定液と接触させること；および該固定液を、ホルムアルデヒド反応性剤を含有するコアを含む組成物と接触させること、ただし該コアがコーティングを有するものであること；を含んでなる方法。 40．ホルムアルデヒド反応性剤が尿素である、請求項39記載の方法。 41．ホルムアルデヒド反応性剤がアンモニウム塩である、請求項39記載の方法。 42．前記コアが発泡剤を含む、請求項39記載の方法。 43．発泡剤が重炭酸ナトリウムおよび二塩基性重炭酸アンモニウムからなる群より選択される、請求項42記載の方法。 44．請求項36記載の方法により調製された生物学的試料。 45．請求項39記載の方法により調製された生物学的試料。 46．組織のホルムアルデヒド固定に関して使用されるキットであって、ホルムアルデヒド含有固定液をクエンチングするための第１の組成物であって、ホルムアルデヒド反応性剤を含有するコアおよび該コアを取り囲むコーティングを含む組成物；および該固定液のｐＨを中和するための第２の組成物；を含んでなるキット。