JP2000507915A

JP2000507915A - 遺伝子療法のためのｄｎａ担体としてのヒアルロン酸および異常な網膜血管新生を治療するためのｖｅｇｆアンチセンスｄｎａ

Info

Publication number: JP2000507915A
Application number: JP9516137A
Authority: JP
Inventors: ラコッツィ，ピロスカ・エリザベス; コンスタブル，イアン・ジェフリー
Original assignee: ハイアル・ファーマシューティカル・オーストラリア・リミテッド
Priority date: 1995-10-23
Filing date: 1996-10-22
Publication date: 2000-06-27
Also published as: KR19990066967A; MY134778A; CN1209068A; WO1997015330A1; EP0859636A4; NZ320006A; EP0859636A1; CA2235685A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、アンチセンス治療を含む遺伝子治療方法およびそれに用いる組成物を提供する。１つの態様では、その組成物は、標的細胞による核酸の取込みを促進するためにヒアルロン酸を含む。本発明は血管新生に起因する網膜疾病の治療を例にとって具体的に説明される。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子療法のためのＤＮＡ担体としてのヒアルロン酸および異常な網膜血管新生を治療するためのＶＥＧＦアンチセンスＤＮＡ本発明は、疾患のコントロールまたは治療において標的遺伝子の機能を奪う（ ablate）活性薬剤を標的化するヒアルロン酸の使用に関する。一態様において、本発明は眼疾患を治療するための方法および組成物、特に脈絡膜および／または網膜の血管新生に関わる網膜疾患を治療するための方法および組成物に関する。本発明は眼における特異的な細胞の食細胞的特徴を利用して、短期または長期の血管新生の治療のために標的へと活性薬剤を運搬する効果的な方法を提供する。本発明の方法および組成物は、食細胞または周辺細胞へとＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド、ペプチドまたは他の治療剤を運搬すのに有用である。発明の背景Ａ）アジュバントまたは標的剤としてのヒアルロン酸ヒアルロン酸（ＨＡ）は、基本的な二糖類グルクロン酸−β（１−３）Ｎ−アセチルグルコサミンβ（１−４）の５００００対までからなる大きな複雑なオリゴ糖である。それは細胞外マトリクスの主要な要素としてイン・ビボで見いだされている。その３次構造は直径約５０ｎｍのランダムコイルである。ＨＡは多量の水に結合する能力を有し、そしてそれはイン・ビボで粘弾性を有する、粘性の含水化合物にする。哺乳類の目におけるこの形態において、硝子体および細胞外マトリクスの両方において見いだされる。ＨＡは全身的および局所的の両方でヒトの体のある疾患または病状の治療において使用される。というのは該疾患または病状が限局されている部位に活性薬剤を標的化する能力のためである（国際特許出願公開番号第ＷＯ９１／０４０５８およびＷＯ９３／１６７３３号）。ＨＡが沈着を形成し、例えば損傷した頸動脈（損傷していない対側動脈に比較して）にて、および実験動物において増殖する結腸直腸腫瘍およびそのような動物の皮膚において保存されることが示されている。これらのすべての場合におて、該沈着部位は高ＨＡ受容体の発現領域であり、そのことはＨＡがこれらの受容体が高レベルで発現している組織、特に損傷、炎症、増殖および催腫瘍（tumorigenesis）に応答する組織を含む通常の増殖および移動をする組織を特異的に標的化していることを示す。アジュバントとしての可能性のある作用に重要であるＨＡの特徴は、同時に他の分子および細胞膜に結合する能力である。ＨＡに特異的である、組織適合性抗原ＣＤ４４、ヒアルロン酸媒介運動性（ＲＨＡＭＭ）、細胞間接着因子（ＩＣＡＭ）およびＣＤ４４ファミリーにおけるいくつかの類似タンパク質の受容体を含む、細胞表面受容体が同定された。ＨＡにより細胞膜へのウイルスの結合が容易にされると、ウイルスの取込みの通常のエンドサイトーシス機構は一層有効になるであろう。Ｂ）眼疾患角膜変性および糖尿病性網膜症などの多様な眼疾患は脈絡膜および／または網膜の血管新生によって特徴付けられる。このプロセスは、これらの病状を患う患者における盲目の主要な原因である。先行技術治療老人性黄斑変性（age-related macular degeneration）（ＡＲＭＤ）において、網膜下血管新生膜（ＳＲＮＶＭ）の形成および出血は、急速かつ実質的な主要な視力の損失となる。多様な治療が可能であるが、すべては心もとないものである。レーザー光凝固術が最も受け入れられている型の治療ではあるが、レーザー光線による損傷が濃い、永久的な暗点（シャチェット（Schachet）、１９９４；イバネズ（Ibanez）ら、１９９５およびハドソン（Hudson）ら、１９９５）を引き起こし、その結果一時的に視力を失い、ついで、血管新生膜の再発のために長期の病状の進行の妨害が不可能となるという不利点に苦しんでいる。したがって、この治療は全くの視力の損失を防ぐという点にのみ利点を提供する。同様に、ＳＲＮＶＭまたは網膜下血液または網膜の回転による窩の再度位置付け(re-positioning)の外科的除去は、術後の余病のためおよび視力において最少または一時的な改善しかみられないため、殆ど不成功である。これらの治療の侵入的な形態およびそれゆえの対応する余病は、得られる利点をかなり上回り、有用性において制限されている。いくぶんの血管形成活性を有するインターフェロンα２ａの投与（ファング（ Fung）、１９９１；ガィヤー（Guyer）ら、１９９２およびエングラー（Engler）ら、１９９４）および網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の移植（アルグベアー（Algvere）ら、１９９４）はまた、利用に制限があることがわかり、および最初に患者の小群で得られた結果の見込みはさらに大きな群での試行において確認されない。上記のように多様な不利点を被るレーザー光凝固術に加えて、糖尿病性網膜症を治療する他の主要な方法は、血糖および血圧のコントロールである。治療のそのような形態の有効性は関連する患者の動機と受け入れによって制限される。７５歳を越える人口の約３０％は黄斑変性を患い、１０００のうちの３人は糖尿病性網膜症を患っている。この数の各々は、集団の年齢および糖尿病の発生数の増加のために増加するであろうため、血管新生によって媒介されるこれらおよび他の眼疾患を治療する一層有効な方法が必要である。血管新生のメカニズム血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、多様な正常ならびに腫瘍細胞によって合成および分泌されているとよく知られているダイマーで、ジスルフィド架橋した糖タンパク質である。最近の観察はＶＥＧＦは頻繁に糖尿病の患者の網膜血管新生において（マレカーゼ（Malecaze）ら、１９９４）、また糖尿病性網膜症または中央網膜血管閉塞（central retinal vein occlusion）（アイエロ（Aiellｏ)、１９９４）の患者からの眼液中において頻繁に検出されることを示している。一層最近では、ＶＥＧＦ発現は中央血管閉塞、網膜剥離および眼内腫瘍などの病状において誘発されることが見いだされている。ウサギのモデルにおて、ＶＥＧＦｍＲＮＡは網膜血管閉塞の誘発後、網膜の酸欠領域において上昇した（ペール（Pe'er）ら、１９９５）。低酸素によるＶＥＧＦ発現の刺激はまた、他の動物モデルにおいても観察され（ピアス（Pierce）ら、１９９５；ミラー（Miller）ら、１９９４）およびイン・ビトロでは、すべての細胞培養の型において観察されている（シモーレ−ピナテル（Simorre-Pinatel）ら、１９９４;ハタ（Hata）ら、１９９５およびチエマ(Thinema)ら、１９９５)。Ｃ）疾患の治療におけるアンチセンスＤＮＡおよび遺伝子療法望ましくない活性を媒介するタンパク質をコードする遺伝子の発現の抑圧は、標的細胞内に導入またはイン・サイチュでの「アンチセンス」ＤＮＡ配列の産生によって多様な状況にて達成されている。それらのアンチセンス配列は、転写されるとその配列が、該タンパク質をコードする配列に類似していないＲＮＡの合成となるＤＮＡ配列である。そのようなアンチセンス配列は多数のウイルス疾患において試験されている。別法として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的細胞中に導入されることができる：そのように短い配列はそれ自体転写されないが、転写および／または標的細胞中で対応するセンスＤＮＡ配列の続く翻訳を抑制する。最近まで、遺伝子発現のアンチセンス抑制を有効とするために必要とされる最少の配列長は１２〜１４ヌクレオチドである（ワグナー（Wagner）１９９４）と考えられていた。しかしながら、標的配列に結合する特異性が、７または８ヌクレオチド長の配列が遺伝子選択的、ミスマッチ感受性の、リボヌクレアーゼＨ− 依存性の阻害を提供することに有効である、そして該標的ＲＮＡのフランキング配列が、特異性の決定において重要である(ワグナーら、１９９６)Ｃ−５プロピンピリミジンおよびホスホロチオエートインターヌクレオチド結合を含む修飾されたオリゴヌクレオチドの利用によって十分増強されることが示されている。しかしながら、イン・ビボでの遺伝子の発現を取り消すためのアンチセンスヌクレオチドの上手な利用は、突然変異遺伝子発現（ミラン（Milan）１９９３；マクアイニス（McInnes）およびバスコム（Bascom）、１９９２）の特異的な抑圧の必要性またはアンチセンスヌクレオチドの高濃度の必要性（アクーター（Ak htar）およびイビンソン（Ivinson）、１９９３）などの因子によって制限される。これまで、療法のこの形態は概してリポソーム中にパッケージングされたアンチセンス配列の使用または、疾患の部位へのアンチセンスｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの直接的な適用に関する。従って、これらの配列をリポソームにカプセル化することによって標的細胞にアンチセンス配列の取込みを増加させる試みは、大概不成功である。また、リポソームを効率よく標的化することも困難であり、また取込みはウイルスでよりもかなり低い。また、標的化は、センダイウイルスなどのウイルスを用いて、ウイルス媒介ＤＮＡトランスファーによって達成されることができる。センダイウイルスは９５％より高い効率で細胞にＤＮＡおよびタンパク質を運搬すると示されているＲＮＡウイルスである（カネダ（Kaneda）ら、１９８７）。この遺伝子トランスファー系において、リポソーム中のＤＮＡ核タンパク質複合体は、センダイウイルスの融合活性によって、細胞の細胞質に直接的に導入される。該ＤＮＡは核タンパク質と共に核に急速に運搬される。センダイウイルス媒介遺伝子トランスファーは細胞膜とウイルスの融合によって起こり、エンドサイトーシス経路を迂回する。最近、アンチセンスまたはプラスミドＤＮＡのセンダイウイルスによる、標的細胞への高効率での運搬が観察されている。アンチセンスおよびプラスミドＤＮＡの両方は培養液中ならびにイン・ビボにおいて、活性を保持している（カネダら、１９８７）。しかしながら、このウイルスの利用は、ベクターとしての利用のため現在利用可能である適切な構築物が存在しない事実によって制限されている。さらに、トランスファーされたＤＮＡは、該遺伝子トランスファーが融合によって媒介されるので、限られた期間のみ発現されることができる。レトロウイルスは全身組織遺伝子両方のために広く使用されている（ボリスーローリー（Boris-Lawrie）およびテミン（Temin）、１９９３）。それらは高効率で広範な多様な宿主細胞を標的化および感染することができ、ついで該トランス遺伝子ＤＮＡは宿主ゲノムに組み入れられる。理論的には、ＤＮＡの組み込みは、該細胞の永久的な救済ができるトランス遺伝子の永久的な産生を提供することができる。しかしながら、レトロウイルスは未分割細胞を感染することがで３）。さらに、該レトロウイルス粒子はイン・ビボでは不安定であり、そのことによって接種で高ウイルス力価を達成することを困難にしている。さらに、組み入れられたウイルスの癌原性に関する重用な関心がある。レトロウイルスの未分割細胞の感染不可能性は、光受容体およびＲＰＥ細胞などの最も重要な標的細胞が未分割細胞であるので、それらが眼における遺伝子トランスファーの候補として選択されることができないことを意味する。単純ヘルペスウイルスベクターの有用性は、その感染の貧弱な効率によって制限されている（クルベール（Culver）、１９９２）。２つの型のベクター、すなわち複製欠損組換え体（replication defective recombinant）およびプラスミド由来アンプリコン（plasmid-derived amplicons1）である。後者は、ヘルパーウイルスを必要とする。毒性遺伝子は単純ヘルペスウイルスから困難を伴って除去されることができるが、該構築物は細胞毒性を残したままである（ジョンソン（Johnson）ら、１９９２）。さらに、挿入された配列の長期間の発現は開始がうまくいかず、該構築物の調節および安定性に関する問題が存在する。修飾された単純ヘルペスウイルスの遺伝子療法での眼への応用は、その病原性のために主要な関心を据える。帯状ヘルペスウイルス（Herpes zoster virus）感染は眼において重篤な感染を引き起こし、しばしばその結果、角膜移植を必要とする盲目となる。アデノウイルスは未分割および増殖細胞の両方における遺伝子トランスファーのために広範に使用される。それらは７．５ｋｂまでＤＮＡを蓄積することができ、ついで有効なトランスフェクションおよび高ウイルス力価を提供する。レトロウイルスよりむしろこれらを利用する主要な利点は、未分割標的細胞の広範囲を感染することができる能力である（コザルスキー（Koazarsky）およびウィルソン（Wilson）、１９９３）。複製欠損アデノウイルスはこれらのウイルスがヒトにおいて一般的な病原体であり、通常は風邪などの相対的に穏やかな病状を引き起こす点で、相対的に安全であるものと考えられている。該ベクターは欠失突然変異を有する腫瘍遺伝子を運搬し、癌原性となる可能性を低くする（シーグフリード（Siegfried）、１９９３）。米国のナショナル・インスティテューツ・オブ・ヘルス・リコンビナント・ＤＮＡ・アドバイザリー・コミッティー（National Institutes of Health Recombinant ＤＮＡ Advisory Comittee）によって認可された最初の実験的な遺伝子療法の試行において、組換えアデノウイルスは膵嚢胞性繊維症を患う個体を治療するために使用された。しかしながら、アデノウイルスの主要な不利点はその一時的な遺伝子の発現である。これは、該トランス遺伝子の細胞性ゲノムへの組み込みの欠如の結果である。さらに、未分割細胞への遺伝子の運搬での試行で成功したものは殆どない。脳（未分割細胞からなる）への遺伝子のトランスファーでの最初の成功は、アデノウイルスを用いて１９９３年に報告されている（ル・ガル・ラ・サレ（Le Gal La Salle）ら、１９９３）。これらの結果は、遺伝子療法が疾患の治療において理論的に実施可能であることを示しているが、効率よい標的化および取り込みの技術的な困難は、接着し、標的細胞によって取り込まれるウイルスを用いることによって克服されることを必要とすることを示す。この工程は効率はよくなく、ウイルスの使用は医原性の（iatrogenic）疾患の望ましくないレベルのリスクを必要とする。しかしながら、陽性の結果は公開され、遺伝子療法による生物学的プロセスの調節が実施可能であるということを教示する。それゆえ、疾患の治療およびそのような治療における使用のためのヒアルロン酸を含む適当な組成物のための、標的化遺伝子療法の改良された方法が必要である。Ｄ）遺伝子療法および眼疾患オーストラリア特許出願第７５１６８／９４号（ハイブリドン・インク (Hybridon Inc.)において、マウスＶＥＧＦのイン・ビトロでの発現が、マウスＶＥＧＦに基づく１９〜２１マーのアンチセンスオリゴヌクレオチドでインキュベートすることによってＣＯＳ−１またはＮＢ４１細胞中で阻害されることができることが示されている。翻訳停止部位に対する標的化した２１マーのアンチセンスヌクレオチドは有効な配列であると示されている。眼の任意の組織に対する配列の特異的な標的化または糖尿病性網膜症の他の任意の眼病状の治療の開示または示唆は全くない。米国特許第５,３２４,６５４号において、悪性でない細胞の増殖を刺激する方法が開示されている。該方法は網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子産物の発現を阻害するために網膜芽細胞腫遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチドで細胞をイン・ビトロで処理することを含み、それによって、細胞の増殖を阻害するタンパク質の発現を抑圧する。このようにして、細胞の増殖が促進される。ついで、該増殖した細胞は所望ならば、再度移植されることができ、ついで該細胞は遺伝的に操作されて、再移植の前に特異的遺伝子を置き換えることができる。しかしながら、眼の病状を治療するためのこのアンチセンス配列の使用のための参考文献は全くない。米国特許５,３２４,６５４号は、長期増殖が可能である細胞株の確立および遺伝子の発現に失敗することにより引き起こされる筋ジストロフィーおよび糖尿病などの病状の治療に関する。特異的細胞に対する特異的な遺伝子の標的化は試みられておらず、全く眼の型は選抜されていない。アデノウイルス単独を用いての特異的な標的化は、該ウイルスが多様な細胞型をトランスフェクションすることができる能力を有するので困難であることが予想されている。眼の疾患の治療に関して、体の他の部位の大半または全体が全く感染されていない場合、眼の標的組織に選択的に治療剤を運搬することが非常に強く望まれている。アンチセンスＤＮＡに関して、これらの標的細胞に該ＤＮＡが実際に取り込まれていることが必要である。上記の遺伝子療法においての進歩は、トランス遺伝子の運搬および発現、例えば運搬システムとして組換えアデノウイルスを用いて網膜へのβ−ガラクトシダーゼトランス遺伝子などの運搬および発現（ベネット（Benndt）ら、１９９４、リ（Ｌｉ）ら、１９９４およびマシュモー（Mashmour)ら、１９９４）の実験へとさらに導く。網膜色素上皮（ＲＰＥ）は眼の非再生単細胞層であり、神経網膜および脈絡膜の間に位置する。ＲＰＥ細胞は、網膜の外側のほとんどの層を形成する食細胞性神経上皮細胞である。これらの細胞の食細胞性の特性は長い間知られており、また概説されている（ボク（Bok）およびヤング（Young）、１９７９）。若い動物において、ＲＰＥ層において３日以内のおよび神経網膜の光受容体細胞において２週間以内のトランス遺伝子の高レベルの発現が観察された。リポーター遺伝子の発現が９週間まで続いた。一層高齢の動物において、網膜下または硝子体内注入も光受容体細胞内のβ−ガラクトシダーゼの発現を誘発されなかった（リら、１９９４）。オーストラリア特許出願番号第６１４４４／９４号は前眼房、硝子体液または眼球後空間への注入の後に眼における多様な組織によって取り込まれることおよびリポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼが発現することを示している。しかしながら、この原稿は、現在そのような形態のウイルスは、標的細胞または領域に活性薬剤を上手に組み入れることは示していない。またＶＥＧＦが任意の眼病状を癒すのに使用されることができるといういかなる開示も示唆も存在しない。眼の治療の形態に関するアンチセンスヌクレオチドの使用の成功の１つの特異的な障害は、標的細胞にヌクレオチドが侵入できないことであり、例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ヘレン(Helene)１９９１）などの修飾されたオリゴヌクレオチドの限られた安定性である。これらの因子はイン・ビボでの特に長期の遺伝子療法の成功を多大に制限する。網膜疾患の治療において、約１２カ月の病状の進行を遅延する能力が、長期療法の価値および有効性を増加する。細胞毒性が、網膜遺伝子療法のための輸送ベクターとしてアデノウイルスの使用に関して観察される。この細胞毒性は用量依存性を示し（マシュモー、１９９４）、そのようなベクターを用いることにおいて他の困難を呈する。所定のベクターの用量を減少させるが、しかしその輸送の有効性を保有するため、アジュバントが使用される。リポフェクチンなどのアジュバントは、細胞によって「そのままの」ＤＮＡの取込みを増加させることが示されている。たとえＨＡが外科手術の間に失われた硝子体液の置換として眼の手術において広く使用されているとしても、本発明者らは当該技術分野においてＨＡが眼の任意の細胞または組織に任意の医薬製剤を取込むことを認識していない。同様に、ＨＡが、オーストラリア特許出願番号第５２２７４／９３号において、ノルファルムコ（Norpharmco）によって示されているように、抗生物質または抗ガン剤などの医薬製剤の透過を促進すると示唆されているが、本明細書はＨＡがＤＮＡ単独であれウイルスであれ、任意の薬剤の取込みを任意の型の個々の細胞によって促進することを示唆しない。特に、本明細書は、眼内注入を介してのＨＡの使用を教示しない。本発明者らは、現在ＲＰＥ細胞の食細胞性の性質がイン・ビボでの硝子体空間に注入後、オリゴヌクレオチドおよびウイルスなどの分子の取込みを増加させるであろうことを見いだした。これらのＲＰＥ細胞は他の細胞型に比較してウイルスの増加した取込みを示す。本発明者らの発見は、網膜または脈絡上皮細胞におけるＶＥＧＦ発現の長期および短期の両方の誘発を可能にし、従って、網膜の血管新生の抑制またはＳＲＮＶＭの増殖の抑制が可能にする。発明の概要一態様により、本発明は、製薬学的に許容し得る担体と共に核酸およびヒアルロン酸またはその誘導体を含む組成物を提供する。該核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡおよび／または標的配列に対してアンチセンス方向にあるヌクレオチド配列であってよい。該標的配列は病状の原因または悪化に関する核酸配列である。この標的核酸配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドであり得る。標的核酸配列がゲノムＤＮＡである場合、該配列はコーディング領域または調節領域、例えばプロモーター配列などに存在するであろう。別法として、該核酸は標的細胞にトランスファーされるべき核酸配列を含むベクターに存在するであろう。また、該核酸配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドであってよい。しかしながら、この場合、該核酸が機能を果たすための標的細胞に提供されるセンス配列であるか、または該標的細胞に存在する核酸の機能を抑制するために提供されるアンチセンス配列である。トランスファーされるべきＤＮＡを含むベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルスであってよい。遺伝子療法のためのベクターとしてのこれらのウイルスのクラスのすべての使用は、当該技術分野において非常によく論じられている。別法として、該ベクターはリポソームであってよい。本発明はまた、本発明の組成物の有効量を投与する工程を含む治療を必要とする被験体における病状の治療方法をも提供する。投与量および経路は治療されるべき病状に依存するであろうし、医師または獣医が容易に適当な投与量および経路を決定することができるであろうことは明確に理解されるであろう。本発明の組成物は、例えば静脈内または皮下注射により非経口的に、例えばジェルまたはスポンジに吸収させて局所的に、または例えば眼内または腫瘍内注入によって治療されるべき組織に直接的に投与されることができると考えられる。治療されるべき被験体は、ヒトまたは動物、特にウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ネコおよびイヌなどの家畜または伴侶的哺乳類（companion mammal）であってよい。本発明の組成物において、核酸またはベクターはヒアルロン酸と単純に混合されるか、または時に物理的または科学的にヒアルロン酸に結合されていてもよい。ヒアルロン酸にＤＮＡを接着させる方法は、“Synthesis of Sulfonated Hyal uronan Derivatives containing Nucleic Acid Bases”、Chemistry Letters、１９９４２０２７−２０３０および“Transport Performnce of Nucleosides Through Nucleic Acid Bases Conjugated to Hyaluronan”；チラチャンチャイ（Chirachanchai，Ｓ.）、ワダ（Wada，Ｔ.）、イナキ（Inaki，Ｙ.）およびタケモト（Takemoto，Ｋ.）、Chemistry Letters、１９９５２１２１−１２２、に開示されている。好ましい態様において、本発明のこの局面は異常な血管新生によって媒介される網膜疾患の治療のための組成物および方法を提供し、そこでは、核酸は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする配列の少なくとも一部に対応するアンチセンス核酸配列であり、以下に記載するようにヒアルロン酸と共に投与される。ＨＡの多数の形態は本発明の目的のための使用に適している。特に、ＨＡの低分子量及び高分子量の両方が使用される。唯一必要とされることは、ＨＡは純粋程度であり、製薬学的な使用に適する程度に無菌であることである；好ましくはＨＡはまた、発熱素無しである。ＨＡの高分子量の調製物は、使用前に希釈を必要とする。特に、本発明においての使用に適した、市販されており入手可能であるＨＡ産物は、ハイアル・ファーマシューティカルズ・コーポレーション（Hyal Pharmaceutical Corporation）、ミッシソウーガ（Missisauga）によって提供されるものであり、平均的な分子量約２２５,０００を有するＨＡの２％溶液である；ライフ・コア^TM・バイオメディカル、インク（Life Core^TMBiomedi cal，Inc.）によって産生されたヒアルロン酸ナトリウム；プロ・ビスク（Pro V isc）（アルコン・ラボラトリーズ（Ａlcon Laboratories））；および「ヘアロン(ＨＥＡＬＯＮ)」（ファルマシアＡＢ（Pharmacia ＡＢ）、ウプサラ）。本明細書の目的のために、ＨＡの誘導体なる語は、ホモログ、類似体、複合体、エステルおよび断片およびＨＡのサブユニットを含むことがはっきりと理解されるであろう。本発明で使用されるＨＡ誘導体は、その製薬学的に許容し得る塩またはＨＡの断片またはサブユニットを含む。当業者は、ＨＡの与えられた調製物またはＨＡの特定の誘導体または複合体などが、本発明における使用に適しているか否かを決定することが容易にできる。第２の局面により、本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）をコードする配列の少なくとも一部に対応するアンチセンス核酸配列、時にはさらに、ヒアルロン酸または細胞取込みを増加させるためのデンドリマー（dendrimer）化合物などの１またはそれ以上のアジュバントを製薬学的に許容し得る担体と共に含む、異常な血管新生において媒介される網膜疾患の治療のための組成物に関する。遺伝的物質を標的細胞に輸送するためのデンドリマー化合物の使用は、国際特許出願公開番号ＷＯ９５／２４２２１に、デンドリテク・インク（Dendritech Inc. ）らによって開示されている。該ＶＥＧＦは、最も好ましくはヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）または脈絡膜内皮ＶＥＧＦである。別の態様において、本発明のこの局面は、短期（約２カ月まで）、長期（約１年まで）および無期限（患者の生涯の間）のそのような網膜疾患のための治療に関する。第１の態様において、短期間の治療に関して本発明は、ＶＥＧＦ遺伝子の対応する領域に１００％の相補性を有する１またはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは１６〜５０ヌクレオチドを有するべきであり、好ましくは１６〜２２であり、およびより好ましくは１６〜１９ヌクレオチドである。ワグナーら（１９９６）によって記載された種類の修飾したオリゴヌクレオチドが使用されてよく、配列長の低限を７ヌクレオチドにまで低減させることができる。長期抑制に関して、本発明はアンチセンス方向でのＦＥＧＦＤＮＡを含む組換えたィウィルスを提供する。このＶＥＧＦＤＮＡは長い配列であり、本明細書の目的は長さ２０ヌクレオチドより多いＶＥＧＦ配列を表していると理解されるべきであり、好ましくは５０ヌクレオチドより長いものでＶＥＧＦの完全長までの範囲を表すと理解される。この態様において、該組換えウイルスはＲＰＥ細胞において蓄積され、ついでイン・サイチュでアンチセンスＶＥＧＦを産生し、それによってＲＰＥ細胞においてＶＥＧＦ発現を阻害する。無期限の阻害に関して、本発明はウイルスがアンチセンス配列を標的細胞のゲノムに組み入れることができる、アンチセンス方向でのＶＥＧＦＤＮＡを含むウイルスを提供する。好ましくは、該ウイルスはアデノ関連ウイルスまたは類似のウイルスである。長期の治療に関する態様におけるように、このＶＥＧＦＤＮＡは少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは５０ヌクレオチドを越える長さである。アデノ関連または類似のウイルスは、アンチセンスＶＥＧＦＤＮＡのＲＰＥ細胞ゲノムに組み入れることを容易にし、従って、細胞がその機能を保有する限り、アンチセンスＶＥＧＦの発現を可能にする。本発明の組成物および方法を使用して治療されるであろう眼疾患には、以下に限るものではないが、老人性黄斑変性（age-related macular degeneration）（ＡＲＭＤ）および糖尿病性網膜症を含む。例えば、分枝または中央網膜血管閉塞、未熟児網膜症（また水晶体後部線維増殖症として知られている）、虹彩ルベオーシス、または角膜血管新生などの他の眼病状および組織もまた本発明によって治療されることができる。他の局面において、本発明は、ＶＥＧＦに対して働くアンチセンスヌクレオチドの有効量を眼に投与し、それによって、血管新生を阻害することを含む異常な血管新生によって媒介される網膜疾患の妨害または改善の方法を提供する。アンチセンス配列はベクターまたはビヒクルとして複製欠損組換えウイルスにおいて運搬されるであろう。該ベクターは、好ましくは呼吸器合胞性ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス主要後期タンパク質（ＭＬＰ）、ＶＡ１ｐｏｌIIIまたはβ−アクチンプロモーターなどのプロモーターを運搬する複製欠損アデノウイルスを含む。該ベクターはまた、ＳＶ４０シグナル配列などのポリアデニル化シグナル配列をも含む。特に好ましい態様において、該ベクターはｐＡｄ．ＲＳＶ、ｐＡｄ．ＭＬＰまたはｐＡｄ．ＶＡ１である。より好ましい態様において該ベクターはＡｄ．ＲＳＶ．ａＶＥＧＦまたはＡｄ．ＶＡ１．ａＶＥＧＦである。好ましい態様において、ヒトＶＥＧＦは該ベクターにサブクローニングされ、挿入に必要な制限部位を作成し、ＶＥＧＦを運搬するアデノウイルスプラスミドまたは、アンチセンス方向でのその部分的配列を形成し、ついで制限酵素消化によって線形化する。線形化したプラスミドは、ついで線形化した複製欠損アデノウイルスで、例えば腎臓２９３細胞株などの適当な寛容性宿主細胞中でトランスフェクションすることができる。本発明の組成物は硝子体内または網膜下注入、好ましくは適当なビヒクル、または担体において眼に運搬されることができる。そのような投与の方法およびそのような注入のためのビヒクルまたは担体は当該技術分野においては公知である。別法として、本発明の組成物のエクス・ビボ運搬は、治療されるべき患者のＲＰＥ細胞を除去し、該細胞を培養して、イン・ビトロで上記に定義した複製欠損アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスで感染させることによって達成されるであろう。ついで、ウイルスを運搬するＲＰＥ細胞は該患者の眼の網膜下層に注入することができる。本発明は特に眼の状態に関して記載されるが、当業者はＶＥＧＦが重要である多くの他の病状が存在することを認識するであろう。当業者は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび組換えウイルスは、そのような他の病状の治療に適用され得ることを理解するであろう。同様に当業者は、本発明はＶＥＧＦに関して特に例示されているが、本明細書に記載されている方法は他のタンパク質にも適用できることを理解するであろう。図面の簡単な説明図１ａは、硝子体内の１回の注入後の網膜におけるイン・ビボでのアンチセンスオリゴヌクレオチドの持続性（persistence）のジーンスキャン（GeneScan）分析の結果を示す。図１ｂは、ＣＡＴＳＣＦの注入後の異なる時点でのＲＣＳ−ｒｄｙ⁺ラットの網膜の共焦点顕微鏡像を示している。図２は、ロング−エバンス（Long−Evans）ラットのＲＰＥ層において食細胞の数のグラフ像である。用量は以下のとおりである：ＣＡＴＳＣアンチセンスオチゴヌクレオチドの低６.６μｇ、中６６μｇおよび高１３２μｇ。各カラムはラットの網膜の５つのランダムに選択した領域における食細胞の数の平均及び標準偏差を示す。図３は、ＲＣＳ−ｒｄｙ⁺ラットのＲＰＥ層における食細胞の数のグラフ図である。実験動物にセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ１）６６μｇおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＣＡＴＳＣ）６６μｇを注入する。図４は、アデノウイルストランス遺伝子を発現する細胞の数に、アデノウイルスベクターの力価の増加が及ぼす影響を示す。いずれの場合も、インキュベーション時間は１６時間である。ＲＰＥ７は７歳齢の提供者からのヒト網膜色素上皮細胞を意味する；Ｆ２０００はＦ２０００繊維芽細胞を意味する。Ｆ２０００キーのＣサフィックスは、Ｆ２０００細胞発現のための数がＲＰＥ７とともに直接比較するために修正されたことを示す。図５は、アデノウイルストランス遺伝子を発現する細胞の数にアデノウイルスベクターとインキュベーションする時間の増加が及ぼす影響を示す。いずれの場合も、アデノウイルスベクターの濃度は２×１０⁶ｐ.ｆ.ｕ.／mlであった。Ｆ２０００キーのＣサフィックスは、Ｆ２０００細胞発現のための数がＲＰＥ７とともに直接比較するために修正されたことを示す。図６は、固定したウイルス力価のアデノウイルストランス遺伝子を発現するＲＰＥ７細胞の数にヒアルロン酸（ＨＡ）が及ぼす効果のグラフ図である。３つのバーは、０.００１％ＨＡ、０.００５％ＨＡおよび無ＨＡ（コントロール）の効果を示している。エラーバーは標準偏差を示している。図７は、固定したウイルス力価のアデノウイルストランス遺伝子を発現するＦ２０００細胞の数にヒアルロン酸（ＨＡ）が及ぼす効果のグラフ図である。３つのバーは、０.００１％ＨＡ、０.００５％ＨＡおよび無ＨＡ（コントロール）の効果を示している。エラーバーは標準偏差を示している。図８はＲＰＥ７およびＦ２０００繊維芽細胞８ａにおいてＨＡ受容体の免疫蛍光染色を示す。ＣＤ４４で染色したＲＰＥ７；ＩＣＡＭ染色したＲＰＥ７；８ｃ．ＲＨＡＭＭ染色したＲＰＥ７；８ｄ．ＣＤ４４染色したＦ２０００繊維芽細胞；８ｅ．ＩＣＡＭ染色したＦ２０００繊維芽細胞；８ｆ．ＲＨＡＭＭ染色したＦ２０００繊維芽細胞。図９は、ブタの眼から単離した脈絡膜毛細血管内皮細胞の顕微鏡写真を示し、その特徴的な外見（最上パネル）、第VIII因子関連抗原(中間パネル)および細胞質内にアセチル化した低密度リポタンパク質を取り込む能力(最下パネル)を示している。図１０は、多様なヒアルロン酸調製物の多様性が脈絡膜毛管内皮細胞による管形成に及ぼす影響を示す。図１１は、網膜色素上皮細胞におけるＣＤ４４抗原のアルカリホスファターゼ染色を示す。各場合において、上皮は上で脈絡膜で写真の一番下である。Ａ．漂白していない色素上皮細胞層Ｂ．メラニン顆粒を除去するために漂白した色素上皮細胞層。Ｃ．アルカリホスファターゼ標識した抗ＣＤ−４４抗体で染色した漂白した色素上皮図１２は、ＶＥＧＦ₁₆₅で網膜色素上皮細胞株のトランスフェクションのＤＮＡＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。図１３は、トランスフェクションしたＲＰＥ細胞によって産生された、ＶＥＧＦ₁₆₅が脈絡膜毛管内皮細胞による管形成に及ぼす影響を示す。発明の詳細な記載ここで本発明は以下の非制限的な例にのみ参考にする方法で記載されるであろう。これらの例のいくつかにおいて、本発明で利用される方法の実施可能性は、カテプシンＳ（ＣＡＴＳＣ）に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて示される。実施例１ＲＰＥ細胞層におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの蓄積ヒト網膜色素上皮細胞を培養し、第３代継代細胞をイン・ビトロ実験に使用した。全面密度（confluent）培養をウシ（bovine rod outer segments）（ＲＯＳ）とインキュートして、イン・ビボ状況を模擬した。ヒトカテプシンＳ（ＣＡＴＳＣＦ）に相補的である蛍光標識したアンチセンスオリゴヌクレオチドをこれらの細胞の培地に加え、ついで７日間インキュベートし、細胞を回収した。ＲＰＥ細胞内の蛍光標識したオリゴヌクレオチドの存在は、フルオロサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検出した。ジーンスキャンＤＮＡ分析機(GeneScan ＤＮＡ a nalyser)を用いて細胞内のオリゴヌクレオチドの存在および安定性を評価した。培養したＲＰＥ細胞の蛍光が、約１００倍に増加することで、ＲＰＥ細胞内のアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在が示された。これらの結果を表１にまとめる。その蛍光が全長ＣＡＴＳＣによって、または変性オリゴヌクレオチドによって発せられるか否かはいまだ分かっていない。ジーンスキャンを用いて、その蛍光はおよそ１９マーのオリゴヌクレオチドのために、そしてそれはＣＡＴＳＣＦのオリゴヌクレオチドに類似の位置で現れることが示された。類似の手法を用いて、ＣＡＴＳＣオリオヌクレオチドが７日間のインキュベート後に、なおも完全であることが観察された。実施例２網膜細胞中のオリゴヌクレオチドの細胞分布および眼への注入後のオリゴヌクレオチドの安定性１ｎＭのＣＡＴＳＣＦを６週齢の非色素ＲＣＳ−ｒｄｙ⁺ラットの硝子体液に注し、ついでオリゴヌクレオチドの動向を共焦点蛍光顕微鏡にて観察した。蛍光（１ｎＭ）はまた、コントロールとしても注入した。動物を注入後２時間、３日後、および７、１４および２８および５６日後に安楽死させた。安楽死後、その注入した眼を除核し、凍結させ、薄片にし、ついで固定せずに共焦点顕微鏡に使用した。ＣＡＴＳＣＦの硝子体注入２時間後、そのオリゴヌクレオチドの透過を２時間で神経節細胞層にて観察し、ついでまた３日後で光受容体および色素上皮層においても観察した。しかしながら、注入７日後、ＲＰＥ層のみが相当量のＣＡＴＳＣＦを有した。１４、２８および５６日後、蛍光シグナルはＲＰＥ層に維持され、他の任意の細胞型にはシグナルは全く見られなかった。これらの結果はＣＡＴＳＣＦの大部分は食細胞性のＲＰＥ細胞によって取り込まれることを示す。上記のように硝子体注入後、眼を切開し、網膜を除去し、ついでＤＮＡを抽出した。精製したＤＮＡをジーンスキャン分析にかけた。編成していない蛍光標識したオリゴヌクレオチドが図１ａに示すように、注入後７、１４、２８および５６日後のラット網膜にて示された。シグナルの強度は５６日で有意に消滅した。共焦点顕微鏡分析を１０ｎＭのＣＡＴＳＣＦの非色素ＲＣＳ−ｒｄｙ⁺への１回の注入後に行った。注入後、網膜を時々試験し、ついでその結果を図１ｂに示し、そこではｇは神経節細胞層を表し、iは内核層、ｏは外核層およびｒは網膜色素上皮層を示す。パネルは１０ｎＭのＣＡＴＳＣＦ注入後２時間後の網膜(Ｂ) 、３日後（Ａ）、７日後（Ｃ）、２８日後（Ｄ）および５６日後（Ｅ）を示し、およびコントロールとしてＦＩＴＣの注入後３日後（Ｆ）を示す。これらの結果は硝子体内注入後、ＲＰＥ細胞注にオリゴヌクレオチドが蓄積することを示す。そのオリゴヌクレオチドはＲＰＥ層に５６日まで存在し、この期間内は生物学的に活性のある形態のままである。実施例３アンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的活性ロング−エバンス系の雌性６０日齢の色素を与えた（pigmented）ラットをチャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリーズ（Charles River Breeding Laboratories）、ウィルミントン（Wilmington）、マサチューセッツより入手した。６０日齢の非色素ＲＣＳ−ｒｄｙ⁺ラットを本発明者らからのコロニーから得た。その動物を１２時間明／１２時間暗の日照サイクルにて馴化させ、実験の前少なくとも１０日間は平均５ルクスの照射した。動物をペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注入によって麻酔した。毛様体（pars plana）を通しての硝子体注入は３２ゲージ針を用いて行われた。左眼をコントロールとし、右眼に１５０ｍＭの塩化ナトリウム（食塩水）の３μｌ、またはそれぞれ６.６、６６または１３２μｇのＣＡＴＳＣを含む３μｌの食塩水、または前記の（ラコッツィー（Rakoczy）ら、１９９４）アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは１００％ＣＡＴＳＣに相補的である６６μｇのセンスオリゴヌクレオチドＳ１を注入した。注入した動物を麻酔から回復させ、注入１週間後にペントバルビタールナトリウムの過剰投与によって１週間後に屠殺し、ついで形態上の検査に使用した。すべての動物を一日のうちの同時刻に１時間半内で、つまり照射開始から約４時間後には屠殺した。３匹のうちの２匹の動物を各投与に使用した。除核後、全眼を０．１２５Ｍのカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．３５）中の２．５％グルタルアルデヒドおよび１％パラホルムアルデヒドに浸した。角膜およびレンズを自由に切開し、ついで方向づけの目的のために眼杯をトリミングした。その組織を一夜４℃で固定し、ついで固定後１時間、室温にて１％オスミウムテトロキシド（osmium tetroxide）中においた。エタノール脱水後、その組織をエポキシ樹脂中に包埋した。前記のように網膜の切片を透過型電子顕微鏡のために作製した（ケネディー（Kennedy）ら、１９９４）。組織学的なデータを光学顕微鏡によって得た。中程度の厚さの（semi-thin）１μｍの切片をＬＫＢ２０８８ウルトラトーム(Ｕltratome)（ＬＫＢ− Produkter）、スウェーデン）でダイヤモンドナイフを用いて作製し、トルイジンブルーで染色した。食塩水、低（６.６μｇ）、中（６６μｇ）、または高（１３２μｇ）のＣＡＴＳＣおよび６６μｇのＳ１センスオリゴヌクレオチドを注入した各切片の、ＲＰＥ細胞中に蓄積された食細胞の数を決定した。眼から数の５セットを４０倍の倍率で決定し、ついで標準偏差を算出した。各セットは６つの異なるランダムに選出された領域からの２５０μｍ長のＲＰＥ中の食細胞の総数からなる。コントロール眼、低培地およびＣＡＴＳＣの高用量のＲＰＥ中に蓄積した食細胞の数を分析してグラフに示した。ＳＡＳ^R（バージョン６）統計パッケージ（ＳＡＳ・インスティテュート・インク）(ＳＡＳ Institute Inc.)、米国）の一般的な線形化モデル手法の後、分散分析を用いて比較した。その結果は、本発明者らがラットの２つの系においてアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＣＡＴＳＣ）を上手に試験したことを示している。コントロールロング−エバンスおよびＲＣＳｒｄｙ⁺ラットにおいて存在する食細胞様含有体の数に有意差はなく、それぞれ３５.１８＋１１.６および４７.２９＋１４.８（平均 ±ＳＤ）であった。硝子体注入は外傷を与えずに行った。食塩水を注入した眼の網膜の光学顕微鏡検査は、網膜の外層に全くダメージがなく、コントロールの非注入動物に比較した場合、ＲＰＥ層における食細胞様含有物の数において全く増加がなかったことを明らかにした。ロング−エバンスラットを使用して、ＲＰＥ層における生物学的変化を誘発するのに必要であるＣＡＴＳＣの最少量を同定した。コントロール眼およびＣＡＴＳＣの低用量（６.６μｇ）を注入した眼において、ＲＰＥ細胞内の食細胞様含有物の数は、それぞれ３５.８＋１１.６および３５.０＋７.４であった。より高い程度の用量（６６μｇおよび１３２μｇ）の注入動物において、食細胞様含有物の数はそれぞれ９６.２＋１３.６および１４１.０＋３４.７であり、その差はコントロールおよび低用量サンプル（図２）に比較した場合、統計学的に有意であった。６６μｇのＣＡＴＳＣを注入したＲＣＳ−ｒｄｙ⁺ラットはまた、コントロールにおける４７.２０＋１４.８に比較した場合、２０４.２０＋３９.３と食細胞様含有体の数において、統計学的に有意な増加が示された。対して、６６μｇのセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ１）の注入は、ＲＰＥ層（３４．４＋１２．５４）において存在する食細胞の数（図３）を増加させなかった。ＣＡＴＳＣ−注入ロング−エバンスおよびＲＣＳ−ｒｄｙ⁺動物のＲＰＥにおいて見られる含有物は形状は球形であり、明らかに、ロンググエバンスラット中に存在する非常に黒い、小さな長楕円形のメラニン粒子から区別することができる。６６μｇのＣＡＴＳＣの存在したで、外側部分の先端は、非組織的なサインを示し、外側核層においていくつかの液胞が存在した。しかしながら、これらの変化はＳ１センスオリゴヌクレオチド注入動物においては見られなかった。ＣＡＴＳＣ注入眼のＲＰＥ層の電子顕微鏡試験は、ＲＰＥ細胞の形態において、全く有意な変化を明らかにしなかった。メラニン粒子は領域的な差のために一層小さなおよび低濃度であったようである。個々のミトコンドリアの外形はコントロールにおいてより、処理群において小さく、その数は非処理動物においてより処理した動物においての方が多数であった。電子顕微鏡試験は未消化物質の構造が食細胞のそれに類似であることを確認した。ＣＡＴＳＣで処理したラットのＲＰＥ層において見られる多数の食細胞は傍核であり、主にぎっしり詰めたリン脂質膜を含み、それは未消化の光受容体外側部位(ＰＯＳ)を類似しており、および光受容体源を確認している。処理した動物における頂点の非組織化した外形を除き、ＰＯＳ層において観察される他の形態学的な変化は全く見られなかった。実施例４ＲＰＥ細胞層への遺伝子のトランスファーアデノウイルスベクターを用いた遺伝子トランスファーの本質および動向を試験した。アジュバントのアデノウイルスの取込みへ及ぼされる効果もまた試験された。ヒトＲＰＥ培養物（ＨＰＲＥ７）は、７歳齢のコーカサスのドナーから提供を受け、ラコッツィーら（１９９２）において記載されるように調製した。ヒトＦ２０００繊維芽細胞を培養し、回収しついで、培地１００ｍｌ当たり１０％ＦＢＳ(マルチザー^TM、トレース・バイオサイエンスィズ（Multiser^TM Trace Biosciences）)および１２５μｌのゲンタマイシン（デルタ・ウエスト（Delta West）、ベントレー（Bentley）、オーストラリア）を含む最少イーグル培地（M inimalEgles Medium）（ＭＥＭ、マルチセル^TM・トレース・バイオサイエンスィズ、オーストラリア）にプールした。プールした細胞懸濁液の１ｍｌアリコートを２４ウエルプレートの各ウエルに静置して、ウエルの播種が均等となるようにした。細胞が全面の密度に達したら実験を行い、少なくとも各実験点の２つの対応するセットを得た。アデノウイルストランス遺伝子の発現ＲＳＶプロモーターおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（Ａd.ＲＳＶ.βgal）を運搬する複製欠損アデノウイルス５（ストラトフォード−ペリコーデット（Stratford-Perricaudet）、１９９２）を培養し、ついでグラハム（Graham）およびプレバック（Prevac）、１９９１のように精製した。Ａd.ＲＳＶ.βgalを各ウエルに１ｍｌのアリコートとして加え、ＭＥＭにおいて、力価に基づく試行期間のため４×１０⁶ｐ.ｆ.ｕ.／ｍｌの濃度で、最終濃度は４×１０⁶ｐ.ｆ.ｕ. ／ｍｌの濃度とした。力価に基づく試行に関し、１ｍｌのアリコートにてウエルに８×１０³、４×１０⁴、８×１０⁴、２.４×１０⁵、４×１０⁵ｐ.ｆ.ｕ. ／ｍｌをウエルに加え、各ウエルにおいて総容量２ｍｌにした（最終的なウイルス濃度は加えたものの半分である）。ウイルス力価の増加の効果を試験する全試行は１６時間という決まった期間のウイルス懸濁液と培養液のインキュベーションを含む。実験は各ウエルから培地を除去し、ついで０.５ｍｌの０.５％グルタルアルデヒドで細胞を固定することによって終了する。そのグルタルアルデヒドを５分後除去し、ついでその細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄する。この後、０.５ｍｌのＸ−ｇａｌ染色［溶液１ｍｌにつき（最終溶液中の濃度）２５μ ｌのＸ−Ｇａｌ（０.５ｍｇ／ｍｌ、バイオ・ラド（BioRad）、ヘルキュルス（Hercules）、カリフォルニア）、４４μｌのＨＥＰＥＳバッファー（４４ｍＭ）、１００μｌのＫ₄Ｆｅ（ＣＮ）₆（３ｍＭ）、１００μｌＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆（３ｍＭ）、１００μｌのＮａＣｌ（１５ｍＭ）、１００μｌのＭｇＣｌ₂（１.３ｍＭ）、滅菌蒸留水を加えて１ｍｌとする（５３１μｌ）］を各ウエルに加えて室温で一夜（約１６時間）インキュベートする。細胞のカウント２００倍の倍率でオリンパス・ＴＯ４１・位相差顕微鏡（Olympus ＴＯ４１）を使用した。カウンティングは１人の観察者によって行った。ついで第２観察者がカウンターチェックとしてサンプルの２５％をブラインドカウントした。顕微鏡中のカウント目盛りを使用して、平均が使用される場合には、カウント領域を定義した。Ｘ−Ｇａｌ染色で染色が陽性であったすべての細胞を数えた。トランス遺伝子の低発現（＜約２０００細胞／ウエル）で、全プレートを数えた。細胞数がそれより多い場合には、平均を使用した。細胞を５つの標準化した領域中において数え、ついでその平均を各ウエルの総数を算出するのに使用した。ＨＲＰＥ７およびＦ２０００繊維芽細胞における発現率を比較する試行において、その遺伝子を発現しているＦ２０００細胞の数を修正した。この修正は２４ウエルプレートにおいての全面培養液中において各細胞型の異なる総細胞数を反映している。ＨＲＰＥ７の数は１ウエルあたり３×１０⁵であり、Ｆ２０００についてはウエルあたり２×１０⁵であった。グラフ（図４および図５）はまた、直接的な比較を可能にする修正した数も含む。細胞型間で比較がされない場合、そのままの数で変更なく行われた。力価に基づく試行において、発現の外形は、増加の速度および絶対的発現の点において顕著に異なった。ＨＲＰＥ７細胞に関して、発現速度は指数関数形態を有しているようであり、一方、Ｆ２０００繊維芽細胞において、その外形はより線形であった。力価比較を行う試行を通した発現における広いギャップが存在する。一層高いウイルス力価にて、ＨＲＰＥ７発現はＦ２０００細胞より一層多大な状態である。この実験において試行された状態および力価に関して、増大するベクターの力価で発現している細胞の数において、全体的および一定の増加がある（図４）。インキュベーション時間のトランス遺伝子発現の外形に及ぼす効果の実験において、ＡｄＶ．ＲＳＶ．βｇａｌの濃度は、２×１０⁶ｐ.ｆ.ｕ.／ｍｌで一定に維持された。２つの細胞型におけるトランス遺伝子の発現の外形は、その遺伝子を発現する細胞の数の増加速度および大きさの両方の点において、顕著に異なる。その遺伝子を発現するＨＲＰＥ７およびＦ２０００繊維芽細胞の数においての激しい増加間で顕著な遅延も存在する。ＨＲＰＥ７細胞に関して、発現速度における好転が４時間で起こるが、一方Ｆ２０００繊維芽細胞においては２４時間で起こる。ＨＲＰＥ７の発現が、Ｆ２０００の発現より多大な程度である４〜２４時間の「窓（window）」期間がある（図５）。実施例５ウイルスベクターを使用するβ−ガル遺伝子の取り込みおよび発現に対するアジュバントととしてのHAの効果 HRPE7およびF2000細胞を２４ウエル平板に振り分けた。細胞を実施例４に記載のようにしてインキュベートし、９５％全面成長させた。０．００１％から０．００５％緩衝化ヒアルロン酸（HA）ナトリウム溶液（鶏のとさか由来の１％ヒアルロン酸；HEALON Pharmacia AB,ウプサラ,スウェーデン）をMEMを用いて調製した。濃度４ｘ１０⁶p.f.u.のウイルス溶液１０μｌをHA希釈溶液のそれぞれ１０ｍｌに加え、対照ではMEM１０ｍｌに加え、時折穏やかに撹拌しながら２５℃にて３０分間インキュベートした。試験溶液および対照溶液の各１ｍｌを２４ウエル平板の別々のウエルに加えた。各試験濃度および対照についてそれぞれ４つの試料を準備し、カウントし、平均化した。ウイルス／HA溶液を細胞培養物とともに１６時間インキュベートした。各実験は実施例４記載の操作に従って終わらせた。アデノウイルス単独では、トランス遺伝子（transgene）を発現しているHRPE ７細胞の各ウエルにおける数の平均は１４７０５(SD±2228)であった。０．００１％HA存在下のアデノウイルスでは、発現細胞の平均の数は各ウエル当たり１９１６８であり（SD 1561)、０．００５％では平均数２０５９２であった（SD 2143）（図６）。これは、０．００１％HAではトランス遺伝子を発現する細胞の数が３０．４％増加し、０．００５％HAでは４０．０％増加することを示す。ステューデントｔ検定により評価すると、０．００５％HAを使用した場合におけるこの遺伝子を発現するHRPE7細胞の数の増加に関する有意性の確率は、対照と比較すると０．００９７であり、これは有意性ｐ＜０．０１のレベルを示す。この有意性は平均値の差が大きく（２０５９２（試験）vs １４７０５（対照））、標準偏差２以上で平均値が乖離していることを反映している。０．００１％HAを対照と比較した場合、この遺伝子を発現するHRPE7細胞の数の増加に関する有意性の確率は０．０２９３１であり、これは有意性ｐ＜０．０５のレベルを示す。有意性が下がるのは、平均値の差が小さくなることと対応している（１９１６８（試験）vs １４７０５（対照））。 F2000繊維芽細胞におけるトランス遺伝子の発現に対するHAの効果を調べるためのプロトコールはHRPE7のものと同じである。トランス遺伝子を発現する細胞の数はHRPE7と比較して有意に少ないが、これは実施例４にて証明された結果と矛盾がない。アデノウイルス単独の各ウエルにおける発現細胞の数の平均は３７８０である(SD±100)。０．００１％HA存在下のアデノウイルスでは、発現細胞の数の平均は各ウエル当たり４３９１(SD±214)であり、０．００５％HAでは平均４３７８であった(SD355)（図７）。これは、アデノウイルストランス遺伝子を発現する細胞の数が０．００１％HAでは１５．８％、０．００５％HAでは１５．５％増加することを示す。両側ステューデントｔ検定を使用し、各実験データの平均間の差の有意性を評価した。各実験では、平均、平均の差の標準誤差、ｔ検定のｐ値を算出した。両実験ともに、HAは非常に有意な取り込みの増加を示した（ｐ＜０．０５）。００５％HA存在下のF2000繊維芽細胞に関するトランス遺伝子発現細胞の数の増加におけるｔ検定の有意性の確率は、対照と比較して０．００４４であり、これはｐ＜０．０１の有意性のレベルを示す。ここの高い有意性は平均間の差が大きく（４３９１（試験）vs ３７９０(対照)）、２つの試料内の偏差が小さいことを反映している。標準偏差は２１４（試験）および１１１（対照）である。０．００１％HA存在下のF2000繊維芽細胞に関するトランス遺伝子発現細胞の数の増加におけるｔ検定の有意性の確率は、対照と比較して０．０１９５であり、これはｐ＜０．０５の有意差のレベルを示す。末処理の数字では偏差が大きくなっており、標準偏差は０．００５％試料（３５５ vs ２１４）のものよりも大きく、これがｐ値が高いことを説明している。コンドロイチン硫酸およびリポフェクタミンのアジュバントととしての予備試験も行い、有効性の可能性（likely efficacy）を評価した。これらの物質はHRP R細胞における遺伝子発現に対して有意な効果を保持していなかった。以下の用量のアジュバントも使用した：これらの数字は、β−ガルトランス遺伝子の取り込みおよび発現に対するHA濃度の効果を示している。ウイルス濃度が高くなれば、β−ガル発現細胞の数が増加している。この数字は、２４ウエル平板中、HAの存在下、ウイルスを１６時間インキュベートした後（約2x10¹¹pfu/ml）におけるβ−ガルに対して陽性に染色されたRPE細胞の数である。ａ：これらの溶液の粘性ではHAは適度に分散せず、操作が非常に困難であった。ｂ：この数字が他の結果の正常分布の外にある理由は明らかでない。実施例６ウイルスベクターを使用するβガル遺伝子の取り込みおよび発現に対するHA分子量の効果 β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子およびRSVプロモーターを有するアデノウイルス（AdV.RSV.βgal）をK293胎児性ヒト腎セルラインの細胞中において培養した。上清を捕集し、各希釈を４回行う連続希釈法によってウイルス濃度を測定した。ウイルス濃度は５ｘ１０⁸pfu/mlと計算された。１０％ウシ胎児血清（FBS）および１２５μｌ／１００ｍｌゲンタマイシンを含有するMEM刈培地中にウイルスを懸濁した。ヒトレチナール色素上皮細胞（HRPE）を20歳のドナーから取り出し、それを上記の培地にて培養した。それを同じストック由来の２４ウエル平板に分別し、全面成長させた。４回継代の細胞を使用した。以下のHA調製物を試験した：１．Hyal（分子量約３００，０００）２．Provisc（分子量約１，９００，０００）３．Healon GV（分子量約５，０００，０００） FBSを含まないMEMにて各調製物を０．００２％の溶液にまで希釈した。上記ウイルス溶液をアジュバント溶液と１：１で混合し、最終ウイルス濃度２．５ｘ１０⁸pfuおよびHA濃度０．００１％とした。２つの溶液をこの混合物として室温、３０分間穏やかに撹拌しながらインキュベートした。対照溶液は、 FBSを含まない、HAの存在しないMEMとウイルスとの混合物から成る。２４ウエルの各細胞にウイルス/HA混合物１ｍlを加えた。CO₂インキュベーター（５％CO₂）中、３７℃にて２４時間インキュベートした。ウイルス／HA混合物を取り除き、０．５％グルタルアルデヒド０．５ｍｌを各ウエルに５分間かけて加えることで、実験を終わらせた。ウエルをPBSで１回洗浄し、Xガル染料と反応させた。オリンパスTO41位相差顕微鏡（オリンパス光学Co.Ltd.東京、日本）の倍率100 Xを一貫して使用した。カウントは一人の観察者が行い、試料の１／４をカウントした別のプラインド観察者がチェックした。顕微鏡の計数線を使用し、カウントの領域を規定した。Xガル染料で陽性的に青に染色されたすべての細胞は陽性としてカウントした。５つの規格領域の細胞をカウントし、その平均を各ウエルの総カウントの計算に使用した。得られた結果および統計分析を以下の表５−９に示す。統計変量分析: 単一係数すべての群間変量分析:単一係数アジュバント間対照と比較して、すべてのHA含有試料にトランス遺伝子発現の増大が認められた（P<0.003）。増加パーセンテイジは、Hyal、ProviscおよびHealon GV調製物についてそれぞれ２１．７％、１８．６％および３４．８％であった。ヒアルロン酸の分子量の違いによる効果には有意差は認められなかった（P=0.09）。これらの結果は、ヒアルロン酸がウイルスベクターの取り込みを増大させることを示しており、これはアジュバント効果を証明するものである。さらに、アジュバント効果は分子量３００，０００−５，０００，０００間のヒアルロン酸分子量に無関係であることが示された。実施例７ HRPE7 およびF2000の細胞膜上のHAレセプターの証明ポリクローナルRHAMN（ヒアルロナン(Hyaluronan)媒介性運動）抗体は、E Turley博士（Manitoba Institute of Cell Biology，カナダ）より親切にも提供を受けた。この抗体は希釈度１：７５で使用した。モノクローナル細胞間接着分子１（ICAM-1）抗体（Boehringer-Mannheim）は濃度４μg／ｍｌで使用し、モノクローナルホーミングレセプターCD44抗体（CD44）は濃度４μg／ｍｌで使用した（Boehringer-Mannheim）。モノクローナル抗−ヒトIgG抗体およびラット非免疫血清はM Baines博士（Lions Eye Institute，Perth，オーストラリア）から親切にも提供を受けた。これらはそれぞれ濃度４μg／ｍｌ、希釈度１：７５で使用した。抗−マウスIgG（Fab特異的）−FITCコンジュゲート二次抗体は希釈度１：６４で使用し、抗−ウサギIgG（全分子）−FITCコンジュゲート二次抗体は希釈度１：１００で使用した（Sigma Immunochemicals，St Louis，Missouri）。 HRPE7およびF2000繊維芽細胞をラボ・テック８ウエル・スライドチャンバー（ Nunc Inc．Naperville，Illinois）中で培養した。細胞培養物を−２０℃にて１０分間メタノールで固定化した後、免疫蛍光染色した。すべての一次抗体溶液を１時間インキュベートした。２つの細胞タイプのそれぞれに使用した一次抗体は試験用としてモノクローナル抗−ICAM-1、抗−CD44、対照として抗−ヒトIgG、また対照として非免疫ウサギ血清を有するポリクローナル抗−RHAMMであった。一次抗体を除去した後、各ウエルをPBSで３回洗浄し、１時間かけて二次抗体を適用した。モノクローナル抗体に対する二次抗体は抗マウスIgGであり、ポリクローナルは抗−ウサギIgGであった。さらなる対照として一次抗体を用いずに二次抗体を組織に適用した。最後に、二次抗体を取り出す際に各ウエルをさらに３回洗浄し、ついでウエルチャンバーを取り出し、免疫蛍光マウンティング培地（ICN Biomedicals Inc，Aurora，Ohio）を用いてスライドを顕微鏡に固定した。モノクローナル抗体を用いたCD44の免疫組織化学染色により、それぞれ図８ａおよび８ｂに示されているようにHRPE7細胞およびF2000繊維芽細胞ともに陽性に染色された。染色パターンは培養組織の細胞アウトラインと同じであるので、染色は細胞表面に一致した分布であった。モノクローナルヒト抗−IgGを対照として使用したが、これはHRPE7細胞および F2000繊維芽細胞の両者に対して陰性であった。一次抗体を伴わない二次蛍光抗体を使用する２回目の対照でも両細胞タイプともに陰性であった。 ICAM-1に対するモノクローナル抗体を使用する免疫組織化学染色ではHRPE7細胞およびF2000繊維芽細胞ともに陽性に染色された（これはそれぞれ図８ｃ、図８ｄに示している）。この染色はCD44の場合と同様の分布を示したが、そのシグナルは若干弱かった。CD44と同じ対照をICAM-1染色でも使用したが、ここでも陰性であった。ウサギモノクローナル抗体を使用したRHAMMレセプターの染色はHRPE7細胞およびF2000繊維芽細胞ともに陽性であった（これはそれぞれ図８ｅ、図８ｆに示している）。しかし、その染色分布は２つの細胞タイプでは大きく異なっていた。 HRPE細胞では、染色パターンは核が主であり、細胞質アウトラインでは非常に微かであった（図８ｅ）。F2000繊維芽細胞の染色分布はCD44およびICAM-1と類似しており、細胞質または細胞アウトラインパターンに渡って観察される有意な核シグナルは認められなかった。対照血清はウサギ非免疫血清であったが、これはHRPE7には陰性であるが、F20 00繊維芽細胞では非常に弱いシグナルを与えた。両方ともに、二次免疫抗体単独ではいずれの細胞タイプにも陽性シグナルを与えなかった。実施例８血管形成に対する異なる分子量のヒアルロン酸調製物の効果試薬カルシウムまたはマグネシウムを含有しないハンクスの平衡塩溶液（Hank'sBS S）、Hams F12培地、イーグル塩を含有する最小必須培地（EMEM）、ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン−ストレプトマイシン、アンフェテリシンBおよびトリプシン−ＥＤＴＡはオーストラリアン・リサーチ（Perth，Western Australia）から入手した。コラゲナーゼA、内皮細胞成長サプルメント（ECGF）、第VIII因子関連抗原に対するマウス抗−ヒトモノクローナル抗体、および抗−マウスIg−フルオレセインはベーリンガー・マンハイム・オーストラリアpty.Ltd．（perth， Western Australia）から入手した。ゼラチン、ヘパリン、アスコルビン酸はシブマ・ケミカル・カンパニー（Sydney，Australia）から購入し、アセチル化低比重リポプロテイン（DiI-ac-LDL，1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチル-インドカルボ-シアニン過塩素酸エステル）はビオメヂカル・テクノロジー， Inc.（Stoughton，Massachusetts）から、マトリゲル（Matrigel）はコラボレイティブ・リサーチ（Bedford，Massachusetts）から、組換えヒト血管内皮細胞成長因子（VEGF）はPepro Tech EC Ltd．(Rocky Hill，New Jersey)から、 ProVisc（MW1.9ｘ10⁶）はアルコン・ラボラトリーズ（Alcon Laboratories）から、ヒーロンGV（Healon GV）(Mw5.0ｘ10⁶)はファルマシア（Pharmacia）からそれぞれ購入した。ブタ絨毛血管内皮細胞の単離および培養死後２−４時間のブタの目を地方屠殺場から入手した。従来発表されているようにして（Norse et al，1990，Sakomoto et al，1995）、絨毛血管内皮細胞を単離した。簡単に説明すれば、カルシウムおよびマグネシウムは含まないが０．１％コラゲナーゼAを含有するハンクス平衡化塩溶液（Hank's BSS）を使用し、３７℃にて１時間内皮細胞を遊離させた。Hank's BSSで２回洗浄し、5% CO₂、95 %空気中、３７℃の１％ゼラチン被覆７５ｃｍ²細胞培養フラスコ内にて細胞を培養した。成長培地はHams F12＋１０％ウシ胎児血清（FCS）、１００Uペニシリン −１００μｇストレプトマイシン／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌアンホテリシンB、３７．５μｇ／ｍｌ内皮細胞成長サプルメント（ECGS）、ヘパリン１００ μｇ／ｍｌ、およびアスコルビン酸２５μｇ／ｍｌから構成されている。毛細管セグメントを培養した２４または４８時間後、丸石形態（cobblestone appearance）を示す内皮細胞のコロニーを平らにし、引延ばした。３または４日目に、内皮細胞でないコロニーを確認し、７５cm²フラスコ上に永久マーカーペンで丸印を付けた。予め炎に通して先端をビーズ状にしたガラスピペットを用い、丸印内の非内皮コロニーを取り出し破壊した（Folkman et al.，1979）。この操作は層流フード内の位相差顕微鏡下（×１０相対物レンズ）に行った。培地を２回交換し、浮遊細胞を除いた。この操作を３から５回繰り返し、内皮細胞の初代細胞を増やし、全面成長させた。典型的な丸石形態、第VIII因子関連抗原の存在（Sakomoto et al，1995）およびDiI-ac-LDLによる陽性染色（取り込み）（Fo lkman et al，1979）に基づき、得られた細胞を血管内皮細胞として同定した。血管形成に対するヒアルロン酸の効果既に発表されているようにして（Haralabopoulos，et al，1994）、血管形成検定を行った。手短に説明すれば、製品シートの推奨に従い、Matrigel(16.1mg タンパク質/ml)をエンゲルブレス−ホルム・スワーム腫瘍（Engelbreth-Holm Sw arm tumour）から調製し、それを使用して２４ウエルクラスター平板（２５０μ ｌ／ウエル）を被覆した。CO₂インキュベーター内にて３７℃で３０分間、 Matrigelをポリマー化した後、１０％FCSを含有するMEM中、１０または２０μｇ／ｍｌの種々の分子量のヒアルロン酸調製物（それぞれProVisc，MW1.9ｘ10⁶；H yal MW2.5ｘ10⁶およびHealonGV MW5.0ｘ10⁶）を含有する培地０．５ｍｌを上記のMatrigel被覆化ウエルに加えた。血管領域の相対ユニットの比較のため、MEM ０．５ｍｌ中、１０％FCSを用いた。０．２５％トリプシン−０．０２％EDTAによってCEC（継代３−７）をフラスコから取上げ、５％MEMに懸濁し、被覆ウエル（培地０．５ｍｌ中、５０、０００細胞／ウエル）に加えた。血管様構造物のゲル上の領域を評価するため、６時間後に位相差顕微鏡を用いて写真を撮った。７つのフィールドのうち５つ（×１０対物レンズ）を、定量試験のため各ウエルから無作為に選択した。絨毛血管内皮細胞血管内皮細胞の初代培養物は他の細胞タイプと区別できる特徴的な形態を有していた。更に、この培養物を、第VIII因子関連抗原の染色およびDiI-ac-LDLを食菌する能力の検定によって特性化した。９５％以上のCECが第VIII因子関連抗原と陽性に反応した。殆どすべての細胞が図９に示しているように、DiI-ac-LDLの細胞質への取り込みを示した。このことは、少なくとも９５％の細胞が絨毛血管内皮細胞（CEC細胞）であることを示している。血管形成および数学的分析の定量化コンピューター・イメージング・アナライザー・システム（Professional Image Processing for Windows，Matrox Inspector）を用い、２つのウエル由来の血管領域を測定した。コンピューターでスライド写真をスキャンし、バックグランドを調整し、血管とMatrigelとの最良のコントラストを得た。次いで、各写真の全血管領域を測定することにより血管形成を定量化した。結果は、７．５％ FCS（最終濃度）単独の存在下、血管領域のパーセンテイジの平均および標準誤差として算定し、少なくとも２つの実験によるステューデントｔ検定によって分析した。血管形成 CECは、Matrigelの先端に接種した１時間後に接着してきた。２−３時間以内に、CECは整列細胞の網様体ネットワーク内へと迅速に移動した。３時間後、CEC は分散し、血管様構造体をMatrigelの表面に形成し始めた。６時間までに、血管様構造体は明らかとなり、血管様の網状ネットワークを示した。対照試料および、種々のヒアルロン酸調製物を生物学的な濃度で含有する実験試料における血管形成を６時間後に評価し、結果を以下の図１０および表１０−１３に示す。対照試料およびヒアルロン酸含有試料間におけるCEC血管形成の違いは統計的に有意差が無く、このことは分子量３００，０００−５，０００，０００のヒアルロン酸は他の物質が存在しなければ、新生血管の形成を誘発しないことを示している。実施例９ヒト網膜におけるＣＤ４４ＨＡ受容体の存在の実証ヒト網膜の調製ヒトアイバンクドナーの眼を角膜の除去に続いて切開した。前区を捨てた後、神経網膜の部分を幾らかと、脈絡膜に結合した色素上皮層を完全に残して、硝子体を注意して除去した。固定のために、アイキャップを２.５％グルタルアルデヒドで満たした。固定した組織の切片をパラフィン包埋した。パラフィ塊を切断して、切片を組織化学スライドガラスに移し、キシランおよびエタノール中で脱ロウして、蒸留水およびトリス緩衝化生理食塩水ｐＨ７.２(ＴＢＳ)中で洗浄した。切片のアルカリホスファターゼ染色眼切片を０.２５％過マンガン酸カリウム５０μl中で４５分間、続いて、１．０％シュウ酸５０μl中で４５分間インキュベートすることにより、メラニン顆粒の除去を成し遂げた。１０％標準ウマ血清／ＴＢＳ(Commonwealth Serum Laboratories、Perth、オーストラリア)の血清５０μl／切片との３０分間のインキュベーションに続いて、漂白を行った。次いで、切片をＴＢＳ中で２回洗浄して(１回の洗浄あたり５分)、マウス抗ＣＤ４４モノクローナル抗体(Boehringe r Mannheim Biochemica、Mannheim、ドイツ)５０μlまたはマウス抗８１−１１モノクローナル抗体(非免疫対照)５０μl中で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、切片を再びＴＢＳ中で２回洗浄し(１回の洗浄あたり５分) 、ポリクローナル抗体として、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせた１／２５０ウマ抗マウスＩgＧ(Ｈ＋Ｌ)(二次抗体)５０μl中で６０分間インキュベートして、ＴＢＳ中で２回洗浄した(１回の洗浄あたり５分)。切片をＦＡＳＴＲＥＤ(Sigma Aldrich、St Louis、米国)中で２０分間インキュベートし、ＴＢＳ中で２回洗浄して(１回の洗浄あたり５分)、Meyerのヘマトキシリン中で１０分間、続いて、水道水中で５分間対比染色した。切片を乾燥させた後、グリセロールゼリーを使用してマウントした(mounted)。第１０図に示すようにして、組織切片に損傷を引き起こすことなく、メラニンの漂白を上手く行った。グルタルアルデヒドで固定したヒト眼切片をマウス対照モノクローナル抗体およびＦＡＳＴＲＥＤで染色すると、未漂白組織において( 第１０Ａ図)、および１０％標準ウマ血清／ＴＢＳとのインキュベーション後の漂白に続いて(第１０Ｂ図)、ＲＰＥ層の透明染色が起こった。脈絡膜においてではなく網膜の色素上皮層においてＣＤ４４ＨＡ受容体が特異的に存在することを実証する強い桃色のシグナルが、抗ＣＤ４４モノクローナル抗体で染色した組織において観察された(第１０Ｃ図)。脈絡膜におけると同様に、神経網膜においてシグナルは全く検出されなかった。これらの結果は、網膜の色素上皮細胞がＨＡ受容体を優先的に発現し、従って、ＨＡ複合体の取込みの増大を促進することを実証する。実施例１０ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるカテプシンＤ発現の上方および下方調節ヒトカテプシンＤの１６２０bpのHindIIIフラグメントをセンスおよびアンチセンス方向の両方でｐＨＢＡpr−１−neoベクターにサブクローン化した。陽性のクローンを選択して、そのフラグメントの方向をEcoRＩ制限酵素分析により確認した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションのために、アンチセンスおよびセンス方向でカテプシンＤを有するクローンを塩化セシウム密度グラジエントにかけた。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、１０％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)を補ったＤＭＥＭ２ml中、２×１０⁵の濃度で、６ウェルの組織培養プレート上に播種した。その細胞を、７０％集密になるまで、３７℃で一晩インキュベートした。集密度に達したら、その細胞を血清および抗生物質を含まない培地で２回洗浄した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ(ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ)１００μl中に希釈したリポフェクチン試薬(１０μl) (ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ)を穏やかに混合して、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、その混合物にＯＰＴＩ−ＭＥＭ８００μlをさらに加えた。この希釈した混合物を、洗浄したＮＩＨ３Ｔ３細胞上に穏やかに重層した。その細胞を１６−２０時間インキュベートした後、トランスフェクション培地を除去して、１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭで置き換えた。さらに４８時間インキュベーションした後、その細胞をトリプシン処理して、１０％ＦＢＳおよびジェネティシン４１８(ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ)を１ng／mlの濃度で含む培地中、１：５の割合で継代培養した(subcultured)。ジェネティシン４１８で選択された、上手くトランスフェクトした細胞を、上記のようにＦＢＳおよびジェネティシン４１８を補った培地中で維持した。集密な形質転換培養物を保存のために凍結させて、さらなる分析のために継代培養した。形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるカテプシンＤの存在を、従来の細胞化学技術およびアルカリホスファターゼで標識した二次抗体を使用して、カテプシンＤに対するポリクローナル抗体で検出した。そのベクターのカテプシンＤフラグメントの存在をHindIII消化で実証した。陽性のクローンは、１６２０bpのフラグメントの存在を示した。その方向は、ＥＣＯＲＩ制限酵素消化により確立され、その消化により、アンチセンス方向の場合には５.７および５.９kbで、またセンス方向の場合には４.３および７.３kbで、２つのフラグメントが与えられた。ジェネティシン４１８選択で生き残ったＮＩＨ３Ｔ３細胞は全て、カテプシンＤクローンを有しており、そのクローンは、抗生物質耐性である。形質転換したＮＩＨ３Ｔ３細胞は、選択操作では生き残らなかった。免疫細胞化学の結果は、センス方向でカテプシンＤを有するＮＩＨ３Ｔ３細胞はカテプシンＤ産生を上方調節するが、アンチセンス方向でカテプシンＤを有するＮＩＨ３Ｔ３細胞はカテプシンＤ産生を下方調節することを示す。実施例１１ＶＥＧＦ₁₆₅を発現するＲＰＥセルラインの製造細胞培養ヒトＲＰＥセルライン４０７Ａ(Davisら、１９９５)を、５％ＣＯ₂を含む加湿した環境において３７℃で維持した。培養培地は、１０％ＦＣＳ(Trace Biosciences、Sydney、ＮＳＷ、オーストラリア)および１００ＩＵ／mlペニシリン／１００μg／mlストレプトマイシン(Ｐ／Ｓ)(ＩＣＮ Pharmaceuticals Inc、 Costa Mesa、ＣＡ、米国)を補った最少必須培地(ＭＥＭ、Trace Bios ciences、Sydney、ＮＳＷ、オーストラリア)からなっていた。細胞を、ほぼ５日毎に、０.２５％トリプシン(Trace Biosciences、Sydney、ＮSＷ、オーストラリア)／０．０５％ＥＤＴＡ(ＢＤＨ Chemicals Austra1ia Pty Ltd、 Kilsyth、ＶＩＣ、オーストラリア)を用いて、５対１で継代接種した。発現べクターへのＶＥＧＦ¹⁶⁵のクローニング Bluescript ＫＳにおけるマウスＶＥＧＦ₁₆₅を、Dr．Georg Breier、Max Planck Institut、ドイツ(Breierら、１９９２)から入手した。ＶＥＧＦ₁₆₅を、ｐＨβ3ＡＰｒ−１−neoのBam ＨＩ部位に挿入した(第１図)(Grunningら、１９８７)。ＶＥＧＦ₁₆₅の３'末端へのBam ＨＩ部位の付加のために、このクローニングをpGem ７Ｚf(＋)によって行った(Promega、Madison、ＷＩ、米国)。センスのＶＥＧＦ−ｐＨβＡＰｒ−１−neoクローンを、EcoRＩ消化により同定した(Pr omega、Madison、ＷＩ、米国)。Qiagen PlasmidMidi Kit(Qiagen GmbＨ、Hilden 、ドイツ)を使用して、ＶＥＧＦ−ｐＨβＡＰｒ−１−neo ＤＮＡを調製した。製造業者のプロトコルに記載されているように抽出を行って、その結果得られたペレットをＴＥ緩衝液(１０mMトリスＨＣl、ｐＨ８.０、１mMＥＤＴＡ)５００μ lに再び懸濁させた。ＲＰＥセルラインのトランスフェクション製造業者の指示に記載されているようにリポフェクチン(Gibco ＢＲＬ、Gaith ersburg、ＭＤ、米国)を使用して、ＶＥＧＦ−ｐＨβＡＰｒ−１−neo ＤＮＡを４０７Ａ細胞にトランスフェクトした。簡単に言えば、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ(Gibco ＢＲＬ、Gaithersburg、ＭＤ、米国)１００μl中のＶＥＧＦ−ｐＨβＡＰｒ− １−neo ＤＮＡ２mgを、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ１００μl中のリポフェクチン試薬５ μlと混合した。その混合物を室温で１５分間放置した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで１mlにして、６０％集密の４０７Ａ細胞上に重層した。その細胞を、加湿した環境および５％ＣＯ₂において、３７℃で一晩インキュベートした後、ＭＥＭ４mlを１０％ＦＣＳおよびＰ／Ｓと共に加えた。その細胞を再び２４時間インキュベートした後、１mg／mlジェネティシン(Gibco ＢＲＬ、Gaithersburg、ＭＤ、米国)を細胞培養培地中に含ませた。１週間後、一連の離散(discrete)コロニーを選択して、確立されるまで、１mg／mlジェネティシン中で培養した。次いで、ジェネティシンの濃度を３００pg／ml細胞培養培地まで減少させた。リポフェクチンを使用して、ｐＨβＡＰｒ−１−neoのみでトランスフェクトした４０７Ａ細胞(４０７Ａ−ｐＨβＡＰｒ−１−neo)からなる対照セルラインもまた製造した。両方のセルラインとも、１０％ＦＣＳ、Ｐ／Ｓ、および３００ μg／mlジェネティシンを含むＭＥＭ中で維持した。ＤＮＡおよびＲＴＰＣＲに対するプライマーの選択ヒト４０７Ａセルラインに由来するヒトＶＥＧＦ₁₆₅のバックグラウンド増幅なしに、トランスフェクトしたマウスＶＥＧＦ₁₆₅の特異的増幅が可能となるよう、プライマーを選択した。ＩＢＩ Pustell Analysis Software(ＩＢＩ Ltd 、Cambridge、英国)を使用して、GenBankデータベースに記載されているマウスＶＥＧＦ₁₆₅およびヒトＶＥＧＦ₁₆₅の配列を比較した。ヒトＶＥＧＦ₁₆₅と７０％未満の相同性である１９ｍｅｒの領域をマウスＶＥＧＦ₁₆₅から選択した。プライマー配列は、「ＶＥＧＦＭＯｌ」、すなわちマウスＶＥＧＦ₁₆₅上の１１５ −１３４bp、５'−ＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＡＴ；「ＶＥＧＦＭＯ２」、すなわちマウスＶＥＧＦ₁₆₅上の３００−３１８bp、５'−ＣＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣであった。Basic Local Alignmen t Search Tool(ＢＬＡＳ、National Centre for Biotechnology Information、 Bethesda、ＭＤ、米国)によるプライマー配列の分析は、マウスＶＥＧＦ型のみに対する相同性を実証した。ＤＮＡＰＣＲ０.２５％トリプシン／０．０５％ＥＤＴＡを用いて細胞を採取した。２×１０⁶細胞の試料を集めて、ＰＢＳで洗浄した。ついでプロティナーゼＫ１００ng ／ml（Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany）および０.５％ｗ／ｖドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（BDH Chemicals Australia Pty Ltd，Kilsyth，VI C，Australia）の存在下、３時間３７℃にてインキュベートした。ＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出および酢酸ナトリウム／エタノール沈澱によって分離した。ＤＮＡペレットはＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。すべてのＰＣＲ試薬は超純水を含めてバイオテクインターナショナルリミテッド（Bentley，WA，Australia）から入手した。ＰＣＲ反応混合物は５Ｘポリメリ化緩衝液５μl、ＭｇＣl₂２５mM、Ｔth Plus ＤＮＡポリメラーゼ1Ｕ、ＶＥＧＦＭＯ１５０ng、ＶＥＧＦＭＯ２５０ngおよび超純水を加えて２５μlからなる。各ＤＮＡ試料１μｌをＰＣＲに用いた。実施された各一連のＰＣＲ反応につき、ＶＥＧＦ−ｐＨβApr−１−neoＤＮＡ２０ｎgを含む陽性対照、およびＤＮＡの代わりに純水を含む陰性対照が含まれていた。ＰＣＲ反応は、Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400テルモサイクラー（Perkin-Elmer Corporation，Norw alk，CT，USA）を用いて行われた。用いたサイクルは、９２℃５分間、５５℃１分間、７４℃１分間の１サイクル；９２℃１分間、５５１分間℃の３５サイクル；９２℃１分間、５５℃１分間、７４℃１０分間の１サイクルである。ＰＣＲ生成物は２％アガロースゲル上電気泳動にかけ、エチジウムブロミド染色により可視化した。逆転写ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）ＲＮＡをＲＮＡzolB（Biotecx Laboratories Inc.，Houston，Texas，USA）を用いて抽出した。この操作は使用説明書に従って、ＲＮＡを細胞の融合２５ｃｍ³ フラスコから直接抽出して行った（フラスコ当たり４×１０⁶細胞）。得られたペレットをピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）(BDH Ltd，Poole，Dorset，England）処理水５０μlに再懸濁させた。ＲＴＰＣＲをGeneAmp Thermostable rTth逆転写酵素ＲＮＡＰＣＲキット（Perkin-ELmer Corporation，Norwalk，CT，USA）を用いて行った。逆転写およびＰＣＲ反応は使用説明書に従って行った。各反応にＲＮＡ２００ｎgを用いた。すべての反応につき用いた水は超純水であった。ＲＴＰＣＲ陽性対照はＶＥＧＦ−phβApr−１−neoＤＮＡ２０ngを含んだ。陰性対照はＲＮＡの代わりに超純水を含んだ。ＤＮＡ混濁の対照は逆転写段階の終了後、rTthＤＮＡポリメラーゼの添加によって産生させた。ＲＴＰＣＲ生成物は酢酸ナトリウム／エタノールを用いて析出させた。試料を７０％エタノールで洗浄し、ＰＣＲ反応容量の１／５のＴＥ緩衝液を再懸濁させた。ＰＣＲ生成物は２％のアガロースゲル上電気泳動にかけ、エチジウムブロミド染色により可視化した。ＶＥＧＦ₁₆₅−発現網膜色素上皮細胞株の産生ＶＥＧＦ₁₆₅は、phβＡpr−１−neoのBam ＨＩ部位中に成功裡にクローニングさせた。このクローンの同定は、phβApr−１−neoに対応する１０.０kb、マウスＶＥＧＦ₁₆₅に対応する６５６bpの２個のフラグメントを生じるBam ＨＩ消化を用いて確認した。ＶＥＧＦ−ｐＨβＡpr−１−neo クローンのEcoR Ｉ消化は５.７kbおよび５.０kbの２個のフラグメントを産生し、ＶＥＧＦはセンス配向であることを確認した。ＶＥＧＦ−ｐＨβＡpr-１−neoは４０７Ａ細胞株にリポフェクチンを用いてトランスフェクションされた。４０７Ａ細胞株にトランスフェクションされたマウスＶＥＧＦ₁₆₅ＤＮＡの存在はＤＮＡＰＣＲを用いて確認された。ＤＮＡをＶＥＧＦ−ｐＨβＡpr−１−neo−トランスフェクション４０７Ａコロニーからも抽出し、対照の４０７Ａ−ｐＨβＡpr−１−neo細胞株からもＤＮＡを抽出した。ＶＥＧＦ−ｐＨβＡpr−１−neo−トランスフェクション４０７ＡＤＮＡのＰＣＲは、すべての被験コロニー中に２００bpのＤＮＡフラグメントを産生させた。このフラグメントは、マウスＶＥＧＦ₁₆₅遺伝子上のプライマーの位置から予想される大きさであり、ＶＥＧＦ−陽性対照から産生されるフラグメントの大きさに一致する。トランスフェクションされた細胞の確立したコロニーを残りの実験のために選択した（４０７Ａ−ＶＥＧＦ）。４０７Ａ−ｐＨβＡpr−１−neoのＰＣＲにシグナルは検出されなかった。結果を図１１Ａに示す。トランスフェクションされなかった４０７Ａ細胞からのＤＮＡもまたＰＣＲシグナルを産生し、用いられているプライマーがマウスＶＥＧＦ₁₆₅に特異的であることを確認した。ＲＴＰＣＲは４０７Ａ−ＶＥＧＦによるＶＥＧＦ₁₆₅mＲＮＡの産生を証明するために用いられた。４０７Ａ−ＶＥＧＦ全ＲＮＡのＲＴＰＣＲで、２００bpのフラグメントが産生し、マウスＶＥＧＦ₁₆₅プライマーの位置から予想されるフラグメントの大きさに一致する。シグナルは４０７Ａ−ｐＨβＡpr−１−neo−全ＲＮＡにはなかった。両方のＲＮＡの試料はＲＴＰＣＲ中のcＤＮＡ合成段階の省略によってＤＮＡの混濁はないことが示された。結果を図１１Ｂに示す。トランスフェクションされなかった４０７ＡＲＮＡを用いるＲＴＰＣＲはいかなるシグナルも生成しなかった。管形成試験試験は実施例８に記載と同様にして行った。ＣＥＣはばん種１時間以内にマトリゲル支持体に付着した。培養２〜３時間後、ＣＥＣは急速に移動し、整列した細胞の網状組織を形成し、その後、マトリゲルの表面に細管様構造を形成しはじめた。２４時間までにＣＥＣは吻合網状組織を出現させ、これは典型的な脈管である。コンピューター画像から得られた管形成の量的な分析を図１３に要約した。最も顕著な細管網状組織はヒト組換ＶＥＧＦ１００ng／mlの存在下で培養されたＣＥＣに観察された（図１３Ｂ）。４０７Ａ−ＶＥＧＦ調整培地により誘導された細管形成の量はヒト組換ＶＥＧＦからのものと同様であった。これに対して、対照４０７Ａ−ｐＨβＡpr−１−neo細胞株の調整培地からの管形成の濃度は著しく少なく、５％ＦＣＳおよびＰ／ＳのみのHam'sＦ１２培地を含む対照培養物に匹敵するものであった。４０７Ａ−ＶＥＧＦ調整培養物により誘導された管形成の量は、４０７Ａ−ｐＨβＡpr-１−neoと比較すると１００％増であった。この差は有意であることが判明した（Ｐ＝０．００９、スチューデンツｔ−検定）。対照培養物とヒト組換ＶＥＧＦ１００ng／mlを含む培養物との差もまた有意であった(Ｐ＝０．００２、スチューデンツｔ−検定)。実施例１２ヒトＲＰＥ脈管内皮成長因子（ＲＰＥ−ＶＥＧＦ）のクローニングおよび特徴当研究室のヒトＲＰＥ細胞を組織培養で生長させた。ＶＥＧＦ発現の上方調整のために、細胞培養物を低酸素条件にて処理した。ＶＥＧＦの条件調整は免疫組織化学的に観察した。mＲＮＡは１０⁷ＲＰＥ細胞から抽出し、ＲＰＥ／脈絡膜中に発現したすべての遺伝子を担持するcＤＮＡライブラリーは当分野で公知の方法を用いて確立した。ＶＥＧＦは高度な保存性分子であり、異なる種間に高い相同性がある。当研究室のげっ歯類ＶＥＧＦ cＤＮＡクローンがヒトＲＰＥ−cＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられ、ヒトＲＰＥ−ＶＥＧＦクローンの全長を同定した。陽性クローンは制限酵素分析および最終的にＤＮＡ配列決定によって分析される。ヒトＲＰＥ−ＶＥＧＦクローンの全長は、ゲノム構造（開始配列、開始および停止コドン、推定エクソンなど）を解明するために分析される。ＲＰＥ−ＶＥＧＦクローンの全長を担持するクローンは、インビトロ翻訳によりＶＥＧＦタンパクの発現について分析される。同定されたクローンは、ビヒクル系への挿入およびアンチ−センスオリゴヌクレオチドの選択のために、アンチ −センス分子を誘導するために用いられた。実施例１３ＶＥＧＦ発現の短期阻害のための医薬試剤アンチ−センスＤＮＡ技術は細胞の非−標的機能に影響を与えることなく、標的分子の配列特異的阻害を可能にする。上述のように、インビトロおよびインビボの両方で、アンチ−センスＤＮＡが硝子体(vitreous)中へのアンチ−センスオリゴヌクレオチドを阻害するために効果的に用いられ得ることを示した。１６〜１９量体のオリゴヌクレオチドの区切りは、ＶＥＧＦ遺伝子の部分に１００％相補的であり、ＤＮＡ配列の５'および３'末端から選択された。センスおよびスクランブル(scrambled)配列も対照に用いた。ホスホロチオエート−保護オリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーで合成し、精製する。実施例１４ＶＥＧＦ発現の長期阻害のためのアンチ−センス試剤相同性組換のためのＶＥＧＦ−pAd．ＲＳＶの調製ブルースクリプトＩＩＫＳ（Stratagene）のＶＥＧＦ₁₆₅をKpnＩ部位産生のために用いた。Kpn Ｉ制限酵素部位はサブクローニングによりＶＥＧＦ₁₆₅の５'および３'末端の両方に得られた。ＶＥＧＦ₁₆₅はXba Ｉ（５'切断）／Kpn Ｉ（３' 切断）制限酵素消化を用いてブルースクリプトＩＩＫＳから取り出し、pＧem ７Ｚf(＋)(Promega)中にクローニングした。ついで、Hind III(３’切断）／／X ba I（５’切断）消化を用いて、pＧem３Ｚf(＋)(Promega)中にＶＥＧＦ₁₆₅をクローニングすることによって、Kpn Ｉ部位を３’末端に加えた。ＶＥＧＦはKpn Ｉ制限酵素消化でpＧem ３Ｚf(＋)から取り出し、pＡd.ＲＳＶ上の単一のKpn Ｉ部位にクローニングした。このプラスミドは外来ＤＮＡの挿入のためのクローニング部位により分離されたアデノウイルスゲノムの２個のセグメントを含む。得られたクローンはセンスおよびアンチ−センスクローンの存在につきスクリーニングし、これを相同性組換に使用した（ＶＥＧＦ−pＡd.ＲＳＶ）。制限酵素開裂および配列決定によって、ＶＥＧＦ₁₆₅がpＡd.ＲＳＶ内に存在し無傷であることが示された。ＶＥＧＦ−ｐＡＤ.ＲＳＶＤＮＡをQiagen plasmid Midi Kitを用いて、使用説明書に従って調製した。このＤＮＡをXmn Ｉ制限酵素消化によって直線化し、酢酸ナトリウム／エタノール沈澱により精製し、ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。その後、このＤＮＡを必要時まで−２０℃にて貯蔵した。相同組換によるＡｄ.ＲＳＶ−ＶＥＧＦまたはＡｄ.ＲＳＶ−aＶＥＧＦの生成アデノウイルス５型欠失変異体、d１３２４、はＶＥＧＦを担持する組換アデノウイルスを生成させるために使用した。ｄ１３２４はＥ１領域を欠失しているために複製が不可能であり、さらに、Ｅ３領域に部分的欠失がある。ウイルス粒子の生成のために、この変異体を２９３細胞中で増殖させ、これは欠失しているＥ１領域をトランスに供給するものである。直線化されたプラスミドＤＮＡ pＡｄ．ＲＳＶ−ＶＥＧＦまたはpＡｄ.ＲＳＶ−ＶＥＧＦを、２９３細胞に、Ｃla１消化により左の先端の配列を除去しておいたd１３２４ウイルスＤＮＡと同時トランスフェクションした。これはd１３２４の感染力を減少させ、組換体の同定を容易にするものである。リン酸カルシウム沈澱法を用いてトランスフェクションした後、得られたプラークのスクリーニングでセンスおよびアンチセンス配向にＶＥＧＦを担持する組換Ａｄ.ＲＳＶ−ＶＥＧＦウイルスを採取した。実施例１５ターゲット分子の恒常的発現のための運搬体の構築実施例１４に記載の運搬体は、アンチセンスＶＥＧＦＤＮＡ分子を一時的（最長１年）に発現し、その後の新血管形成から保護するという点で、長期間の治療に適している。無期限の治療を達成するため、私達は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを用いて、アンチセンス方向にＶＥＧＦを、ＲＰＥ細胞に存在するヒトゲノムヘ組み込ませることのできるベクター系を用いた。これは、新血管形成からの保護が、ＲＰＥ細胞が機能的である限り、患者の残りの生命の間可能になることを意味する。アデノ関連ウイルスは、非病原性であり、非分裂細胞に感染することが可能であり、高頻度に組み込みを起こす。私達は、ＲＰＥ細胞のような他の細胞に容易に感染し、宿主細胞のゲノムへ組み込むことのできる、複製に欠陥のあるパルボウイルスである、ＡＡＶ−２を用いた。最近の特徴づけにより、ＡＡＶ−２は、ヒト１９染色体長腕を、特異的にターゲッティングすることが示されている。ＡＡＶ構築体は、レポーター遺伝子に応じて変動する様々なプロモーター配列を用いる。レポーター遺伝子ｍＲＮＡの発現は、ＰＣＲ増幅又はｉｎｓｉｔｅＰＣＲによって検出され、レポーター遺伝子の組み込みは、ＲＰＥ細胞の染色体分析によって同定される。適当な制限部位を用いて、レポーター遺伝子をアンチセンスＶＥＧＦＤＮＡに置き換える。この新しい構築体を、アデノウイルスタイプ５を感染させておいたｋｉｄｎｙ２９３細胞へ、相補的プラスミド（ｐＡＡＶ／ａｄ）と共に同時トランスフェクションし、ｒＡＡＶａＶＥＧＦ構築体を作成する。作成した構築体をＲＰＥ細胞に感染させ、アンチセンスＶＥＧＦの発現をＰＣＲ増幅によって検出する。実施例１６ＩｎＶｉｔｒｏ阻害試験のためのモデル系ヒトＶＥＧＦをＣＯＳ細胞へクローン化し、ＶＥＧＦ発現の効果的阻害を試験することが可能な培養系（ＶＥＧＦ−ＣＯＳ）を作成する。ＶＥＧＦ発現の阻害は、ノザン及びウエスタンブロット分析によって試験し、免疫分析によって定量する。ＣＯＳ細胞における増加濃度オリゴヌクレオチドの毒性をトライパンブルー分析によって評価する。増加濃度オリゴヌクレオチドの存在又は不存在下で、ＣＯＳ細胞の増殖をモニターする。アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下に維持した培養物及びコントロールにおけるＶＥＧＦの発現阻害を、ノザン及びウエスタンブロット分析、免疫細胞化学及び定量的免疫分析によってモニターする。ＲＰＥ細胞を低酸素条件下に培養し、増加濃度オリゴヌクレオチドの存在下、ＶＥＧＦ発現の調節増大を長時間モニターする。毒性、増殖分析及びＶＥＧＦ発現のモニターは前記の通りに行う。ＣＥＣ細胞を、増加濃度オリゴヌクレオチドの存在又は不存在下、正常及び低酸素条件で培養する。毒性、増殖分析及びＶＥＧＦ検出に加えて、血管形成におけるアンチセンスオリゴヌクレオチド媒介のＶＥＧＦ発現阻害の効果を分析する。正常及び低酸素条件で作成したＲＰＥ／ＣＥＣ２種培養物を、類似の試験に付す。これらのモデル系を、本発明の長期間及び恒常的物質を評価するために用いる実施例１７副網膜新血管膜（ＳＲＮＶＭ）のＩｎＶｉｖｏモデル前記の実施例に加えて、ＳＲＮＶ発育の特異的阻害試験のための動物モデルを開発した。このモデルでは、ＳＲＮＶとしてヒトで観察されるものと類似の徴候を誘発するためにレーザー処理したラットを用いた。体重１７５〜２５０ｇの色素性ラット（ＤａｒｋＡｇｏｕｔｉ，ＤＡ）を、キシラジン塩酸塩（２ｍｇ／体重１Ｋｇ）、アセプロマジンマレイン酸塩（０．５ｍｇ／Ｋｇ）、及び塩酸ケタミン（１００ｍｇ／体重１Ｋｇ）を筋肉内注射して麻酔にかけ、０．５％プロパラカイン塩酸塩を局所投与する。被検動物を２．５％塩酸フェニレフリンで散瞳させる。クリプトンレーザー放射（６４７ｎｍ）は、コンタクトレンズとしての手持ちカバースリップ（２２ｃ３０ｍｍ）付属のＺｅｉｓｓスリップランプを通して供給する。用いたレーザーパラメーターは以下の通りである：スポットサイズ１００μｍ、出力１５０ｍＷ、及び照射時間０．１ｓ。内網膜又は脈絡膜出血を伴う又は伴わない中央気泡形成によって臨床的に証明されるように、Ｂｒｕｃｈ膜の破壊を試みる。私達は、出力１５０ｍＷでの処理が、最も一貫してこの効果を生み出すことを見い出した。前記の方法で処理した動物の約４０％が、脈絡膜から網膜に血管を発育させた。この成育は、ＶＥＧＦ発現の調節増加を付随し、私達のオリゴヌクレオチド及び構築体を試験するために優れた系を供給する。実施例１８アンチセンスオリゴヌクレオチド、Ａｄ．ＲＳＶ．ａＶＥＧＦ及びｒＡＡＶａＶＥＧＦによるラットＩｎＶｉｖｏにおけるＲＰＥ−ＶＥＧＦ発現阻害新血管形成は、脈絡膜又は副網膜層にてポケット移植を用いて誘導することができる。これらのモデルの不利な点の１つは、新血管形成の過程が、ヒトにおいてＡＲＭＤを被ったときに自然に起こる同じ生化学的工程に従わないという点である。これらの困難を克服するために、私達は、脈絡膜新血管形成がＶＥＧＦ過剰発現によって誘導される動物モデルを用いる。ＶＥＧＦを担持する組み換えアデノウイルス、例えばＡｄ．ＲＳＶ．ＶＥＧＦをｉｎｖｉｖｏ試験に用いて、広範な情報を得るために、前記のすべての動物モデルを利用する。試験は、１年間のＶＥＧＦ発現を実証するために行われる。ノザン及びウエスタンブロット分析を用いて、ＶＥＧＦ調節減少をモニターし、免疫組織化学を用いて細胞特異的様式でのＶＥＧＦ発現の調節減少を実証する。前記の動物モデルを用いて、組織学及び血管造影によって、脈絡膜新血管形成をモニターする。これらのモデルは、本発明のすべての具体化に適用可能である。アデノウイルス遺伝子が、首尾よくＲＰＥへ転移することから、本発明は、年令関連黄班性退化の研究、治療又は予防に特に有効であると理解される。観察された利点に対して提案される機構によって拘束されるつもりはないが、Ｆ２０００細胞と比べてＨＲＰＥ７細胞での遺伝子発現の程度がより高いことは、ＲＰＥ細胞は大きな分子を食食でき、それゆえアデノウイルスの取り込みを増加させる能力を示している。導入遺伝子の発現レベルは、露出時間又はウイルス力価の増大によっても増加する。ＨＲＰＥ７細胞及びＦ２０００繊維芽細胞の比較研究によって、同じ条件下、異なる細胞種間で発現パターンに明白な相違があることが示される。これらの相違は異なった細胞、例えばＲＰＥのターゲッティングに利用できる。ＲＰＥ細胞に対する時間／発現カーブ（図５）の頂点は４時間であるが、Ｆ２０００細胞では２４時間である。それゆえ、ＲＰＥ細胞がＡｄ．ＲＳＶ．βｇａｌ．を取り込み、この導入遺伝子を、Ｆ２０００繊維芽細胞より目立って高い程度に発現するウインドウが存在する。２４時間以内のトランスフェクションでは、このウインドウをターゲッティングの手段として用いることができる（例えば、２４時間後、ウィルス溶液を副網膜ブレブ又は硝子体から吸引する）。力価／発現カーブ（図５）も又、細胞間に相違があり、ＲＰＥ細胞ではより低い濃度で高度の発現が開始されることを示す。ここで再び、ＲＰＥ細胞を優先的にターゲッティングすることに低い濃度を用いることができる。２４時間以内のより低い力価を組み合わせて、２つの効果を結合させれば、ターゲッティングされた供給が可能となろう。いくつかの具体化で示されたように、本発明は又、遺伝子導入及び発現をもたらすのに必要な力価を減じることによって、ウイルスの毒性を最小限に抑えるために、アジュバントと共に用いることができる。私達はＨＡを用いたアデノウイルス遺伝子導入に対する一貫した、意義のあるアジュバント効果を示してきた。これは食細胞及び非食細胞両方の細胞株においてである。ＨＡの利点は、ヒト硝子体及び細胞外基質の正常成分として存在していること、及び外科医学に対する粘度弾性助剤としての長い歴史を持つ治療上の容認である。潜在的アジュバントとしての働きに関する、ＨＡの重要な特徴は、その細胞膜及び他の分子に同時に結合する能力にある。私達は、ＨＡ分子は、アデノウイルス及び細胞膜に同時に結合することができ、それゆえこの機構を用いて細胞膜付近のウイルスの接触時間又は濃度を増加させることを提案する。私達は、Ｆ２０００及びＲＰＥ７（ＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ及びＩＣＡＭ−１レセプターの存在に対して陽性と試験された細胞）の両方において同定されたＨＡに特異的な細胞表面のレセプターを同定した。興味深いことに、ＲＰＥのＲＨＡＭＭレセプターは、核分布を示し、このことは、Ｆ２０００よりもＲＰＥにおいてＨＡのアジュバント効果が若干高いことを説明できる。私達のｉｎｖｉｖｏＣＤ４４免疫蛍光染色の予備研究によって、視神経網膜にはシグナルがないことが示され、アデノウイルスのＨＡ関連性も又、ｉｎｖｉｖｏにおけるＲＰＥに対する潜在的ターゲッティング機構であることが示唆される。本発明を実施例によって説明してきたが、ここに記載した、具体化に対する種々の修飾及び変更は、この明細書に開示している発明概念の範囲から逸脱することなく可能であることは、当業者であれば明らかであろう。ここに引用された参考文献を、以下のページの表に示すが、これらは引用によって本明細書に包含されるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１０月１０日（１９９７．１０．１０）【補正内容】【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年１月１２日（１９９８．１．１２）【補正内容】請求の範囲１．(ａ)特定の蛋白質をコードする核酸配列および(ｂ)ヒアルロン酸またはその誘導体と医薬的に許容される担体からなり、該核酸が標的配列に反対方向のアンチセンス核酸かまたは特定の所望の蛋白質をコードするセンス核酸のいずれかである組成物。２．該核酸が標的配列に対してアンチセンス配向にあるヌクレオチド配列を有する請求項１の組成物。３．標的核酸配列がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドである請求項２の組成物。４．該核酸が標的細胞に転移される核酸配列を含むベクター中にある請求項１の組成物。５．該転移される核酸配列がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドである請求項４の組成物。６．該ベクターが機能を発揮するために標的細胞に提供されるべきセンス配列を含む請求項５の組成物。７．該ベクターが標的細胞中の核酸の機能を抑制するために標的細胞に提供されるべきアンチセンス配列を含む請求項６の組成物。８．該ベクターがリポソームである請求項１〜７のいずれか１つの組成物。９．該ベクターがウイルスである請求項１〜８のいずれか１つの組成物。１０．該ウイルスが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはレトロウイルスである請求項１〜９のいずれか１つの組成物。１１．該ウイルスが増殖抑制アデノウイルスである請求項９の組成物。１２．該ウイルスが、呼吸合胞細胞ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス・メジャー・レイト・プロテイン(ＭＬＰ)、ＶＡ１ pol IIIおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選ばれるプロモーターを含む増殖抑制アデノウイルスである請求項１１の組成物。２３．該アンチセンス核酸配列が、標的細胞に転移される核酸配列を含むベクター中にある請求項２２の組成物。２４．該ベクターがウイルスである請求項２３の組成物。２５．該ベクターがアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはレトロウイルスである請求項２３の組成物。２６．該ウイルスベクターが増殖抑制組換えウイルスである請求項２４または２５の組成物。２７．該ウイルスが、呼吸合胞細胞ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス・メジャー・レイト・プロテイン（ＭＬＰ）、ＶＡ１ pol IIIおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選ばれるプロモーターを含む増殖抑制アデノウイルスである請求項２６の組成物。２８．該ベクターが、pＡｄ．ＲＳＶ，ｐＡｄ．ＭＬＰまたはｐＡｄ．ＶＡ１である請求項２７の組成物。２９．該ベクターがＡd.ＲＳＶ.αＶＥＧＦまたはＡd.ＶＡ１.αＶＥＧＦである請求項２７の組成物。３０．該ベクターがポリアデニル化シグナル配列も含む請求項１〜２９のいずれか１つの組成物。３１．該ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０シグナル配列である請求項３０の組成物。３２．ＶＥＧＦをコードする配列の少なくとも１部に相当するアンチセンス核酸配列、所望によりさらに細胞の取込みを増加する１またはそれ以上のアジュバンド、ならびに医薬的に許容される担体からなる、異常血管新生により媒介される網膜疾病治療用組成物。３３．アジュバンドとしてヒアルロン酸またはその誘導体を含有する請求項３２の組成物。３４．該アンチセンス配列がＶＥＧＦをコードする遺伝子の対応領域に１００％相同性を有する請求項３２または３３の組成物。３５．該アンチセンス配列が１６〜５０ヌクレオチド長を有する請求項３２または３３の短期治療用組成物。３６．該アンチセンス配列が１６〜２２ヌクレオチド長を有する請求項３２または３３の短期治療用組成物。３７．該アンチセンス配列が１６〜１９ヌクレオチド長を有する請求項３２または３３の短期治療用組成物。３８．本明細書に定義されている修飾オリゴヌクレオチドを用い、該アンチセンス配列が７〜５０ヌクレオチド長を有する請求項３２または３３の組成物。３９．ＶＥＧＦをコードする配列の少なくとも１部に相当するアンチセンス核酸配列を含む組換えウイルスと医薬的に許容される担体とからなり、該アンチセンス配列が２０ヌクレオチドとＶＥＧＦをコードする完全長配列の間の長さを有することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の長期治療用組成物。４０．さらにアジュバンドとしてヒアルロン酸またはその誘導体を含有する請求項３９の組成物。４１．該アンチセンス配列が５０ヌクレオチド長とＶＥＧＦの完全長の間にある請求項３９または４０の組成物。４２．該ＶＥＧＦ配列がヒト網膜色素上皮細胞または脈絡膜内皮細胞からのＶＥＧＦの配列である請求項２２〜４１のいずれか１つの組成物。４３．ＶＥＧＦをコードする配列の少なくとも１部に相当するアンチセンス核酸配列を含む組換えウイルスと医薬的に許容される担体とからなり、該ウイルスが標的細胞のゲノム中にアンチセンス配列を組込みできるものである、異常血管新生により媒介される網膜疾病治療に一定期間有効な組成物。４４．さらにアジュバンドとしてヒアルロン酸またはその誘導体を含有する請求項４３の組成物。４５．該ウイルスがアデノ関連ウイルスである請求項４３または４４の組成物。４６．該アンチセンス配列が２０ヌクレオチド長とＶＥＧＦの完全長の間にある請求項４３、４４または４５の組成物。４７．該アンチセンス配列が５０ヌクレオチド長とＶＥＧＦの完全長の間にある請求項４３、４４または４５の組成物。４８．ＶＥＧＦをコードする配列の少なくとも１部に相当するアンチセンス核酸配列の有効量を治療が必要な個体の眼に投与し、血管新生を抑制することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の治療方法。４９．さらにアジュバンドとしてヒアルロン酸またはその誘導体を含有する請求項４８の方法。５０．該アンチセンス配列が１６〜５０ヌクレオチド長を有する請求項４８または４９の方法。５１．該アンチセンス配列が１６〜２２ヌクレオチド長を有する請求項４８または４９の方法。５２．該アンチセンス配列が１６〜１９ヌクレオチド長を有する請求項４８または４９の方法。５３．本明細書に定義されている修飾オリゴヌクレオチドを用い、該アンチセンス配列が７〜５０ヌクレオチド長を有する請求項４８または４９の方法。５４．請求項２２〜４７のいずれか１つによる組成物の有効量を治療に必要な個体に投与することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の治療方法。５５．請求項３９〜４２のいずれか１つの組成物を治療が必要な個体の眼に投与して長期間血管新生を抑制することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の治療方法。５６．請求項４２〜４７のいずれか１つの組成物を治療が必要な個体の眼に投与して一定期間血管新生を抑制することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の治療方法。５７．該網膜疾病が、年令関連斑点変性、糖尿病性網膜症、分枝または中央網膜静脈閉鎖、早熟網膜症、皮膚潮紅虹彩および角膜の血管新生から選ばれる請求項４８〜５６のいずれか１つの方法。５８．細胞をヒアルロン酸またはその誘導体の存在下に核酸または核酸含有ウイルスまたはベクターに曝すことを特徴とする標的細胞による外来遺伝子核酸配列の取込みを促進する方法。５９．標的細胞が食菌細胞である請求項５８の方法。６０．該核酸およびヒアルロン酸をin vitroで一緒に投与する請求項５８または５９の方法。６１．該核酸およびヒアルロン酸をin vivoで一緒に投与する請求項５８または５９の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/36 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コンスタブル，イアン・ジェフリーオーストラリア6009ウエスタン・オーストラリア州ネッドランズ・バーダン・ストリート２番、ライオンズ・アイ・インスティテュート

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸配列およびヒアルロン酸またはその誘導体と医薬的に許容される担体からなる組成物。２．該核酸が標的配列に対してアンチセンス配向にあるヌクレオチド配列を有する請求項１の組成物。３．標的核酸配列がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドである請求項２の組成物。４．該核酸が標的細胞に転移される核酸配列を含むベクター中にある請求項１の組成物。５．該転移される核酸配列がゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドである請求項４の組成物。６．該ベクターが機能を発揮するために標的細胞に提供されるべきセンス配列を含む請求項５の組成物。７．該ベクターが標的細胞中の核酸の機能を抑制するために標的細胞に提供されるべきアンチセンス配列を含む請求項６の組成物。８．該ベクターがリポソームである請求項１〜７のいずれか１つの組成物。９．該ベクターがウイルスである請求項１〜８のいずれか１つの組成物。１０．該ウイルスが、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはレトロウイルスである請求項１〜９のいずれか１つの組成物。１１．該ウイルスが増殖抑制アデノウイルスである請求項９の組成物。１２．該ウイルスが、呼吸合胞細胞ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス・メジャー・レイト・プロテイン（ＭＬＰ）、ＶＡ１ pol IIIおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選ばれるプロモーターを含む増殖抑制アデノウイルスである請求項１１の組成物。１３．該ベッッックターがpＡｄ．ＲＳＶ，ｐＡｄ．ＭＬＰまたはｐＡｄ．ＶＡ１である請求項１１の組成物。１４．該ベクターがＡd.ＲＳＶ.aＶＥＧＦまたはＡd.ＶＡ１.aＶＥＧＦである請求項１１の組成物。１５．該ベクターがポリアデニル化シグナル配列も含む請求項１０〜１４のいずれか１つの組成物。１６．該ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０シグナル配列である請求項１５の組成物。１７．請求項１〜１６のいずれか１つの組成物の有効量を治療の必要な個体に投与することを特徴とする個体の病的状態を治療する方法。１８．該組成物を注射により全身的に投与する請求項１７の方法。１９．該組成物を局所投与する請求項１７の方法。２０．該組成物を治療すべき組織に直接投与する請求項１７の方法。２１．核酸またはベクターをヒアルロン酸またはその誘導体に結合させ、その形成された複合体を単離する工程からなる請求項１〜１６のいずれか１つの組成物の製造法。２２．ａ）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に反対方向のアンチセンス核酸配列およびｂ）ヒアルロン酸ならびに医薬的に許容される担体からなる、異常血管新生により媒介される網膜疾病治療用組成物。２３．該アンチセンス核酸配列が、標的細胞に転移される核酸配列を含むベクター中にある請求項２２の組成物。２４．該ベクターがウイルスである請求項２３の組成物。２５．該ベクターがアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはレトロウイルスである請求項２３の組成物。２６．該ウイルスベクターが増殖抑制組換えウイルスである請求項２４または２５の組成物。２７．該ウイルスが、呼吸合胞細胞ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、アデノウイルス・メジャー・レイト・プロテイン（ＭＬＰ）、ＶＡ１ pol IIIおよびβ−アクチンプロモーターからなる群から選ばれるプロモーターを含む増殖抑制アデノウイルスである請求項２６の組成物。２８．該ベクターが、pＡｄ．ＲＳＶ，ｐＡｄ．ＭＬＰまたはｐＡｄ．ＶＡ１である請求項２７の組成物。２９．該ベクターがＡd.ＲＳＶ.aＶＥＧＦまたはＡd.ＶＡ１.aＶＥＧＦである請求項２７の組成物。３０．該ベクターがポリアデニル化シグナル配列も含む請求項１〜２９のいずれか１つの組成物。３１．該ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０シグナル配列である請求項３０の組成物。３２．ＶＥＧＦをコードする配列の少なくとも１部に相当するアンチセンス核酸配列、所望によりさらに細胞の取込みを増加する１またはそれ以上のアジュバンド、ならびに医薬的に許容される担体からなる、異常血管新生により媒介される網膜疾病治療用組成物。３３．該アンチセンス配列がＶＥＧＦをコードする遺伝子の対応領域に１００％相同性を有する請求項３２の組成物。３４．該アンチセンス配列が１６〜５０ヌクレオチド長を有する請求項３２または３３の短期治療用組成物。３５．該アンチセンス配列が１６〜２２ヌクレオチド長を有する請求項３４の短期治療用組成物。３６．該アンチセンス配列が１６〜１９ヌクレオチド長を有する請求項３５の短期治療用組成物。３７．本明細書に定義されている修飾オリゴヌクレオチドを用い、該アンチセンス配列が７〜５０ヌクレオチド長を有する請求項３３の組成物。３８．該アジュバンドがヒアルロン酸またはその誘導体である請求項３２〜３８のいずれか１つの組成物。３９．ＶＥＧＦをコードする配列の少なくとも１部に相当するアンチセンス核酸配列を含む組換えウイルスと医薬的に許容される担体とからなり、該アンチセンス配列が２０ヌクレオチドとＶＥＧＦをコードする完全長配列の間の長さを有することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の長期治療用組成物。４０．該アンチセンス配列が５０ヌクレオチド長とＶＥＧＦの完全長の間にある請求項３９の組成物。４１．該ＶＥＧＦ配列がヒト網膜色素上皮細胞または脈絡膜内皮細胞の配列である請求項１〜４０のいずれか１つの組成物。４２．ＶＥＧＦをコードする配列の少なくとも１部に相当するアンチセンス核酸配列を含む組換えウイルスと医薬的に許容される担体とからなり、該ウイルスが標的細胞のゲノム中にアンチセンス配列を組込みできるものである、異常血管新生により媒介される網膜疾病治療に一定期間有効な組成物。４３．該ウイルスがアデノ関連ウイルスである請求項４２の組成物。４４．該アンチセンス配列が２０ヌクレオチド長とＶＥＧＦの完全長の間にある請求項４２または４３の組成物。４５．該アンチセンス配列が５０ヌクレオチド長とＶＥＧＦの完全長の間にある請求項４４の組成物。４６．ＶＥＧＦをコードする配列の少なくとも１部に相当するアンチセンス核酸配列の有効量を治療が必要な個体の眼に投与し、血管新生を抑制することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の治療方法。４７．該アンチセンス配列が１６〜５０ヌクレオチド長を有する請求項４６の方法。４８．該アンチセンス配列が１６〜２２ヌクレオチド長を有する請求項４６の方法。４９．該アンチセンス配列が１６〜１９ヌクレオチド長を有する請求項４６の方法。５０．本明細書に定義されている修飾オリゴヌクレオチドを用い、該アンチセンス配列が７〜５０ヌクレオチド長を有する請求項４６の方法。５１．請求項２２〜４５のいずれか１つによる組成物の有効量を治療に必要な個体に投与することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の治療方法。５２．請求項３９〜４１のいずれか１つの組成物を治療が必要な個体の眼に投与して長期間血管新生を抑制することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の治療方法。５３．請求項４２〜４５のいずれか１つの組成物を治療が必要な個体の眼に投与して一定期間血管新生を抑制することを特徴とする異常血管新生により媒介される網膜疾病の治療方法。５４．該網膜疾病が、年令関連斑点変性、糖尿病性網膜症、分枝または中央網膜静脈閉鎖、早熟網膜症、皮膚潮紅虹彩および角膜の血管新生から選ばれる請求項４６〜５３のいずれか１つの方法。５５．細胞をヒアルロン酸またはその誘導体の存在下に核酸または核酸含有ウイルスまたはベクターに曝すことを特徴とする標的細胞による外来遺伝子核酸配列の取込みを促進する方法。５６．標的細胞が食菌細胞である請求項５５の方法。５７．該核酸およびヒアルロン酸をin vitroで一緒に投与する請求項５５または５６の方法。５８．該核酸およびヒアルロン酸をin vivoで一緒に投与する請求項５５または５６の方法。