JP2000509022A

JP2000509022A - 糖尿病の処置および予防のための環状ペプチドワクチン

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Publication number: JP2000509022A
Application number: JP9535577A
Authority: JP
Inventors: レイチ，エバ―ピア; デシュパンデ，シュリカント
Original assignee: アナージェン，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-04-03
Filing date: 1997-04-02
Publication date: 2000-07-18
Also published as: AU713067B2; WO1997036601A1; EP0954324A1; CA2250814A1; AU2605097A; EP0954324A4

Abstract

(57)【要約】本発明は、糖尿病の処置、予防、および診断のための組成物および方法における使用のための主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）糖タンパク質タンパク質配列由来の免疫原性オリゴペプチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】糖尿病の処置および予防のための環状ペプチドワクチン関連出願に対する相互参照これは、USSN 60/014,790（これは、参考として本明細書に援用される）の一部継続出願である。発明の背景本発明は、自己免疫疾患に関連する免疫応答を阻害するための新規な組成物および方法に関する。特に、本発明は、インスリン依存性糖尿病（IDDM）に関連するMHC分子の超可変領域由来のペプチドでのワクチン接種に関する。 IDDMは、膵臓中のインスリン産生β細胞の選択的破壊の結果である（例えば、 Eisenbarth，N．Engl．J．Med．314:1360-1368(1986)およびReichら、Diabetes Reviews 1:293(1993)を参照のこと）。インスリンは、グルコースの細胞性取り込みおよび代謝を調節し、そしてその欠損は高血糖症糖尿病性アシドーシスおよび糖尿病性昏睡を導く。この疾患は通常20才より前の個体において出現し、そして世界中の白人集団の約0.5％を冒す。 IDDMの予防を目指す現在の治療アプローチは、Ｔ細胞の非抗原特異的阻害（例えば、シクロスポリンＡ）に基づくか、またはβ細胞に静止を提供することによる（例えば、インスリンの非経口投与）。既に糖尿病を有する患者において、膵臓またはインスリン産生β細胞の移植もまた行われている。これらの先行技術の方法は、IDDMに関連する自己免疫応答に関連するMHC対立遺伝子によりコードされる糖タンパク質により拘束される免疫応答を特異的に排除するための、単純な自己媒介性の方法を提供できない。自己反応性Ｔ細胞は糖尿病を導く抗β細胞攻撃を担うので、TCRエンゲージメント（engagement）の段階で介入する治療ストラテジーは特に有用である。本発明はこれらおよび他の必要性に取り組む。発明の要旨本発明は、IDDMに関連するHLA分子（例えば、HLA-DQ分子）に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。方法は、アジュバントおよびHLA-DQ分子の超可変領域（代表的には、HLA-DQ分子のβ鎖）由来の環状免疫原性MHCポリペプチドを含む薬学的組成物の免疫学的有効量を患者に投与する工程を含む。ペプチドは約10 残基〜約50残基を含むが、代表的には約20残基〜約30残基からなる。好ましいペプチドは、DQBl^#0302によりコードされるタンパク質のアミノ酸残基57〜78を含む。特に好ましいペプチドはCAAEYWNSQKEVLERTRAELDTVCである。ペプチドは標準的なプロトコルに従って、代表的には非経口投与により投与され得る。ミョウバンのようなアジュバントが含まれ得る。本発明の組成物は、予防的または治療的に投与され得る。例えば、組成物は、症状の発症を予防または改善するために糖尿病前症に投与され得る。定義用語「ペプチド」は、本明細書において、「オリゴペプチド」または「ポリペプチド」と互換的に、一方から他方に、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボニル基との間で代表的にはペプチド結合により連結された、一連の残基（代表的にはL-アミノ酸）を命名するために使用される。用語「環状ペプチド」は、Ｎ末端残基がＣ末端残基に直接的に、または中間物を介して結合されているペプチドをいう。２つの残基間の結合の例としては、下記のようにジスルフィド結合およびチオエーテル結合が挙げられる。本発明の「免疫原性MHCポリペプチド」は、患者における有害な免疫応答（例えば、IDDM)に関連するMHC分子に対する免疫応答を誘起し得るポリペプチドである。以下でより詳細に記載するように、ポリペプチド中の残基の配列は、MHC分子中のポリペプチド配列と同一または実質的に同一である。従って、「HLA-DQ分予の超可変領域由来の」配列を有する本発明のポリペプチドは、この領域の天然に生じるMHCアミノ酸配列と同一または実質的に同一のいずれかである。本明細書中で用いる場合、MHC分子の「超可変領域」は、同じ遺伝子座における異なる対立遺伝子によりコードされるポリペプチドが高い配列可変性または多型性を有する分子の領域である。多型性は、代表的には、クラスＩ分子のα1およびα2ドメインならびにクラスII分子のα1およびβ1ドメインに集中される。対立遺伝子の数および対立遺伝子間の多型性の程度は、異なる遺伝子座において変動し得る。例えば、HLA-DR分子において、全ての多型性はβ鎖に属し、そして α鎖は比較的不変である。HLA-DQについては、α鎖およびβ鎖の両方が多型性である。例えば、DQβ鎖の残基57〜78にわたる超可変領域が使用され得る。種々の HLA遺伝子産物における超可変領域の記載については、Fundamental Immunology （前出）を参照のこと。本明細書中で用いる場合、用語「アジュバント」は、抗原とともにまたは抗原の前に投与される場合に、抗体形成および／または細胞媒介性応答に関して、抗原に対する免疫応答を増加させるおよび／またはそれに量的に影響する任意の物質をいう。本発明における使用のための例示的なアジュバントは、以下に提供される。用語「単離された」または「生物学的に純粋な」は、その天然状態において見出されるような、それに通常伴う成分が実質的または本質的にない物質をいう。従って、本発明のMHCポリペプチドは、そのインサイチュ環境に通常関連する物質（例えば、抗原提示細胞上の表面タンパク質）を含まない。タンパク質が均質または優勢バンドまで単離されている場合でさえも、所望のタンパク質と共精製される、天然タンパク質の５〜10％の範囲の微量混入物が存在する。本発明の単離されたポリペプチドは、そのような内因性共精製タンパク質を含まない。用語「残基」は、アミド結合またはアミド結合模倣物によりオリゴペプチド中に組み込まれたアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。図面の簡単な説明図１は、種々のヒトおよびマウスのクラスIIβ鎖の第３超可変領域のアミノ酸配列を示す。図２は、種々の用量の本発明の環状ペプチドで処置したNODマウスにおける糖尿病割合を示す。図３は、本発明のペプチドで処置したマウス由来の血清のELISA分析の結果を示す。図４は、本発明のペプチドで処置したマウス由来の血清のELISA分析の結果を示す。図５は、異なる追加免疫レジメを使用して、本発明のペプチドで処置したマウス由来の血清のELISA分析の結果を示す。図６は、本発明のペプチドで処置したマウスにおけるＴ細胞反応性の分析の結果を示す。好ましい実施態様の説明本発明は、IDDMの処置、予防、および診断のための組成物および方法における使用のための、MHC糖タンパク質タンパク質配列由来の免疫原性ポリペプチドを提供する。このポリペプチドは、この疾患に関連するMHC対立遺伝子によりコードされる糖タンパク質に対する免疫応答を誘導し得る。好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは環化され、そしてHLA-DQ分子のα鎖およびβ鎖の超可変領域に由来する。 MHCによりコードされる糖タンパク質は、ヒトおよびマウスの両方の系において広範に研究されている。組織適合性タンパク質の多くが、単離および特徴付けられている。MHC糖タンパク質の構造および機能の一般的な総説については、Fun damental Immunology（前出）を参照のこと。 MHC分子は、高等脊椎動物の細胞上で発現されるヘテロダイマー糖タンパク質であり、そして免疫応答における役割を担う。ヒトにおいて、これらの分子は、ヒト白血球抗原（HLA）といわれる。MHC糖タンパク質は２つの群、クラスＩおよびクラスIIに分けられ、これらは互いに構造的および機能的に異なる。一般に、 MHC分子の主要な機能は、抗原性ペプチドを結合し、そしてそれを細胞の表面上に提示することである。ヒトMHCクラスII分子は、HLA-DR、-DP、および-DQサブ領域（subregion）中の遺伝子によりコードされる。これらの糖タンパク質は２つの鎖、α鎖およびβ鎖を含み、これらは膜二重層から伸長する。MHCクラスII分子中の各サブユニットは、α1、α2:、β1、およびβ2といわれる球状ドメインからなる。α1以外の全ては、免疫グロブリンスーパーファミリー中の分子に典型的な鎖内ジスルフィド結合により安定化されている。α鎖およびβ鎖のＮ末端部分、α1ドメインおよびβ1ドメインは、抗原結合部位の大部分を含むと考えられている超可変領域を含む（Brownら、Nature 364:33-39(1993)を参照のこと）。 HLA-DQサブ領域は、α鎖をコードする２つの遺伝子（DQA1およびDQA2）ならびにβ鎖をコードする３つの遺伝子（DQB1、DQB2、およびDQB3）を含む。DQA1およびDQB1遺伝子はHLA-DQ分子をコードし、一方他の遺伝子は偽遺伝子である。上記のように、各MHC対立遺伝子は、特定の組の抗原性ペプチドに特異的な超可変領域および抗原結合部位を含むタンパク質をコードする。MHC分子により結合されるペプチドが自己抗原、アレルゲン、または有害な免疫応答に関連する他のタンパク質に由来する場合、MHC分子の超可変領域は、MHC分子に対する免疫応答を誘起する免疫原性ポリペプチドを産生するために使用され得る。それゆえ、これらのポリペプチドは、有害な免疫応答に関連する特定の遺伝子産物の標的化において有用である。なぜなら、MHC分子に対する免疫応答は、有害な免疫応答に関連する抗原提示を阻害するからである（PCT出願第US93/12351号を参照のこと）。従って、ポリペプチドでの免疫はハプロタイプ特異的であり、そして、他の対立遺伝子を影響されないままにして、標的分子により媒介される免疫応答の阻害のみを生じる。大部分の個体は、各MHC遺伝子座において、ヘテロ接合型である。それゆえ、MHC遺伝子の疾患罹患性遺伝子産物のポリペプチドでの免疫による、疾患のハプロタイプ特異的治療は、新規な免疫療法の手段を提供する。ヒトの処置のためには、IDDMに関連するHLA分子の超可変領域由来のペプチドが使用される。多数のHLA対立遺伝子がIDDMに関連する。これらはDR4、DR3、およびDQを含む。種々のHLA対立遣伝子のIDDMとの関連の議論については、以下を参照のこと：Green、Current Topics in Microbiology and Immunology 164:3(1 990)、Todd、Current Topics in Microbiology and Immunology 164:17(1990)、 Erlich、Current Topics in Microbiology and Immunology 164:41(1990)、Mich elsenら、Current Topics in Microbiologyand Immunology 164:57(1990)、およびLo、Current Topics in Microbiology and Immunology 164:71(1990)。本発明のペブチドは、好ましくはHLA-DQB1分子の超可変領域に由来する。下記の実施例において、マウスMHCクラスII I-A^g7β配列の残基56〜77からなるペプチド（その中で、残基56におけるヒスチジンがシステインに置換されている）が免疫原として使用される。この合成ペプチドは、以下の配列を有する： DQB1はマウスI-A^g7β鎖遺伝子のヒト等価物である。ヒトおよびマウスクラスＩＩβ鎖の第３超可変領域の配列の比較を図１に示す。好ましいペプチドは、DQ B1^#0302の第３超可変領域由来のペプチドである。例示的なペプチドは以下の配列を含む。好ましい実施態様において、本発明のペプチドは環化される。ペプチドを環化する方法を以下で詳細に記載する。ペプチドがジスルフィド結合により環化される場合、ペプチド内かまたは各末端でのいずれかでペプチドがさらにシステイン残基を含むことを、当業者は認識する。本発明における使用のために適切なポリペプチドは、種々の方法で得られ得る。便利なことに、それらは、周知のプロトコルを使用して、自動合成機（例えば、Beckman、Applied Biosystems、または他の一般に入手可能なペプチド合成機）を用いる従来の技術により合成され得る。それらはまた、当該分野で周知の技術を使用して、手動で合成され得る。例えば、StewartおよびYoung、Solid Phas e Peptide Synthesis(Rockford，Ill.，Pierce)，第２版（1984）を参照のこと。あるいは、特定のMHCポリペプチドをコードするDNA配列が、ペプチドを提供するためにクローン化および発現され得る。種々のMHC遺伝子を含む細胞が容易に入手可能である。例えば、それらはアメリカンタイプカルチャーコレクション（「Catalogue of Cell Lines and Hybridomas」、第６版（1988）Rockville，M aryland，U.S.A.）から得られ得る。The National Institute of General Medic al Sciences Catalog of Cell Lines（NIGMS）Human Genetic Mutant Cell Repo sitory，Camden，NJ；およびASHI Repository，Bingham and Women's Hospital ，75 Francis Street，Boston，MA 02115もまた、有用な供給源である。適切なD Q対立遺伝子を発現する細胞株としては、GMO6824A（DQB1^#0201）およびGMO6821A （DQB1^#0302）が挙げられ、その両方はNIGMSから入手可能である。標準的な技術を使用して、cDNAライブラリーをスクリーニングして、所望の配列をコードする配列を同定し得る（Sambrookら、Molecular Cloning‐ALaborato ry Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York， 1989を参照のこと）。融合タンパク質（２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列のすべてまたは一部からなるタンパク質）は、組換え的に産生し得る。さらに、インビトロ変異誘発技術を用いて、関連のないタンパク質を適切な配列を含むように変異し得る。種々の天然供給源由来のMHC糖タンパク質はまた、標準的なタンパク質精製技術を用いて簡便に単離し得る。ペプチドは、任意の種々の公知の技術（例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、イオン交換またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、サイズによる分離、または電気泳動（一般には、Scop es，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.(1982)を参照のこと）を含む）により精製され得る。本発明の免疫原性MHCポリペプチドは、未改変のペプチドの実質的にすべての生物学的活性を増大させるか、または少なくとも保持しながら、種々の所望の性質（例えば、改善された薬理学的特性）を提供するように改変させ得ると理解される。例えば、ペプチドは、ペプチドのアミノ酸配列の延長、低減により改変され得る。異なるアミノ酸またはアミノ酸模倣物との置換もまた、なされ得る。本発明において使用されるペプチドは、本ペプチドが所望のMHC分子に対して免疫応答を惹起し得る限り、以下の実施例の章で示されたペプチドと同一である必要はない。従って、当業者は、ペプチドの活性に実質的に影響することなく多数の保存的置換（以下により詳細に説明する）をなし得ることを理解する。単一アミノ酸置換、欠失または挿入を使用して、どの残基が改変に対して比較的非感受性であるかを決定し得る。置換は好ましくは、小さくて比較的中性の部分（例えば、Ala,Gly,Proまたは類似の残基）でなされる。単一アミノ酸置換の効果はまた、D-アミノ酸を用いて試験し得る。置換されるか、または付加される残基の数およびタイプは、必須の接触点と目的とする特定の機能性質（例えば、疎水性対親水性）との間で必要な間隔に依存する。親ペプチドと比較して増大した免疫原性もまた、このような置換により達成され得る。いずれにせよ、このような置換は、例えば、結合を破壊し得るような構造および荷電の干渉を避けるように選択されたアミノ酸残基または他の分子フラグメントを使用するべきである。しかし、置換アミノ酸は、タンパク質において天然に生じるアミノ酸（例えば、Ｌ-α-アミノ酸、またはそのD異性体）に限定する必要はない。ペプチドは、種々の部分（例えば、当業者に周知のアミノ酸模倣物）で置換し得る。免疫原性MHCポリペプチドの個々の残基は、ペプチド結合またはペプチド結合模倣物によりペプチド中に取り込ませ得る。本発明のペプチド結合模倣物は、当業者に周知のペプチド骨格改変を含む。このような改変は、アミド窒素、α−炭素、アミドカルボニルの修飾、アミド結合の完全な置換、伸長、欠失、または骨格の架橋を含む。一般的には、Spatola,Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptide and Proteins、第VII巻(Weinstein編、1983)を参照のこと。いくつかのペプチド骨格改変が公知であり、これらとしては、ψ[CH₂S]、ψ[CH₂NH ]、ψ[CSNH₂]、ψ[NHCO]、ψ[COCH₂]、およびψ[(E)または(Z)CH=CH]が挙げられる。上述の名称は、上記Spatolaにより示唆されているものに追従している。この情況下で、ψはアミド結合の欠如を示す。アミド基を置換する構造は、カッコ内に規定されている。ペプチド内にはアミノ酸模倣物もまた取り込ませ得る。本明細書で用いる「アミノ酸模倣物」とは、コンホメーション的にもそして機能的にも本発明のポリペプチド中のアミノ酸に対する置換物として振舞う天然に存在するアミノ酸以外の部分のことである。このような部分は、適切なMHC分子に対する免疫応答を誘発するペプチドの能力を妨害しないならば、アミノ酸残基に対する置換物として振舞う。アミノ酸模倣物は、β-γ-δ-アミノ酸、β-γ-δ-イミノ酸(例えば、ピペリジン-4-カルボン酸)ならびにＬ-α-アミノ酸の数多くの誘導体のような、非タンパク質アミノ酸を含み得る。当業者には、多くの適切なアミノ酸模倣物が公知であり、それらのものは、シクロヘキシルアラニン、３−シクロヘキシルプロピオン酸、Ｌ−アダマンチルアラニン、アダマンチル酢酸などを含む。本発明のペプチドに適したペプチド模倣物については、MorganおよびGainor、（1989）An n．Repts．Med．Chem．24:243-252により議論されている。上述のように、本発明で利用されるペプチドは、標的MHC分子の対応する配列と同一である必要はないが、実質的に同一であり得る。従って、そのペプチドは、保存的または非保存的な挿入、欠失、および置換のような種々の変化を受け得る。ここでそのような変化は、その使用において特定の利点を提供し得る。本発明のポリペプチドは、それがMHC分子の標的領域内の配列に実質的に同一の(以下に定義するように)配列を含むかぎり、数多くの様式で改変され得る。比較的短いアミノ酸配列(約30残基未満)の整列および比較は、代表的には簡単なことである。より長い配列の比較には、２つの配列の最適な整列を達成するためにより精巧な方法が必要とされ得る。比較ウインドウを整列させるための配列の最適な整列は、SmithおよびWaterman(1981)Adv．Appl．Math．2:482の局所的相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性整列アルゴリズムにより、PearsonおよびLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sc ｉ.(USA)85:2444の類似性探究方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，Genetics C omputer Group,575 Science Dr.，Madison，WIでのGAP，BESTFIT，FASTA、およびTFASTA)により、または検査により実行し得、そして種々の方法により生成された最高の整列(すなわち、比較ウインドウ全体にわたる最高の配列類似性百分率をもたらすもの)が選択される。用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、１つの比較ウインドウにわたり同一である(すなわちヌクレオチド毎基準で)ことを意味する。用語「配列同一性の百分率」は、比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較し、両方の配列において同一の残基が生じる位置の数を決定して整合する位置の数を得、整合した位置の数をその比較ウインドウ内の合計位置数(すなわち、ウインドウサイズ)で割り、その結果に100を乗じて配列同一性の百分率を得ることにより算出される。ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的同一性」は、２つのペプチド配列が、例えばデフォールトギャップウェイト(default gap weight)を用いるプログラムGAPまたはBESTFITにより最適に整列されたとき、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性、またはそれ以上(例えば99%の配列同一性)を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。保存的アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性のことを言う。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本発明のポリペプチドは、代表的には少なくとも約10個の残基、より好ましくは少なくとも約15個の残基を含む。特定の実施態様においては、ペプチドは約50 個の残基を超えず、そして代表的には約30個の残基を超えない。例えば、以下に記載のDQB1^#0302ペプチドは、各末端の付加的なシステイン残基を除いて22残基からなる。その他の実施態様においては、全サブユニット(αまたはβ鎖)または分子の大部分が使用される。例えば、ポリペプチドは、MHCサブユニット由来の細胞外ドメインを含み得る(約90〜100残基)。代表的には、Ｎ末端ドメイン(β1 またはα1)が用いられる。そのサブユニット由来の全細胞外領域（例えば、クラスII分子のβ1およびβ2またはα1およびα2、またはクラスＩ分子のα1、α2およびα3)もまた用いられ得る。従って、本発明においては、広範囲のポリペプチドサイズが使用され得る。本発明の好ましい実施態様において、免疫原性ペプチドは環化される。環状オリゴペプチドを生成するために一般に使用される任意の方法を使用して、本発明のペプチドを生成し得る。例えば、特定の実施態様において、ペプチドは両端にシステイン残基を含み、ジスルフィド結合を介して環状ペプチドを産生する。このようなペプチドの酸化剤（例えば、酸素、ヨウ素、または類似の試薬）による処理は、環状ペプチドを産生し、これはクロマトグラフィーまたは他の化学精製方法を用いてさらに精製され得る。環状ペプチドの構築はまた、チオエーテル結合を介して達成され得る。例えば、N-ブロモアセチル誘導体化ペプチドは、スルフヒドリル含有残基（例えば、システイン）と反応し得る。環化は、ペプチドのシステインの遊離のスルフヒドリルとブロモアセチル基との反応により生じ、チオエーテル結合を形成する(Robeyら、Anal．Biochem．177:373-7(1989)および米国特許第5,066,716号）。環状ペプチドを構築する他の方法も当業者に公知である。これらは、側鎖−側鎖、側鎖−主鎖、および主鎖−主鎖の環化を含む。さらに、リンカーを使用して、ペプチドのアミノ末端とカルボキシル末端とを結合し得る。リンカーは、アミノ末端およびカルボキシル末端の両方と共有結合を形成し得る。適切なリンカーは当業者に周知であり、そして以下を含むがこれらに限定されない：直鎖または分枝鎖炭素りンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカー。リンカーは、カルボキシル末端およびアミノ末端アミノ酸と、それらの側鎖（例えば、システインに対するジスルフィド結合）をまたは末端アミノ酸のα炭素アミノ基およびカルボキシル基を介して結合し得る。環化のための適切な方法の一般的な議論については、HrubyおよびBonner（Met hods in Molecular Biology,第35巻：Peptide Synthesis Protocols Pennington およびDunn編（Humana Press，Totowa NJ，1994））を参照のこと。例えば、環化は、カルバアナログおよびチオエーテルの形成（Leblら(Peptides 1986，Proc eedings of the 19th European Peptide Symposium）341〜344頁）；Robeyら、A nal．Biochem．177:373-7（1989）および米国特許第5,066,716号）、ビスチオエーテル（Mosbergら、JACS 107:2986-2987(1985)）、アゾペプチド（Siemionら、 Mol．Cell．Biochem．34:(1991)）、および他の環状構造（例えば、架橋構造(C harpentier，M．ら、J．Med．Chem．32(6):1184-1190(1989)、Thaisrivongs，S ．ら、J．Med．Chem．34(4):127(1991)およびOzeki,E.ら、Int．J．Peptide Pro tein Res．34:111(1989)））を含み得る。骨格位置−骨格位置の環化もまた、使用され得る。架橋は、別々の架橋分子またはフラグメントを用いて、ペプチド内の離れた部位を連結させる特別な型の環化である。架橋分子は、例えば、無水コハク酸分子（Charpentier，B.ら、前出）およびカルボキシメチレンフラグメント（Thaisri vongs，S.ら、前出）を含み得る。金属による架橋もまた、使用され得る（Ozeki 、E.ら、前出）いくつかの実施態様において、ペプチドは、２つ以上のシスチン残基を含む。シスチンは、ペプチド内か、または一方の末端において置換され得るか、または付加され得る。シスチンの位置は、ジスルフィド結合がシスチン残基間で環化ペプチドの産生を可能にするように形成し得るのであれば、重要ではない。例えば、このようなペプチドの酸化剤（例えば、酸素、ヨウ素または類似の試薬）での処理は、環状ペプチドを産生し、これは、クロマトグラフィーまたは他の化学精製方法を用いてさらに精製され得る。ペプチドの使用に加えて、本発明のペプチドに対して惹起した抗体を用いて、自己免疫応答（例えば、IDDM）を阻害し得る。抗体は、本発明のペプチドに対して当業者に周知の技術を用いて惹起され得る。抗イディオタイプ抗体もまた生成され得る。以下の議論は、利用可能な技術の一般的な概説として提示したものである。しかし、当業者は、以下の方法での多くの改変が公知であることを理解する。多数の免疫原を使用して、ペプチドに特異的に反応する抗体を産生し得る。例えば、完全なMHC分子または所望の配列を含むフラグメントを使用し得る。本明細書中において開示した合成ペプチドは、直鎖状または環状のいずれかの形態において使用され得る。ポリクローナル抗体の産生方法は、当業者に公知である。手短に言えば、免疫原（抗原）、好ましくは、精製ポリペプチド、適切なキャリア（例えば、GST、キーホールリンペットヘマノシアニンなど）に結合したポリペプチド、または免疫化べクター（例えば、組換えワクシニアウイルス（米国特許第4,722,848号を参照のこと））に組み込まれたポリペプチドをアジュバントと混合し、そして動物をこの混合物で免疫する。動物の免疫原調製物に対する免疫応答は、試験出血物をとりそして目的のポリペプチドに対して反応性の力価を決定することによりモニターする。免疫原に対して適切に高い力価の抗体を得た場合、血液を動物から採集し、そして抗血清を調製する。所望であれば、ポリペプチドに反応性の抗体について富化するための抗血清のさらなる分画を実施する（例えば、Coligan （1991）Current Protocols in Immunology Wiley/Greene，NY；およびHarlowおよびLane(1989)Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press， NYを参照のこと）。いくつかの例において、種々の哺乳動物（例えば、マウス、囓歯類、霊長類、ヒトなど）宿主からのモノクローナル抗体を調製することが所望される。このようなモノクローナル抗体の調製のための技術の説明は、例えば、Stitesら編、Ba sic and Clinical Immunology（第４版）Lange Medical Publications，Los Alt os，CAおよび同書で引用される参考文献；HarlowおよびLane、前出；Goding(198 6)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice（第２版）Academic Press ，New York，NY；およびKohlerおよびMilstein(1975)Nature 256:495-497に見い出される。手短に要約すると、この方法は、免疫原を動物に注射することにより処理される。次いで、動物を屠殺し、そして細胞をその脾臓から取り出し、これをミエローマ細胞と融合させる。結果は、インビトロで複製可能なハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」である。次いで、ハイブリドーマの集団をスクリーニングして、各々が免疫原に対する単一の抗体種を分泌する個々のクローンを単離する。このように、得られた個々の抗体種は、免疫原性物質上で認識された特異的な部位に応答して生成された免疫動物由来の不死化し、かつクローン化された単一のＢ細胞の産物である。不死化の代替的方法には、エプスタインバーウイルス、ガン遺伝子、もしくはレトロウイルスでの形質転換、または当該分野で公知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングされ、そしてこのような細胞により産生されるモノクローナル抗体の収率は、脊椎動物（好ましくは哺乳動物）宿主の腹腔への注射を含む種々の技術により増強される。特異的モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は、通常少なくとも約１mM、より通常には少なくとも約50 μＭ、そして最も好ましくは少なくとも約１μＭ以下のK_Dで結合する。他の適切な技術は、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択を含む（例えば、Huseら、（1989）Science 246:1275-1281;およびWardら、（1989）Nature 341:544-546;およびVaughanら、（1996）Nature Bio technology，14:309-314を参照のこと）。頻繁に、本発明のペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを提供する物質に共有結合的にまたは非共有結合的にのいずれかで連結することによって標識される。広範な種々の標識および結合技術が公知であり、そして科学文献および特許文献の両方において広範に報告されている。適切な標識には、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、コファクター、インヒビター、蛍光部分、化学ルミネセンス部分、磁性粒子などが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許には、米国特許第3,817,837号；同第3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,345号；同第4,277,437号；同第4,275,149号；同第4,366,241号が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンが産生され得る。Cabilly、米国特許第4,816,567号；およびQueenら、（1989）Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 86:10029-10033を参照のこと。本発明の抗体はまた、治療目的で（例えば、自己免疫応答を阻害するために）生物（例えば、ヒト患者）に投与され得る。その抗体が惹起される種以外の生物に投与される抗体は、しばしば免疫原性である。従って、例えば、ヒトに投与されるマウス抗体は、抗体に対する免疫学的応答（例えば、ヒト抗マウス抗体(HAM A)応答）を複数の投与に際してしばしば誘導する。抗体の免疫原性特性は、抗体の一部または全部を特徴的にヒトの配列に変更し、それによりキメラまたはヒト抗体をそれぞれ産生することによって低減される。キメラ抗体は、ヒトおよび非ヒト部分を含む免疫グロブリン分子である。より詳細には、ヒト化キメラ抗体の抗原結合領域（または可変領域）は、非ヒト供給源（例えば、マウス）由来であり、そしてキメラ抗体の定常領域（これは、免疫グロブリンに生物学的エフェクター機能を与える）は、ヒト供給源由来である。キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性およびヒト抗体分子によって与えられるエフェクター機能を有するべきである。キメラ抗体を生成する多数の方法が当業者に周知である（例えば、米国特許第5,502,167号、同第5,500,362号、同第5,491,088号、同第5,482,856号、同第5,472,693号、同第5,354,847号、同第 5,292,867号、同第5,231,026号、同第5,204,244号、同第5,202,238号、同第5,16 9,939号、同第5,081,235号、同第5,075,431号、および同第4,975,369号を参照のこと）。代替のアプローチは、組換えDNA技術により、非ヒト抗体のCDR領域をヒト定常領域に連結することによるヒト化抗体の生成である。Queenら、Proc．Nat ｌ．Acad．Sci．USA86:10029-10033(1989)およびWO90/07861を参照のこと。１つの好ましい実施態様において、組換えDNAベクターが、本発明のペプチドに対する抗体を産生する細胞株をトランスフェクトするために使用される。新規の組換えDNAベクターは、細胞株において免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子の全部または一部を置換するための「置換遺伝子」（例えば、置換遺伝子は、ヒト免疫グロブリンまたは特定の免疫グロブリンクラスの定常領域の全部または一部をコードし得る）、および抗体産生細胞内での免疫グロブリン配列との標的化された相同組換えを可能にする「標的配列」を含む。別の実施態様において、組換えDNAベクターは、所望のエフェクター機能（例えば、ヒト免疫グロブリンの定常領域）を有する抗体を産生する細胞株をトランスフェクトするために使用され、この場合、組換えベクターに含まれる置換遺伝子は抗体の領域の全てまたは一部をコードし得、そして組換えベクターに含まれる標的配列は、抗体産生細胞内で相同組換えおよび標的化遺伝子改変を可能にする。いずれの実施態様においても、可変または定常領域の一部のみが置換される場合、生じるキメラ抗体は、同一の抗原を規定し得、そして/またはなお改変または改善された同一のエフェクター機能を有し得、その結果、キメラ抗体がより大きい抗原特異性、より大きい親和性結合定数、増大したエフェクター機能、またはトランスフェクトされた抗体産生細胞株による増大した分泌および産生などを示し得る。別の実施態様において、本発明は、完全ヒト抗体を提供する。ヒト抗体は、完全に、特徴的にヒトのポリペプチド配列からなる。本発明のヒト抗体は、広範な種々の方法を用いて産生され得る（例えば、Larrickら、米国特許第5,001,065号を参照のこと）。１つの好ましい実施態様において、本発明のヒト抗体は、トリオーマ細胞において初めに産生される。次いで、抗体をコードする遺伝子は、クローン化され、そして他の細胞（特に非ヒト哺乳動物細胞）において発現される。トリオーマ技術によってヒト抗体を産生するための一般的なアプローチは、Os tbergら(1983)，Hybridoma 2:361-367、Ostberg，米国特許第4,634,664号、およびEngelmanら、米国特許第4,634,666号によって記載されている。本方法によって得られる抗体産生細胞株は、トリオーマと呼ばれる。なぜなら、それらは３つの細胞に由来するからである；２つのヒトおよび１つのマウス。トリオーマは、ヒト細胞から作製された通常のハイブリドーマよりも安定に抗体を産生することが見出されている。インビボ試験のためのモデル系自発的IDDMおよび甲状腺炎のための動物モデルは、BBラットにおいて開発されている（例えば、Rossiniら、Autoimmunity 8:221-235(1991)を参照のこと）。ヒトにおいてと同様に、ラット疾患は、MHC抗原をコードする遺伝子によって部分的に制御され、島浸潤（islet infiltration）によって特徴づけられ、そして抗島抗体の存在と関連している。I-E等価クラスII MHC抗原は、BBラットにおける自己免疫疾患の出現に関与しているようである。Biotardら、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 82:6627(1985)。別の自発的モデルにおいて、NODマウス系統(H-2^g7)は、自己免疫IDDMのマウスモデルである。これらの動物における疾患は、抗島細胞抗体、重篤な膵島炎、およびβ細胞の自己免疫破壊の証拠によって特徴づけられる。Kanazawaら、Diabet ologia（1984）27:113。疾患は、リンパ球で受動的に移動され得、そしてシクロスポリンＡで処置することによって防止され得る(Ikeharaら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA(1985)82:7743；Moriら、Diabetologia（1986）29:244)。未処置の動物は、顕著なグルコース不耐性およびケトン症を発達させ、その疾患の発症から数週間以内に死亡する。70〜90％の雌および20〜30％の雄の動物が、寿命の最初の６ケ月以内に糖尿病を発症する。繁殖研究は、疾患感受性を担う少なくとも２つの遺伝子座を規定し、その１つがMHCにマップされた。血清学的および分子的レベルの両方でのNODクラスII抗原の特徴付けは、自己免疫疾患に対する感受性が、I-Aβに関連していることを示唆する。Baxterら、Autoimmunity 9:61-6 7(1991)およびKikutaniら、Adv．Immunol．51:285(1992)。処方および投与本発明のペプチドまたは抗体（代表的にはモノクローナル抗体）およびそれらの薬学的組成物は、有害な免疫応答を処置および/または防止するための哺乳動物（特にヒト）への投与に有用である。適切な処方は、Remington's Pharmaceut ical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，第17版（1985）に見出される。本発明の免疫原性ペプチドまたは抗体は、予防的に、またはその疾患をすでに患っている患者に投与される。特に、本発明の組成物は、糖尿病前症または初期糖尿病に対して投与され得る。さらに、IDDM患者の一親等の親戚は、現在、３つの共通島細胞抗原GAD、ICS、およびIA-2に対する自己抗体についてスクリーニングされ得る。これらまたは他の診断アッセイにおいて試験結果が陽性であった者は、本発明の組成物で処置され得る。このようにして、疾患症状の発症が、予防または改善され得る。ペプチド紹成物は、そのペプチドが由来するMHC分子に対して有効な免疫応答を惹起するのに充分な量で患者に投与される。これを達成するのに十分な量を、「治療的有効用量」または「免疫原性的有効用量」と定義づける。この使用のための有効量は、例えば、ペプチド組成、投与方法、処置されるべき疾患の段階および重症度、患者の体重および全般的な健康状態、そして処方する医師の判断に依存するが、一般に初期免疫(すなわち、治療的または予防的投与)については、 70kgの患者１人当たり約0.1mg〜約1.0mｇ、より一般的には体重70kg当たり約0.5 mg〜約0.75mｇの範囲である。追加免疫用量は、患者の応答および状態に応じて、数週間〜数カ月にわたる追加免疫レジメンを用いて代表的に約0.1mg〜約0.5mg のペプチドである。適切なプロトコルは、０週目、４週目、２週目、６週目、10 週目および14週目の注入、それに続く24週目および28週目のさらなる追加免疫注入を含む。本発明のペプチドおよび組成物は、一般に重症の疾患状態、すなわち、生命を脅すかまたはその可能性のある状況において用いられ得ることを念頭に置いておかなくてはならない。このようなケースにおいては、外来性物質の最小限化およびペプチドの相対的非毒性を考慮して、実質的に過剰量のこれらのペプチド組成物を投与することが可能でありそして処置する医師により望ましいとされ得る。治療的使用については、投与は自己免疫疾患の最初の徴候があった時点で開始すべきである。この後、少なくとも症状が実質的に和らぐまでそしてその後一定期間、追加免疫用量が続く。いくつかの状況下では、負荷用量とそれに続く追加免疫用量が必要となり得る。得られる免疫応答は、症状および/または合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に阻止する助けとなる。ペプチドを含むワクチン組成物は、標的MHC抗原に対する免疫応答を惹起するために、疾患に対して感受性である患者または疾患の危険性がある患者に対して予防的に投与される。薬学的組成物（ペプチドまたは抗体のいずれかを含有する）は、非経口または経口投与を意図している。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的に(例えば、皮下、皮内、または筋肉内に)投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは水性キャリア）中に溶解または懸濁した免疫原性ペプチドの溶液を含む非経口投与向けの組成物を提供する。種々の水性キャリア(例えば、水、緩衝水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸など)を使用し得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌され得るし、またはろ過滅菌され得る。得られた水溶液は、そのままの状態での使用のためにパッケージされ得るか、または凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は投与前に無菌溶液と混合される。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要とされる緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤などのような薬学的に受容可能な補助物質(例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。固体組成物用には、従来の非毒性固体キャリア(例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石粉、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む)が用いられ得る。経口投与用には、先に列挙したキャリアのような通常用いられる賦形剤のいずれか、および一般に10〜95％の、そしてより好ましくは25％〜75％の濃度の有効成分(すなわち、本発明の１つ以上のペプチド)を取り込ませることにより、薬学的に受容可能な非毒性組成物が形成される。上記のように、ペプチド組成物は、ペプチドに対する免疫応答を誘発することが意図される。従って、免疫応答を最大限にするのに適した組成物および投与方法が好ましい。例えば、ペプチドは、担体に結合させた状態でまたは活性ペプチドユニットのホモポリマーまたはヘテロポリマーとして、ヒトを含む宿主中に導入され得る。あるいは、ポリペプチドの「カクテル」が使用され得る。１つ以上のポリペプチドの混合物は、免疫学的反応の増加、そしてポリマーを構成するのに異なるペプチドが用いられる場合には、複数のエピトープに対する抗体を誘発するさらなる能力という利点を有する。例えば、α鎖およびβ鎖の超可変領域由来の配列を含むポリペプチドは組合わせて使用され得る。有用なキャリアは当該技術分野において周知であり、例えば、KLH、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイド、ポリ(リジン:グルタミン酸)のようなポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス組換え体ワクチンなどが挙げられる。本発明のポリペプチドに対する免疫応答を増強するためには、１つ以上のポリペプチドの使用が特に有用である。以下に示すように、このポリペプチドは、患者の体内で発現される自己MHC分子由来であり得るが、それらは免疫応答を誘発し得る。いくつかの例では、自己ポリペプチドに対する免疫応答は充分には強くない可能性がある。このような場合には、そのポリペプチドに対する寛容を破ることが必要であり得る。この組成物は、外来および自己ポリペプチドの両方に対する免疫応答を誘発するに十分に自己ポリペプチドに類似している１つ以上の外来ポリペプチドを含み得る(Mamulaら、J.Immunol.149:789-795(1992)。適切なタンパク質としては、この目的のために設計された合成ポリペプチドまたは、例えば、自己ポリペプチドと同じ遺伝子座の異なる対立遺伝子によりコードされるタンパク質のような天然供給源からの相同なタンパク質由来のポリペプチド配列が挙げられる。この組成物はまたアジュバントを含む。本明細書中において使用される多数のアジュバントは当業者に周知である。適切なアジュバントとしては、不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、 N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル- ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(CGP11637、ノル-MDPと呼ばれる) 、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イングルタミル-L-アラニンー2-(1'2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(CGP 19835A、MTP-PEと呼ばれる)、および2％のスクアレン/Tween80エマルジョン中の細菌から抽出された３つの成分(モノホスホリルリピドA、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS))を含むRIBIが挙げられる。アジュバントの有効性は、免疫原性ペプチドに対する抗体の量を測定することにより決定され得る。特に有用なアジュバントおよび免疫化スケジュールは、Kwakら、New Eng．J． Med．327-1209-1215(1992)中に記載されている。そこに記載の免疫的アジュバントは、リン酸緩衝化生理食塩水中に５％(重量/容量)のスクアレン、2.5％のプルロニックL121ポリマー、および0.2％のポリソルベートを含む。薬学的処方物中の本発明の免疫原性ペプチドの濃度は広範に変わり得(すなわち、重量％で、約0.1％未満、通常は約2％または少なくとも約2％から、最高で2 0〜50％以上まで)、そしてそれは主に、選択された特定の投与様式に従い、液体容量、粘度などによって選択される。本発明のペプチドはまた、ワクシニアまたは鶏痘のような弱毒化ウイルス宿主により発現され得る。このアプローチは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためにベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入に際して、組換え型ワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それにより免疫応答を惹起する。免疫化プロトコルにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、米国特許第4,722,848号中に記載されている。別のベクターはBCG(Bacille Calmmette Guerin)である。BCGベクターは、 Stoverら、(Nature 351:456-460(1991))に記載されている。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化のために有用な非常に様々なその他のベクター(例えば、S almonella typhiベクターなど)は、本明細書中の記載から当業者には明らかである。本発明の１以上のペプチドをコードするDNAはまた、患者に投与され得る。このアプローチは、例えば、Wolffら、Science 247：1465-1468(1990)ならびに米国特許第5,580,859号および同5,589,466号に記載されている。血清半減期を増強するために、ペプチドはまた、カプセル化されるか、リポソームのルーメンに導入されるか、コロイドとして調製されるか、または延長したペプチドの血清半減期を提供する他の従来の技術が用いられ得る。例えば、Szok aら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng．9:467(1980)，米国特許第4,235,871号、同第4,5 01,728号および同第4,837,028号に記載されるような、種々の方法がリポソーム調製に利用可能である。本発明のペプチドまたは抗体はまた、診断目的に用いられ得る。例えば、ペプチドは、ワクチン接種が効果的であったことを確実にするために、自己抗体についてスクリーニングするために用いられ得る。抗体は、疾患に関与する特定のMH C分子の存在を検出するために用いられ得る。以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。実施例１本実施例は、マウスI-A^g7β鎖（アミノ酸56〜77を含む）由来の環化したペプチドの使用を記載する。 I-A^g7β 56-77 C56ペプチド配列は、NODマウスのMHCクラスII I-A^g7の第３の超可変領域に由来し、56位のヒスチジンがシステインに置換している。この合成ペプチドは、以下の配列を有する：環状ペプチドの合成および特徴付け直鎖状ペプチドI-Ag7β 56-77 C56を、Luuら、Int.J.Peptide Protein Res.4 7:91-96(1996)により一般的に記載されるように、自動ペプチドシンセサイザー( 433A A pplied Biosystems,Foster City USA)でのMerrifield固相ペプチド合成( SPPS)により合成した。ペプチドを、RinkアミドMBHA樹脂（１グラムあたり0.55m molの置換レベル）上で、0.25mmolスケールでカルボキシ末端からアセンブリした。HOBt/HBTUカップリングストラテジーを、樹脂上でのアミンのアセチル化のために使用し、そしてピペリジンを、樹脂上のアミノ酸のFmoc保護化α-アミンの脱保護のために使用した。側鎖保護ストラテジーを、表１に示す。本発明者らの以前の研究は、C末端からの第７の残基の後にカップリングの問題を示し、それ故、第７の残基の後にアミノ酸の２重カップリングを実施した。N-メチルピロージノン(N-methylpyrrohdinone)(NMP)を、カップリング／脱保護反応のための溶媒として使用し、そしてジクロロメタン(DCM)を、ペプチド樹脂の最終洗浄のために使用した。脱保護を、遊離したFmocの伝導率を測定することによりモニターした。樹脂上でのペプチド鎖の首尾良いアセンブリの後に、ペプチド樹脂を、減圧下で２時間乾燥し、そしてペプチド切断プロトコルを行った。樹脂を、0.6gの4-メチルメルカプトフェノールおよび１mlの4-メトキシベンゼンチオールを含む10ml のトリフルオロ酢酸(TFA)中に懸濁した。懸濁液を、室温にて２時間撹拌し、次いで濾過して1000mlの有機溶媒（ペンタン：アセトン4:1）へ入れた。沈殿物を、室温にて２時間沈下させた。清澄な溶媒をデカンテーションおよび遠心分離により除去した。沈殿物を、ペンタンアセトン混合物で洗浄し（各回50mlで５回）、そして最後にペンタンで洗浄した（50mlで２回）。粗直鎖状ペプチドを、減圧下で１時間乾燥した。これを、C18カラムを使用する逆相HPLCに供した。粗ペプチドの環化：粗直鎖状ペプチド(100mg)を、15％アセトニトリルを含む100mlの0.5％酢酸中に溶解した。これと、２gの市販の分子内ジスルフィド結合形成樹脂（Ekagen Co rp.San Carlos,CAからのEkathiox）を混合し、そして懸濁物を室温にて一晩穏やかに回転させた(tumble)。環状ペプチドの形成を、HPLCおよびEllman Reagentによる溶液中の遊離SH基の評価によりモニターした。樹脂を濾過により除去し、そして濾液を環状ペプチドの単離のために使用した。上記で得られた粗環状ペプチド溶液を、C18逆相カラムを有するHPLCに直接ロードした。環状ペプチドを、アセトニトリル水グラジエントを使用して溶出した。HPLCにより示される純粋な画分をプールし(pole)、凍結乾燥し、そして純粋な環化ペプチドを、HPLC、アミノ酸分析、および質量分析により特徴付けた。ペプチドを、使用するまで-20℃で保存した。実施例２本実施例は、実施例１に記載したペプチドを使用する動物研究を記載する。 IDDMからNODマウスを保護する環状I-A^g7ペプチドワクチンの能力を実証するためのインビボ研究を実施した。計画の全体を、以下のように低用量、中用量、および高用量の研究に分けた。低用量：処置群／マウス n= ５μｇペプチド／150μｌミョウバン５ 50μｇペプチド／150μｌミョウバン５ 150μｌミョウバン５ 150μｌPBS ５中用量：処置群／マウス n= 50μｇペプチド／150μｌミョウバン５ 100μｇペプチド／150μｌミョウバン 10 200μｇペプチド／150μｌミョウバン７ 150μｌミョウバン 10 150μｌPBS ５高用量：処置群／マウス n= 400μｇペプチド／150μｌミョウバン 600μｇペプチド／ミョウバンマウスに、３つの皮下の背部部位における処置を投与した。ペプチドをミョウバンアジュバント中で乳化した；これが、NODマウスにおける糖尿病の発現からの保護を生じないことまたはその発現を遅延しないことは以前に実証されていた（データは示さず）。各処置群について、初めの注射は５週齢で行い、続いて２〜３週間の間隔で３回追加免疫を行い、最終の注射は12週齢で行った。糖尿病のスクリーニングを、 12週齢で始め、そして製造者の説明書に従ってAmes Glucose Diastix（Ames，El khart、IN）を用いて、尿検査により実施した。これらの実験の結果を、図２に示す。ここで、50μｇ以上の用量レベルにおいて、コントロール（ミョウバンのみ）と比較して、統計学的に有為な糖尿病に対する保護が観察されたことが理解され得る。ウエスタンブロット分析を使用して、ペプチドを用いた免疫の24週後のマウス由来の抗血清の反応性を決定した。これらの結果は、50、100、および200μｇのペプチドを受けたマウス由来の抗血清はIA^g7β鎖に反応性であるが、それに対して未処置NODマウス由来のコントロール血清は反応性を示さないことを示した。さらに、ELISA分析を実施して、マウス由来の抗血清の反応性を試験した。プレートを、IA^S由来の直鎖状ペプチド（これは、投与されたペプチドとは３つの残基が異なる（図１を参照のこと））ならびに直鎖状および環化形態の投与されたペプチドでコートした。次いで、抗体MKD6（抗IA^d）、10.2.16(抗IA^g7,S、k）、ならびに処置されたマウスおよびコントロールマウス由来の血清の結合を試験した。図３において理解され得るように、処置されたマウス由来の血清は、IA^g7 に結合するがIA^Sに結合しない高力価の抗体を含む。図４は、２つのさらなるコントロールおよび異なる濃度で力価決定された血清を用いる、類似の実験の結果を示す。追加免疫レジメおよび動物の齢の、I-A^g7に特異的な抗体を誘導する能力における影響もまた研究した。これらの研究において、３、４、５、および６週齢の 10匹のマウスの群を上記のペプチドで注射し（開始用量＝50または100μｇ／マウス）、続いて４または６週に示した用量の追加免疫を行った。次いで、図４について記載されるELISA分析を実施した。図５に示すように、I-A^g7ペプチドに対する特異的な免疫応答を、４週または６週に100μｇ／マウスの投与により高めた(boost)。６週に見られる結果がわずかに良かった。図５はまた、I-A^g7に対して惹起された抗体もまた、IA^Sの対応する領域の配列（図１を参照のこと）に従って67位のアルギニンがグルタミンに変更されたペプチドを認識するかどうかを試験するために計画された実験の結果を示す。図５において理解され得るように、このアミノ酸置換は、抗体により認識されなかった。従って、I-A^g7に対する免疫応答の特異性は、見かけ上、これらの分子における他の位置の変更に基づく。図６は、抗体応答のＴ細胞媒介を試験するために計画された実験の結果を示す。これらの実験において、動物に、ミョウバンまたはPBSコントロールで、あるいは50、100、または200μｇの本発明のペプチドのいずれかでのインビボ処置を受けさせ、次いで動物を４または６週後のいずれかで屠殺した。脾臓およびリンパ節由来の両方のＴ細胞の、免疫原およびマイトジェンでのインビトロでのチャレンジに対する反応性を、標準的な技術に従って、[³H]チミジンの取り込みを測定することにより決定した。図６において理解され得るように、各処置の100％のマウスにおいて、Ｔ細胞によるマイトジェンConAおよびLPSに対する応答が存在した。このことは、本発明のペプチドは、一般的な免疫抑制を全く生じないことを示す。直鎖状または環状いずれかのI-Ag7ペプチドを用いるインビトロでのチャレンジは、処置されたマウスにおいて脾臓応答を誘導した；Ｔ細胞応答を示すマウスのパーセンテージは最初のインビボ処置の投与量と共に増加し、そしてミョウバンまたはPBSで初めに処置したコントロールマウスはこの応答を示さなかった。さらに、本発明以外のペプチド（GADペプチドまたはマウス血清アルブミン(MSA)）を用いたチャレンジは、Ｔ細胞増殖を誘導せず、このことはこれらの抗原と特異的に反応性であるＴ細胞が存在しないことを示した。本発明の直鎖状または環状ペプチドと反応性であるＴ細胞は、脾臓に存在したが、リンパ節において検出されなかった。これらの結果は、ペプチドと特異的に反応性である循環しているＴ細胞が、本発明のペプチドを受けた動物において存在することを示す。それらはまた、上記の検出された抗体応答がＴ細胞媒介であることを示唆する。実施例３この実施例は、DQB1^#0302由来の配列に基づく環化ペプチドの調製を記載した。Ａ．チオエーテル結合形成を介して環化された環状DQB1^#0302ペプチドの合成および特徴付け１．ペプチドの合成。直鎖状ペプチドDQB1^#302を、Luuら、Int．J．Peptide．Protein Res．47:91-9 6（1996）に一般的に記載されるように、自動ペプチド合成機（433A、Applied B iosystems，Foster City，California，USA）上でMerrifield固相合成（SPPS）によって合成した。ペプチドを、RinkアミドMBHA樹脂上で0.25ミリモルスケールでカルボキシ末端からアセンブリした（１グラムあたり0.49mmolの置換レベル）。HOBt/HBTUカップリングストラテジーを樹脂上のアミンのアシル化のために使用し、そしてピペリジンを樹脂上のアミノ酸のFmoc保護α-アミンの脱保護のために使用した。側鎖保護ストラテジーを表２に示す。N-メチルピロリジノン（NM P）をカップリング／脱保護反応のための溶媒として使用し、そしてジクロロメタン（DCM）をペプチド樹脂の最終的な洗浄のために使用した。脱保護を、放出されたFmocの伝導率を測定することによってモニターした。表２．ペプチド合成に使用した側鎖保護基樹脂上でのペプチド鎖の良好なアセンブリの後、ペプチド樹脂を２時間減圧下で乾燥させ、そしてブロモアセチル化手順に供した。樹脂を0.1％（容量）DIEA を含有するDMF中に懸濁し、そして無水ブロモ酢酸を４：１モル過剰で添加した。懸濁物を室温で２時間混合した。少量のスラリーを採取し、DMF、メタノールで３回、そして最後にDCMで洗浄した。次いで、ニンヒドリン試験を行い、これはネガティブであった（青または紫の呈色なし）。これは、反応が完了したことを示した。次いで、樹脂を上記のように洗浄し、そして減圧下で乾燥させた。ブロモアセチル化後、ペプチド樹脂を２時間減圧下で乾燥させ、そしてペプチド切断プロトコルに供した。樹脂を10mlのトリフルオロ酢酸（TFA）、0.75gの4- (メチルメルカプト)フェノールおよび0.75mlの4-メトキシベンゼンチオール中に懸濁した。懸濁物を２時間室温で混合し、次いで1000mlのペンタン-アセトン溶液（容量で４：１）中に濾過した。透明な溶媒を遠心分離によって除去した。沈澱（ペプチド）をペンタン-アセトン溶液でさらに３回（それぞれ50ml）で洗浄し、そして最後にペンタン（50ml）で洗浄した。粗直鎖状ペプチドを１時間減圧下で乾燥させた。これを、品質管理のために、C18カラムを使用して逆相分析HPL Cに供した。２．チオエーテル架橋の形成によるペプチドの環化。環化のために、直鎖状ペプチドを、アルゴンでスパージした水性の0.1M重炭酸ナトリウム溶液中に１mg/mlの濃度で溶解した。一晩環化反応させた。溶液を遠心分離し、そして上清をHPLCによって調べた。環化ペプチドの保持時間は、直鎖状ペプチドよりも約４分短かかった。ペプチド溶液を凍結乾燥し、そして精製した。３．ペプチド精製。ペプチドを、勾配法を適用する分取逆相HPLCシステムで精製した。以下の溶媒を使用した：水中の0.1％TFAおよびアセトニトリル中の0.1％TFA。画分を分析HP LCで調べた。HPLCによって示された純粋な画分をプールし、そして凍結乾燥した。ペプチドの総純度は78％以上であった。４．ペプチドの特徴付け。ペプチドを、分析HPLCからのクロマトグラムおよび質量分析によって特徴付けた。環状ぺプチドの分子量は2564amuであった。Ｂ．ジスルフィド結合形成を介して環化された環状DQB1^#0302ペプチドの合成および特徴付け１．ペプチドの合成。直鎖状ペプチドDQB1^#302を、Luuら、Int．J．Peptide．Protein Res．47:91-9 6（1996）に一般的に記載されるように、自動ペプチド合成機（433A、Applied B iosystems，Foster City，California，USA）上でMerrifield固相合成（SPPS）によって合成した。ペプチドを、RinkアミドMBHA樹脂上で0.25ミリモルスケールでカルボキシ末端からアセンブリした（１グラムあたり0.49mmolの置換レベル）。HOBt/HBTUカップリングストラテジーを樹脂上のアミンのアシル化のために使用し、そしてピペリジンを樹脂上のアミノ酸のFmoc保護α-アミンの脱保護のために使用した。側鎖保護基を表３に示す。N-メチルピロリジノン（NMP）をカップリング／脱保護反応のための溶媒として使用し、そしてジクロロメタン（DCM ）をペプチド樹脂の最終的な洗浄のために使用した。脱保護を、放出されたFmoc の伝導率を測定することによってモニターした。表３．ペプチド合成に使用した側鎖保護基樹脂上でのペプチド鎖の良好なアセンブリの後、ペプチド樹脂を２時間減圧下で乾燥させ、そしてペプチド切断プロトコルに供した。樹脂を10mlのトリフルオロ酢酸（TFA）、0.75gの4-(メチルメルカプト)フェノールおよび0.75mlの4-メトキシベンゼンチオール中に懸濁した。懸濁物を２時間室温で混合し、次いで1000 mlのペンタン-アセトン溶液（容量で４：１）中に濾過した。透明な溶媒を遠心分離によって除去した。沈澱（ペプチド）をペンタン−アセトン溶液でさらに３回（それぞれ50ml）で洗浄し、そして最後にペンタン（50ml）で洗浄した。粗直鎖状ペプチドを１時間減圧下で乾燥させた。これを、品質管理のために、C18カラムを使用して逆相分析HPLCに供した。２．ジスルフィド結合を介するペプチドの環化。環化のために、ペプチドを、１mg/mlの濃度で水に溶解し、溶液のpHを水酸化アンモニウムの添加によって８〜９にした。この溶液を、ペプチドを環化させるために３〜４時間40℃で維持した。凍結乾燥後、ペプチドを同じ分析HPLCによって調べた。環状ペプチドの保持時間は、直鎖状ペプチドよりも約４分短かい。３．ペプチド精製。ペプチドを、勾配法を適用する分取逆相HPLCシステムで精製した。以下の溶媒を使用した：水中の0.1％TFAおよびアセトニトリル中の0.1％TFA。画分を分析HP LCで調べた。HPLCによって示された純粋な画分をプールし、そして凍結乾燥した。ペプチドの総純度は78％以上であった。４．ペプチドの特徴付け。ペプチドを、分析HPLCからのクロマトグラムおよび質量分析によって特徴付けた。環状ペプチドの分子量は2625amuであった。上記の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、その範囲を限定するためには提供されない。本発明の他の改変が当業者に容易に明らかであり、そして添付の請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願が、本明細書中で参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/74 Ｃ０７Ｋ 14/74 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．患者においてHLA-DQ分子に対する免疫応答を誘導する方法であって、アジュバントおよびHLA-DQ分子の超可変領域由来の環状免疫原性MHCポリペプチドを含む薬学的組成物の免疫学的有効量を、該患者に投与する工程を包含する、方法。２．前記超可変領域がHLA-DQ分子のβ鎖にある、請求項１に記載の方法。３．前記環状免疫原性MHCポリペプチドが約20残基〜約30残基からなる、請求項１に記載の方法。４．前記免疫原性MHCポリペプチドがDQB1^#0302によりコードされるタンパク質のアミノ酸残基57〜78を含む、請求項１に記載の方法。５．前記免疫原性MHCポリペプチドがアミノ酸配列CAAEYWNSQKEVLERTRAELDTVCを有する、請求項１に記載の方法。６．前記投与が非経口である、請求項１に記載の方法。７．前記アジュバントがミョウバンである、請求項１に記載の方法。８．患者においてインスリン依存性糖尿病を処置または予防する方法であって、アジュバントおよびHLA-DQ分子の超可変領域由来の環状免疫原性MHCポリペプチドを含む薬学的組成物の免疫学的有効量を、該患者に投与する工程を包含する、方法。９．前記超可変領域がHLA-DQ分子のβ鎖である、請求項８に記載の方法。１０．前記環状免疫原性MHCポリペプチドが約20残基〜約30残基からなる、請求項８に記載の方法。１１．前記免疫原性MHCポリペプチドがDQBl^#0302によりコードされるタンパク質のアミノ酸残基57〜78を含む、請求項８に記載の方法。１２．前記免疫原性MHCポリペプチドがアミノ酸配列CAAEYWNSQKEVLERTRAELDTVC を有する、請求項８に記載の方法。１３．前記投与が非経口である、請求項８に記載の方法。１４．前記アジュバントがミョウバンである、請求項８に記載の方法。１５．前記免疫原性MHCポリペプチドが予防的に投与される、請求項８に記載の方法。１６．アジュバントおよびHLA-DQ分子の超可変領域由来の単離された環状免疫原性MHCポリペプチドを含む薬学的組成物。１７．前記超可変領域がHLA-DQ分子のβ鎖にある、請求項１６に記載の組成物。１８．前記環状免疫原性MHCポリペプチドが約20残基〜約30残基からなる、請求項１６に記載の組成物。１９．前記免疫原性MHCポリペプチドがDQBl^#0302によりコードされるタンパク質のアミノ酸残基57〜78を含む、請求項１６に記載の組成物。２０．前記免疫原性MHCポリペプチドがアミノ酸配列CAAEYWNSQKEVLERTRAELDTVC を有する、請求項１６に記載の組成物。