JP2000508293A - Ｆｓｈ作用の促進に有用な新規なペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の活性を促進するのに有用な新規なペプチド、および受精能の向上におけるこれらの使用が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＦＳＨ作用の促進に有用な新規なペプチド 本発明は、哺乳動物における卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）生理活性の促進に有 用な新規なペプチドに関するものである。特に、本発明は、このようなペプチド および特にヒト、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウマ、ラクダ、ラマ 及びアルパカにおけるＦＳＨ活性の刺激におけるこれらの使用に関するものであ る。 卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホル モン（ＴＳＨ）及び絨毛性性腺刺激ホルモン（ＣＧ）などの糖タンパク質ホルモ ンの系統群に属する。これらはすべて、α及びβと称される２種の異なる非共有 結合サブユニットから構成される。ある種においては、上記異なるホルモンに関 するαサブユニットのアミノ酸配列は同一である。ホルモンに特異的なβサブユ ニットは異なるアミノ酸配列を示す（評論として、コンバルナウス(Combarnous) 、エンドクリンレビューズ(Endocrine Reviews)、１３：６７０〜６９１（１９ ９２年）を参照）。 ＦＳＨは、卵胞形成(folliculogenesis)及び精子形成の制御に鍵となる役割を 果たす。ＦＳＨの存在は、静止原子卵胞の漸増および卵胞腔(antral follicle) へのその発達に必須である（評論として、ヒリアー(Hillier)、ヒューマン レ プロダクション(Human Reproduction)、9:１８８〜１９１（１９９４年）を参照 ）。これらの生物学的な効果は、特異的な細胞レセプターへのＦＳＨの結合によ って仲介される；このようなレセプターはレセプター認識部位と称されるＦＳＨ 分子の特異的な部位に結合する（コンバルナウス(Combarnous)、上記）。異なる 動物モ デルを用いて、卵胞の成長及び排卵へのＦＳＨの効果が研究された。これらとし ては、下垂体摘出マウス（ウァング(Wang)及びグリーンワルド(Greenwald)、エ ンドクリノロジー(Endocrinology)、１３２：２００９〜２０１６（１９９３年 ）；ウァング(Wang)及びグリーンワルド(Greenwald)、ジェー レプロド ファ ート(J．Reprod．Fert.)、９９：４０３〜４１３（１９９３年））および性機能 低下マウス（ハルピン(Halpin)及びチャールトン(Charlton)、ジェー レプロド ファート(J．Reprod．Fert.)、８２：３９３〜４００（１９８８年）；カタナ ック(Cattanach)ら、ネーチャー(Nature)、２６９：３３８〜３４０（１９７７ 年）；メイソン(Mason)ら、サイエンス(Science)、２３４：１３６６〜１３７１ （１９８６年））が挙げられる。特に、スネル及びエイムス矮小マウス(Snell a nd Amesd warf mouse)において、ＦＳＨの補足が２４日齢の動物の全健常卵胞数 及び子宮と卵巣の重量を増加できることが観察された（デ レビアーズ(de Revi ers)、アクタ エンドクリノロジカ(Acta．Endocrinologica)、１０６：１２１ 〜１２６（１９８４年））。 動物モデルを用いて、ＦＳＨ生理活性に関する抗体の効果をも研究した。抗体 の作用は、通常、生理活性の中和に関して考慮される。しかしながら、モノクロ ーナル抗体（ＭＡｂ）もまたＦＳＨ活性を向上できることが分かった（グレンク ロス(Glencross)ら、ジャーナル オブ エンドクリノロジー(Journal of Endoc rinology)、１３６：Ｒ５〜Ｒ７（１９９３年））。上記研究において、ウシの ＦＳＨ（ｂＦＳＨ）に対して調製されたモノクローナル抗体は、ｂＦＳＨのスネ ル矮小マウス(Snell dwarf mouse)の子宮の成長の誘導能を促進することが分か った。しかしながら、マウスのＭＡｂを他の種に長期間投与すると、有害な結果 がもたらされる。 したがって、適当な種由来のＦＳＨの選ばれたペプチド配列の投与によって部 位特異的なＦＳＨ促進抗血清を得ることが好ましい。サブユニットの一方と他の 糖タンパク質との共通性があると、完全ホルモンまたは完全ホルモンに対して生 じた抗体の投与により、他の糖タンパク質ホルモンの生理活性への交差反応効果 に関して問題が起こるかもしれない。したがって、ＦＳＨとの構造の共通性を共 有する他の糖タンパク質ホルモンの生理活性について効果をほとんど有さずにま たは全く有さずに、ＦＳＨの活性を刺激する点で特異的である抗体を産生するこ とが目的である。 本発明者らは、ここで上記結果を達成する範囲のペプチドを発見した。これら のペプチドは、ＦＳＨ分子の３３〜４７番目及び４０〜５１番目のアミノ酸残基 から構成される（図１を参照）。この領域はレセプター認識部位として含まれて いるので、上記自体は驚くべきことである。したがって、ＦＳＨの上記領域への 抗体の結合はＦＳＨのそのレセプターへの結合と矛盾してはならない（サンタ コロマ(Santa Coloma)ら、バイオケミストリー(Biochemistry)、２９：１１９４ 〜１２００（１９９０年）；サンタ コロマ(Santa Coloma)及びライチャート(R eichert)、ジェー バイオル ケム(J．Biol．Chem.)、２６５：５０３７〜５０ ４２（１９９０年）；ラプトーン(Lapthorn)ら、ネーチャー(Nature)、３６９： ４５５〜４６１（１９９４年））。上記ペプチドは、ＦＳＨ生理活性の促進を誘 発する範囲の哺乳動物種について、単独で、あるいは組み合わせて投与されても よい。 したがって、第一の概念によると、本発明は、下記配列を有するペプチドを提 供するものである： （ｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＲＤＰＡＲＰＮＩ； （ｉｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＮＩ； （ｉｉｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩ； （ｉｖ） ＲＤＰＡＲＰＮＩＱＫＴＣ； （ｖ） ＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣ； （ｖｉ） ＫＤＰＡＲＰＮＩＱＫＡＣ；または （ｖｉｉ） ＫＤＰＡＲＰＮＩＱＫＴＣ、 またはこれと実質的に相同性を有する配列。 本発明のペプチドは、抗体が内因性または外因性いずれかのＦＳＨ活性の促進 を引き起こす、哺乳動物の抗体反応を誘発するのに有用である。これによりさら に、排卵または精子形成、即ち受精能の促進が起こる。 上記一ペプチドまたは複数のペプチドは、被検哺乳動物のＦＳＨを認識する免 疫反応を刺激するのに使用されるワクチンとして提供できる。このようなワクチ ンは、本発明の第二の概念を形成する。 第三の概念によると、本発明は、上記ペプチドをコードする核酸配列、または これと実質的に相同性を有する配列を提供するものである。このような核酸配列 は、ＤＮＡ配列であって或いはＲＮＡ配列であってもよい。このような核酸配列 は、遺伝暗号の縮重によって、目的とするアミノ酸をコードする、またはこのよ うな配列と実質的に相同性を有するすべての他の核酸配列を含む。 本発明の明細書において、アミノ酸レベルでの実質的な相同性とは、有意な数 の構成アミノ酸を有するペプチド配列が上記ペプチド配列と相同性を有すること を意味する。例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９ ０％、９５％または９９％（大きくなるほど好ましい）が相同性を有する。 または、本発明のペプチドは、抗体を生産するのに使用でき、これらの抗体は さらに内因性または外因性ＦＳＨのいずれかの生理活性の促進を誘発するために 哺乳動物に投与される。したがって、さらなる概念に よると、本発明は、一以上の本発明のペプチドに対して特異性を有する抗体を提 供するものである。特に、上記抗体はモノクローナル抗体である。 本発明の上記概念の一実施態様によると、上記抗体は、一以上の本発明のペプ チドと反応性を有する一以上の抗体からなる、抗体調製物として形成される。 本発明の上記概念の好ましい実施態様によると、ペプチド（ｉ）または（ｉｖ ）は、ヒツジのＦＳＨ活性を促進するのに、またはヒツジのＦＳＨ活性を促進す るための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｉ）は、ウシまたはブタ のＦＳＨ活性を促進するのに、またはウシまたはブタのＦＳＨ活性を促進するた めの抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｉ）は、ウマまたはヒトのＦ ＳＨ活性を促進するのに、またはウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するための 抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｉｉ）は、ヒツジまたはブタのＦ ＳＨ活性を促進するのに、またはヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するため の抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｉｉ）は、ウマ、ヒトまたはウ シのＦＳＨ活性を促進するのに、またはウマ、ヒトまたはウシのＦＳＨ活性を促 進するための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｉｉｉ）は、ウマま たはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに、またはウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促 進するための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｉｉｉ）は、ウシ、 ヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに、またはウシ、ヒツジまたはブタ のＦＳＨ活性を促進するための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｉ ｖ）は、ウシのＦＳＨ活性を促進するのに、またはウシのＦＳＨ活性を促進する ための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｉｖ）は、ブタ、ウマまた はヒトのＦＳＨ活性を促進するのに、またはブタ、ウマまたは ヒトのＦＳＨ活性を促進するための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド （ｖ）は、ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに、またはウマまたはヒト のＦＳＨ活性を促進するための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｖ ）は、ウシ、ヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに、またはウシ、ヒツ ジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するための抗体を生じさせるのに使用される； ペプチド（ｖｉ）は、ヒツジのＦＳＨ活性を促進するのに、またはヒツジのＦＳ Ｈ活性を促進するための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｖｉ）は 、ウシ、ブタ、ヒトまたはウマのＦＳＨ活性を促進するのに、またはウシ、ブタ 、ヒトまたはウマのＦＳＨ活性を促進するための抗体を生じさせるのに使用され る；ペプチド（ｖｉｉ）は、ブタのＦＳＨ活性を促進するのに、またはブタのＦ ＳＨ活性を促進するための抗体を生じさせるのに使用される；ペプチド（ｖｉｉ ）は、ウシ、ヒツジ、ヒトまたはウマのＦＳＨ活性を促進するのに、またはウシ 、ヒツジ、ヒトまたはウマのＦＳＨ活性を促進するための抗体を生じさせるのに 使用される。 本発明のペプチドまたは抗体は、好ましくは、製薬上許容できる配合物の形態 で投与される。したがって、第五の概念によると、本発明は、一以上の本発明の ペプチド、または一以上の本発明の抗体若しくは抗体調製物、および一以上の製 薬上許容できる担体、希釈剤または賦形剤からなる薬剤配合物を提供するもので ある。 第六の概念によると、本発明は、哺乳動物のＦＳＨ生理活性の促進における本 発明のペプチドまたは抗体の使用を提供するものである。特定の実施態様による と、生理活性は、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヒト、ラクダ、ヤギ、ネコ、イヌ 、ラマまたはアルパカにおいて促進される。 第七の概念によると、本発明は、本発明の、一以上のペプチド、または一以上 の抗体を哺乳動物に投与する段階からなる、哺乳動物、特にウ シ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヒト、ラクダ、ヤギ、ネコ、イヌ、ラマまたはアルパ カのＦＳＨ生理活性の促進方法を提供するものである。 本発明を、下記実施例を参照しながら説明するが、下記実施例は本発明を何等 制限するものではない。 実施例は下記図面を参照する： 図１は、様々な種由来のＦＳＨのβサブユニットの配列の比較を示すものであ る； 図２は、免疫前血清（血液(bleed)０）におけるならびにヒツジＡ１（２−ａ ）及びＡ２（２−ｂ）のペプチドＡ（血液(bleed)４）、及びヒツジＢ１（２− ｃ）のペプチドＢを４回投与した後の抗血清における全ウシＦＳＨ（ｂＦＳＨ） に対する抗体の力価間の比較を示すものである； 図３は、３．３、１０、３０及び９０μｇ／日のヒツジＦＳＨ（ｏＦＳＨ）ま たはリン酸緩衝溶液（ホルモン希釈剤、ＰＢＳ）を与えたスネル矮小マウス(Sne ll dwarf mouse)群の子宮（３−ａ）及び卵巣（３−ｂ）の重量ならびにケラチ ン化指数（３−ｃ）の平均（±ＳＥＭ）を示すものである； 図４は、２０μｇ／日のｏＦＳＨ（ＦＳＨ群）、２０μｇ／日のｏＦＳＨ＋ペ プチドＡ抗血清（ＦＳＨ＋Ａ群）、２０μｇ／日のｏＦＳＨ＋免疫前血清（ＦＳ Ｈ＋Ｐ群）、ペプチドＡ抗血清単独（Ａ群）、およびＰＢＳコントロール（Ｃ群 ）を投与した異なる５スネル矮小マウス群における、子宮（４−ａ）及び卵巣（ ４−ｂ）の重量ならびに膣スミアのケラチン化指数（４−ｃ）の測定によるｏＦ ＳＨ生理活性の抗体仲介促進の評価を示すものである；この際、すべての値は平 均±ＳＥＭである；および 図５は、２０μｇ／日のｏＦＳＨ（ＦＳＨ群）、２０μｇ／日のｏＦ ＳＨ＋ペプチドＢ抗血清（ＦＳＨ＋Ｂ群）、２０μｇ／日のｏＦＳＨ＋免疫前血 清（ＦＳＨ＋Ｐ群）、ペプチドＢ抗血清単独（Ｂ群）、およびＰＢＳコントロー ル（Ｃ群）を投与した異なる５マウス群における、子宮（５ａ）及び卵巣（５ｂ ）の重量ならびに膣スミアのケラチン化指数（５ｃ）の測定によるＦＳＨ生理活 性の抗体仲介促進の評価を示すものである；この際、すべての値は平均±ＳＥＭ である。実施例１ ｂＦＳＨのペプチド配列に対する抗血清の調製 ペプチド：ＦＳＨの配列の異なるペプチドを、改良型４３１Ａ(upgraded 431A )自動ペプチド合成器（アプライド バイオシステムズ(Applied Biosystems)を 用いたF_moc化学(Fmoc chemistry)によって合成した。ペプチドは遊離アミノ及び カルボキシル末端を有するように合成した。ペプチドの同一性をＭＡＬＤＩ（マ トリックスアシステッドレーザーデソープションイオニゼーション(matrix assi sted laser desorption ionisation)）質量分光によって確認し、ペプチドを分 析用逆相クロマトグラフィーによって分析したところ、９５％を超える純度が測 定された。 ＫＬＨ複合(conjugation)：２０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ６．８）を、５ｍｇのペプチド及び５ｍｇのキーホール リンペットヘモシニ アン（ＫＬＨ）からなる混合物に添加した；この溶液を、５０μｌの２５％グル タルアルデヒドをゆっくり加えながら撹拌し、撹拌を３時間行った。次に、この 溶液を２０×２ｍｌのアリコートに分けて、容易に使用できるように２０℃で貯 蔵した。 動物および処置：１０匹の成熟雌ヒツジを５群に分けた。２匹のヒツジに、ペ プチド（ｉ）及び（ｉｖ）（本研究ではそれぞれＡ及びＢと記す）、および下記 ペプチドをそれぞれ免疫処置した： ＨＡＤＳＬＹＴＹＰＶＡＴ（Ｃと記す；６９〜８０番目のｂＦＳＨ 配列）； ＨＣＳＫＣＤＳＤＳＴＤＣ（Ｄと記す；８３〜９４番目のｂＦＳＨ配列）； および ＷＣＡＧＹＣＹＴＲＤＬＶＹ（Ｅと記す；２７〜３９番目のｂＦＳＨ配列） 。 ヒツジを免疫処置したペプチドに従って見分けた（すなわち、ペプチドＡ＝ヒ ツジＡ１及びＡ２）。上記と同様にして調製した、ペプチド／ＫＬＨ複合体(con jugate)の２ｍｌアリコートを２ｍｌの完全フロイントアジュバントで希釈し、 １ｍｌを各ヒツジの各後肢に注射した。不完全フロイントアジュバントを用いて ３週間間隔で３回追加免疫を行った。 ラジオイムノアッセイ：血清サンプルを、初めにペプチドを注射する前（免疫 前）および各免疫処置を施してから１０日後に各ヒツジから採取した。各血清サ ンプルの一連の希釈液（１／１０〜１／６２５０）について、液相ラジオイムノ アッセイでヨウ素化ｂＦＳＨの認識能を試験した。簡単にいうと、５０μｌの血 清を、１００μｌラジオイムノアッセイバッファー（０．０５％ツィーンを含む ０．０５Ｍリン酸緩衝液）＋５０μｌヨウ素化ｂＦＳＨ（¹²⁵Ｉ；ＵＳＤＡ ｂ ＦＳＨ−Ｉ−２ＡＦＰ ５３１８Ｃ；２０，０００ＣＰＭ／チューブ、サラチン スキー(Salacinski)ら、アナリト バイオケム(Analyt．Biochem.)、１１７：１ ３６〜１４６（１９８１年）の方法によってヨードゲン(iodogen)を用いてヨウ 素化）と混合した。アッセイチューブを４℃で一晩インキュベートした後、２５ ％ポリエチレングリコール６０００及び０．１５％ウシガンマグロブリンを含む ０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）２００μｌを添加した。４℃でさらに １時間インキュベートした後、チューブを遠心し、ペレット中の放射能をガンマ カウンターを用いて計測した。ＦＳＨ生理活性の測定 ホルモン：ＰＢＳ中に溶解されたヒツジＦＳＨ（ＮＩＨ−ＦＳＨ−ＳＩ（ヒツ ジＲ０４１２１２））を用いて、ＦＳＨの生理活性を測定した。 動物および処置：スネル矮小マウスを、従来ホルダー(Holder)ら、ジェー エ ンドクリノル(J．Endocrinol.)、8５：３５〜４７（１９８０年）によって記載 されるのと同様に繁殖し、維持し、マークをつけた。３０匹の２６〜３５日齢の 雌の矮小マウスを任意に５処置群に分け、それぞれに、０、３．３、１０、３０ 、９０μｇ／日のｏＦＳＨを、０．０５ｍｌの溶液を用いて５日間毎日２回皮下 注射により投与した。最後に注射してから１４時間後、マウスをハロタン／酸素 麻酔下で断頭によって殺した。 卵巣および子宮の重量：卵巣及び子宮を取り出し、立体顕微鏡下で脂肪を除い て解剖し、ホルマリン（３．７％）中に固定し、固定後、カーン微量天秤(Cahn microbalance)を用いて秤量した。 膣スミア：普通のピペットを介して膣中に導入した後引き抜かれた数滴のＰＢ Ｓを用いて、膣細胞を集めた。この細胞を顕微鏡スライド上に移し、メタノール で固定し、ライト−ギムザで染色した。スミアを１００倍率下で分析し、ケラチ ン化指数［（ケラチン化細胞／全細胞）×１００］を算出した。 統計学的分析：子宮及び卵巣の重量（ｍｇ／ｇ体重として表示）およびケラチ ン化指数を統計学的分析に使用した。ホルモン処理された各群のデータを、ステ ューデントのｔ−検定(Student's t-Test)を用いてＰＢＳを注射されたコントロ ールと比較した。ヒツジＡ１のペブチドＡに対する抗血清を用いたＦＳＨ生理活性の促進 ホルモンおよび精製抗血清：ヒツジＦＳＨ（ＮＩＨ−ＦＳＨ−ＳＩ）をＰＢＳ に溶解した。免疫前血清またはペプチドＡに対する抗血清を以 下のようにして精製した：１容の２７％硫酸ナトリウムを２容の血清と混合して 、３７℃で３．５時間インキュベートした。沈殿したＩＧ画分を遠心し、ペレッ トを誘導される血清の容積に再構成した。次に、このＩＧ画分をＰＢＳに対して 高度に透析した。等容のＦＳＨ及び精製血清を、最終濃度が１００μｌの注射溶 液に対して２０μｇのｏＦＳＨ及び５０μｌの適切に精製された抗血清となるよ うに、合わせた。ＦＳＨを単独で使用する際には、ＰＢＳを血清の代わりに使用 し、抗ペプチド抗血清のみを使用する際には、ＰＢＳをＦＳＨの代わりに使用し た。コントロール動物にはＰＢＳのみを投与した。マウスに、毎日、０．０５ｍ ｌの上記溶液（示すとおり）を２回注射して投与した。 動物および処置：矮小マウスを、前記したのと同様に繁殖し、維持し、マーク をつけた。３０匹の３１〜４０日齢の雌のスネル矮小マウスを任意に以下の５処 置群に分けた： １群（ＦＳＨ）：ＰＢＳに溶解したｏＦＳＨ２０μｇ／マウス／日； ２群（ｏＦＳＨ＋抗血清；ＦＳＨ＋Ａ）：ｏＦＳＨ２０μｇ＋上記と同様に調製 された精製ペプチドＡ； ３群（ｏＦＳＨ＋免疫前血清；ＦＳＨ＋Ｐ）：ｏＦＳＨ２０μｇ＋上記と同様に 調製された精製免疫前血清； ４群（抗血清単独；Ａ）：上記と同様に調製された精製抗ペプチドＡ抗血清＋等 容のＰＢＳ； ５群（コントロール；ＰＢＳ）：ＰＢＳのみを投与。 各動物を、前記実験と同様のプロトコルで、注射し、殺した。 子宮及び卵巣の重量（ｍｇ／ｇ体重として表示）ならびにケラチン化の指数を 上記と同様にして測定した。各群間の差を、ステューデントのｔ−検定(Student 's t-Test)によって評価した。ペプチドＢに対する抗血清を用いたＦＳＨ生理活性の促進 動物および処置：２５匹の３１〜４０日齢の雌のスネル矮小マウスを任意に以 下の５処置群に分けた。マウスは上記と同様に繁殖し、維持した。 ホルモンおよび精製抗血清：ホルモン及び血清を前記セクションで記載したの と同様にして調製、精製した。 １群（ＦＳＨ）：ＰＢＳに溶解したｏＦＳＨ２０μｇ／マウス／日； ２群（ｏＦＳＨ＋抗血清；ＦＳＨ＋Ｂ）：ｏＦＳＨ２０μｇ＋精製ペプチドＢ； ３群（ｏＦＳＨ＋免疫前血清；ＦＳＨ＋Ｐ）：ｏＦＳＨ２０μｇ＋精製免疫前血 清； ４群（抗血清単独；Ｂ）：精製抗ペプチドＢ抗血清単独； ５群（コントロール；ＰＢＳ）：ＰＢＳのみを投与。 各動物を、前記実験と同様のプロトコルで、注射し、殺した。 子宮及び卵巣の重量（ｍｇ／ｇ体重として表示）ならびに膣スミアにおけるケ ラチン化の指数を上記と同様にして測定した。各群間の差を、ステューデントの ｔ−検定(Student's t-Test)によって評価した。結果 ペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥに対する抗血清の生産 図２ａ、ｂ及びｃは、免疫前血清（血液(bleed)０）における、ならびにペプ チドＡが注射された２匹のヒツジ（Ａ１及びＡ２）の及びペプチドＢに対して免 疫処置された２匹のヒツジの一方（Ｂ１）の、４回注射後の抗血清（血液(bleed )４）におけるｂＦＳＨに対する抗体の力価間の比較を示すものである。第二の 動物（Ｂ２）は本試みの終了前に死亡した。ペプチドＡが注射された２匹のヒツ ジのうち、ヒツジＡ１はｂＦＳＨを認識する抗血清の最高の力価であった。上記 ヒツジ（Ａ１）及びヒツジＢ１（ペプチドＢを注射）からの抗血清について、イ ンビボで 下垂体機能低下スネル矮小マウスにおけるｏＦＳＨの生理作用の促進能を調べた 。ペプチドＣ、ＤまたはＥで免疫処置された動物では、ほとんど抗血清の力価は 観察されなかった。ｏＦＳＨ生理活性の線量効果(dose response)曲線 図３は、子宮及び卵巣の重量（ｍｇ／ｇ体重として表示；図３ａ及び３ｂ）に 関するおよび膣スミアにおけるケラチン化の指数（ケラチン化細胞の割合（％） ；図３ｃ）に関する、様々な量のｏＦＳＨ単独の効果を示すものである。ｏＦＳ Ｈで処置することにより、子宮の重量が有意に投与量(dose)に依存して上昇した （１０μｇ／日＝０．８８±０．１９；Ｐ＜０．０５；３０μｇ／日＝２．０４ ±０．３４；Ｐ＜０．０１；９０μｇ／日＝３．１１±０．１８；Ｐ＜０．００ １；有意値はＰＢＳコントロール群０．３４±０．０５に対するものである）。 卵巣の重量は最も高い２種の投与量のｏＦＳＨ（３０μｇ／日＝０．６０±０． ０９；Ｐ＜０．０５；９０μｇ／日＝１．１８±０．１４；Ｐ＜０．０１）でコ ントロール群（０．３６±０．０５）の重量にくらべて有意に大きかったのみで あったが、卵巣の重量においても同様の投与量(dose)に依存した上昇が観察され た。ケラチン化の指数は、投与量(dose)に依存する同様のパターンを示した（１ ０μｇ／日＝１３．４８±２．９５；Ｐ＜０．０５；３０μｇ／日＝３１．８５ ±６．１２；Ｐ＜０．０５；９０μｇ／日＝５９．８９±５．２３；Ｐ＜０．０ ０１；有意値はＰＢＳコントロール群２．４０±１．５６に対するものである） 。ペプチドＡに対する抗血清によるＦＳＨ生理活性の促進 図４は、スネル矮小マウスにおける子宮の（図４ａ）及び卵巣の（図４ｂ）の 重量の増加さらには膣スミアのケラチン化指数の増加（図４ｃ）によって測定さ れる、ペプチドＡに対する抗血清のＦＳＨ活性の促進能を示すものである。 子宮の重量（図４ａ）に関しては、ＦＳＨ＋ペプチドＡに対する抗血清（ＦＳ Ｈ＋Ａ）に対する応答は、ＦＳＨ単独（ＦＳＨ；Ｐ＜０．００１）またはＦＳＨ ＋免疫前血清（ＦＳＨ＋Ｐ；Ｐ＜０．０１）で観察されるのに比べて有意に大き かった。ＦＳＨ単独に対するおよびＦＳＨ＋免疫前血清に対する応答の間に有意 な差はなかった。しかしながら、双方の応答は、ペプチドＡに対する抗血清単独 （Ａ）またはＰＢＳが注射されたコントロールで観察されるのに比べて有意に大 きかった（すべての場合でＰ＜０．０５）。 卵巣の重量（図４Ｂ）に関しては、同様の結果が得られた。ＦＳＨ＋ペプチド Ａに対する抗血清（ＦＳＨ＋Ａ）は、ＦＳＨ単独（ＦＳＨ；Ｐ＜０．００１）ま たはＦＳＨ＋免疫前血清（ＦＳＨ＋Ｐ；Ｐ＜０．０１）で観察されるのに比べて 卵巣の重量の有意により大きい増加を促進した。ＦＳＨ単独およびＦＳＨ＋免疫 前血清に対する応答の間に有意な差はなかった；しかしながら、双方の応答は、 ペプチドＡに対する抗血清単独（Ａ）またはＰＢＳが注射されたコントロールで 観察されるのに比べて有意に大きかった（すべての場合でＰ＜０．０５）。 繰り返すが、上記動物の膣スミアのケラチン化指数について、同様の結果が得 られた（図４ｃ）。ＦＳＨ＋ペプチドＡに対する抗血清（ＦＳＨ＋Ａ）に対する 応答は、ＦＳＨ単独（ＦＳＨ；Ｐ＜０．００１）またはＦＳＨ＋免疫前血清（Ｆ ＳＨ＋Ｐ；Ｐ＜０．０１）で観察されるのに比べて有意に大きかった。ＦＳＨ単 独およびＦＳＨ＋免疫前血清に対する応答の間に有意な差はなかった。しかしな がら、双方の応答は、ペプチドＡに対する抗血清単独（Ａ）またはＰＢＳが注射 されたコントロールで観察されるのに比べて有意に大きかった（すべての場合で Ｐ＜０．０５）。 これらのデータをすべて図４及び関連する表に要約する。ペプチドＢに対する抗血清によるＦＳＨ生理活性の促進 図５は、スネル矮小マウスにおける子宮の（図５ａ）及び卵巣の（図５ｂ）の 重量の増加さらには膣スミアのケラチン化指数の増加（図５ｃ）によって測定さ れる、ペプチドＢに対する抗血清のＦＳＨ活性の促進能を示すものである。 子宮の重量（図５ａ）に関しては、ＦＳＨ＋ペプチドＢに対する抗血清（ＦＳ Ｈ＋Ｂ）に対する応答は、ＦＳＨ単独（ＦＳＨ；Ｐ＜０．０１）またはＦＳＨ＋ 免疫前血清（ＦＳＨ＋Ｐ；Ｐ＜０．０１）で観察されるのに比べて有意に大きか った。ＦＳＨ単独に対するおよびＦＳＨ＋免疫前血清に対する応答の間に有意な 差はなかった。しかしながら、双方の応答は、ペプチドＢに対する抗血清単独（ Ｂ）またはＰＢＳが注射されたコントロールで観察されるのに比べて有意に大き かった（すべての場合でＰ＜０．０１）。 卵巣の重量（図５Ｂ）に関しては、同様の結果が得られた。ＦＳＨ＋ペプチド Ｂに対する抗血清（ＦＳＨ＋Ｂ）は、ＦＳＨ単独（ＦＳＨ；Ｐ＜０．０１）また はＦＳＨ＋免疫前血清（ＦＳＨ＋Ｐ；Ｐ＜０．０１）で観察されるのに比べて卵 巣の重量の有意により大きい増加を促進した。ＦＳＨ単独およびＦＳＨ＋免疫前 血清に対する応答の間に有意な差はなかった。ＦＳＨ単独またはＦＳＨ＋免疫前 血清に対する応答は、ＰＢＳが注射されたコントロールで観察されるのに比べて 有意に大きかった（すべての場合でＰ＜０．０５）。 繰り返すが、上記動物の膣スミアのケラチン化指数について、同様の結果が得 られた（図５ｃ）。ＦＳＨ＋ペプチドＢに対する抗血清（ＦＳＨ＋Ｂ）に対する 応答は、ＦＳＨ単独（ＦＳＨ；Ｐ＜０．００１）またはＦＳＨ＋免疫前血清（Ｆ ＳＨ＋Ｐ；Ｐ＜０．００１）で観察されるのに比べて有意に大きかった。ＦＳＨ 単独およびＦＳＨ＋免疫前血清に対 する応答の間に有意な差はなかった。ＦＳＨ単独に対する応答は、ＰＢＳが注射 されたコントロールで観察されるのに比べて有意に大きかった（Ｐ＜０．０５） 。 これらのデータをすべて図５及び関連する表に要約する。ディスカッション ヒツジをペプチドＡまたはＢで免疫処置することによってｂＦＳＨを認識でき る抗血清が得られるが、ペプチドＣ、Ｄ及びＥでは得られなかった。ペプチドに よる免疫処置に起因する有害な生理学的な作用を受けたヒツジは見あたらなかっ た。これらの結果から、明らかに、ペプチドＡまたはペプチドＢのいずれかに対 する抗血清と混合されるＦＳＨによる下垂体機能低下スネル矮小マウスの処置は 子宮及び卵巣重量の増加ならびに膣スミアのケラチン化指数によって測定される ＦＳＨ生理活性の劇的な促進を誘導することが示される。 ＦＳＨ促進抗血清を生産するためのペプチドワクチンの使用は、他の商業上重 要な種の卵胞の発達の制御方法に比べて数多くの利点を有する。これらの利点の うちいくつかを下記に列挙する。 １． 本方法は、比較的長期間継続する効果を生じさせるために、少量の抗原を 動物に一時的に接触させるのみでよい。 ２． ＦＳＨ促進抗血清は活動免疫によって被検動物中に産生できる； または、ある動物の抗体調製物を受動免疫によって同じ種の他の動物に投 与してもよい。 ３． 様々な種由来の既知のＦＳＨ配列を用いて、特異的なペプチドワクチンが 様々な商業上重要な動物に適するように容易に設計できる。 ４． 本技術は、内因性のＦＳＨ活性を促進するのに使用できる；このような状 況下では、ＦＳＨの循環レベルは下垂体の制御下にあり 続けるため、ＦＳＨが産生される際にのみ促進が起こる。これにより、現 在の過排卵処置によってしばしば生じる卵巣の過度の刺激(hyperstimulati on)を防止することができるであろう。 ５． 活性成分、即ち抗血清及びＦＳＨの双方とも、動物によって産生される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年９月１５日（１９９７．９．１５） 【補正内容】 請求の範囲 １．哺乳動物のＦＳＨ活性を促進できる、下記配列を有するペプチド： （ｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＲＤＰＡＲＰＮＩ； （ｉｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＮＩ； （ｉｉｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩ； （ｉｖ） ＲＤＰＡＲＰＮＩＱＫＴＣ； （ｖ） ＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣ； （ｖｉ） ＫＤＰＡＲＰＮＩＱＫＡＣ；または （ｖｉｉ） ＫＤＰＡＲＰＮＩＱＫＴＣ、 またはこれと実質的に相同性を有する配列。 ２．請求の範囲第１項に記載の一以上のペプチドからなるワクチン。 ３．ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヒト、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、ラマまた はアルパカに投与することを目的とする、請求の範囲第２項に記載のワクチン。 ４．ヒトに投与することを目的とする、請求の範囲第３項に記載のワクチン。 ５．該哺乳動物がヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒト、ラクダ、ヤギ、ネコ、イ ヌ、ラマまたはアルパカである、請求の範囲第１項に記載のペプチド。 ６．該哺乳動物がヒトである、請求の範囲第５項に記載のペプチド。 ７．ヒツジのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載 の、ペプチド（ｉ）。 ８．ヒツジのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載 の、ペプチド（ｉｖ）。 ９．ウシまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１ 項に記載の、ペプチド（ｉ）。 １０．ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１ 項に記載の、ペプチド（ｉ）。 １１．ヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第 １項に記載の、ペプチド（ｉｉ）。 １２．ウマ、ヒトまたはウシのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範 囲第１項に記載の、ペプチド（ｉｉ）。 １３．ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１ 項に記載の、ペプチド（ｉｉｉ）。 １４．ウシ、ヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の 範囲第１項に記載の、ペプチド（ｉｉｉ）。 １５．ウシのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載の 、ペプチド（ｉｖ）。 １６．ブタ、ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範 囲第１項に記載の、ペプチド（ｉｖ）。 １７．ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１ 項に記載の、ペプチド（ｖ）。 １８．ウシ、ヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の 範囲第１項に記載の、ペプチド（ｖ）。 １９．ヒツジのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載 の、ペプチド（ｖｉ）。 ２０．ウシ、ブタ、ヒトまたはウマのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請 求の範囲第１項に記載の、ペプチド（ｖｉ）。 ２１．ブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載の 、ペプチド（ｖｉｉ）。 ２２．ウシ、ヒツジ、ヒトまたはウマのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、 請求の範囲第１項に記載の、ペプチド（ｖｉｉ）。 ２３．請求の範囲第１項に記載の少なくとも一のペプチド、および一以上の製薬 上許容できる担体、賦形剤または希釈剤からなる薬剤配合物。 ２４．請求の範囲第１項または第５項から第２２項のいずれかに記載のペプチド 、または請求の範囲第２３項に記載の薬剤配合物を哺乳動物に投与することから なる哺乳動物のＦＳＨ活性の促進方法。 ２５．請求の範囲第１項または第５項から第２２項のいずれかに記載のペプチド 、または請求の範囲第２３項に記載の薬剤配合物を哺乳動物に投与することから なる哺乳動物の受精能の向上方法。 ２６．該哺乳動物がヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒト、ラクダ、ヤギ、ネコ、イ ヌ、ラマまたはアルパカである、請求の範囲第２４項または第２５項に記載の方 法。 ２７．該哺乳動物がヒトである、請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２８．ＦＳＨ活性を促進する薬剤の調製における、請求の範囲第１項または第５ 項から第２２項のいずれかに記載のペプチドの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ビートル，ジェームズ イギリス国，アイル ケーエー６ ５エッ チエル，ザ ハナー リサーチ インステ ィテュート, (72)発明者 ホルダー，アンドリュー，トーマス イギリス国，ケンブリッジ シービー１ ２ビーワイ，セント バーナバス ロード ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記配列を有するペプチド： （ｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＲＤＰＡＲＰＮＩ； （ｉｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＮＩ； （ｉｉｉ） ＹＴＲＤＬＶＹＫＤＰＡＲＰＫＩ； （ｉｖ） ＲＤＰＡＲＰＮＩＱＫＴＣ； （ｖ） ＫＤＰＡＲＰＫＩＱＫＴＣ； （ｖｉ） ＫＤＰＡＲＰＮＩＱＫＡＣ；または （ｖｉｉ） ＫＤＰＡＲＰＮＩＱＫＴＣ、 またはこれと実質的に相同性を有する配列。 ２．請求の範囲第１項に記載の一以上のペプチドからなるワクチン。 ３．ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヒト、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、ラマまた はアルパカに投与することを目的とする、請求の範囲第２項に記載のワクチン。 ４．ヒトに投与することを目的とする、請求の範囲第３項に記載のワクチン。 ５．請求の範囲第１項に記載のペプチドをコードする核酸配列またはこれと実 質的に相同性を有する核酸配列。 ６．ＤＮＡ配列である、請求の範囲第５項に記載の核酸配列。 ７．請求の範囲第１項に記載の一以上のペプチドに対する特異性を有する抗体 。 ８．モノクローナル抗体である、請求の範囲第７項に記載の抗体。 ９．請求の範囲第７項または第８項に記載の抗体からなる抗体調製物。 １０．哺乳動物のＦＳＨ活性を促進するのに使用される請求の範囲第１項に記載 のペプチド。 １１．該哺乳動物がヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒト、ラクダ、ヤギ、ネコ、イ ヌ、ラマまたはアルパカである、請求の範囲第１０項に記載のペプチド。 １２．該哺乳動物がヒトである、請求の範囲第１１項に記載のペプチド。 １３．ヒツジのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載 の、ペプチド（ｉ）。 １４．ヒツジのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載 の、ペプチド（ｉｖ）。 １５．ウシまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１ 項に記載の、ペプチド（ｉ）。 １６．ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１ 項に記載の、ペプチド（ｉ）。 １７．ヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第 １項に記載の、ペプチド（ｉｉ）。 １８．ウマ、ヒトまたはウシのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範 囲第１項に記載の、ペプチド（ｉｉ）。 １９．ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１ 項に記載の、ペプチド（ｉｉｉ）。 ２０．ウシ、ヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の 範囲第１項に記載の、ペプチド（ｉｉｉ）。 ２１．ウシのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載の 、ペプチド（ｉｖ）。 ２２．ブタ、ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範 囲第１項に記載の、ペプチド（ｉｖ）。 ２３．ウマまたはヒトのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１ 項に記載の、ペプチド（ｖ）。 ２４．ウシ、ヒツジまたはブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の 範囲第１項に記載の、ペプチド（ｖ）。 ２５．ヒツジのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載 の、ペプチド（ｖｉ）。 ２６．ウシ、ブタ、ヒトまたはウマのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請 求の範囲第１項に記載の、ペプチド（ｖｉ）。 ２７．ブタのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、請求の範囲第１項に記載の 、ペプチド（ｖｉｉ）。 ２８．ウシ、ヒツジ、ヒトまたはウマのＦＳＨ活性を促進するのに使用される、 請求の範囲第１項に記載の、ペプチド（ｖｉｉ）。 ２９．請求の範囲第１項に記載の少なくとも一のペプチド、および一以上の製薬 上許容できる担体、賦形剤または希釈剤からなる薬剤配合物。 ３０．請求の範囲第１項または第１０項から第２８項のいずれかに記載のペプチ ド、請求の範囲第７項または第８項に記載の抗体、請求の範囲第９項に記載の抗 体調製物、または請求の範囲第２９項に記載の薬剤配合物を哺乳動物に投与する ことからなる哺乳動物のＦＳＨ活性の促進方法。 ３１．請求の範囲第１項または第１０項から第２８項のいずれかに記載のペプチ ド、請求の範囲第７項または第８項に記載の抗体、請求の範囲第９項に記載の抗 体調製物、または請求の範囲第２９項に記載の薬剤配合物を哺乳動物に投与する ことからなる哺乳動物の受精能の向上方法。 ３２．該哺乳動物がヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒト、ラクダ、ヤギ、ネコ、イ ヌ、ラマまたはアルパカである、請求の範囲第３０項または第３１項に記載の方 法。 ３３．該哺乳動物がヒトである、請求の範囲第３２項に記載の方法。 ３４．ＦＳＨ活性を促進する薬剤の調製における、請求の範囲第１項ま たは第１０項から第２８項のいずれかに記載のペプチド、請求の範囲第７項また は第８項に記載の抗体、請求の範囲第９項に記載の抗体調製物の使用。